薬剤として有用なペグ化可溶性ｇｐ１３０二量体
2つの可溶性gp130分子を含むポリペプチド二量体であって、該可溶性gp130分子の少なくとも一方がポリエチレングリコールに共有結合している、ポリペプチド二量体を開示する。さらにまた、該二量体を含む医薬組成物およびさまざまな医学的用途を記載する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、2つの可溶性gp130分子を含むポリペプチド二量体であって、該可溶性gp130分子の少なくとも一方がポリエチレングリコールに共有結合している二量体に関する。また、本発明は、該二量体を含む医薬組成物およびさまざまな医学的用途に関する。
【０００２】
多機能性のサイトカインであるインターロイキン-6（IL-6）は、とりわけ肝臓におけるB細胞の刺激および急性期タンパク質合成の誘導がもっとも顕著である、広い範囲の生物学的機能を示す。IL-6は、IL-6特異的な表面レセプター（「IL-6R」または「gp80」）への結合を介して標的細胞に対しその活性を及ぼす。このレセプター／リガンド複合体は、IL-6レセプター複合体の2番目のサブユニットであるgp130のホモ二量体化を促進する。gp130の二量体化は、IL-6シグナルの伝達をもたらす。2種類のメカニズム（選択的スプライシングおよび分断（shedding））によって生成される可溶性型のIL-6R（sIL-6R）も、IL-6と複合体を形成すると、gp130の二量体化およびシグナル伝達を開始させることができる。
【０００３】
IL-6Rの細胞質部位はシグナル伝達に寄与しないため、gp130のホモ二量体によるシグナル伝達は、膜結合型または可溶型のIL-6Rと複合体になったIL-6によって誘導することができる。しかしながら、ヒト肝癌細胞HepG2について既述されているように、sIL-6Rが存在することによって、IL-6応答細胞のリガンドに対する感作がもたらされる。さらに、培養培地に存在するsIL-6Rを絶えず取り除けば、厳密にIL-6依存型ハイブリドーマ細胞が、非常に低量のIL-6に反応して増殖することはないことが分かっている。
【０００４】
gp130は、当初、インターロイキン-6のシグナル伝達因子として説明されていたが、IL-6、IL-11、白血病抑制因子（LIF）、オンコスタチンM（OSM）、および毛様体神経栄養因子（CNTF）など、さまざまなサイトカインに共通するシグナル伝達因子の鎖である。これらのサイトカインはすべて、gp130のホモ二量体化（IL-6に対して）、または、LIF-Rb／gp130タンパク質とのヘテロ二量体化（IL-11、LIF、OSMおよびCNTFに対して）によってシグナル伝達が開始される、2部または3部からなるレセプター複合体を介して作用する。したがって、これらのサイトカインは、さまざまな組織において同じような生物学的活性を媒介する。
【０００５】
gp130は、ほとんどすべての細胞型で見ることができるが、IL-6Rは、それよりもずっと制限された発現を示す。1つの細胞型からsIL-6Rが放出されると、IL-6に反応するgp130を発現するだけの別の細胞が生じる。このシナリオはトランス・シグナル伝達と呼ばれる。実際、sIL-6RとIL-6の複合体を必要とするが、IL-6単独では見られない細胞活性がいくつか記述されている。可溶性gp130タンパク質は、ヒト血漿の中に高濃度で見られる。最近、デザイナーサイトカインであるハイパーLL-6（H-IL-6）について説明されているが、そこでは、sIL-6RのC-末端が、フレキシブルなペプチドリンカーによって成熟IL-6のN-末端に共有的に融合している。IL-6／sIL-6Rの複合体で見られるように、H-IL-6も、gp130を発現するだけの細胞に作用する。別個の成分としてのIL-6およびsIL-6Rとは対照的に、この融合分子では濃度が100倍から1000倍低くても同等の生物学的シグナルを誘導するのに十分である。
【０００６】
クローン病などさまざまな病気を治療するためには、可溶性IL-6Rに依存したIL-6反応の特異的ブロッキングが治療にとって望ましいかもしれない。残念ながら、この目的のために今のところ利用できる化合物は、低産生率、高クリアランス率、低半減期など、不利な特徴をいくつか有する。
【０００７】
このように、本発明の基礎にある技術的課題は、sIL-6Rに依存したIL-6反応の特異的ブロッキングが、先行技術の方法がもつ不利益を克服して有益な効果をもつ病気の治療に適した方法を提供することであった。
【０００８】
この技術的課題の解決は、請求項にその特徴が記載されている態様を提供することによってもたらされる。本発明に至る実験の過程で、ペグ化(PEGylated)可溶性gp130二量体が、クローン病（CD）患者のLPMCに由来するsIL-6Rの抗アポトーシス作用を効率的に阻害し、そのため該化合物が、該疾患およびその関連疾患、例えば、大腸炎または慢性関節リウマチなどを治療する上で有用なことが発見された。クローン病は、頻繁に急性炎症の再発が起きるという特徴をもつ、胃腸管の慢性炎症性疾患である。感染症、傷害、およびその他の要因に伴う炎症は、急性期タンパク質（APP）が産生されるという特徴をもつ急性期反応（APR）を速やかに誘導する。APRは、主に血管透過および体熱の上昇をもたらす。APPは、それらの発現および活性化を調節するサイトカインによって、2つの異なるグループに分けることができる。IL-6ファミリーのサイトカインは、STAT3の活性化によってもたらされるII型APP遺伝子の発現を上方制御する。また、IL-6は、I型APPのレベルの上昇にも寄与するが、これは、主に、IL-1によって調節されている。IBD患者の結腸組織における強力なSTAT3活性化（すなわち、チロシンリン酸化）については既に記載されている。さらに、IL-6 KOマウスではSTAT3活性化が顕著に低下するが、それには、これらマウスにおける実験的大腸炎の発症の低下が伴った（Suzukiら, J Exp Med, 2001, 193:471）。これらの知見は、IL-6／IL-6Rの介在によるSTAT3活性化が、大腸炎の発生および持続において中心的な役割を果たすことを示すものである。別の炎症性疾患である慢性関節リウマチ（RA）では、STAT3がRA滑膜線維芽細胞の生存にとって重要であることが分かった（Krauseら, J Immunol, 2002, 169:6610）。このように、STAT3が遺伝子治療の優れた標的となりうることが示唆された。恒常的なSTAT3の活性化も「発癌性」因子であることが知られており、例えば、Bcl-2またはBcl-XLなどの抗アポトーシス蛋白質の上方制御を伴う（Turksonら, Oncogene, 2000, 19;6613）。ペグ化可溶性gp130二量体がSTAT3の活性を顕著に低下させることが発見された。さらに、IL-6／IL-6R／gp130によるシグナル伝達経路および疾患パラメーターの低下において、sgp130PEGの効率は、EP 00 108 691.7のsgp130Fcの効率よりも顕著に高いことが発見された。さらに、sgp130PEGの半減期は、sgp130Fc分子の半減期の約2倍長い。これから先、低用量のsgp130PEGが、sgp130Fcによるのと同じ結果を得るために治療法において使用されるかもしれない。そうなれば、sgp130PEGのこのような結果は、弱い副作用、患者への曝露の低減、使用頻度の減少、および治療費の削減を意味する。
【０００９】
このように、本発明は、2つの可溶性gp130分子を含むポリペプチド二量体であって、該可溶性gp130分子の少なくとも一方が、好ましくは、その両方がポリエチレングリコールに共有結合しているポリペプチド二量体に関する。
【００１０】
本発明に係るポリペプチド二量体は、公知の方法を用いて改造することができる。本明細書において用いられる「可溶性」という用語は、細胞内ドメイン、および、好ましくは、膜貫通領域を持たないgp130分子を意味する。利用されるドメインは、gp130の細胞外ドメインD1〜D3からなるか、またはその変異体または断片であって、アゴニスト複合体であるIL-6／sIL-6Rの活性を阻害する能力を維持している部分からなっていてもよい。sgp130分子のペグ化は、例えば、ヒトのIFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-15またはIL-2について記載されている方法（Tangら, Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao （Shanghai）, （1996）, 28:312; Youngsterら, Curr Pharm Des （2002）, 8:2139; Graceら, J Interferon Cytokine Res （2001）, 21:1103; Pepinskyら, J Pharmacol Exp Ther （2001）, 297:1059; Pettitら, J Biol Chem （1997）, 272:2312; Goodsonら, Biotechnology NY （1990）, 8:343; Katre; J Immunol （1990）, 144:209）に従って行うことができる。好ましくは、gp130の可溶性部分に相当するポリペプチドが、本発明に係るポリペプチド二量体の唯一の生物学的活性ポリペプチドであり、それは、Fc-ドメインおよび／またはフィブロネクチン（FN）IIIのような更なるポリペプチド部分を含まない。
【００１１】
好適な態様において、本発明に係るポリペプチド二量体は、その2つの可溶性gp130分子の少なくとも一方が、図2または3に示したアミノ酸配列を含むという特徴をもつ。
【００１２】
より好適な態様において、本発明に係るポリペプチド二量体は、その2つの可溶性gp130分子の両方が、図2または3に示したアミノ酸配列を含むという特徴をもつ。
【００１３】
PEG-ポリペプチド-二量体が、例えば、実施例1に記載されている方法など、当技術分野において公知の方法によって測定することができる、sIL-6Rに依存するIL-6応答を阻害できるのであれば、あらゆる種類のポリエチレングリコールが本発明に適している。好ましくは、本発明に係るポリペプチド-二量体のポリエチレングリコールは、PEG 1000、2000、3000、5000、10000、15000、20000または40000であって、PEG 20000または40000が特に好ましい。
【００１４】
二量体を形成するためには、2つの可溶性gp130分子を、1個以上のジスルフィド架橋によって互いに結合させる。これは、例えば、組換え発現によって行うことができるが、ここで、sgp130をコードする核酸配列は、終止コドンとsgp130のC末端にあるアミノ酸残基をコードするコドンとの間に1つ以上のシステイン残基をコードするコドンを含む。あるいは、二量体を生成させるためには、好ましくは、単量体をタンデムに融合させた（テール対テール型の：tail-to-tail）フレキシブルなリンカーのドメインを用いることができる。このリンカーは、完全に人工的なもの（例えば、一定の間隔でセリン、アラニンおよび／またはスレオニンによって中断されるポリグリシンの反復配列）でもよいし、または、ヒトIgGのヒンジ領域など、天然のタンパク質から「借用」したものでもよい。さらに、二量体の分子は、例えばHis-His-His-His-His-His（His6）、FLAG、Strep-Tag、緑色蛍光タンパク質（GFP）、c-myc、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、HA、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、または抗体を利用することができるその他のエピトープによって標識して、適当なクロマトグラフィー装置による迅速な精製、例えばウエスタンブロッティングまたはELISAによる検出、免疫沈殿、またはバイオアッセイ法における活性の枯渇／遮断を行うことができる。
【００１５】
更なる別の態様において、2つの可溶性gp130分子は、少なくとも一方のPEGおよび2つの反応基を正確な距離を置いて含む「分岐(forked)型」のPEGを介して互いに結合している。
【００１６】
所望の性質を有するsgp130の変異を発生および同定するためにさまざまな手段を用いることができる。標準的な方法による、sgp130をコードするDNAのランダムな変異誘発を用いた後、生成物の集合体を解析して、所望の性質を有する変異型サイトカインを同定することができる。遺伝子工学による変異誘発が、組換えタンパク質の機能的ドメインの構造機構を解明するために広範に用いられてきた。欠失または置換による変異誘発を実施するための異なった方法がいくつか文献に記載されている。もっとも成功したのは、アラニンスキャニング変異誘発法（Cunningham and Wells, Science 244 （1989）, 1081-1085）およびホモログスキャニング変異誘発法（Cunninghamら, Science 243 （1989）, 1330-1336）と考えられる。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および、好ましくは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターであるベクターを用いることによって、好ましくは組換え法によって製造される。本発明に係るポリペプチドを製造するために、ポリペプチドを、既存のクローン、すなわち、好ましくは、天然のポリペプチドまたはその一部をコードするものから得る。天然型のDNAまたはRNAの相補鎖に、高厳密度条件または中厳密度条件（定義については、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory （1989） N.Y.参照）の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドも、このポリヌクレオチドが天然型配列の生物学的活性を維持している限り、本発明に係るポリペプチドを製造するために役立つ。
【００１８】
組換えベクターは、当業者に周知された方法に従って構築することができる。例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory （1989） N.Y.参照。さまざまな発現ベクター／宿主系を利用して、本発明に係るsgp130ポリペプチドをコードする配列を含み、発現させることができる。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；ウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウイルス）；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスのCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または動物細胞系などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
「制御エレメント」または「調節領域」とは、ベクターの非翻訳領域、すなわち、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実行するエンハンサー、プロモーター、5'側および3'側の非翻訳領域などである。このようなエレメントの長さや特異性はさまざまであろう。ベクター系および利用される宿主に応じて、構成的プロモーターおよび誘導的プロモーターなど、適当な転写および翻訳のエレメントを任意の数使用することができる。例えば、細菌系でクローニングする場合、Bluescript.RTMファージミド（Stratagene, LaJolla, Calif.）のハイブリッドlacZプロモーターまたはpSport1.TMプラスミド（Gibco BRL）などを用いることができる。バキュロウイルスのポリへドリンプロモーターを昆虫細胞で用いることもできる。植物細胞のゲノム由来のプロモーターもしくはエンハンサー（例えばヒートショック、RUBISCO、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルス由来のプロモーターもしくはエンハンサー（例えばウイルスプロモーターまたはリーダー配列）をベクターにクローニングすることも可能である。哺乳動物細胞系では、哺乳動物の遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが好ましい。spg130ポリペプチドをコードする配列のコピーを多数含む細胞株を作成する必要がある場合には、SV40またはEBVに基づくベクターを、適当な選択マーカーとともに用いることができる。
