薬剤代謝に影響を及ぼすＣＹＰ３Ａ４遺伝子における多型およびその使用
ＣＹＰ３Ａ４関連障害に関する被験体のリスク要因を予測するための方法には、被験体の核酸試料中のＳＮＰの対立遺伝子状態を検出する工程が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本出願は、その開示全体が本明細書に援用される、２００９年３月２６日出願の米国仮特許出願６１／１６３，５５５の優先権を請求する。
【０００２】
政府支援
[0002]本発明は、米国衛生研究所によって授与される助成金番号ＮＩＨ ＮＩＡＩＤ（１Ｒ２１ＡＩ０７４３９９）の元で政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
[0003]本出願は、ＥＦＳウェブを通じて提出されており、そしてその全体が本明細書に援用される配列表を含有する。２０１０年３月２３日に作製されたＡＳＣＩＩコピーは、６０４ ５０８０６ ＳＥＱＬＩＳＴ ＯＳＵＲＦ−０９０３２．ｔｘｔと名付けられており、そしてサイズは３４，６６９バイトである。
【背景技術】
【０００４】
[0004]チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素は、内因性および生体異物化合物を代謝する。ＣＹＰ３Ａ４はＣＹＰ３Ａサブファミリーに属し、そして最も豊富なＣＹＰ酵素である。ＣＹＰ３Ａ４は、現在使用されている薬剤すべての４５〜６０％を代謝するのに関与し（１）、こうした薬剤には、コレステロールを低下させるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であるいくつかのスタチンが含まれる。しかし、ＣＹＰ３Ａ４活性は、広い個体間変動を示し、薬剤反応および毒性に影響を及ぼす。遺伝的要因が、ＣＹＰ３Ａ４活性の個体間相違の主な寄与因子であると考えられる（２）が、現在知られるＣＹＰ３Ａ４多型は、観察される変動性を説明しえない。
【０００５】
[0005]ＣＹＰ３Ａ４においてアミノ酸配列を変化させる遺伝子変異体は稀である（＜１％）（ｗｗｗ．ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ．ｋｉ．ｓｅ／ｃｙｐ３ａ４．ｈｔｍ）。５’隣接領域中のより一般的な変異体、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂが、薬剤反応および疾患と関連付けられてきている（３、４）が、結果は一貫しておらず（５〜７）、そしてその機能には議論の余地があるままである。（３、８〜１０）。さらに、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂは隣接するＣＹＰ３Ａ５と連鎖不平衡（ＬＤ）にあり（１１）、ＣＹＰ３Ａ５は、関連する臨床表現型のいずれかを説明した可能性もある、類似であるが、通常はより豊富でないＣＹＰ酵素をコードする（１２）。
【０００６】
[0006]さらに疑われるＣＹＰ３Ａ４多型には、ＴＧＴ挿入（１３）、エンハンサー領域ＳＮＰ（ｒｓ２７３７４１８）（１４）、およびイントロン７ ＳＮＰ（ｒｓ４６４６４３７）（１５）が含まれる。レポーター遺伝子アッセイによって、ＴＧＴ挿入およびｒｓ２７３７４１８の影響が示唆されるが、ＴＧＴのｉｎ ｖｉｖｏ重要性は解決されないままであり（１３）、一方、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡおよび酵素活性に関する結果は、ｒｓ２７３７４１８に関して矛盾した（１４）。イントロン７ ＳＮＰ ｒｓ４６４６４３７は、ＣＹＰ３Ａ４タンパク質／酵素活性と関連していることが見出されたが、男性由来の肝臓においてのみであった（１５）。したがって、ＣＹＰ３Ａ４における機能的多型の役割は不確かなままである。
【０００７】
[0007]一塩基多型（ＳＮＰ）は、疾患感受性または進行を予測するためのバイオマーカーとして、または薬剤療法を含む個別化された療法の指針として、有用である。
【０００８】
[0008]欠けているのは、特定の患者が特定の療法剤に反応性である可能性を予測するための、そして特にＣＹＰ３Ａ４剤が感受性であるかまたは抵抗性であろう多型を同定するためのツールである。やはり欠けているのは、こうした療法剤に対する患者の感受性および抵抗性に影響を及ぼす遺伝的要因をプロファイリングするためのツールである。こうしたツール、および生じる遺伝子発現プロファイルは、特定の薬剤に対する患者の治療反応を予測し、そして有効性、不都合な薬剤反応、こうした患者の化学的感受性または化学的抵抗性に関する予測可能性を増加させて、患者にとって最適な治療措置の設計を可能にするか、または早期臨床試験において薬剤開発を可能にして、劣った代謝者における予期されない毒性を回避するであろう。
【０００９】
[0009]本発明のさらなる利点、目的、および特徴が、続く説明に一部示され、そして一部は、以下を調べることによって一般の当業者には明らかとなるであろうし、または本発明の実施から学ぶことも可能である。本発明の目的および利点は、付随する請求項に特に指摘されるように、理解されそして達成されることも可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0010]第一の側面において、例えば有効性および／または不都合な薬剤反応を含む、ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物に対する被験体の反応を予測するための方法を本明細書に提供する。該方法には、被験体の核酸試料において、１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出する工程を含み、多型が：ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；またはｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；の１またはそれより多くの多型である、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態が、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するものである、前記方法を提供する。
【００１１】
[0011]別の側面において、ＣＹＰ３Ａ４関連障害の予後バイオマーカーに関して、被験体をスクリーニングする方法であって、被験体の核酸試料において、１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出する工程を含み、多型が：ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；またはｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；の１またはそれより多くの多型である、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態が、ＣＹＰ３Ａ４関連障害の予後転帰を予測するものである、前記方法を本明細書に提供する。
【００１２】
[0012]特定の態様において、方法は、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発展させるリスクを予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む。
【００１３】
[0013]特定の態様において、方法は、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害のより重度かまたはより重度でない表現型を有するかどうか予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む。
【００１４】
[0014]特定の態様において、方法は、被験体における障害の予後転帰を予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む。
【００１５】
[0015]特定の態様において、方法は、治療に対する被験体の反応、投薬量および／または毒性を予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む。
【００１６】
[0016]特定の態様において、ＣＹＰ３Ａ４関連障害は代謝関連障害を含む。
【００１７】
[0017]特定の態様において、ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物は、スタチン薬剤を含む、肝臓で代謝される１以上の薬剤を含む。
【００１８】
[0018]特定の態様において、ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物は：ＣＹＰ３Ａ４阻害剤またはＣＹＰ３Ａ４増進剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）の１以上を含む。
【００１９】
[0019]特定の態様において、多型は、イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む。
【００２０】
[0020]特定の態様において、多型は、ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］を含み、ここで被験体における該多型の存在は、ＣＹＰ３Ａ４関連障害のリスク増加を予測するものである。
【００２１】
