腫瘍形成を診断するための方法及びキット
血液、血奬、血清、唾液、尿、及び他の生物液中のＧＰ８８濃度を測定することによる腫瘍形成診断方法及びキット。該方法及びキットは、１ミリリットルあたり約０．１〜１０ナノグラムの低さの濃度で生物液中のＧＰ８８を検出し、患者の血清又は他の生物液中のＧＰ８８濃度を測定することによって、患者が腫瘍形成状態を有するか、患者が抗腫瘍形成治療に反応性である可能性が高いか、治療した患者が抗腫瘍形成治療に反応するかの判定に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、現在は放棄されている１９９７年５月２３日に出願された米国特許出願第０８／８６３，０７９号の一部継続出願である１９９７年１２月１６日に出願された米国出願番０８／９９１，８６２号の分割出願（現在、米国特許第６，３０９，８２６号）である１９９９年１２月８日に出願された米国出願番号０９／４５６，８８６号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、細胞生物学、生理学、及び薬剤に関し、８８ｋＤａの糖タンパク質成長因子（「ＧＰ８８」）並びにＧＰ８８の発現及び生物活性に影響を及ぼす組成物及び方法に関する。本発明は、癌を含む疾患の診断及び治療に有用なキット製品、組成物、及び方法にも関する。
【０００３】
参照
いくつかの公表物を括弧内のアラビア数字によって本明細書中で参照する。特許請求の範囲の直前の本明細書の最後にこれらの参照の全ての引用を見ることができる。
【０００４】
背景技術
多細胞生物における細胞の増殖及び分化は、高度に調節されたプロセスを受ける。癌細胞を区別する特徴はこのプロセスに対する制御が無いことであって、増殖及び分化が調節されなくなり、結果として制御されない増殖が生じる。正常細胞及び腫瘍細胞の間のこの違いをより理解することに対して多大な研究努力が向けられてきた。焦点が当てられている研究の一領域は成長因子であり、より具体的にはオートクリン増殖刺激である。
【０００５】
成長因子は、増殖、分化、移入、及び遺伝子発現に関するメッセージを細胞に運ぶポリペプチドである。典型的には、成長因子はある細胞中で産生され、別の細胞に対して増殖を刺激するように作用にする。しかしながら、培養物中のある種の悪性細胞では、オートクリン増殖機構により大きくあるいは完全に依存していることが実証される。このオートクリン挙動が見られる悪性細胞は、他の細胞による成長因子の産生調節を回避し、したがってその増殖が調節されない。
【０００６】
オートクリン増殖制御の研究によって、細胞増殖機構の理解が進み、癌の診断及び治療における重要な発展がもたらされる。このような目的に対して、インスリン様成長因子（「ＩＧＦ１」及び「ＩＧＦ２」）、ガストリン放出ペプチド（「ＧＲＰ」）、形質転換成長因子アルファ及びベータ（「ＴＧＦ−ａ」及び「ＴＧＦ−ｂ」）、及び上皮成長因子（「ＥＧＦ」）を含む多数の成長因子が研究されている。
【０００７】
本発明は、最近発見された成長因子に関する。この成長因子は、腫瘍形成能の高い（highly tumorigenic）「ＰＣ細胞」（奇形腫由来の脂肪生成細胞系１２４６から単離されたインスリン非依存性変異体）の培地中に最初に発見された。この成長因子を本明細書中では「ＧＰ８８」と称する。ＧＰ８８は精製され、構造的に特性決定がなされている。ＧＰ８８のアミノ酸配列決定により、ＧＰ８８はマウスグラヌリン（granulin）／エピセリン（epithelin）前駆体とのアミノ酸配列の類似性を有していることが示される。
【０００８】
グラヌリン／エピセリン（「ｇｒｎ／ｅｐｉ」）は６ｋＤａのポリペプチドであり、二重システインに富むポリペプチド(double cysteine rich polypeptide)の新しいファミリーに属する。特許文献１（Shoyab et al.）は、６ｋＤａのエピセリン、具体的にはエピセリン１及びエピセリン２に関する。Shoyabによれば、両方のエピセリンは共通の６３．５ｋＤａの前駆体によってコードされており、該前駆体は、合成されると直ぐ、生物試料中に見出される天然産物のみが６ｋＤａの形態となるようにより小さな形態へとプロセシングされる。
【０００９】
Shoyabらの教示に反して、本発明者らの研究室により、前駆体は合成されたら直ぐにプロセシングされることは常ではないことが実証された。本発明者によって一部なされた研究によって、前駆体（すなわち、ＧＰ８８）が、実は、Ｎへ結合した２０ｋＤａの炭水化物部分を有する８８ｋＤａの糖タンパク質として分泌されることが実証された。ＧＰ８８のＮ末端配列の分析によって、ＧＰ８８はｇｒｎ／ｅｐｉ前駆体のアミノ酸１７で始まることが示され、前駆体ｃＤＮＡから推定されるタンパク質配列由来の最初の１７個のアミノ酸は膜への局在化又は分泌の標的化に適合する(compatible）シグナルペプチドに対応することが実証されている。さらにShoyabの教示とは対照的に、ＧＰ８８は生物活性であり、増殖促進活性、具体的には産生細胞のオートクリン成長因子としての増殖促進活性を有する。
【００１０】
癌の診断では、腫瘍形成が疑われる組織の生検のサンプリング、腫瘍マーカーが存在するかを決定するための組織試料の試験、及び組織試料が腫瘍形成性であるかの決定がしばしば必要となる。生検手順は、組織の位置及び患者の状態に拠っては危険性を有し、かつ、痛いこともある。さらに、生検手順によって与えられた外傷が悪性の危険性を増大することもある。英国医学雑誌（British Medical Journal）で報告された研究によって、生検が精巣癌の最大の危険因子であると同定された（非特許文献１）。生検は、乳癌、肝癌、及びその他の癌における危険因子としても同定されている。さらに、ジョンズ・ホプキンス大学で行われた研究では、生検後の誤診は有意な率で起こると結論した（非特許文献２）。誤診は、一部には、針の生検及び小さな組織試料だけを得る他の手順から得られる小さな組織試料サイズに因ることもある。小さな生検試料サイズでは、患者の危険性が減じる。Id。しかしながら、小さな組織試料だけが利用される場合に誤診の危険性が増加する。Id。
【特許文献１】米国特許第５，４１６，１９２号
【非特許文献１】Swerdlow et al.,BMJ 1997 ;314:1507
【非特許文献２】Kronz et al., Cancer:Dec.1, 1999, vol.86, no.11 pp 2426-2435
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
癌の診断、治療、及び予防のための新規な方法及びキット、具体的には、組織の生検に関連する危険性を回避する方法及びキットが必要とされているものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の概要
本発明者は、正常細胞では厳格に調節された形式で発現される糖タンパク質（ＧＰ８８）が正常な細胞由来の腫瘍形成能の高い細胞では過剰発現され、かつ、調節されないこと、腫瘍形成細胞に厳格に（stringently）必要とされる増殖刺激物質としてＧＰ８８が作用すること、及び腫瘍形成細胞でのＧＰ８８の発現又は作用を阻害することによって過剰産生細胞の腫瘍形成特性が阻害されることを今、予想外にも発見した。
【００１３】
本発明者は、さらに、１ミリリットルあたりのＧＰ８８濃度約０．１ナノグラムの低さの濃度での生物液中のＧＰ８８の検出方法を発見した。本発明の実施態様は、生物液（例えば、全血、血奬、血清、リンパ、唾液、及び尿）中のＧＰ８８の非侵襲検出方法及びキットを提供する。
【００１４】
本発明の別の実施態様は、生物液中のＧＰ８８レベルを測定する工程及びＧＰ８８レベルが腫瘍形成を示すのに十分であるかを決定する工程を含む、腫瘍形成の診断方法及びキットを提供する。さらなる実施態様において、本発明は、方法及びキットを提供する。患者から採取した第１の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、同じ患者から採取した第２の又は後の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、及び第２の生物液試料中の測定されたＧＰ８８タンパク質レベルが第１の生物液試料中のレベルよりも、腫瘍形成能を示すのに十分な程に高い量であるかを判定することによって腫瘍形成を診断する工程を含む、腫瘍形成の診断方法及びキットを提供する。
【００１５】
さらに本発明の実施態様は、血清中のＧＰ８８レベルを測定することによって患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるかを決定するための方法及びキットを提供する。抗腫瘍形成治療を受けている患者におけるＧＰ８８血清濃度が特定の患者に帰する基準値より大きい場合（例えば、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ）、患者は抗腫瘍形成治療に反応していない。本発明の別の実施態様において、癌再発の治療又は予防方法を提供する。この実施態様によれば、患者から採取した生物液試料中のＧＰ８８濃度を決定する。生物液中のＧＰ８８濃度が特定の患者に帰する基準値より大きい場（例えば、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＰ８８アンタゴニストを癌の再発を治療又は予防するのに十分な量で患者に投与する。
【００１６】
本発明は、ＧＰ８８の発現又は活性を阻害することが可能であるＧＰ８８拮抗組成物、限定するものではないが、例えば、血液、髄液、血清、血奬、尿、乳頭吸引液（nipple aspirate）、肝、腎、乳、骨、骨髄、精巣、脳、卵巣、皮膚、及び肺を含む組織における哺乳動物での癌など、ＧＰ８８の量又は活性の欠陥に関連する疾患の治療方法、ＧＰ８８の発現又は作用の欠陥に関連する疾患に対する被検体の感受性の決定方法、ＧＰ８８拮抗治療に対する感受性の測定方法、並びに細胞中のＧＰ８８及び腫瘍形成活性のin vitro及びin vivo検出方法、試薬、及びキットも提供する。
【００１７】
本発明の追加の目的及び利点は、一部には以下の詳細な説明中に説明され、一部には詳細な説明から明らかであり、あるいは本発明の実施例によって理解することができる。
【００１８】
本発明の目的を達成するため、発明の目的によれば、本明細書中で実施態様が提供され、適切に記載される通り、本発明は、細胞が変化したＧＰ８８の発現又はＧＰ８８に対する変化した反応を示す乳癌などの疾患の診断及び治療用組成物を提供する。
【００１９】
本明細書中の「変化した発現」という用語の使用は、対応する正常な細胞又は周囲末梢細胞と比較して、ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルに基づき、少なくとも２倍、時には１０倍以上のＧＰ８８の増加した発現又は過剰発現を意味する。「変化した発現」との用語は、制御されなくなったか、あるいは必ずしも高くすることがなく構成的になった発現も意味する。ＧＰ８８に対する増加した又は変化した「反応」という用語の使用は、ＧＰ８８によって与えられる任意の生物機能（例えば、増殖、分化、ウイルス感染）の増加によってＧＰ８８の変化した発現と同じ又は同等の状態となる状態を意味する。
【００２０】
本明細書中の「ＧＰ８８」という用語の使用は、細胞抽出物及び細胞外液中のエピセリン／グラヌリン前駆体を意味し、マウス及びヒトを起源とする図８又は９中に含まれるアミノ酸配列によるＧＰ８８を含むだけでなく他の種を起源とするＧＰ８８も含むことを意図する。さらに、該用語には、糖タンパク質又は他の修飾構造を含む炭水化物部分などの追加成分を有するＧＰ８８の機能性誘導体が含まれる。
【００２１】
ＧＰ８８という用語は、上記の配列中に存在する少なくとも１０個のアミノ酸を有する任意のポリペプチドフラグメントも意図する。この長さの配列は、抗原として有用であり、タンパク質全体の種々のエピトープに特異的な抗体の産生のための担体との免疫原性共役体の作製に有用である。そのようなポリペプチドは、そのような抗体のスクリーニング及び生物液中のＧＰ８８の検出に関する方法に有用である。ペプチドがより大きいタンパク質に対する抗体の生成に有用であることは当該技術分野で周知である（７）。本発明の一実施態様において、長さが１２〜１９個のアミノ酸のペプチドを用いて全長ＧＰ８８を認識する抗体を生成することに成功したことが示されている。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、別の分子と共有結合してあるいは共有結合せずに存在してもよい。例えば、該ポリペプチドを、グルタチオントランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、又はｍｙｃ標識などの１つ以上のペプチド結合を介して１つ以上の他のポリペプチドに融合してもよい。
【００２３】
本ポリペプチドは、ＧＰ８８又はその機能性誘導体に対する抗体を再生産又は試験するための免疫原として用いることができる免疫原性が異なった（antigenetically distinct）決定基又はエピトープを含有する程に十分に大きい。
【００２４】
一実施態様には、他の哺乳動物ペプチドを実質的に有していないポリペプチドが含まれる。本発明のＧＰ８８は、細胞、組織、又は生物液から生物化学的に又は免疫化学的に精製することができる。あるいは、ポリペプチドは、原核生物又は真核生物の発現系及び宿主細胞中で組換え手段によって産生することができる。
【００２５】
「他の哺乳動物ペプチドを実質的に有していないポリペプチド」とは、原核生物中であるいは所望する場合には非哺乳動物若しくは哺乳動物の真核生物中でポリペプチドを合成することができる事実を反映している。あるいは、固相支持体上の化学合成及びその後の支持体からの分離による所望の配列のポリペプチドの合成方法が周知である。あるいは、少なくとも９０％の純度（重量ベースで）あるいは所望する場合にはさらに９９％の純度の他の哺乳動物のポリペプチドとなるように、天然に存在する哺乳動物の組織又は液からタンパク質を精製することができ、したがって実質的にそれらを有していないこととなる。タンパク質に対して反応性である抗体を保有する免疫吸着剤上などでの標準のタンパク質精製を組織抽出物又は液に施すことによって、これを成すことができる。本発明の一実施態様は、天然に存在するＧＰ８８及びバキュロウイルスが感染した昆虫細胞中で発現される組換えＧＰ８８の精製のための精製方法を記載する。あるいは、そのような組織又は液からの精製を、限定するものではないが参照（４）に記載のものなど、標準の方法の組み合わせによって成すことができる。
【００２６】
野生型の精製糖タンパク質若しくはポリペプチド又は組換え糖タンパク質若しくはポリペプチドに対する代替として、「ＧＰ８８」は機能性誘導体を含むことも意図している。機能性誘導体とは、後述のタンパク質又は糖タンパク質の「フラグメント」、「変異体」、「アナログ」、又は「化学誘導体」を意味する。機能性誘導体は、本発明による有用性を可能とする全長ＧＰ８８の機能の少なくとも一部を保持する。
【００２７】
ＧＰ８８の「フラグメント」とは、ＧＰ８８の腫瘍形成特性を保持する比較的短いペプチドである分子の任意のサブセットをいう。これは、限定するものではないが、例えば、マウスＧＰ８８のＫ１９Ｔ及びＳ１４Ｒ、及びヒトＧＰ８８のＥ１９Ｖ及びＡ１４Ｒ（それぞれマウスＫ１９Ｔ及びＳ１４Ｒに対応する）などの領域に対応する。
【００２８】
ＧＰ８８の「変異体」とは、ペプチド全体又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する分子をいう。変異体ペプチドは、変異体ペプチドの直接化学合成により、当該技術分野で既知の方法を用いて調製することができる。
【００２９】
あるいは、ペプチドのアミノ酸配列変異体は、合成されたタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを修飾することによって調製することができる。そのような変異体には、例えば、ＧＰ８８のアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換が含まれる。最終構築体が所望の活性を有するという条件において、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って最終構築体に到達することもできる。変異体ペプチドをコードするＤＮＡでなされる変異は、リーディング・フレームを変えてはならず、好ましくは、ｍＲＮＡ二次構造を作ることができる相補領域を作り出してはいけない。ペプチド分子をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異（８）によってこれらの変異体を遺伝子レベルで調製することができ、それによって変異体をコードするＤＮＡが産生され、続いて組換え細胞培養でＤＮＡが発現される。変異体は、典型的には、非変異体ペプチドと同じ定性的な生物活性を示す。
【００３０】
ＧＰ８８のタンパク質の「アナログ」とは、分子全体又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する非天然分子をいう。
【００３１】
「化学誘導体」は、通常はペプチド又はタンパク質の一部ではない追加の化学部分を含む。ペプチドの共有結合による修飾も本発明の範囲内に含まれる。選択した側鎖又は末端アミノ酸残基と反応することができる有機誘導体化剤とペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることにより、そのような修飾を分子中に導入することができる。最もよく誘導体化する残基は、システイニル、ヒスチジル、リシニル、アルギニル、チロシル、グルタミニル、アスパラギニル、及びアミノ末端残基である。プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル及びスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、ヒスチジン、及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びにＣ末端カルボキシル基のアミド化。そのような誘導体化部分によって、溶解性、吸収性（absorption）、生物半減期などが向上する。該部分により、タンパク質などの任意の望ましくない副作用を取り除くあるいは弱めることもできる。さらに、二官能性剤による誘導体化は、水不溶性支持マトリクス又は他の高分子担体へのペプチドの架橋に有用である。通常用いられる架橋剤には、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性（homobifunctional）イミドエステル、１，１−ビス（−ジアゾロアセチル）−２−フェニルエタン、及び二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［９ｐ−アジドフェニル）］ジチオプロピオイミデートなどの誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体が生ずる。臭化シアン活性化炭水化物などの反応性かつ水不溶性のマトリクス並びに米国特許第３，９６９，２８７号及び第３，６９１，０１６号に記載される反応性基質をタンパク質固定化に用いることができる。
【００３２】
本明細書中のＧＰ８８「拮抗剤」いう用語の使用は、ＧＰ８８の発現、産生、若しくは分泌を阻害若しくは遮断する任意の組成物、又はＧＰ８８の生物活性を阻害若しくは遮断する任意の組成物を意味する。これは、限定するものではなく、以下のものなど、任意の作用形式で成すことができる。
【００３３】
（Ａ）ＧＰ８８拮抗剤には、以下のものを含むが限定するものではないＧＰ８８発現又は産生を阻害する任意の試薬又は分子が含まれる。
【００３４】
（１）ＧＰ８８翻訳を阻害することによってＧＰ８８発現を阻害するアンチセンスＧＰ８８ＤＮＡ又はＲＮＡ分子
【００３５】
（２）ＧＰ８８ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現を転写、翻訳、又は翻訳後レベルで阻害する試薬（ホルモン、成長因子、小分子）
【００３６】
（３）ＧＰ８８分泌を阻害する因子、試薬、又はホルモン
【００３７】
（Ｂ）ＧＰ８８拮抗剤には、限定するものではないが、以下のものなどのＧＰ８８作用又は生物活性を阻害する任意の試薬又は分子も含まれる。
【００３８】
（１）タンパク質を結合し、該タンパク質がその生物活性を発揮するのを妨げるＧＰ８８に対する中和抗体
【００３９】
（２）ＧＰ８８がその受容体に結合するのを妨げ、かつ、生物活性を発揮するのを妨げるＧＰ８８受容体に対する抗体
【００４０】
（３）受容体に結合するＧＰ８８の競合阻害剤
【００４１】
（４）ＧＰ８８シグナル伝達経路の阻害剤
【００４２】
本明細書中に示される具体例は、好ましい実施態様の記載、具体的にはＧＰ８８生物作用及び乳癌細胞を含むがそれに限定するものではない癌細胞の増殖を阻害するための中和抗体の使用、ＰＣ細胞の腫瘍形成特性の阻害をもたらすＧＰ８８発現を阻害するためのアンチセンスＧＰ８８ｃＤＮＡ及びアンチセンスＧＰ８８オリゴヌクレオチドの使用、乳房上皮細胞系Ｃ５７ＭＧ、１２４６、及びＰＣ細胞系、並びにミンク（mink）肺上皮細胞系ＣＣＬ６４を含むいくつかの細胞系の細胞表面上のＧＰ８８の受容体の特性決定を提供する。
【００４３】
本発明の一実施態様において、ＧＰ８８拮抗剤は、ＧＰ８８に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＰ８８タンパク質の翻訳を阻害することによってＧＰ８８発現を阻害することが好ましい。
【００４４】
あるいは、そのような組成物は、ＧＰ８８遺伝子転写活性を調節することによってＧＰ８８発現を阻害する試薬、因子、又はホルモンを含有することができる。そのような組成物は、ＧＰ８８翻訳後修飾及び分泌を阻害する試薬、因子、又はホルモンを含有することができる。そのような組成物は、ＧＰ８８細胞表面受容体への結合をＧＰ８８と競合することによってＧＰ８８活性を遮断するＧＰ８８アンタゴニストとして作用する試薬を含有することができる。あるいは、そのような組成物は、一度患部細胞上の受容体に結合したらＧＰ８８によって変換される(transduced)シグナル伝達経路を阻害する因子又は試薬を含有することができる。
【００４５】
あるいは、組成物は、ＧＰ８８の生物活性を中和するＧＰ８８に特異的な抗体又はＧＰ８８の活性を遮断するＧＰ８８受容体に対する抗体などのＧＰ８８の作用を遮断する試薬を含有することができる。
【００４６】
本発明の抗体（中和抗体など）は、乳癌、その他の癌、又はＧＰ８８の増加した発現を示す細胞での他の疾患の治療薬として用いることが好ましい。「中和」という用語は、抗体が実験動物及びヒトで細胞増殖を刺激するあるいは腫瘍増殖を誘発するＧＰ８８の能力を含むＧＰ８８の正常な生物活性を阻害又は遮断する能力を有すると理解しなければならない。有効量の抗ＧＰ８８抗体をヒトを含む動物に種々の経路で投与する。代替の実施態様において、限定するものではないが癌（例えば、乳癌）などの疾患で生じるＧＰ８８の変化した（増加した）発現を示す細胞を検出するための診断薬として、さらに増殖がＧＰ８８に依存し、かつ、ＧＰ８８拮抗治療に反応する患部細胞を同定するための診断薬として、抗ＧＰ８８抗体を用いる。さらに別の実施態様において、抗ＧＰ８８抗体を用いて、ＧＰ８８を発現するあるいはＧＰ８８に反応性を有する細胞に細胞毒性因子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの化合物を送達する。細胞毒性因子は、抗ＧＰ８８抗体に付着、結合、又は会合することができる。
【００４７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＰ８８の増加した発現を示す細胞における癌の治療薬として用いることができる。有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトを含む動物に種々の経路で投与する。
【００４８】
本発明は、生物液又は組織の試料を得る工程、及び液又は組織中のＧＰ８８の量を測定する工程又はＧＰ８８に反応する細胞の感受性を測定する工程を含む、ＧＰ８８の発現又は作用の欠陥に関連する疾患に対する感受性の測定方法も提供する。癌（例えば、乳癌）の場合、ＧＰ８８の量は癌に対する感受性と比例する。
【００４９】
本発明は、生物液又は組織の試料を得る工程、及び液又は組織試料中のＧＰ８８の量を測定する工程を含む、癌（例えば、乳癌）の重篤度の測定方法も提供する。該ＧＰ８８の量は癌の程度又は重篤度と比例する。本発明の一実施態様において、組織試料を血清、リンパ、又は尿から得る。
【００５０】
本発明は、患部組織又は患部であると疑われる組織の試料を得る工程（生検）、試料由来の細胞を培養物中で維持する工程、培養物由来の細胞を抗ＧＰ８８中和抗体で処理する工程、及び中和抗体が細胞増殖を阻害するかの測定工程を含む、ＧＰ８８拮抗治療に対する感受性の測定方法も提供する。抗体の細胞増殖阻害能力によって、細胞がＧＰ８８に依存して増殖することが示され、ＧＰ８８拮抗治療が有効であることが予測される。
【００５１】
本発明は、組織試料を得る工程、及び組織中のＧＰ８８受容体タンパク質又はｍＲＮＡの量を測定する工程又は組織中の受容体のチロシンキナーゼ活性を測定する工程（ＧＰ８８がその受容体に結合することによって、ＧＰ８８の受容体を含む細胞タンパク質のチロシンリン酸化が誘発される）を含む、ＧＰ８８受容体のレベル又は活性の異常に関連する癌に対する感受性の決定方法も提供する。
【００５２】