【００２０】
細菌系では、本発明に係るポリペプチド二量体の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを選択することができる。本発明において使用するのに適したベクターは、細菌で発現させるためのpSKK発現ベクターなどであるが、これに限定されるものではない。
【００２１】
酵母であるサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、アルファ因子、アルコール酸化酵素、およびPGHなどの構成的または誘導的なプロモーターを含むベクターをいくつか使用することができる。概説については、Grantら, （1987） Methods Enzymol. 153:516-544。
【００２２】
植物の発現ベクターを用いる場合、本発明に係る抗体をコードする配列の発現を、多数のプロモーターのいずれによっても推進することができる。例えば、CaMVの35Sプロモーターおよび19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独で、またはTMV由来のオメガ・リーダー配列と併用して使用することができる（Takamatsu, N. （1987） EMBO J. 6:307-311）。あるいは、RUBISCOの小サブユニットまたはヒートショックのプロモーターなど、植物プロモーターを用いることもできる（Coruzzi, G.ら （1984） EMBO J. 3:1671-1680；Broglie, R.ら （1984） Science 224:838-843；およびWinter, J.ら （1991） Results Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これらのコンストラクトは、直接的なDNA形質転換法または病原体介在による形質転換法によって植物細胞の中に導入することができる。このような技術については、一般的に閲覧可能な数多くの概説書に記載がある（例えば、Hobbs, S. および Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology （1992） McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196）。
【００２３】
昆虫系を用いて、本発明に係るsgp130分子を発現させることも可能である。例えば、このような系の1つにおいて、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして用いて、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア属（Trichoplusia）の幼虫の中で発現させることができる。配列を、ポリへドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングして、ポリへドリンプロモーターの調節下に置くことができる。sgp130をコードする遺伝子の挿入に成功すると、ポリへドリン遺伝子が不活性になって、コートタンパク質を持たない組換えウイルスが産生される。そして、この組換えウイルスを用いて、例えば、APOPが発現されている可能性のあるS.フルギペルダ細胞またはトリコプルシア属の幼虫に感染させることができる。（Engelhard, E. K.ら （1994） Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227）。
【００２４】
哺乳動物の宿主細胞においては、多くのウイルスによる発現系を利用することが可能である。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、本発明に係るポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターと、3つの部分に分かれるリーダー配列とからなるアデノウイルスの転写／翻訳複合体にライゲーションすることができる。ウイルスゲノムのE1またはE3という非必須領域への挿入を利用して、感染宿主細胞において該抗体を発現できる生存ウイルスを得ることができる（Logan, J. and Shenk, T. （1984） Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を増加させることができる。
【００２５】
プラスミドに含有させて発現させることができないような大きなDNA断片を送達するために、ヒト人工染色体（HAC）を用いることも可能である。6から10MのHACを構築して、治療のための通常の送達法（リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、またはベシクル）によって送達する。
【００２６】
特異的な開始シグナルを用いて、より効率的な翻訳を行うことも可能である。そのようなシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。sgp130、その開始コドン、および上流配列をコードする配列を適当な発現ベクターに挿入する場合には、余計な転写または翻訳の調節シグナルを必要としないであろう。しかし、コード配列のみを挿入する場合には、ATG開始コドンなどの外来の翻訳調節シグナルを提供する必要がある。さらに、開始コドンを正しいリーディングフレームに入れて、挿入配列全部が確実に翻訳されるようにしなければならない。外来の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然のものでも、合成されたものでも、さまざまな由来のものでよい。発現の効率は、文献に記載されているような、利用される具体的な細胞系に適したエンハンサーを含ませることによって増進させることができる（Scharf, D.ら （1994） Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）。
【００２７】
さらに、挿入された配列の発現を調節できるか、または、発現されたポリペプチド鎖を所望の形式に処理できるかについて、宿主細胞系統を選択することができる。「プレプロ」型のポリペプチドを切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、折りたたみ、および／または機能を促進することも可能である。翻訳後活性について特異的な細胞装置および特徴的な機構を有するさまざまな宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびW138）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC：Bethesda, Md.）から入手することができ、外来ポリペプチド鎖の正確な修飾およびプロセッシングを保証するために選択することができる。
【００２８】
長期間、高收率で組換えポリペプチド生産を行うためには、安定した発現が好ましい。例えば、sgp130鎖を安定して発現する細胞株を、ウイルス由来の複製点および／または内在性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を同一または別々のベクター上に含むことができる発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターを導入した後、強化培地の中で1〜2日間増殖させてから、選択培地に交換する。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することにあり、それが存在すると、導入された配列の発現に成功した細胞の増殖と回収が可能になる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００２９】
組換えベクターを導入した後、宿主細胞を選択培地で増殖させることによって、ベクター含有細胞の増殖が選択される。形質転換された細胞株を回収するためにいくつの選択系を用いてもよい。これらには、それぞれtk-細胞またはaprt-細胞において用いることができる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler,M.ら （1977） Cell 11:223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy, I.ら （1980） Cell 22:817-23）等があるが、これらに限定されるものではない。また、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr（Wigler, M.ら （1980） Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70）、アミノグリコシド系ネオマイシンおよびG-418に対する耐性を付与するnpt（Colbere-Garapin, F.ら （1981） J. Mol. Biol. 150:1-14）、およびクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼのそれぞれに対する耐性を付与するalsまたはpat（Murry、前掲）など、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準として利用することもできる。さらに別の選択可能な遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、または、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにするhisD（Hartman, S.C. and R.C. Mulligan （1988） Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51）などが既に記載されている。最近では、アントシアニン、ベータ-グルクロニダーゼとその基質であるGUS、およびルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンなどのマーカーによって、可視的なマーカーが人気を博すようになっており、形質転換体を同定するためだけでなく、特異的なベクター系に起因させることができる一過的または安定的なタンパク質発現の量を定量するために広く使用されている（Rhodes, C.A.ら （1995） Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【００３０】
組換えポリペプチドの精製は、この目的にとって公知の方法のいずれか、すなわち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを含む従来からの処理法によって実施される。利用可能なさらなる精製処理法は、標的ポリペプチドに結合し、カラム内に含まれるゲル基質上に産生および固定されるモノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーである。組換えポリペプチドを含む不純な調製物をカラムに通過させる。不純物がカラムを通過する間に、特異的抗体によってポリペプチドがカラムに結合する。洗浄後、pHまたはイオン強度を変化させてゲルからポリペプチドを溶出してから、それが単量体で産生された場合には、二量体化およびペグ化する。
【００３１】
したがって、本発明はまた、本発明に係るポリペプチド二量体を製造する方法であって、該ポリペプチドの単量体をコードするDNA配列によって形質転換された宿主細胞を培養すること、該宿主細胞または培養液からポリペプチドの単量体または二量体を回収すること、および単量体または二量体をペグ化することを含む方法に関する。
【００３２】
本発明に係るポリペプチド二量体は、アゴニスト複合体IL-6／sIL-6Rの活性を阻害しなければならない病理すべての治療および／または予防に役立つ。例えば、本発明に係るポリペプチド二量体の治療上の用法には、以下のものを含む。
【００３３】
（a）IL-6は、自己分泌様またはパラクリン様のいずれかで作用して腫瘍形成を促進することによって、多発性骨髄腫に直接関係すると考えられている。さらに、IL-6レベルが上昇すると、骨再吸収、高カルシウム血症、および悪液質などの望ましくない副次的作用を生じる。これらの場合、sIL-6Rが、IL-6に対する標的細胞を感作することが知られている。したがって、本明細書に記載されている、本発明に係るポリペプチド二量体は、副次作用および腫瘍増殖の抑制の両方にとって有益であろう。
【００３４】
（b）自己免疫疾患において：自己免疫疾患におけるIL-6の病理的有意性が、文献において多くの著者によって概説されている（例えば、Yoshizakiら, Semin. Immunol. 4（3） （1992）, 155-166を参照）ため、IL-6シグナル伝達を阻害することが、自己免疫疾患の治療にとって有用であるかもしれない（Nishimotoら, Intern. Med. 38（2） （1999）, 178-182）。このような病理の例は、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、強皮症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性上皮炎、糖尿病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、糸球体腎炎、およびその他、乾癬およびクローン病などの炎症性疾患である。
【００３５】
（c）骨粗鬆症では、閉経後の女性における、または卵巣切除によるにエストロゲンレベルの低下によって悪化し得るが、IL-6が、骨再吸収をもたらす破骨細胞形成の中心的なメディエーターであると考えられている。重要なのは、IL-6は、エストロゲンが枯渇した状態で主要な役割を果たすと考えられているに過ぎず、正常な骨の維持については、明らかに最小限の関与しかない。このことと整合して、実験による証拠は、IL-6に対する機能阻害抗体が、破骨細胞の数を減少させうることを示している。エストロゲン補充療法も用いられるが、子宮内膜癌および乳癌のリスクが増加するなどの副作用があると考えられている。このように、本発明に係るポリペプチド二量体は、破骨細胞形成を正常なレベルに低下させるのにより特異的であると考えられる。
【００３６】
（d）IL-6は、おそらく、脂肪組織におけるリポタンパク質リパーゼ活性を低下させることによってAIDSおよび癌に随伴する悪液質をもたらす腫瘍壊死因子（TNF）のメディエーターである可能性がある。したがって、ここで、本発明に係るポリペプチド二量体は、そのような患者において悪液質を緩和または軽減するのに有用であると考えられる。
【００３７】
（e）細菌およびウイルスによる感染：カポジ肉腫（KS）病変部の91％以上にヒトヘルペスウイルス8型（HHV8）が存在することが明らかになっている。さらに、このウイルスは、原発性滲出液リンパ腫（PEL）において、また、多中心性キャッスルマン病（MCD）患者において確認されている。興味深いことに、多発性骨髄腫（MM）患者の骨髄樹状細胞は、HHV8に感染していることが明らかになった。それ以来、HHV8とMMの関連性が激しい論争の主題になっていたが、最近になって再燃した。HHV8のゲノムは、ヒトの抗アポトーシスタンパク質、ケモカイン、および、ヒトIL-6に25％相同性をもつインターロイキン-6（vIL-6）の活性型などのサイトカインに有意な相同性をもつタンパク質をいくつかコードしている。vIL-6は、ヒトIL-6によく似た生物学的活性を持つこと、すなわち、マウスハイブリドーマおよびヒト骨髄腫細胞の増殖を刺激することが明らかになっている。つい最近になって、vIL-6によって形質転換されたNIH3T3細胞を注射されたマウスにおいて、viL-6が血管形成と造血を誘導したことが明らかにされた。これらの機能を通して、vIL-6は、HHV8関連疾患の発病機序に重要な役割を果たすと結論された。vIL-6シグナル伝達へのIL-6Rの寄与については、論争となるほど検討されてきた。vIL-6によって形質転換されたCOS-7細胞の未精製上清を用いた群が、gp130を発現する細胞ではSTAT活性が誘導されるが、IL-6Rは誘導されないことを示している。これに対して、別の群は、vIL-6の活性が、IL-6レセプターアンタゴニストによって低下させられたことを発見して、IL-6RがvIL-6シグナル伝達に関与すると主張している。
