芽胞形成細菌の検出用ポリヌクレオチドおよび芽胞形成細菌の検出法
【課題】腐敗の原因となる芽胞形成細菌を迅速で簡便に検出・同定できるプローブおよびプライマーの提供。
【解決手段】ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、芽胞形成細菌の検出に用いられるプローブおよびプライマー。
【解決手段】ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、芽胞形成細菌の検出に用いられるプローブおよびプライマー。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、芽胞形成細菌の検出に用いられるプローブおよびプライマーに関する。本発明は、また、芽胞形成細菌の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチラス属やクロストリディウム属の細菌は耐久性と休眠性を備えた細菌内生胞子（以下、「芽胞」ということがある）を形成する（蜂須賀養悦 1988 芽胞学 東海大学出版、The Bacterial Spore Vol.2 1983 Edited by Hurst A., and Gould G.W. Academic Press）。これらの細菌内生胞子は一般的に栄養細胞よりも耐熱性が高いことから、加熱処理による生菌数の減少率を測定することにより、試料中に含まれる胞子の有無を知ることができる。あるいは、試料を胞子染色し顕微鏡観察するか、位相差顕微鏡で観察することにより、直接存在を確認することができる（近藤雅臣・渡部一仁 編著（１９９５）スポア実験マニュアル 技報堂出版）。これらの方法は、培養可能で胞子形成条件が知られている細菌の研究や、多数の胞子によって汚染された食品・飲料などの検査にのみ有効である。
【０００３】
一方、１６Ｓ ｒＲＮＡなど保存性の高い遺伝子の塩基配列を比較解析することにより、既知の芽胞形成細菌との類縁性から芽胞形成の可能性を予測することもできる。しかし、バチラス属やクロストリディウム属の類縁菌には、非芽胞形成細菌であるリステリア属やスタフィロコッカス属などが存在することから、系統上の類縁性だけで芽胞形成能を判別することは容易でない（Bacterial spore formers 2004 Edited by Ricca E., Henriques A.O., and S. Cutting, Horizon Bioscience）。
【０００４】
近年、細菌ゲノム研究の発展により、多くの芽胞形成細菌について遺伝情報の比較が可能となった。枯草菌は芽胞形成細菌のモデル生物であり、芽胞形成機構の遺伝学的・分子生物学的解析が最も進んでいる。枯草菌において芽胞形成期特異的に発現する遺伝子は約４００種類存在する（Steil L., Serrano M., Henriques A.O., Vlker U. 2005 Microbiology 151:399-420）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Bacillus属やClostridium属に代表される芽胞形成細菌は、熱などに対する抵抗性や長期休眠能を持った芽胞を形成する。これらの芽胞は防除が困難であり、食品・飲料・医薬品などの変敗の原因となるため、芽胞形成細菌の迅速で簡便な検出法の開発が求められている。
【０００６】
すなわち、本発明は、腐敗の原因となる芽胞形成細菌を迅速で簡便に検出・同定できるプローブおよびプライマー並びに方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いわゆる芽胞細菌は全てFirmicutes門に属しているが、Firmicutes門には非芽胞形成細菌も含まれている。本発明者らは、細菌の分類から離れて、芽胞形成細菌に特異的な遺伝子の特定を試みた。その結果、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧのタンパク質の遺伝子が、芽胞形成細菌に特異的に存在することが判明した（実施例１）。Bacillales目とClostridiales目は、Lactobacillales目などの非芽胞形成グループより遺伝的に離れているが、Bacillales目にはListeria属やStaphylococcus属など非芽胞形成細菌も含まれている。芽胞形成細菌と非芽胞形成細菌が混在するFirmicutes門全般において、芽胞形成細菌にのみ共通の芽胞形成に関与するタンパク質の遺伝子が特定されたことは意外であった。
【０００８】
本発明者らは、また、ＳｐｏＩＶＡ遺伝子の保存領域に対するユニバーサルプライマーを設計し、ＰＣＲ法によりその効果を検討したところ、芽胞形成細菌特異的に染色体ＤＮＡが増幅された（実施例２）。以上の結果から、ＳｐｏＩＶＡは芽胞形成能の有無を示す指標遺伝子として重要であることが示された。
【０００９】
本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１０】
本発明によれば、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、芽胞形成細菌の検出に用いられるプローブまたはプライマーが提供される。
【００１１】
本発明によれば、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質またはその遺伝子を検出することを含んでなる、芽胞形成細菌の検出法が提供される。
【００１２】
本発明によれば、試料中の芽胞形成細菌を迅速で簡便に検出することができる。従って、芽胞形成細菌による食品、飲料、医薬品などの汚染検査に用いることができる。また、細菌の分類によらず芽胞形成細菌を検出することができることから、未知の芽胞形成細菌の検出・同定にも用いることができる。特に、人工培養が困難あるいは芽胞形成条件が知られていない細菌については、食品・飲料等の生産分野における芽胞汚染リスクを知る手がかりとなることから有利である。更に、本発明による検出法をノザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法を組み合わせて実施することにより、試料中に芽胞形成過程の細胞が存在することを確認できる。
【発明の具体的説明】
【００１３】
［プローブおよびプライマー］
本発明によるプローブおよびプライマーにより検出される芽胞形成細菌は、環境に応じて栄養増殖と芽胞形成を行うライフサイクルを有する細菌であれば特に限定されない。本発明によるプローブおよびプライマーにより検出される芽胞形成細菌の代表例としては、Bacillus属やClostridium属に属する芽胞形成細菌が挙げられる。
【００１４】
本発明によるプローブおよびプライマーは、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、かつ芽胞形成細菌の検出に用いられるものであるポリヌクレオチドであればいずれも用いることができる。
【００１５】
本発明によるプローブおよびプライマーとしては、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１２個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。本発明によるプローブおよびプライマーとしては、また、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１２〜５０個または１２〜２９個、１５〜５０個または１５〜２９個、２０〜５０個または２０〜２９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１６】
ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧをコードするヌクレオチド配列はＢＬＡＳＴゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)に登載されているものを利用することができる。ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧをコードするBacillus subtilis由来の遺伝子配列は、それぞれ、配列番号１４、１５、１６、および１７に記載されている。
【００１７】
本発明によるプローブおよびプライマーのうち、ＳｐｏＩＶＡ遺伝子の検出に用いることができるプローブおよびプライマーとしては、以下のポリヌクレオチドが挙げられる。
・ 配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ１）またはプライマー（プライマー１）、
・ 配列番号２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ２）またはプライマー（プライマー２）、
・ 配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ３）またはプライマー（プライマー３）、
・ 配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ４）またはプライマー（プライマー４）、
・ 配列番号５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ５）またはプライマー（プライマー５）、