本発明は、ＧＰ８８拮抗試薬を抗ＧＰ８８抗体又は抗ＧＰ８８受容体抗体に共役することによる、患部部位へのＧＰ８８拮抗試薬の標的化方法も提供する。
【００５３】
本明細書中に組み込まれ、かつ、本明細書の一部を構成する付随の図面は、本発明の実施態様を例証し、詳細な説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
ここで、以下の実施例とともに本発明の要点を説明するのに役立つ現在好ましい本発明の実施態様について詳細に参照する。
【００５５】
ＧＰ８８の生物活性
本発明は、ＧＰ８８の変化した（増加した）発現に関連した疾患の治療及び診断に有用なＧＰ８８並びに抗腫瘍及び抗ウイルス組成物に関する。あるいは、本発明は、ＧＰ８８に対する増加した反応に関連した疾患の治療及び診断に用いられる。３つの細胞系からなるマウスモデル系を用いて、本発明者によって、ＧＰ８８を過剰発現する細胞が腫瘍を形成することが示された。親細胞系１２４６は、合成（defined）培地中でインスリンによる厳格な調節下で増殖して脂肪細胞へと分化するＣ３Ｈマウス脂肪生成細胞系である。１２４６細胞は、高い細胞密度で注射したときでさえ、同系の動物（Ｃ３Ｈマウス）で腫瘍を形成することはできない。インスリン非依存性細胞系１２４６−３Ａを、インスリンなしの培地で維持された１２４６細胞から単離した。１０６個を同系マウスに皮下注射したとき、１２４６−３Ａ細胞は分化する能力を失って腫瘍を形成した。in vitro- in vivoシャトル技術により、腫瘍形成能の高い細胞系ＰＣが１２４６−３Ａ細胞から生成された。１０４個の細胞を同系マウスに注射したときに、ＰＣ細胞は腫瘍を形成した。
【００５６】
ＧＰ８８は、親非腫瘍形成インスリン依存性細胞系に関連するインスリン非依存性腫瘍形成細胞系で過剰発現する。さらに、ＧＰ８８の過剰発現の程度はこれらの細胞の腫瘍形成の程度と正相関し、ＧＰ８８が腫瘍形成に重要であることが初めて実証された（図１）。図１を参照して、ＧＰ８８は細胞によって合成されるだけでなく培地中に分泌されるので、細胞溶解産物中及び培地（ＣＭ）中のＧＰ８８レベルを決定した。すべての細胞を２％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥ／Ｆ１２栄養培地中で培養した。細胞がコンフルエンシー（confluency）に達したとき、培地（ＣＭ）を回収し、界面活性剤を含有する緩衝液中でのインキュベーションに続く１０，０００×ｇでの遠心分離によって細胞溶解産物を調製した。細胞溶解産物及び調整培地を細胞数で規格化した。以下に説明する通り、抗ＧＰ８８抗体を用いたウエスタンブロット分析により、細胞溶解産物から得た試料及び調整培地を分析した。
【００５７】
中和抗体の生成によって、腫瘍形成におけるＧＰ８８の重要な役割が確認された。マウスＧＰ８８のＫ１９Ｔ領域に対して生じた（directed）抗ＧＰ８８抗体を培地に添加したとき、腫瘍形成能の高いＰＣ細胞の増殖は用量に依存した形式で阻害された（図２）。図２を参照して、９６ウェルのプレート中のヒトフィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）及びヒトトランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）を補足したＤＭＥ／Ｆ１２培地中で２×１０４個の細胞／ウェルの密度においてＰＣ細胞を培養した。細胞付着後に、抗ＧＰ８８ＩｇＧ画分を、濃度を増加させつつウェルに添加した。対照細胞を等濃度の非免疫ＩｇＧで処理した。２日後、１ウェルあたり３Ｈ−チミジン０．２５ｍＣｉを６時間加えた。次いで、細胞を回収し、細胞増殖の測度としてのＤＮＡに組み込まれた３Ｈ−チミジンを計数した。
【００５８】
さらに、ＧＰ８８の発現がＰＣ細胞中でアンチセンスＧＰ８８ｃＤＮＡによって特に阻害されとき、ＧＰ８８の産生は減少し、これらのＰＣ細胞は同系Ｃ３Ｈマウスでは腫瘍をもはや形成できなかった。さらに、これらのＰＣ細胞はインスリンに対する反応を回復した。図３及び表１及び２を参照して、１０６個のアンチセンスＧＰ８８でトランスフェクションしたＰＣ細胞（以下で説明する通り）又は１０６個の空のベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞をＣ３Ｈ雌マウスに皮下注射した。腫瘍の様相についてマウスを毎日モニタリングした。細胞注射後４５日目に写真を撮った。対照として用いた空のベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞を注射したマウスとは対照的に、アンチセンスＧＰ８８ＰＣ細胞を注射したマウスは腫瘍を発達しないことが結果により示される。
【００５９】
【表１】
ＰＣ：対照非トランスフェクション細胞
Ｐ−１４：空のベクターでトランスフェクションした対照ＰＣ細胞
ＡＳＧＰ８８：ＧＰ８８アンチセンスｃＤＮＡを含有する発現ベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞
４５日目に腫瘍を切除し、重量測定した。−−−は、腫瘍形成がなかったことを示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】
ＧＰ８８の発現を比較することによって、腫瘍でのin vivoＧＰ８８レベルは正常組織より劇的に高いことが示される（図４）。Ｃ３Ｈマウスに１０６個のＰＣ細胞を注射した。腫瘍を有するマウスを安楽死させた。腫瘍、脂肪部分（fat pads）、及び結合組織を採取した。図１で記載した通り、界面活性剤を含有する緩衝液中でインキュベーションすることによって細胞溶解産物を調製した。組織抽出物のタンパク質濃度を決定し、各試料について等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く抗ＧＰ８８抗体を用いたウエスタンブロット分析により分析し、組織抽出物中のＧＰ８８含量を測定した。結果は、腫瘍抽出物中のＧＰ８８レベルは周囲結合組織及び脂肪組織中のレベルよりも少なくとも１０倍高いことを示している。
【００６２】
正常細胞（１２４６細胞、線維芽細胞）では、ＧＰ８８の発現は、特にインスリンによって調節され、ウシ胎児血清によって阻害される。腫瘍形成細胞では、正常増殖の調節が失われることによって、ＧＰ８８の増加した発現及び増殖のためのＧＰ８８依存性の獲得に至る。したがって、ＧＰ８８発現及び／又は作用の阻害は、腫瘍形成の抑制の有効な手法である。生検中での高いＧＰ８８発現の検出によって、ＧＰ８８阻害療法に反応性である腫瘍の診断用分析が提供される。
【００６３】
ＧＰ８８は、ヒト癌における腫瘍誘発因子でもある。１２４６−３Ａ細胞系で見られる通り、限定するものではないが乳癌を含むいくつかのヒト癌において、インスリン（又はＩＧＦ−Ｉ）に対する反応がなくなると同時に悪性が増加することについては十分に証拠書類が提供されている。具体的には、乳癌は、上記のマウスモデル系での腫瘍形成特性の発達の出発点でもあるインスリン／ＩＧＦ−Ｉオートクリンループの獲得を伴う。さらに、ヒト乳癌では、ＧＰ８８発現が高い。より具体的には、図５を参照して、エストロゲン受容体陽性及びエストロゲン受容体陰性インスリン／ＩＧＦ−Ｉ非依存性の悪性の高い細胞では、ヒトＧＰ８８が高発現する。さらに、ＧＰ８８は、乳房上皮細胞の効力ある（potent）成長因子である（図６）。図５のデータは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＤＭＥ／Ｆ１２培地中でＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を培養することによって得たものである。ＲＮＡｚｏｌ方法によって各細胞系からＲＮＡを抽出し、ポリ−Ａ＋ＲＮＡを調製した。３２Ｐ−標識したＧＰ８８ｃＤＮＡプローブを用い、各細胞系のポリＡ＋ＲＮＡ３μｇを用いたノーザンブロット分析によって、ＧＰ８８ｍＲＮＡ発現を検査した。
【００６４】
齧歯類の細胞又は組織（マウス及びラット）中でＧＰ８８のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析をするため、ヌクレオチド５５１で始まり８６２までの（アミノ酸配列１６０から２７０に対応する）長さ３１１ｂｐのマウスＧＰ８８ｃＤＮＡプローブを用いた。当業者に周知の種々の方法（Sambrook, Molecular Biology manual:35）により、ＲＮＡを抽出することができる。選択した方法は、ＲＮＡｚｏｌ（シンナバイオテック社（Cinnabiotech））又はグアニジニウムイソチオシアナート（guanidinium isothiocyanate）及びフェノール−クロロホルムによる単一工程の抽出からなるトリゾール（Trizol）（ギブコ−ＢＲＬ社（Gibco−BRL））溶液を用いてＲＮＡを抽出することであった。
【００６５】
ヒト細胞系でＧＰ８８のｍＲＮＡ発現をノーザンブロット分析するため、ヒトＧＰ８８のヌクレオチド１００２〜１６７４（アミノ酸配列３３４〜５５８に対応する）に対応する６７２ｂｐのヒトＧＰ８８ｃＤＮＡプローブを開発した。
【００６６】
図６に関して、ＰＣ細胞調整培地（上側パネル）から精製されたＧＰ８８及び昆虫細胞で発現された組換えＧＰ８８（下側パネル）の増加する濃度の存在下でＣ５７ＭＧ細胞を培養して、マウス乳房上皮細胞系Ｃ５７ＭＧの増殖に対する増加する濃度のＧＰ８８の増殖刺激効果を実証した。
【００６７】
ＩＧＦ−１オートクリン産生及び増加した悪性の間の相関は、膠芽細胞腫、奇形癌、及び乳癌では十分に確立されている。これらの癌では、ＧＰ８８発現も、非腫瘍形成ヒト線維芽細胞及び他のヒト細胞系と比較したときにヒト腫瘍中で高い。ＧＰ８８は、乳癌細胞の増殖を促進する。
【００６８】
抗ＧＰ８８抗体
本発明は、ＧＰ８８の増加した発現に関連する疾患の治療及び予防用組成物を提供する。これは、ＧＰ８８の増加した反応に関連する疾患の治療及び診断にも適用される。本発明の組成物には、ＧＰ８８の生物活性を中和する抗ＧＰ８８抗体が含まれる。
【００６９】
本発明は、ＧＰ８８のエピトープに特異的な抗体、並びに細胞、細胞若しくは組織抽出物、培地、又は生物液（例えば、全血、血清、血奬、リンパ、及び尿）中におけるＧＰ８８分子、その機能性誘導体、又は異なる動物種由来の同族体の存在を検出するためあるいは量又は濃度を測定するためのそのような抗体の使用にも関する。さらに、抗ＧＰ８８抗体を用いて、特定部位へ細胞毒性分子を標的化することができる。
【００７０】
抗体生成のための抗原として使用するため、天然で産生されたあるいは組換え体又はその機能性誘導体中で発現された少なくとも９個のアミノ酸を有することが好ましいＧＰ８８タンパク質を得て、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の産生のため動物を免疫処置（immunize）に用いる。抗体が分子と反応することによって該分子が抗体と結合することが可能である場合、抗体は分子を結合できると言う。特異的反応とは、抗原がその対応する抗体と選択性の高い形式で反応し、他の抗原によって生じ得る多数の他の抗体と反応しないことを示すことを意味する。
【００７１】
本明細書中の抗体との用語には、ヒト及び非ヒトポリクローナル抗体、ヒト及び非ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体（抗ＩｄＡｂ）、並びにヒト化抗体が含まれるが、限定するものではない。ポリクローナル抗体は、抗原で免疫処置された動物の血清又は鶏卵由来の抗体分子の異種集団である。モノクローナル抗体（「ｍＡｂｓ」）は、特異的抗原に対する抗体の実質的に同種の集団である。ｍＡｂｓは、当業者に既知の方法によって得ることができる（米国特許第４、３７６，１１０号）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びそのサブクラスのいずれも含む免疫学的クラスのいずれであってもよい。ＧＰ８８に対するヒト及び非ヒト抗体を産生するハイブリドーマをin vitro又はin vivoで培養することができる。多量のｍＡｂｓの産生のため、in vivoは現在好ましい産生方法である。簡単に言えば、個々のハイブリドーマから得られる細胞をプリスタンプライム化（primed）Ｂａｌｂ／ｃマウス又はヌードマウスに腹腔内注射し、高濃度の所望のｍＡｂｓを含有する腹水液を産生させた。当業者に周知である標準のクロマトグラフィー方法を用いて、腹水液又は培養物上清からｍＡｂｓを精製することができる。
【００７２】
ヒトＧＰ８８に対するヒトモノクローナルＡｂは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを免疫処置することによって調製することができる。トランスジェニック動物から得たリンパ球を用いることによって産生されるハイブリドーマは、マウス免疫グロブリンの代わりにヒト免疫グロブリンを産生する。
【００７３】
ほとんどのモノクローナル抗体はマウス供給源及び他の非ヒト供給源由来であるので、それらの臨床的有効性は、ヒトに投与される齧歯類ｍＡｂｓの免疫原性、エフェクター機能の動員が弱いこと、及び血清からの急速な排泄のため制限され得る。これらの問題を回避するため、マウス抗体の抗原結合特性をヒト化と呼ばれるプロセスによってヒト抗体に付与することができる。ヒト化抗体は、ヒト抗体骨格に移植される（grafted）親マウスｍＡｂの６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）についてのアミノ酸配列を含有する。ヒト化抗体中の非ヒト配列の含量が低いこと（約５％）は、ヒトにおける免疫原性の減少及び血清半減期の延長の双方に有効であることが証明された。モノクローナル抗体のヒト化のために一価ファージディスプレイ及びコンビナトリアルライブラリー戦略を用いたものなどの方法は、現在、種々の抗体のヒト化に広く適用され、当業者に既知である。上記のトランスジェニック動物により生成されたこれらのヒト化抗体及びヒト抗体は、限定するものではないが癌を含むいくつかの疾患にとって治療上非常に有用である。
【００７４】
当該技術分野で周知であるドットブロット及び標準の免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）を含む任意数の免疫測定法により、ＧＰ８８の抗体の存在についてハイブリドーマ上清及び血清をスクリーニングする。一度、上清が対象の抗体を有すると同定された場合、それをウエスタンブロッティングによってさらにスクリーニングして、抗体が結合する抗原のサイズを同定する。当業者は、所望のポリクローナル又はｍＡｂを得るために、如何にして過度の実験なしにそのようなハイブリドーマの調製及びスクリーニングをするかを理解するであろう。
【００７５】
キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分を有している。例えば、キメラ抗体は、マウスｍＡｂから得られる可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有していてもよい。キメラ抗体及びその作成方法は当業者に既知である。
【００７６】
したがって、ＧＰ８８に対して生じたｍＡｂｓを用いて、好適な動物でヒト及び非ヒト抗ＩｄＡｂｓを誘発することができる。そのような免疫処置マウスから得た脾臓細胞を用いて、ヒト又は非ヒト抗ＩｄｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマを産生することができる。さらに、抗ＩｄｍＡｂｓをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体とカップリングして、追加のマウスを免疫処置することができる。これらのマウスから得た血清は、ＧＰ８８ポリペプチドエピトープに特異的な元来の（original）ｍＡｂの結合特性を有するヒト又は非ヒト抗抗ＩｄＡｂを含有する。したがって、抗ＩｄｍＡｂｓは、評価されるエピトープと構造的に類似した自身のイディオタイプエピトープ又はイディオタイプを有する。
【００７７】
抗体との用語は、完全体の分子及び抗原に結合することができるそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２など）の双方を含むことも意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全体の抗体のＦｃフラグメントを欠き、より速やかに循環から除かれ、完全体の抗体よりも少ない非特異的組織結合性を有することができる。そのようなフラグメントは、典型的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生ずる）及びペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生ずる）などの酵素を用いたタンパク質分解性の切断によって産生される。完全体の抗体分子について本明細書中に記載された方法に従って、本発明に有用であるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２並びに抗体の他のフラグメントをＧＰ８８の検出又は定量化及びＧＰ８８発現に関連する病理状態の治療に用いることができることは明らかである。
【００７８】
本発明によれば、ＧＰ８８活性をin vitroで中和する抗体を用いてＧＰ８８活性をin vivoで中和し、増加したＧＰ８８発現又はＧＰ８８に対する増加した反応に関連する疾患を治療することができる。増加したＧＰ８８発現に関連する疾患を患った被検体、好ましくはヒト被検体をＧＰ８８に対する抗体で治療する。そのような治療は、他の抗癌又は抗ウイルス療法と併用して行うことができる。典型的な処方計画は、１週間又は数週間にわたり及び約１〜６ヶ月の間を含む期間にわたりＧＰ８８に特異的な抗体を有効量投与することを含む。本発明の抗体は、その意図する目的を達成する任意の手段によって投与することができる。例えば、投与は、限定するものではないが皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、及び／又は経口を含む種々の経路によることができる。非経口投与は、ボーラス注射又は長期にわたる徐々の灌流（gradual perfusion）によることができる。非経口投与用製剤は、当該技術分野で既知の助剤又は賦形剤を含むことができる無菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。錠剤又はカプセル剤などの医薬組成物は、日常的な方法に従って調製することができる。投与量は、患者の年齢、性別、及び体重、在る場合には併用治療の種類、治療の頻度、並びに所望する効果の性質に拠ると理解される。以下に提供する有効用量の範囲は本発明を限定することを意図するものではなく、好ましい用量範囲を単に示しているだけである。しかしながら、最も好ましい投与量は、当業者によって理解され、かつ、決定される通り、個々の被検体に応じて合わせたものである。各治療に必要な全用量を多数回投与によりあるいは単回投与で投与することができる。有効量の抗体は、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。抗体を単独であるいは同じ疾患に関する他の治療薬と組み合わせて投与することができる。
【００７９】
本発明によれば、中和抗体に関して、たとえＧＰ８８発現の変化があることが必要ではなくても、ＧＰ８８の細胞表面受容体の過剰発現があって今度はこのことが増加した生物活性を生ずる場合、又はシグナル伝達経路が常に「作動している（turned on）」であるとの事実に至るＧＰ８８シグナル伝達経路又は受容体の変化がある場合を含む、ＧＰ８８生物活性を阻害することが必要となるすべての治療の場合において、ＧＰ８８中和抗体を用いることができる。成長因子に対する及び成長因子受容体に対する中和抗体を用いて、増殖がこの成長因子に依存している細胞の増殖を阻害することに成功している。これは、ヒト乳癌細胞中のＩＧＦ−Ｉ受容体及び肺癌でのボンベシンの場合にそうであった。ＧＰ８８に対する抗体を用いて、限定するものではないが、毒素、オンコトキシン（oncotoxins）、マイトトキシン（mitotoxins）、及び免疫毒素、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの細胞毒性試薬などの化合物を、ＧＰ８８を発現する細胞又はＧＰ８８に反応性である細胞へそれらを特異的に標的化するために送達することもできる。
【００８０】
抗原によるＧＰ８８に対する中和抗体の生成を可能とする一領域は、マウスＧＰ８８中のＫ１９Ｔ、及び６ｋＤａのエピセリン／グラヌリンの繰り返し内に位置せずこれらの繰り返しの間に位置している、具体的には可変(variant)領域（図１０を参照のこと）とみなされるものの中のグラヌリンＡ（エピセリン１）及びグラヌリンＣの間に位置しているヒトＧＰ８８中のＥ１９Ｖとして定義される１９個のアミノ酸領域である。理論に拘束されることを望むものではないが、ＧＰ８８の生物活性に重要な領域はエピセリンの繰り返しの外部に在ると信じられている。
【００８１】
本発明に有用である抗体又は抗体のフラグメントを用いて、定量的又は定性的にＧＰ８８タンパク質を発現する細胞の存在を検出することもできる。これは、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、又は蛍光測定による検出を伴った蛍光標識抗体を用いた免疫蛍光法技術によって成すことができる（以下を参照のこと）。本発明の抗体及びポリペプチドの反応は、当該技術分野で周知の免疫測定法法によって検出することができる。
【００８２】
本発明の抗体は、組織試料、生検、及び生物液中のＧＰ８８タンパク質のインサイチュー（in situ）検出のために、光学顕微鏡法、免疫蛍光法、又は免疫電子顕微鏡法などで組織学的に用いることができる。インサイチュー（in situ）検出は、患者から組織学的被検物を取り出し、適切に標識した本発明の抗体を適用することにより成すことができる。抗体（又はフラグメント）は、標識抗体（又はフラグメント）を生物試料に付与又はオーバーレイすることによって提供されることが好ましい。そのような手順を用いることにより、ＧＰ８８タンパク質の存在のみならず検査組織でのその分布又は生物液中での濃度も決定することが可能である。本発明を用いるとき、そのようなインサイチュー（in situ）検出を行うために非常に種々の組織学的方法（染色手順など）を改変することができることを当業者は容易に理解することができる。
【００８３】
ＧＰ８８のアッセイは、典型的には、ＧＰ８８タンパク質を同定することが可能な検出できるように標識した抗体の存在下で生物液、組織抽出物、新たに採取され若しくは培養された細胞、又はその培地などの生物試料をインキュベーションする工程、及び当該技術分野で周知の多数の技術で抗体を検出する工程を含む。
【００８４】
生物試料をニトロセルロースなどの固相支持体若しくは担体、又は細胞若しくは細胞粒子若しくは可溶性タンパク質を固定化する他の固相支持体で処理することができる。次いで、支持体を洗浄し、続いて検出可能に標識した抗ＧＰ８８抗体で処理する。これに続いて支持体を洗浄して未結合の抗体を除去する。次いで、該支持体上の結合標識の量を慣用の手段によって検出することができる。固相支持体とは、限定するものではないが、ガラス、ポリスチレンポリプロピレン、ナイロン、改質セルロース、又はポリアクリルアミドなどの抗原又は抗体を結合することができる任意の支持体を意図する。
【００８５】
ＧＰ８８タンパク質に対する所与の多くの抗体の結合活性を周知の方法に従って決定することができる。当業者は、日常的な実験を用いることにより、各決定に対する有効な（operative）及び最適なアッセイ条件を決定することができる。
【００８６】
ＧＰ８８タンパク質又はその機能性誘導体の検出及び該タンパク質に特異的な抗体の検出は、酵素結合免疫測定法（ＥＩＡ）又は放射線免疫測定法（ＲＩＡ）などの当該技術分野で周知である種々の免疫測定法によって成すことができる。そのようなアッセイは当該技術分野で周知であり、当業者は本発明の抗ＧＰ８８抗体及びＧＰ８８タンパク質を用いてそのようなアッセイを如何にして実施するかを容易に理解することができる。
【００８７】
そのような免疫測定法は、血清又は他の生物液中及び組織、細胞、細胞抽出物、又は生検中のＧＰ８８タンパク質の検出及び定量化に有用である。好ましい実施態様において、癌又はＧＰ８８の増加した発現に関連する他の疾患を診断するための手段として、組織被検物中のＧＰ８８濃度を測定する。別の好ましい実施態様において、生物液試料中のＧＰ８８濃度を用いて、患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるか又は反応しているかを決定する。
【００８８】
ある種のタイプの癌（例えば、乳癌）の存在及び悪性度は、ＧＰ８８タンパク質のレベルの増加に「比例する」と言う。本明細書中で用いる「比例する」との用語は、タンパク質のレベルと癌の悪性特性との間の、直線的な又は一定の関係に限定されることを意図しない。本明細書中に用いる「比例する」との用語は、増加したＧＰ８８タンパク質のレベルは、当業者が容易に決定することができるタンパク質の濃度範囲において、癌又はＧＰ８８の増加した発現に関連する他の疾患の悪性特性の様相、再発、又は提示と関連することが示されることを意図している。
【００８９】