【００３８】
このように、本発明は、好ましくは、医薬的に許容できる担体と一緒に、本発明に係るポリペプチド二量体を有効量含む医薬組成物にも関する。「医薬的に許容できる」は、有効成分の生物学的活性の有効性を阻害せず、それが投与される宿主に対して有毒でないあらゆる担体を含むことを意味する。適当な医薬用担体の例は当技術分野において周知されており、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョンなどの乳剤、さまざまなタイプの湿潤剤、滅菌溶液などである。常法によって、このような担体を調合し、有効用量を被験体に投与することができる。
【００３９】
「有効量」とは、病気の過程および重篤度に影響を与えて、その病理の軽減または緩和をもたらすのに十分な有効成分量を意味する。
【００４０】
これらの病気や疾患を治療および／または予防するのに有用な「有効用量」は、当業者に公知の方法を用いて決定することができる（例えば、Finglら, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman編, Macmillan Publising Co., New York, pp. 1-46（1975）を参照）。
【００４１】
適当な組成物の投与は、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、または皮内への投与など、さまざまな方法で行うことができる。もちろん、投与の経路は、治療の種類、および、医薬組成物の中に含まれる化合物の種類に依存する。投与量計画は、担当医および他の臨床的要因によって決められる。医学の技術分野において周知されているように、一人の患者に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与される具体的化合物、投与の時間および経路、治療の種類、全身の健康状態、および同時に投与される他の薬剤など、多くの要因によって決められる。
【００４２】
上記した本発明に係るポリペプチド二量体の好適な医学的用途は、骨再吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍、クローン病などの自己免疫疾患、および細菌もしくはウイルスによる感染症を治療／予防することである。
【００４３】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものである。
【００４４】
実施例1：材料および方法
（A）材料
DMEM、RPMI-1640、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびゲンタマイシンは、Gibco社（エッゲンシュタイン,ドイツ）から購入した。FCSは、Biochrom社（ベルリン,ドイツ）から入手した。DEAE-デキストランは、Sigma社（タウフキルヘン,ドイツ）から得た。制限酵素のT4-DNAリガーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼは、New England Biolabs社（シュワルバッハ,ドイツ）から得た。［3H］-チミジン、ECL-試薬、およびX線フィルムは、Amersham Bioscience社（フライブルク,ドイツ）から入手した。クイックチェンジ部位特異的変異誘発キットは、Stratagene社（アムステルダム, NL）から得た。抗体は、Cell Signalling Technology社（フランクフルト,ドイツ）から購入した。BAF／gp130細胞、組換えIL-6およびハイパー-IL-6（H-1L-6）、IL-6＋sIL-6Rを含む融合タンパク質（Rakemannら, J. Biol. Chem. 274 （1999）, 1257）は、Stefan Rose-John氏（生化学研究所所長、キール,ドイツ）から入手した。ヒトsgp130Fcは、上記したように通りに作成した（Atreyaら, Nat. Med. 6 （2000）, 583）。
【００４５】
（B）細胞の培養および形質転換
BAF／gp130細胞を、水飽和大気（water saturated atmosphere）内において5％CO2、37℃でDMEMの中で増殖させた。細胞培養培地に10％FCS、100 mg／lのストレプトマイシンおよび60mg／lのペニシリンを添加した。10ng／mlのH-IL-6が存在する中でBAF／gp130細胞を培養した。
【００４６】
（C）sgp130（D1-D3）およびsgp130（D1-D3）Hisの発現プラスミドの構築
標準的なプロトコールに従ったPCRによって、gp130のコード配列の1番目から978番目までの塩基（Met1からPro326までのアミノ酸に相当する（図2））を増幅することによって、gp130（D1-D3）のリガンド結合ドメインのクローニングを行った。pSVL-sgp130-Fc（Atreyaら, Nat. Med. 6 （2000）, 583）を鋳型として採用した。得られたDNA断片を、1％アガロースゲル上で精製し、Qiagen MiniEluteキットを用いて単離し、発現プラスミドpQE60、pQE70（Qiagen）、pBAD／Myc-His（Invitrogen）、pET-3、pET-11、pCAL-c、およびpCAL-kc（Stratagene）にクローニングした。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００４７】
（D）sgp130（D1-D3）Pn発現プラスミドの構築
標準的なクローニング技術に従った部位特異的変異誘発法によって、1個以上のシステイン残基を含むさまざまな長さのポリペプチド（Pn）をsgp130（D1-D3）のC末端に付加した。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、挿入配列の配列を確認した。
【００４８】
（E）vIL-6-His発現プラスミドの構築
単離されたばかりのヒトゲノムDNAを鋳型として使用して、PCRによってvIL-6のcDNAを増幅した（図3のコード配列）。vIL-6-HisをCOS-7細胞で発現させるために、viL-6のcDNAを、ポリヒスチジン（His）タグの前で、哺乳動物発現プラスミドであるpEF11myc-His、pUB6N5-His（Invitrogen）またはpQE-TriSystem（Qiagen）の中に挿入した。vIL-6-Hisを細菌で発現させるために、vIL-6のcDNAを、ポリヒスチジンタグの前で、原核生物発現ベクター（pQE60、pQE70（Qiagen）、pBAD／Myc-His（Invitrogen）、pET-3、pET-11、pCAL-c、およびpCAL-kc（Stratagene）の中に挿入した。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００４９】
（F）ViL-6-Hisの精製
組換えviL-6-Hisを、Muellbergら; J. Immunol. 164 （2000）, 4672に記載されている通りに精製した。
【００５０】
（G）sgp130（D1-D3）-Pnの精製（方法1）
精製された組換えVIL-6-Hisを以下のようにしてNi-NTAアガロースカラム（Qiagen）に結合させた。カラム材料は、5容積倍量50 mMのリン酸緩衝液（pH 7.5）、500 mM NaCl、および20 mMイミダゾール（平衡用緩衝液、EB）で平衡させた。vIL-6-Hisをカラムにかけて、未結合タンパク質を5容積倍量のEBで洗浄して除去した。sgp130（D1-D3）-Pnを含むタンパク質懸濁液をカラムにかけ、続いて、そのカラムを10容積倍量のEBで洗浄した。最後に、クエン酸緩衝液（pH 1.4）でsgp130（D1-D3）-Pnを溶出し、溶出液を直ちに中和した。溶出物を、モノQファーストタンパク質液体クロマトグラフィー（Pharmacia）によって精製してから、PBSに対して透析した。
【００５１】
（H）sgp130（D1-D3）-Pnの精製（方法2）
sgp130（D1-D3）-PnおよびvIL-6-Hisをコードする原核生物発現プラスミドを、細菌株のTOP10（Invitrogen）、XL1-Blue、BL21（DE3）（Stratagene）、M15［pREP4］またはSG13009［pREP4］（Qiagen）に同時形質移入した。形質転換から24時間後、1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）によってタンパク質産生を開始させ、6時間後にタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物を、予め5容積倍量のEBで平衡しておいたNi-NTAアガロースカラム上に負荷した。カラムを10容積倍量のEBで洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。最後にgp130（D1-D3）-Pnを溶出させて、上記のようにして精製および透析した。
【００５２】
（I）sgp130（D1-D3）-Hisの精製
vIL-6-Hisについて述べた技術と同じ技術によって、sgp130（D1-D3）-Hisを精製した。
【００５３】
（J）sgp130（D1-D3）-Pnのペグ化
ここ数年、ポリエチレングリコール（PEG）によって生体高分子の共有的修飾についての興味の高まりが起きている。この種の修飾は、医薬およびバイオテクノロジーに応用する上で非常に重要である。ペグ化（PEGの共有的結合）は、例えば、抗原性または免疫原性のエピトープの遮蔽をもたらす。さらに、細網内皮系によるレセプター介在型取り込みを抑制し、タンパク質分解酵素による認識と分解を防止する（5）。タンパク質のペグ化は、腎臓濾過を低下させることによって、その生物利用能を高めることが分かっている。sp130（D1-D3）は、9個のシステイン（C）残基を含み、そのうちの8個がジスルフィド架橋に関与する（C28-C54、C48-C103、C134-C144、C172-C182）。最後のC301は、遊離のスルフヒドリル基を含むため、部位特異的なペグ化に適している。3倍モル過剰のmPEG-MAL（分子量20,000）（Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, USA）をsgp130（D1-D3）-PnにpH 7.2で付加してsgp130（D1-D3）の修飾を行った。この反応を室温で60分間行ってから、標準的な条件による最終的なゲル濾過工程で生成物を単離した。このタンパク質を、3倍モル過剰の分岐型mPEG（MAL）2（分子量20,000）（Nektar）とpH7.2、室温で90分間インキュベートして、ペグ化sgp130（D1-D3）-Hisを生成させた。次に、標準的な技術によって、この生成物をゲル濾過した。
【００５４】
（K）粘膜固有層単核細胞（LPMC）の単離および刺激
3 mMのL-グルタミン、10 mMのHEPES緩衝液、10μg／mlのゲンタマイシン、100 U／mlのペニシリン、100U／mlのストレプトマイシン、50μMの2-メルカプトエタノールおよび10％の熱不活性化FCSを加えたRPMI-1640からなる完全培地の中でLPMCを培養した。図に示すように、1から10μg／mlの濃度のsgp130Fc、中和IL-6R特異的抗体（ドイツ国キール大学教授であるRose-John博士より提供された）、sgp130PEGまたはsgp130TagPEGの存在下または非存在下で細胞を10μg／mlのC反応性タンパク質（Sigma）、50 ng／mlのホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）、および10μg／mlのフィトヘマグルチニン（PHA）（Sigma）によって刺激した。48時間後、ApoAlertアネキシンV-FITCアポトーシス検出キット（BD Bioscience社、ハイデルベルク,ドイツ）を用いて、アネキシンVとヨウ化プロピジウムで細胞を染色し、FACSによる分析を行った。
【００５５】
（L）増殖アッセイ法
増殖因子を除去するためにBAF／gp130細胞をPBSで入念に洗浄してから、サイトカインを含まない培地に再懸濁した。96ウエルプレートの1ウエルにつき5×103個の細胞を、サイトカインを入れて最終用量100μlにして、図に示すようにsgp130Fcまたはsgp130PEGまたはsgp130TagPEGの量を増加させながら68時間培養した後、0.25 mCiの［3H］-チミジンで4時間パルス標識した。細胞をガラスフィルター上に回収して、取り込まれた［3H］-チミジンをシンチレーション計測法によって測定した。
【００５６】
（M）ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ法
BAF31gp130細胞を、レポーター遺伝子プラスミドのpSTAT3-TA-Luc（BD Bioscience社、ハイデルベルク,ドイツ）およびpCMV-Lucによって同時形質転換して、24時間インキュベートした。そして、形質転換された細胞を、10μg／mlのsgp130Fc、sgp130PEGまたはsgp130TagPEGがそれぞれ存在するかしない中で、5 ng／mlのH-IL-6とともにさらに20時間インキュベートした。Promega社（マンハイム,ドイツ）から購入した二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（Dual Luciferase Reporter Gene Assay）を用い、製造業者の使用説明書に従って、MicroLumatPlus LB96Vマイクロプレート発光測定装置（EG&G Berthold, ウェルズリー, MA, USA）で測定してルシフェラーゼ活性の抽出および検出を行った。
【００５７】
（N）sgp130（D1-D3）.1およびsgp130（D1-D3）-Tagの発現プラスミド構築
標準的なプロトコールに従ったPCRによって、gp130のコード配列の70番目から966番目までの塩基（Leu 24からTyr 322までのアミノ酸に相当する（図2））を増幅することによって、gp130（D1-D3）.1のリガンド結合ドメインのクローニングを行った。pSVL-sgp130-Fc（2）を鋳型として採用した。得られたDNA断片を、1％アガロースゲル上で精製し、Qiagen MiniEluteキットを用いて単離し、適当な発現プラスミドにクローニングした。標識されたタンパク質を発現させるために、His（4-6）、FLAG、Step-Tag、GFP、GST、HA CBP、またはその他、抗体を利用できるエピトープなど、適当な標識を含むベクターを用いた。あるいは、所望の標識をsgp130（D1-D3）.1のc-DNAのすぐ後ろにクローニングした。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００５８】
（O）sgp130-Pn発現プラスミドの構築
製造業者の使用説明書に従って、対応する発現プラスミドを部位特異的変異誘発することによって、1個以上のシステイン残基を含むさまざまな長さ（Pn）のポリペプチドをsgp130のC末端に付加した。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００５９】
（P）vIL-6-His発現プラスミドの構築
単離されたばかりのヒトゲノムDNAを鋳型として使用して、PCRによってvIL-6のcDNAを増幅した（図3のコード配列）。vIL-6-HisをCOS-7細胞で発現させるために、vIL-6のcDNAを、ポリヒスチジン（His）タグの前で、適当な哺乳動物発現プラスミド、例えば、pcDNA3.1／myc-His、pEF1／myc-His、pUB6／V5-His（Invitrogen）、pQE-TriSystem（Qiagen）などの中に挿入した。vIL-6-Hisを細菌で発現させるために、vIL-6のcDNAを、ポリヒスチジンタグの前で、適当な原核生物発現ベクター、例えば、pQE60、pQE70（Qiagen）、pBAD／Myc-His（Invitrogen）、pET-3、pET-11、pCAL-c、pCAL-kc（Stratagene）などの中に挿入した。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００６０】
