葉緑体工学による植物の生産性を向上させる方法
本発明の目的は、高等植物中で葉緑体工学によって特定の遺伝子を形質発現させることによって、野生株に比べ高い光合成活性を持ち、生育及び生産性が促進される形質転換植物にあって、花粉による導入遺伝子の拡散の恐れが無い形質転換植物を提供することである。本発明によれば、葉緑体遺伝子ｒｂｃＬの相補的塩基配列と葉緑体遺伝子ａｃｃＤの相補的塩基配列の間に、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ活性、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを含んだ、光合成活性を高める発現カセットを有する遺伝子組み換えベクターを用いて形質転換植物が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成活性が高く、特に二酸化炭素の固定に優れた形質転換植物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物は光合成を行い、大気中の二酸化炭素を固定し生物のエネルギー源となる糖や有機物を合成する。植物において、大気中の二酸化炭素を固定し、二酸化炭素から糖を合成する過程はカルビンサイクルと呼ばれる。カルビンサイクルでは、光のエネルギーを必要とせず、以下の２つの段階に分けられている。第１段階は、リブロース−１，５−ビスリン酸（ＲｕＢＰ）と二酸化炭素から３−ホスホグリセリン酸（ＰＧＡ）が合成され、さらにこれが還元されてグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）が合成される過程である。第２段階は合成されたＧＡＰの一部は糖（光合成生成物）の合成に使われ、残りのＧＡＰは、フルクトース１，６−ビスリン酸（ＦＢＰ）からフルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、セドヘプツロース１，７−ビスリン酸（ＳＢＰ）、セドヘプツロース７−リン酸（Ｓ７Ｐ）、リボース５−リン酸などを経てＲｕＢＰに再生される過程である。この時、ＲｕＢＰからＰＧＡの合成、すなわちカルビンサイクルへの二酸化炭素の取り込みはリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（以下、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）と略称する。）によって触媒される。第２段階においては、アルドラーゼ〔ＧＡＰとジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）からＦＢＰへの反応と、ＤＨＡＰ及びエリトロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）からＳＢＰへの反応をそれぞれ可逆的に触媒する酵素〕、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ；ＦＢＰからＦ６Ｐへの反応を触媒する酵素）、セドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ（ＳＢＰａｓｅ；ＳＢＰからＳ７Ｐへの反応を触媒する酵素）、トランスケトラーゼが律速酵素として代謝反応を担っている。
【０００３】
カルビンサイクルで作用する多くの酵素は、二酸化炭素固定の連続した反応を維持するのに必要とされるレベル以上に存在するものもある。しかしＦＢＰａｓｅ及びＳＢＰａｓｅはカルビンサイクルで重要な律速酵素でありながら、そのレベルは、カルビンサイクルの他の酵素に比較して極端に低いことが知られている（参照：ミヤガワ（Ｍｉｙａｇａｗａ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）２００１年、第１９巻、ｐ．９６５−９６９）。
【０００４】
このため、光合成能を高めるトランスジェニック植物として、植物の葉に特有の葉肉細胞から得られるサイトゾルのフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ遺伝子（ｃｙ−ＦＢＰａｓｅ遺伝子）を永続的に特異的に発現させるプロモーターを有するベクター及び、該ベクターにより形質転換されたトランスジェニック植物が報告されている（ＷＯ９８／１８９４０）。
【０００５】
また、ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４２遺伝子由来のＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを形質発現させる方法が報告されている。この方法によると、形質転換された植物は野生株に比べ高い光合成活性を持ち、生育が促進されることが知られている（参照：特開２０００−２５３７６８号公報；ミヤガワ（Ｍｉｙａｇａｗａ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）２００１年、第１９巻、ｐ．９６５−９６９）。
【０００６】
しかし、上記のいずれの形質転換体も、遺伝子を用いて構築されたプラスミドをアグロバクテリウム ツメファシエンスに導入し、葉ディスクに感染させることによって、各遺伝子を葉核ゲノムに導入されるものである。このため、植物に導入された遺伝子の発現タンパク質は、葉緑体に移行する確率が低かった。
【０００７】
また、核ゲノムへの異種遺伝子の導入は、導入した人工改変遺伝子が交雑、交配等により環境へ拡散していく懸念がある。さらに、このようにして導入された遺伝子の発現は不安定で、植物体ごとに発現量、ひいてはその効果は大きく異なる。
【０００８】
高等植物の葉緑体は、成葉１細胞あたり１００個程度存在し、葉緑体１個あたり１００コピーの葉緑体ゲノム遺伝子が存在する（アーカイブス・オブ・バイオテクノロジー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、１９９６年、第３３４巻、ｐ． ２７−３６；ベンディッヒ・エー・ジェイ（Ｂｅｎｄｉｃｈ，Ａ．Ｊ．）、バイオエッセイズ（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ）、１９８７年、第６巻、ｐ．２７９−２８２参照）。
【０００９】
このことは、もし１コピーの外来遺伝子を葉緑体ゲノムに挿入した場合、形質転換体においては細胞あたり１万コピー存在することになり、コピー数の多さから導入遺伝子の高発現が期待できる（マリガ・ピー（Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．）、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９３年、第１１巻、ｐ．１０１−１０７参照）。
【００１０】
さらに、葉緑体への遺伝子導入は相同組み換えを利用するため、核への挿入時に見られる位置効果がおこらず、安定した遺伝子発現が行われる。また、葉緑体は母性遺伝をするため、導入した遺伝子の花粉を介した環境への飛散を防ぐことができる等、葉緑体への遺伝子導入は利点が多いと考えられている。
【００１１】
目的タンパク質を葉緑体において高度に発現させることができる発現ベクター、及び該発現ベクターを用いて形質転換させた形質転換葉緑体、該形質転換葉緑体を有する植物が知られている。この発現ベクターは、ｐｓｂＡプロモーターと、タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴としている。本方法は、薬理活性を有するタンパク質、医薬品工業用材料等として有用なタンパク質を、微生物による製造に換えて、植物を使用して製造することを目的としたものである。該実施例において、緑色蛍光蛋白の遺伝子を用いて形質転換された植物に、その蛋白の発現が確認されている（マリガ・ピー（Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．）、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９３年、第１１巻、ｐ．１０１−１０７参照）。
【００１２】
しかし、本文献には、植物において光合成活性や二酸化炭素の固定を改善すること等についての記載はなく、またカルビンサイクルの律速酵素であるＦＢＰａｓｅ又はＳＢＰａｓｅ、或いはそれらの遺伝子についての記載も認められない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、高等植物中で光合成、特にカルビンサイクルに関与する酵素の遺伝子を形質発現させることによって、野生株に比べ高い光合成活性を持ち、生育が促進される形質転換植物を作製することである。より、詳しくは葉緑体ＤＮＡにカルビンサイクル反応を律速している酵素の遺伝子を導入し、光合成能が増強された形質転換葉緑体を有する植物を作製することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ＦＢＰａｓｅ及び／又はＳＢＰａｓｅを有するタンパク質を高等植物の葉緑体中で確実に発現させることができる形質転換技術を見出した。また形質転換された植物は高い光合成活性を有するのみならず、より大きな植物体を有する植物に成長することを見出した。本発明は、これらの知見を基礎として更に種々研究を重ね完成されたものである。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）ルビスコ大サブユニットとアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子の間にＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを含んだ光合成活性を高める発現カセットを有する遺伝子組み換えベクター、
（２）ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質、
（３）ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（４）ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号３において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質、
（５）ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号４において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（６）ＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号５において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質、
（７）ＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号６において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（８）発現カセットが、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載のベクター、
（９）発現カセットが、リボゾーム結合部位の上流にプロモーター、及びＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの下流にターミネーターを有することを特徴とする上記（８）に記載のベクター、
（１０） プロモーター及びターミネーターがそれぞれタバコ葉緑体由来のプロモーター及びターミネーターであることを特徴とする上記（９）に記載のベクター、
（１１）ルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子がそれぞれタバコ由来の遺伝子である上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のベクター、
（１２）タバコ由来のルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子の間に、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを有し、上記ＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有し、さらに、上記ルビスコ大サブユニット遺伝子とリボゾーム結合部位の間にタバコ由来のプロモーターを有し、そして上記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子とＤＮＡフラグメントの間にタバコ由来のターミネーターを有する発現カセットを有する遺伝子組み換えベクター、
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載のベクターを葉緑体に導入した形質転換葉緑体、
（１４）上記（１３）に記載の形質転換葉緑体を有する植物、
（１５）植物がタバコである上記（１４）に記載の植物、及び
（１６）葉緑体形質転換の手法を用いて、高等植物の葉緑体ゲノムにＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させることにより、ＦＢＰａｓｅ活性を元の植物の２倍以上に高めた植物、
に関する。
【００１６】
また、本発明は葉緑体ＤＮＡの遺伝子間の非コード領域にＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを挿入し、形質転換された葉緑体を有する植物を生産する方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のベクターは、確実に高等植物の葉緑体へ、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質を導入できる。本発明のベクターにより形質転換された植物は、カルビンサイクルの律速酵素であるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質の発現が増強されるので、野性株よりも光合成能が強化される。この結果、本発明の形質転換植物は、野生株に比べて、糖、デンプンの合成能力が増大し得る。また、本発明の形質転換植物は、背丈が大きく、また葉の面積も大きく、茎も太くなり、早く生育し得る。したがって、本発明のベクターを用いた形質転換植物の栽培は、早生、高収量植物を作出する上で非常に有効な手段となり得る。
【００１８】
本発明の形質転換植物は、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が核ゲノムではなく、葉緑体ゲノムに直接導入されるため、導入された遺伝子の花粉による拡散の恐れがない。すなわち、例えば核に遺伝子が導入された植物のように、花粉が風や昆虫により広範囲に撒き散らされ、動植物界への悪影響を与える等の環境汚染の心配がない。また、形質転換体の間で発現が安定している。また、葉緑体ゲノムに直接導入された本発明の形質転換植物は、核に遺伝子が導入された形質転換植物に比較して、糖、デンプンの合成能力が増大し、背丈、葉が大きくなり、早生、高収量植物に生育し得る。
【００１９】
組み換えＤＮＡ技術を利用して、高等植物の一次代謝である光合成の機能を改善し、早生、収穫量の増大が可能であるので、将来の食料危機に対応する上で極めて重要な技術となり得る。
【００２０】