・ 配列番号６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ６）またはプライマー（プライマー６）、
・ 配列番号７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ７）またはプライマー（プライマー７）、
・ 配列番号８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ８）またはプライマー（プライマー８）、
・ 配列番号９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ９）またはプライマー（プライマー９）、および
・ 配列番号１０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ１０）またはプライマー（プライマー１０）
（配列番号１〜１０の各ヌクレオチド配列の「ｎ」は、イノシン（Ｉ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択されるいずれかの塩基（好ましくは、イノシン（Ｉ））を表し、配列番号１〜１０の各ヌクレオチド配列において１〜数個（好ましくは、１〜６個、より好ましくは、１、２、または３個、特に好ましくは、１または２個、最も好ましくは１個）のヌクレオチドが置換（イノシンへの置換を含む）、欠失、挿入、または付加されていてもよい）。
【００１８】
ここで、「相補的」とは、ＡについてはＴが対応し、Ｔに対してはＡが対応し、Ｇに対してはＣが対応し、Ｃに対してはＧが対応し、Ｉに対してはＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴのいずれか一つが対応することを意味する。
【００１９】
ＳｐｏＩＶＡの遺伝子のＰＣＲ法による検出に用いることができるプライマーペアとしては以下のプライマーペアが挙げられる。
・ プライマー１と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（１）、
・ プライマー２と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（２）、
・ プライマー３と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（３）、
・ プライマー４と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（４）、
・ プライマー５と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（５）、
・ プライマー１と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（６）、
・ プライマー２と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（７）、
・ プライマー３と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（８）、
・ プライマー４と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（９）、および
・ プライマー５と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（１０）
（プライマー１〜１０は前記の内容と同義である）。
【００２０】
ＳｐｏＩＶＡの遺伝子のＰＣＲ法による検出においては、プライマーペア（１）〜（１０）の一部またはすべてを組み合わせて使用することができる。好ましい組み合わせとしては、以下の組み合わせが挙げられる。
・ プライマー１、プライマー２、およびプライマー３からなるセンスプライマーと、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマーセット（１）
・ プライマー４およびプライマー５からなるセンスプライマーと、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマーセット（２）
・ プライマー１、プライマー２、およびプライマー３からなるセンスプライマーと、プライマー９およびプライマー１０からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマーセット（３）
・ プライマー４およびプライマー５とからなるセンスプライマーと、プライマー９およびプライマー１０からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマーセット（４）
【００２１】
プライマー１〜１０において、配列番号１〜１０のヌクレオチド配列の相補鎖をプライマーとして用いる場合には、ペアとなる双方のプライマーについて相補鎖を使用すべきことは当業者に自明であろう。
【００２２】
［芽胞形成タンパク質の検出］
本発明では、芽胞形成タンパク質を検出することにより、芽胞形成細菌の存在を検出することができる。芽胞形成タンパク質の検出は、当業者に周知である免疫学的方法により行うことができる。
【００２３】
免疫学的方法による芽胞形成タンパク質の検出は、例えば、抗体抗原反応に基づく免疫学的方法により実施することができ、このような方法は、
（ｉ）芽胞形成タンパク質に対する抗体と試料とを接触させ、
（ii）抗体抗原複合体を検出する
ことにより実施することができる。
【００２４】
抗体抗原複合体の存在は、芽胞形成細菌が試料中に存在することの指標となる。
【００２５】
試料は、芽胞形成細菌が含まれる可能性があればいずれのものでもよいが、典型的には、食品、飲料、医薬品などの原材料や最終製品が挙げられる。
【００２６】
抗体抗原反応に基づく免疫学的方法による抗体抗原複合体の検出は当業者に周知であり、必要に応じて適切な処理（例えば、細菌の分離、タンパク質の抽出など）をした試料について、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。標識化は蛍光物質、放射性物質、酵素、酵素の基質など公知の標識物質を用いて行うことができる。
【００２７】
芽胞検出タンパク質に対する抗体は、抗体抗原複合体が検出できる限り特に限定されないが、例えば、芽胞検出タンパク質に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いて抗体抗原複合体を検出できる。
【００２８】
抗体の作製は当業者に周知であり、例えば、ポリクローナル抗体については、芽胞検出タンパク質またはその一部のペプチドを、必要に応じて、任意の担体（例えば、ウシ血清アルブミン）や免疫賦活剤（例えば、フロイントアジュバント）とともに非ヒト動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ）に注射し、一定期間後にその動物の血清を精製することによって製造することができる。また、モノクローナル抗体については、Kohler and Milsteinの方法（Nature, 256:495-97(1975）)に従って、上記動物の脾臓やリンパ節などから抗体産生細胞を取得し、その抗体産生細胞と自己抗体産生能のない哺乳動物由来のミエローマ細胞とを細胞融合させた後、抗体産生細胞であるハイブリドーマ細胞を選択し、そのハイブリドーマ細胞をインビトロで培養するか、あるいは非ヒト動物の腹水中等でインビボで培養することにより製造することができる。
【００２９】
抗原として用いるタンパク質は、芽胞形成細菌から抽出して調製しても、遺伝子組み換え技術により宿主細菌から生産させて調製してもよい。ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧの遺伝子のヌクレオチド配列は前記のように配列表に記載されている。
【００３０】
［芽胞形成タンパク質の遺伝子の検出］
本発明では、芽胞形成タンパク質の遺伝子を検出することにより、芽胞形成細菌の存在を検出することができる。芽胞形成タンパク質の遺伝子の検出は、当業者に周知であるハイブリダイゼーション法や核酸増幅法により行うことができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーション法による芽胞形成タンパク質の遺伝子の検出は、プローブと標的核酸とが二本鎖を形成する現象を利用する限りいずれの方法を用いることができる。ハイブリダイゼーション法、例えば、
（iii）本発明によるプローブと試料由来のポリヌクレオチドとを接触させ、
（iv）ハイブリダイゼーション複合体を検出する
ことにより実施することができる。
【００３２】
ハイブリダイゼーション複合体の存在は、芽胞形成細菌が試料中に存在することの指標となる。
【００３３】
試料は、芽胞形成細菌が含まれる可能性があればいずれのものでもよいが、典型的には、食品、飲料、医薬品などの原材料や最終製品が挙げられる。
【００３４】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は当業者に周知であり、必要に応じて適切な処理（例えば、細菌の分離、染色体ＤＮＡの抽出など）をした試料について、サザンハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーションなど既知の方法を適用することができる。