（Q）sgp130-Pnの精製（方法I）
ウイルスのインターロイキン-6（vIL-6）（4）は、さらにIL-6レセプター（IL-6R）を必要とせずにgp130に特異的結合することが分かっている（3）。vIL-6のこの相互作用を用いて、vIL-6-Hisアフィニティーカラムによってsgp130を精製した。精製された組換えVIL-6-Hisを以下のようにしてNi-NTAアガロースカラム（Qiagen）に結合させた。カラム材料は、5容積倍量50 mMのリン酸緩衝液（pH 7.5）、500 mM NaCl、および20 mMイミダゾール（平衡用緩衝液、EB）で平衡させた。vIL-6-Hisをカラムにかけて、未結合タンパク質を5容積倍量のEBで洗浄して除去した。sgp130-Pnを含むタンパク質懸濁液をカラムにかけ、続いて、そのカラムを10容積倍量のEBで洗浄した。最後に、クエン酸緩衝液（pH 1.4）でsgp130-Pnを溶出した。溶出液を直ちに中和して、モノQファーストタンパク質液体クロマトグラフィー（Pharmacia）によって精製してから、PBSに対して透析した。
【００６１】
（R）sgp130-Pnの精製（方法II）
gp130-PnおよびvIL-6-Hisをコードする原核生物発現プラスミドを、適当な細菌株、例えば、TOP10（Invitrogen）、XL1-Blue、BL21（DE3）（Stratagene）、M15［pREP4］、SG13009［pREP4］（Qiagen）などに同時形質移入した。形質転換から24時間後、1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）によってタンパク質生産を開始し、6時間後にタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物を、予め5容積倍量のEBで平衡にしておいたNi-NTAアガロースカラム上に負荷した。カラムを10容積倍量のEBで洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。最後にgp130-Pnを溶出させて、上記のようにして精製および透析した。
【００６２】
（S）sgp130-Tagの精製
vIL-6-Hisについて述べた技術と同じ技術によって、sgp130-Tag（His6の標識を有する）を精製した。His（4-6）、FLAG、Step-Tag、GFP、GST、HA CBP、またはその他、抗体を利用できるエピトープなど、別の標識の場合には、アガロースなどの基質上に固定した適当な抗体によってsgp130Tag分子を分離した。
【００６３】
（T）sgp130のペグ化
ここ数年、ポリエチレングリコール（PEG）によって生体高分子の共有的修飾についての興味の高まりが起きている。この種の修飾は、医薬およびバイオテクノロジーに応用する上で非常に重要である。ペグ化（PEGの共有的結合）は、例えば、抗原性または免疫原性のエピトープの遮蔽をもたらす。さらに、細網内皮系によるレセプター介在型取り込みを抑制し、タンパク質分解酵素による認識と分解を防止する（5）。タンパク質のペグ化は、腎臓濾過を低下させることによって、その生物利用能を高めることが分かっている。sp130は、9個のシステイン（C）残基を含み、そのうちの8個がジスルフィド架橋に関与する（C28-C54、C48-C103、C134-C144、C172-C182）。最後のC301は、遊離のスルフヒドリル基を含むため、部位特異的なペグ化に適している。3倍モル過剰のmPEG-MAL（分子量2,000）（Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, USA）をsgp130-PnにpH 7.2で付加してsgp130の修飾を行った。この反応を室温で60分間行ってから、標準的な条件による最終的なゲル濾過工程で生成物を単離した。このタンパク質を、3倍モル過剰のmPEG（MAL）2（分子量2,000）とpH7.2、室温で90分間インキュベートして、ペグ化sgp130Tagを生成させた。次に、標準的な技術によって、この生成物をゲル濾過した。
【００６４】
実施例2：sgp130PEGおよびsgp130TagPEGは、クローン病（CD）患者由来のLPMCに対するsIL-6Rの抗アポトーシス作用を阻害する。
IL-6Rに対する中和抗体は、CD患者由来の粘膜固有層T細胞におけるアポトーシスを誘導することができる（Atreyaら, 2000）。抗IL-6R mAbの作用は、大腸炎の3つの異なったモデル、すなわち、CD62L+ CD45RBhighCD4+T細胞によって再構築された重症複合型免疫不全症マウス、IL-10欠損マウス、およびトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）処理されたマウスでも実証された。すべての場合で、大腸炎の活性が、抗TNF mAb処理した後に観察されたレベルと同じレベルにまで下方制御された（Atreyaら, 2000）。この実験の目標は、本発明に係るsgp130PEGおよびsgp130TagPEGが、LPMCにおけるアポトーシスの誘導について、例えばsgp130Fcなどと同じ効率を示すか否かを明らかにすることであった。実施例1に記載した条件下、中和抗IL-6R抗体、sgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGの存在下でLPMCを培養した。FACS分析によって、アネキシンV陽性でヨウ化プロピジウム陰性の細胞をアポトーシス細胞と判定した。未処理の試料は、約60％のアポトーシス細胞を含んでいたが、抗IL-6R抗体、sgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGで処理すると、11％から16％までアポトーシス細胞が増加した。ペグ化していないsgp130二量体は効果が低く、分子の生物学的活性にとってペグ化が重要であることを示している（図4および8）。
【００６５】
実施例3：BAF／3細胞のIL-6／sIL-6R依存性増殖の阻害
IL-3依存性前駆B細胞株BAF／3はgp130を発現しないため、IL-6にもIL-6／IL-6Rにも応答できない。これに対し、ヒトgp130のcDNAで形質転換されたBAF／3細胞（BAF／gp130細胞）は、IL-3非存在下で、IL-6／IL-6Rまたはハイパー-IL-6（H-IL-6）に応答して増殖することができる。IL-6／IL-6R（図5Aおよび9A）またはH-IL-6（図5Bおよび9B）で刺激されたBAF／gp130をsgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGで量を増加させながら処理し、細胞増殖に対する両sgp130分子の効果を測定した。どちらの実験においても、sgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGの量を増加させると、［3H］-チミジンの取り込みが有意に低下する結果となった。しかし、7.5から10 ng／mlのsgp130Fcを細胞に投与すると、最大半量取り込みに達した（約7.500 cpmにおける点線）。これに対し、sgp130PEGおよびsgp130TagPEGの濃度が1から5 ng／mlのときに、同様の取り込みの低下が既に見られた。このことは、sgp130PEGおよびsgp130TagPEGによる処理が、sgp130Fcよりも1.5から3倍強く作用することを示している。さらに、パネルBでは、ペグ化されていないsgp130二量体を用いて、タンパク質の生物学的活性に対するペグ化の重要な役割を明らかにしている。
【００６６】
実施例4：sgp130PEGは、BAF／gp130細胞においてH-IL-6によって誘導されるSTAT3活性化を阻害する。
転写の潜在型細胞質転写因子シグナル伝達因子および活性化因子（STAT）3が、IL-6処理によっていくつかの異なった細胞型において活性化されることが知られている。STAT3の機能が、さまざまな細胞型において盛んに研究されている。これらには、肝癌細胞における急性期反応の誘導、Bリンパ球における増殖刺激、最終分化および増殖アレスチン単核細胞（growth arrestin monocytes）の活性化、および胚幹細胞の多分化能の維持などが含まれる（Levy and Lee, J. Clin. Invest. 109 （2002）, 1143における概説）。IL-6誘導型STAT3活性化がsgp130PEGまたはsgp130TagPEGによって影響を受けるか否かを判定するために、実施例1に記載されているように、pSTAT3-TA-LucによってBAF／gp130細胞を形質転換した。24時間後、10μg／mlのsgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGそれぞれの存在下または非存在下において細胞を5 ng／mlのH-IL-6でさらに20時間処理した。細胞を抽出して、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。H-IL-6だけで処理した細胞における相対的ルシフェラーゼ活性を100％とした（図6Aおよび10A）。これに対して、STAT3活性は、それぞれ、26％（sgp130Fc）、18％（sgp130PEG）、および19％（sgp130TagPEG）に低下した。第2の実験において、細胞をsgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGの量をそれぞれ増加させながら処理して、上記した作用の用量依存性を測定した（図6Bおよび10B）。sgp130PEGおよびsgp130TagPEGを2.5μg／mlの濃度で用いて、STAT3の最大半量活性化を測定したが、これと同じ効果は、約7.5μg／mlの濃度のsgp130Fcで見られた。ここでも、前に示したように、sgp130PEGおよびsgp130TagPEGの効率は、sgp130Fcで見られる効率よりも約2〜3倍高かった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、sgp130PEGおよびsgp130 HisPEGの概略図である。
【図２】図２は、ヒトgp130（sgp130（D1-D3））の最初の3つの細胞外ドメイン（D1〜D3）の塩基配列、およびそれに対応してコードされるタンパク質の配列である。
【図３】図３は、ヒトヘルペスウイルス8型（HHV8）由来のウイルスインターロイキン-6（vIL-6）の塩基配列およびそれに対応してコードされるタンパク質の配列である。
【図４】図４は、クローン病患者由来の粘膜固有層単核細胞（LPMC）におけるアポトーシスの解析結果を示す。LPMCは、実施例1に記載されているようにして単離され、中和抗IL-6抗体、sgp130Fc、およびsgp130PEGのそれぞれ10μg／mlの存在下または非存在下で48時間培養された。アネキシンVおよびヨウ化プロピジウムで細胞を染色した後FACS分析を行って、アポトーシスを測定した。アポトーシスした細胞（アネキシンV陽性およびヨウ化プロピジウム陰性）の割合を図示した。
【図５】図５は、（A）5 ng／mlのハイパーIL-6（H-IL-6）または（B）100 ng／mlのIL-6＋50 ng／mlのsIL-6R、および次第に量を増加させたsgp130Fcまたはsgp130PEGに応答したBAF／gp130細胞の増殖を示す。増殖は、シンチレーションカウンター内で［3H］-チミジンの取り込みを検出して測定した。
【図６】図６は、A）H-IL-6処理後のSTAT3作動によるレポーター遺伝子プラスミドの活性化、およびsgp130Fcまたはsgp130PEG（各10μg／ml）によるSTAT3の活性化の阻害、B）sgp130Fcまたはsgp130PEGのいずれかによる、H-IL-6に誘導にされたSTAT3活性化の濃度依存性下方制御を示す。
【図７】図７は、ヒトgp130（sgp130（D1-D3）.1）の最初の3つの細胞外ドメイン（D1〜D3）の塩基配列、およびそれに対応するタンパク質の配列を示す。
【図８】図８のA）は、クローン病患者由来の粘膜固有層単核細胞（LPMC）におけるアポトーシスの解析結果を示す。LPMCは、実施例1に記載されているようにして単離され、中和抗IL-6抗体、sgp130Fc、およびsgp130PEGのそれぞれ10μg／mlの存在下または非存在下で48時間培養された。アネキシンVおよびヨウ化プロピジウムで細胞を染色した後FACS分析を行って、アポトーシスを測定した。アポトーシスした細胞（アネキシンV陽性およびヨウ化プロピジウム陰性）の割合を図示した。図８のB）は、抗IL-6抗体、sgp130Fcおよびsgp130PEGの代わりにsgp130二量体またはsgp130TagPEGを用いた以外は、図4Aに記載した実験と同じ実験を行ったものを示す。
【図９】図９は、（A）5 ng／mlのハイパーIL-6（H-IL-6）または（B）100 ng／mlのIL-6＋50 ng／mlのsIL-6R、および次第に量を増加させたsgp130TagPEGまたはsgp130二量体のいずれかに応答したBAF／gp130細胞の増殖を示す。増殖は、シンチレーションカウンター内で［3H］-チミジンの取り込みを検出して測定した。
【図１０】図１０は、A）H-IL-6処理後のSTAT3作動によるレポーター遺伝子プラスミドの活性化、およびsgp130二量体またはsgp130TagPEG（各10μg／ml）によるSTAT3の活性化の阻害、B）sgp130二量体またはsgp130TagPEGのいずれかによる、H-IL-6に誘導にされたSTAT3活性化の濃度依存性下方制御を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、2つの可溶性gp130分子を含むポリペプチド二量体であって、該可溶性gp130分子の少なくとも一方がポリエチレングリコールに共有結合している二量体に関する。また、本発明は、該二量体を含む医薬組成物およびさまざまな医学的用途に関する。
【０００２】
多機能性のサイトカインであるインターロイキン-6（IL-6）は、とりわけ肝臓におけるB細胞の刺激および急性期タンパク質合成の誘導がもっとも顕著である、広い範囲の生物学的機能を示す。IL-6は、IL-6特異的な表面レセプター（「IL-6R」または「gp80」）への結合を介して標的細胞に対しその活性を及ぼす。このレセプター／リガンド複合体は、IL-6レセプター複合体の2番目のサブユニットであるgp130のホモ二量体化を促進する。gp130の二量体化は、IL-6シグナルの伝達をもたらす。2種類のメカニズム（選択的スプライシングおよび分断（shedding））によって生成される可溶性型のIL-6R（sIL-6R）も、IL-6と複合体を形成すると、gp130の二量体化およびシグナル伝達を開始させることができる。
【０００３】
IL-6Rの細胞質部位はシグナル伝達に寄与しないため、gp130のホモ二量体によるシグナル伝達は、膜結合型または可溶型のIL-6Rと複合体になったIL-6によって誘導することができる。しかしながら、ヒト肝癌細胞HepG2について既述されているように、sIL-6Rが存在することによって、IL-6応答細胞のリガンドに対する感作がもたらされる。さらに、培養培地に存在するsIL-6Rを絶えず取り除けば、厳密にIL-6依存型ハイブリドーマ細胞が、非常に低量のIL-6に反応して増殖することはないことが分かっている。
【０００４】
gp130は、当初、インターロイキン-6のシグナル伝達因子として説明されていたが、IL-6、IL-11、白血病抑制因子（LIF）、オンコスタチンM（OSM）、および毛様体神経栄養因子（CNTF）など、さまざまなサイトカインに共通するシグナル伝達因子の鎖である。これらのサイトカインはすべて、gp130のホモ二量体化（IL-6に対して）、または、LIF-Rb／gp130タンパク質とのヘテロ二量体化（IL-11、LIF、OSMおよびCNTFに対して）によってシグナル伝達が開始される、2部または3部からなるレセプター複合体を介して作用する。したがって、これらのサイトカインは、さまざまな組織において同じような生物学的活性を媒介する。
【０００５】