[0021]特定の態様において、多型のマイナー対立遺伝子の存在は、ターゲット組織におけるＣＹＰ３Ａ４のより低いレベルを予測するものであり、そしてＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ発現減少と関連する。
【００２２】
[0022]別の側面において、被験体の核酸試料における１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出するためのアッセイを含むキットであって、多型が：ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；またはｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；の１またはそれより多くの多型である、前記キットを、本明細書に提供する。
【００２３】
[0023]特定の態様において、キットは、アッセイ結果と、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発展させるリスクを相関させるための指示をさらに含む。
【００２４】
[0024]特定の態様において、キットは、アッセイ結果と、障害に関する被験体の予後転帰を相関させるための指示をさらに含む。
【００２５】
[0025]特定の態様において、キットは、アッセイ結果と、被験体における特定の薬剤治療の成功または失敗の可能性を相関させるための指示をさらに含む。
【００２６】
[0026]別の側面において、ＣＹＰ３Ａ４関連障害に関与するターゲット遺伝子における機能的多型を発見するための方法であって：ｉ）ターゲット遺伝子を発現しているターゲット組織の試料を提供し；ｉｉ）ａ）ターゲット遺伝子の転写領域中の２つの対立遺伝子各々から生じるｍＲＮＡの相対量を定量的に測定し、そしてｂ）他方の対立遺伝子に対して一方の対立遺伝子のｍＲＮＡ発現を比較して、対立遺伝子ｍＲＮＡ発現不均衡（ＡＥＩ）比を得ることによって、ターゲット遺伝子のＡＥＩを測定し；そしてｉｉｉ）ＡＥＩ比を、多型を含有する領域に関してターゲット遺伝子をスキャンするための表現型として用いる、ここで、ＡＥＩ比および多型の間に有意な関連がある場合、多型がＣＹＰ３Ａ４関連障害に関するバイオマーカーとして働きうる機能的多型であることを示す工程を含む、前記方法を、本明細書に提供する。
【００２７】
[0027]特定の態様において、多型はエクソン領域にある。
【００２８】
[0028]特定の態様において、多型はＳＮＰである。
【００２９】
[0029]特定の態様において、バイオマーカーは、遺伝子転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡスプライシング、またはその組み合わせに影響を及ぼす。
【００３０】
[0030]特定の態様において、ターゲット遺伝子は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子座である。
【００３１】
[0031]別の側面において、イントロン６ ＳＮＰに関するスクリーニングを含む、スタチン薬剤の代謝を決定するための方法を、本明細書に提供する。
【００３２】
[0032]別の側面において、イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）に関するスクリーニングを含む、スタチン薬剤の代謝を決定するための方法を、本明細書に提供する。
【００３３】
[0033]別の側面において、イントロン６ ＳＮＰを含む、ＣＹＰ３Ａ４における変動性を検出するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。
【００３４】
[0034]別の側面において、イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４における変動性を検出するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。
【００３５】
[0035]別の側面において、イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の投薬必要量を決定するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。
【００３６】
[0036]別の側面において、イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の反応を決定するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。
【００３７】
[0037]別の側面において、イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の毒性を決定するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。特定の態様において、療法剤はスタチン薬剤である。特定の態様において、療法剤は抗癌薬剤である。特定の態様において、療法剤は、狭く定義された投薬措置を有する薬剤である。
【００３８】
[0038]別の側面において、臨床的薬理ゲノミクススクリーニングの方法であって：ａ）本明細書記載の少なくとも１以上のバイオマーカーの存在に関して試料をスクリーニングし、ここで、１以上のバイオマーカーの存在が、患者が改変された代謝を有する指標となり；そしてｂ）スクリーニングにおいて、ランダムな方式またはあらかじめ決定された方式で、参照対照を含む、ここで、参照対照は、改変された代謝を伴う患者の指標となるバイオマーカーを含むＤＮＡを含む工程を含み、参照対照中、１またはそれより多くの薬剤代謝遺伝子における１またはそれより多くのバイオマーカーの存在が検出されると、試料中の１またはそれより多くの薬剤代謝遺伝子において、同じ１またはそれより多くのバイオマーカーを検出するのにスクリーニングが有効であることが検証される、前記方法を、本明細書に提供する。
【００３９】
[0039]別の側面において、個別化医学的療法であって：ｉ）ターゲット患者集団由来の試料に対して、本明細書記載のスクリーニング法を行って、ＣＹＰ３Ａ４または薬剤代謝に関連する他の遺伝子における１またはそれより多くの突然変異を含む遺伝子プロファイルを持つ患者を同定し；そしてｉｉ）工程ｉ）において、特定の遺伝子プロファイルを所持すると同定された患者を、同定された遺伝子プロファイルに特有の関心対象の療法で治療する工程を含む、前記方法を、本明細書に提供する。
【００４０】
[0040]特定の態様において、遺伝子プロファイルは、改変された代謝を持つ患者の指標である。
【００４１】
[0041]特定の態様において、改変された代謝は：劣った代謝者、中間代謝者、高代謝者、および超迅速代謝者からなる群より選択される。
【００４２】
[0042]特定の態様において、遺伝子プロファイルは、患者における関心対象の療法の有効性の指標となる。
【００４３】
[0043]特定の態様において、遺伝子プロファイルは、遺伝的障害を持つ患者の指標となる。
【００４４】
[0044]特定の態様において、遺伝子プロファイルは、特定の療法で治療してはならない患者の指標となる。
【００４５】
[0045]特定の態様において、関心対象の療法が：癌、心臓疾患、神経学的障害、精神障害、自己免疫障害、および代謝障害からなる群より選択される、疾患または障害を治療するために用いられる。
【００４６】
[0046]特定の態様において、１以上の突然変異はＣＹＰ３Ａ４における突然変異を含み、そして関心対象の療法は、患者への少なくとも１つのスタチンの投与を含む。
【００４７】
[0047]別の側面において、参照対照として使用するのに適した単離ゲノムＤＮＡを生成するのに使用可能な細胞を同定するための方法であって：ａ）特定の療法に対する患者の反応の予測される度合いを決定する遺伝子素因に関連する、志願者核酸試料中の１以上の多型を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列の存在に関してヒト志願者を前向きに（prospectively）スクリーニングし；ここで多型は：ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；またはｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；の１またはそれより多くの多型であり、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態が、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するものである；ｂ）関心対象の１以上の突然変異を所持する志願者由来の細胞を単離し；そしてｃ）複数の有効なゲノムスクリーニングアッセイに細胞由来のＤＮＡを供する工程を含む、前記方法を、本明細書に提供する。
【００４８】
図面の簡単な説明
[0048]特許または出願ファイルは、カラーで作成される少なくとも１つの図を含有してもよい。カラーの図（単数または複数）を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、要望があり、そして必要な料金の支払いがあれば、特許局によって提供されるであろう。
【００４９】