【００３５】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光物質、酵素、酵素の基質など公知の標識物質が挙げられる。
【００３６】
核酸増幅法による芽胞形成タンパク質の遺伝子の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
（ｖ）試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施し、
（vi）形成された増幅産物を検出する。
【００３７】
増幅産物の存在は、芽胞形成細菌が試料中に存在することの指標となる。
【００３８】
試料は、芽胞形成細菌が含まれる可能性があればいずれのものでもよいが、典型的には、食品、飲料、医薬品などの原材料や最終製品が挙げられる。必要に応じて適切な処理（例えば、細菌の分離、染色体ＤＮＡの抽出など）をすることにより調製された菌体の染色体ＤＮＡを核酸増幅法の鋳型として用いることができる。
【００３９】
核酸増幅法は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法などを用いて実施できる。増幅産物の検出は当業者に周知であり、例えば、アガロースゲル電気泳動など既知の方法を適用することができる。
【００４０】
本発明の好ましい態様によれば、芽胞形成タンパク質であるＳｐｏＩＶＡの遺伝子を検出することを含んでなる、芽胞形成細菌の検出法が提供される。
【００４１】
この検出法は、本発明によるプローブを用いたハイブリダイゼーション法により実施することができる。
【００４２】
この検出法は、また、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いたＰＣＲ法により実施することができる。
【００４３】
本発明による検出法によって芽胞形成細菌か否か同定可能な細菌としてはFirmicutes門に属する細菌全般が挙げられ、具体的には、Bacillales目に属する細菌（Bacillus属に属する細菌、Geobacillus属に属する細菌、Paenibacillus属に属する細菌、Brevibacillus属に属する細菌、Alicyclobacillus属に属する細菌、Staphylococcus属に属する細菌など）、Clostridiales目に属する細菌（Clostridium属に属する細菌、 Moorella属に属する細菌、Pectinatus属に属する細菌、Propionispora属に属する細菌など）、Lactobacillales目に属する細菌（Enterococcus属に属する細菌など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１：芽胞形成細菌に保存されているタンパク質の検索
ＢＬＡＳＴゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)を用いて、枯草菌芽胞形成遺伝子と類似性を持つ遺伝子を検索し、保存性の高い芽胞形成遺伝子としてＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧを見いだした。結果は図１に示される通りであった。なお、リステリア属やスタフィロコッカス属を含めて、全ゲノムＤＮＡの塩基配列情報が明らかにされている非芽胞形成細菌にはＳｐｏＩＶＡ遺伝子が存在しなかった。
【００４６】
実施例２：ユニバーサルプライマーによる芽胞形成菌の検出
（ａ）ユニバーサルプライマーの設計
ＢＬＡＳＴゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)に登載されているＳｐｏＩＶＡ遺伝子のヌクレオチド配列を用いて以下のユニバーサルプライマーを設計した。
［Ｓ４Ａ６７プライマー］
S4A67BA GTIGGIGCIGTICGIACIGGIAAITCIAC（配列番号１）
S4A67CL GTIGGICCIGTIAGIACIGGIAAITCIAC（配列番号２）
S4A67MO GTIGGIGGIGTICGIACIGGIAAITCIAC（配列番号３）
［Ｓ４Ａ２１１プライマー］
S4A211BA ACIGAACCIAAITTTGTTCCIAAICAIGC（配列番号４）
S4A211CL ACIGAACCIAAATTTGTICCIAAIGAIGC（配列番号５）
［Ｓ４Ａ４１６プライマー］
S4A416RBA GTICCGATTTCIGCIGCTTCITGIAAIGG（配列番号６）
S4A416RCL GTICCIATITCIGCIGCITIITCAAAIGG（配列番号７）
S4A416RMO GTICCIATITCIGCIGCITCCTGIAAIGG（配列番号８）
［Ｓ４Ａ４２８プライマー］
S4A428RBA ATIACTTTICIIGTICCIATTTCIGCIGC（配列番号９）
S4A428RCL ATIACITTTITIGTICCIATITCIGCIGC（配列番号１０）
［Ｓ４Ａ４６７プライマー］
S4A467RBA GTIGTAATIACIACICCIATIGTIGAITGITC（配列番号１１）
S4A467RCL GTIGTIAIIACIAIICCIATIGTIGAATGITC（配列番号１２）
S4A467RMO GTIGTIACIAIIAIICCIATIGTIGAITGITC（配列番号１３）
配列番号１〜１３のヌクレオチド配列が上記プライマーを表す場合には、配列表中の「ｎ」はイノシン残基（Ｉ）を表す。
【００４７】
ｓｐｏＩＶＡ遺伝子上における上記プライマー配列の位置は、図２に示される通りである。
【００４８】
上記配列を有するユニバーサルプライマーを常法に従って化学合成し、（ｃ）のＰＣＲ法による増幅に用いた。
【００４９】
ＰＣＲ法では、以下のユニバーサルプライマーペアのセットを用いた。
【００５０】
セット（１）：Ｓ４Ａ６７プライマーとＳ４Ａ４１６プライマーとのセット
Ｓ４Ａ６７プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４１６プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５１】
セット（２）：Ｓ４Ａ２１１プライマーとＳ４Ａ４１６プライマーとのセット
Ｓ４Ａ２１１プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４１６プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５２】
セット（３）：Ｓ４Ａ６７プライマーとＳ４Ａ４２８プライマーとのセット
Ｓ４Ａ６７プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４２８プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５３】
セット（４）：Ｓ４Ａ２１１プライマーとＳ４Ａ４２８プライマーとのセット
Ｓ４Ａ２１１プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４２８プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５４】
セット（５）：Ｓ４Ａ６７プライマーとＳ４Ａ４６７プライマーとのセット
Ｓ４Ａ６７プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４６７プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５５】
セット（６）：Ｓ４Ａ２１１プライマーとＳ４Ａ４６７プライマーとのセット
Ｓ４Ａ２１１プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４６７プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５６】
（ｂ）染色体ＤＮＡの抽出
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みを染色体ＤＮＡ溶液として（ｃ）のＰＣＲ法による増幅に用いた。ＰＣＲ法による核酸増幅では、以下の１８種類の芽胞形成細菌と４種類の非芽胞形成細菌の染色体ＤＮＡから抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。
【００５７】
［芽胞形成細菌］
1 Bacillus subtilis 168
2 Bacillus pumilus (IFO 14367)
3 Bacillus megaterium (JCM 2506)
4 Bacillus thurigienesis (IFO 13865)
5 Bacillus sphaericus (IFO 3525)
6 Bacillus coagulans (JCM 2257)
7 Bacillus halodurans (C-125)
8 Geobacillus stearothemophilus (DSM 5934)
9 Paenibacillus polymyxa
10 Paenibacillus thiaminolyticus (NRBC 14293)
11 Brevibacillus brevis (NBRC 100599)