gp130は、ほとんどすべての細胞型で見ることができるが、IL-6Rは、それよりもずっと制限された発現を示す。1つの細胞型からsIL-6Rが放出されると、IL-6に反応するgp130を発現するだけの別の細胞が生じる。このシナリオはトランス・シグナル伝達と呼ばれる。実際、sIL-6RとIL-6の複合体を必要とするが、IL-6単独では見られない細胞活性がいくつか記述されている。可溶性gp130タンパク質は、ヒト血漿の中に高濃度で見られる。最近、デザイナーサイトカインであるハイパーLL-6（H-IL-6）について説明されているが、そこでは、sIL-6RのC-末端が、フレキシブルなペプチドリンカーによって成熟IL-6のN-末端に共有的に融合している。IL-6／sIL-6Rの複合体で見られるように、H-IL-6も、gp130を発現するだけの細胞に作用する。別個の成分としてのIL-6およびsIL-6Rとは対照的に、この融合分子では濃度が100倍から1000倍低くても同等の生物学的シグナルを誘導するのに十分である。
【０００６】
クローン病などさまざまな病気を治療するためには、可溶性IL-6Rに依存したIL-6反応の特異的ブロッキングが治療にとって望ましいかもしれない。残念ながら、この目的のために今のところ利用できる化合物は、低産生率、高クリアランス率、低半減期など、不利な特徴をいくつか有する。
【０００７】
このように、本発明の基礎にある技術的課題は、sIL-6Rに依存したIL-6反応の特異的ブロッキングが、先行技術の方法がもつ不利益を克服して有益な効果をもつ病気の治療に適した方法を提供することであった。
【０００８】
この技術的課題の解決は、請求項にその特徴が記載されている態様を提供することによってもたらされる。本発明に至る実験の過程で、ペグ化(PEGylated)可溶性gp130二量体が、クローン病（CD）患者のLPMCに由来するsIL-6Rの抗アポトーシス作用を効率的に阻害し、そのため該化合物が、該疾患およびその関連疾患、例えば、大腸炎または慢性関節リウマチなどを治療する上で有用なことが発見された。クローン病は、頻繁に急性炎症の再発が起きるという特徴をもつ、胃腸管の慢性炎症性疾患である。感染症、傷害、およびその他の要因に伴う炎症は、急性期タンパク質（APP）が産生されるという特徴をもつ急性期反応（APR）を速やかに誘導する。APRは、主に血管透過および体熱の上昇をもたらす。APPは、それらの発現および活性化を調節するサイトカインによって、2つの異なるグループに分けることができる。IL-6ファミリーのサイトカインは、STAT3の活性化によってもたらされるII型APP遺伝子の発現を上方制御する。また、IL-6は、I型APPのレベルの上昇にも寄与するが、これは、主に、IL-1によって調節されている。IBD患者の結腸組織における強力なSTAT3活性化（すなわち、チロシンリン酸化）については既に記載されている。さらに、IL-6 KOマウスではSTAT3活性化が顕著に低下するが、それには、これらマウスにおける実験的大腸炎の発症の低下が伴った（Suzukiら, J Exp Med, 2001, 193:471）。これらの知見は、IL-6／IL-6Rの介在によるSTAT3活性化が、大腸炎の発生および持続において中心的な役割を果たすことを示すものである。別の炎症性疾患である慢性関節リウマチ（RA）では、STAT3がRA滑膜線維芽細胞の生存にとって重要であることが分かった（Krauseら, J Immunol, 2002, 169:6610）。このように、STAT3が遺伝子治療の優れた標的となりうることが示唆された。恒常的なSTAT3の活性化も「発癌性」因子であることが知られており、例えば、Bcl-2またはBcl-XLなどの抗アポトーシス蛋白質の上方制御を伴う（Turksonら, Oncogene, 2000, 19;6613）。ペグ化可溶性gp130二量体がSTAT3の活性を顕著に低下させることが発見された。さらに、IL-6／IL-6R／gp130によるシグナル伝達経路および疾患パラメーターの低下において、sgp130PEGの効率は、EP 00 108 691.7のsgp130Fcの効率よりも顕著に高いことが発見された。さらに、sgp130PEGの半減期は、sgp130Fc分子の半減期の約2倍長い。これから先、低用量のsgp130PEGが、sgp130Fcによるのと同じ結果を得るために治療法において使用されるかもしれない。そうなれば、sgp130PEGのこのような結果は、弱い副作用、患者への曝露の低減、使用頻度の減少、および治療費の削減を意味する。
【０００９】
このように、本発明は、2つの可溶性gp130分子を含むポリペプチド二量体であって、該可溶性gp130分子の少なくとも一方が、好ましくは、その両方がポリエチレングリコールに共有結合しているポリペプチド二量体に関する。
【００１０】
本発明に係るポリペプチド二量体は、公知の方法を用いて改造することができる。本明細書において用いられる「可溶性」という用語は、細胞内ドメイン、および、好ましくは、膜貫通領域を持たないgp130分子を意味する。利用されるドメインは、gp130の細胞外ドメインD1〜D3からなるか、またはその変異体または断片であって、アゴニスト複合体であるIL-6／sIL-6Rの活性を阻害する能力を維持している部分からなっていてもよい。sgp130分子のペグ化は、例えば、ヒトのIFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-15またはIL-2について記載されている方法（Tangら, Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao （Shanghai）, （1996）, 28:312; Youngsterら, Curr Pharm Des （2002）, 8:2139; Graceら, J Interferon Cytokine Res （2001）, 21:1103; Pepinskyら, J Pharmacol Exp Ther （2001）, 297:1059; Pettitら, J Biol Chem （1997）, 272:2312; Goodsonら, Biotechnology NY （1990）, 8:343; Katre; J Immunol （1990）, 144:209）に従って行うことができる。好ましくは、gp130の可溶性部分に相当するポリペプチドが、本発明に係るポリペプチド二量体の唯一の生物学的活性ポリペプチドであり、それは、Fc-ドメインおよび／またはフィブロネクチン（FN）IIIのような更なるポリペプチド部分を含まない。
【００１１】
好適な態様において、本発明に係るポリペプチド二量体は、その2つの可溶性gp130分子の少なくとも一方が、図2または3に示したアミノ酸配列を含むという特徴をもつ。
【００１２】
より好適な態様において、本発明に係るポリペプチド二量体は、その2つの可溶性gp130分子の両方が、図2または3に示したアミノ酸配列を含むという特徴をもつ。
【００１３】
PEG-ポリペプチド-二量体が、例えば、実施例1に記載されている方法など、当技術分野において公知の方法によって測定することができる、sIL-6Rに依存するIL-6応答を阻害できるのであれば、あらゆる種類のポリエチレングリコールが本発明に適している。好ましくは、本発明に係るポリペプチド-二量体のポリエチレングリコールは、PEG 1000、2000、3000、5000、10000、15000、20000または40000であって、PEG 20000または40000が特に好ましい。
【００１４】
二量体を形成するためには、2つの可溶性gp130分子を、1個以上のジスルフィド架橋によって互いに結合させる。これは、例えば、組換え発現によって行うことができるが、ここで、sgp130をコードする核酸配列は、終止コドンとsgp130のC末端にあるアミノ酸残基をコードするコドンとの間に1つ以上のシステイン残基をコードするコドンを含む。あるいは、二量体を生成させるためには、好ましくは、単量体をタンデムに融合させた（テール対テール型の：tail-to-tail）フレキシブルなリンカーのドメインを用いることができる。このリンカーは、完全に人工的なもの（例えば、一定の間隔でセリン、アラニンおよび／またはスレオニンによって中断されるポリグリシンの反復配列）でもよいし、または、ヒトIgGのヒンジ領域など、天然のタンパク質から「借用」したものでもよい。さらに、二量体の分子は、例えばHis-His-His-His-His-His（His6）、FLAG、Strep-Tag、緑色蛍光タンパク質（GFP）、c-myc、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、HA、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、または抗体を利用することができるその他のエピトープによって標識して、適当なクロマトグラフィー装置による迅速な精製、例えばウエスタンブロッティングまたはELISAによる検出、免疫沈殿、またはバイオアッセイ法における活性の枯渇／遮断を行うことができる。
【００１５】
更なる別の態様において、2つの可溶性gp130分子は、少なくとも一方のPEGおよび2つの反応基を正確な距離を置いて含む「分岐(forked)型」のPEGを介して互いに結合している。
【００１６】
所望の性質を有するsgp130の変異を発生および同定するためにさまざまな手段を用いることができる。標準的な方法による、sgp130をコードするDNAのランダムな変異誘発を用いた後、生成物の集合体を解析して、所望の性質を有する変異型サイトカインを同定することができる。遺伝子工学による変異誘発が、組換えタンパク質の機能的ドメインの構造機構を解明するために広範に用いられてきた。欠失または置換による変異誘発を実施するための異なった方法がいくつか文献に記載されている。もっとも成功したのは、アラニンスキャニング変異誘発法（Cunningham and Wells, Science 244 （1989）, 1081-1085）およびホモログスキャニング変異誘発法（Cunninghamら, Science 243 （1989）, 1330-1336）と考えられる。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および、好ましくは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターであるベクターを用いることによって、好ましくは組換え法によって製造される。本発明に係るポリペプチドを製造するために、ポリペプチドを、既存のクローン、すなわち、好ましくは、天然のポリペプチドまたはその一部をコードするものから得る。天然型のDNAまたはRNAの相補鎖に、高厳密度条件または中厳密度条件（定義については、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory （1989） N.Y.参照）の下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドも、このポリヌクレオチドが天然型配列の生物学的活性を維持している限り、本発明に係るポリペプチドを製造するために役立つ。
【００１８】
組換えベクターは、当業者に周知された方法に従って構築することができる。例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory （1989） N.Y.参照。さまざまな発現ベクター／宿主系を利用して、本発明に係るsgp130ポリペプチドをコードする配列を含み、発現させることができる。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；ウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウイルス）；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスのCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または動物細胞系などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
「制御エレメント」または「調節領域」とは、ベクターの非翻訳領域、すなわち、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実行するエンハンサー、プロモーター、5'側および3'側の非翻訳領域などである。このようなエレメントの長さや特異性はさまざまであろう。ベクター系および利用される宿主に応じて、構成的プロモーターおよび誘導的プロモーターなど、適当な転写および翻訳のエレメントを任意の数使用することができる。例えば、細菌系でクローニングする場合、Bluescript.RTMファージミド（Stratagene, LaJolla, Calif.）のハイブリッドlacZプロモーターまたはpSport1.TMプラスミド（Gibco BRL）などを用いることができる。バキュロウイルスのポリへドリンプロモーターを昆虫細胞で用いることもできる。植物細胞のゲノム由来のプロモーターもしくはエンハンサー（例えばヒートショック、RUBISCO、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルス由来のプロモーターもしくはエンハンサー（例えばウイルスプロモーターまたはリーダー配列）をベクターにクローニングすることも可能である。哺乳動物細胞系では、哺乳動物の遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが好ましい。spg130ポリペプチドをコードする配列のコピーを多数含む細胞株を作成する必要がある場合には、SV40またはEBVに基づくベクターを、適当な選択マーカーとともに用いることができる。
【００２０】
細菌系では、本発明に係るポリペプチド二量体の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを選択することができる。本発明において使用するのに適したベクターは、細菌で発現させるためのpSKK発現ベクターなどであるが、これに限定されるものではない。
【００２１】
酵母であるサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、アルファ因子、アルコール酸化酵素、およびPGHなどの構成的または誘導的なプロモーターを含むベクターをいくつか使用することができる。概説については、Grantら, （1987） Methods Enzymol. 153:516-544。
【００２２】
植物の発現ベクターを用いる場合、本発明に係る抗体をコードする配列の発現を、多数のプロモーターのいずれによっても推進することができる。例えば、CaMVの35Sプロモーターおよび19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独で、またはTMV由来のオメガ・リーダー配列と併用して使用することができる（Takamatsu, N. （1987） EMBO J. 6:307-311）。あるいは、RUBISCOの小サブユニットまたはヒートショックのプロモーターなど、植物プロモーターを用いることもできる（Coruzzi, G.ら （1984） EMBO J. 3:1671-1680；Broglie, R.ら （1984） Science 224:838-843；およびWinter, J.ら （1991） Results Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これらのコンストラクトは、直接的なDNA形質転換法または病原体介在による形質転換法によって植物細胞の中に導入することができる。このような技術については、一般的に閲覧可能な数多くの概説書に記載がある（例えば、Hobbs, S. および Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology （1992） McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196）。
【００２３】
昆虫系を用いて、本発明に係るsgp130分子を発現させることも可能である。例えば、このような系の1つにおいて、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして用いて、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア属（Trichoplusia）の幼虫の中で発現させることができる。配列を、ポリへドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングして、ポリへドリンプロモーターの調節下に置くことができる。sgp130をコードする遺伝子の挿入に成功すると、ポリへドリン遺伝子が不活性になって、コートタンパク質を持たない組換えウイルスが産生される。そして、この組換えウイルスを用いて、例えば、APOPが発現されている可能性のあるS.フルギペルダ細胞またはトリコプルシア属の幼虫に感染させることができる。（Engelhard, E. K.ら （1994） Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227）。