[0049]本発明は、本出願の一部を形成する、以下の詳細な説明、図面および配列説明からより完全に理解可能である。本明細書に添付される配列説明および配列表は、３７ＣＦＲ§§１．８２１〜１．８２５に示されるような特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列開示に適用される規則にしたがう。配列説明は本明細書に援用される３７ＣＦＲ§§１．８２１〜１．８２５に定義されるようなアミノ酸の３文字コードを含有する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】[0050]多重マーカーＳＮＰ（図３）（図１Ａ）またはイントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］のみ（図１Ｂ）を用いたプライマー伸張アッセイ（ＳＮａＰｓｈｏｔ）を用いて測定した、ヒト肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４の対立遺伝子ｍＲＮＡ／ｈｎＲＮＡ発現比。対立遺伝子ＲＮＡ比を、１に設定したｇＤＮＡ比に対して標準化した。データは、単一または多重マーカーＳＮＰを用いた２〜３回の測定の平均に相当する。矢印は、ＡＥＩ比が１とは有意に異なる（Ｐ＜０．０５）試料を示す。パネルＢ中のすべての対立遺伝子ＲＮＡ比は、１とは有意に異なる（Ｄｕｎｎｅｔ事後検定を伴うＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）。
【図２】[0051]図２Ａ〜２Ｂ：ヒト肝臓試料におけるＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベル（図２Ａ）および酵素活性（図２Ｂ）のボックスプロット、イントロン６ ＳＮＰ遺伝子型によってグループ化。
【図３】[0052]ＡＥＩ測定に用いたマーカーＳＮＰの位置およびｒｓ番号。イントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］を赤で示す。
【図４】[0053]遺伝子型および対立遺伝子ＲＮＡ発現不均衡（ＡＥＩ）間の関連。調整Ｐ＜０．０５で、イントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］のみが、そしてはるかにより弱い強度でＳＮＰ ｒｓ２２４６７０９がＡＥＩと関連した。
【図５】[0054]ＣＹＰ３Ａ４における１３の多型に関するＬＤプロット。詳細なＳＮＰ情報を表１に提供する。ＳＮＰ６は、イントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］であり、ＳＮＰ ７ ｒｓ２２４６７０９とは部分的にしかＬＤでない。
【図６】[0055]図６Ａ〜６Ｄ：ヒト肝臓における４つの転写因子およびＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現間の相関。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
[0056]本発明は、ここで、本発明の特定の態様に時に言及しながら記載されるであろう。しかし、本発明は、異なる型で具体化可能であり、そして本明細書に示す態様に限定されると見なされてはならない。これらの態様はむしろ、本開示が徹底的でそして完全であり、そして本発明の範囲を当業者に完全に伝えるであろうように提供される。
【００５２】
[0057]本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が本明細書に援用される。すべての特許、特許出願（およびそこから生じるいかなる特許、ならびに対応するいかなる刊行外国特許出願も）、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の寄託番号および関連データ、ならびに本説明全体で言及される刊行物は、本明細書に援用される。しかし、本明細書に援用されるいかなる文書も、本発明を解説するかまたは開示するとは、明らかに認められない。
【００５３】
[0058]本発明は、本発明の態様の以下の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することによってより容易に理解されうる。しかし、本方法、化合物および組成物を開示し、そして説明する前に、本発明が特定の方法、特定の細胞タイプ、特定の宿主細胞または特定の状態などに限定されず、これは、こうしたものが、もちろん、多様であることが可能であるためであり、そして多くの修飾および変動が当業者には明らかとなるであろうことが理解されるものとする。本明細書に用いる専門用語は、特定の態様を記載する目的のみのためのものであり、そして限定すると意図されないこともまた理解されるものとする。
【００５４】
[0059]広い側面において、本発明者らは、ここで、ヒト剖検肝臓において、対立遺伝子ｈｎＲＮＡ／ｍＲＮＡ発現を測定することによって、ＣＹＰ３Ａ４における一般的な多型を発見した。検出可能な対立遺伝子ＲＮＡ発現不均衡（ＡＥＩ）は、ＲＮＡ発現、プロセシング、または代謝回転に影響を及ぼす、ＣＹＰ３Ａ４中のシス作用性制御因子の直接の測定値である。
【００５５】
[0060]本明細書に記載する結果は、ＣＹＰ３Ａ４のイントロン６ ＳＮＰが、観察される対立遺伝子ｍＲＮＡ発現パターンを説明し、そしてヒト肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４酵素活性と相関する一方、以前示唆されていた多型がまったく影響を持たないことを示す。
【００５６】
[0061]さらに、イントロン６ ＳＮＰは、ＣＡＤ患者のコホートにおいて、コレステロール管理のために服用される安定スタチン投薬と、そして療法ＬＤＬ目標の達成と、有意に関連した。
【実施例】
【００５７】
[0062]実施例Ｉ
[0063]方法：
[0064]組織試料。１３３の肝臓剖検／生検試料を、オハイオ州立大学施設審査委員会（ＯＳＵ ＩＲＢ）によって認可されたプロトコルの元で、Ｔｈｅ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｍｉｄｗｅｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから得た。
【００５８】
[0065]患者。被験体は、オハイオ州立大学冠動脈疾患研究の参加者であり、患者はＰＣＩコールを必要とする症候性心臓血管疾患でＯＳＵ心臓センターを受診している。脂質管理のため、安定用量のスタチンを服用していると立証される２７５人の患者を選択した。登録および試験条件は、ＯＳＵ ＩＲＢによって認可されており、各患者からは書面のインフォームドコンセントが得られている。研究集団は、オハイオ州のコロンバス地域および周辺の田舎地方の人口動態を反映する。
【００５９】
[0066]ＤＮＡおよびＲＮＡ調製。組織または血液試料からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製を記載されるように行った（１６〜１８）。
【００６０】
[0067]ＳＮａＰｓｈｏｔを用いた、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡにおける対立遺伝子比の定量的分析。詳細な方法が公表されている（１６、１７）。簡潔には、マーカーＳＮＰ周囲のＤＮＡまたはＲＮＡ（ｃＤＮＡに変換した後）の断片をＰＣＲ増幅した後、多型部位をターゲットとするプライマー伸張アッセイ（ＳＮａＰｓｈｏｔ）を行った。３’ＵＴＲ領域またはイントロン領域のいずれかに位置する７つのマーカーＳＮＰを用いて、少なくとも１つのマーカーＳＮＰに関してヘテロ接合性である、１３３の肝臓のうち７３において、成熟ｍＲＮＡ（３’ＵＴＲマーカー）またはｈｎＲＮＡ（イントロンマーカー）の対立遺伝子比を測定した。１に標準化されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）対立遺伝子比が内部対照として働き；いずれの被験体も、まとまりからの有意な偏差によって検出可能な、ｇＤＮＡコピー数変動を示さなかった。１からの対立遺伝子ＲＮＡ比の偏差（ＤＮＡ比に対する標準化後）、すなわち対立遺伝子発現不均衡（ＡＥＩ）は、ｍＲＮＡ発現レベルに影響を及ぼす、ＣＹＰ３Ａ４におけるシス作用性多型の存在を示す。
【００６１】
[0068]遺伝子型決定：表１に示すように、多重ＳＮａＰｓｈｏｔアッセイ（１９）または対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲ（２０）を用い、肝臓試料由来のｇＤＮＡにおいて、ＣＹＰ３Ａ４中の１３のＳＮＰ（７つのマーカーＳＮＰを含む）を遺伝子型決定した。
【００６２】
【表１】
【００６３】
[0069]表２に示すように、２７５人の患者から、ｇＤＮＡにおいて、ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ５中の７つのＳＮＰを遺伝子型決定した。
【００６４】
【表２】
【００６５】
[0070]ＰＣＲ条件およびプライマー配列を表３、表４、表５に示す。
【００６６】
[0071]ヒト肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４ならびに転写因子ＰＸＲ、ＲＸＲａ、ＣＡＲ、およびＨＮＦ４ａの定量的ｍＲＮＡ分析： ＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡを内部対照として用い、遺伝子特異的プライマー（２２）（表３、表４、表５）およびＳＹＢＲグリーン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリアルタイムＰＣＲ（１６、２１）を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。
【００６７】