また、本発明の形質転換植物は、光合成のうち、特に二酸化炭素固定に重要な役目を果たすカルビンサイクルの律速酵素が増強される。このため、本発明の形質転換植物は、大気中の二酸化炭素の取り込み率を高め、大気中の二酸化炭素濃度を低減できるので、該植物の栽培は、地球温暖化の抑制にも貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質は、カルビンサイクルの律速酵素となり得るタンパク質である。該タンパク質は、ＦＢＰａｓｅ及び／又はＳＢＰａｓｅのいずれの酵素活性を有するものであっても、また両方の酵素活性を併せ持つものであってもよい。特に、高等植物では、カルビンサイクルの一連の反応において、その反応の全体としての速度を支配するペースメーカー酵素となり得るＳＢＰａｓｅの酵素活性を有するタンパク質並びに、ＦＢＰａｓｅ及びＳＢＰａｓｅの両活性を有するタンパク質（以下、ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅと略称する。）が好ましい。
【００２２】
ＦＢＰａｓｅ活性を有する蛋白質としては、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を挙げることができる。また、ＳＢＰａｓｅ活性を有する蛋白質としては、例えば配列番号３で示されるアミノ酸配列を挙げることができる。ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を示すタンパク質としては、例えば配列番号５で示されるラン藻由来のＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅのアミノ酸配列を挙げることができる。本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質には、上記各アミノ酸配列のうち、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつそれぞれＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質も含まれる。さらに、本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質には、配列番号１、３又は５に記載のアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも６０％以上の相同性を有するタンパク質、好ましくは８０％以上の相同性を有するタンパク質、より好ましくは９０％以上の相同性を有するタンパク質、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質であって、かつそれぞれＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２３】
なお、本明細書でアミノ酸配列について「相同」というときは、タンパク質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いる。
【００２４】
また、アミノ酸配列について、「１又は数個（２〜６個程度）のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入」というときは、部位特異的突然変異誘発法などの周知の技術的方法により、天然に生じうる程度の数が、欠失、置換、付加又は挿入などされていることを意味する。
【００２５】
本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡフラグメントとしては、ＦＢＰａｓｅ、ＳＢＰａｓｅ、ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの各酵素をコードするＤＮＡ及び前記各酵素の活性部位を有するタンパク質をコードするＤＮＡをいう。ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列としては、例えば配列番号２に示されるＤＮＡ配列が挙げられる。ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列としては、例えば配列番号４に示されるＤＮＡ配列が挙げられる。ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列としては、例えば配列番号６に示されるＤＮＡ配列が挙げられる。本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントには、上記した配列番号２、４又は６に示されるＤＮＡ配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。塩基配列について、「１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入」というときは、部位特異的突然変異誘発法などの周知の技術的方法により、天然に生じうる程度の数（１〜数個）の塩基が、欠失、置換、付加又は挿入などされていることを意味する。
【００２６】
また、本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントには、配列番号２、４又は６に示される各ＤＮＡ配列と、それぞれ相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ストリンジェントな条件とは、塩濃度、０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。
【００２７】
さらに本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントには、配列番号２、４又は６に示される各ＤＮＡ配列と、それぞれ少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつそれぞれＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。相同性を有するＤＮＡとは、ハイストリンジェントな条件において、少なくとも約６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、より好ましくは、約９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡをいう。なお、ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ程度、好ましくは約１９〜２０ｍＭ程度で、温度が約５０〜７０℃程度、好ましくは約６０〜６５℃程度の条件をいう。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃程度の場合が最も好ましい条件である。
【００２８】
なお、以下、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、及び上記ハイブリダイズするＤＮＡ並びに相同性を有するＤＮＡを被導入遺伝子ともいう。
【００２９】
本発明の発現カセットは、葉緑体ＤＮＡ中に相同的組換えによって、確実に導入されるように、被導入遺伝子の５’−及び３’−側に、葉緑体ＤＮＡの遺伝子［例えば、ｔｒｎＧ（ｔＲＮＡ−Ｇｌｙ（ＧＣＣ））、ｔｒｎＶ（ｔＲＮＡ−Ｖａｌ（ＧＡＣ））、ｔｒｎｆＭ（ｔＲＮＡ−ｆＭｅｔ（ＣＡＵ））、ｒｂｃＬ遺伝子、ａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩ（ｔＲＮＡ−Ｉｌｅ（ＧＡＵ））とｔｒｎＡ（ｔＲＮＡ−Ａｌａ（ＵＧＵ））、３’ｒｐｓ１２（リボソーマルプロテインＳ１２エクソン−３）遺伝子、ｔｒｎＶ（ｔＲＮＡ−Ｖａｌ（ＧＡＣ））等］配列と相補的塩基対をつくる塩基配列を付加したものである。相補的塩基対をつくる塩基配列は、葉緑体ＤＮＡの遺伝子と相補的塩基対をつくる相同的部分を有する、約５００〜１５００程度の塩基配列からなる配列であれば、好ましく用いることができる。このような塩基配列としては、葉緑体ＤＮＡの遺伝子と実質的に同一の配列、葉緑体ＤＮＡの遺伝子の部分配列と実質的に同一の配列、又は葉緑体ＤＮＡの遺伝子と実質的に同一の配列を含む配列に対する相補的な塩基配列が挙げられる。
【００３０】
また、被導入遺伝子の導入位置から約１０００〜１５００程度の塩基配列を有し、葉緑体ＤＮＡの遺伝子（例えば、ｔｒｎＧ、ｔｒｎｆＭ、ｒｂｃＬ遺伝子、ａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩ、ｔｒｎＡ、３’ｒｐｓ１２遺伝子、ｔｒｎＶ等）と相補的塩基対をつくるものであれば、上記葉緑体ＤＮＡの遺伝子配列に限定されない。
【００３１】
この時、葉緑体ＤＮＡの塩基配列は、外来遺伝子が導入されること以外、変化がないことが肝要である。外来遺伝子の導入先となる葉緑体ＤＮＡの塩基配列は、すでにＮＣＢＩのデータベースに登録され、開示されている（登録番号：ＮＣ ００１８７９）。葉緑体ＤＮＡ中に被導入遺伝子が導入される位置は、好ましくは葉緑体ＤＮＡの遺伝子のｔｒｎＧとｔｒｎｆＭの間、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間、ｔｒｎＩとｔｒｎＡの間、３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶの間であり、それぞれの遺伝子から充分な距離を置いた非コード領域が望ましい。前記充分な距離とは、遺伝子から少なくとも５０塩基以上、好ましくは約１００〜１０００塩基程度、より好ましくは約２００〜５００塩基程度である。該非コード領域は、葉緑体ＤＮＡ上のいずれの非コード領域であってもよい。
【００３２】
以下に、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子を使用した発現カセットにつき、より詳細に説明する。
【００３３】
光合成活性を高める発現カセットを構成するｒｂｃＬ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の遺伝子である。ルビスコは、光合成ＣＯ２固定反応回路（カルビンサイクル）において，初発段階であるＣＯ２固定反応（カルボキシラーゼ反応）を触媒し、該回路における代謝の律速となる鍵酵素である。また、該酵素は酸素（Ｏ２）を固定する反応（オキシゲナーゼ反応）も触媒する。本発明における葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子としては、タバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子を好ましく用いることができる。
【００３４】
光合成活性を高める発現カセットを構成するａｃｃＤ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの遺伝子である。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、植物において脂肪酸合成に関与している酵素である。本発明における葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子としては、タバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子を好ましく用いることができる。
【００３５】
葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子と葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子とを有する発現カセットを用いることにより、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、相同組換えにより葉緑体に組み込まれやすくなり、さらに葉緑体でのＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質の発現量が多くなるという利点ある。
【００３６】
なお、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子はそれらの全長を使う必要はない。例えばｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子との間の非コード領域の、被導入遺伝子の導入位置からｒｂｃＬ遺伝子側又はａｃｃＤ遺伝子側にそれぞれ約１０００〜１５００程度の塩基対の長さを有し、ｒｂｃＬ遺伝子又はａｃｃＤ遺伝子とそれぞれ相同的組換えし得る配列であればよい。
【００３７】
また、光合成活性を高める発現カセットは、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流に、リボゾーム結合部位を有することが好ましい。該ＤＮＡフラグメントの上流にリボソーム結合部位を置くことにより、該タンパク質を高度に発現させることができる。該リボゾーム結合部位は、タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点に隣接して、あるいは上流にあってもよいが、翻訳開始点の約７〜１１塩基程度上流にあることが好ましく、９塩基程度上流にあることがさらに好ましい。かかるリボゾーム結合部位は、リボゾームが結合できることが知られている自体公知の塩基配列を有していればよいが、ＳＤ配列が好ましい。ＳＤ配列は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の略称であり、４〜７個のヌクレオチドからなるセグメントであって、その塩基配列は５'−ＡＧＧＡＧＧＵ−３’（配列番号１８）の一部又は全部である。
【００３８】
光合成活性を高める発現カセットには、上記リボゾーム結合部位の上流にさらに、植物細胞由来のプロモーターを有することが好ましい。該プロモーターは、リボゾーム結合部位の上流であれば、リボゾーム結合部位に隣接してもよく、約１〜３０塩基程度上流にあってもよい。該プロモーターとしては、例えば、エロンゲーションファクター１α遺伝子のプロモーター（ＥＦ１αプロモーター）、３５Ｓプロモーター、ｐｓｂＡプロモーター、ＰＰＤＫプロモーター、ＰｓＰＡＬ１プロモーター、ＰＡＬプロモーター、ＵＢＩＺＭ１ユビキチンプロモーター、ｒｒｎプロモーター等が挙げられる。中でも、葉緑体由来のプロモーターが好ましく、タバコ葉緑体由来のプロモーターがより好ましく、例えば配列表の配列番号７で記載されたタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーター等を特に好ましく用いることができる。
【００３９】
光合成活性を高める発現カセットには、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントとａｃｃＤ遺伝子の間に植物由来のターミネーターを有することが好ましい。該ターミネーターは、ＤＮＡフラグメントの下流であれば、ＤＮＡフラグメントに隣接してもよく、約１〜３０塩基程度下流にあってもよい。該ターミネーターとしては、例えば３５Ｓターミネーター、ｒｐｓ１６ターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ＯＲＦ２５ｐｏｌｙＡ転写ターミネーター、ＰｓｂＡターミネーター等が挙げられる。中でも、葉緑体由来のターミネーターが好ましく、タバコ葉緑体由来のターミネーターがより好ましく、タバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターが最も好ましく、例えば配列表の配列番号８で記載されたタバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターを好ましく用いることができる。