12 Alicyclobacillus sp. (DSM 11984)
13 Alicyclobacillus acidoterrestris (DSM 3922)
14 Alicyclobacillus hesperidum (DSM 12489)
15 Clostridium sporogenes (NBRC 14293)
16 Clostridium acetobutylicum (JCM 7828)
17 Clostridium thermocellum (ATCC 27405)
18 Moorella thermoacetica (DSM 521)
【００５８】
［非芽胞形成細菌］
19 Staphylococcus aureus (IFO 12732)
20 Staphylococcus epidermidis (IFO 12993)
21 Enterococcus faecalis (ATCC 51559)
24 Escherichia coli K12
【００５９】
（ｃ）ＰＣＲ法による核酸増幅
ユニバーサルプライマーペアのセット（１）〜（６）をプライマーとして用いて、各種細菌の染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ試薬はタカラバイオ社のＴａＫａＲａ Ｔａｑと、付属バッファー、付属ｄＮＴＰ溶液を使用した。ＰＣＲ反応装置はＢｉｏＲａｄ社のＭｙＣｙｃｌｅｒを使用した。具体的には、２０μｌの反応溶液中に１μｌのサンプルＤＮＡを混合し、ＰＣＲ試薬およびＰＣＲ反応装置の添付文書の手順に従って、以下の条件でＰＣＲ法を実施した。
ステップ１：９５℃・２分を１回反応。
ステップ２：９４℃・３０秒，４０℃・３０秒，７０℃・１分を１０回反応。
ステップ３：９４℃・３０秒，５２℃・３０秒，７２℃・３０秒を５０回反応。
ステップ４：４℃で保存。
増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって分離し、増幅産物の有無を確認した。
【００６０】
プライマーペアセット（１）および（２）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡを増幅した結果は図３に示される通りであった。
【００６１】
また、プライマーペアセット（１）〜（６）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡを増幅した結果を表にまとめると図４の通りであった。
【００６２】
図３および図４から明らかなように、プライマーペアセット（１）〜（４）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡを増幅したところ、検査した全ての芽胞形成細菌について特異的なＤＮＡ断片の増幅が認められ、非芽胞形成細菌では特異的なＤＮＡ断片の増幅が認められなかった。以上の結果から、ｓｐｏＩＶＡユニバーサルプライマーの有効性が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】芽胞形成細菌に保存されているタンパク質を検索した結果を示した図である。四角で囲んだ菌種は芽胞形成細菌を示す。
【図２】ＳｐｏＩＶＡ遺伝子上におけるプライマーの位置を示した図である。
【図３】プライマーペアのセット（１）および（２）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した結果（電気泳動写真）を示した図である。上段がセット（１）を用いた場合の結果を、下段がセット（２）を用いた場合の結果を、それぞれ示す。
【図４】プライマーペアのセット（１）〜（６）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した結果を示した図である。二重丸は増幅産物が確認できたことを示す。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、芽胞形成細菌の検出に用いられるプローブおよびプライマーに関する。本発明は、また、芽胞形成細菌の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチラス属やクロストリディウム属の細菌は耐久性と休眠性を備えた細菌内生胞子（以下、「芽胞」ということがある）を形成する（蜂須賀養悦 1988 芽胞学 東海大学出版、The Bacterial Spore Vol.2 1983 Edited by Hurst A., and Gould G.W. Academic Press）。これらの細菌内生胞子は一般的に栄養細胞よりも耐熱性が高いことから、加熱処理による生菌数の減少率を測定することにより、試料中に含まれる胞子の有無を知ることができる。あるいは、試料を胞子染色し顕微鏡観察するか、位相差顕微鏡で観察することにより、直接存在を確認することができる（近藤雅臣・渡部一仁 編著（１９９５）スポア実験マニュアル 技報堂出版）。これらの方法は、培養可能で胞子形成条件が知られている細菌の研究や、多数の胞子によって汚染された食品・飲料などの検査にのみ有効である。
【０００３】
一方、１６Ｓ ｒＲＮＡなど保存性の高い遺伝子の塩基配列を比較解析することにより、既知の芽胞形成細菌との類縁性から芽胞形成の可能性を予測することもできる。しかし、バチラス属やクロストリディウム属の類縁菌には、非芽胞形成細菌であるリステリア属やスタフィロコッカス属などが存在することから、系統上の類縁性だけで芽胞形成能を判別することは容易でない（Bacterial spore formers 2004 Edited by Ricca E., Henriques A.O., and S. Cutting, Horizon Bioscience）。
【０００４】
近年、細菌ゲノム研究の発展により、多くの芽胞形成細菌について遺伝情報の比較が可能となった。枯草菌は芽胞形成細菌のモデル生物であり、芽胞形成機構の遺伝学的・分子生物学的解析が最も進んでいる。枯草菌において芽胞形成期特異的に発現する遺伝子は約４００種類存在する（Steil L., Serrano M., Henriques A.O., Vlker U. 2005 Microbiology 151:399-420）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Bacillus属やClostridium属に代表される芽胞形成細菌は、熱などに対する抵抗性や長期休眠能を持った芽胞を形成する。これらの芽胞は防除が困難であり、食品・飲料・医薬品などの変敗の原因となるため、芽胞形成細菌の迅速で簡便な検出法の開発が求められている。
【０００６】
すなわち、本発明は、腐敗の原因となる芽胞形成細菌を迅速で簡便に検出・同定できるプローブおよびプライマー並びに方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いわゆる芽胞細菌は全てFirmicutes門に属しているが、Firmicutes門には非芽胞形成細菌も含まれている。本発明者らは、細菌の分類から離れて、芽胞形成細菌に特異的な遺伝子の特定を試みた。その結果、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧのタンパク質の遺伝子が、芽胞形成細菌に特異的に存在することが判明した（実施例１）。Bacillales目とClostridiales目は、Lactobacillales目などの非芽胞形成グループより遺伝的に離れているが、Bacillales目にはListeria属やStaphylococcus属など非芽胞形成細菌も含まれている。芽胞形成細菌と非芽胞形成細菌が混在するFirmicutes門全般において、芽胞形成細菌にのみ共通の芽胞形成に関与するタンパク質の遺伝子が特定されたことは意外であった。
【０００８】
本発明者らは、また、ＳｐｏＩＶＡ遺伝子の保存領域に対するユニバーサルプライマーを設計し、ＰＣＲ法によりその効果を検討したところ、芽胞形成細菌特異的に染色体ＤＮＡが増幅された（実施例２）。以上の結果から、ＳｐｏＩＶＡは芽胞形成能の有無を示す指標遺伝子として重要であることが示された。
【０００９】
本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１０】
本発明によれば、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、芽胞形成細菌の検出に用いられるプローブまたはプライマーが提供される。
【００１１】
本発明によれば、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質またはその遺伝子を検出することを含んでなる、芽胞形成細菌の検出法が提供される。
【００１２】
本発明によれば、試料中の芽胞形成細菌を迅速で簡便に検出することができる。従って、芽胞形成細菌による食品、飲料、医薬品などの汚染検査に用いることができる。また、細菌の分類によらず芽胞形成細菌を検出することができることから、未知の芽胞形成細菌の検出・同定にも用いることができる。特に、人工培養が困難あるいは芽胞形成条件が知られていない細菌については、食品・飲料等の生産分野における芽胞汚染リスクを知る手がかりとなることから有利である。更に、本発明による検出法をノザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法を組み合わせて実施することにより、試料中に芽胞形成過程の細胞が存在することを確認できる。