本発明の別の実施態様は、薬物又は薬剤（agent）のＧＰ８８の発現又は産生を阻害する能力を測定することによる抗癌又は抗ウイルス薬物又は剤の効力の評価に関する。本発明の抗体は、該抗体を用いて上記の免疫測定法の１つでＧＰ８８タンパク質の量を決定することができるという点で、抗癌又は抗ウイルス薬物の評価方法に有用である。あるいは、産生されたＧＰ８８タンパク質の量を本明細書中で記載した生物アッセイ（細胞増殖アッセイ）によって測定する。より正確な評価のために生物アッセイ及び免疫測定法を組み合わせて用いることができる。
【００９０】
追加の実施態様は、好ましくはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを用いて、組織又は生物液中のＧＰ８８又はその機能性誘導体をコードする存在しているｍＲＮＡ配列の量を測定することに基づいた、癌又はＧＰ８８発現の増加に関連する他の疾患の診断用アッセイに関する。ある種の癌の存在及びその悪性度は、存在するそのようなｍＲＮＡの量に比例する。そのようなアッセイでは、ｍＲＮＡの供給源は生検及び周囲組織であることができる。ｍＲＮＡの量を測定するための好ましい技術は、相補性塩基配列のＤＮＡを用いたハイブリダイゼーションアッセイである。
【００９１】
別の関連する実施態様は、抗ＧＰ８８中和抗体による治療によって増殖又は他の生物活性が阻害されるかを組織生検について測定することに基づいた、癌又はＧＰ８８反応の増加に関連する他の疾患の診断用アッセイに関する。
【００９２】
別の関連する実施態様は、ＧＰ８８ｍのＲＮＡの発現阻害に対する薬剤の効果を測定する工程を含む、抗癌又は抗ウイルス薬物又は薬剤の効力の測定方法である。同様に、そのような方法を用いて、ＧＰ８８のｍＲＮＡの産生を阻害する該薬剤の能力を測定することによってＧＰ８８拮抗剤の効力を同定又は評価することができる。
【００９３】
核酸検出アッセイ、特にハイブリダイゼーションアッセイは、サイズ、配列、又は制限エンドヌクレアーゼによる消化に対する感受性など、核酸分子の任意の特徴に基づくことができる。検出が観察者に報告又は信号伝達される形式を変えることによって、そのようなアッセイの感度を増加することができる。酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識、化学標識、及び修飾塩基を含む非常に種々の標識が多く開発され、当業者によって用いられている。
【００９４】
核酸の検出感度の制限を克服する一方法は、アッセイを行なう前に核酸を選択的に増幅することである。この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」又はＰＣＲと称されている（米国特許第４，６８３，２０２号及び４，５８２，７８８号）。ＰＣＲ反応は、その配列が先に精製されてなく、かつ、特定の試料中で単に単一のコピーで存在していたとしても、特定の核酸配列の濃度を選択的に増加する方法を提供する。
【００９５】
生物液中のＧＰ８８の検出
本発明の好ましい実施態様は、生物液中のＧＰ８８を検出する方法及びキットに関する。上記の通り、癌細胞は高いレベルのＧＰ８８を発現する。本発明は、ＧＰ８８を約０．１ｎｇ／ｍｌの低さの濃度において生物液中で検出することができることを実証している。上記の通り、ＧＰ８８は癌細胞中で過剰発現し、高いレベルのＧＰ８８は腫瘍形成を示している。典型的には、腫瘍マーカーの存在を検出するためには組織試料又は生検が必要である。例えば、乳癌患者には、特定の腫瘍マーカーが存在しているかの決定の検査のために乳房組織試料を取り出すため、しばしば針生検手順が施される。生検手順は、任意の外科手術手順と同様に、患者への増加した危険性と関連している。生検手順は、特に、腫瘍形成の増加した危険性に関連している。
【００９６】
組織生検手順と異なり、血液サンプリングは、必要な場合には患者が行なうことができる日常的かつ安全な手順である。例えば、小さな滅菌ランセットを用いて患者の指先を穿刺し、わずかな試料血液を得ることができる。血液試料を、血清又は血奬分画を単離するために任意の好適な手順によって処理することができる。あるいは、全血試料を用いることができる。抗ＧＰ８８抗体を利用したアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて血清試料中のＧＰ８８の存在を検出し、その量を定量化することができる。血液サンプリングによって組織生検に関連する危険性が回避される。さらに、規則正しく（例えば、毎週の検査）同じ患者から血液試料を得ることにより、長期にわたり、患者のモニタリングによって血清中のＧＰ８８のレベルを検出することが可能となる。ＧＰ８８のレベルが増加した場合、有意な腫瘍の増殖が起こる前に、医師はそれに応じて患者を治療することができる（例えば、ＧＰ８８アンタゴニストを投与する）。
【００９７】
生物液中のＧＰ８８濃度測定方法を実施する際には、生物液（例えば、全血、血奬、血清、リンパ、唾液、及び尿）を抗ＧＰ８８抗体と接触させ、ＧＰ８８の濃度を測定する。例えば、約０．１ｎｇ／ｍｌの低さの濃度でＧＰ８８を検出することができる。本発明の別の実施態様において、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの生物液の濃度でＧＰ８８を検出することができる。上記の通り、抗ＧＰ８８抗体はＧＰ８８結合することができ、試料中のＧＰ８８の量を決定するのに用いることができる。生物液試料中のＧＰ８８の濃度の測定に用いることができる抗ＧＰ８８抗体の例には、ＡＴＣＣ受託番号６Ｂ３ＰＴＡ−５２６２及び６Ｂ２ＰＴＡ−５２６１（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、マナッサス（Manassas）、ＶＡ２０１１０）のハイブリドーマ細胞系から産生される抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
ＥＬＩＳＡは、試料中の抗原量の定量化のための速やかで、高感度で、かつ再現性のあるアッセイである。「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡでは、抗原（例えば、タンパク質）に結合又は「捕捉」する一次抗体及び同様に抗原に結合する標識した二次抗体を利用する。検出部分に対する基質を添加することによって、試料中に存在する抗原の量に比例するシグナル（例えば、色の変化又は放射能）が生ずる。代表的なサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、一次抗体をマイクロタイタープレートのウェルなどの支持体に吸着させる。抗原を含有する試料を付着した一次抗体とともにインキュベーションし、抗原を抗体に結合させる。次に、検出分子（例えば、酵素、放射性核種）で標識した二次抗体も抗原に結合させる。標識の例には、アルカリホスファターゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼが含まれる。あるいは、二次抗体は標識せずに、三次抗体（例えば、標識した抗ＩｇＧ抗体）をアッセイで用いることもできる。標識した三次抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の定常領域に結合する。酵素に対する基質（例えば、２，２−アゾ−ビス（３−エチルベンゼンチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、及び３，３，−５，５−テトラメチルベンジジン基剤（base）（ＴＭＢ））を添加することによって、試料中に存在する抗原の量に比例して試料溶液中の色の変化が生ずる。色の変化は、分光光度計を用いて、酵素標識によって引き起こされる色の変化を検出するのに好適な波長で（例えば、ＴＭＢを基質として用いて６２４ｎｍ）検出することができる。
【００９９】
あるいは、二次抗体又は三次抗体を放射能部分（例えば、ｌ２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２Ｃ）によって標識することができる。放射能検出器（例えば、ガンマ計数管）を用いて、抗原結合後に二次抗体より発せられる放射能を測定することができる。放射能レベルは、試料中に存在する抗原量に比例する。さらに別の代替例において、生物液試料中のＧＰ８８レベルをウエスタンブロット手順を用いて決定することができる。代表的なウエスタンブロット手順では、電流（例えば、２０ｍＡ）が施されるＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に生物液試料をローディングして、生物液中試料のタンパク質を分子量に応じて分離する。タンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、標識した抗ＧＰ８８抗体とともにインキュベーションする。抗ＧＰ８８抗体を酵素で標識する場合、ニトロセルロースメンブレンをニトロセルロースメンブレン上に位置するＧＰ８８タンパク質バンドの変色を引き起こす酵素に対する基質に曝す。試料中のＧＰ８８量は、色の変化に比例する。
【０１００】
本発明の一実施態様において、ハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６２）によって産生されるＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３をサンドイッチＥＬＩＳＡでの一次抗体として用いる。ＧＰ８８に対して生じた種々の抗体をＥＬＩＳＡで用いて、ＧＰ８８（例えば、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６２、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６１、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５８９、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５９３、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２５９、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６０、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５９１のハイブリドーマ細胞系からそれぞれ産生されるＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３、６Ｂ２、２Ａ５、４Ｄ１、３Ｆ５、５Ｂ４、３Ｆ８）を検出することができる。セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識したＧＰ８８抗体を二次抗体として用い、ＴＭＢを基質として用いることができる。あるいは、免疫グロブリンの定常領域に結合することができる標識した抗体をＥＬＩＳＡでの二次抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体）として用いることができる。既知量のＧＰ８８のタンパク質（０．１、２、５、１０、２０ナノグラム）を担体（例えば、緩衝溶液）中に含有する試料を用いて、ＥＬＩＳＡの結果に基づいた標準曲線を作成することができる。試料の光学濃度を試料中の既知量のＧＰ８８に対してプロットし、標準曲線を作成することができる（例えば、図１６）。未知試料中のＧＰ８８の濃度を、未知試料の光学濃度を測定し、ＧＰ８８濃度を計算するために標準曲線を用いることによって決定できる。
【０１０１】
サンドイッチＥＬＩＳＡの代表的なプロトコルには、以下の工程が含まれる。
【０１０２】
（１）一次抗体を含有する溶液をマイクロタイタープレートのウェルの底に添加する（例えば、２０ｍｇ／ｍｌの抗体を含有する５０マイクロリッターの抗体溶液）。
【０１０３】
（２）マイクロタイタープレートを４℃で一晩インキュベーションして、抗体をウェルに完全に結合させる。
【０１０４】
（３）ウェルを緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で洗浄する。
【０１０５】
（４）ウェルを遮断用緩衝液（例えば、ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で飽和することによって非特異的タンパク質結合を遮断する。
【０１０６】
（５）緩衝溶液でウェルを洗浄する。
【０１０７】
（６）抗原を含有する溶液を添加し、マイクロタイタープレートを室温で少なくとも２時間インキュベーションする。
【０１０８】
（７）緩衝溶液でウェルを洗浄する。
【０１０９】
（８）標識した二次抗体を添加し、マイクロタイタープレートを室温で少なくとも２時間インキュベーションする。
【０１１０】
（９）緩衝溶液でウェルを洗浄する。
【０１１１】
（１０）緩衝溶液で希釈された所望の基質を添加して、反応が起こるのに十分な時間を許容する。
【０１１２】
（１１）得られた基質溶液の光学濃度を基質に対して適切な波長においてＥＬＩＳＡ読み取り器で読み取る。
【０１１３】
図１６は、血清生物液中のＧＰ８８の濃度の決定に用いることができる代表的な曲線を示している。既知量の組換えＧＰ８８タンパク質を含有する試料を調製して、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。試料の光学濃度を既知量ＧＰ８８のタンパク質に対してプロットした。図１６は、生物液試料のＯＤ（光学濃度）（ｙ軸）及びＧＰ８８の濃度（ｘ軸）の間の直線的な関係を示している。上記の好適な検出技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット）において抗ＧＰ８８抗体を用いて生物液試料中のＧＰ８８の濃度を決定することができる。一実施態様において、生物液試料の光学濃度を測定し、測定した光学濃度を標準曲線（例えば、図１６）と比較することによって生物液試料中のＧＰ８８の濃度を決定する。例えば、図１６の曲線を用いて、抗ＧＰ８８抗体と接触させ、かつ、免疫測定法を施した生物液試料の光学濃度が０．６である場合、生物試料液中のＧＰ８８濃度は１５ｎｇ／ｍｌであろう。
【０１１４】
健康なヒトでのＧＰ８８の血清濃度は、健康なヒトでは約２３ｎｇ／ｍｌ及び４４ｎｇ／ｍｌの間で変動する。健康なヒトボランティアから得た血奬中のＧＰ８８レベルの測定では、同様の結果が示された。ヒト乳癌患者では、血清中で高いレベルのＧＰ８８が示された。２０人の乳癌患者のうち３人で、高いレベルのＧＰ８８（４９、５１、及び５６ｎｇ／ｍｌ）が示された。しかしながら、治療に対して何ら反応を示さない進行性の疾患（例えば、転移性）を有する患者は、劇的に増加したＧＰ８８血清レベルを長期にわたって有していた（２７〜２３３ｎｇ／ｍｌ、６ヶ月）。抗腫瘍形成治療に反応性でない進行した（advanced）疾患を有する別の患者は、２００２年３月２１日に１５８ｎｇ／ｍｌのＧＰ８８血清濃度を有し、２００２年５月２３日に１４８ｎｇ／ｍｌのＧＰ８８血清濃度を有していた。非転移性乳癌であると最初診断された患者及び寛解中の患者は、正常範囲内のＧＰ８８血清濃度を有していた。したがって、高いＧＰ８８血清濃度（例えば、約４０〜５０ｎｇ／ｍｌ）は腫瘍形成を示している。非常に高いＧＰ８８血清レベル（例えば、約１００〜３００ｎｇ／ｍｌ）は、進行性の疾患であり、かつ、抗腫瘍形成治療に抵抗性であることを示している。
【０１１５】
本発明の別の実施態様において、第１の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、第２の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、第２の生物液試料中の測定されたＧＰ８８タンパク質レベルが第１の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルよりも腫瘍形成能を示すのに十分な程に高い量であるかを判定することによって腫瘍形成を診断する工程を含む、腫瘍形成の診断方法を提供する。最初の生物液試料は、癌又は細胞増殖に関連する疾患を有すると疑われる患者から採取することができる。最初の生物液試料中のＧＰ８８のレベルを測定し、異なる時間に採取した第２の生物液試料中のＧＰ８８のレベルと比較することができる。生物液試料を規則正しい間隔で採取し、後の試料中の測定されたＧＰ８８濃度を第１の試料中のＧＰ８８レベルと比較するすることができる。結果が長期にわたって生物液中のＧＰ８８のレベルの増加を示す場合、医師は腫瘍の増殖を減少又は排除するために患者の治療を開始又は改変することができる。
【０１１６】
本発明は、抗腫瘍形成治療を受けている患者から得た生物液試料中のＧＰ８８の濃度を測定する工程を含み、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌのＧＰ８８の濃度は患者が抗腫瘍形成治療に反応しないことを示す、患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるか又は反応しているかの判定方法も提供する。「抗腫瘍形成治療」という用語は、癌又は増殖に関連する疾患を治療する目的のための任意の薬剤、薬物、治療、又は薬剤、薬物、若しくは治療薬の投与方法をいう。抗腫瘍形成治療の例には、抗エストロゲン治療、抗腫瘍抗体（例えば、抗ＧＰ８８抗体）の使用、アンチセンス療法（例えば、抗ＧＰ８８核酸）、化学療法、放射線療法、及び遺伝子治療が含まれる。抗腫瘍形成治療を受けている患者のＧＰ８８血清濃度を、規則正しい間隔で（例えば、毎日、毎週、毎月）血清試料を分析することによってモニタリングすることができる。少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌのＧＰ８８血清レベルは、患者が抗腫瘍形成治療に反応性でないか又は反応していないことを示すであろう。
【０１１７】
ある種の抗腫瘍形成治療は、患者に対して望ましくない副作用又はさらなる危険性を有する。例えば、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン）による乳癌の治療又は予防は、卵巣癌の危険性の増加と関連している。高いＧＰ８８レベルは、患者が抗エストロゲンによる治療に反応しないことを示している。患者が高いＧＰ８８レベルを有する場合（例えば、約１００ｎｇ／ｍｌより大きい）、患者は抗エストロゲン治療に反応性でない可能性が高く、抗エストロゲン治療が有するさらなる危険性はいずれの利益よりも勝っているであろう。化学療法も、嘔気、衰弱、脱毛、食欲喪失などの多くの望ましくない副作用と関連している。患者が特定のタイプの化学療法に反応しない可能性が高い場合、より少ない副作用を有する抗腫瘍形成治療がより効果的であり、患者にさらなる外傷を与えない。本発明は、患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるか又は反応しているかの判定に有用である。
【０１１８】
本発明の別の実施態様は、生物液試料中のＧＰ８８濃度を測定する工程、及び生物液試料中のＧＰ８８濃度が約４０〜５０ｎｇ／ｍｌである場合に癌を治療又は予防するのに十分な量の抗腫瘍形成治療を投与する工程による、患者における癌再発の治療又は予防方法を提供する。先に記載して示した通り、約４０ｎｇ／ｍｌ以上のＧＰ８８血清レベルを有する患者は癌であると診断されるか、有意に高い癌発達の危険性を有する。抗腫瘍形成治療（例えば、抗エストロゲン治療、抗腫瘍抗体療法、アンチセンス治療、化学療法、放射線療法、及び遺伝子治療）を癌であると診断されたか、高い癌発達の危険性があると診断された患者に疾患を予防又は治療するために投与することができる。
【０１１９】
抗エストロゲン治療は、腫瘍の成長を予防又は治療する目的での抗エストロゲン剤の投与に関する。抗エストロゲン剤の例には、タモキシフェン及びラロキシフェンが含まれる。クエン酸タモキシフェン（「タモキシフェン」）は、強力な抗エストロゲン及び抗新生物特性が実証された、乳癌を患った患者によく処方される非ステロイド抗エストロゲンである。米国特許第４，５３６，５１６号を参照されたい。タモキシフェンは、エストロゲン受容体への結合に関してエストロゲンと競合するエストロゲン受容体アンタゴニストである。他の抗エストロゲンには、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤（例えば、アリミデックス（Arimidex（登録商標）（アナストロゾール）、フェメラ（Femera）（登録商標））、及びエストロゲン受容体ダウンレギュレート調節剤（down-regulators）（例えば、ファスロデックス（Faslodex）（登録商標））が含まれる。タモキシフェンの抗エストロゲン効果は、標的組織中の結合部位に関してエストロゲンと競合する能力に関するものであってもよい。アロマターゼ阻害剤などの他の抗エストロゲンは、利用可能なエストロゲンの量を阻害又は減少させる。
【０１２０】
抗腫瘍抗体（例えば、抗ＧＰ８８抗体、ヘルセプチン）を患者に投与して、腫瘍を起こす又は促進するタンパク質又はその他の分子の活性を阻害することができる。例えば、抗ＧＰ８８抗体を投与してＧＰ８８の活性を阻害することができる。抗腫瘍抗体を上記の種々の経路（経口、注射、非経口）で患者に投与することができる。
【０１２１】
アンチセンス治療とは、腫瘍の複製を促進する遺伝子を阻害するため、あるいは腫瘍を促進するタンパク質の翻訳を阻害するため、患者へアンチセンス核酸を投与することをいう。アンチセンス治療の例には、抗ＧＰ８８アンチセンス核酸の投与が含まれる。アンチセンス核酸は、組織に直接注射することによって投与することができ、あるいは静脈内又は非経口投与することができる。生体外（ex vivo）技術を用いてアンチセンス核酸を細胞に投与することができる。腫瘍形成細胞又は正常細胞を被検体（例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又はニワトリ）から取り除いて、培養物中で増殖させることができる。細胞は、アンチセンス核酸をコードするＤＮＡ又はＲＮＡでトランスフェクションされ、再び被検体に導入され、アンチセンス核酸を産生して、腫瘍細胞増殖を阻害することができる。
【０１２２】
「遺伝子治療」とは、腫瘍の増殖を予防又は治療するために、抗腫瘍タンパク質をコードする核酸を患者へ投与することをいう。アンチセンス核酸と同様に、直接注射することにより、あるいは上記のｅｘ ｖｉｖｏ技術を用いて、遺伝子治療用の核酸を投与することができる。遺伝子治療用の核酸でトランスフェクションされた細胞は、抗腫瘍タンパク質を産生して、腫瘍の増殖を阻害又は予防する。
【０１２３】
化学療法とは、一般的に、化学化合物又は化学化合物の組み合わせ（例えば、メトトレキセート）を用いた癌の治療をいう。化学療法剤の特定の組み合わせは、特定の腫瘍タイプ及び疾患の段階に依存する。放射線療法とは、腫瘍細胞を直接的に殺すための放射線（例えば、ガンマ照射）の使用をいう。用いられる照射の量及びタイプも、特定の腫瘍タイプ及び疾患の段階に依存する。
【０１２４】
本発明は、腫瘍形成診断用及び患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるか又は反応しているかを決定するためのキットも提供する。そのようなキットは、容器及びＧＰ８８検出用の化合物（例えば、抗ＧＰ８８抗体又は抗体フラグメント）を含有することが好ましい。抗ＧＰ８８抗体又は抗体フラグメントを、好適な検出方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫測定法）で用いるために標識することができる（例えば、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識、及び化学標識）。一実施態様において、キットは、少なくとも１種の一次抗体（例えば、抗ＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３）、少なくとも１種の標識した二次抗体（例えば、ＨＲＰなどの検出酵素で標識した抗ヒトＧＰ８８ポリクローナル抗体）、及び少なくとも１種の基質（例えば、ＴＭＢ）を含有する。あるいは、キットは、酵素で標識した二次抗体の代わりに放射性標識した二次抗体を含有することができる。キットは、検出アッセイを行うための使い捨て型補給品（例えば、マイクロタイタープレート、ピペット）も含有することができる。
【０１２５】
ＧＰ８８アンチセンス成分
本発明は、ＧＰ８８アンチセンス成分も提供する。細胞中でのアンチセンスＲＮＡの構成性発現は２０種より多くの遺伝子の発現を阻害することが示され、列記は増え続けている。アンチセンス効果の可能な機構は翻訳の遮断又はスプライシングの妨害であり、双方ともin vitroで観察されている。スプライシングの妨害によって、保存性が低いイントロン配列が使用されることとなり、したがってより大きな特異性が生じ、ある種の遺伝子産物の発現は阻害されるが別の種ではそのホモログは阻害されないこととなる。
【０１２６】
アンチセンス成分との用語は、ｍＲＮＡの翻訳が阻害されるようにアンチセンスＲＮＡ及びｍＲＮＡの間の分子ハイブリダイゼーションを生ずるのにアンチセンスＲＮＡが特異的である特定のｍＲＮＡ分子に十分に相補的である、ＲＮＡ配列及び該ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列に対応する。そのようなハイブリダイゼーションをin vivo条件下で行うことができる。アンチセンスＲＮＡの作用によって、細胞中での遺伝子発現の特異的阻害が生ずる。
【０１２７】