【００４０】
また、発現カセットには、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有することが好ましい。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。そのような遺伝子としては、例えば、各種の薬剤耐性遺伝子（ａａｄＡ）、及び宿主の栄養要求性を相補する遺伝子などが挙げられる。より具体的には、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子等が挙げられる。より具体的には、例えば配列表の配列番号９に記載されたスペクチノマイシン耐性遺伝子などを好ましく用いることができる。また、該遺伝子の上流及び下流には、それぞれ該遺伝子を認識するためのプロモーター（以下、ａａｄＡプロモーターと略記する。）及び該遺伝子のターミネーター（以下、ａａｄＡターミネーターと略記する。）を配することが好ましい。該ａａｄＡプロモーター及びａａｄＡターミネーターは、上記した植物由来のプロモーター及びターミネーターを好ましく使用できるが、ｒｒｎプロモーター及びｐｓｂＡターミネーターが特に好適である。ａａｄＡプロモーター／ａａｄＡ／ａａｄＡターミネーターをａａｄＡカセットということもある。
【００４１】
遺伝子組換え体を識別するためのａａｄＡカセットは、ｒｂｃＬ遺伝子とリボゾーム結合部位の上流にあるプロモーターとの間に配することが好ましい。
【００４２】
本発明のベクターに使用される発現カッセトは、５'側からｒｂｃＬ遺伝子、ａａｄＡカセット、プロモーター、リボソーム結合部位、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメント、ターミネーター及びａｃｃＤ遺伝子の順序に構築されることが好ましい。各ＤＮＡ間は連続していてもよく、あるいは各ＤＮＡの間に例えばイントロン配列等が挿入されていてもよい。
【００４３】
本発明における遺伝子組換えベクターは、例えば以下の工程により作製することができる。
【００４４】
まず、ｐＬＤ６ベクターを作製する工程である。かかるベクターは、実施例の〔工程１〕に記載の方法で容易に作製することができる。ｐＬＤ６の全塩基配列を配列番号１０に示す。ｐＬＤ６のＮｏｔＩとＳａｌＩの切断部位に構築遺伝子群を挿入する。構築遺伝子群は、（ａ）配列番号１１で表される塩基配列からなるマルチクローニング領域（配列番号１０中の３６９８−３７４８に位置する）と、その上流に配列番号７で表されるタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーター（配列番号１０中の３５６９−３７０１に位置する）と、マルチクローニング領域の下流に配列番号８で表されるタバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーター（配列番号１０中の３７５５−３９１３に位置する）とからなる群と、その群の上流に（ｂ）遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としての配列番号９で表されるスペクチノマイシン耐性遺伝子であるａａｄＡ遺伝子（配列番号１０中の２３６９−３１７３に位置する）と、ａａｄＡ遺伝子の上流に配列番号１２で表されるタバコ葉緑体由来のｒｒｎプロモーター（配列番号１０中の２２２７−２３６８に位置する）と、ａａｄＡ遺伝子の下流に配列番号１３で表されるタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡターミネーター（配列番号１０中の３１７５−３５６４に位置する）とを有している。上記マルチクローニング領域の制限酵素認識部位（ＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩ、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ）に、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挿入する。より具体的には、ｐＬＤ６ベクターのマルチクローニング領域のＳｐｈＩとＥｃｏＲＩの切断部位に、例えば配列番号２で示されるホウレンソウ由来のＳＢＰａｓｅをコードする遺伝子又は配列番号４で示されるホウレンソウ由来のＦＢＰａｓｅをコードする遺伝子、あるいはラン藻由来の配列番号６で示されるＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅをコードする遺伝子等を挿入する。この場合、配列番号の第１３〜１７位の塩基配列（５’−ａｇｇａｇ−３’）がＳＤ配列に相当し、リボソーム結合部位として働く。以下、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挿入された構築遺伝子群をＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子群と称し、該遺伝子群が挿入されたｐＬＤ６ベクターをｐＬＤ６−ＦＢＰ／ＳＢＰと称する。
【００４５】
次いで、ｐＬＤ６−ＦＢＰ／ＳＢＰを適当な宿主細胞に導入し、かかる宿主細胞を培養して、ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子群をクローニングする。
【００４６】
宿主細胞は、自体公知の宿主細胞から適宜選択でき、具体的には、例えばエシェリヒア属菌やバチルス属菌などの原核生物、酵母や糸状菌などの真核生物、植物細胞又は動物細胞等が挙げられる。また、宿主細胞の培養条件は、宿主細胞の種類に応じて当業界で通常行われている条件に従えば良い。また、クローニングされた遺伝子にＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がうまく導入されたか否かは、ｐＬＤ６−ＦＢＰ／ＳＢＰが有する選択マーカー等に基づき容易に判別することができる。
【００４７】
次いで、ｐＬＤ２００ベクターを作製する工程である。かかるベクターは、実施例の〔工程２〕に記載の方法で容易に作製することができる。先の工程のｐＬＤ６−ＦＢＰ／ＳＢＰを用いてクローニングされた遺伝子組換え体から、ＮｏｔＩ及びＳａｌＩを用いてＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子群を切り出し、切り出した該遺伝子群をｐＬＤ２００のポリリンカーのＮｏｔＩとＳａｌＩの切断部位に挿入する。ｐＬＤ２００の全塩基配列を配列番号１４に記載する。上記ポリリンカーは配列番号１７で表される塩基配列（配列番号１４の２１２５−２１４５に位置する）を有し、複数の制限酵素部位（ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ及びＳａｌＩ）を有する。ｐＬＤ２００ベクターは、ポリリンカーとその上流に配列番号１５で表される塩基配列からなるタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子（配列番号１４の４２３−１８５６に位置する。）と、その下流に配列番号１６で表される塩基配列からなるタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子（配列番号１４の２６２４−３３２８に位置する。）からなる発現カセットを有することを特徴とするベクターである。このようにしてＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子群が挿入されたｐＬＤ２００ベクターをｐＬＤ２００−ＦＢＰ／ＳＢＰと称する。
【００４８】
上記ベクターは、自体公知のクローニングベクターに、複数の制限酵素部位を有するポリリンカー（好ましくは配列番号１７で表される塩基配列の遺伝子）と、ポリリンカーの上流にタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子と、ポリリンカーの下流にタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子とを挿入することにより得ることもできる。
【００４９】
このようにして作製された上記ｐＬＤ２００−ＦＢＰ／ＳＢＰを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する。このとき、宿主細胞としては、植物細胞が好ましく、葉緑体がより好ましく、タバコ葉緑体がさらに好ましい。このように、植物細胞、特に葉緑体を宿主細胞として用いることにより、導入した遺伝子がコードするタンパク質を高発現させることができ、さらに導入した遺伝子の花粉を介した環境への飛散を防ぐことができる等の利点がある。
【００５０】
ｐＬＤ２００−ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを宿主細胞、特に葉緑体へ導入して形質転換する方法としては、公知の方法を用いてよい。そのような方法としては、例えば、該発現ベクターを金又はタングステンの極めて細かい粒子にまぶし、この発現ベクターが付着した粒子を火薬又は高圧ガスで宿主細胞に打ち込み、該発現ベクターを導入するというパーティクルガン法などが挙げられる。中でも、高等植物の葉緑体への遺伝子導入系は、パーティクルガンによる手法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，及びＭａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，第８７巻，ｐ．８５２６−８５３０）または、ＰＥＧによる手法（Ｇｏｌｄｓ，Ｔ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，及びＫｏｏｐ，Ｈ．−Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３年，第１１巻，ｐ．９５−９７）を用いるのが好ましい。
【００５１】
本発明に係る上記形質転換葉緑体を有する植物は、自体公知の方法によって得ることができる。ここで、上記植物は特に限定されないが、高等植物が好ましく、葉緑体形質転換系が確立されている植物がより好ましく、例えば、タバコ、イネ、ジャガイモ、ナタネ及びレタスが挙げられ、タバコが特に好ましい。タバコとしては、ニコチアナ・アキュミネート（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、ニコチアナ・アラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ）、ニコチアナ・アテヌエイタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）、ニコチアナ・クレベランディ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、ニコチアナ・エクセルシオール（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ）、ニコチアナ・フォルゲティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ）、ニコチアナ・ゴッセイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｏｓｓｅｉ）、ニコチアナ・グラウカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌａｕｃａ）、ニコチアナ・グルティノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、ニコチアナ・ラングスドルフィー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ）、ニコチアナ・ロンギフローラ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ）、ニコチアナ・オブツシホリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）、ニコチアナ・パニュキュレータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ニコチアナ・プルムバギホリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｆｏｌｉａ）、ニコチアナ・クアドリバリビス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ）、ニコチアナ・レパンダ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｅｐａｎｄａ）、ニコチアナ・ルスチカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・サンデラエ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓａｎｄｅｒａｅ）、ニコチアナ・スーベオレンス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・トメントサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）などが挙げられる。中でも、ニコチアナ・ルスチカ及びニコチアナ・タバカムが好ましい。特にニコチアナ・タバカムが好適であり、ニコチアナ・タバカムのうちの「バーレー種」、「黄色種（バージニア種）」、「在来種」及び「オリエント種」がとりわけ好ましい。
【００５２】
上記植物はその植物に応じた自体公知の条件で生育させことができる。
【００５３】
なお、上記の遺伝子工学又は生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等に記載された方法に従って容易に行うことができる。
【００５４】
本発明に係るタバコ葉緑体ゲノム中への遺伝子導入用ベクターの構築の過程で利用したベクターのｐＬＤ６及びｐＬＤ２００については、特願２００１−０８３５６９で公開されている。
【００５５】
以下に具体的実施例を挙げ、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限定されることはない。
【００５６】
なお、実施例で使用する各略号の意味は、次のとおりである。
Ｓ．７９４２：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ ７９４２
ＬＢ培地：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム
【実施例】
【００５７】
遺伝子組み換え体の作製
〔工程１〕ｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの作製
配列表の配列番号２で表されるＳ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ遺伝子（ｆｂｐ／ｓｂｐ）をタバコ葉緑体において高発現が期待できるｐｓｂＡプロモーター（ＰｐｓｂＡ）をもつベクターｐＬＤ６の制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、ｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを作製した。この、ｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを常法に従い大腸菌に導入した。この大腸菌を、スペクチノマイシンを添加したＬＢ培地で３７℃下、１６時間培養し、かかる遺伝子が導入された大腸菌を選択した。選択された大腸菌を同様の条件で培養し、その後遠心分離により集菌し、常法に従いｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ（プラスミドＤＮＡ）を精製した。なお、ＬＢ培地１Ｌ中の組成は、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、及び５ｇＮａＣｌである。