【発明の具体的説明】
【００１３】
［プローブおよびプライマー］
本発明によるプローブおよびプライマーにより検出される芽胞形成細菌は、環境に応じて栄養増殖と芽胞形成を行うライフサイクルを有する細菌であれば特に限定されない。本発明によるプローブおよびプライマーにより検出される芽胞形成細菌の代表例としては、Bacillus属やClostridium属に属する芽胞形成細菌が挙げられる。
【００１４】
本発明によるプローブおよびプライマーは、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、かつ芽胞形成細菌の検出に用いられるものであるポリヌクレオチドであればいずれも用いることができる。
【００１５】
本発明によるプローブおよびプライマーとしては、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１２個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。本発明によるプローブおよびプライマーとしては、また、ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１２〜５０個または１２〜２９個、１５〜５０個または１５〜２９個、２０〜５０個または２０〜２９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１６】
ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧをコードするヌクレオチド配列はＢＬＡＳＴゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)に登載されているものを利用することができる。ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧをコードするBacillus subtilis由来の遺伝子配列は、それぞれ、配列番号１４、１５、１６、および１７に記載されている。
【００１７】
本発明によるプローブおよびプライマーのうち、ＳｐｏＩＶＡ遺伝子の検出に用いることができるプローブおよびプライマーとしては、以下のポリヌクレオチドが挙げられる。
・ 配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ１）またはプライマー（プライマー１）、
・ 配列番号２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ２）またはプライマー（プライマー２）、
・ 配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ３）またはプライマー（プライマー３）、
・ 配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ４）またはプライマー（プライマー４）、
・ 配列番号５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ５）またはプライマー（プライマー５）、
・ 配列番号６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ６）またはプライマー（プライマー６）、
・ 配列番号７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ７）またはプライマー（プライマー７）、
・ 配列番号８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ８）またはプライマー（プライマー８）、
・ 配列番号９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ９）またはプライマー（プライマー９）、および
・ 配列番号１０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ１０）またはプライマー（プライマー１０）
（配列番号１〜１０の各ヌクレオチド配列の「ｎ」は、イノシン（Ｉ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択されるいずれかの塩基（好ましくは、イノシン（Ｉ））を表し、配列番号１〜１０の各ヌクレオチド配列において１〜数個（好ましくは、１〜６個、より好ましくは、１、２、または３個、特に好ましくは、１または２個、最も好ましくは１個）のヌクレオチドが置換（イノシンへの置換を含む）、欠失、挿入、または付加されていてもよい）。
【００１８】
ここで、「相補的」とは、ＡについてはＴが対応し、Ｔに対してはＡが対応し、Ｇに対してはＣが対応し、Ｃに対してはＧが対応し、Ｉに対してはＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴのいずれか一つが対応することを意味する。
【００１９】
ＳｐｏＩＶＡの遺伝子のＰＣＲ法による検出に用いることができるプライマーペアとしては以下のプライマーペアが挙げられる。
・ プライマー１と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（１）、
・ プライマー２と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（２）、
・ プライマー３と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（３）、
・ プライマー４と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（４）、
・ プライマー５と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（５）、
・ プライマー１と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（６）、
・ プライマー２と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（７）、
・ プライマー３と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（８）、
・ プライマー４と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（９）、および
・ プライマー５と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（１０）
（プライマー１〜１０は前記の内容と同義である）。
【００２０】
ＳｐｏＩＶＡの遺伝子のＰＣＲ法による検出においては、プライマーペア（１）〜（１０）の一部またはすべてを組み合わせて使用することができる。好ましい組み合わせとしては、以下の組み合わせが挙げられる。
・ プライマー１、プライマー２、およびプライマー３からなるセンスプライマーと、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマーセット（１）
・ プライマー４およびプライマー５からなるセンスプライマーと、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマーセット（２）
・ プライマー１、プライマー２、およびプライマー３からなるセンスプライマーと、プライマー９およびプライマー１０からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマーセット（３）
・ プライマー４およびプライマー５とからなるセンスプライマーと、プライマー９およびプライマー１０からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマーセット（４）
【００２１】
プライマー１〜１０において、配列番号１〜１０のヌクレオチド配列の相補鎖をプライマーとして用いる場合には、ペアとなる双方のプライマーについて相補鎖を使用すべきことは当業者に自明であろう。
【００２２】
［芽胞形成タンパク質の検出］
本発明では、芽胞形成タンパク質を検出することにより、芽胞形成細菌の存在を検出することができる。芽胞形成タンパク質の検出は、当業者に周知である免疫学的方法により行うことができる。
【００２３】
免疫学的方法による芽胞形成タンパク質の検出は、例えば、抗体抗原反応に基づく免疫学的方法により実施することができ、このような方法は、
（ｉ）芽胞形成タンパク質に対する抗体と試料とを接触させ、
（ii）抗体抗原複合体を検出する
ことにより実施することができる。
【００２４】
抗体抗原複合体の存在は、芽胞形成細菌が試料中に存在することの指標となる。
【００２５】
試料は、芽胞形成細菌が含まれる可能性があればいずれのものでもよいが、典型的には、食品、飲料、医薬品などの原材料や最終製品が挙げられる。
【００２６】