本発明によれば、ＧＰ８８ｃＤＮＡに対するＤＮＡアンチセンスで多発性骨髄腫細胞をトランスフェクションすることによって、内因性ＧＰ８８の発現が阻害され、アンチセンスｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞の腫瘍形成が阻害される。このアンチセンスＤＮＡは、作用がスプライシング、転写、又は翻訳のレベルであるかに関わらず、アンチセンスＲＮＡがＧＰ８８遺伝子（又はｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションしてＧＰ８８遺伝子発現を阻害することができるように、ＧＰ８８遺伝子に対して十分な相補性（長さ約１８〜３０ヌクレオチド）を有していなければならない。阻害の程度は、本明細書中の技術が与えられれば過度の実験なしに当業者に容易に認識でき、増殖がＧＰ８８の発現に依存した細胞の増殖を阻害するのに十分であることが好ましい。当業者は、アンチセンスＲＮＡ手法は特異的遺伝子発現を遮断するために用いられる多数の既知の機構の１つであることを十分に認識している。
【０１２８】
本発明のアンチセンス成分は、コード配列、３’又は５’非翻訳領域、又は他のイントロン配列を含む標的ＧＰ８８ｃＤＮＡのいくつかの部分のいずれとも又はＧＰ８８のｍＲＮＡとハイブリダゼーションすることができる。当業者に容易に理解される通り、本発明に必要な最小量の相同性は、好ましくは他のｍＲＮＡ分子の機能及び他の無関係な遺伝子の発現に影響を及ぼすことなしにＧＰ８８のＤＮＡ又はｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを生じ、かつ、ＤＮＡの転写又はｍＲＮＡの翻訳若しくは機能を阻害するのに十分なものである。
【０１２９】
プロモーターを含む適切な調節配列とともにアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡが配置されたレトロウイルスベクター及びプラスミドを含むベクターによる形質転換又はトランスフェクションによってアンチセンスＲＮＡが細胞に送達され、宿主細胞中でアンチセンスＲＮＡの発現が生じる。ＧＰ８８のｃＤＮＡフラグメントをアンチセンス方向で含有する種々のアンチセンス発現ベクターの安定的なトランスフェクションを行った。レトロウイルスベクターを用いてアンチセンス成分を細胞に送達することもできる。リポソームによって送達することもできる。
【０１３０】
in vivo治療用のアンチセンス技術の目的のために、現在好ましい方法は、発現ベクター中に構成されたアンチセンスｃＤＮＡフラグメントの安定的なトランスフェクションを行なうのに代えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることである。長さ１５〜３０個の塩基のサイズを有し、かつ、コード配列、３’又は５’非翻訳領域、又は他のイントロン配列を含む標的ＧＰ８８のｃＤＮＡのいくつかの部分のいずれか、又はＧＰ８８のｍＲＮＡとハイブリダイゼーション可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。ＧＰ８８に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、最も効力があるアンチセンス効果を有するものとして選択されることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の標的部位を律する要因は、オリゴヌクレオチドの長さ、結合親和性、及び標的配列への到達容易性（accessibility）に関連する。ＧＰ８８タンパク質翻訳及びＧＰ８８に関連する表現型の阻害、例えば培養物中の細胞増殖の阻害を測定することにより、配列をそのアンチセンス活性についてin vitroでスクリーニングすることができる。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＲＮＡのほとんどの領域（５’及び３’非翻訳領域、ＡＵＧ開始部、コード領域、スプライス接合部、及びイントロン）を標的にすることができることは既知である。
【０１３１】
好ましいＧＰ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは安定であり、ヌクレアーゼ（オリゴヌクレオチドを潜在的に分解することができる酵素）に対して高い回復力（resilience）を有し、非毒性用量でそれらを疾患組織へ運搬することを可能とする好適な薬物動態を有し、かつ、形質膜を横切る能力を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１３２】
ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。リン酸ジエステル結合の修飾及び複素環又は糖の修飾によって、効力を増加することができる。リン酸ジエステル結合の修飾に関して、ホスホロチオエートを用いることができる。Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合は、ヌクレアーゼに対してオリゴヌクレオチドを安定化し、ＲＮＡへの結合を増加すると記載されている。ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合は、リボース及びリン酸ジエステル骨格の完全な置換であり、ヌクレアーゼに安定であり、ＲＮＡに対する結合親和性を増加し、かつ、ＲＮＡｓｅＨによって開裂されない。その基本構造は、アンチセンス成分としてそれを最適化することを可能とする修飾を受け入れやすい（amenable）。複素環の修飾に関して、ある種の複素環修飾は、ＲＮＡｓｅＨ活性を妨げることなしにアンチセンス効果を増大することが証明されている。そのような修飾の例は、Ｃ−５チアゾール修飾である。最後に、糖の修飾も考慮することができる。２’−Ｏ−プロピル及び２’−メトキシエトキシリボース修飾は、細胞培養物中及びin vivoにおいてヌクレアーゼに対してオリゴヌクレオチドを安定化する。ｃ−ｒａｆ−１を標的としたこれらのタイプのオリゴヌクレオチドを用いた細胞培養物及びin vivo腫瘍実験では、効力が増大した。
【０１３３】
送達経路は、上記の基準に従って測定された最良のアンチセンス効果を提供するものである。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたin vitro細胞培養アッセイ及びin vivo腫瘍増殖アッセイによって、カチオン性リポソームによって仲介される送達、レトロウイルスベクターによって仲介される送達、及び直接的な送達が効果的であることが示された。別の可能性ある送達様式は、抗体を用いて腫瘍細胞の細胞表面マーカーを標的としたものである。ＧＰ８８又はその受容体に対する抗体は、この目的に役立つことができる。
【０１３４】
組換えＧＰ８８
本発明は、他の哺乳動物ＤＮＡ配列を実質的に有さない組換えＧＰ８８ポリペプチド又はその機能性誘導体を発現するためのＤＮＡ発現系にも関する。そのようなＤＮＡは、二重鎖又は一本鎖であることができる。ＤＮＡ配列は、好ましくは、別のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能とするために約２０個以上のヌクレオチドを有しなければならない。ＧＰ８８タンパク質又はその同族体若しくは機能性誘導体をコードする配列以外の配列とのハイブリダイゼーションが無いことによって特徴付けられるより高い特異性のハイブリダイゼーションを達成するためには、長さが少なくとも５０個のヌクレオチドが好ましい。
【０１３５】
本発明は、上記のＤＮＡ分子、発現可能なベヒクル又はベクター、及びベヒクルでトランスフェクションされた又は形質転換された、かつ、ポリペプチドを発現することができる宿主にも関する。そのような宿主は、原核生物、好ましくは細菌、又は真核生物、好ましくは酵母若しくは哺乳動物細胞であることができる。好ましいベクター系には、昆虫細胞中で発現するバキュロウイルスが含まれる。形質転換、形質導入(transduction)、トランスフェクション、感染、又は当該技術分野で既知の関連するプロセスによって、ＤＮＡを宿主生物に組み込むことができる。ＧＰ８８ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びｍＲＮＡ配列に加えて、本発明は核酸配列の発現方法も提供する。さらに、遺伝子配列及びオリゴヌクレオチドによって、本明細書中に記載されるポリペプチドＧＰ８８と配列相同性を有する追加のポリペプチドの同定及びクローニングが可能となる。
【０１３６】
発現ベクターは、（適切な転写及び／又は翻訳制御配列の存在ゆえに）ベクター中にクローニングされたＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）分子を発現することができ、それによってポリペプチド又はタンパク質を産生するベクターである。クローニングされた配列の発現は、発現ベクターが適切な宿主細胞に組み込まれたときに起こる。原核生物発現ベクターを用いた場合、適切な宿主細胞はクローニングされた配列を発現することができる任意の原核生物細胞であろう。同様に、真核生物発現系を用いた場合、適切な宿主細胞はクローニングされた配列を発現することができる任意の真核生物細胞であろう。例えば、バキュロウイルスベクターを用いて、ＧＰ８８ｃＤＮＡをクローニングし、続いて昆虫細胞中でｃＤＮＡを発現することができる。
【０１３７】
ＧＰ８８ポリペプチド又はその機能性誘導体をコードするＤＮＡ配列を、連結のための平滑末端又は付着末端、適切な末端を与える制限酵素消化、必要に応じた付着末端の充填（filling）、望ましくない接合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び的確な酵素リガーゼによる連結を含む慣用技術に従って、ベクターＤＮＡと組み換えることができる。そのような操作のための技術は（３５）で論じている。
【０１３８】
核酸分子は、該核酸分子が転写及び翻訳調節情報を含有するヌクレオチド配列を含有し、かつ、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に動作可能に結合されている場合、ポリペプチドを発現することができる。動作可能な結合とは、調節ＤＮＡ配列及び発現させたいＤＮＡ配列が遺伝子発現するような方法で結合される結合である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は生物ごとに変わってもよいが、一般には、原核生物ではプロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）及びＲＮＡに転写されたときにタンパク質合成の開始をシグナル伝達するＤＮＡ配列の双方を含有するプロモーター領域を含んでいなければならない。それらの領域は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャップ形成配列（capping sequence）、ＣＡＡＴ配列などの転写及び翻訳の開始に関与するそれらの５’非コード配列などを含む。
【０１３９】
所望する場合、タンパク質をコードする遺伝子配列に対する３’非コード領域を記載の方法（適切なｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング又はＰＣＲ増幅）によって得ることができる。この領域は、終結及びポリアデニル化などの転写終結調節配列が存在するために保持することができる。したがって、タンパク質をコードするＤＮＡ配列にもともと隣接している３’領域を保持することによって、転写終結シグナルを付与することができる。発現宿主細胞中で転写終結シグナルが与えられず、又は満足がいくほど機能的ではない場合、別の遺伝子由来の３’領域に置き換えることができる。
【０１４０】
配列間の結合の性質によって、フレームシフト変異の導入が生じず、かつ、ポリペプチド遺伝子配列の転写を指示するプロモーター配列の能力が妨げられない場合、プロモーター領域配列及びＧＰ８８コード配列などの２つのＤＮＡ配列が動作可能に結合していると言う。プロモーター配列は、原核生物性、真核生物性、又はウイルス性であることができる。好適なプロモーターは、誘導性、抑制性、又は構成的であることができる。
【０１４１】
真核生物プロモーターには、マウスメタロチオネインＩ遺伝子用プロモーター、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、遺伝子ｇａｌ４プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、及びサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれるが、限定するものではない。強力なプロモーターが好ましい。そのようなプロモーターの例は、Ｔ３、ＳＰ６、及びＴ７ポリメラーゼ、バクテリオファージラムダのＰＬプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、及びＣＭＶプロモーターを認識するものである。
【０１４２】
本発明の教示を特定の問題又は環境へ適用することは、本明細書中に含まれる技術に照らして、当業者の能力の範囲内であると理解すべきである。以下の限定するものではない実施例によって本発明をより十分に例証する。
【実施例１】
【０１４３】
生物液試料中のＧＰ８８濃度の決定
１７人の正常かつ健康なヒトボランティアから血清試料を得た。ヒト血清試料中のＧＰ８８濃度を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって３つ組で測定した。３０％グリセロール及び１％ミルク−ＰＢＳの溶液に希釈した組換えＧＰ８８から０、０．１、０．２５、０．５、１、３、１０、及び２０ｎｇ／ｍｌの濃度で標準のＧＰ８８試料を調製した。マイクロタイタープレート上の１００マイクロリットルのウェルを１ミリリットルあたり１０マイクログラムの抗ヒトＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．７８ｍｇ／ｍｌの６Ｂ３抗体）でコーティングし、４℃で一晩インキュベーションした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、続いて抗ヒトＰＣＤＧＦポリクローナル（ＩｇＧ分画）を各ウェルに３マイクログラム／ｍｌの濃度で３７℃で１．５時間添加した。各ウェルへの検出抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ヤギ−ウサギ−ＩｇＧ）の添加前に、ウェルをＰＢＳ中で洗浄した。ＴＭＢ（基質）を添加し、試料とともに１時間インキュベーションした。６２０ナノメートルの波長で設定したＥＬＩＳＡ分光計読み取り器を用いて試料の光学濃度を決定した。各試料中のＧＰ８８量（ｘ軸）に対して標準のＧＰ８８試料の光学濃度（ｙ軸）をプロットし、標準曲線を作成した（図１６）。未知試料中のＧＰ８８の濃度は、光学濃度を測定し、標準曲線（図１６）を用いてＧＰ８８濃度を決定することによって決定した。表３は、１７人の健康なヒトボランティアの各人のＧＰ８８血清試料濃度を提供するものである。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
表４は、抗腫瘍形成治療に反応しない進行した（advanced）進行性の乳癌を有する患者から採取したＧＰ８８の血清試料濃度を示している。ＧＰ８８血清濃度は、６ヶ月の期間中に２７ｎｇ／ｍｌから２３３ｎｇ／ｍｌに増加した。
【０１４６】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１Ａ】図１Ａは、１２４６、１２４６−３Ａ、及びＰＣ細胞系中のＧＰ８８タンパク質発現レベルを比較する。２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＤＭＥ−Ｆ１２培地中で細胞を培養した。抗Ｋ１９Ｔ抗体を用いた免疫沈降及びウエスタンブロット分析により、ＧＰ８８発現レベルを測定した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１２４６、１２４６−３Ａ、及びＰＣ細胞系でのＧＰ８８ｍＲＮＡ発現レベルを比較する。ＲＰＬ３２のｍＲＮＡを等量のＲＮＡローディングの内部対照として用いた。
【図１Ｃ】図１Ｃは、無血清及び血清含有培地中の１２４６細胞（左パネル）及びＰＣ細胞（右パネル）中でのＧＰ８８ｍＲＮＡの発現を比較する。結果により、１２４６細胞中でのＧＰ８８発現はウシ胎児血清の添加によって阻害されるのに対し、腫瘍形成能の高いＰＣ細胞ではそのような阻害が観察されないことが示される。
【図２】図２は、抗ＧＰ８８中和抗体の濃度の増加による、腫瘍形成能の高いＰＣ細胞の治療効果を例証している。
【図３】図３は、１０６個のアンチセンスＧＰ８８をトランスフェクションしたＰＣ細胞を皮下注射したＣ３Ｈマウス（下部）及び空のベクターをトランスフェクションした対照ＰＣ細胞を皮下注射したＣ３Ｈマウス（上部）を示している。
【図４】図４は、Ｃ３Ｈマウス腫瘍組織及び周囲正常組織中でのin vivoＧＰ８８発現レベルを示している。
【図５】図５は、エストロゲン受容体陽性及びエストロゲン受容体陰性ヒト乳癌細胞系中でのＧＰ８８ｍＲＮＡ発現レベルを示している。
【図６】図６は、マウス乳房上皮細胞系Ｃ５７の増殖に対するＧＰ８８濃度の増加の効果を示している。
【図７】図７は、サイトメガロウィルスプロモーターで制御されかつアンチセンス方向でＧＰ８８を含有する発現ベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞、及び空のベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞の増殖特性及び腫瘍形成能力を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、マウスＧＰ８８のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示している。抗ＧＰ８８抗体であるＫ１９Ｔ及びＳ１４Ｒを生じさせるための抗原として用いられるペプチド領域には下線を引いてある。ｐＣＭＶ４哺乳動物発現ベクターにアンチセンス方向でクローニングされた領域が括弧の間に示されている。
【図８Ｂ】図８Ｂは、マウスＧＰ８８のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示している。
【図８Ｃ】図８Ｃは、マウスＧＰ８８のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示している。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒトＧＰ８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示している。ｐｃＤＮＡ３哺乳動物発現系にアンチセンス方向でクローニングされた領域が括弧の間に示されている。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ヒトＧＰ８８の推定アミノ酸配列を示している。抗ヒトＧＰ８８中和抗体を生成するための抗原として用いるＥ１９Ｖ領域に下線を引いてある。それは、マウスＳ１４Ｒ領域に相当する領域Ａ１４Ｒも示している。
【図１０】図１０は、グラヌリンｇ、ｆ、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄ、及びｅ（右側）として定義される７つと半分の繰り返しを示すように並べたマウスＧＰ８８のアミノ酸配列を示している。この図示により、抗ＧＰ８８中和抗体を生成するためのＧＰ８８抗体を生じさせるのに用いる領域Ｋ１９Ｔ及びＳ１４Ｒが変異体領域とみなされるものの中の２つのエピセリン／グラヌリンの繰り返しの間に見出されることが示される。Batemanら（６）による繰り返しのグラヌリン分類を右側及び左側に示す。グラヌリンＢ及びグラヌリンＡはそれぞれ、Plowmanら（1992）（５）によるエピセリン２及びエピセリン１としても定義される。
【図１１】図１１は、ＧＰ８８アンチセンスｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングするための制限部位を示すｐＣＭＶ４及びＧＰ８８ｃＤＮＡクローンを図示したものを示している。
【図１２】図１２は、ＣＣＬ−６４細胞上のＧＰ８８細胞表面受容体への１３５Ｉ−ｒＧＰ８８の架橋を示している。スベリン酸ジスクシンイミジル（disuccinimidyl suberate）（ＤＳＳ）を用いて架橋反応を行なった。７％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって反応産物を分析した。
【図１３】図１３は、３Ｔ３線維芽細胞、ＰＣ細胞、及びＣ５７ＭＧ乳房上皮細胞上のＧＰ８８細胞表面受容体への１３５Ｉ−ｒＧＰ８８の架橋を示している。結果は、これらの種々の細胞系がＣＣＬ６４細胞上のものと類似した分子量のＧＰ８８細胞表面受容体を提示することを示している（図１２）。
【図１４】図１４は、非腫瘍形成ＭＣＦ１０Ａ及び悪性（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−４６８）ヒト乳房上皮細胞中でのＧＰ８８発現レベルを示している。
【図１５】図１５は、ヒト乳癌ＭＤＡ−４６８細胞中でアンチセンスＧＰ８８ｃＤＮＡのトランスフェクションによってＧＰ８８発現が阻害されることを示している。
【図１６】図１６は、既知量のＧＰ８８（ｘ軸）を含有する血清試料の光学濃度（ｙ軸）を示すグラフである。血清などの生物液試料中のＧＰ８８濃度を決定するのための参照として、グラフを用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、現在は放棄されている１９９７年５月２３日に出願された米国特許出願第０８／８６３，０７９号の一部継続出願である１９９７年１２月１６日に出願された米国出願番０８／９９１，８６２号の分割出願（現在、米国特許第６，３０９，８２６号）である１９９９年１２月８日に出願された米国出願番号０９／４５６，８８６号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、細胞生物学、生理学、及び薬剤に関し、８８ｋＤａの糖タンパク質成長因子（「ＧＰ８８」）並びにＧＰ８８の発現及び生物活性に影響を及ぼす組成物及び方法に関する。本発明は、癌を含む疾患の診断及び治療に有用なキット製品、組成物、及び方法にも関する。
【０００３】
参照
いくつかの公表物を括弧内のアラビア数字によって本明細書中で参照する。特許請求の範囲の直前の本明細書の最後にこれらの参照の全ての引用を見ることができる。
【０００４】
背景技術
多細胞生物における細胞の増殖及び分化は、高度に調節されたプロセスを受ける。癌細胞を区別する特徴はこのプロセスに対する制御が無いことであって、増殖及び分化が調節されなくなり、結果として制御されない増殖が生じる。正常細胞及び腫瘍細胞の間のこの違いをより理解することに対して多大な研究努力が向けられてきた。焦点が当てられている研究の一領域は成長因子であり、より具体的にはオートクリン増殖刺激である。
【０００５】
成長因子は、増殖、分化、移入、及び遺伝子発現に関するメッセージを細胞に運ぶポリペプチドである。典型的には、成長因子はある細胞中で産生され、別の細胞に対して増殖を刺激するように作用にする。しかしながら、培養物中のある種の悪性細胞では、オートクリン増殖機構により大きくあるいは完全に依存していることが実証される。このオートクリン挙動が見られる悪性細胞は、他の細胞による成長因子の産生調節を回避し、したがってその増殖が調節されない。
【０００６】
オートクリン増殖制御の研究によって、細胞増殖機構の理解が進み、癌の診断及び治療における重要な発展がもたらされる。このような目的に対して、インスリン様成長因子（「ＩＧＦ１」及び「ＩＧＦ２」）、ガストリン放出ペプチド（「ＧＲＰ」）、形質転換成長因子アルファ及びベータ（「ＴＧＦ−ａ」及び「ＴＧＦ−ｂ」）、及び上皮成長因子（「ＥＧＦ」）を含む多数の成長因子が研究されている。
【０００７】
本発明は、最近発見された成長因子に関する。この成長因子は、腫瘍形成能の高い（highly tumorigenic）「ＰＣ細胞」（奇形腫由来の脂肪生成細胞系１２４６から単離されたインスリン非依存性変異体）の培地中に最初に発見された。この成長因子を本明細書中では「ＧＰ８８」と称する。ＧＰ８８は精製され、構造的に特性決定がなされている。ＧＰ８８のアミノ酸配列決定により、ＧＰ８８はマウスグラヌリン（granulin）／エピセリン（epithelin）前駆体とのアミノ酸配列の類似性を有していることが示される。
【０００８】
グラヌリン／エピセリン（「ｇｒｎ／ｅｐｉ」）は６ｋＤａのポリペプチドであり、二重システインに富むポリペプチド(double cysteine rich polypeptide)の新しいファミリーに属する。特許文献１（Shoyab et al.）は、６ｋＤａのエピセリン、具体的にはエピセリン１及びエピセリン２に関する。Shoyabによれば、両方のエピセリンは共通の６３．５ｋＤａの前駆体によってコードされており、該前駆体は、合成されると直ぐ、生物試料中に見出される天然産物のみが６ｋＤａの形態となるようにより小さな形態へとプロセシングされる。
【０００９】