【００５８】
〔工程２〕ｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの作製］
工程１で精製したｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｌＩで処理した後、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを含む断片をＮｏｔＩ上流とＳａｌＩ下流にタバコ葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子の一部とａｃｃＤ遺伝子の一部を含む葉緑体形質転換用ベクターｐＬＤ２００のＮｏｔＩとＳａｌＩ部位の間に挿入し、ｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを作製した。この、ｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを常法に従い大腸菌に導入した。この大腸菌を、スペクチノマイシンを添加したＬＢ培地で３７℃下、１６時間培養し、かかる遺伝子が導入された大腸菌を選択した。選択された大腸菌を同様の条件で培養し、その後遠心分離により集菌し、常法に従いｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ（プラスミドＤＮＡ）を精製した（図１）。
【００５９】
〔工程３〕葉緑体形質転換体の作製
精製したｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅをパーティクルガンによりタバコ葉緑体に導入し、葉緑体形質転換体を作製した。タバコ葉緑体形質転換は、既知の方法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．ａｎｄ ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，８５２６−８５３０（１９９０））に従い実施した。
【００６０】
スペクチノマイシン添加培地上での再分化後、ＰＣＲにより葉緑体ゲノム中にＳ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの導入された形質転換体（ｐＴｐｓｂＡＦＳ）６系統を得ることが出来た。自家交配により作出したＴ１世代においても遺伝子の脱落は認めらなかった（図２）。抗Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ抗体を用い、ウエスタンブロッティンクを行った結果、形質転換植物（ｐＴｐｓｂＡＦＳ）においてのみ、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの分子質量に一致する約４０ｋＤａの位置にシグナルが認められ、ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅが高発現していることが明らかになった（図３）。
【００６１】
播種１０週及び１８週後の植物を用い、ＦＢＰａｓｅ活性の測定を行った。野生株に比べ、形質転換植物では約１０−４０倍高いＦＢＰａｓｅ活性を有していた（図４）。
【００６２】
播種１２週後のＴ１世代を用い、ＣＯ２濃度３６０ｐｐｍ条件下における光強度変化による光合成活性を測定した。その結果を図５に示す。形質転換体（ｐＴｐｓｂＡＦＳ−３及びｐＴｐｓｂＡＦＳ−９）及び野生株（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）は、光強度約５００mｍｏｌ／ｍ２／ｓで光合成速度がマキシマムとなり、以後その速度を維持した。マキシマムにおける形質転換体の光合成速度は、野生株の約２倍であった。
【００６３】
比較として、特開２０００−２５３７６８号公報に記載の方法により、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを連結したプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に導入し、タバコのリーフディスクに感染させた形質転換体（ＴｐＦＳ−３及びＴＰＦＳ−６）を作製した。ＴｐＦＳ−３及びＴＰＦＳ−６は、野生株に比較し、マキシマムにおける光合成速度は約１．２〜１．３倍程度で、ｐＴｐｓｂＡＦＳ−３及びｐＴｐｓｂＡＦＳ−９の光合成速度より、非常に低かった。このことは、本発明の形質転換体は、野生株及び従来法による形質転換植物に比較して、光合成活性が非常に亢進していることを示すものである。
【００６４】
また、ｐＴｐｓｂＡＦＳ−３及びｐＴｐｓｂＡＦＳ−９は、光強度約２００mｍｏｌ／ｍ２／ｓで、野生株のマキシマムと、３００mｍｏｌ／ｍ２／ｓで、ＴｐＦＳ−３及びＴＰＦＳ−６のマキシマムと同程度の光合成速度を示した。このことは、本発明の形質転換植物は、光強度が低い場合でも、充分な光合成活性を有することを示すものである。
【００６５】
播種１８週後の形質転換体の生育を野生株と比較したところ、野生株に比べ形質転換植物では明らかに生育が促進されており、最終的な生育は野生株の１．２〜１．３倍に達した（図６及び７）。また、形質転換体では野生株に比べ茎が太くなっており、根も著しく発達していた（図８）。さらに、生育１８週後の形質転換体は、野生株の約１．５倍の大きさに成長していた。
【００６６】
このように、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ遺伝子をタバコ葉緑体ゲノムに導入することで、タバコの葉の光合成能を向上させることができた。さらにそのことにより、生育を促進させ、収穫量を増やすことが可能となった。
【００６７】
タバコ以外の植物種については、前記プラスミドｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰをパーティクルガンによりその葉緑体に導入し、スペクチノマイシン添加培地上で耐性細胞を選択することにより、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子が導入され、発現する植物細胞を得ることができる。
【００６８】
例えば、ナタネの子葉、ジャガイモの葉片、レタスの葉片、イネの葉片または胚性幹細胞等にパーティクルガンにより前記プラスミドを打ち込み、適当な濃度のスペクチノマイシン添加培地上で耐性細胞を選択することにより形質転換植物細胞を得ることができる。Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させて得られた細胞を、適当な条件で再分化させることにより、生育を促進する、向上した光合成能を有する植物体を得ることができる。ナタネに対する形質転換の条件は、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１） ｐ１１１−１１４（２００３）に、ジャガイモに対する形質転換の条件は、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １９（２） ｐ．２０９−２１６（１９９９）に、イネに対する形質転換の条件は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７（９） ｐ．９１０−９１５（１９９９）に、レタスに対する形質転換の条件は、Ｓｙｍｐｏｄｉｕｍ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １Ｄａ−１０， ２００４に記載されている。
【００６９】
その他の植物種についても同様に、パーティクルガンを用いて葉片または胚性幹細胞等に前記ｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を撃ち込み、スペクチノマイシン添加培地上で耐性株を選択し、再分化させることにより、形質転換植物体を得ることができる。スペクチノマイシンを用いての選択条件は、種々の濃度のスペクチノマイシンを添加した培地での増殖、再分化を観察することで容易に決定することができる。通常は野生型株が増殖できない濃度であって、できる限り低濃度を選択するのが好ましい。カルスから植物体への再分化条件は、通常の手法を用いて決定することができる。この選択は、例えば、オーキシンあるいはサイトカイニンの濃度を段階的に変えたマトリックスの培地を用いて行われて、再分化の最適条件が決められる。必要に応じて、ジベレリンやアミノ酸を添加する場合もある。現在では、多くの植物種でカルスから植物への再分化条件が決定されている。これらの植物に上に述べた葉緑体形質転換の手法を適用することにより、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させた植物体を得ることができ、このものは生育を促進する光合成能が向上している。これまで再分化条件が確立していない植物種について再分化が将来可能になれば、本発明のベクターをそのような植物に適用して、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させて、光合成能の向上により生育が促進された植物体を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の遺伝子組み換え体を用いて形質転換された植物は、光合成活性が高く、早生あるいは高収量の作物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は発現ベクターｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを示す図である。
【図２】図２はＰＣＲによる遺伝子導入の確認を示す図である。図中、Ｗは野生株を示す。
【図３】図３は播種後１０週目の植物における導入遺伝子及び発現タンパク質の確認を示す図である。図中、Ｗは野生株を示す。
【図４】図４は播種後１０週及び１８週目における上葉及び下葉におけるＦＢＰａｓｅ活性の比較を示す図である。図中、縦軸はＦＢＰａｓｅ活性を示す。
【図５】図５は播種後１０週目の光合成活性を示す図である。
【図６】図６は生育速度を示す図である。図中、縦軸は植物の高さ（ｃｍ）を示す。
【図７】図７は播種後１８週目の植物を示す図である。
【図８】図８は播種後１８週目の植物における茎及び根を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成活性が高く、特に二酸化炭素の固定に優れた形質転換植物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物は光合成を行い、大気中の二酸化炭素を固定し生物のエネルギー源となる糖や有機物を合成する。植物において、大気中の二酸化炭素を固定し、二酸化炭素から糖を合成する過程はカルビンサイクルと呼ばれる。カルビンサイクルでは、光のエネルギーを必要とせず、以下の２つの段階に分けられている。第１段階は、リブロース−１，５−ビスリン酸（ＲｕＢＰ）と二酸化炭素から３−ホスホグリセリン酸（ＰＧＡ）が合成され、さらにこれが還元されてグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）が合成される過程である。第２段階は合成されたＧＡＰの一部は糖（光合成生成物）の合成に使われ、残りのＧＡＰは、フルクトース１，６−ビスリン酸（ＦＢＰ）からフルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、セドヘプツロース１，７−ビスリン酸（ＳＢＰ）、セドヘプツロース７−リン酸（Ｓ７Ｐ）、リボース５−リン酸などを経てＲｕＢＰに再生される過程である。この時、ＲｕＢＰからＰＧＡの合成、すなわちカルビンサイクルへの二酸化炭素の取り込みはリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（以下、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）と略称する。）によって触媒される。第２段階においては、アルドラーゼ〔ＧＡＰとジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）からＦＢＰへの反応と、ＤＨＡＰ及びエリトロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）からＳＢＰへの反応をそれぞれ可逆的に触媒する酵素〕、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ；ＦＢＰからＦ６Ｐへの反応を触媒する酵素）、セドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ（ＳＢＰａｓｅ；ＳＢＰからＳ７Ｐへの反応を触媒する酵素）、トランスケトラーゼが律速酵素として代謝反応を担っている。
【０００３】
カルビンサイクルで作用する多くの酵素は、二酸化炭素固定の連続した反応を維持するのに必要とされるレベル以上に存在するものもある。しかしＦＢＰａｓｅ及びＳＢＰａｓｅはカルビンサイクルで重要な律速酵素でありながら、そのレベルは、カルビンサイクルの他の酵素に比較して極端に低いことが知られている（参照：ミヤガワ（Ｍｉｙａｇａｗａ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）２００１年、第１９巻、ｐ．９６５−９６９）。
【０００４】
このため、光合成能を高めるトランスジェニック植物として、植物の葉に特有の葉肉細胞から得られるサイトゾルのフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ遺伝子（ｃｙ−ＦＢＰａｓｅ遺伝子）を永続的に特異的に発現させるプロモーターを有するベクター及び、該ベクターにより形質転換されたトランスジェニック植物が報告されている（ＷＯ９８／１８９４０）。
【０００５】
また、ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ７９４２遺伝子由来のＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを形質発現させる方法が報告されている。この方法によると、形質転換された植物は野生株に比べ高い光合成活性を持ち、生育が促進されることが知られている（参照：特開２０００−２５３７６８号公報；ミヤガワ（Ｍｉｙａｇａｗａ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）２００１年、第１９巻、ｐ．９６５−９６９）。
【０００６】
しかし、上記のいずれの形質転換体も、遺伝子を用いて構築されたプラスミドをアグロバクテリウム ツメファシエンスに導入し、葉ディスクに感染させることによって、各遺伝子を葉核ゲノムに導入されるものである。このため、植物に導入された遺伝子の発現タンパク質は、葉緑体に移行する確率が低かった。
【０００７】