【００２４】
哺乳動物の宿主細胞においては、多くのウイルスによる発現系を利用することが可能である。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、本発明に係るポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターと、3つの部分に分かれるリーダー配列とからなるアデノウイルスの転写／翻訳複合体にライゲーションすることができる。ウイルスゲノムのE1またはE3という非必須領域への挿入を利用して、感染宿主細胞において該抗体を発現できる生存ウイルスを得ることができる（Logan, J. and Shenk, T. （1984） Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を増加させることができる。
【００２５】
プラスミドに含有させて発現させることができないような大きなDNA断片を送達するために、ヒト人工染色体（HAC）を用いることも可能である。6から10MのHACを構築して、治療のための通常の送達法（リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、またはベシクル）によって送達する。
【００２６】
特異的な開始シグナルを用いて、より効率的な翻訳を行うことも可能である。そのようなシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。sgp130、その開始コドン、および上流配列をコードする配列を適当な発現ベクターに挿入する場合には、余計な転写または翻訳の調節シグナルを必要としないであろう。しかし、コード配列のみを挿入する場合には、ATG開始コドンなどの外来の翻訳調節シグナルを提供する必要がある。さらに、開始コドンを正しいリーディングフレームに入れて、挿入配列全部が確実に翻訳されるようにしなければならない。外来の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然のものでも、合成されたものでも、さまざまな由来のものでよい。発現の効率は、文献に記載されているような、利用される具体的な細胞系に適したエンハンサーを含ませることによって増進させることができる（Scharf, D.ら （1994） Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）。
【００２７】
さらに、挿入された配列の発現を調節できるか、または、発現されたポリペプチド鎖を所望の形式に処理できるかについて、宿主細胞系統を選択することができる。「プレプロ」型のポリペプチドを切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、折りたたみ、および／または機能を促進することも可能である。翻訳後活性について特異的な細胞装置および特徴的な機構を有するさまざまな宿主細胞（例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびW138）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC：Bethesda, Md.）から入手することができ、外来ポリペプチド鎖の正確な修飾およびプロセッシングを保証するために選択することができる。
【００２８】
長期間、高收率で組換えポリペプチド生産を行うためには、安定した発現が好ましい。例えば、sgp130鎖を安定して発現する細胞株を、ウイルス由来の複製点および／または内在性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を同一または別々のベクター上に含むことができる発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクターを導入した後、強化培地の中で1〜2日間増殖させてから、選択培地に交換する。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することにあり、それが存在すると、導入された配列の発現に成功した細胞の増殖と回収が可能になる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００２９】
組換えベクターを導入した後、宿主細胞を選択培地で増殖させることによって、ベクター含有細胞の増殖が選択される。形質転換された細胞株を回収するためにいくつの選択系を用いてもよい。これらには、それぞれtk-細胞またはaprt-細胞において用いることができる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler,M.ら （1977） Cell 11:223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy, I.ら （1980） Cell 22:817-23）等があるが、これらに限定されるものではない。また、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr（Wigler, M.ら （1980） Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70）、アミノグリコシド系ネオマイシンおよびG-418に対する耐性を付与するnpt（Colbere-Garapin, F.ら （1981） J. Mol. Biol. 150:1-14）、およびクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼのそれぞれに対する耐性を付与するalsまたはpat（Murry、前掲）など、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準として利用することもできる。さらに別の選択可能な遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、または、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにするhisD（Hartman, S.C. and R.C. Mulligan （1988） Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51）などが既に記載されている。最近では、アントシアニン、ベータ-グルクロニダーゼとその基質であるGUS、およびルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンなどのマーカーによって、可視的なマーカーが人気を博すようになっており、形質転換体を同定するためだけでなく、特異的なベクター系に起因させることができる一過的または安定的なタンパク質発現の量を定量するために広く使用されている（Rhodes, C.A.ら （1995） Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【００３０】
組換えポリペプチドの精製は、この目的にとって公知の方法のいずれか、すなわち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを含む従来からの処理法によって実施される。利用可能なさらなる精製処理法は、標的ポリペプチドに結合し、カラム内に含まれるゲル基質上に産生および固定されるモノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーである。組換えポリペプチドを含む不純な調製物をカラムに通過させる。不純物がカラムを通過する間に、特異的抗体によってポリペプチドがカラムに結合する。洗浄後、pHまたはイオン強度を変化させてゲルからポリペプチドを溶出してから、それが単量体で産生された場合には、二量体化およびペグ化する。
【００３１】
したがって、本発明はまた、本発明に係るポリペプチド二量体を製造する方法であって、該ポリペプチドの単量体をコードするDNA配列によって形質転換された宿主細胞を培養すること、該宿主細胞または培養液からポリペプチドの単量体または二量体を回収すること、および単量体または二量体をペグ化することを含む方法に関する。
【００３２】
本発明に係るポリペプチド二量体は、アゴニスト複合体IL-6／sIL-6Rの活性を阻害しなければならない病理すべての治療および／または予防に役立つ。例えば、本発明に係るポリペプチド二量体の治療上の用法には、以下のものを含む。
【００３３】
（a）IL-6は、自己分泌様またはパラクリン様のいずれかで作用して腫瘍形成を促進することによって、多発性骨髄腫に直接関係すると考えられている。さらに、IL-6レベルが上昇すると、骨再吸収、高カルシウム血症、および悪液質などの望ましくない副次的作用を生じる。これらの場合、sIL-6Rが、IL-6に対する標的細胞を感作することが知られている。したがって、本明細書に記載されている、本発明に係るポリペプチド二量体は、副次作用および腫瘍増殖の抑制の両方にとって有益であろう。
【００３４】
（b）自己免疫疾患において：自己免疫疾患におけるIL-6の病理的有意性が、文献において多くの著者によって概説されている（例えば、Yoshizakiら, Semin. Immunol. 4（3） （1992）, 155-166を参照）ため、IL-6シグナル伝達を阻害することが、自己免疫疾患の治療にとって有用であるかもしれない（Nishimotoら, Intern. Med. 38（2） （1999）, 178-182）。このような病理の例は、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、強皮症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性上皮炎、糖尿病、シェーグレン症候群、多発性筋炎、糸球体腎炎、およびその他、乾癬およびクローン病などの炎症性疾患である。
【００３５】
（c）骨粗鬆症では、閉経後の女性における、または卵巣切除によるにエストロゲンレベルの低下によって悪化し得るが、IL-6が、骨再吸収をもたらす破骨細胞形成の中心的なメディエーターであると考えられている。重要なのは、IL-6は、エストロゲンが枯渇した状態で主要な役割を果たすと考えられているに過ぎず、正常な骨の維持については、明らかに最小限の関与しかない。このことと整合して、実験による証拠は、IL-6に対する機能阻害抗体が、破骨細胞の数を減少させうることを示している。エストロゲン補充療法も用いられるが、子宮内膜癌および乳癌のリスクが増加するなどの副作用があると考えられている。このように、本発明に係るポリペプチド二量体は、破骨細胞形成を正常なレベルに低下させるのにより特異的であると考えられる。
【００３６】
（d）IL-6は、おそらく、脂肪組織におけるリポタンパク質リパーゼ活性を低下させることによってAIDSおよび癌に随伴する悪液質をもたらす腫瘍壊死因子（TNF）のメディエーターである可能性がある。したがって、ここで、本発明に係るポリペプチド二量体は、そのような患者において悪液質を緩和または軽減するのに有用であると考えられる。
【００３７】
（e）細菌およびウイルスによる感染：カポジ肉腫（KS）病変部の91％以上にヒトヘルペスウイルス8型（HHV8）が存在することが明らかになっている。さらに、このウイルスは、原発性滲出液リンパ腫（PEL）において、また、多中心性キャッスルマン病（MCD）患者において確認されている。興味深いことに、多発性骨髄腫（MM）患者の骨髄樹状細胞は、HHV8に感染していることが明らかになった。それ以来、HHV8とMMの関連性が激しい論争の主題になっていたが、最近になって再燃した。HHV8のゲノムは、ヒトの抗アポトーシスタンパク質、ケモカイン、および、ヒトIL-6に25％相同性をもつインターロイキン-6（vIL-6）の活性型などのサイトカインに有意な相同性をもつタンパク質をいくつかコードしている。vIL-6は、ヒトIL-6によく似た生物学的活性を持つこと、すなわち、マウスハイブリドーマおよびヒト骨髄腫細胞の増殖を刺激することが明らかになっている。つい最近になって、vIL-6によって形質転換されたNIH3T3細胞を注射されたマウスにおいて、viL-6が血管形成と造血を誘導したことが明らかにされた。これらの機能を通して、vIL-6は、HHV8関連疾患の発病機序に重要な役割を果たすと結論された。vIL-6シグナル伝達へのIL-6Rの寄与については、論争となるほど検討されてきた。vIL-6によって形質転換されたCOS-7細胞の未精製上清を用いた群が、gp130を発現する細胞ではSTAT活性が誘導されるが、IL-6Rは誘導されないことを示している。これに対して、別の群は、vIL-6の活性が、IL-6レセプターアンタゴニストによって低下させられたことを発見して、IL-6RがvIL-6シグナル伝達に関与すると主張している。
【００３８】
このように、本発明は、好ましくは、医薬的に許容できる担体と一緒に、本発明に係るポリペプチド二量体を有効量含む医薬組成物にも関する。「医薬的に許容できる」は、有効成分の生物学的活性の有効性を阻害せず、それが投与される宿主に対して有毒でないあらゆる担体を含むことを意味する。適当な医薬用担体の例は当技術分野において周知されており、リン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョンなどの乳剤、さまざまなタイプの湿潤剤、滅菌溶液などである。常法によって、このような担体を調合し、有効用量を被験体に投与することができる。
【００３９】
「有効量」とは、病気の過程および重篤度に影響を与えて、その病理の軽減または緩和をもたらすのに十分な有効成分量を意味する。
【００４０】
これらの病気や疾患を治療および／または予防するのに有用な「有効用量」は、当業者に公知の方法を用いて決定することができる（例えば、Finglら, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman編, Macmillan Publising Co., New York, pp. 1-46（1975）を参照）。
【００４１】
適当な組成物の投与は、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、または皮内への投与など、さまざまな方法で行うことができる。もちろん、投与の経路は、治療の種類、および、医薬組成物の中に含まれる化合物の種類に依存する。投与量計画は、担当医および他の臨床的要因によって決められる。医学の技術分野において周知されているように、一人の患者に対する投与量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与される具体的化合物、投与の時間および経路、治療の種類、全身の健康状態、および同時に投与される他の薬剤など、多くの要因によって決められる。
【００４２】
上記した本発明に係るポリペプチド二量体の好適な医学的用途は、骨再吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍、クローン病などの自己免疫疾患、および細菌もしくはウイルスによる感染症を治療／予防することである。
【００４３】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものである。
【００４４】
実施例1：材料および方法
（A）材料