[0072]表３：遺伝子型決定またはＡＥＩアッセイ。「ＰＣＲプライマー配列およびアッセイ条件」と示す列は、提示順に、それぞれ、配列番号１〜４２を開示し、そして「プライマー伸張プライマーおよび条件」と示す列は、提示順に、それぞれ、配列番号４３〜５６を開示する。
【００６８】
【表３−１】
【００６９】
【表３−２】
【００７０】
【表３−３】
【００７１】
[0073]表４： ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ４Ａ５ ＳＮＰ遺伝子型決定に関する多重ＰＣＲおよびＳｎａｐｓｈｏｔアッセイ。「ＰＣＲプライマー配列」と示す列は、提示順に、それぞれ、配列番号５７〜６８を開示し、そして「プライマー伸張プライマー」と示す列は、提示順に、それぞれ、配列番号６９〜７５を開示する。
【００７２】
【表４】
【００７３】
[0074]表５：プライマーおよび配列決定プライマー。ＰＣＲプライマーは、提示順に、それぞれ、配列番号７６〜９５として開示され、そして配列決定プライマーは、提示順に、それぞれ、配列番号９６〜１５１として開示される。
【００７４】
【表５−１】
【００７５】
【表５−２】
【００７６】
【表５−３】
【００７７】
【表５−４】
【００７８】
[0075]ＣＹＰ３Ａの配列決定：転写開始部位の〜１０，０００ｂｐ上流から最後のエクソンまでの領域（ＡＦ２８０１０７の５００１３〜８９４１０、全長３９，３９７ｂｐ）を、対立遺伝子特異的ＲＮＡ発現を示す２つの肝臓試料において配列決定した。ＰＣＲおよび配列決定プライマーを図１６−表１０に示す。
【００７９】
[0076]ＣＹＰ３Ａ４酵素活性アッセイ：記載されるように（２３）、プローブとしてテストステロンを用いて、肝臓ミクロソーム由来のＣＹＰ３Ａ４活性を定量化した。
【００８０】
[0077]データ分析：別個の変数および遺伝子型の間の関連を、Ｈｅｌｉｘ−Ｔｒｅｅソフトウェア（Ｇｏｌｄｅｎ Ｈｅｌｉｘ、モンタナ州ボーズマン）を用いて分析した。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗを用いて、ＬＤプロットを生成した。ＳＰＳＳまたはＭｉｎｉｔａｂソフトウェアを用いて、ＲＮＡ発現、酵素活性、およびスタチン用量必要性に対する遺伝子型の影響を試験するために、重回帰分析を用いた。
【００８１】
[0078]結果：
[0079]ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼすシス作用性ＣＹＰ３Ａ４多型に関するスキャニング：
[0080]３つの頻繁な３’ＵＴＲマーカーＳＮＰを用いて、ヒト肝臓において、ＣＹＰ３Ａ４の対立遺伝子ｍＲＮＡ発現を測定した（図３）。ＣＹＰ３Ａ４が高発現であるため、４つのイントロンＳＮＰもまた、ＣＹＰ３Ａ４ ｈｎＲＮＡの対立遺伝子発現を測定するのに利用した（２４）。スクリーニングした１３３の肝臓試料のうち、７３が７つのマーカーＳＮＰの少なくとも１つに関してヘテロ接合性であり、そしてしたがって、ＡＥＩ測定に適していた。７３の試料のうち、７つが、強い対立遺伝子発現不均衡（ＡＥＩ）を示すと同定され、メインの対立遺伝子がマイナーな対立遺伝子より少なく発現され（０．２〜０．５倍）、これはイントロンおよびエクソンマーカーＳＮＰの両方で観察された（図１Ａ）。したがって、ＣＹＰ３Ａ４中のシス作用性多型（単数または複数）は、ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡレベル両方に等しく影響を及ぼす。
【００８２】
[0081]関与する多型（単数または複数）を検索するため、１３のＣＹＰ３Ａ４多型（表１）を遺伝子型決定し、そして対立遺伝子ＲＮＡ比および遺伝子型間の関連を試験した。
【００８３】
[0082]イントロン６に位置する単一ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）は、ＡＥＩと非常に有意な関連を示し（調整ｐ値９．１２ｘ１０−１０）（図４）、一方、別のＳＮＰ ｒｓ２２４６７０９もまた、中程度の有意性（Ｐ＝０．０３４）をスコアリングし、これはおそらくイントロン６ ＳＮＰと部分的な連鎖不平衡（ＬＤ）にある結果であった（図５）。
【００８４】
[0083]先に同定されたプロモーターＳＮＰ ｒｓ２７４０５７４、ＴＧＴ挿入、ｒｓ２７３７４１８、およびｒｓ４６４６４３７を含む他のＳＮＰは、有意な関連を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。これらの結果は、イントロン６ ＳＮＰが機能性であるか、または機能性ＳＮＰと非常にＬＤであることを示した。これをさらに試験するため、イントロン６ ＳＮＰをマーカーとして用いて、そしてイントロン６ ＳＮＰに関してのみヘテロ接合性である３つを含めて、１０のヘテロ接合性試料において、ＡＥＩを測定した。１０の試料はすべて、ＡＥＩを示し、対立遺伝子比（マイナーＴ対立遺伝子／メジャーＣ対立遺伝子）は０．１６〜０．６２の範囲であり（図１Ｂ）、男性および女性の間で相違はなかった（Ｐ＝０．３１４）。したがって、イントロン６ ＳＮＰのマイナーＴ対立遺伝子は、ｍＲＮＡ／ｈｎＲＮＡレベル減少と関連している（メジャーＣ／マイナーＴの逆対立遺伝子ｍＲＮＡ比は１．６〜６．２５）。マイナーＴ対立遺伝子は、ｒｓ２２４６７０９との低いＬＤを除いて、もっぱら、メインのＣＹＰ３Ａ４ハプロタイプに連鎖している（図１２−表６；ＬＤプロット図５）。
【００８５】
[0084]表６：ハプロタイプ構造、および肝臓において試験された１３のＳＮＰの概算頻度。詳細なＳＮＰ情報を表１に提供する。ハプロタイプ５において、イントロン６ ＳＮＰ（左から６番目）のマイナーＴ対立遺伝子は、メジャー・ハプロタイプ１（太字）にもっぱら連鎖しており、一方、他のＳＮＰいずれとも検出可能なＬＤを持たない。
【００８６】
【表６】
【００８７】
[0085]２つのＡＥＩ陽性試料中の全ＣＹＰ３Ａ４遺伝子座の配列決定は、どちらの試料においてもヘテロ接合性でなければならない他の多型いずれかが関係しているとは見なされず、イントロン６ ＳＮＰが機能性であることが示された。
【００８８】
[0086]イントロン６ ＳＮＰは、ヒト肝臓において、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベルおよび酵素活性の減少と関連する：
[0087]９３の肝臓試料において、総ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡレベルは、コーカソイドおよびアフリカ系アメリカ人の間で異ならなかったが、報告されるように（２５）、女性は男性よりも１．３倍より高いレベルを有した（９５％ＣＬ １．００〜１．６８、両側Ｐ＝０．０４２）。イントロン６ ＳＮＰのメインのＣＣ遺伝子型を持つ肝臓は、ＣＴ／ＴＴキャリアーよりも１．７１倍（９５％信頼区間（ＣＩ）１．０６〜２．７６）高いレベルを有し（ｔ検定、両側Ｐ＝０．０２８）、遺伝子型および性別の間に関係はなかった。ＣＹＰ３Ａ４転写因子（２６〜２９）の影響を試験するため、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ、ＮＲ１１２）、恒常的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ、ＮＲ１１３）、レチノイド受容体（ＲＸＲａ）、および肝細胞核因子（ＨＮＦ４α１Ａ）に関してもまた、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ発現は、報告されるように（２６〜２９）、すべての４つの転写因子と正に相関した（図６Ａ〜６Ｄ）。
【００８９】
[0088]年齢および転写因子に関して調整した後、イントロン６ ＳＮＰは、ＣＹＰ３Ａ４発現と有意に関連したままであり（ＣＴ／ＴＴよりもＣＣが１．６７倍（９５％ＣＩ １．１１〜２．４６、ｐ＝０．０１４）（図２Ａ））、遺伝子型の影響が転写因子とは独立であることが示された。
【００９０】
[0089]年齢（＜１５歳は小児、＞１５歳は成人）、性別、および誘導剤（フェノバルビタール、カルバマゼピン、ニフェジピンおよびデキサメタゾン）の使用に関して調整した後、２３の肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４酵素活性（テストステロン６βヒドロキシル化）は、ＣＴキャリアーよりもイントロン６ ＳＮＰ ＣＣに関して、２．４６倍高かった（両側ｐ＝０．０３７、９５％ＣＩ １．０７〜５．６２）（図２Ｂ）。
【００９１】
[0090]対立遺伝子ｍＲＮＡ発現と一致して、これらの結果は、イントロン６ ＳＮＰがｉｎ ｖｉｖｏでＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを減少させることを示す。対照的に、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ、ＴＧＴ挿入、ｒｓ２７３７４１８、およびｒｓ４６４６４３７は、総ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベルまたは酵素活性にまったく影響を及ぼさなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００９２】
[0091]イントロン６ ＳＮＰ（Ｃ＞Ｔ）は、スタチン用量必要性および脂質管理転帰と関連する：