また、核ゲノムへの異種遺伝子の導入は、導入した人工改変遺伝子が交雑、交配等により環境へ拡散していく懸念がある。さらに、このようにして導入された遺伝子の発現は不安定で、植物体ごとに発現量、ひいてはその効果は大きく異なる。
【０００８】
高等植物の葉緑体は、成葉１細胞あたり１００個程度存在し、葉緑体１個あたり１００コピーの葉緑体ゲノム遺伝子が存在する（アーカイブス・オブ・バイオテクノロジー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、１９９６年、第３３４巻、ｐ． ２７−３６；ベンディッヒ・エー・ジェイ（Ｂｅｎｄｉｃｈ，Ａ．Ｊ．）、バイオエッセイズ（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ）、１９８７年、第６巻、ｐ．２７９−２８２参照）。
【０００９】
このことは、もし１コピーの外来遺伝子を葉緑体ゲノムに挿入した場合、形質転換体においては細胞あたり１万コピー存在することになり、コピー数の多さから導入遺伝子の高発現が期待できる（マリガ・ピー（Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．）、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９３年、第１１巻、ｐ．１０１−１０７参照）。
【００１０】
さらに、葉緑体への遺伝子導入は相同組み換えを利用するため、核への挿入時に見られる位置効果がおこらず、安定した遺伝子発現が行われる。また、葉緑体は母性遺伝をするため、導入した遺伝子の花粉を介した環境への飛散を防ぐことができる等、葉緑体への遺伝子導入は利点が多いと考えられている。
【００１１】
目的タンパク質を葉緑体において高度に発現させることができる発現ベクター、及び該発現ベクターを用いて形質転換させた形質転換葉緑体、該形質転換葉緑体を有する植物が知られている。この発現ベクターは、ｐｓｂＡプロモーターと、タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴としている。本方法は、薬理活性を有するタンパク質、医薬品工業用材料等として有用なタンパク質を、微生物による製造に換えて、植物を使用して製造することを目的としたものである。該実施例において、緑色蛍光蛋白の遺伝子を用いて形質転換された植物に、その蛋白の発現が確認されている（マリガ・ピー（Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．）、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９３年、第１１巻、ｐ．１０１−１０７参照）。
【００１２】
しかし、本文献には、植物において光合成活性や二酸化炭素の固定を改善すること等についての記載はなく、またカルビンサイクルの律速酵素であるＦＢＰａｓｅ又はＳＢＰａｓｅ、或いはそれらの遺伝子についての記載も認められない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、高等植物中で光合成、特にカルビンサイクルに関与する酵素の遺伝子を形質発現させることによって、野生株に比べ高い光合成活性を持ち、生育が促進される形質転換植物を作製することである。より、詳しくは葉緑体ＤＮＡにカルビンサイクル反応を律速している酵素の遺伝子を導入し、光合成能が増強された形質転換葉緑体を有する植物を作製することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ＦＢＰａｓｅ及び／又はＳＢＰａｓｅを有するタンパク質を高等植物の葉緑体中で確実に発現させることができる形質転換技術を見出した。また形質転換された植物は高い光合成活性を有するのみならず、より大きな植物体を有する植物に成長することを見出した。本発明は、これらの知見を基礎として更に種々研究を重ね完成されたものである。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）ルビスコ大サブユニットとアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子の間にＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを含んだ光合成活性を高める発現カセットを有する遺伝子組み換えベクター、
（２）ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質、
（３）ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（４）ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号３において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質、
（５）ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号４において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（６）ＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号５において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質、
（７）ＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、上記（１）に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号６において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（８）発現カセットが、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載のベクター、
（９）発現カセットが、リボゾーム結合部位の上流にプロモーター、及びＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの下流にターミネーターを有することを特徴とする上記（８）に記載のベクター、
（１０） プロモーター及びターミネーターがそれぞれタバコ葉緑体由来のプロモーター及びターミネーターであることを特徴とする上記（９）に記載のベクター、
（１１）ルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子がそれぞれタバコ由来の遺伝子である上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のベクター、
（１２）タバコ由来のルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子の間に、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを有し、上記ＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有し、さらに、上記ルビスコ大サブユニット遺伝子とリボゾーム結合部位の間にタバコ由来のプロモーターを有し、そして上記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子とＤＮＡフラグメントの間にタバコ由来のターミネーターを有する発現カセットを有する遺伝子組み換えベクター、
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載のベクターを葉緑体に導入した形質転換葉緑体、
（１４）上記（１３）に記載の形質転換葉緑体を有する植物、
（１５）植物がタバコである上記（１４）に記載の植物、及び
（１６）葉緑体形質転換の手法を用いて、高等植物の葉緑体ゲノムにＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させることにより、ＦＢＰａｓｅ活性を元の植物の２倍以上に高めた植物、
に関する。
【００１６】
また、本発明は葉緑体ＤＮＡの遺伝子間の非コード領域にＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを挿入し、形質転換された葉緑体を有する植物を生産する方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のベクターは、確実に高等植物の葉緑体へ、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質を導入できる。本発明のベクターにより形質転換された植物は、カルビンサイクルの律速酵素であるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質の発現が増強されるので、野性株よりも光合成能が強化される。この結果、本発明の形質転換植物は、野生株に比べて、糖、デンプンの合成能力が増大し得る。また、本発明の形質転換植物は、背丈が大きく、また葉の面積も大きく、茎も太くなり、早く生育し得る。したがって、本発明のベクターを用いた形質転換植物の栽培は、早生、高収量植物を作出する上で非常に有効な手段となり得る。
【００１８】
本発明の形質転換植物は、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が核ゲノムではなく、葉緑体ゲノムに直接導入されるため、導入された遺伝子の花粉による拡散の恐れがない。すなわち、例えば核に遺伝子が導入された植物のように、花粉が風や昆虫により広範囲に撒き散らされ、動植物界への悪影響を与える等の環境汚染の心配がない。また、形質転換体の間で発現が安定している。また、葉緑体ゲノムに直接導入された本発明の形質転換植物は、核に遺伝子が導入された形質転換植物に比較して、糖、デンプンの合成能力が増大し、背丈、葉が大きくなり、早生、高収量植物に生育し得る。
【００１９】
組み換えＤＮＡ技術を利用して、高等植物の一次代謝である光合成の機能を改善し、早生、収穫量の増大が可能であるので、将来の食料危機に対応する上で極めて重要な技術となり得る。
【００２０】
また、本発明の形質転換植物は、光合成のうち、特に二酸化炭素固定に重要な役目を果たすカルビンサイクルの律速酵素が増強される。このため、本発明の形質転換植物は、大気中の二酸化炭素の取り込み率を高め、大気中の二酸化炭素濃度を低減できるので、該植物の栽培は、地球温暖化の抑制にも貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質は、カルビンサイクルの律速酵素となり得るタンパク質である。該タンパク質は、ＦＢＰａｓｅ及び／又はＳＢＰａｓｅのいずれの酵素活性を有するものであっても、また両方の酵素活性を併せ持つものであってもよい。特に、高等植物では、カルビンサイクルの一連の反応において、その反応の全体としての速度を支配するペースメーカー酵素となり得るＳＢＰａｓｅの酵素活性を有するタンパク質並びに、ＦＢＰａｓｅ及びＳＢＰａｓｅの両活性を有するタンパク質（以下、ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅと略称する。）が好ましい。
【００２２】
ＦＢＰａｓｅ活性を有する蛋白質としては、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を挙げることができる。また、ＳＢＰａｓｅ活性を有する蛋白質としては、例えば配列番号３で示されるアミノ酸配列を挙げることができる。ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を示すタンパク質としては、例えば配列番号５で示されるラン藻由来のＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅのアミノ酸配列を挙げることができる。本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質には、上記各アミノ酸配列のうち、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつそれぞれＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質も含まれる。さらに、本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質には、配列番号１、３又は５に記載のアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも６０％以上の相同性を有するタンパク質、好ましくは８０％以上の相同性を有するタンパク質、より好ましくは９０％以上の相同性を有するタンパク質、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質であって、かつそれぞれＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２３】
なお、本明細書でアミノ酸配列について「相同」というときは、タンパク質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いる。
【００２４】
また、アミノ酸配列について、「１又は数個（２〜６個程度）のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入」というときは、部位特異的突然変異誘発法などの周知の技術的方法により、天然に生じうる程度の数が、欠失、置換、付加又は挿入などされていることを意味する。
【００２５】
本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡフラグメントとしては、ＦＢＰａｓｅ、ＳＢＰａｓｅ、ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの各酵素をコードするＤＮＡ及び前記各酵素の活性部位を有するタンパク質をコードするＤＮＡをいう。ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列としては、例えば配列番号２に示されるＤＮＡ配列が挙げられる。ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列としては、例えば配列番号４に示されるＤＮＡ配列が挙げられる。ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列としては、例えば配列番号６に示されるＤＮＡ配列が挙げられる。本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントには、上記した配列番号２、４又は６に示されるＤＮＡ配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。塩基配列について、「１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入」というときは、部位特異的突然変異誘発法などの周知の技術的方法により、天然に生じうる程度の数（１〜数個）の塩基が、欠失、置換、付加又は挿入などされていることを意味する。
【００２６】
また、本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントには、配列番号２、４又は６に示される各ＤＮＡ配列と、それぞれ相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつそれぞれＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡを意味する。ストリンジェントな条件とは、塩濃度、０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。