Shoyabらの教示に反して、本発明者らの研究室により、前駆体は合成されたら直ぐにプロセシングされることは常ではないことが実証された。本発明者によって一部なされた研究によって、前駆体（すなわち、ＧＰ８８）が、実は、Ｎへ結合した２０ｋＤａの炭水化物部分を有する８８ｋＤａの糖タンパク質として分泌されることが実証された。ＧＰ８８のＮ末端配列の分析によって、ＧＰ８８はｇｒｎ／ｅｐｉ前駆体のアミノ酸１７で始まることが示され、前駆体ｃＤＮＡから推定されるタンパク質配列由来の最初の１７個のアミノ酸は膜への局在化又は分泌の標的化に適合する(compatible）シグナルペプチドに対応することが実証されている。さらにShoyabの教示とは対照的に、ＧＰ８８は生物活性であり、増殖促進活性、具体的には産生細胞のオートクリン成長因子としての増殖促進活性を有する。
【００１０】
癌の診断では、腫瘍形成が疑われる組織の生検のサンプリング、腫瘍マーカーが存在するかを決定するための組織試料の試験、及び組織試料が腫瘍形成性であるかの決定がしばしば必要となる。生検手順は、組織の位置及び患者の状態に拠っては危険性を有し、かつ、痛いこともある。さらに、生検手順によって与えられた外傷が悪性の危険性を増大することもある。英国医学雑誌（British Medical Journal）で報告された研究によって、生検が精巣癌の最大の危険因子であると同定された（非特許文献１）。生検は、乳癌、肝癌、及びその他の癌における危険因子としても同定されている。さらに、ジョンズ・ホプキンス大学で行われた研究では、生検後の誤診は有意な率で起こると結論した（非特許文献２）。誤診は、一部には、針の生検及び小さな組織試料だけを得る他の手順から得られる小さな組織試料サイズに因ることもある。小さな生検試料サイズでは、患者の危険性が減じる。Id。しかしながら、小さな組織試料だけが利用される場合に誤診の危険性が増加する。Id。
【特許文献１】米国特許第５，４１６，１９２号
【非特許文献１】Swerdlow et al.,BMJ 1997 ;314:1507
【非特許文献２】Kronz et al., Cancer:Dec.1, 1999, vol.86, no.11 pp 2426-2435
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
癌の診断、治療、及び予防のための新規な方法及びキット、具体的には、組織の生検に関連する危険性を回避する方法及びキットが必要とされているものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の概要
本発明者は、正常細胞では厳格に調節された形式で発現される糖タンパク質（ＧＰ８８）が正常な細胞由来の腫瘍形成能の高い細胞では過剰発現され、かつ、調節されないこと、腫瘍形成細胞に厳格に（stringently）必要とされる増殖刺激物質としてＧＰ８８が作用すること、及び腫瘍形成細胞でのＧＰ８８の発現又は作用を阻害することによって過剰産生細胞の腫瘍形成特性が阻害されることを今、予想外にも発見した。
【００１３】
本発明者は、さらに、１ミリリットルあたりのＧＰ８８濃度約０．１ナノグラムの低さの濃度での生物液中のＧＰ８８の検出方法を発見した。本発明の実施態様は、生物液（例えば、全血、血奬、血清、リンパ、唾液、及び尿）中のＧＰ８８の非侵襲検出方法及びキットを提供する。
【００１４】
本発明の別の実施態様は、生物液中のＧＰ８８レベルを測定する工程及びＧＰ８８レベルが腫瘍形成を示すのに十分であるかを決定する工程を含む、腫瘍形成の診断方法及びキットを提供する。さらなる実施態様において、本発明は、方法及びキットを提供する。患者から採取した第１の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、同じ患者から採取した第２の又は後の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、及び第２の生物液試料中の測定されたＧＰ８８タンパク質レベルが第１の生物液試料中のレベルよりも、腫瘍形成能を示すのに十分な程に高い量であるかを判定することによって腫瘍形成を診断する工程を含む、腫瘍形成の診断方法及びキットを提供する。
【００１５】
さらに本発明の実施態様は、血清中のＧＰ８８レベルを測定することによって患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるかを決定するための方法及びキットを提供する。抗腫瘍形成治療を受けている患者におけるＧＰ８８血清濃度が特定の患者に帰する基準値より大きい場合（例えば、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ）、患者は抗腫瘍形成治療に反応していない。本発明の別の実施態様において、癌再発の治療又は予防方法を提供する。この実施態様によれば、患者から採取した生物液試料中のＧＰ８８濃度を決定する。生物液中のＧＰ８８濃度が特定の患者に帰する基準値より大きい場（例えば、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＰ８８アンタゴニストを癌の再発を治療又は予防するのに十分な量で患者に投与する。
【００１６】
本発明は、ＧＰ８８の発現又は活性を阻害することが可能であるＧＰ８８拮抗組成物、限定するものではないが、例えば、血液、髄液、血清、血奬、尿、乳頭吸引液（nipple aspirate）、肝、腎、乳、骨、骨髄、精巣、脳、卵巣、皮膚、及び肺を含む組織における哺乳動物での癌など、ＧＰ８８の量又は活性の欠陥に関連する疾患の治療方法、ＧＰ８８の発現又は作用の欠陥に関連する疾患に対する被検体の感受性の決定方法、ＧＰ８８拮抗治療に対する感受性の測定方法、並びに細胞中のＧＰ８８及び腫瘍形成活性のin vitro及びin vivo検出方法、試薬、及びキットも提供する。
【００１７】
本発明の追加の目的及び利点は、一部には以下の詳細な説明中に説明され、一部には詳細な説明から明らかであり、あるいは本発明の実施例によって理解することができる。
【００１８】
本発明の目的を達成するため、発明の目的によれば、本明細書中で実施態様が提供され、適切に記載される通り、本発明は、細胞が変化したＧＰ８８の発現又はＧＰ８８に対する変化した反応を示す乳癌などの疾患の診断及び治療用組成物を提供する。
【００１９】
本明細書中の「変化した発現」という用語の使用は、対応する正常な細胞又は周囲末梢細胞と比較して、ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルに基づき、少なくとも２倍、時には１０倍以上のＧＰ８８の増加した発現又は過剰発現を意味する。「変化した発現」との用語は、制御されなくなったか、あるいは必ずしも高くすることがなく構成的になった発現も意味する。ＧＰ８８に対する増加した又は変化した「反応」という用語の使用は、ＧＰ８８によって与えられる任意の生物機能（例えば、増殖、分化、ウイルス感染）の増加によってＧＰ８８の変化した発現と同じ又は同等の状態となる状態を意味する。
【００２０】
本明細書中の「ＧＰ８８」という用語の使用は、細胞抽出物及び細胞外液中のエピセリン／グラヌリン前駆体を意味し、マウス及びヒトを起源とする図８又は９中に含まれるアミノ酸配列によるＧＰ８８を含むだけでなく他の種を起源とするＧＰ８８も含むことを意図する。さらに、該用語には、糖タンパク質又は他の修飾構造を含む炭水化物部分などの追加成分を有するＧＰ８８の機能性誘導体が含まれる。
【００２１】
ＧＰ８８という用語は、上記の配列中に存在する少なくとも１０個のアミノ酸を有する任意のポリペプチドフラグメントも意図する。この長さの配列は、抗原として有用であり、タンパク質全体の種々のエピトープに特異的な抗体の産生のための担体との免疫原性共役体の作製に有用である。そのようなポリペプチドは、そのような抗体のスクリーニング及び生物液中のＧＰ８８の検出に関する方法に有用である。ペプチドがより大きいタンパク質に対する抗体の生成に有用であることは当該技術分野で周知である（７）。本発明の一実施態様において、長さが１２〜１９個のアミノ酸のペプチドを用いて全長ＧＰ８８を認識する抗体を生成することに成功したことが示されている。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、別の分子と共有結合してあるいは共有結合せずに存在してもよい。例えば、該ポリペプチドを、グルタチオントランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、又はｍｙｃ標識などの１つ以上のペプチド結合を介して１つ以上の他のポリペプチドに融合してもよい。
【００２３】
本ポリペプチドは、ＧＰ８８又はその機能性誘導体に対する抗体を再生産又は試験するための免疫原として用いることができる免疫原性が異なった（antigenetically distinct）決定基又はエピトープを含有する程に十分に大きい。
【００２４】
一実施態様には、他の哺乳動物ペプチドを実質的に有していないポリペプチドが含まれる。本発明のＧＰ８８は、細胞、組織、又は生物液から生物化学的に又は免疫化学的に精製することができる。あるいは、ポリペプチドは、原核生物又は真核生物の発現系及び宿主細胞中で組換え手段によって産生することができる。
【００２５】
「他の哺乳動物ペプチドを実質的に有していないポリペプチド」とは、原核生物中であるいは所望する場合には非哺乳動物若しくは哺乳動物の真核生物中でポリペプチドを合成することができる事実を反映している。あるいは、固相支持体上の化学合成及びその後の支持体からの分離による所望の配列のポリペプチドの合成方法が周知である。あるいは、少なくとも９０％の純度（重量ベースで）あるいは所望する場合にはさらに９９％の純度の他の哺乳動物のポリペプチドとなるように、天然に存在する哺乳動物の組織又は液からタンパク質を精製することができ、したがって実質的にそれらを有していないこととなる。タンパク質に対して反応性である抗体を保有する免疫吸着剤上などでの標準のタンパク質精製を組織抽出物又は液に施すことによって、これを成すことができる。本発明の一実施態様は、天然に存在するＧＰ８８及びバキュロウイルスが感染した昆虫細胞中で発現される組換えＧＰ８８の精製のための精製方法を記載する。あるいは、そのような組織又は液からの精製を、限定するものではないが参照（４）に記載のものなど、標準の方法の組み合わせによって成すことができる。
【００２６】
野生型の精製糖タンパク質若しくはポリペプチド又は組換え糖タンパク質若しくはポリペプチドに対する代替として、「ＧＰ８８」は機能性誘導体を含むことも意図している。機能性誘導体とは、後述のタンパク質又は糖タンパク質の「フラグメント」、「変異体」、「アナログ」、又は「化学誘導体」を意味する。機能性誘導体は、本発明による有用性を可能とする全長ＧＰ８８の機能の少なくとも一部を保持する。
【００２７】
ＧＰ８８の「フラグメント」とは、ＧＰ８８の腫瘍形成特性を保持する比較的短いペプチドである分子の任意のサブセットをいう。これは、限定するものではないが、例えば、マウスＧＰ８８のＫ１９Ｔ及びＳ１４Ｒ、及びヒトＧＰ８８のＥ１９Ｖ及びＡ１４Ｒ（それぞれマウスＫ１９Ｔ及びＳ１４Ｒに対応する）などの領域に対応する。
【００２８】
ＧＰ８８の「変異体」とは、ペプチド全体又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する分子をいう。変異体ペプチドは、変異体ペプチドの直接化学合成により、当該技術分野で既知の方法を用いて調製することができる。
【００２９】
あるいは、ペプチドのアミノ酸配列変異体は、合成されたタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを修飾することによって調製することができる。そのような変異体には、例えば、ＧＰ８８のアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換が含まれる。最終構築体が所望の活性を有するという条件において、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って最終構築体に到達することもできる。変異体ペプチドをコードするＤＮＡでなされる変異は、リーディング・フレームを変えてはならず、好ましくは、ｍＲＮＡ二次構造を作ることができる相補領域を作り出してはいけない。ペプチド分子をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異（８）によってこれらの変異体を遺伝子レベルで調製することができ、それによって変異体をコードするＤＮＡが産生され、続いて組換え細胞培養でＤＮＡが発現される。変異体は、典型的には、非変異体ペプチドと同じ定性的な生物活性を示す。
【００３０】
ＧＰ８８のタンパク質の「アナログ」とは、分子全体又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する非天然分子をいう。
【００３１】
「化学誘導体」は、通常はペプチド又はタンパク質の一部ではない追加の化学部分を含む。ペプチドの共有結合による修飾も本発明の範囲内に含まれる。選択した側鎖又は末端アミノ酸残基と反応することができる有機誘導体化剤とペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることにより、そのような修飾を分子中に導入することができる。最もよく誘導体化する残基は、システイニル、ヒスチジル、リシニル、アルギニル、チロシル、グルタミニル、アスパラギニル、及びアミノ末端残基である。プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル及びスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、ヒスチジン、及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びにＣ末端カルボキシル基のアミド化。そのような誘導体化部分によって、溶解性、吸収性（absorption）、生物半減期などが向上する。該部分により、タンパク質などの任意の望ましくない副作用を取り除くあるいは弱めることもできる。さらに、二官能性剤による誘導体化は、水不溶性支持マトリクス又は他の高分子担体へのペプチドの架橋に有用である。通常用いられる架橋剤には、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性（homobifunctional）イミドエステル、１，１−ビス（−ジアゾロアセチル）−２−フェニルエタン、及び二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［９ｐ−アジドフェニル）］ジチオプロピオイミデートなどの誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体が生ずる。臭化シアン活性化炭水化物などの反応性かつ水不溶性のマトリクス並びに米国特許第３，９６９，２８７号及び第３，６９１，０１６号に記載される反応性基質をタンパク質固定化に用いることができる。
【００３２】
本明細書中のＧＰ８８「拮抗剤」いう用語の使用は、ＧＰ８８の発現、産生、若しくは分泌を阻害若しくは遮断する任意の組成物、又はＧＰ８８の生物活性を阻害若しくは遮断する任意の組成物を意味する。これは、限定するものではなく、以下のものなど、任意の作用形式で成すことができる。
【００３３】
（Ａ）ＧＰ８８拮抗剤には、以下のものを含むが限定するものではないＧＰ８８発現又は産生を阻害する任意の試薬又は分子が含まれる。
【００３４】
（１）ＧＰ８８翻訳を阻害することによってＧＰ８８発現を阻害するアンチセンスＧＰ８８ＤＮＡ又はＲＮＡ分子
【００３５】
（２）ＧＰ８８ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現を転写、翻訳、又は翻訳後レベルで阻害する試薬（ホルモン、成長因子、小分子）
【００３６】
（３）ＧＰ８８分泌を阻害する因子、試薬、又はホルモン
【００３７】
（Ｂ）ＧＰ８８拮抗剤には、限定するものではないが、以下のものなどのＧＰ８８作用又は生物活性を阻害する任意の試薬又は分子も含まれる。
【００３８】
（１）タンパク質を結合し、該タンパク質がその生物活性を発揮するのを妨げるＧＰ８８に対する中和抗体
【００３９】
（２）ＧＰ８８がその受容体に結合するのを妨げ、かつ、生物活性を発揮するのを妨げるＧＰ８８受容体に対する抗体
【００４０】
（３）受容体に結合するＧＰ８８の競合阻害剤
【００４１】
（４）ＧＰ８８シグナル伝達経路の阻害剤
【００４２】
本明細書中に示される具体例は、好ましい実施態様の記載、具体的にはＧＰ８８生物作用及び乳癌細胞を含むがそれに限定するものではない癌細胞の増殖を阻害するための中和抗体の使用、ＰＣ細胞の腫瘍形成特性の阻害をもたらすＧＰ８８発現を阻害するためのアンチセンスＧＰ８８ｃＤＮＡ及びアンチセンスＧＰ８８オリゴヌクレオチドの使用、乳房上皮細胞系Ｃ５７ＭＧ、１２４６、及びＰＣ細胞系、並びにミンク（mink）肺上皮細胞系ＣＣＬ６４を含むいくつかの細胞系の細胞表面上のＧＰ８８の受容体の特性決定を提供する。
【００４３】
本発明の一実施態様において、ＧＰ８８拮抗剤は、ＧＰ８８に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＰ８８タンパク質の翻訳を阻害することによってＧＰ８８発現を阻害することが好ましい。
【００４４】
あるいは、そのような組成物は、ＧＰ８８遺伝子転写活性を調節することによってＧＰ８８発現を阻害する試薬、因子、又はホルモンを含有することができる。そのような組成物は、ＧＰ８８翻訳後修飾及び分泌を阻害する試薬、因子、又はホルモンを含有することができる。そのような組成物は、ＧＰ８８細胞表面受容体への結合をＧＰ８８と競合することによってＧＰ８８活性を遮断するＧＰ８８アンタゴニストとして作用する試薬を含有することができる。あるいは、そのような組成物は、一度患部細胞上の受容体に結合したらＧＰ８８によって変換される(transduced)シグナル伝達経路を阻害する因子又は試薬を含有することができる。
【００４５】
あるいは、組成物は、ＧＰ８８の生物活性を中和するＧＰ８８に特異的な抗体又はＧＰ８８の活性を遮断するＧＰ８８受容体に対する抗体などのＧＰ８８の作用を遮断する試薬を含有することができる。
【００４６】
本発明の抗体（中和抗体など）は、乳癌、その他の癌、又はＧＰ８８の増加した発現を示す細胞での他の疾患の治療薬として用いることが好ましい。「中和」という用語は、抗体が実験動物及びヒトで細胞増殖を刺激するあるいは腫瘍増殖を誘発するＧＰ８８の能力を含むＧＰ８８の正常な生物活性を阻害又は遮断する能力を有すると理解しなければならない。有効量の抗ＧＰ８８抗体をヒトを含む動物に種々の経路で投与する。代替の実施態様において、限定するものではないが癌（例えば、乳癌）などの疾患で生じるＧＰ８８の変化した（増加した）発現を示す細胞を検出するための診断薬として、さらに増殖がＧＰ８８に依存し、かつ、ＧＰ８８拮抗治療に反応する患部細胞を同定するための診断薬として、抗ＧＰ８８抗体を用いる。さらに別の実施態様において、抗ＧＰ８８抗体を用いて、ＧＰ８８を発現するあるいはＧＰ８８に反応性を有する細胞に細胞毒性因子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの化合物を送達する。細胞毒性因子は、抗ＧＰ８８抗体に付着、結合、又は会合することができる。
【００４７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＰ８８の増加した発現を示す細胞における癌の治療薬として用いることができる。有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトを含む動物に種々の経路で投与する。
【００４８】
本発明は、生物液又は組織の試料を得る工程、及び液又は組織中のＧＰ８８の量を測定する工程又はＧＰ８８に反応する細胞の感受性を測定する工程を含む、ＧＰ８８の発現又は作用の欠陥に関連する疾患に対する感受性の測定方法も提供する。癌（例えば、乳癌）の場合、ＧＰ８８の量は癌に対する感受性と比例する。
【００４９】
本発明は、生物液又は組織の試料を得る工程、及び液又は組織試料中のＧＰ８８の量を測定する工程を含む、癌（例えば、乳癌）の重篤度の測定方法も提供する。該ＧＰ８８の量は癌の程度又は重篤度と比例する。本発明の一実施態様において、組織試料を血清、リンパ、又は尿から得る。
【００５０】
本発明は、患部組織又は患部であると疑われる組織の試料を得る工程（生検）、試料由来の細胞を培養物中で維持する工程、培養物由来の細胞を抗ＧＰ８８中和抗体で処理する工程、及び中和抗体が細胞増殖を阻害するかの測定工程を含む、ＧＰ８８拮抗治療に対する感受性の測定方法も提供する。抗体の細胞増殖阻害能力によって、細胞がＧＰ８８に依存して増殖することが示され、ＧＰ８８拮抗治療が有効であることが予測される。
【００５１】
本発明は、組織試料を得る工程、及び組織中のＧＰ８８受容体タンパク質又はｍＲＮＡの量を測定する工程又は組織中の受容体のチロシンキナーゼ活性を測定する工程（ＧＰ８８がその受容体に結合することによって、ＧＰ８８の受容体を含む細胞タンパク質のチロシンリン酸化が誘発される）を含む、ＧＰ８８受容体のレベル又は活性の異常に関連する癌に対する感受性の決定方法も提供する。
【００５２】
本発明は、ＧＰ８８拮抗試薬を抗ＧＰ８８抗体又は抗ＧＰ８８受容体抗体に共役することによる、患部部位へのＧＰ８８拮抗試薬の標的化方法も提供する。
【００５３】
本明細書中に組み込まれ、かつ、本明細書の一部を構成する付随の図面は、本発明の実施態様を例証し、詳細な説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
ここで、以下の実施例とともに本発明の要点を説明するのに役立つ現在好ましい本発明の実施態様について詳細に参照する。
【００５５】
ＧＰ８８の生物活性
本発明は、ＧＰ８８の変化した（増加した）発現に関連した疾患の治療及び診断に有用なＧＰ８８並びに抗腫瘍及び抗ウイルス組成物に関する。あるいは、本発明は、ＧＰ８８に対する増加した反応に関連した疾患の治療及び診断に用いられる。３つの細胞系からなるマウスモデル系を用いて、本発明者によって、ＧＰ８８を過剰発現する細胞が腫瘍を形成することが示された。親細胞系１２４６は、合成（defined）培地中でインスリンによる厳格な調節下で増殖して脂肪細胞へと分化するＣ３Ｈマウス脂肪生成細胞系である。１２４６細胞は、高い細胞密度で注射したときでさえ、同系の動物（Ｃ３Ｈマウス）で腫瘍を形成することはできない。インスリン非依存性細胞系１２４６−３Ａを、インスリンなしの培地で維持された１２４６細胞から単離した。１０６個を同系マウスに皮下注射したとき、１２４６−３Ａ細胞は分化する能力を失って腫瘍を形成した。in vitro- in vivoシャトル技術により、腫瘍形成能の高い細胞系ＰＣが１２４６−３Ａ細胞から生成された。１０４個の細胞を同系マウスに注射したときに、ＰＣ細胞は腫瘍を形成した。
【００５６】
ＧＰ８８は、親非腫瘍形成インスリン依存性細胞系に関連するインスリン非依存性腫瘍形成細胞系で過剰発現する。さらに、ＧＰ８８の過剰発現の程度はこれらの細胞の腫瘍形成の程度と正相関し、ＧＰ８８が腫瘍形成に重要であることが初めて実証された（図１）。図１を参照して、ＧＰ８８は細胞によって合成されるだけでなく培地中に分泌されるので、細胞溶解産物中及び培地（ＣＭ）中のＧＰ８８レベルを決定した。すべての細胞を２％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥ／Ｆ１２栄養培地中で培養した。細胞がコンフルエンシー（confluency）に達したとき、培地（ＣＭ）を回収し、界面活性剤を含有する緩衝液中でのインキュベーションに続く１０，０００×ｇでの遠心分離によって細胞溶解産物を調製した。細胞溶解産物及び調整培地を細胞数で規格化した。以下に説明する通り、抗ＧＰ８８抗体を用いたウエスタンブロット分析により、細胞溶解産物から得た試料及び調整培地を分析した。
【００５７】
中和抗体の生成によって、腫瘍形成におけるＧＰ８８の重要な役割が確認された。マウスＧＰ８８のＫ１９Ｔ領域に対して生じた（directed）抗ＧＰ８８抗体を培地に添加したとき、腫瘍形成能の高いＰＣ細胞の増殖は用量に依存した形式で阻害された（図２）。図２を参照して、９６ウェルのプレート中のヒトフィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ）及びヒトトランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）を補足したＤＭＥ／Ｆ１２培地中で２×１０４個の細胞／ウェルの密度においてＰＣ細胞を培養した。細胞付着後に、抗ＧＰ８８ＩｇＧ画分を、濃度を増加させつつウェルに添加した。対照細胞を等濃度の非免疫ＩｇＧで処理した。２日後、１ウェルあたり３Ｈ−チミジン０．２５ｍＣｉを６時間加えた。次いで、細胞を回収し、細胞増殖の測度としてのＤＮＡに組み込まれた３Ｈ−チミジンを計数した。
【００５８】
さらに、ＧＰ８８の発現がＰＣ細胞中でアンチセンスＧＰ８８ｃＤＮＡによって特に阻害されとき、ＧＰ８８の産生は減少し、これらのＰＣ細胞は同系Ｃ３Ｈマウスでは腫瘍をもはや形成できなかった。さらに、これらのＰＣ細胞はインスリンに対する反応を回復した。図３及び表１及び２を参照して、１０６個のアンチセンスＧＰ８８でトランスフェクションしたＰＣ細胞（以下で説明する通り）又は１０６個の空のベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞をＣ３Ｈ雌マウスに皮下注射した。腫瘍の様相についてマウスを毎日モニタリングした。細胞注射後４５日目に写真を撮った。対照として用いた空のベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞を注射したマウスとは対照的に、アンチセンスＧＰ８８ＰＣ細胞を注射したマウスは腫瘍を発達しないことが結果により示される。