[0092]あらかじめ決定されたＬＤＬ目標に到達するのに必要なＣＹＰ３Ａ４が代謝するスタチンの投薬量として、イントロン６ ＳＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ効果を評価した。安定用量のアトルバスタチン、ロバスタチン、およびシンバスタチン、または非ＣＹＰ３Ａ４基質ロスバスタチンおよびプラバスタチンを投与されている２７５人の患者において、イントロン６ ＳＮＰを遺伝子型決定した。ＣＹＰ３Ａ４（＊１Ｂ ｒｓ２７４０５７４、ＴＧＴ挿入、＊１７ ｒｓ４９８７１６１、および＊１８ ｒｓ２８３７１７５９）およびＣＹＰ３Ａ５（＊３ ｒｓ７７６７４６および＊５ ｒｓ４１３０３３４３）（図１１−表５）中のさらなるＳＮＰもまた遺伝子型決定した。３つのＳＮＰがＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡（ＨＷＥ）から逸脱し、これは、コーカソイドおよびアフリカ系アメリカ人集団において、異なる対立遺伝子頻度があるためであり、集団中で別個に分析すると、すべてのＳＮＰがＨＷＥにしたがう（表７）。
【００９３】
【表７】
【００９４】
[0093]イントロン６ ＳＮＰの対立遺伝子頻度は〜５％であり、ＮＣＢＩデータベースで報告されるものと一致する。ＣＹＰ３Ａ４ ＳＮＰ＊１７および＊１８の不在は、報告される対立遺伝子低頻度と一致する。
【００９５】
[0094]２３７人の患者のサブセットは、５ｍｇ〜８０ｍｇの範囲の用量のＣＹＰ３Ａ４が代謝するスタチン（アトルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン）を投与されていた。スタチンを一緒に、または別個に評価して、有効性相違を説明した。すべてのスタチンを投与されている患者を、低用量（２０ｍｇ以下、平均１６±５ｍｇ）および高用量（４０ｍｇ以上、平均５３±１９ｍｇ）（Ｐ＜０．００１）群に分けた。ベースライン特性および脂質レベルは、最大トリグリセリドおよび安定ＨＤＬレベル（Ｐ＜０．０５）を除いて、低用量および高用量群間で異ならなかった（表８）。表８は、ＣＹＰ３Ａ４が代謝するスタチン（アトルバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチン）を投与されている患者のベースライン特性を示す。
【００９６】
【表８】
【００９７】
[0095]マイナーイントロン６ ＳＮＰ Ｔ対立遺伝子は、より低い安定スタチン用量と有意に関連した（オッズ比＝３．８０、Ｐ＝０．００５）。他のＳＮＰはいずれも有意ではなかった。表９は、スタチン用量必要性およびコレステロール管理転帰とＣＹＰ３Ａ４／３Ａ５ ＳＮＰ遺伝子型の関連を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００９８】
【表９】
【００９９】
[0096]重回帰分析は、イントロン６ Ｔ対立遺伝子キャリアーに関する安定スタチン用量が、最大脂質レベルに関する調整後、非Ｔキャリアーに関するものに対してわずか０．２７であった（Ｐ＝０．０１９）ことを示す（表１０）。患者をアトルバスタチンおよびシンバスタチンに対して別個に分析した際、類似の結果が得られた（表１０）。したがって、イントロン６ ＳＮＰは、スタチン用量必要性の減少と関連する。
【０１００】
【表１０】
【０１０１】
[0097]コレステロール管理転帰とイントロン６ ＳＮＰの関連を試験するため、入手可能なＬＤＬデータを伴う１９８人の患者を、成人治療パネルＩＩＩ指針（３０）にしたがって、コレステロール目標に到達したもの（ＬＤＬコレステロール＜７０ｍｇ／ｄｌ；または７１〜９９ｍｇ／ｄｌであって、低リスク／中程度のリスク；または１００〜１２９ｍｇ／ｄｌであって、低リスク）および到達しなかったもの（＞１３０ｍｇ／ｄｌ；または１００〜１２９ｍｇ／ｄｌであって、中程度／高リスク；または７１〜９９ｍｇ／ｄｌであって、高リスク）に分けた。イントロン６ ＳＮＰのＴ対立遺伝子を所持する個体は、非Ｔキャリアーよりも、目標のコレステロール管理に到達する可能性が３．５倍高かった（Ｐ＝０．０３９）（表２）。対照的に、他のＳＮＰは、こうした関連を示さなかった。
【０１０２】
[0098]実施例Ｉの考察：
[0099]実施例Ｉは、イントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］が、ヒト肝臓において、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ発現および酵素活性減少に有意に関連しており、そしてさらに、完全に対立遺伝子ｍＲＮＡ発現における相違を説明することを示す。
【０１０３】
[00100]イントロン６ ＳＮＰは、ＣＹＰ３Ａ４のメイン・ハプロタイプ中に包埋されており、いかなる他のＳＮＰとも実質的なＬＤを欠くため、ハプロタイプタグＳＮＰを用いた関連研究（１４、１５）による検出を逃れてきた。プロモーター＊１Ｂ、エンハンサーＴＧＴ挿入、エンハンサーｒｓ２７３７４１８、およびイントロン７ ＳＮＰ ｒｓ４６４６４３７を含む、以前報告されたＣＹＰ３Ａ４ ＳＮＰはいずれも、対立遺伝子ｍＲＮＡ発現、ｍＲＮＡ、および酵素活性に検出可能な影響を持たず、ＣＹＰ３Ａ４変動性に対するこれらのＳＮＰの寄与に反論する。
【０１０４】
[00101]調べたコホート中のイントロン６ ＳＮＰの対立遺伝子頻度は〜５％であり、〜１０％のヘテロ接合性を生じた。先に報告された対立遺伝子頻度（３５）は、アフリカ系アメリカ人、中国人、およびコーカソイドに関して、それぞれ、０．０４３、０．０４３、および０．０８３であり、イントロン６ ＳＮＰ対立遺伝子頻度が、多様な民族群において、４〜８％の範囲であることが示される。
【０１０５】
[00102]イントロンＳＮＰがｍＲＮＡレベルを改変する一般的な分子機構は、ＲＮＡ発現、伸長、スプライシング、または成熟に影響を及ぼすことである。対立遺伝子比は、エクソンおよびイントロンマーカーＳＮＰの両方に関してヘテロ接合体である肝臓において、ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡで類似であったため、スプライシングおよびｍＲＮＡ代謝回転は、主な機構からは排除されうる。さらに、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡレベルは、ヒト肝臓において、並行して、多様であることが示され（３６）、発現およびプロセシングの初期の事象であることを支持する。例えば、イントロン６ ＳＮＰは、発生期ＲＮＡのフォールディング、そしてしたがって伸長に影響を及ぼしうる。
【０１０６】
[00103]インシリコＲＮＡフォールディング分析によって、イントロン６ ＳＮＰは、ループからステムへの構造変化を促進することが示されており（未提示）、これはおそらく、制御タンパク質の結合を妨害する。
【０１０７】
[00104]マイナー対立遺伝子の発現減少と一致して、イントロン６ ＳＮＰは、ＣＹＰ３Ａ４によって主に代謝されるスタチン薬剤（アトルバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチン）の安定用量必要性の減少と有意に関連した。スタチン用量は、望ましいＬＤＬに到達するよう用量設定されているため、代謝減少を伝達するイントロン６ ＳＮＰ Ｔ対立遺伝子のキャリアーでは、より低い用量が達成可能である。本発明者らの考えを支持して、薬物動態研究によって、ＣＹＰ３Ａ４活性阻害は、シンバスタチンおよびロバスタチンの血漿濃度を劇的に増加させることが示され（３１、３２）、ＣＹＰ３Ａ４活性がＣＹＰ３Ａ４が代謝するスタチンの血清濃度の主な決定要因であることが示唆される。
【０１０８】
[00105]イントロン６ Ｔ対立遺伝子を所持する患者はまた、ＬＤＬ目標に到達する可能性がより高いという発見を、正常ＣＹＰ３Ａ４代謝を持つ被験体における不十分な投薬量の用量設定に、またはＴ対立遺伝子キャリアーにおける用量間のスタチンレベルにおける変動がより少ないことに、関連づけることも可能である。先に同定されたＣＹＰ３Ａ４プロモーターＳＮＰ（＊１Ｂ、−３９２Ａ＞Ｇ）は、シンバスタチン治療の脂質低下有効性および安全性に関連せず（３３）、このプロモーターＳＮＰが肝臓ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼさないことを示す本明細書の結果と一致する。さらに、現在の結果は、ＣＹＰ３Ａ５におけるＳＮＰが、スタチン用量または治療転帰に影響を及ぼさず、ＣＹＰ３Ａ５がスタチン代謝に大きな役割を果たさないという報告と一致する（３４）。したがって、イントロン６ ＳＮＰは、スタチン療法に影響を及ぼすことが示された唯一のＣＹＰ３Ａ多型である。
【０１０９】
[00106]ＣＹＰ３Ａ４活性は、かなりの個体間変動を示すが、新規薬剤は、しばしば、ＣＹＰ３Ａ４による代謝に関してターゲティングされ、ＣＹＰ２Ｄ６などの他の薬剤代謝性ＣＹＰ酵素のヌル突然変異から生じる問題を回避する。
【０１１０】
[00107]本明細書に示す結果は、ＣＹＰ３Ａ４の変動性の一部が、イントロン６ ＳＮＰによって説明可能であることを示す。この発見の臨床的関連性は、その排出に関してＣＹＰ３Ａ４に依存する２つのスタチン薬剤の設定用量に対するイントロン６ ＳＮＰの影響によって立証される。ＣＹＰ３Ａ４は、すべての臨床的に用いられる薬剤のおよそ半分の代謝に関与するため、現在、本発明者らは本明細書において、イントロン６ ＳＮＰは、狭く定義された投薬措置を持つ抗癌剤を含めて、多数の薬剤の投薬必要性、反応、および毒性に影響を及ぼすと考えている。
【０１１１】
[00108]したがって、ＣＹＰ３Ａ４イントロン６ ＳＮＰは、臨床実施において、そして薬剤発見および発展において、価値あるバイオマーカーである。
【０１１２】
[00109]実施例ＩＩ