【００２７】
さらに本発明に使用されるＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントには、配列番号２、４又は６に示される各ＤＮＡ配列と、それぞれ少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつそれぞれＦＢＰａｓｅ活性、ＳＢＰａｓｅ活性、又はＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。相同性を有するＤＮＡとは、ハイストリンジェントな条件において、少なくとも約６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、より好ましくは、約９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡをいう。なお、ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ程度、好ましくは約１９〜２０ｍＭ程度で、温度が約５０〜７０℃程度、好ましくは約６０〜６５℃程度の条件をいう。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃程度の場合が最も好ましい条件である。
【００２８】
なお、以下、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグメント、及び上記ハイブリダイズするＤＮＡ並びに相同性を有するＤＮＡを被導入遺伝子ともいう。
【００２９】
本発明の発現カセットは、葉緑体ＤＮＡ中に相同的組換えによって、確実に導入されるように、被導入遺伝子の５’−及び３’−側に、葉緑体ＤＮＡの遺伝子［例えば、ｔｒｎＧ（ｔＲＮＡ−Ｇｌｙ（ＧＣＣ））、ｔｒｎＶ（ｔＲＮＡ−Ｖａｌ（ＧＡＣ））、ｔｒｎｆＭ（ｔＲＮＡ−ｆＭｅｔ（ＣＡＵ））、ｒｂｃＬ遺伝子、ａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩ（ｔＲＮＡ−Ｉｌｅ（ＧＡＵ））とｔｒｎＡ（ｔＲＮＡ−Ａｌａ（ＵＧＵ））、３’ｒｐｓ１２（リボソーマルプロテインＳ１２エクソン−３）遺伝子、ｔｒｎＶ（ｔＲＮＡ−Ｖａｌ（ＧＡＣ））等］配列と相補的塩基対をつくる塩基配列を付加したものである。相補的塩基対をつくる塩基配列は、葉緑体ＤＮＡの遺伝子と相補的塩基対をつくる相同的部分を有する、約５００〜１５００程度の塩基配列からなる配列であれば、好ましく用いることができる。このような塩基配列としては、葉緑体ＤＮＡの遺伝子と実質的に同一の配列、葉緑体ＤＮＡの遺伝子の部分配列と実質的に同一の配列、又は葉緑体ＤＮＡの遺伝子と実質的に同一の配列を含む配列に対する相補的な塩基配列が挙げられる。
【００３０】
また、被導入遺伝子の導入位置から約１０００〜１５００程度の塩基配列を有し、葉緑体ＤＮＡの遺伝子（例えば、ｔｒｎＧ、ｔｒｎｆＭ、ｒｂｃＬ遺伝子、ａｃｃＤ遺伝子、ｔｒｎＩ、ｔｒｎＡ、３’ｒｐｓ１２遺伝子、ｔｒｎＶ等）と相補的塩基対をつくるものであれば、上記葉緑体ＤＮＡの遺伝子配列に限定されない。
【００３１】
この時、葉緑体ＤＮＡの塩基配列は、外来遺伝子が導入されること以外、変化がないことが肝要である。外来遺伝子の導入先となる葉緑体ＤＮＡの塩基配列は、すでにＮＣＢＩのデータベースに登録され、開示されている（登録番号：ＮＣ ００１８７９）。葉緑体ＤＮＡ中に被導入遺伝子が導入される位置は、好ましくは葉緑体ＤＮＡの遺伝子のｔｒｎＧとｔｒｎｆＭの間、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間、ｔｒｎＩとｔｒｎＡの間、３’ｒｐｓ１２遺伝子とｔｒｎＶの間であり、それぞれの遺伝子から充分な距離を置いた非コード領域が望ましい。前記充分な距離とは、遺伝子から少なくとも５０塩基以上、好ましくは約１００〜１０００塩基程度、より好ましくは約２００〜５００塩基程度である。該非コード領域は、葉緑体ＤＮＡ上のいずれの非コード領域であってもよい。
【００３２】
以下に、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子を使用した発現カセットにつき、より詳細に説明する。
【００３３】
光合成活性を高める発現カセットを構成するｒｂｃＬ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の遺伝子である。ルビスコは、光合成ＣＯ２固定反応回路（カルビンサイクル）において，初発段階であるＣＯ２固定反応（カルボキシラーゼ反応）を触媒し、該回路における代謝の律速となる鍵酵素である。また、該酵素は酸素（Ｏ２）を固定する反応（オキシゲナーゼ反応）も触媒する。本発明における葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子としては、タバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子を好ましく用いることができる。
【００３４】
光合成活性を高める発現カセットを構成するａｃｃＤ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの遺伝子である。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、植物において脂肪酸合成に関与している酵素である。本発明における葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子としては、タバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子を好ましく用いることができる。
【００３５】
葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子と葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子とを有する発現カセットを用いることにより、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、相同組換えにより葉緑体に組み込まれやすくなり、さらに葉緑体でのＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質の発現量が多くなるという利点ある。
【００３６】
なお、ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子はそれらの全長を使う必要はない。例えばｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子との間の非コード領域の、被導入遺伝子の導入位置からｒｂｃＬ遺伝子側又はａｃｃＤ遺伝子側にそれぞれ約１０００〜１５００程度の塩基対の長さを有し、ｒｂｃＬ遺伝子又はａｃｃＤ遺伝子とそれぞれ相同的組換えし得る配列であればよい。
【００３７】
また、光合成活性を高める発現カセットは、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流に、リボゾーム結合部位を有することが好ましい。該ＤＮＡフラグメントの上流にリボソーム結合部位を置くことにより、該タンパク質を高度に発現させることができる。該リボゾーム結合部位は、タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点に隣接して、あるいは上流にあってもよいが、翻訳開始点の約７〜１１塩基程度上流にあることが好ましく、９塩基程度上流にあることがさらに好ましい。かかるリボゾーム結合部位は、リボゾームが結合できることが知られている自体公知の塩基配列を有していればよいが、ＳＤ配列が好ましい。ＳＤ配列は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の略称であり、４〜７個のヌクレオチドからなるセグメントであって、その塩基配列は５'−ＡＧＧＡＧＧＵ−３’（配列番号１８）の一部又は全部である。
【００３８】
光合成活性を高める発現カセットには、上記リボゾーム結合部位の上流にさらに、植物細胞由来のプロモーターを有することが好ましい。該プロモーターは、リボゾーム結合部位の上流であれば、リボゾーム結合部位に隣接してもよく、約１〜３０塩基程度上流にあってもよい。該プロモーターとしては、例えば、エロンゲーションファクター１α遺伝子のプロモーター（ＥＦ１αプロモーター）、３５Ｓプロモーター、ｐｓｂＡプロモーター、ＰＰＤＫプロモーター、ＰｓＰＡＬ１プロモーター、ＰＡＬプロモーター、ＵＢＩＺＭ１ユビキチンプロモーター、ｒｒｎプロモーター等が挙げられる。中でも、葉緑体由来のプロモーターが好ましく、タバコ葉緑体由来のプロモーターがより好ましく、例えば配列表の配列番号７で記載されたタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーター等を特に好ましく用いることができる。
【００３９】
光合成活性を高める発現カセットには、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントとａｃｃＤ遺伝子の間に植物由来のターミネーターを有することが好ましい。該ターミネーターは、ＤＮＡフラグメントの下流であれば、ＤＮＡフラグメントに隣接してもよく、約１〜３０塩基程度下流にあってもよい。該ターミネーターとしては、例えば３５Ｓターミネーター、ｒｐｓ１６ターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ＯＲＦ２５ｐｏｌｙＡ転写ターミネーター、ＰｓｂＡターミネーター等が挙げられる。中でも、葉緑体由来のターミネーターが好ましく、タバコ葉緑体由来のターミネーターがより好ましく、タバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターが最も好ましく、例えば配列表の配列番号８で記載されたタバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターを好ましく用いることができる。
【００４０】
また、発現カセットには、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有することが好ましい。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。そのような遺伝子としては、例えば、各種の薬剤耐性遺伝子（ａａｄＡ）、及び宿主の栄養要求性を相補する遺伝子などが挙げられる。より具体的には、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子等が挙げられる。より具体的には、例えば配列表の配列番号９に記載されたスペクチノマイシン耐性遺伝子などを好ましく用いることができる。また、該遺伝子の上流及び下流には、それぞれ該遺伝子を認識するためのプロモーター（以下、ａａｄＡプロモーターと略記する。）及び該遺伝子のターミネーター（以下、ａａｄＡターミネーターと略記する。）を配することが好ましい。該ａａｄＡプロモーター及びａａｄＡターミネーターは、上記した植物由来のプロモーター及びターミネーターを好ましく使用できるが、ｒｒｎプロモーター及びｐｓｂＡターミネーターが特に好適である。ａａｄＡプロモーター／ａａｄＡ／ａａｄＡターミネーターをａａｄＡカセットということもある。
【００４１】
遺伝子組換え体を識別するためのａａｄＡカセットは、ｒｂｃＬ遺伝子とリボゾーム結合部位の上流にあるプロモーターとの間に配することが好ましい。
【００４２】
本発明のベクターに使用される発現カッセトは、５'側からｒｂｃＬ遺伝子、ａａｄＡカセット、プロモーター、リボソーム結合部位、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメント、ターミネーター及びａｃｃＤ遺伝子の順序に構築されることが好ましい。各ＤＮＡ間は連続していてもよく、あるいは各ＤＮＡの間に例えばイントロン配列等が挿入されていてもよい。
【００４３】
本発明における遺伝子組換えベクターは、例えば以下の工程により作製することができる。
【００４４】
まず、ｐＬＤ６ベクターを作製する工程である。かかるベクターは、実施例の〔工程１〕に記載の方法で容易に作製することができる。ｐＬＤ６の全塩基配列を配列番号１０に示す。ｐＬＤ６のＮｏｔＩとＳａｌＩの切断部位に構築遺伝子群を挿入する。構築遺伝子群は、（ａ）配列番号１１で表される塩基配列からなるマルチクローニング領域（配列番号１０中の３６９８−３７４８に位置する）と、その上流に配列番号７で表されるタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーター（配列番号１０中の３５６９−３７０１に位置する）と、マルチクローニング領域の下流に配列番号８で表されるタバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーター（配列番号１０中の３７５５−３９１３に位置する）とからなる群と、その群の上流に（ｂ）遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としての配列番号９で表されるスペクチノマイシン耐性遺伝子であるａａｄＡ遺伝子（配列番号１０中の２３６９−３１７３に位置する）と、ａａｄＡ遺伝子の上流に配列番号１２で表されるタバコ葉緑体由来のｒｒｎプロモーター（配列番号１０中の２２２７−２３６８に位置する）と、ａａｄＡ遺伝子の下流に配列番号１３で表されるタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡターミネーター（配列番号１０中の３１７５−３５６４に位置する）とを有している。上記マルチクローニング領域の制限酵素認識部位（ＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩ、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ）に、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挿入する。より具体的には、ｐＬＤ６ベクターのマルチクローニング領域のＳｐｈＩとＥｃｏＲＩの切断部位に、例えば配列番号２で示されるホウレンソウ由来のＳＢＰａｓｅをコードする遺伝子又は配列番号４で示されるホウレンソウ由来のＦＢＰａｓｅをコードする遺伝子、あるいはラン藻由来の配列番号６で示されるＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅをコードする遺伝子等を挿入する。この場合、配列番号の第１３〜１７位の塩基配列（５’−ａｇｇａｇ−３’）がＳＤ配列に相当し、リボソーム結合部位として働く。以下、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挿入された構築遺伝子群をＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子群と称し、該遺伝子群が挿入されたｐＬＤ６ベクターをｐＬＤ６−ＦＢＰ／ＳＢＰと称する。
【００４５】
次いで、ｐＬＤ６−ＦＢＰ／ＳＢＰを適当な宿主細胞に導入し、かかる宿主細胞を培養して、ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子群をクローニングする。