抗体抗原反応に基づく免疫学的方法による抗体抗原複合体の検出は当業者に周知であり、必要に応じて適切な処理（例えば、細菌の分離、タンパク質の抽出など）をした試料について、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。標識化は蛍光物質、放射性物質、酵素、酵素の基質など公知の標識物質を用いて行うことができる。
【００２７】
芽胞検出タンパク質に対する抗体は、抗体抗原複合体が検出できる限り特に限定されないが、例えば、芽胞検出タンパク質に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いて抗体抗原複合体を検出できる。
【００２８】
抗体の作製は当業者に周知であり、例えば、ポリクローナル抗体については、芽胞検出タンパク質またはその一部のペプチドを、必要に応じて、任意の担体（例えば、ウシ血清アルブミン）や免疫賦活剤（例えば、フロイントアジュバント）とともに非ヒト動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ）に注射し、一定期間後にその動物の血清を精製することによって製造することができる。また、モノクローナル抗体については、Kohler and Milsteinの方法（Nature, 256:495-97(1975）)に従って、上記動物の脾臓やリンパ節などから抗体産生細胞を取得し、その抗体産生細胞と自己抗体産生能のない哺乳動物由来のミエローマ細胞とを細胞融合させた後、抗体産生細胞であるハイブリドーマ細胞を選択し、そのハイブリドーマ細胞をインビトロで培養するか、あるいは非ヒト動物の腹水中等でインビボで培養することにより製造することができる。
【００２９】
抗原として用いるタンパク質は、芽胞形成細菌から抽出して調製しても、遺伝子組み換え技術により宿主細菌から生産させて調製してもよい。ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧの遺伝子のヌクレオチド配列は前記のように配列表に記載されている。
【００３０】
［芽胞形成タンパク質の遺伝子の検出］
本発明では、芽胞形成タンパク質の遺伝子を検出することにより、芽胞形成細菌の存在を検出することができる。芽胞形成タンパク質の遺伝子の検出は、当業者に周知であるハイブリダイゼーション法や核酸増幅法により行うことができる。
【００３１】
ハイブリダイゼーション法による芽胞形成タンパク質の遺伝子の検出は、プローブと標的核酸とが二本鎖を形成する現象を利用する限りいずれの方法を用いることができる。ハイブリダイゼーション法、例えば、
（iii）本発明によるプローブと試料由来のポリヌクレオチドとを接触させ、
（iv）ハイブリダイゼーション複合体を検出する
ことにより実施することができる。
【００３２】
ハイブリダイゼーション複合体の存在は、芽胞形成細菌が試料中に存在することの指標となる。
【００３３】
試料は、芽胞形成細菌が含まれる可能性があればいずれのものでもよいが、典型的には、食品、飲料、医薬品などの原材料や最終製品が挙げられる。
【００３４】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は当業者に周知であり、必要に応じて適切な処理（例えば、細菌の分離、染色体ＤＮＡの抽出など）をした試料について、サザンハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーションなど既知の方法を適用することができる。
【００３５】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光物質、酵素、酵素の基質など公知の標識物質が挙げられる。
【００３６】
核酸増幅法による芽胞形成タンパク質の遺伝子の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
（ｖ）試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施し、
（vi）形成された増幅産物を検出する。
【００３７】
増幅産物の存在は、芽胞形成細菌が試料中に存在することの指標となる。
【００３８】
試料は、芽胞形成細菌が含まれる可能性があればいずれのものでもよいが、典型的には、食品、飲料、医薬品などの原材料や最終製品が挙げられる。必要に応じて適切な処理（例えば、細菌の分離、染色体ＤＮＡの抽出など）をすることにより調製された菌体の染色体ＤＮＡを核酸増幅法の鋳型として用いることができる。
【００３９】
核酸増幅法は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法などを用いて実施できる。増幅産物の検出は当業者に周知であり、例えば、アガロースゲル電気泳動など既知の方法を適用することができる。
【００４０】
本発明の好ましい態様によれば、芽胞形成タンパク質であるＳｐｏＩＶＡの遺伝子を検出することを含んでなる、芽胞形成細菌の検出法が提供される。
【００４１】
この検出法は、本発明によるプローブを用いたハイブリダイゼーション法により実施することができる。
【００４２】
この検出法は、また、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いたＰＣＲ法により実施することができる。
【００４３】
本発明による検出法によって芽胞形成細菌か否か同定可能な細菌としてはFirmicutes門に属する細菌全般が挙げられ、具体的には、Bacillales目に属する細菌（Bacillus属に属する細菌、Geobacillus属に属する細菌、Paenibacillus属に属する細菌、Brevibacillus属に属する細菌、Alicyclobacillus属に属する細菌、Staphylococcus属に属する細菌など）、Clostridiales目に属する細菌（Clostridium属に属する細菌、 Moorella属に属する細菌、Pectinatus属に属する細菌、Propionispora属に属する細菌など）、Lactobacillales目に属する細菌（Enterococcus属に属する細菌など）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１：芽胞形成細菌に保存されているタンパク質の検索
ＢＬＡＳＴゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)を用いて、枯草菌芽胞形成遺伝子と類似性を持つ遺伝子を検索し、保存性の高い芽胞形成遺伝子としてＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧを見いだした。結果は図１に示される通りであった。なお、リステリア属やスタフィロコッカス属を含めて、全ゲノムＤＮＡの塩基配列情報が明らかにされている非芽胞形成細菌にはＳｐｏＩＶＡ遺伝子が存在しなかった。
【００４６】
実施例２：ユニバーサルプライマーによる芽胞形成菌の検出
（ａ）ユニバーサルプライマーの設計
ＢＬＡＳＴゲノムデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)に登載されているＳｐｏＩＶＡ遺伝子のヌクレオチド配列を用いて以下のユニバーサルプライマーを設計した。
［Ｓ４Ａ６７プライマー］
S4A67BA GTIGGIGCIGTICGIACIGGIAAITCIAC（配列番号１）
S4A67CL GTIGGICCIGTIAGIACIGGIAAITCIAC（配列番号２）
S4A67MO GTIGGIGGIGTICGIACIGGIAAITCIAC（配列番号３）
［Ｓ４Ａ２１１プライマー］
S4A211BA ACIGAACCIAAITTTGTTCCIAAICAIGC（配列番号４）
S4A211CL ACIGAACCIAAATTTGTICCIAAIGAIGC（配列番号５）
［Ｓ４Ａ４１６プライマー］
S4A416RBA GTICCGATTTCIGCIGCTTCITGIAAIGG（配列番号６）
S4A416RCL GTICCIATITCIGCIGCITIITCAAAIGG（配列番号７）
S4A416RMO GTICCIATITCIGCIGCITCCTGIAAIGG（配列番号８）
［Ｓ４Ａ４２８プライマー］
S4A428RBA ATIACTTTICIIGTICCIATTTCIGCIGC（配列番号９）
S4A428RCL ATIACITTTITIGTICCIATITCIGCIGC（配列番号１０）
［Ｓ４Ａ４６７プライマー］
S4A467RBA GTIGTAATIACIACICCIATIGTIGAITGITC（配列番号１１）
S4A467RCL GTIGTIAIIACIAIICCIATIGTIGAATGITC（配列番号１２）
S4A467RMO GTIGTIACIAIIAIICCIATIGTIGAITGITC（配列番号１３）
配列番号１〜１３のヌクレオチド配列が上記プライマーを表す場合には、配列表中の「ｎ」はイノシン残基（Ｉ）を表す。
【００４７】
ｓｐｏＩＶＡ遺伝子上における上記プライマー配列の位置は、図２に示される通りである。
【００４８】
上記配列を有するユニバーサルプライマーを常法に従って化学合成し、（ｃ）のＰＣＲ法による増幅に用いた。
【００４９】
ＰＣＲ法では、以下のユニバーサルプライマーペアのセットを用いた。
【００５０】
セット（１）：Ｓ４Ａ６７プライマーとＳ４Ａ４１６プライマーとのセット