[00110]細胞から単離されたＤＮＡを、特にヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子に関して、陽性ヒトゲノム参照対照（すなわち突然変異が存在する）または陰性対照（すなわち正常または野生型に相当する）として用いてもよい。これは、これらの遺伝子に関して、正確でそして信頼可能な臨床診断試験を確実にしうる。
【０１１３】
[00111]例えば、臨床試験中に行われる遺伝子型決定アッセイにおいて、参照対照を用いてもよい。参照対照に、療法に反応しない患者に典型的な遺伝子変異が含まれる場合、参照対照を使用すると、非反応者が適切に同定され、そして非反応者に対する研究療法が無効であることに関するデータが適切に同定されるように、用いる遺伝子型決定アッセイが信頼性を持って行われるのが確実になるよう補助される。同様に、参照対照に、正常患者とは異なる速度で薬剤を代謝する患者（すなわち突然変異体チトクロムＰ４５０遺伝子を持つ患者）に典型的な遺伝子変異が含まれる場合、参照対照を使用すると、これらの患者が適切に同定され、そして適切に投薬され、そして不都合な薬剤反応または無効な療法が回避されるように、遺伝子変異の有効性が確実になるよう補助される。
【０１１４】
[00112]参照対照はまた、患者治療においても使用可能である。臨床試験におけるその使用と同様に、適切な療法が開始される前に、患者の状態が悪化しないように、有効な療法が時間に制約がある方式で同定されることが必須である。適切な投薬措置を選択する事もまた必須である。
【０１１５】
[00113]したがって、本発明の１つの側面は、特定の療法に反応する遺伝的素因に関して、複数の患者を試験する方法に関する。この側面において、１以上の参照対照を、既知の予期される結果を持つ「試料」として試験する。これらの対照には、療法に反応しない素因を示す患者（陽性対照）に関連する遺伝子変異体が含まれてもよいし、または療法に反応する素因を示す患者に関連する正常／野生型変異体（陰性対照）が含まれてもよい。
【０１１６】
[00114]したがって、診断アッセイが正確に実施されていることを確実にし、そして薬剤療法に対する耐性または減少した代謝状態を伝達する遺伝子変異を同定するため、試験実験室は参照対照を用いてもよい。非反応者が適切に同定されるのを確実にするため、試験実験室には、アッセイ、そしてしたがって患者の結果の有効性を決定するため、各アッセイ中に参照対照が含まれてもよい。参照対照をランダムにまたはあらかじめ決定された間隔で用いてもよい。同じ観点で、試験実験室は、実験室スタッフの正確さを評価するためのパネルとして参照対照を用いてもよい。
【０１１７】
[00115]したがって、本発明の別の側面は、適切な投薬措置を設定可能であるように、迅速なまたは緩慢になった代謝を示す遺伝子素因に関して、複数の患者を試験する方法に関する。この側面において、試験する１以上の試料は、「迅速な」または「緩慢な」代謝者である素因を有する患者と関連する遺伝子変異を含む、参照対照である。
【０１１８】
[00116]これらの多型は、例えば、「劣った」代謝者、「中間の」代謝者、「高」代謝者、および「超迅速」代謝者などの集団において、多数の表現型で発現される。特定の状況において、「高」代謝者は、少なくとも１つ、そして２より多くない正常な機能性対立遺伝子を有してもよく；「中間の」代謝者は、活性が低下した１つの対立遺伝子および１つのヌル対立遺伝子を所持してもよく；そして「劣った」代謝者は、酵素活性の完全な喪失を生じる、２つの突然変異体対立遺伝子を所持してもよい。特定の状況において、超迅速代謝者は、多数コピーの機能性対立遺伝子を所持し、そしてしたがって過剰な酵素活性を生じてもよい。したがって、特定の薬剤を投与する場合、「劣った」代謝者は、薬剤から有意な利益を得ずに、むしろ、標準用量を投与された際に、過剰な薬剤反応および副作用を経験する可能性もある。すなわち、代謝産物が活性療法部分である場合、「劣った」代謝者は療法的反応を示さない可能性もある。他方、「超迅速」代謝者は、標準的用量に反応するのに失敗しうる。
【０１１９】
[00117]試料をプレスクリーニングするための多様な方法を用いてもよい。例えば、生物学的試料をプレスクリーニングして、試料が関心対象の突然変異を有することを確実にしてもよい。患者集団を多様な要因に基づいてプレスクリーニングして、試料サイズを、突然変異体を含む個体の同定に必要な最小限にしてもよい。関心対象の突然変異を含む１以上の試料を同定する、試料に対する最初のゲノムスクリーニングを実行した後、これらの突然変異を持つ患者は、さらなる生物学的材料を得るため、場合によって召還されうる。場合によって、この材料を完全に配列決定して、関心対象の突然変異の存在を確認してもよい。生物学的材料は不死化されていてもよく、したがって、該材料は、参照対照の安定で、要望に応じた供給源を提供してもよく、あるいは、細胞はそれ自体、参照対照であってもよい。当該技術分野によく確立されたプロトコルを用いて、限定されるわけではないが、組織、体液（例えば血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、精液、膣分泌物、リンパ液、脳脊髄液または粘膜分泌物）の核酸を含有する試料いずれかの中に存在する、ヒトゲノムＤＮＡ、個々の細胞または供給源の核酸を含有するこうした供給源の抽出物、ならびに細胞内構造、例えばミトコンドリアまたは葉緑体などを用いてもよい。
【０１２０】
[00118]特定の態様において、医学的状態または疾患に関して診断可能であるか、または被験体を医学的状態または疾患に罹患しやすくしうる、１またはそれより多くの遺伝子配列の存在に関して、プレスクリーニングしようとするヒトから、核酸が得られている。患者集団のプレスクリーニングの代替法として、関心対象の遺伝子配列に関して、一般的に利用可能な細胞培養をスクリーニングして、そして次いで、将来、連続して供給するために、細胞クローンを拡大し、そして保存してもよい。
【０１２１】
[00119]いくつかの既知のゲノムアッセイ法があり、該アッセイ法のため、試験において参照対照を用いてもよく、ここで大部分は、関心対象のＳＮＰを含んでもまたは含まなくてもよいＤＮＡ試料とプライマーをハイブリダイズさせることを伴う。診断プライマーおよび／またはプローブにタグを付けて、迅速な同定を可能にしてもよい。ハイブリダイゼーションが起こったら、ＤＮＡを増幅してもよく、そしてタグ付けされたプライマーおよび／またはプローブを検出する。検証されたプライマーを用いて、参照対照の有効性を確認してもよい。参照対照が有効とされたら、これらを参照対照として商業的に入手可能なアッセイで用いてもよく、そして特定の突然変異の存在または非存在を決定する、これらのまたは他のアッセイで使用するために設計されるプライマーを確認するのに用いてもよい。したがって、本明細書に例示的なアッセイ法を記載する一方、本発明はこうしたものに限定されない。
【０１２２】
[00120]本発明は、多様なそして好ましい態様に言及して記載されてきているが、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、多様な変化を行ってもよく、そしてその要素を同等物で置換してもよいことが、当業者には理解されなければならない。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の解説に対して、特定の状況または材料を適応させるよう、多くの修飾を行ってもよい。したがって、本発明は、本発明を実施するために意図される、本明細書に開示する特定の態様に限定されず、本発明には、請求項の範囲内に属するすべての態様が含まれると意図される。
【０１２３】
[00121]本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、こうした参考文献が本発明に対して先行技術として利用可能であることの承認ではない。本明細書に言及するいかなる刊行物も本明細書に援用される。本明細書に含まれている文書、条例、材料、デバイス、物品等のいかなる議論も、単に、本発明の背景を提供する目的のためである。あらゆるこれらの事項が本出願の各請求項の優先日以前に存在していたために、先行技術の基礎の一部を形成するか、または本発明が関連する分野において、共通の一般的な知識であったことの承認であるとは解釈されないものとする。
【０１２４】
参考文献
【０１２５】
【化１−１】
【０１２６】
【化１−２】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本出願は、その開示全体が本明細書に援用される、２００９年３月２６日出願の米国仮特許出願６１／１６３，５５５の優先権を請求する。
【０００２】
政府支援
[0002]本発明は、米国衛生研究所によって授与される助成金番号ＮＩＨ ＮＩＡＩＤ（１Ｒ２１ＡＩ０７４３９９）の元で政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
[0003]本出願は、ＥＦＳウェブを通じて提出されており、そしてその全体が本明細書に援用される配列表を含有する。２０１０年３月２３日に作製されたＡＳＣＩＩコピーは、６０４ ５０８０６ ＳＥＱＬＩＳＴ ＯＳＵＲＦ−０９０３２．ｔｘｔと名付けられており、そしてサイズは３４，６６９バイトである。
【背景技術】
【０００４】
[0004]チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素は、内因性および生体異物化合物を代謝する。ＣＹＰ３Ａ４はＣＹＰ３Ａサブファミリーに属し、そして最も豊富なＣＹＰ酵素である。ＣＹＰ３Ａ４は、現在使用されている薬剤すべての４５〜６０％を代謝するのに関与し（１）、こうした薬剤には、コレステロールを低下させるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であるいくつかのスタチンが含まれる。しかし、ＣＹＰ３Ａ４活性は、広い個体間変動を示し、薬剤反応および毒性に影響を及ぼす。遺伝的要因が、ＣＹＰ３Ａ４活性の個体間相違の主な寄与因子であると考えられる（２）が、現在知られるＣＹＰ３Ａ４多型は、観察される変動性を説明しえない。