【００４６】
宿主細胞は、自体公知の宿主細胞から適宜選択でき、具体的には、例えばエシェリヒア属菌やバチルス属菌などの原核生物、酵母や糸状菌などの真核生物、植物細胞又は動物細胞等が挙げられる。また、宿主細胞の培養条件は、宿主細胞の種類に応じて当業界で通常行われている条件に従えば良い。また、クローニングされた遺伝子にＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がうまく導入されたか否かは、ｐＬＤ６−ＦＢＰ／ＳＢＰが有する選択マーカー等に基づき容易に判別することができる。
【００４７】
次いで、ｐＬＤ２００ベクターを作製する工程である。かかるベクターは、実施例の〔工程２〕に記載の方法で容易に作製することができる。先の工程のｐＬＤ６−ＦＢＰ／ＳＢＰを用いてクローニングされた遺伝子組換え体から、ＮｏｔＩ及びＳａｌＩを用いてＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子群を切り出し、切り出した該遺伝子群をｐＬＤ２００のポリリンカーのＮｏｔＩとＳａｌＩの切断部位に挿入する。ｐＬＤ２００の全塩基配列を配列番号１４に記載する。上記ポリリンカーは配列番号１７で表される塩基配列（配列番号１４の２１２５−２１４５に位置する）を有し、複数の制限酵素部位（ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ及びＳａｌＩ）を有する。ｐＬＤ２００ベクターは、ポリリンカーとその上流に配列番号１５で表される塩基配列からなるタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子（配列番号１４の４２３−１８５６に位置する。）と、その下流に配列番号１６で表される塩基配列からなるタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子（配列番号１４の２６２４−３３２８に位置する。）からなる発現カセットを有することを特徴とするベクターである。このようにしてＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子群が挿入されたｐＬＤ２００ベクターをｐＬＤ２００−ＦＢＰ／ＳＢＰと称する。
【００４８】
上記ベクターは、自体公知のクローニングベクターに、複数の制限酵素部位を有するポリリンカー（好ましくは配列番号１７で表される塩基配列の遺伝子）と、ポリリンカーの上流にタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子と、ポリリンカーの下流にタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子とを挿入することにより得ることもできる。
【００４９】
このようにして作製された上記ｐＬＤ２００−ＦＢＰ／ＳＢＰを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する。このとき、宿主細胞としては、植物細胞が好ましく、葉緑体がより好ましく、タバコ葉緑体がさらに好ましい。このように、植物細胞、特に葉緑体を宿主細胞として用いることにより、導入した遺伝子がコードするタンパク質を高発現させることができ、さらに導入した遺伝子の花粉を介した環境への飛散を防ぐことができる等の利点がある。
【００５０】
ｐＬＤ２００−ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを宿主細胞、特に葉緑体へ導入して形質転換する方法としては、公知の方法を用いてよい。そのような方法としては、例えば、該発現ベクターを金又はタングステンの極めて細かい粒子にまぶし、この発現ベクターが付着した粒子を火薬又は高圧ガスで宿主細胞に打ち込み、該発現ベクターを導入するというパーティクルガン法などが挙げられる。中でも、高等植物の葉緑体への遺伝子導入系は、パーティクルガンによる手法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，及びＭａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，第８７巻，ｐ．８５２６−８５３０）または、ＰＥＧによる手法（Ｇｏｌｄｓ，Ｔ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，及びＫｏｏｐ，Ｈ．−Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３年，第１１巻，ｐ．９５−９７）を用いるのが好ましい。
【００５１】
本発明に係る上記形質転換葉緑体を有する植物は、自体公知の方法によって得ることができる。ここで、上記植物は特に限定されないが、高等植物が好ましく、葉緑体形質転換系が確立されている植物がより好ましく、例えば、タバコ、イネ、ジャガイモ、ナタネ及びレタスが挙げられ、タバコが特に好ましい。タバコとしては、ニコチアナ・アキュミネート（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、ニコチアナ・アラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ）、ニコチアナ・アテヌエイタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）、ニコチアナ・クレベランディ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ）、ニコチアナ・エクセルシオール（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ）、ニコチアナ・フォルゲティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ）、ニコチアナ・ゴッセイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｏｓｓｅｉ）、ニコチアナ・グラウカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌａｕｃａ）、ニコチアナ・グルティノサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、ニコチアナ・ラングスドルフィー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ）、ニコチアナ・ロンギフローラ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ）、ニコチアナ・オブツシホリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）、ニコチアナ・パニュキュレータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ニコチアナ・プルムバギホリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｆｏｌｉａ）、ニコチアナ・クアドリバリビス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ）、ニコチアナ・レパンダ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｅｐａｎｄａ）、ニコチアナ・ルスチカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｒｕｓｔｉｃａ）、ニコチアナ・サンデラエ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓａｎｄｅｒａｅ）、ニコチアナ・スーベオレンス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・トメントサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）などが挙げられる。中でも、ニコチアナ・ルスチカ及びニコチアナ・タバカムが好ましい。特にニコチアナ・タバカムが好適であり、ニコチアナ・タバカムのうちの「バーレー種」、「黄色種（バージニア種）」、「在来種」及び「オリエント種」がとりわけ好ましい。
【００５２】
上記植物はその植物に応じた自体公知の条件で生育させことができる。
【００５３】
なお、上記の遺伝子工学又は生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）等に記載された方法に従って容易に行うことができる。
【００５４】
本発明に係るタバコ葉緑体ゲノム中への遺伝子導入用ベクターの構築の過程で利用したベクターのｐＬＤ６及びｐＬＤ２００については、特願２００１−０８３５６９で公開されている。
【００５５】
以下に具体的実施例を挙げ、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限定されることはない。
【００５６】
なお、実施例で使用する各略号の意味は、次のとおりである。
Ｓ．７９４２：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ＰＣＣ ７９４２
ＬＢ培地：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム
【実施例】
【００５７】
遺伝子組み換え体の作製
〔工程１〕ｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの作製
配列表の配列番号２で表されるＳ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ遺伝子（ｆｂｐ／ｓｂｐ）をタバコ葉緑体において高発現が期待できるｐｓｂＡプロモーター（ＰｐｓｂＡ）をもつベクターｐＬＤ６の制限酵素ＳｐｈＩとＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、ｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを作製した。この、ｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを常法に従い大腸菌に導入した。この大腸菌を、スペクチノマイシンを添加したＬＢ培地で３７℃下、１６時間培養し、かかる遺伝子が導入された大腸菌を選択した。選択された大腸菌を同様の条件で培養し、その後遠心分離により集菌し、常法に従いｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ（プラスミドＤＮＡ）を精製した。なお、ＬＢ培地１Ｌ中の組成は、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、及び５ｇＮａＣｌである。
【００５８】
〔工程２〕ｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの作製］
工程１で精製したｐＬＤ６−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを制限酵素ＮｏｔＩ及びＳａｌＩで処理した後、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを含む断片をＮｏｔＩ上流とＳａｌＩ下流にタバコ葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子の一部とａｃｃＤ遺伝子の一部を含む葉緑体形質転換用ベクターｐＬＤ２００のＮｏｔＩとＳａｌＩ部位の間に挿入し、ｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを作製した。この、ｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを常法に従い大腸菌に導入した。この大腸菌を、スペクチノマイシンを添加したＬＢ培地で３７℃下、１６時間培養し、かかる遺伝子が導入された大腸菌を選択した。選択された大腸菌を同様の条件で培養し、その後遠心分離により集菌し、常法に従いｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ（プラスミドＤＮＡ）を精製した（図１）。
【００５９】
〔工程３〕葉緑体形質転換体の作製
精製したｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅをパーティクルガンによりタバコ葉緑体に導入し、葉緑体形質転換体を作製した。タバコ葉緑体形質転換は、既知の方法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．ａｎｄ ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，８５２６−８５３０（１９９０））に従い実施した。
【００６０】
スペクチノマイシン添加培地上での再分化後、ＰＣＲにより葉緑体ゲノム中にＳ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの導入された形質転換体（ｐＴｐｓｂＡＦＳ）６系統を得ることが出来た。自家交配により作出したＴ１世代においても遺伝子の脱落は認めらなかった（図２）。抗Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ抗体を用い、ウエスタンブロッティンクを行った結果、形質転換植物（ｐＴｐｓｂＡＦＳ）においてのみ、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅの分子質量に一致する約４０ｋＤａの位置にシグナルが認められ、ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅが高発現していることが明らかになった（図３）。
【００６１】
播種１０週及び１８週後の植物を用い、ＦＢＰａｓｅ活性の測定を行った。野生株に比べ、形質転換植物では約１０−４０倍高いＦＢＰａｓｅ活性を有していた（図４）。
【００６２】
播種１２週後のＴ１世代を用い、ＣＯ２濃度３６０ｐｐｍ条件下における光強度変化による光合成活性を測定した。その結果を図５に示す。形質転換体（ｐＴｐｓｂＡＦＳ−３及びｐＴｐｓｂＡＦＳ−９）及び野生株（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）は、光強度約５００mｍｏｌ／ｍ２／ｓで光合成速度がマキシマムとなり、以後その速度を維持した。マキシマムにおける形質転換体の光合成速度は、野生株の約２倍であった。
【００６３】
比較として、特開２０００−２５３７６８号公報に記載の方法により、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを連結したプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に導入し、タバコのリーフディスクに感染させた形質転換体（ＴｐＦＳ−３及びＴＰＦＳ−６）を作製した。ＴｐＦＳ−３及びＴＰＦＳ−６は、野生株に比較し、マキシマムにおける光合成速度は約１．２〜１．３倍程度で、ｐＴｐｓｂＡＦＳ−３及びｐＴｐｓｂＡＦＳ−９の光合成速度より、非常に低かった。このことは、本発明の形質転換体は、野生株及び従来法による形質転換植物に比較して、光合成活性が非常に亢進していることを示すものである。
【００６４】