DMEM、RPMI-1640、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびゲンタマイシンは、Gibco社（エッゲンシュタイン,ドイツ）から購入した。FCSは、Biochrom社（ベルリン,ドイツ）から入手した。DEAE-デキストランは、Sigma社（タウフキルヘン,ドイツ）から得た。制限酵素のT4-DNAリガーゼおよびポリヌクレオチドキナーゼは、New England Biolabs社（シュワルバッハ,ドイツ）から得た。［3H］-チミジン、ECL-試薬、およびX線フィルムは、Amersham Bioscience社（フライブルク,ドイツ）から入手した。クイックチェンジ部位特異的変異誘発キットは、Stratagene社（アムステルダム, NL）から得た。抗体は、Cell Signalling Technology社（フランクフルト,ドイツ）から購入した。BAF／gp130細胞、組換えIL-6およびハイパー-IL-6（H-1L-6）、IL-6＋sIL-6Rを含む融合タンパク質（Rakemannら, J. Biol. Chem. 274 （1999）, 1257）は、Stefan Rose-John氏（生化学研究所所長、キール,ドイツ）から入手した。ヒトsgp130Fcは、上記したように通りに作成した（Atreyaら, Nat. Med. 6 （2000）, 583）。
【００４５】
（B）細胞の培養および形質転換
BAF／gp130細胞を、水飽和大気（water saturated atmosphere）内において5％CO2、37℃でDMEMの中で増殖させた。細胞培養培地に10％FCS、100 mg／lのストレプトマイシンおよび60mg／lのペニシリンを添加した。10ng／mlのH-IL-6が存在する中でBAF／gp130細胞を培養した。
【００４６】
（C）sgp130（D1-D3）およびsgp130（D1-D3）Hisの発現プラスミドの構築
標準的なプロトコールに従ったPCRによって、gp130のコード配列の1番目から978番目までの塩基（Met1からPro326までのアミノ酸に相当する（図2））を増幅することによって、gp130（D1-D3）のリガンド結合ドメインのクローニングを行った。pSVL-sgp130-Fc（Atreyaら, Nat. Med. 6 （2000）, 583）を鋳型として採用した。得られたDNA断片を、1％アガロースゲル上で精製し、Qiagen MiniEluteキットを用いて単離し、発現プラスミドpQE60、pQE70（Qiagen）、pBAD／Myc-His（Invitrogen）、pET-3、pET-11、pCAL-c、およびpCAL-kc（Stratagene）にクローニングした。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００４７】
（D）sgp130（D1-D3）Pn発現プラスミドの構築
標準的なクローニング技術に従った部位特異的変異誘発法によって、1個以上のシステイン残基を含むさまざまな長さのポリペプチド（Pn）をsgp130（D1-D3）のC末端に付加した。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、挿入配列の配列を確認した。
【００４８】
（E）vIL-6-His発現プラスミドの構築
単離されたばかりのヒトゲノムDNAを鋳型として使用して、PCRによってvIL-6のcDNAを増幅した（図3のコード配列）。vIL-6-HisをCOS-7細胞で発現させるために、viL-6のcDNAを、ポリヒスチジン（His）タグの前で、哺乳動物発現プラスミドであるpEF11myc-His、pUB6N5-His（Invitrogen）またはpQE-TriSystem（Qiagen）の中に挿入した。vIL-6-Hisを細菌で発現させるために、vIL-6のcDNAを、ポリヒスチジンタグの前で、原核生物発現ベクター（pQE60、pQE70（Qiagen）、pBAD／Myc-His（Invitrogen）、pET-3、pET-11、pCAL-c、およびpCAL-kc（Stratagene）の中に挿入した。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００４９】
（F）ViL-6-Hisの精製
組換えviL-6-Hisを、Muellbergら; J. Immunol. 164 （2000）, 4672に記載されている通りに精製した。
【００５０】
（G）sgp130（D1-D3）-Pnの精製（方法1）
精製された組換えVIL-6-Hisを以下のようにしてNi-NTAアガロースカラム（Qiagen）に結合させた。カラム材料は、5容積倍量50 mMのリン酸緩衝液（pH 7.5）、500 mM NaCl、および20 mMイミダゾール（平衡用緩衝液、EB）で平衡させた。vIL-6-Hisをカラムにかけて、未結合タンパク質を5容積倍量のEBで洗浄して除去した。sgp130（D1-D3）-Pnを含むタンパク質懸濁液をカラムにかけ、続いて、そのカラムを10容積倍量のEBで洗浄した。最後に、クエン酸緩衝液（pH 1.4）でsgp130（D1-D3）-Pnを溶出し、溶出液を直ちに中和した。溶出物を、モノQファーストタンパク質液体クロマトグラフィー（Pharmacia）によって精製してから、PBSに対して透析した。
【００５１】
（H）sgp130（D1-D3）-Pnの精製（方法2）
sgp130（D1-D3）-PnおよびvIL-6-Hisをコードする原核生物発現プラスミドを、細菌株のTOP10（Invitrogen）、XL1-Blue、BL21（DE3）（Stratagene）、M15［pREP4］またはSG13009［pREP4］（Qiagen）に同時形質移入した。形質転換から24時間後、1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）によってタンパク質産生を開始させ、6時間後にタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物を、予め5容積倍量のEBで平衡しておいたNi-NTAアガロースカラム上に負荷した。カラムを10容積倍量のEBで洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。最後にgp130（D1-D3）-Pnを溶出させて、上記のようにして精製および透析した。
【００５２】
（I）sgp130（D1-D3）-Hisの精製
vIL-6-Hisについて述べた技術と同じ技術によって、sgp130（D1-D3）-Hisを精製した。
【００５３】
（J）sgp130（D1-D3）-Pnのペグ化
ここ数年、ポリエチレングリコール（PEG）によって生体高分子の共有的修飾についての興味の高まりが起きている。この種の修飾は、医薬およびバイオテクノロジーに応用する上で非常に重要である。ペグ化（PEGの共有的結合）は、例えば、抗原性または免疫原性のエピトープの遮蔽をもたらす。さらに、細網内皮系によるレセプター介在型取り込みを抑制し、タンパク質分解酵素による認識と分解を防止する（5）。タンパク質のペグ化は、腎臓濾過を低下させることによって、その生物利用能を高めることが分かっている。sp130（D1-D3）は、9個のシステイン（C）残基を含み、そのうちの8個がジスルフィド架橋に関与する（C28-C54、C48-C103、C134-C144、C172-C182）。最後のC301は、遊離のスルフヒドリル基を含むため、部位特異的なペグ化に適している。3倍モル過剰のmPEG-MAL（分子量20,000）（Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, USA）をsgp130（D1-D3）-PnにpH 7.2で付加してsgp130（D1-D3）の修飾を行った。この反応を室温で60分間行ってから、標準的な条件による最終的なゲル濾過工程で生成物を単離した。このタンパク質を、3倍モル過剰の分岐型mPEG（MAL）2（分子量20,000）（Nektar）とpH7.2、室温で90分間インキュベートして、ペグ化sgp130（D1-D3）-Hisを生成させた。次に、標準的な技術によって、この生成物をゲル濾過した。
【００５４】
（K）粘膜固有層単核細胞（LPMC）の単離および刺激
3 mMのL-グルタミン、10 mMのHEPES緩衝液、10μg／mlのゲンタマイシン、100 U／mlのペニシリン、100U／mlのストレプトマイシン、50μMの2-メルカプトエタノールおよび10％の熱不活性化FCSを加えたRPMI-1640からなる完全培地の中でLPMCを培養した。図に示すように、1から10μg／mlの濃度のsgp130Fc、中和IL-6R特異的抗体（ドイツ国キール大学教授であるRose-John博士より提供された）、sgp130PEGまたはsgp130TagPEGの存在下または非存在下で細胞を10μg／mlのC反応性タンパク質（Sigma）、50 ng／mlのホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）、および10μg／mlのフィトヘマグルチニン（PHA）（Sigma）によって刺激した。48時間後、ApoAlertアネキシンV-FITCアポトーシス検出キット（BD Bioscience社、ハイデルベルク,ドイツ）を用いて、アネキシンVとヨウ化プロピジウムで細胞を染色し、FACSによる分析を行った。
【００５５】
（L）増殖アッセイ法
増殖因子を除去するためにBAF／gp130細胞をPBSで入念に洗浄してから、サイトカインを含まない培地に再懸濁した。96ウエルプレートの1ウエルにつき5×103個の細胞を、サイトカインを入れて最終用量100μlにして、図に示すようにsgp130Fcまたはsgp130PEGまたはsgp130TagPEGの量を増加させながら68時間培養した後、0.25 mCiの［3H］-チミジンで4時間パルス標識した。細胞をガラスフィルター上に回収して、取り込まれた［3H］-チミジンをシンチレーション計測法によって測定した。
【００５６】
（M）ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ法
BAF31gp130細胞を、レポーター遺伝子プラスミドのpSTAT3-TA-Luc（BD Bioscience社、ハイデルベルク,ドイツ）およびpCMV-Lucによって同時形質転換して、24時間インキュベートした。そして、形質転換された細胞を、10μg／mlのsgp130Fc、sgp130PEGまたはsgp130TagPEGがそれぞれ存在するかしない中で、5 ng／mlのH-IL-6とともにさらに20時間インキュベートした。Promega社（マンハイム,ドイツ）から購入した二重ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（Dual Luciferase Reporter Gene Assay）を用い、製造業者の使用説明書に従って、MicroLumatPlus LB96Vマイクロプレート発光測定装置（EG&G Berthold, ウェルズリー, MA, USA）で測定してルシフェラーゼ活性の抽出および検出を行った。
【００５７】
（N）sgp130（D1-D3）.1およびsgp130（D1-D3）-Tagの発現プラスミド構築
標準的なプロトコールに従ったPCRによって、gp130のコード配列の70番目から966番目までの塩基（Leu 24からTyr 322までのアミノ酸に相当する（図2））を増幅することによって、gp130（D1-D3）.1のリガンド結合ドメインのクローニングを行った。pSVL-sgp130-Fc（2）を鋳型として採用した。得られたDNA断片を、1％アガロースゲル上で精製し、Qiagen MiniEluteキットを用いて単離し、適当な発現プラスミドにクローニングした。標識されたタンパク質を発現させるために、His（4-6）、FLAG、Step-Tag、GFP、GST、HA CBP、またはその他、抗体を利用できるエピトープなど、適当な標識を含むベクターを用いた。あるいは、所望の標識をsgp130（D1-D3）.1のc-DNAのすぐ後ろにクローニングした。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００５８】
（O）sgp130-Pn発現プラスミドの構築
製造業者の使用説明書に従って、対応する発現プラスミドを部位特異的変異誘発することによって、1個以上のシステイン残基を含むさまざまな長さ（Pn）のポリペプチドをsgp130のC末端に付加した。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００５９】
（P）vIL-6-His発現プラスミドの構築
単離されたばかりのヒトゲノムDNAを鋳型として使用して、PCRによってvIL-6のcDNAを増幅した（図3のコード配列）。vIL-6-HisをCOS-7細胞で発現させるために、vIL-6のcDNAを、ポリヒスチジン（His）タグの前で、適当な哺乳動物発現プラスミド、例えば、pcDNA3.1／myc-His、pEF1／myc-His、pUB6／V5-His（Invitrogen）、pQE-TriSystem（Qiagen）などの中に挿入した。vIL-6-Hisを細菌で発現させるために、vIL-6のcDNAを、ポリヒスチジンタグの前で、適当な原核生物発現ベクター、例えば、pQE60、pQE70（Qiagen）、pBAD／Myc-His（Invitrogen）、pET-3、pET-11、pCAL-c、pCAL-kc（Stratagene）などの中に挿入した。すべての構築物を制限酵素分解によって同定し、標準的な技術によって挿入配列の配列を確認した。
【００６０】
（Q）sgp130-Pnの精製（方法I）
ウイルスのインターロイキン-6（vIL-6）（4）は、さらにIL-6レセプター（IL-6R）を必要とせずにgp130に特異的結合することが分かっている（3）。vIL-6のこの相互作用を用いて、vIL-6-Hisアフィニティーカラムによってsgp130を精製した。精製された組換えVIL-6-Hisを以下のようにしてNi-NTAアガロースカラム（Qiagen）に結合させた。カラム材料は、5容積倍量50 mMのリン酸緩衝液（pH 7.5）、500 mM NaCl、および20 mMイミダゾール（平衡用緩衝液、EB）で平衡させた。vIL-6-Hisをカラムにかけて、未結合タンパク質を5容積倍量のEBで洗浄して除去した。sgp130-Pnを含むタンパク質懸濁液をカラムにかけ、続いて、そのカラムを10容積倍量のEBで洗浄した。最後に、クエン酸緩衝液（pH 1.4）でsgp130-Pnを溶出した。溶出液を直ちに中和して、モノQファーストタンパク質液体クロマトグラフィー（Pharmacia）によって精製してから、PBSに対して透析した。
【００６１】
（R）sgp130-Pnの精製（方法II）
gp130-PnおよびvIL-6-Hisをコードする原核生物発現プラスミドを、適当な細菌株、例えば、TOP10（Invitrogen）、XL1-Blue、BL21（DE3）（Stratagene）、M15［pREP4］、SG13009［pREP4］（Qiagen）などに同時形質移入した。形質転換から24時間後、1 mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）によってタンパク質生産を開始し、6時間後にタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物を、予め5容積倍量のEBで平衡にしておいたNi-NTAアガロースカラム上に負荷した。カラムを10容積倍量のEBで洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。最後にgp130-Pnを溶出させて、上記のようにして精製および透析した。
【００６２】
（S）sgp130-Tagの精製
vIL-6-Hisについて述べた技術と同じ技術によって、sgp130-Tag（His6の標識を有する）を精製した。His（4-6）、FLAG、Step-Tag、GFP、GST、HA CBP、またはその他、抗体を利用できるエピトープなど、別の標識の場合には、アガロースなどの基質上に固定した適当な抗体によってsgp130Tag分子を分離した。
【００６３】
（T）sgp130のペグ化
ここ数年、ポリエチレングリコール（PEG）によって生体高分子の共有的修飾についての興味の高まりが起きている。この種の修飾は、医薬およびバイオテクノロジーに応用する上で非常に重要である。ペグ化（PEGの共有的結合）は、例えば、抗原性または免疫原性のエピトープの遮蔽をもたらす。さらに、細網内皮系によるレセプター介在型取り込みを抑制し、タンパク質分解酵素による認識と分解を防止する（5）。タンパク質のペグ化は、腎臓濾過を低下させることによって、その生物利用能を高めることが分かっている。sp130は、9個のシステイン（C）残基を含み、そのうちの8個がジスルフィド架橋に関与する（C28-C54、C48-C103、C134-C144、C172-C182）。最後のC301は、遊離のスルフヒドリル基を含むため、部位特異的なペグ化に適している。3倍モル過剰のmPEG-MAL（分子量2,000）（Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, USA）をsgp130-PnにpH 7.2で付加してsgp130の修飾を行った。この反応を室温で60分間行ってから、標準的な条件による最終的なゲル濾過工程で生成物を単離した。このタンパク質を、3倍モル過剰のmPEG（MAL）2（分子量2,000）とpH7.2、室温で90分間インキュベートして、ペグ化sgp130Tagを生成させた。次に、標準的な技術によって、この生成物をゲル濾過した。