【００５９】
【表１】
ＰＣ：対照非トランスフェクション細胞
Ｐ−１４：空のベクターでトランスフェクションした対照ＰＣ細胞
ＡＳＧＰ８８：ＧＰ８８アンチセンスｃＤＮＡを含有する発現ベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞
４５日目に腫瘍を切除し、重量測定した。−−−は、腫瘍形成がなかったことを示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】
ＧＰ８８の発現を比較することによって、腫瘍でのin vivoＧＰ８８レベルは正常組織より劇的に高いことが示される（図４）。Ｃ３Ｈマウスに１０６個のＰＣ細胞を注射した。腫瘍を有するマウスを安楽死させた。腫瘍、脂肪部分（fat pads）、及び結合組織を採取した。図１で記載した通り、界面活性剤を含有する緩衝液中でインキュベーションすることによって細胞溶解産物を調製した。組織抽出物のタンパク質濃度を決定し、各試料について等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く抗ＧＰ８８抗体を用いたウエスタンブロット分析により分析し、組織抽出物中のＧＰ８８含量を測定した。結果は、腫瘍抽出物中のＧＰ８８レベルは周囲結合組織及び脂肪組織中のレベルよりも少なくとも１０倍高いことを示している。
【００６２】
正常細胞（１２４６細胞、線維芽細胞）では、ＧＰ８８の発現は、特にインスリンによって調節され、ウシ胎児血清によって阻害される。腫瘍形成細胞では、正常増殖の調節が失われることによって、ＧＰ８８の増加した発現及び増殖のためのＧＰ８８依存性の獲得に至る。したがって、ＧＰ８８発現及び／又は作用の阻害は、腫瘍形成の抑制の有効な手法である。生検中での高いＧＰ８８発現の検出によって、ＧＰ８８阻害療法に反応性である腫瘍の診断用分析が提供される。
【００６３】
ＧＰ８８は、ヒト癌における腫瘍誘発因子でもある。１２４６−３Ａ細胞系で見られる通り、限定するものではないが乳癌を含むいくつかのヒト癌において、インスリン（又はＩＧＦ−Ｉ）に対する反応がなくなると同時に悪性が増加することについては十分に証拠書類が提供されている。具体的には、乳癌は、上記のマウスモデル系での腫瘍形成特性の発達の出発点でもあるインスリン／ＩＧＦ−Ｉオートクリンループの獲得を伴う。さらに、ヒト乳癌では、ＧＰ８８発現が高い。より具体的には、図５を参照して、エストロゲン受容体陽性及びエストロゲン受容体陰性インスリン／ＩＧＦ−Ｉ非依存性の悪性の高い細胞では、ヒトＧＰ８８が高発現する。さらに、ＧＰ８８は、乳房上皮細胞の効力ある（potent）成長因子である（図６）。図５のデータは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＤＭＥ／Ｆ１２培地中でＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を培養することによって得たものである。ＲＮＡｚｏｌ方法によって各細胞系からＲＮＡを抽出し、ポリ−Ａ＋ＲＮＡを調製した。３２Ｐ−標識したＧＰ８８ｃＤＮＡプローブを用い、各細胞系のポリＡ＋ＲＮＡ３μｇを用いたノーザンブロット分析によって、ＧＰ８８ｍＲＮＡ発現を検査した。
【００６４】
齧歯類の細胞又は組織（マウス及びラット）中でＧＰ８８のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析をするため、ヌクレオチド５５１で始まり８６２までの（アミノ酸配列１６０から２７０に対応する）長さ３１１ｂｐのマウスＧＰ８８ｃＤＮＡプローブを用いた。当業者に周知の種々の方法（Sambrook, Molecular Biology manual:35）により、ＲＮＡを抽出することができる。選択した方法は、ＲＮＡｚｏｌ（シンナバイオテック社（Cinnabiotech））又はグアニジニウムイソチオシアナート（guanidinium isothiocyanate）及びフェノール−クロロホルムによる単一工程の抽出からなるトリゾール（Trizol）（ギブコ−ＢＲＬ社（Gibco−BRL））溶液を用いてＲＮＡを抽出することであった。
【００６５】
ヒト細胞系でＧＰ８８のｍＲＮＡ発現をノーザンブロット分析するため、ヒトＧＰ８８のヌクレオチド１００２〜１６７４（アミノ酸配列３３４〜５５８に対応する）に対応する６７２ｂｐのヒトＧＰ８８ｃＤＮＡプローブを開発した。
【００６６】
図６に関して、ＰＣ細胞調整培地（上側パネル）から精製されたＧＰ８８及び昆虫細胞で発現された組換えＧＰ８８（下側パネル）の増加する濃度の存在下でＣ５７ＭＧ細胞を培養して、マウス乳房上皮細胞系Ｃ５７ＭＧの増殖に対する増加する濃度のＧＰ８８の増殖刺激効果を実証した。
【００６７】
ＩＧＦ−１オートクリン産生及び増加した悪性の間の相関は、膠芽細胞腫、奇形癌、及び乳癌では十分に確立されている。これらの癌では、ＧＰ８８発現も、非腫瘍形成ヒト線維芽細胞及び他のヒト細胞系と比較したときにヒト腫瘍中で高い。ＧＰ８８は、乳癌細胞の増殖を促進する。
【００６８】
抗ＧＰ８８抗体
本発明は、ＧＰ８８の増加した発現に関連する疾患の治療及び予防用組成物を提供する。これは、ＧＰ８８の増加した反応に関連する疾患の治療及び診断にも適用される。本発明の組成物には、ＧＰ８８の生物活性を中和する抗ＧＰ８８抗体が含まれる。
【００６９】
本発明は、ＧＰ８８のエピトープに特異的な抗体、並びに細胞、細胞若しくは組織抽出物、培地、又は生物液（例えば、全血、血清、血奬、リンパ、及び尿）中におけるＧＰ８８分子、その機能性誘導体、又は異なる動物種由来の同族体の存在を検出するためあるいは量又は濃度を測定するためのそのような抗体の使用にも関する。さらに、抗ＧＰ８８抗体を用いて、特定部位へ細胞毒性分子を標的化することができる。
【００７０】
抗体生成のための抗原として使用するため、天然で産生されたあるいは組換え体又はその機能性誘導体中で発現された少なくとも９個のアミノ酸を有することが好ましいＧＰ８８タンパク質を得て、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の産生のため動物を免疫処置（immunize）に用いる。抗体が分子と反応することによって該分子が抗体と結合することが可能である場合、抗体は分子を結合できると言う。特異的反応とは、抗原がその対応する抗体と選択性の高い形式で反応し、他の抗原によって生じ得る多数の他の抗体と反応しないことを示すことを意味する。
【００７１】
本明細書中の抗体との用語には、ヒト及び非ヒトポリクローナル抗体、ヒト及び非ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体（抗ＩｄＡｂ）、並びにヒト化抗体が含まれるが、限定するものではない。ポリクローナル抗体は、抗原で免疫処置された動物の血清又は鶏卵由来の抗体分子の異種集団である。モノクローナル抗体（「ｍＡｂｓ」）は、特異的抗原に対する抗体の実質的に同種の集団である。ｍＡｂｓは、当業者に既知の方法によって得ることができる（米国特許第４、３７６，１１０号）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びそのサブクラスのいずれも含む免疫学的クラスのいずれであってもよい。ＧＰ８８に対するヒト及び非ヒト抗体を産生するハイブリドーマをin vitro又はin vivoで培養することができる。多量のｍＡｂｓの産生のため、in vivoは現在好ましい産生方法である。簡単に言えば、個々のハイブリドーマから得られる細胞をプリスタンプライム化（primed）Ｂａｌｂ／ｃマウス又はヌードマウスに腹腔内注射し、高濃度の所望のｍＡｂｓを含有する腹水液を産生させた。当業者に周知である標準のクロマトグラフィー方法を用いて、腹水液又は培養物上清からｍＡｂｓを精製することができる。
【００７２】
ヒトＧＰ８８に対するヒトモノクローナルＡｂは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを免疫処置することによって調製することができる。トランスジェニック動物から得たリンパ球を用いることによって産生されるハイブリドーマは、マウス免疫グロブリンの代わりにヒト免疫グロブリンを産生する。
【００７３】
ほとんどのモノクローナル抗体はマウス供給源及び他の非ヒト供給源由来であるので、それらの臨床的有効性は、ヒトに投与される齧歯類ｍＡｂｓの免疫原性、エフェクター機能の動員が弱いこと、及び血清からの急速な排泄のため制限され得る。これらの問題を回避するため、マウス抗体の抗原結合特性をヒト化と呼ばれるプロセスによってヒト抗体に付与することができる。ヒト化抗体は、ヒト抗体骨格に移植される（grafted）親マウスｍＡｂの６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）についてのアミノ酸配列を含有する。ヒト化抗体中の非ヒト配列の含量が低いこと（約５％）は、ヒトにおける免疫原性の減少及び血清半減期の延長の双方に有効であることが証明された。モノクローナル抗体のヒト化のために一価ファージディスプレイ及びコンビナトリアルライブラリー戦略を用いたものなどの方法は、現在、種々の抗体のヒト化に広く適用され、当業者に既知である。上記のトランスジェニック動物により生成されたこれらのヒト化抗体及びヒト抗体は、限定するものではないが癌を含むいくつかの疾患にとって治療上非常に有用である。
【００７４】
当該技術分野で周知であるドットブロット及び標準の免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）を含む任意数の免疫測定法により、ＧＰ８８の抗体の存在についてハイブリドーマ上清及び血清をスクリーニングする。一度、上清が対象の抗体を有すると同定された場合、それをウエスタンブロッティングによってさらにスクリーニングして、抗体が結合する抗原のサイズを同定する。当業者は、所望のポリクローナル又はｍＡｂを得るために、如何にして過度の実験なしにそのようなハイブリドーマの調製及びスクリーニングをするかを理解するであろう。
【００７５】
キメラ抗体は、異なる動物種由来の異なる部分を有している。例えば、キメラ抗体は、マウスｍＡｂから得られる可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有していてもよい。キメラ抗体及びその作成方法は当業者に既知である。
【００７６】
したがって、ＧＰ８８に対して生じたｍＡｂｓを用いて、好適な動物でヒト及び非ヒト抗ＩｄＡｂｓを誘発することができる。そのような免疫処置マウスから得た脾臓細胞を用いて、ヒト又は非ヒト抗ＩｄｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマを産生することができる。さらに、抗ＩｄｍＡｂｓをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体とカップリングして、追加のマウスを免疫処置することができる。これらのマウスから得た血清は、ＧＰ８８ポリペプチドエピトープに特異的な元来の（original）ｍＡｂの結合特性を有するヒト又は非ヒト抗抗ＩｄＡｂを含有する。したがって、抗ＩｄｍＡｂｓは、評価されるエピトープと構造的に類似した自身のイディオタイプエピトープ又はイディオタイプを有する。
【００７７】
抗体との用語は、完全体の分子及び抗原に結合することができるそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２など）の双方を含むことも意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全体の抗体のＦｃフラグメントを欠き、より速やかに循環から除かれ、完全体の抗体よりも少ない非特異的組織結合性を有することができる。そのようなフラグメントは、典型的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生ずる）及びペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生ずる）などの酵素を用いたタンパク質分解性の切断によって産生される。完全体の抗体分子について本明細書中に記載された方法に従って、本発明に有用であるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２並びに抗体の他のフラグメントをＧＰ８８の検出又は定量化及びＧＰ８８発現に関連する病理状態の治療に用いることができることは明らかである。
【００７８】
本発明によれば、ＧＰ８８活性をin vitroで中和する抗体を用いてＧＰ８８活性をin vivoで中和し、増加したＧＰ８８発現又はＧＰ８８に対する増加した反応に関連する疾患を治療することができる。増加したＧＰ８８発現に関連する疾患を患った被検体、好ましくはヒト被検体をＧＰ８８に対する抗体で治療する。そのような治療は、他の抗癌又は抗ウイルス療法と併用して行うことができる。典型的な処方計画は、１週間又は数週間にわたり及び約１〜６ヶ月の間を含む期間にわたりＧＰ８８に特異的な抗体を有効量投与することを含む。本発明の抗体は、その意図する目的を達成する任意の手段によって投与することができる。例えば、投与は、限定するものではないが皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、及び／又は経口を含む種々の経路によることができる。非経口投与は、ボーラス注射又は長期にわたる徐々の灌流（gradual perfusion）によることができる。非経口投与用製剤は、当該技術分野で既知の助剤又は賦形剤を含むことができる無菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。錠剤又はカプセル剤などの医薬組成物は、日常的な方法に従って調製することができる。投与量は、患者の年齢、性別、及び体重、在る場合には併用治療の種類、治療の頻度、並びに所望する効果の性質に拠ると理解される。以下に提供する有効用量の範囲は本発明を限定することを意図するものではなく、好ましい用量範囲を単に示しているだけである。しかしながら、最も好ましい投与量は、当業者によって理解され、かつ、決定される通り、個々の被検体に応じて合わせたものである。各治療に必要な全用量を多数回投与によりあるいは単回投与で投与することができる。有効量の抗体は、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。抗体を単独であるいは同じ疾患に関する他の治療薬と組み合わせて投与することができる。
【００７９】
本発明によれば、中和抗体に関して、たとえＧＰ８８発現の変化があることが必要ではなくても、ＧＰ８８の細胞表面受容体の過剰発現があって今度はこのことが増加した生物活性を生ずる場合、又はシグナル伝達経路が常に「作動している（turned on）」であるとの事実に至るＧＰ８８シグナル伝達経路又は受容体の変化がある場合を含む、ＧＰ８８生物活性を阻害することが必要となるすべての治療の場合において、ＧＰ８８中和抗体を用いることができる。成長因子に対する及び成長因子受容体に対する中和抗体を用いて、増殖がこの成長因子に依存している細胞の増殖を阻害することに成功している。これは、ヒト乳癌細胞中のＩＧＦ−Ｉ受容体及び肺癌でのボンベシンの場合にそうであった。ＧＰ８８に対する抗体を用いて、限定するものではないが、毒素、オンコトキシン（oncotoxins）、マイトトキシン（mitotoxins）、及び免疫毒素、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの細胞毒性試薬などの化合物を、ＧＰ８８を発現する細胞又はＧＰ８８に反応性である細胞へそれらを特異的に標的化するために送達することもできる。
【００８０】
抗原によるＧＰ８８に対する中和抗体の生成を可能とする一領域は、マウスＧＰ８８中のＫ１９Ｔ、及び６ｋＤａのエピセリン／グラヌリンの繰り返し内に位置せずこれらの繰り返しの間に位置している、具体的には可変(variant)領域（図１０を参照のこと）とみなされるものの中のグラヌリンＡ（エピセリン１）及びグラヌリンＣの間に位置しているヒトＧＰ８８中のＥ１９Ｖとして定義される１９個のアミノ酸領域である。理論に拘束されることを望むものではないが、ＧＰ８８の生物活性に重要な領域はエピセリンの繰り返しの外部に在ると信じられている。
【００８１】
本発明に有用である抗体又は抗体のフラグメントを用いて、定量的又は定性的にＧＰ８８タンパク質を発現する細胞の存在を検出することもできる。これは、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、又は蛍光測定による検出を伴った蛍光標識抗体を用いた免疫蛍光法技術によって成すことができる（以下を参照のこと）。本発明の抗体及びポリペプチドの反応は、当該技術分野で周知の免疫測定法法によって検出することができる。
【００８２】
本発明の抗体は、組織試料、生検、及び生物液中のＧＰ８８タンパク質のインサイチュー（in situ）検出のために、光学顕微鏡法、免疫蛍光法、又は免疫電子顕微鏡法などで組織学的に用いることができる。インサイチュー（in situ）検出は、患者から組織学的被検物を取り出し、適切に標識した本発明の抗体を適用することにより成すことができる。抗体（又はフラグメント）は、標識抗体（又はフラグメント）を生物試料に付与又はオーバーレイすることによって提供されることが好ましい。そのような手順を用いることにより、ＧＰ８８タンパク質の存在のみならず検査組織でのその分布又は生物液中での濃度も決定することが可能である。本発明を用いるとき、そのようなインサイチュー（in situ）検出を行うために非常に種々の組織学的方法（染色手順など）を改変することができることを当業者は容易に理解することができる。
【００８３】
ＧＰ８８のアッセイは、典型的には、ＧＰ８８タンパク質を同定することが可能な検出できるように標識した抗体の存在下で生物液、組織抽出物、新たに採取され若しくは培養された細胞、又はその培地などの生物試料をインキュベーションする工程、及び当該技術分野で周知の多数の技術で抗体を検出する工程を含む。
【００８４】
生物試料をニトロセルロースなどの固相支持体若しくは担体、又は細胞若しくは細胞粒子若しくは可溶性タンパク質を固定化する他の固相支持体で処理することができる。次いで、支持体を洗浄し、続いて検出可能に標識した抗ＧＰ８８抗体で処理する。これに続いて支持体を洗浄して未結合の抗体を除去する。次いで、該支持体上の結合標識の量を慣用の手段によって検出することができる。固相支持体とは、限定するものではないが、ガラス、ポリスチレンポリプロピレン、ナイロン、改質セルロース、又はポリアクリルアミドなどの抗原又は抗体を結合することができる任意の支持体を意図する。
【００８５】
ＧＰ８８タンパク質に対する所与の多くの抗体の結合活性を周知の方法に従って決定することができる。当業者は、日常的な実験を用いることにより、各決定に対する有効な（operative）及び最適なアッセイ条件を決定することができる。
【００８６】
ＧＰ８８タンパク質又はその機能性誘導体の検出及び該タンパク質に特異的な抗体の検出は、酵素結合免疫測定法（ＥＩＡ）又は放射線免疫測定法（ＲＩＡ）などの当該技術分野で周知である種々の免疫測定法によって成すことができる。そのようなアッセイは当該技術分野で周知であり、当業者は本発明の抗ＧＰ８８抗体及びＧＰ８８タンパク質を用いてそのようなアッセイを如何にして実施するかを容易に理解することができる。
【００８７】
そのような免疫測定法は、血清又は他の生物液中及び組織、細胞、細胞抽出物、又は生検中のＧＰ８８タンパク質の検出及び定量化に有用である。好ましい実施態様において、癌又はＧＰ８８の増加した発現に関連する他の疾患を診断するための手段として、組織被検物中のＧＰ８８濃度を測定する。別の好ましい実施態様において、生物液試料中のＧＰ８８濃度を用いて、患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるか又は反応しているかを決定する。
【００８８】
ある種のタイプの癌（例えば、乳癌）の存在及び悪性度は、ＧＰ８８タンパク質のレベルの増加に「比例する」と言う。本明細書中で用いる「比例する」との用語は、タンパク質のレベルと癌の悪性特性との間の、直線的な又は一定の関係に限定されることを意図しない。本明細書中に用いる「比例する」との用語は、増加したＧＰ８８タンパク質のレベルは、当業者が容易に決定することができるタンパク質の濃度範囲において、癌又はＧＰ８８の増加した発現に関連する他の疾患の悪性特性の様相、再発、又は提示と関連することが示されることを意図している。
【００８９】
本発明の別の実施態様は、薬物又は薬剤（agent）のＧＰ８８の発現又は産生を阻害する能力を測定することによる抗癌又は抗ウイルス薬物又は剤の効力の評価に関する。本発明の抗体は、該抗体を用いて上記の免疫測定法の１つでＧＰ８８タンパク質の量を決定することができるという点で、抗癌又は抗ウイルス薬物の評価方法に有用である。あるいは、産生されたＧＰ８８タンパク質の量を本明細書中で記載した生物アッセイ（細胞増殖アッセイ）によって測定する。より正確な評価のために生物アッセイ及び免疫測定法を組み合わせて用いることができる。
【００９０】
追加の実施態様は、好ましくはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを用いて、組織又は生物液中のＧＰ８８又はその機能性誘導体をコードする存在しているｍＲＮＡ配列の量を測定することに基づいた、癌又はＧＰ８８発現の増加に関連する他の疾患の診断用アッセイに関する。ある種の癌の存在及びその悪性度は、存在するそのようなｍＲＮＡの量に比例する。そのようなアッセイでは、ｍＲＮＡの供給源は生検及び周囲組織であることができる。ｍＲＮＡの量を測定するための好ましい技術は、相補性塩基配列のＤＮＡを用いたハイブリダイゼーションアッセイである。
【００９１】
別の関連する実施態様は、抗ＧＰ８８中和抗体による治療によって増殖又は他の生物活性が阻害されるかを組織生検について測定することに基づいた、癌又はＧＰ８８反応の増加に関連する他の疾患の診断用アッセイに関する。
【００９２】
別の関連する実施態様は、ＧＰ８８ｍのＲＮＡの発現阻害に対する薬剤の効果を測定する工程を含む、抗癌又は抗ウイルス薬物又は薬剤の効力の測定方法である。同様に、そのような方法を用いて、ＧＰ８８のｍＲＮＡの産生を阻害する該薬剤の能力を測定することによってＧＰ８８拮抗剤の効力を同定又は評価することができる。
【００９３】
核酸検出アッセイ、特にハイブリダイゼーションアッセイは、サイズ、配列、又は制限エンドヌクレアーゼによる消化に対する感受性など、核酸分子の任意の特徴に基づくことができる。検出が観察者に報告又は信号伝達される形式を変えることによって、そのようなアッセイの感度を増加することができる。酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識、化学標識、及び修飾塩基を含む非常に種々の標識が多く開発され、当業者によって用いられている。
【００９４】
核酸の検出感度の制限を克服する一方法は、アッセイを行なう前に核酸を選択的に増幅することである。この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」又はＰＣＲと称されている（米国特許第４，６８３，２０２号及び４，５８２，７８８号）。ＰＣＲ反応は、その配列が先に精製されてなく、かつ、特定の試料中で単に単一のコピーで存在していたとしても、特定の核酸配列の濃度を選択的に増加する方法を提供する。
【００９５】
生物液中のＧＰ８８の検出
本発明の好ましい実施態様は、生物液中のＧＰ８８を検出する方法及びキットに関する。上記の通り、癌細胞は高いレベルのＧＰ８８を発現する。本発明は、ＧＰ８８を約０．１ｎｇ／ｍｌの低さの濃度において生物液中で検出することができることを実証している。上記の通り、ＧＰ８８は癌細胞中で過剰発現し、高いレベルのＧＰ８８は腫瘍形成を示している。典型的には、腫瘍マーカーの存在を検出するためには組織試料又は生検が必要である。例えば、乳癌患者には、特定の腫瘍マーカーが存在しているかの決定の検査のために乳房組織試料を取り出すため、しばしば針生検手順が施される。生検手順は、任意の外科手術手順と同様に、患者への増加した危険性と関連している。生検手順は、特に、腫瘍形成の増加した危険性に関連している。
【００９６】
組織生検手順と異なり、血液サンプリングは、必要な場合には患者が行なうことができる日常的かつ安全な手順である。例えば、小さな滅菌ランセットを用いて患者の指先を穿刺し、わずかな試料血液を得ることができる。血液試料を、血清又は血奬分画を単離するために任意の好適な手順によって処理することができる。あるいは、全血試料を用いることができる。抗ＧＰ８８抗体を利用したアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて血清試料中のＧＰ８８の存在を検出し、その量を定量化することができる。血液サンプリングによって組織生検に関連する危険性が回避される。さらに、規則正しく（例えば、毎週の検査）同じ患者から血液試料を得ることにより、長期にわたり、患者のモニタリングによって血清中のＧＰ８８のレベルを検出することが可能となる。ＧＰ８８のレベルが増加した場合、有意な腫瘍の増殖が起こる前に、医師はそれに応じて患者を治療することができる（例えば、ＧＰ８８アンタゴニストを投与する）。