また、ｐＴｐｓｂＡＦＳ−３及びｐＴｐｓｂＡＦＳ−９は、光強度約２００mｍｏｌ／ｍ２／ｓで、野生株のマキシマムと、３００mｍｏｌ／ｍ２／ｓで、ＴｐＦＳ−３及びＴＰＦＳ−６のマキシマムと同程度の光合成速度を示した。このことは、本発明の形質転換植物は、光強度が低い場合でも、充分な光合成活性を有することを示すものである。
【００６５】
播種１８週後の形質転換体の生育を野生株と比較したところ、野生株に比べ形質転換植物では明らかに生育が促進されており、最終的な生育は野生株の１．２〜１．３倍に達した（図６及び７）。また、形質転換体では野生株に比べ茎が太くなっており、根も著しく発達していた（図８）。さらに、生育１８週後の形質転換体は、野生株の約１．５倍の大きさに成長していた。
【００６６】
このように、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅ遺伝子をタバコ葉緑体ゲノムに導入することで、タバコの葉の光合成能を向上させることができた。さらにそのことにより、生育を促進させ、収穫量を増やすことが可能となった。
【００６７】
タバコ以外の植物種については、前記プラスミドｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰをパーティクルガンによりその葉緑体に導入し、スペクチノマイシン添加培地上で耐性細胞を選択することにより、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子が導入され、発現する植物細胞を得ることができる。
【００６８】
例えば、ナタネの子葉、ジャガイモの葉片、レタスの葉片、イネの葉片または胚性幹細胞等にパーティクルガンにより前記プラスミドを打ち込み、適当な濃度のスペクチノマイシン添加培地上で耐性細胞を選択することにより形質転換植物細胞を得ることができる。Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させて得られた細胞を、適当な条件で再分化させることにより、生育を促進する、向上した光合成能を有する植物体を得ることができる。ナタネに対する形質転換の条件は、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１） ｐ１１１−１１４（２００３）に、ジャガイモに対する形質転換の条件は、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １９（２） ｐ．２０９−２１６（１９９９）に、イネに対する形質転換の条件は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７（９） ｐ．９１０−９１５（１９９９）に、レタスに対する形質転換の条件は、Ｓｙｍｐｏｄｉｕｍ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １Ｄａ−１０， ２００４に記載されている。
【００６９】
その他の植物種についても同様に、パーティクルガンを用いて葉片または胚性幹細胞等に前記ｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を撃ち込み、スペクチノマイシン添加培地上で耐性株を選択し、再分化させることにより、形質転換植物体を得ることができる。スペクチノマイシンを用いての選択条件は、種々の濃度のスペクチノマイシンを添加した培地での増殖、再分化を観察することで容易に決定することができる。通常は野生型株が増殖できない濃度であって、できる限り低濃度を選択するのが好ましい。カルスから植物体への再分化条件は、通常の手法を用いて決定することができる。この選択は、例えば、オーキシンあるいはサイトカイニンの濃度を段階的に変えたマトリックスの培地を用いて行われて、再分化の最適条件が決められる。必要に応じて、ジベレリンやアミノ酸を添加する場合もある。現在では、多くの植物種でカルスから植物への再分化条件が決定されている。これらの植物に上に述べた葉緑体形質転換の手法を適用することにより、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させた植物体を得ることができ、このものは生育を促進する光合成能が向上している。これまで再分化条件が確立していない植物種について再分化が将来可能になれば、本発明のベクターをそのような植物に適用して、Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させて、光合成能の向上により生育が促進された植物体を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の遺伝子組み換え体を用いて形質転換された植物は、光合成活性が高く、早生あるいは高収量の作物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は発現ベクターｐＬＤ２００−Ｓ．７９４２ＦＢＰ／ＳＢＰａｓｅを示す図である。
【図２】図２はＰＣＲによる遺伝子導入の確認を示す図である。図中、Ｗは野生株を示す。
【図３】図３は播種後１０週目の植物における導入遺伝子及び発現タンパク質の確認を示す図である。図中、Ｗは野生株を示す。
【図４】図４は播種後１０週及び１８週目における上葉及び下葉におけるＦＢＰａｓｅ活性の比較を示す図である。図中、縦軸はＦＢＰａｓｅ活性を示す。
【図５】図５は播種後１０週目の光合成活性を示す図である。
【図６】図６は生育速度を示す図である。図中、縦軸は植物の高さ（ｃｍ）を示す。
【図７】図７は播種後１８週目の植物を示す図である。
【図８】図８は播種後１８週目の植物における茎及び根を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子の間に、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを含んだ光合成活性を高める発現カセットを有する遺伝子組み換えベクター。
【請求項２】
ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかのタンパク質である請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号３において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号４において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
ＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号５において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
ＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号６において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項８】
発現カセットが、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
発現カセットが、リボゾーム結合部位の上流にプロモーター、及びＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの下流にターミネーターを有することを特徴とする請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
プロモーター及びターミネーターが、それぞれタバコ葉緑体由来のプロモーター及びターミネーターであることを特徴とする請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
ルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子がそれぞれタバコ由来の遺伝子である請求項１〜１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
タバコ由来のルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子の間に、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを有し、上記ＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有し、さらに、ルビスコ大サブユニット遺伝子とリボゾーム結合部位の間にタバコ由来のプロモーターを有し、そして上記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子と上記ＤＮＡフラグメントの間にタバコ由来のターミネーターを有する発現カセットを有する遺伝子組み換えベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のベクターを葉緑体に導入した形質転換葉緑体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換葉緑体を有する植物。
【請求項１５】
植物がタバコである請求項１４に記載の植物。
【請求項１６】
葉緑体形質転換の手法を用いて、高等植物の葉緑体ゲノムにＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させることにより、ＦＢＰａｓｅ活性を元の植物の２倍以上に高めた植物。
【請求項１】
ルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子の間に、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを含んだ光合成活性を高める発現カセットを有する遺伝子組み換えベクター。
【請求項２】
ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号１において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
ＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかのタンパク質である請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号３において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
ＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号４において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
ＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質が、次のいずれかである請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号５において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
ＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項１に記載のベクター；
（ａ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号６において、１又は数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｄ）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有し、かつＦＢＰａｓｅ活性及びＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項８】
発現カセットが、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
発現カセットが、リボゾーム結合部位の上流にプロモーター、及びＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの下流にターミネーターを有することを特徴とする請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
プロモーター及びターミネーターが、それぞれタバコ葉緑体由来のプロモーター及びターミネーターであることを特徴とする請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
ルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子がそれぞれタバコ由来の遺伝子である請求項１〜１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
タバコ由来のルビスコ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子の間に、ＦＢＰａｓｅ活性及び／又はＳＢＰａｓｅ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを有し、上記ＤＮＡフラグメントの翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有し、さらに、ルビスコ大サブユニット遺伝子とリボゾーム結合部位の間にタバコ由来のプロモーターを有し、そして上記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニット遺伝子と上記ＤＮＡフラグメントの間にタバコ由来のターミネーターを有する発現カセットを有する遺伝子組み換えベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のベクターを葉緑体に導入した形質転換葉緑体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換葉緑体を有する植物。
【請求項１５】
植物がタバコである請求項１４に記載の植物。
【請求項１６】
葉緑体形質転換の手法を用いて、高等植物の葉緑体ゲノムにＦＢＰ／ＳＢＰ遺伝子を導入、発現させることにより、ＦＢＰａｓｅ活性を元の植物の２倍以上に高めた植物。
【図５】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５２５９７４（Ｐ２００７−５２５９７４Ａ）
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２７１８３（Ｐ２００６−５２７１８３）
【出願日】平成１７年３月２日（２００５．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００４０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８５４５４
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２日（２００５．３．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００４０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８５４５４
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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