【００６４】
実施例2：sgp130PEGおよびsgp130TagPEGは、クローン病（CD）患者由来のLPMCに対するsIL-6Rの抗アポトーシス作用を阻害する。
IL-6Rに対する中和抗体は、CD患者由来の粘膜固有層T細胞におけるアポトーシスを誘導することができる（Atreyaら, 2000）。抗IL-6R mAbの作用は、大腸炎の3つの異なったモデル、すなわち、CD62L+ CD45RBhighCD4+T細胞によって再構築された重症複合型免疫不全症マウス、IL-10欠損マウス、およびトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）処理されたマウスでも実証された。すべての場合で、大腸炎の活性が、抗TNF mAb処理した後に観察されたレベルと同じレベルにまで下方制御された（Atreyaら, 2000）。この実験の目標は、本発明に係るsgp130PEGおよびsgp130TagPEGが、LPMCにおけるアポトーシスの誘導について、例えばsgp130Fcなどと同じ効率を示すか否かを明らかにすることであった。実施例1に記載した条件下、中和抗IL-6R抗体、sgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGの存在下でLPMCを培養した。FACS分析によって、アネキシンV陽性でヨウ化プロピジウム陰性の細胞をアポトーシス細胞と判定した。未処理の試料は、約60％のアポトーシス細胞を含んでいたが、抗IL-6R抗体、sgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGで処理すると、11％から16％までアポトーシス細胞が増加した。ペグ化していないsgp130二量体は効果が低く、分子の生物学的活性にとってペグ化が重要であることを示している（図4および8）。
【００６５】
実施例3：BAF／3細胞のIL-6／sIL-6R依存性増殖の阻害
IL-3依存性前駆B細胞株BAF／3はgp130を発現しないため、IL-6にもIL-6／IL-6Rにも応答できない。これに対し、ヒトgp130のcDNAで形質転換されたBAF／3細胞（BAF／gp130細胞）は、IL-3非存在下で、IL-6／IL-6Rまたはハイパー-IL-6（H-IL-6）に応答して増殖することができる。IL-6／IL-6R（図5Aおよび9A）またはH-IL-6（図5Bおよび9B）で刺激されたBAF／gp130をsgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGで量を増加させながら処理し、細胞増殖に対する両sgp130分子の効果を測定した。どちらの実験においても、sgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGの量を増加させると、［3H］-チミジンの取り込みが有意に低下する結果となった。しかし、7.5から10 ng／mlのsgp130Fcを細胞に投与すると、最大半量取り込みに達した（約7.500 cpmにおける点線）。これに対し、sgp130PEGおよびsgp130TagPEGの濃度が1から5 ng／mlのときに、同様の取り込みの低下が既に見られた。このことは、sgp130PEGおよびsgp130TagPEGによる処理が、sgp130Fcよりも1.5から3倍強く作用することを示している。さらに、パネルBでは、ペグ化されていないsgp130二量体を用いて、タンパク質の生物学的活性に対するペグ化の重要な役割を明らかにしている。
【００６６】
実施例4：sgp130PEGは、BAF／gp130細胞においてH-IL-6によって誘導されるSTAT3活性化を阻害する。
転写の潜在型細胞質転写因子シグナル伝達因子および活性化因子（STAT）3が、IL-6処理によっていくつかの異なった細胞型において活性化されることが知られている。STAT3の機能が、さまざまな細胞型において盛んに研究されている。これらには、肝癌細胞における急性期反応の誘導、Bリンパ球における増殖刺激、最終分化および増殖アレスチン単核細胞（growth arrestin monocytes）の活性化、および胚幹細胞の多分化能の維持などが含まれる（Levy and Lee, J. Clin. Invest. 109 （2002）, 1143における概説）。IL-6誘導型STAT3活性化がsgp130PEGまたはsgp130TagPEGによって影響を受けるか否かを判定するために、実施例1に記載されているように、pSTAT3-TA-LucによってBAF／gp130細胞を形質転換した。24時間後、10μg／mlのsgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGそれぞれの存在下または非存在下において細胞を5 ng／mlのH-IL-6でさらに20時間処理した。細胞を抽出して、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。H-IL-6だけで処理した細胞における相対的ルシフェラーゼ活性を100％とした（図6Aおよび10A）。これに対して、STAT3活性は、それぞれ、26％（sgp130Fc）、18％（sgp130PEG）、および19％（sgp130TagPEG）に低下した。第2の実験において、細胞をsgp130Fc、sgp130PEG、またはsgp130TagPEGの量をそれぞれ増加させながら処理して、上記した作用の用量依存性を測定した（図6Bおよび10B）。sgp130PEGおよびsgp130TagPEGを2.5μg／mlの濃度で用いて、STAT3の最大半量活性化を測定したが、これと同じ効果は、約7.5μg／mlの濃度のsgp130Fcで見られた。ここでも、前に示したように、sgp130PEGおよびsgp130TagPEGの効率は、sgp130Fcで見られる効率よりも約2〜3倍高かった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、sgp130PEGおよびsgp130 HisPEGの概略図である。
【図２】図２は、ヒトgp130（sgp130（D1-D3））の最初の3つの細胞外ドメイン（D1〜D3）の塩基配列、およびそれに対応してコードされるタンパク質の配列である。
【図３】図３は、ヒトヘルペスウイルス8型（HHV8）由来のウイルスインターロイキン-6（vIL-6）の塩基配列およびそれに対応してコードされるタンパク質の配列である。
【図４】図４は、クローン病患者由来の粘膜固有層単核細胞（LPMC）におけるアポトーシスの解析結果を示す。LPMCは、実施例1に記載されているようにして単離され、中和抗IL-6抗体、sgp130Fc、およびsgp130PEGのそれぞれ10μg／mlの存在下または非存在下で48時間培養された。アネキシンVおよびヨウ化プロピジウムで細胞を染色した後FACS分析を行って、アポトーシスを測定した。アポトーシスした細胞（アネキシンV陽性およびヨウ化プロピジウム陰性）の割合を図示した。
【図５】図５は、（A）5 ng／mlのハイパーIL-6（H-IL-6）または（B）100 ng／mlのIL-6＋50 ng／mlのsIL-6R、および次第に量を増加させたsgp130Fcまたはsgp130PEGに応答したBAF／gp130細胞の増殖を示す。増殖は、シンチレーションカウンター内で［3H］-チミジンの取り込みを検出して測定した。
【図６】図６は、A）H-IL-6処理後のSTAT3作動によるレポーター遺伝子プラスミドの活性化、およびsgp130Fcまたはsgp130PEG（各10μg／ml）によるSTAT3の活性化の阻害、B）sgp130Fcまたはsgp130PEGのいずれかによる、H-IL-6に誘導にされたSTAT3活性化の濃度依存性下方制御を示す。
【図７】図７は、ヒトgp130（sgp130（D1-D3）.1）の最初の3つの細胞外ドメイン（D1〜D3）の塩基配列、およびそれに対応するタンパク質の配列を示す。
【図８】図８のA）は、クローン病患者由来の粘膜固有層単核細胞（LPMC）におけるアポトーシスの解析結果を示す。LPMCは、実施例1に記載されているようにして単離され、中和抗IL-6抗体、sgp130Fc、およびsgp130PEGのそれぞれ10μg／mlの存在下または非存在下で48時間培養された。アネキシンVおよびヨウ化プロピジウムで細胞を染色した後FACS分析を行って、アポトーシスを測定した。アポトーシスした細胞（アネキシンV陽性およびヨウ化プロピジウム陰性）の割合を図示した。図８のB）は、抗IL-6抗体、sgp130Fcおよびsgp130PEGの代わりにsgp130二量体またはsgp130TagPEGを用いた以外は、図4Aに記載した実験と同じ実験を行ったものを示す。
【図９】図９は、（A）5 ng／mlのハイパーIL-6（H-IL-6）または（B）100 ng／mlのIL-6＋50 ng／mlのsIL-6R、および次第に量を増加させたsgp130TagPEGまたはsgp130二量体のいずれかに応答したBAF／gp130細胞の増殖を示す。増殖は、シンチレーションカウンター内で［3H］-チミジンの取り込みを検出して測定した。
【図１０】図１０は、A）H-IL-6処理後のSTAT3作動によるレポーター遺伝子プラスミドの活性化、およびsgp130二量体またはsgp130TagPEG（各10μg／ml）によるSTAT3の活性化の阻害、B）sgp130二量体またはsgp130TagPEGのいずれかによる、H-IL-6に誘導にされたSTAT3活性化の濃度依存性下方制御を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つの可溶性gp130分子を含むポリペプチド二量体であって、該可溶性gp130分子の少なくとも一方がポリエチレングリコールに共有結合している、ポリペプチド二量体。
【請求項２】
前記可溶性gp130分子の各々がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項１記載のポリペプチド二量体。
【請求項３】
前記2つの可溶性gp130分子の少なくとも一方が、図2または3に示したアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載のポリペプチド二量体。
【請求項４】
前記2つの可溶性gp130分子の両方が、図2または3に示したアミノ酸配列を含む、請求項３記載のポリペプチド二量体。
【請求項５】
2つの可溶性gp130分子が1個以上のジスルフィド架橋を介して互いに結合している、請求項１〜４いずれか記載のポリペプチド二量体。
【請求項６】
2つの可溶性gp130分子が分岐型ポリエチレングリコールを介して互いに結合している、請求項１〜４記載のポリペプチド二量体。
【請求項７】
2つの可溶性gp130分子がフレキシブルなペプチドリンカーを介して互いに結合している、請求項１〜４いずれか記載のポリペプチド二量体。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載のポリペプチド二量体または該二量体の単量体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８記載のポリヌクレオチドを含有してなる発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含有してなる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の宿主細胞を培養すること、該宿主細胞または培養物からポリペプチド単量体または二量体を回収すること、および該単量体または二量体をペグ化することを含む、請求項１〜７いずれか記載のポリペプチド二量体の作製方法。
【請求項１２】
請求項１〜７いずれか記載のポリペプチド二量体を含有してなる医薬組成物。
【請求項１３】
骨再吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患、細菌またはウイルス感染の処置または予防用医薬組成物の調製のための請求項１〜７いずれか記載のポリペプチド二量体の使用。
【請求項１】
2つの可溶性gp130分子を含むポリペプチド二量体であって、該可溶性gp130分子の少なくとも一方がポリエチレングリコールに共有結合している、ポリペプチド二量体。
【請求項２】
前記可溶性gp130分子の各々がポリエチレングリコールに共有結合している、請求項１記載のポリペプチド二量体。
【請求項３】
前記2つの可溶性gp130分子の少なくとも一方が、図2または3に示したアミノ酸配列を含む、請求項１または２記載のポリペプチド二量体。
【請求項４】
前記2つの可溶性gp130分子の両方が、図2または3に示したアミノ酸配列を含む、請求項３記載のポリペプチド二量体。
【請求項５】
2つの可溶性gp130分子が1個以上のジスルフィド架橋を介して互いに結合している、請求項１〜４いずれか記載のポリペプチド二量体。
【請求項６】
2つの可溶性gp130分子が分岐型ポリエチレングリコールを介して互いに結合している、請求項１〜４記載のポリペプチド二量体。
【請求項７】
2つの可溶性gp130分子がフレキシブルなペプチドリンカーを介して互いに結合している、請求項１〜４いずれか記載のポリペプチド二量体。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載のポリペプチド二量体または該二量体の単量体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８記載のポリヌクレオチドを含有してなる発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含有してなる宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の宿主細胞を培養すること、該宿主細胞または培養物からポリペプチド単量体または二量体を回収すること、および該単量体または二量体をペグ化することを含む、請求項１〜７いずれか記載のポリペプチド二量体の作製方法。
【請求項１２】
請求項１〜７いずれか記載のポリペプチド二量体を含有してなる医薬組成物。
【請求項１３】
骨再吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患、細菌またはウイルス感染の処置または予防用医薬組成物の調製のための請求項１〜７いずれか記載のポリペプチド二量体の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５２６７４５（Ｐ２００７−５２６７４５Ａ）
【公表日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６０３５（Ｐ２００６−５１６０３５）
【出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６７８７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３３８３
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５０５４７０９６０）コナリス リサーチ インスティチュート アーゲー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２３日（２００４．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６７８７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１３３８３
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５０５４７０９６０）コナリス リサーチ インスティチュート アーゲー (6)
【Ｆターム（参考）】
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