【００９７】
生物液中のＧＰ８８濃度測定方法を実施する際には、生物液（例えば、全血、血奬、血清、リンパ、唾液、及び尿）を抗ＧＰ８８抗体と接触させ、ＧＰ８８の濃度を測定する。例えば、約０．１ｎｇ／ｍｌの低さの濃度でＧＰ８８を検出することができる。本発明の別の実施態様において、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの生物液の濃度でＧＰ８８を検出することができる。上記の通り、抗ＧＰ８８抗体はＧＰ８８結合することができ、試料中のＧＰ８８の量を決定するのに用いることができる。生物液試料中のＧＰ８８の濃度の測定に用いることができる抗ＧＰ８８抗体の例には、ＡＴＣＣ受託番号６Ｂ３ＰＴＡ−５２６２及び６Ｂ２ＰＴＡ−５２６１（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、マナッサス（Manassas）、ＶＡ２０１１０）のハイブリドーマ細胞系から産生される抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
ＥＬＩＳＡは、試料中の抗原量の定量化のための速やかで、高感度で、かつ再現性のあるアッセイである。「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡでは、抗原（例えば、タンパク質）に結合又は「捕捉」する一次抗体及び同様に抗原に結合する標識した二次抗体を利用する。検出部分に対する基質を添加することによって、試料中に存在する抗原の量に比例するシグナル（例えば、色の変化又は放射能）が生ずる。代表的なサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、一次抗体をマイクロタイタープレートのウェルなどの支持体に吸着させる。抗原を含有する試料を付着した一次抗体とともにインキュベーションし、抗原を抗体に結合させる。次に、検出分子（例えば、酵素、放射性核種）で標識した二次抗体も抗原に結合させる。標識の例には、アルカリホスファターゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼが含まれる。あるいは、二次抗体は標識せずに、三次抗体（例えば、標識した抗ＩｇＧ抗体）をアッセイで用いることもできる。標識した三次抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の定常領域に結合する。酵素に対する基質（例えば、２，２−アゾ−ビス（３−エチルベンゼンチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、及び３，３，−５，５−テトラメチルベンジジン基剤（base）（ＴＭＢ））を添加することによって、試料中に存在する抗原の量に比例して試料溶液中の色の変化が生ずる。色の変化は、分光光度計を用いて、酵素標識によって引き起こされる色の変化を検出するのに好適な波長で（例えば、ＴＭＢを基質として用いて６２４ｎｍ）検出することができる。
【００９９】
あるいは、二次抗体又は三次抗体を放射能部分（例えば、ｌ２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２Ｃ）によって標識することができる。放射能検出器（例えば、ガンマ計数管）を用いて、抗原結合後に二次抗体より発せられる放射能を測定することができる。放射能レベルは、試料中に存在する抗原量に比例する。さらに別の代替例において、生物液試料中のＧＰ８８レベルをウエスタンブロット手順を用いて決定することができる。代表的なウエスタンブロット手順では、電流（例えば、２０ｍＡ）が施されるＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に生物液試料をローディングして、生物液中試料のタンパク質を分子量に応じて分離する。タンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、標識した抗ＧＰ８８抗体とともにインキュベーションする。抗ＧＰ８８抗体を酵素で標識する場合、ニトロセルロースメンブレンをニトロセルロースメンブレン上に位置するＧＰ８８タンパク質バンドの変色を引き起こす酵素に対する基質に曝す。試料中のＧＰ８８量は、色の変化に比例する。
【０１００】
本発明の一実施態様において、ハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６２）によって産生されるＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３をサンドイッチＥＬＩＳＡでの一次抗体として用いる。ＧＰ８８に対して生じた種々の抗体をＥＬＩＳＡで用いて、ＧＰ８８（例えば、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６２、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６１、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５８９、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５９３、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２５９、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６０、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５９１のハイブリドーマ細胞系からそれぞれ産生されるＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３、６Ｂ２、２Ａ５、４Ｄ１、３Ｆ５、５Ｂ４、３Ｆ８）を検出することができる。セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識したＧＰ８８抗体を二次抗体として用い、ＴＭＢを基質として用いることができる。あるいは、免疫グロブリンの定常領域に結合することができる標識した抗体をＥＬＩＳＡでの二次抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体）として用いることができる。既知量のＧＰ８８のタンパク質（０．１、２、５、１０、２０ナノグラム）を担体（例えば、緩衝溶液）中に含有する試料を用いて、ＥＬＩＳＡの結果に基づいた標準曲線を作成することができる。試料の光学濃度を試料中の既知量のＧＰ８８に対してプロットし、標準曲線を作成することができる（例えば、図１６）。未知試料中のＧＰ８８の濃度を、未知試料の光学濃度を測定し、ＧＰ８８濃度を計算するために標準曲線を用いることによって決定できる。
【０１０１】
サンドイッチＥＬＩＳＡの代表的なプロトコルには、以下の工程が含まれる。
【０１０２】
（１）一次抗体を含有する溶液をマイクロタイタープレートのウェルの底に添加する（例えば、２０ｍｇ／ｍｌの抗体を含有する５０マイクロリッターの抗体溶液）。
【０１０３】
（２）マイクロタイタープレートを４℃で一晩インキュベーションして、抗体をウェルに完全に結合させる。
【０１０４】
（３）ウェルを緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で洗浄する。
【０１０５】
（４）ウェルを遮断用緩衝液（例えば、ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で飽和することによって非特異的タンパク質結合を遮断する。
【０１０６】
（５）緩衝溶液でウェルを洗浄する。
【０１０７】
（６）抗原を含有する溶液を添加し、マイクロタイタープレートを室温で少なくとも２時間インキュベーションする。
【０１０８】
（７）緩衝溶液でウェルを洗浄する。
【０１０９】
（８）標識した二次抗体を添加し、マイクロタイタープレートを室温で少なくとも２時間インキュベーションする。
【０１１０】
（９）緩衝溶液でウェルを洗浄する。
【０１１１】
（１０）緩衝溶液で希釈された所望の基質を添加して、反応が起こるのに十分な時間を許容する。
【０１１２】
（１１）得られた基質溶液の光学濃度を基質に対して適切な波長においてＥＬＩＳＡ読み取り器で読み取る。
【０１１３】
図１６は、血清生物液中のＧＰ８８の濃度の決定に用いることができる代表的な曲線を示している。既知量の組換えＧＰ８８タンパク質を含有する試料を調製して、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。試料の光学濃度を既知量ＧＰ８８のタンパク質に対してプロットした。図１６は、生物液試料のＯＤ（光学濃度）（ｙ軸）及びＧＰ８８の濃度（ｘ軸）の間の直線的な関係を示している。上記の好適な検出技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット）において抗ＧＰ８８抗体を用いて生物液試料中のＧＰ８８の濃度を決定することができる。一実施態様において、生物液試料の光学濃度を測定し、測定した光学濃度を標準曲線（例えば、図１６）と比較することによって生物液試料中のＧＰ８８の濃度を決定する。例えば、図１６の曲線を用いて、抗ＧＰ８８抗体と接触させ、かつ、免疫測定法を施した生物液試料の光学濃度が０．６である場合、生物試料液中のＧＰ８８濃度は１５ｎｇ／ｍｌであろう。
【０１１４】
健康なヒトでのＧＰ８８の血清濃度は、健康なヒトでは約２３ｎｇ／ｍｌ及び４４ｎｇ／ｍｌの間で変動する。健康なヒトボランティアから得た血奬中のＧＰ８８レベルの測定では、同様の結果が示された。ヒト乳癌患者では、血清中で高いレベルのＧＰ８８が示された。２０人の乳癌患者のうち３人で、高いレベルのＧＰ８８（４９、５１、及び５６ｎｇ／ｍｌ）が示された。しかしながら、治療に対して何ら反応を示さない進行性の疾患（例えば、転移性）を有する患者は、劇的に増加したＧＰ８８血清レベルを長期にわたって有していた（２７〜２３３ｎｇ／ｍｌ、６ヶ月）。抗腫瘍形成治療に反応性でない進行した（advanced）疾患を有する別の患者は、２００２年３月２１日に１５８ｎｇ／ｍｌのＧＰ８８血清濃度を有し、２００２年５月２３日に１４８ｎｇ／ｍｌのＧＰ８８血清濃度を有していた。非転移性乳癌であると最初診断された患者及び寛解中の患者は、正常範囲内のＧＰ８８血清濃度を有していた。したがって、高いＧＰ８８血清濃度（例えば、約４０〜５０ｎｇ／ｍｌ）は腫瘍形成を示している。非常に高いＧＰ８８血清レベル（例えば、約１００〜３００ｎｇ／ｍｌ）は、進行性の疾患であり、かつ、抗腫瘍形成治療に抵抗性であることを示している。
【０１１５】
本発明の別の実施態様において、第１の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、第２の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、第２の生物液試料中の測定されたＧＰ８８タンパク質レベルが第１の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルよりも腫瘍形成能を示すのに十分な程に高い量であるかを判定することによって腫瘍形成を診断する工程を含む、腫瘍形成の診断方法を提供する。最初の生物液試料は、癌又は細胞増殖に関連する疾患を有すると疑われる患者から採取することができる。最初の生物液試料中のＧＰ８８のレベルを測定し、異なる時間に採取した第２の生物液試料中のＧＰ８８のレベルと比較することができる。生物液試料を規則正しい間隔で採取し、後の試料中の測定されたＧＰ８８濃度を第１の試料中のＧＰ８８レベルと比較するすることができる。結果が長期にわたって生物液中のＧＰ８８のレベルの増加を示す場合、医師は腫瘍の増殖を減少又は排除するために患者の治療を開始又は改変することができる。
【０１１６】
本発明は、抗腫瘍形成治療を受けている患者から得た生物液試料中のＧＰ８８の濃度を測定する工程を含み、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌのＧＰ８８の濃度は患者が抗腫瘍形成治療に反応しないことを示す、患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるか又は反応しているかの判定方法も提供する。「抗腫瘍形成治療」という用語は、癌又は増殖に関連する疾患を治療する目的のための任意の薬剤、薬物、治療、又は薬剤、薬物、若しくは治療薬の投与方法をいう。抗腫瘍形成治療の例には、抗エストロゲン治療、抗腫瘍抗体（例えば、抗ＧＰ８８抗体）の使用、アンチセンス療法（例えば、抗ＧＰ８８核酸）、化学療法、放射線療法、及び遺伝子治療が含まれる。抗腫瘍形成治療を受けている患者のＧＰ８８血清濃度を、規則正しい間隔で（例えば、毎日、毎週、毎月）血清試料を分析することによってモニタリングすることができる。少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌのＧＰ８８血清レベルは、患者が抗腫瘍形成治療に反応性でないか又は反応していないことを示すであろう。
【０１１７】
ある種の抗腫瘍形成治療は、患者に対して望ましくない副作用又はさらなる危険性を有する。例えば、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン）による乳癌の治療又は予防は、卵巣癌の危険性の増加と関連している。高いＧＰ８８レベルは、患者が抗エストロゲンによる治療に反応しないことを示している。患者が高いＧＰ８８レベルを有する場合（例えば、約１００ｎｇ／ｍｌより大きい）、患者は抗エストロゲン治療に反応性でない可能性が高く、抗エストロゲン治療が有するさらなる危険性はいずれの利益よりも勝っているであろう。化学療法も、嘔気、衰弱、脱毛、食欲喪失などの多くの望ましくない副作用と関連している。患者が特定のタイプの化学療法に反応しない可能性が高い場合、より少ない副作用を有する抗腫瘍形成治療がより効果的であり、患者にさらなる外傷を与えない。本発明は、患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるか又は反応しているかの判定に有用である。
【０１１８】
本発明の別の実施態様は、生物液試料中のＧＰ８８濃度を測定する工程、及び生物液試料中のＧＰ８８濃度が約４０〜５０ｎｇ／ｍｌである場合に癌を治療又は予防するのに十分な量の抗腫瘍形成治療を投与する工程による、患者における癌再発の治療又は予防方法を提供する。先に記載して示した通り、約４０ｎｇ／ｍｌ以上のＧＰ８８血清レベルを有する患者は癌であると診断されるか、有意に高い癌発達の危険性を有する。抗腫瘍形成治療（例えば、抗エストロゲン治療、抗腫瘍抗体療法、アンチセンス治療、化学療法、放射線療法、及び遺伝子治療）を癌であると診断されたか、高い癌発達の危険性があると診断された患者に疾患を予防又は治療するために投与することができる。
【０１１９】
抗エストロゲン治療は、腫瘍の成長を予防又は治療する目的での抗エストロゲン剤の投与に関する。抗エストロゲン剤の例には、タモキシフェン及びラロキシフェンが含まれる。クエン酸タモキシフェン（「タモキシフェン」）は、強力な抗エストロゲン及び抗新生物特性が実証された、乳癌を患った患者によく処方される非ステロイド抗エストロゲンである。米国特許第４，５３６，５１６号を参照されたい。タモキシフェンは、エストロゲン受容体への結合に関してエストロゲンと競合するエストロゲン受容体アンタゴニストである。他の抗エストロゲンには、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤（例えば、アリミデックス（Arimidex（登録商標）（アナストロゾール）、フェメラ（Femera）（登録商標））、及びエストロゲン受容体ダウンレギュレート調節剤（down-regulators）（例えば、ファスロデックス（Faslodex）（登録商標））が含まれる。タモキシフェンの抗エストロゲン効果は、標的組織中の結合部位に関してエストロゲンと競合する能力に関するものであってもよい。アロマターゼ阻害剤などの他の抗エストロゲンは、利用可能なエストロゲンの量を阻害又は減少させる。
【０１２０】
抗腫瘍抗体（例えば、抗ＧＰ８８抗体、ヘルセプチン）を患者に投与して、腫瘍を起こす又は促進するタンパク質又はその他の分子の活性を阻害することができる。例えば、抗ＧＰ８８抗体を投与してＧＰ８８の活性を阻害することができる。抗腫瘍抗体を上記の種々の経路（経口、注射、非経口）で患者に投与することができる。
【０１２１】
アンチセンス治療とは、腫瘍の複製を促進する遺伝子を阻害するため、あるいは腫瘍を促進するタンパク質の翻訳を阻害するため、患者へアンチセンス核酸を投与することをいう。アンチセンス治療の例には、抗ＧＰ８８アンチセンス核酸の投与が含まれる。アンチセンス核酸は、組織に直接注射することによって投与することができ、あるいは静脈内又は非経口投与することができる。生体外（ex vivo）技術を用いてアンチセンス核酸を細胞に投与することができる。腫瘍形成細胞又は正常細胞を被検体（例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又はニワトリ）から取り除いて、培養物中で増殖させることができる。細胞は、アンチセンス核酸をコードするＤＮＡ又はＲＮＡでトランスフェクションされ、再び被検体に導入され、アンチセンス核酸を産生して、腫瘍細胞増殖を阻害することができる。
【０１２２】
「遺伝子治療」とは、腫瘍の増殖を予防又は治療するために、抗腫瘍タンパク質をコードする核酸を患者へ投与することをいう。アンチセンス核酸と同様に、直接注射することにより、あるいは上記のｅｘ ｖｉｖｏ技術を用いて、遺伝子治療用の核酸を投与することができる。遺伝子治療用の核酸でトランスフェクションされた細胞は、抗腫瘍タンパク質を産生して、腫瘍の増殖を阻害又は予防する。
【０１２３】
化学療法とは、一般的に、化学化合物又は化学化合物の組み合わせ（例えば、メトトレキセート）を用いた癌の治療をいう。化学療法剤の特定の組み合わせは、特定の腫瘍タイプ及び疾患の段階に依存する。放射線療法とは、腫瘍細胞を直接的に殺すための放射線（例えば、ガンマ照射）の使用をいう。用いられる照射の量及びタイプも、特定の腫瘍タイプ及び疾患の段階に依存する。
【０１２４】
本発明は、腫瘍形成診断用及び患者が抗腫瘍形成治療に反応性であるか又は反応しているかを決定するためのキットも提供する。そのようなキットは、容器及びＧＰ８８検出用の化合物（例えば、抗ＧＰ８８抗体又は抗体フラグメント）を含有することが好ましい。抗ＧＰ８８抗体又は抗体フラグメントを、好適な検出方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫測定法）で用いるために標識することができる（例えば、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識、及び化学標識）。一実施態様において、キットは、少なくとも１種の一次抗体（例えば、抗ＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３）、少なくとも１種の標識した二次抗体（例えば、ＨＲＰなどの検出酵素で標識した抗ヒトＧＰ８８ポリクローナル抗体）、及び少なくとも１種の基質（例えば、ＴＭＢ）を含有する。あるいは、キットは、酵素で標識した二次抗体の代わりに放射性標識した二次抗体を含有することができる。キットは、検出アッセイを行うための使い捨て型補給品（例えば、マイクロタイタープレート、ピペット）も含有することができる。
【０１２５】
ＧＰ８８アンチセンス成分
本発明は、ＧＰ８８アンチセンス成分も提供する。細胞中でのアンチセンスＲＮＡの構成性発現は２０種より多くの遺伝子の発現を阻害することが示され、列記は増え続けている。アンチセンス効果の可能な機構は翻訳の遮断又はスプライシングの妨害であり、双方ともin vitroで観察されている。スプライシングの妨害によって、保存性が低いイントロン配列が使用されることとなり、したがってより大きな特異性が生じ、ある種の遺伝子産物の発現は阻害されるが別の種ではそのホモログは阻害されないこととなる。
【０１２６】
アンチセンス成分との用語は、ｍＲＮＡの翻訳が阻害されるようにアンチセンスＲＮＡ及びｍＲＮＡの間の分子ハイブリダイゼーションを生ずるのにアンチセンスＲＮＡが特異的である特定のｍＲＮＡ分子に十分に相補的である、ＲＮＡ配列及び該ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列に対応する。そのようなハイブリダイゼーションをin vivo条件下で行うことができる。アンチセンスＲＮＡの作用によって、細胞中での遺伝子発現の特異的阻害が生ずる。
【０１２７】
本発明によれば、ＧＰ８８ｃＤＮＡに対するＤＮＡアンチセンスで多発性骨髄腫細胞をトランスフェクションすることによって、内因性ＧＰ８８の発現が阻害され、アンチセンスｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞の腫瘍形成が阻害される。このアンチセンスＤＮＡは、作用がスプライシング、転写、又は翻訳のレベルであるかに関わらず、アンチセンスＲＮＡがＧＰ８８遺伝子（又はｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションしてＧＰ８８遺伝子発現を阻害することができるように、ＧＰ８８遺伝子に対して十分な相補性（長さ約１８〜３０ヌクレオチド）を有していなければならない。阻害の程度は、本明細書中の技術が与えられれば過度の実験なしに当業者に容易に認識でき、増殖がＧＰ８８の発現に依存した細胞の増殖を阻害するのに十分であることが好ましい。当業者は、アンチセンスＲＮＡ手法は特異的遺伝子発現を遮断するために用いられる多数の既知の機構の１つであることを十分に認識している。
【０１２８】
本発明のアンチセンス成分は、コード配列、３’又は５’非翻訳領域、又は他のイントロン配列を含む標的ＧＰ８８ｃＤＮＡのいくつかの部分のいずれとも又はＧＰ８８のｍＲＮＡとハイブリダゼーションすることができる。当業者に容易に理解される通り、本発明に必要な最小量の相同性は、好ましくは他のｍＲＮＡ分子の機能及び他の無関係な遺伝子の発現に影響を及ぼすことなしにＧＰ８８のＤＮＡ又はｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを生じ、かつ、ＤＮＡの転写又はｍＲＮＡの翻訳若しくは機能を阻害するのに十分なものである。
【０１２９】
プロモーターを含む適切な調節配列とともにアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡが配置されたレトロウイルスベクター及びプラスミドを含むベクターによる形質転換又はトランスフェクションによってアンチセンスＲＮＡが細胞に送達され、宿主細胞中でアンチセンスＲＮＡの発現が生じる。ＧＰ８８のｃＤＮＡフラグメントをアンチセンス方向で含有する種々のアンチセンス発現ベクターの安定的なトランスフェクションを行った。レトロウイルスベクターを用いてアンチセンス成分を細胞に送達することもできる。リポソームによって送達することもできる。
【０１３０】
in vivo治療用のアンチセンス技術の目的のために、現在好ましい方法は、発現ベクター中に構成されたアンチセンスｃＤＮＡフラグメントの安定的なトランスフェクションを行なうのに代えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることである。長さ１５〜３０個の塩基のサイズを有し、かつ、コード配列、３’又は５’非翻訳領域、又は他のイントロン配列を含む標的ＧＰ８８のｃＤＮＡのいくつかの部分のいずれか、又はＧＰ８８のｍＲＮＡとハイブリダイゼーション可能な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。ＧＰ８８に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、最も効力があるアンチセンス効果を有するものとして選択されることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の標的部位を律する要因は、オリゴヌクレオチドの長さ、結合親和性、及び標的配列への到達容易性（accessibility）に関連する。ＧＰ８８タンパク質翻訳及びＧＰ８８に関連する表現型の阻害、例えば培養物中の細胞増殖の阻害を測定することにより、配列をそのアンチセンス活性についてin vitroでスクリーニングすることができる。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＲＮＡのほとんどの領域（５’及び３’非翻訳領域、ＡＵＧ開始部、コード領域、スプライス接合部、及びイントロン）を標的にすることができることは既知である。
【０１３１】
好ましいＧＰ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは安定であり、ヌクレアーゼ（オリゴヌクレオチドを潜在的に分解することができる酵素）に対して高い回復力（resilience）を有し、非毒性用量でそれらを疾患組織へ運搬することを可能とする好適な薬物動態を有し、かつ、形質膜を横切る能力を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１３２】
ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。リン酸ジエステル結合の修飾及び複素環又は糖の修飾によって、効力を増加することができる。リン酸ジエステル結合の修飾に関して、ホスホロチオエートを用いることができる。Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合は、ヌクレアーゼに対してオリゴヌクレオチドを安定化し、ＲＮＡへの結合を増加すると記載されている。ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合は、リボース及びリン酸ジエステル骨格の完全な置換であり、ヌクレアーゼに安定であり、ＲＮＡに対する結合親和性を増加し、かつ、ＲＮＡｓｅＨによって開裂されない。その基本構造は、アンチセンス成分としてそれを最適化することを可能とする修飾を受け入れやすい（amenable）。複素環の修飾に関して、ある種の複素環修飾は、ＲＮＡｓｅＨ活性を妨げることなしにアンチセンス効果を増大することが証明されている。そのような修飾の例は、Ｃ−５チアゾール修飾である。最後に、糖の修飾も考慮することができる。２’−Ｏ−プロピル及び２’−メトキシエトキシリボース修飾は、細胞培養物中及びin vivoにおいてヌクレアーゼに対してオリゴヌクレオチドを安定化する。ｃ−ｒａｆ−１を標的としたこれらのタイプのオリゴヌクレオチドを用いた細胞培養物及びin vivo腫瘍実験では、効力が増大した。
【０１３３】
送達経路は、上記の基準に従って測定された最良のアンチセンス効果を提供するものである。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたin vitro細胞培養アッセイ及びin vivo腫瘍増殖アッセイによって、カチオン性リポソームによって仲介される送達、レトロウイルスベクターによって仲介される送達、及び直接的な送達が効果的であることが示された。別の可能性ある送達様式は、抗体を用いて腫瘍細胞の細胞表面マーカーを標的としたものである。ＧＰ８８又はその受容体に対する抗体は、この目的に役立つことができる。
【０１３４】
組換えＧＰ８８
本発明は、他の哺乳動物ＤＮＡ配列を実質的に有さない組換えＧＰ８８ポリペプチド又はその機能性誘導体を発現するためのＤＮＡ発現系にも関する。そのようなＤＮＡは、二重鎖又は一本鎖であることができる。ＤＮＡ配列は、好ましくは、別のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能とするために約２０個以上のヌクレオチドを有しなければならない。ＧＰ８８タンパク質又はその同族体若しくは機能性誘導体をコードする配列以外の配列とのハイブリダイゼーションが無いことによって特徴付けられるより高い特異性のハイブリダイゼーションを達成するためには、長さが少なくとも５０個のヌクレオチドが好ましい。
【０１３５】
本発明は、上記のＤＮＡ分子、発現可能なベヒクル又はベクター、及びベヒクルでトランスフェクションされた又は形質転換された、かつ、ポリペプチドを発現することができる宿主にも関する。そのような宿主は、原核生物、好ましくは細菌、又は真核生物、好ましくは酵母若しくは哺乳動物細胞であることができる。好ましいベクター系には、昆虫細胞中で発現するバキュロウイルスが含まれる。形質転換、形質導入(transduction)、トランスフェクション、感染、又は当該技術分野で既知の関連するプロセスによって、ＤＮＡを宿主生物に組み込むことができる。ＧＰ８８ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びｍＲＮＡ配列に加えて、本発明は核酸配列の発現方法も提供する。さらに、遺伝子配列及びオリゴヌクレオチドによって、本明細書中に記載されるポリペプチドＧＰ８８と配列相同性を有する追加のポリペプチドの同定及びクローニングが可能となる。
【０１３６】
発現ベクターは、（適切な転写及び／又は翻訳制御配列の存在ゆえに）ベクター中にクローニングされたＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）分子を発現することができ、それによってポリペプチド又はタンパク質を産生するベクターである。クローニングされた配列の発現は、発現ベクターが適切な宿主細胞に組み込まれたときに起こる。原核生物発現ベクターを用いた場合、適切な宿主細胞はクローニングされた配列を発現することができる任意の原核生物細胞であろう。同様に、真核生物発現系を用いた場合、適切な宿主細胞はクローニングされた配列を発現することができる任意の真核生物細胞であろう。例えば、バキュロウイルスベクターを用いて、ＧＰ８８ｃＤＮＡをクローニングし、続いて昆虫細胞中でｃＤＮＡを発現することができる。
【０１３７】
ＧＰ８８ポリペプチド又はその機能性誘導体をコードするＤＮＡ配列を、連結のための平滑末端又は付着末端、適切な末端を与える制限酵素消化、必要に応じた付着末端の充填（filling）、望ましくない接合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び的確な酵素リガーゼによる連結を含む慣用技術に従って、ベクターＤＮＡと組み換えることができる。そのような操作のための技術は（３５）で論じている。
【０１３８】
核酸分子は、該核酸分子が転写及び翻訳調節情報を含有するヌクレオチド配列を含有し、かつ、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に動作可能に結合されている場合、ポリペプチドを発現することができる。動作可能な結合とは、調節ＤＮＡ配列及び発現させたいＤＮＡ配列が遺伝子発現するような方法で結合される結合である。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は生物ごとに変わってもよいが、一般には、原核生物ではプロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指示する）及びＲＮＡに転写されたときにタンパク質合成の開始をシグナル伝達するＤＮＡ配列の双方を含有するプロモーター領域を含んでいなければならない。それらの領域は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャップ形成配列（capping sequence）、ＣＡＡＴ配列などの転写及び翻訳の開始に関与するそれらの５’非コード配列などを含む。
【０１３９】
所望する場合、タンパク質をコードする遺伝子配列に対する３’非コード領域を記載の方法（適切なｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング又はＰＣＲ増幅）によって得ることができる。この領域は、終結及びポリアデニル化などの転写終結調節配列が存在するために保持することができる。したがって、タンパク質をコードするＤＮＡ配列にもともと隣接している３’領域を保持することによって、転写終結シグナルを付与することができる。発現宿主細胞中で転写終結シグナルが与えられず、又は満足がいくほど機能的ではない場合、別の遺伝子由来の３’領域に置き換えることができる。
【０１４０】
配列間の結合の性質によって、フレームシフト変異の導入が生じず、かつ、ポリペプチド遺伝子配列の転写を指示するプロモーター配列の能力が妨げられない場合、プロモーター領域配列及びＧＰ８８コード配列などの２つのＤＮＡ配列が動作可能に結合していると言う。プロモーター配列は、原核生物性、真核生物性、又はウイルス性であることができる。好適なプロモーターは、誘導性、抑制性、又は構成的であることができる。
【０１４１】
真核生物プロモーターには、マウスメタロチオネインＩ遺伝子用プロモーター、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、遺伝子ｇａｌ４プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、及びサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれるが、限定するものではない。強力なプロモーターが好ましい。そのようなプロモーターの例は、Ｔ３、ＳＰ６、及びＴ７ポリメラーゼ、バクテリオファージラムダのＰＬプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、及びＣＭＶプロモーターを認識するものである。
【０１４２】
本発明の教示を特定の問題又は環境へ適用することは、本明細書中に含まれる技術に照らして、当業者の能力の範囲内であると理解すべきである。以下の限定するものではない実施例によって本発明をより十分に例証する。
【実施例１】
【０１４３】
生物液試料中のＧＰ８８濃度の決定
１７人の正常かつ健康なヒトボランティアから血清試料を得た。ヒト血清試料中のＧＰ８８濃度を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって３つ組で測定した。３０％グリセロール及び１％ミルク−ＰＢＳの溶液に希釈した組換えＧＰ８８から０、０．１、０．２５、０．５、１、３、１０、及び２０ｎｇ／ｍｌの濃度で標準のＧＰ８８試料を調製した。マイクロタイタープレート上の１００マイクロリットルのウェルを１ミリリットルあたり１０マイクログラムの抗ヒトＧＰ８８モノクローナル抗体６Ｂ３（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．７８ｍｇ／ｍｌの６Ｂ３抗体）でコーティングし、４℃で一晩インキュベーションした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、続いて抗ヒトＰＣＤＧＦポリクローナル（ＩｇＧ分画）を各ウェルに３マイクログラム／ｍｌの濃度で３７℃で１．５時間添加した。各ウェルへの検出抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ヤギ−ウサギ−ＩｇＧ）の添加前に、ウェルをＰＢＳ中で洗浄した。ＴＭＢ（基質）を添加し、試料とともに１時間インキュベーションした。６２０ナノメートルの波長で設定したＥＬＩＳＡ分光計読み取り器を用いて試料の光学濃度を決定した。各試料中のＧＰ８８量（ｘ軸）に対して標準のＧＰ８８試料の光学濃度（ｙ軸）をプロットし、標準曲線を作成した（図１６）。未知試料中のＧＰ８８の濃度は、光学濃度を測定し、標準曲線（図１６）を用いてＧＰ８８濃度を決定することによって決定した。表３は、１７人の健康なヒトボランティアの各人のＧＰ８８血清試料濃度を提供するものである。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
表４は、抗腫瘍形成治療に反応しない進行した（advanced）進行性の乳癌を有する患者から採取したＧＰ８８の血清試料濃度を示している。ＧＰ８８血清濃度は、６ヶ月の期間中に２７ｎｇ／ｍｌから２３３ｎｇ／ｍｌに増加した。
【０１４６】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１Ａ】図１Ａは、１２４６、１２４６−３Ａ、及びＰＣ細胞系中のＧＰ８８タンパク質発現レベルを比較する。２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＤＭＥ−Ｆ１２培地中で細胞を培養した。抗Ｋ１９Ｔ抗体を用いた免疫沈降及びウエスタンブロット分析により、ＧＰ８８発現レベルを測定した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１２４６、１２４６−３Ａ、及びＰＣ細胞系でのＧＰ８８ｍＲＮＡ発現レベルを比較する。ＲＰＬ３２のｍＲＮＡを等量のＲＮＡローディングの内部対照として用いた。
【図１Ｃ】図１Ｃは、無血清及び血清含有培地中の１２４６細胞（左パネル）及びＰＣ細胞（右パネル）中でのＧＰ８８ｍＲＮＡの発現を比較する。結果により、１２４６細胞中でのＧＰ８８発現はウシ胎児血清の添加によって阻害されるのに対し、腫瘍形成能の高いＰＣ細胞ではそのような阻害が観察されないことが示される。
【図２】図２は、抗ＧＰ８８中和抗体の濃度の増加による、腫瘍形成能の高いＰＣ細胞の治療効果を例証している。
【図３】図３は、１０６個のアンチセンスＧＰ８８をトランスフェクションしたＰＣ細胞を皮下注射したＣ３Ｈマウス（下部）及び空のベクターをトランスフェクションした対照ＰＣ細胞を皮下注射したＣ３Ｈマウス（上部）を示している。
【図４】図４は、Ｃ３Ｈマウス腫瘍組織及び周囲正常組織中でのin vivoＧＰ８８発現レベルを示している。
【図５】図５は、エストロゲン受容体陽性及びエストロゲン受容体陰性ヒト乳癌細胞系中でのＧＰ８８ｍＲＮＡ発現レベルを示している。
【図６】図６は、マウス乳房上皮細胞系Ｃ５７の増殖に対するＧＰ８８濃度の増加の効果を示している。
【図７】図７は、サイトメガロウィルスプロモーターで制御されかつアンチセンス方向でＧＰ８８を含有する発現ベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞、及び空のベクターでトランスフェクションしたＰＣ細胞の増殖特性及び腫瘍形成能力を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、マウスＧＰ８８のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示している。抗ＧＰ８８抗体であるＫ１９Ｔ及びＳ１４Ｒを生じさせるための抗原として用いられるペプチド領域には下線を引いてある。ｐＣＭＶ４哺乳動物発現ベクターにアンチセンス方向でクローニングされた領域が括弧の間に示されている。
【図８Ｂ】図８Ｂは、マウスＧＰ８８のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示している。
【図８Ｃ】図８Ｃは、マウスＧＰ８８のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示している。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒトＧＰ８８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示している。ｐｃＤＮＡ３哺乳動物発現系にアンチセンス方向でクローニングされた領域が括弧の間に示されている。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ヒトＧＰ８８の推定アミノ酸配列を示している。抗ヒトＧＰ８８中和抗体を生成するための抗原として用いるＥ１９Ｖ領域に下線を引いてある。それは、マウスＳ１４Ｒ領域に相当する領域Ａ１４Ｒも示している。
【図１０】図１０は、グラヌリンｇ、ｆ、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄ、及びｅ（右側）として定義される７つと半分の繰り返しを示すように並べたマウスＧＰ８８のアミノ酸配列を示している。この図示により、抗ＧＰ８８中和抗体を生成するためのＧＰ８８抗体を生じさせるのに用いる領域Ｋ１９Ｔ及びＳ１４Ｒが変異体領域とみなされるものの中の２つのエピセリン／グラヌリンの繰り返しの間に見出されることが示される。Batemanら（６）による繰り返しのグラヌリン分類を右側及び左側に示す。グラヌリンＢ及びグラヌリンＡはそれぞれ、Plowmanら（1992）（５）によるエピセリン２及びエピセリン１としても定義される。
【図１１】図１１は、ＧＰ８８アンチセンスｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングするための制限部位を示すｐＣＭＶ４及びＧＰ８８ｃＤＮＡクローンを図示したものを示している。
【図１２】図１２は、ＣＣＬ−６４細胞上のＧＰ８８細胞表面受容体への１３５Ｉ−ｒＧＰ８８の架橋を示している。スベリン酸ジスクシンイミジル（disuccinimidyl suberate）（ＤＳＳ）を用いて架橋反応を行なった。７％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって反応産物を分析した。
【図１３】図１３は、３Ｔ３線維芽細胞、ＰＣ細胞、及びＣ５７ＭＧ乳房上皮細胞上のＧＰ８８細胞表面受容体への１３５Ｉ−ｒＧＰ８８の架橋を示している。結果は、これらの種々の細胞系がＣＣＬ６４細胞上のものと類似した分子量のＧＰ８８細胞表面受容体を提示することを示している（図１２）。
【図１４】図１４は、非腫瘍形成ＭＣＦ１０Ａ及び悪性（ＭＣＦ７、ＭＤＡ−４６８）ヒト乳房上皮細胞中でのＧＰ８８発現レベルを示している。
【図１５】図１５は、ヒト乳癌ＭＤＡ−４６８細胞中でアンチセンスＧＰ８８ｃＤＮＡのトランスフェクションによってＧＰ８８発現が阻害されることを示している。
【図１６】図１６は、既知量のＧＰ８８（ｘ軸）を含有する血清試料の光学濃度（ｙ軸）を示すグラフである。血清などの生物液試料中のＧＰ８８濃度を決定するのための参照として、グラフを用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物液を抗ＧＰ８８抗体又は抗体フラグメントと接触させる工程及びＧＰ８８の濃度を測定する工程を含み、ここで１ミリリットルあたりのＧＰ８８濃度が約０．１〜約１０ナノグラムの低さでもＧＰ８８を検出することが可能である、生物液中のＧＰ８８濃度の高感度測定方法。
【請求項２】
前記ＧＰ８８抗体が、ＡＴＣＣ受託番号６Ｂ３ＰＴＡ−５２６２及びＡＴＣＣ受託番号６Ｂ２ＰＴＡ−５２６１から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株から産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＧＰ８８抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者から採取した第１の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、前記患者から採取した第２の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、及び前記第２の生物液試料中の測定されたＧＰ８８タンパク質レベルが前記第１の生物液試料中のレベルよりも腫瘍形成能を示すのに十分な程に高い量であるかを判定することによって腫瘍形成を診断する工程を含む、腫瘍形成の診断方法。
【請求項５】
抗ＧＰ８８抗体を用いて生物液試料中のＧＰ８８レベルを測定する工程、及び前記生物液試料中のＧＰ８８レベルが腫瘍形成を示すのに十分であるかを判定する工程を含む、腫瘍形成の診断方法。
【請求項６】
患者から得た生物液試料中のＧＰ８８濃度を測定する工程、及び前記生物液試料中のＧＰ８８濃度が、前記患者が抗腫瘍形成治療に反応していないか又は反応性でないかを示すのに十分であるかを判定する工程を含む、患者が抗腫瘍形成治療に反応しているか反応性であるかの判定方法。
【請求項７】
患者から得た生物液試料中のＧＰ８８濃度を決定する工程、及び前記生物液試料中のＧＰ８８濃度が腫瘍形成を示すのに十分である場合に、癌を治療又は予防するのに十分な量の抗腫瘍形成治療を投与する工程を含む、患者における癌再発の治療又は予防方法。
【請求項８】
容器及び抗ヒトＧＰ８８抗体又は抗体フラグメントを含有する、腫瘍形成診断のためのキット。
【請求項９】
容器及び抗ヒトＧＰ８８抗体を含有する、患者が抗腫瘍形成治療に反応しているか又は反応性であるかを判定するためのキット。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５２６２、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５２６１、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５８９、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５９３、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２５９、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６０、及びＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５９１から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株から産生される抗ＧＰ８８抗体。
【請求項１】
生物液を抗ＧＰ８８抗体又は抗体フラグメントと接触させる工程及びＧＰ８８の濃度を測定する工程を含み、ここで１ミリリットルあたりのＧＰ８８濃度が約０．１〜約１０ナノグラムの低さでもＧＰ８８を検出することが可能である、生物液中のＧＰ８８濃度の高感度測定方法。
【請求項２】
前記ＧＰ８８抗体が、ＡＴＣＣ受託番号６Ｂ３ＰＴＡ−５２６２及びＡＴＣＣ受託番号６Ｂ２ＰＴＡ−５２６１から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株から産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＧＰ８８抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者から採取した第１の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、前記患者から採取した第２の生物液試料中のＧＰ８８タンパク質レベルを測定する工程、及び前記第２の生物液試料中の測定されたＧＰ８８タンパク質レベルが前記第１の生物液試料中のレベルよりも腫瘍形成能を示すのに十分な程に高い量であるかを判定することによって腫瘍形成を診断する工程を含む、腫瘍形成の診断方法。
【請求項５】
抗ＧＰ８８抗体を用いて生物液試料中のＧＰ８８レベルを測定する工程、及び前記生物液試料中のＧＰ８８レベルが腫瘍形成を示すのに十分であるかを判定する工程を含む、腫瘍形成の診断方法。
【請求項６】
患者から得た生物液試料中のＧＰ８８濃度を測定する工程、及び前記生物液試料中のＧＰ８８濃度が、前記患者が抗腫瘍形成治療に反応していないか又は反応性でないかを示すのに十分であるかを判定する工程を含む、患者が抗腫瘍形成治療に反応しているか反応性であるかの判定方法。
【請求項７】
患者から得た生物液試料中のＧＰ８８濃度を決定する工程、及び前記生物液試料中のＧＰ８８濃度が腫瘍形成を示すのに十分である場合に、癌を治療又は予防するのに十分な量の抗腫瘍形成治療を投与する工程を含む、患者における癌再発の治療又は予防方法。
【請求項８】
容器及び抗ヒトＧＰ８８抗体又は抗体フラグメントを含有する、腫瘍形成診断のためのキット。
【請求項９】
容器及び抗ヒトＧＰ８８抗体を含有する、患者が抗腫瘍形成治療に反応しているか又は反応性であるかを判定するためのキット。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５２６２、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５２６１、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５８９、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５９３、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２５９、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５２６０、及びＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５５９１から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株から産生される抗ＧＰ８８抗体。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００６−５０４１０４（Ｐ２００６−５０４１０４Ａ）
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４８５２０（Ｐ２００４−５４８５２０）
【出願日】平成１５年１０月２７日（２００３．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３４１４６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９２４４
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５０５１６１２２０）エイアンドジー ファーマスーティカル インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月２７日（２００３．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３４１４６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９２４４
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５０５１６１２２０）エイアンドジー ファーマスーティカル インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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