Ｓ４Ａ６７プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４１６プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５１】
セット（２）：Ｓ４Ａ２１１プライマーとＳ４Ａ４１６プライマーとのセット
Ｓ４Ａ２１１プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４１６プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５２】
セット（３）：Ｓ４Ａ６７プライマーとＳ４Ａ４２８プライマーとのセット
Ｓ４Ａ６７プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４２８プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５３】
セット（４）：Ｓ４Ａ２１１プライマーとＳ４Ａ４２８プライマーとのセット
Ｓ４Ａ２１１プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４２８プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５４】
セット（５）：Ｓ４Ａ６７プライマーとＳ４Ａ４６７プライマーとのセット
Ｓ４Ａ６７プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４６７プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５５】
セット（６）：Ｓ４Ａ２１１プライマーとＳ４Ａ４６７プライマーとのセット
Ｓ４Ａ２１１プライマーをセンスプライマーとして、Ｓ４Ａ４６７プライマーをアンチセンスプライマーとして用いた。
【００５６】
（ｂ）染色体ＤＮＡの抽出
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みを染色体ＤＮＡ溶液として（ｃ）のＰＣＲ法による増幅に用いた。ＰＣＲ法による核酸増幅では、以下の１８種類の芽胞形成細菌と４種類の非芽胞形成細菌の染色体ＤＮＡから抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として用いた。
【００５７】
［芽胞形成細菌］
1 Bacillus subtilis 168
2 Bacillus pumilus (IFO 14367)
3 Bacillus megaterium (JCM 2506)
4 Bacillus thurigienesis (IFO 13865)
5 Bacillus sphaericus (IFO 3525)
6 Bacillus coagulans (JCM 2257)
7 Bacillus halodurans (C-125)
8 Geobacillus stearothemophilus (DSM 5934)
9 Paenibacillus polymyxa
10 Paenibacillus thiaminolyticus (NRBC 14293)
11 Brevibacillus brevis (NBRC 100599)
12 Alicyclobacillus sp. (DSM 11984)
13 Alicyclobacillus acidoterrestris (DSM 3922)
14 Alicyclobacillus hesperidum (DSM 12489)
15 Clostridium sporogenes (NBRC 14293)
16 Clostridium acetobutylicum (JCM 7828)
17 Clostridium thermocellum (ATCC 27405)
18 Moorella thermoacetica (DSM 521)
【００５８】
［非芽胞形成細菌］
19 Staphylococcus aureus (IFO 12732)
20 Staphylococcus epidermidis (IFO 12993)
21 Enterococcus faecalis (ATCC 51559)
24 Escherichia coli K12
【００５９】
（ｃ）ＰＣＲ法による核酸増幅
ユニバーサルプライマーペアのセット（１）〜（６）をプライマーとして用いて、各種細菌の染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ試薬はタカラバイオ社のＴａＫａＲａ Ｔａｑと、付属バッファー、付属ｄＮＴＰ溶液を使用した。ＰＣＲ反応装置はＢｉｏＲａｄ社のＭｙＣｙｃｌｅｒを使用した。具体的には、２０μｌの反応溶液中に１μｌのサンプルＤＮＡを混合し、ＰＣＲ試薬およびＰＣＲ反応装置の添付文書の手順に従って、以下の条件でＰＣＲ法を実施した。
ステップ１：９５℃・２分を１回反応。
ステップ２：９４℃・３０秒，４０℃・３０秒，７０℃・１分を１０回反応。
ステップ３：９４℃・３０秒，５２℃・３０秒，７２℃・３０秒を５０回反応。
ステップ４：４℃で保存。
増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって分離し、増幅産物の有無を確認した。
【００６０】
プライマーペアセット（１）および（２）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡを増幅した結果は図３に示される通りであった。
【００６１】
また、プライマーペアセット（１）〜（６）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡを増幅した結果を表にまとめると図４の通りであった。
【００６２】
図３および図４から明らかなように、プライマーペアセット（１）〜（４）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡを増幅したところ、検査した全ての芽胞形成細菌について特異的なＤＮＡ断片の増幅が認められ、非芽胞形成細菌では特異的なＤＮＡ断片の増幅が認められなかった。以上の結果から、ｓｐｏＩＶＡユニバーサルプライマーの有効性が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】芽胞形成細菌に保存されているタンパク質を検索した結果を示した図である。四角で囲んだ菌種は芽胞形成細菌を示す。
【図２】ＳｐｏＩＶＡ遺伝子上におけるプライマーの位置を示した図である。
【図３】プライマーペアのセット（１）および（２）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した結果（電気泳動写真）を示した図である。上段がセット（１）を用いた場合の結果を、下段がセット（２）を用いた場合の結果を、それぞれ示す。
【図４】プライマーペアのセット（１）〜（６）を用いて各種細菌の染色体ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した結果を示した図である。二重丸は増幅産物が確認できたことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、芽胞形成細菌の検出に用いられるプローブまたはプライマー。
【請求項２】
以下から選択される、請求項１に記載のプローブまたはプライマー：
・ 配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ１）またはプライマー（プライマー１）、
・ 配列番号２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ２）またはプライマー（プライマー２）、
・ 配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ３）またはプライマー（プライマー３）、
・ 配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ４）またはプライマー（プライマー４）、
・ 配列番号５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ５）またはプライマー（プライマー５）、
・ 配列番号６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ６）またはプライマー（プライマー６）、
・ 配列番号７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ７）またはプライマー（プライマー７）、
・ 配列番号８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ８）またはプライマー（プライマー８）、
・ 配列番号９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ９）またはプライマー（プライマー９）、および
・ 配列番号１０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ１０）またはプライマー（プライマー１０）
（上記ポリヌクレオチドにおいて、配列番号１〜１０の各ヌクレオチド配列の「ｎ」は、イノシン（Ｉ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択されるいずれかの塩基を表し、配列番号１〜１０の各ヌクレオチド配列において１〜数個のヌクレオチドが置換（イノシンへの置換を含む）、欠失、挿入、または付加されていてもよい）。