【０００５】
[0005]ＣＹＰ３Ａ４においてアミノ酸配列を変化させる遺伝子変異体は稀である（＜１％）（ｗｗｗ．ｃｙｐａｌｌｅｌｅｓ．ｋｉ．ｓｅ／ｃｙｐ３ａ４．ｈｔｍ）。５’隣接領域中のより一般的な変異体、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂが、薬剤反応および疾患と関連付けられてきている（３、４）が、結果は一貫しておらず（５〜７）、そしてその機能には議論の余地があるままである。（３、８〜１０）。さらに、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂは隣接するＣＹＰ３Ａ５と連鎖不平衡（ＬＤ）にあり（１１）、ＣＹＰ３Ａ５は、関連する臨床表現型のいずれかを説明した可能性もある、類似であるが、通常はより豊富でないＣＹＰ酵素をコードする（１２）。
【０００６】
[0006]さらに疑われるＣＹＰ３Ａ４多型には、ＴＧＴ挿入（１３）、エンハンサー領域ＳＮＰ（ｒｓ２７３７４１８）（１４）、およびイントロン７ ＳＮＰ（ｒｓ４６４６４３７）（１５）が含まれる。レポーター遺伝子アッセイによって、ＴＧＴ挿入およびｒｓ２７３７４１８の影響が示唆されるが、ＴＧＴのｉｎ ｖｉｖｏ重要性は解決されないままであり（１３）、一方、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡおよび酵素活性に関する結果は、ｒｓ２７３７４１８に関して矛盾した（１４）。イントロン７ ＳＮＰ ｒｓ４６４６４３７は、ＣＹＰ３Ａ４タンパク質／酵素活性と関連していることが見出されたが、男性由来の肝臓においてのみであった（１５）。したがって、ＣＹＰ３Ａ４における機能的多型の役割は不確かなままである。
【０００７】
[0007]一塩基多型（ＳＮＰ）は、疾患感受性または進行を予測するためのバイオマーカーとして、または薬剤療法を含む個別化された療法の指針として、有用である。
【０００８】
[0008]欠けているのは、特定の患者が特定の療法剤に反応性である可能性を予測するための、そして特にＣＹＰ３Ａ４剤が感受性であるかまたは抵抗性であろう多型を同定するためのツールである。やはり欠けているのは、こうした療法剤に対する患者の感受性および抵抗性に影響を及ぼす遺伝的要因をプロファイリングするためのツールである。こうしたツール、および生じる遺伝子発現プロファイルは、特定の薬剤に対する患者の治療反応を予測し、そして有効性、不都合な薬剤反応、こうした患者の化学的感受性または化学的抵抗性に関する予測可能性を増加させて、患者にとって最適な治療措置の設計を可能にするか、または早期臨床試験において薬剤開発を可能にして、劣った代謝者における予期されない毒性を回避するであろう。
【０００９】
[0009]本発明のさらなる利点、目的、および特徴が、続く説明に一部示され、そして一部は、以下を調べることによって一般の当業者には明らかとなるであろうし、または本発明の実施から学ぶことも可能である。本発明の目的および利点は、付随する請求項に特に指摘されるように、理解されそして達成されることも可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0010]第一の側面において、例えば有効性および／または不都合な薬剤反応を含む、ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物に対する被験体の反応を予測するための方法を本明細書に提供する。該方法には、被験体の核酸試料において、１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出する工程を含み、多型が：ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；またはｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；の１またはそれより多くの多型である、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態が、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するものである、前記方法を提供する。
【００１１】
[0011]別の側面において、ＣＹＰ３Ａ４関連障害の予後バイオマーカーに関して、被験体をスクリーニングする方法であって、被験体の核酸試料において、１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出する工程を含み、多型が：ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；またはｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；の１またはそれより多くの多型である、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態が、ＣＹＰ３Ａ４関連障害の予後転帰を予測するものである、前記方法を本明細書に提供する。
【００１２】
[0012]特定の態様において、方法は、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発展させるリスクを予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む。
【００１３】
[0013]特定の態様において、方法は、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害のより重度かまたはより重度でない表現型を有するかどうか予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む。
【００１４】
[0014]特定の態様において、方法は、被験体における障害の予後転帰を予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む。
【００１５】
[0015]特定の態様において、方法は、治療に対する被験体の反応、投薬量および／または毒性を予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む。
【００１６】
[0016]特定の態様において、ＣＹＰ３Ａ４関連障害は代謝関連障害を含む。
【００１７】
[0017]特定の態様において、ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物は、スタチン薬剤を含む、肝臓で代謝される１以上の薬剤を含む。
【００１８】
[0018]特定の態様において、ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物は：ＣＹＰ３Ａ４阻害剤またはＣＹＰ３Ａ４増進剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）の１以上を含む。
【００１９】
[0019]特定の態様において、多型は、イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む。
【００２０】
[0020]特定の態様において、多型は、ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］を含み、ここで被験体における該多型の存在は、ＣＹＰ３Ａ４関連障害のリスク増加を予測するものである。
【００２１】
[0021]特定の態様において、多型のマイナー対立遺伝子の存在は、ターゲット組織におけるＣＹＰ３Ａ４のより低いレベルを予測するものであり、そしてＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ発現減少と関連する。
【００２２】
[0022]別の側面において、被験体の核酸試料における１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出するためのアッセイを含むキットであって、多型が：ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；またはｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；の１またはそれより多くの多型である、前記キットを、本明細書に提供する。
【００２３】
[0023]特定の態様において、キットは、アッセイ結果と、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発展させるリスクを相関させるための指示をさらに含む。
【００２４】
[0024]特定の態様において、キットは、アッセイ結果と、障害に関する被験体の予後転帰を相関させるための指示をさらに含む。
【００２５】
[0025]特定の態様において、キットは、アッセイ結果と、被験体における特定の薬剤治療の成功または失敗の可能性を相関させるための指示をさらに含む。
【００２６】