【請求項３】
以下のプライマーペアのいずれか一つまたはその組み合わせからなる、芽胞形成細菌の検出に用いられるプライマーペア：
・ プライマー１と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（１）、
・ プライマー２と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（２）、
・ プライマー３と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（３）、
・ プライマー４と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（４）、
・ プライマー５と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（５）、
・ プライマー１と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（６）、
・ プライマー２と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（７）、
・ プライマー３と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（８）、
・ プライマー４と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（９）、および
・ プライマー５と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（１０）
（プライマー１〜１０は請求項２において定義された内容と同義である）。
【請求項４】
ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質またはその遺伝子を検出することを含んでなる、芽胞形成細菌の検出法。
【請求項５】
芽胞形成タンパク質の遺伝子をハイブリダイゼーション法または核酸増幅法により検出する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
芽胞形成タンパク質がＳｐｏＩＶＡである、請求項４に記載の検出法。
【請求項７】
ＳｐｏＩＶＡの遺伝子をＰＣＲ法により検出する、請求項４に記載の検出法。
【請求項８】
請求項２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つをプローブまたはプライマーとして用いてハイブリダイゼーション法または核酸増幅法を実施する、請求項４〜７のいずれか一項に記載の検出法。
【請求項９】
請求項３に記載のプライマーペアの少なくとも一つを用いてＰＣＲ法を実施する、請求項４〜７のいずれか一項に記載の検出法。
【請求項１】
ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、芽胞形成細菌の検出に用いられるプローブまたはプライマー。
【請求項２】
以下から選択される、請求項１に記載のプローブまたはプライマー：
・ 配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ１）またはプライマー（プライマー１）、
・ 配列番号２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ２）またはプライマー（プライマー２）、
・ 配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ３）またはプライマー（プライマー３）、
・ 配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ４）またはプライマー（プライマー４）、
・ 配列番号５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ５）またはプライマー（プライマー５）、
・ 配列番号６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ６）またはプライマー（プライマー６）、
・ 配列番号７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ７）またはプライマー（プライマー７）、
・ 配列番号８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ８）またはプライマー（プライマー８）、
・ 配列番号９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ９）またはプライマー（プライマー９）、および
・ 配列番号１０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドからなるプローブ（プローブ１０）またはプライマー（プライマー１０）
（上記ポリヌクレオチドにおいて、配列番号１〜１０の各ヌクレオチド配列の「ｎ」は、イノシン（Ｉ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）からなる群から選択されるいずれかの塩基を表し、配列番号１〜１０の各ヌクレオチド配列において１〜数個のヌクレオチドが置換（イノシンへの置換を含む）、欠失、挿入、または付加されていてもよい）。
【請求項３】
以下のプライマーペアのいずれか一つまたはその組み合わせからなる、芽胞形成細菌の検出に用いられるプライマーペア：
・ プライマー１と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（１）、
・ プライマー２と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（２）、
・ プライマー３と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（３）、
・ プライマー４と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（４）、
・ プライマー５と、プライマー６、プライマー７、およびプライマー８並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（５）、
・ プライマー１と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（６）、
・ プライマー２と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（７）、
・ プライマー３と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（８）、
・ プライマー４と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（９）、および
・ プライマー５と、プライマー９およびプライマー１０並びにそれらの組み合わせから選択されるプライマーとからなるプライマーペア（１０）
（プライマー１〜１０は請求項２において定義された内容と同義である）。
【請求項４】
ＧＰＲ、ＳｐｏＩＶＡ、ＳｐｏＶＴ、およびＹａｂＧからなる群から選択される芽胞形成タンパク質またはその遺伝子を検出することを含んでなる、芽胞形成細菌の検出法。
【請求項５】
芽胞形成タンパク質の遺伝子をハイブリダイゼーション法または核酸増幅法により検出する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
芽胞形成タンパク質がＳｐｏＩＶＡである、請求項４に記載の検出法。
【請求項７】
ＳｐｏＩＶＡの遺伝子をＰＣＲ法により検出する、請求項４に記載の検出法。
【請求項８】
請求項２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つをプローブまたはプライマーとして用いてハイブリダイゼーション法または核酸増幅法を実施する、請求項４〜７のいずれか一項に記載の検出法。
【請求項９】
請求項３に記載のプライマーペアの少なくとも一つを用いてＰＣＲ法を実施する、請求項４〜７のいずれか一項に記載の検出法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
【図２】
【図４】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１８９３２０（Ｐ２００９−１８９３２０Ａ）
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３５０４４（Ｐ２００８−３５０４４）
【出願日】平成２０年２月１５日（２００８．２．１５）
【出願人】（３９１０５８３８１）キリンビバレッジ株式会社 (94)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１５日（２００８．２．１５）
【出願人】（３９１０５８３８１）キリンビバレッジ株式会社 (94)
【Ｆターム（参考）】
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