[0026]別の側面において、ＣＹＰ３Ａ４関連障害に関与するターゲット遺伝子における機能的多型を発見するための方法であって：ｉ）ターゲット遺伝子を発現しているターゲット組織の試料を提供し；ｉｉ）ａ）ターゲット遺伝子の転写領域中の２つの対立遺伝子各々から生じるｍＲＮＡの相対量を定量的に測定し、そしてｂ）他方の対立遺伝子に対して一方の対立遺伝子のｍＲＮＡ発現を比較して、対立遺伝子ｍＲＮＡ発現不均衡（ＡＥＩ）比を得ることによって、ターゲット遺伝子のＡＥＩを測定し；そしてｉｉｉ）ＡＥＩ比を、多型を含有する領域に関してターゲット遺伝子をスキャンするための表現型として用いる、ここで、ＡＥＩ比および多型の間に有意な関連がある場合、多型がＣＹＰ３Ａ４関連障害に関するバイオマーカーとして働きうる機能的多型であることを示す工程を含む、前記方法を、本明細書に提供する。
【００２７】
[0027]特定の態様において、多型はエクソン領域にある。
【００２８】
[0028]特定の態様において、多型はＳＮＰである。
【００２９】
[0029]特定の態様において、バイオマーカーは、遺伝子転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡスプライシング、またはその組み合わせに影響を及ぼす。
【００３０】
[0030]特定の態様において、ターゲット遺伝子は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子座である。
【００３１】
[0031]別の側面において、イントロン６ ＳＮＰに関するスクリーニングを含む、スタチン薬剤の代謝を決定するための方法を、本明細書に提供する。
【００３２】
[0032]別の側面において、イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）に関するスクリーニングを含む、スタチン薬剤の代謝を決定するための方法を、本明細書に提供する。
【００３３】
[0033]別の側面において、イントロン６ ＳＮＰを含む、ＣＹＰ３Ａ４における変動性を検出するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。
【００３４】
[0034]別の側面において、イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４における変動性を検出するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。
【００３５】
[0035]別の側面において、イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の投薬必要量を決定するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。
【００３６】
[0036]別の側面において、イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の反応を決定するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。
【００３７】
[0037]別の側面において、イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の毒性を決定するためのバイオマーカーを、本明細書に提供する。特定の態様において、療法剤はスタチン薬剤である。特定の態様において、療法剤は抗癌薬剤である。特定の態様において、療法剤は、狭く定義された投薬措置を有する薬剤である。
【００３８】
[0038]別の側面において、臨床的薬理ゲノミクススクリーニングの方法であって：ａ）本明細書記載の少なくとも１以上のバイオマーカーの存在に関して試料をスクリーニングし、ここで、１以上のバイオマーカーの存在が、患者が改変された代謝を有する指標となり；そしてｂ）スクリーニングにおいて、ランダムな方式またはあらかじめ決定された方式で、参照対照を含む、ここで、参照対照は、改変された代謝を伴う患者の指標となるバイオマーカーを含むＤＮＡを含む工程を含み、参照対照中、１またはそれより多くの薬剤代謝遺伝子における１またはそれより多くのバイオマーカーの存在が検出されると、試料中の１またはそれより多くの薬剤代謝遺伝子において、同じ１またはそれより多くのバイオマーカーを検出するのにスクリーニングが有効であることが検証される、前記方法を、本明細書に提供する。
【００３９】
[0039]別の側面において、個別化医学的療法であって：ｉ）ターゲット患者集団由来の試料に対して、本明細書記載のスクリーニング法を行って、ＣＹＰ３Ａ４または薬剤代謝に関連する他の遺伝子における１またはそれより多くの突然変異を含む遺伝子プロファイルを持つ患者を同定し；そしてｉｉ）工程ｉ）において、特定の遺伝子プロファイルを所持すると同定された患者を、同定された遺伝子プロファイルに特有の関心対象の療法で治療する工程を含む、前記方法を、本明細書に提供する。
【００４０】
[0040]特定の態様において、遺伝子プロファイルは、改変された代謝を持つ患者の指標である。
【００４１】
[0041]特定の態様において、改変された代謝は：劣った代謝者、中間代謝者、高代謝者、および超迅速代謝者からなる群より選択される。
【００４２】
[0042]特定の態様において、遺伝子プロファイルは、患者における関心対象の療法の有効性の指標となる。
【００４３】
[0043]特定の態様において、遺伝子プロファイルは、遺伝的障害を持つ患者の指標となる。
【００４４】
[0044]特定の態様において、遺伝子プロファイルは、特定の療法で治療してはならない患者の指標となる。
【００４５】
[0045]特定の態様において、関心対象の療法が：癌、心臓疾患、神経学的障害、精神障害、自己免疫障害、および代謝障害からなる群より選択される、疾患または障害を治療するために用いられる。
【００４６】
[0046]特定の態様において、１以上の突然変異はＣＹＰ３Ａ４における突然変異を含み、そして関心対象の療法は、患者への少なくとも１つのスタチンの投与を含む。
【００４７】
[0047]別の側面において、参照対照として使用するのに適した単離ゲノムＤＮＡを生成するのに使用可能な細胞を同定するための方法であって：ａ）特定の療法に対する患者の反応の予測される度合いを決定する遺伝子素因に関連する、志願者核酸試料中の１以上の多型を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列の存在に関してヒト志願者を前向きに（prospectively）スクリーニングし；ここで多型は：ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；またはｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；の１またはそれより多くの多型であり、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態が、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するものである；ｂ）関心対象の１以上の突然変異を所持する志願者由来の細胞を単離し；そしてｃ）複数の有効なゲノムスクリーニングアッセイに細胞由来のＤＮＡを供する工程を含む、前記方法を、本明細書に提供する。
【００４８】
図面の簡単な説明
[0048]特許または出願ファイルは、カラーで作成される少なくとも１つの図を含有してもよい。カラーの図（単数または複数）を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、要望があり、そして必要な料金の支払いがあれば、特許局によって提供されるであろう。
【００４９】
[0049]本発明は、本出願の一部を形成する、以下の詳細な説明、図面および配列説明からより完全に理解可能である。本明細書に添付される配列説明および配列表は、３７ＣＦＲ§§１．８２１〜１．８２５に示されるような特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列開示に適用される規則にしたがう。配列説明は本明細書に援用される３７ＣＦＲ§§１．８２１〜１．８２５に定義されるようなアミノ酸の３文字コードを含有する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】[0050]多重マーカーＳＮＰ（図３）（図１Ａ）またはイントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］のみ（図１Ｂ）を用いたプライマー伸張アッセイ（ＳＮａＰｓｈｏｔ）を用いて測定した、ヒト肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４の対立遺伝子ｍＲＮＡ／ｈｎＲＮＡ発現比。対立遺伝子ＲＮＡ比を、１に設定したｇＤＮＡ比に対して標準化した。データは、単一または多重マーカーＳＮＰを用いた２〜３回の測定の平均に相当する。矢印は、ＡＥＩ比が１とは有意に異なる（Ｐ＜０．０５）試料を示す。パネルＢ中のすべての対立遺伝子ＲＮＡ比は、１とは有意に異なる（Ｄｕｎｎｅｔ事後検定を伴うＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０５）。
【図２】[0051]図２Ａ〜２Ｂ：ヒト肝臓試料におけるＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベル（図２Ａ）および酵素活性（図２Ｂ）のボックスプロット、イントロン６ ＳＮＰ遺伝子型によってグループ化。
【図３】[0052]ＡＥＩ測定に用いたマーカーＳＮＰの位置およびｒｓ番号。イントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］を赤で示す。
【図４】[0053]遺伝子型および対立遺伝子ＲＮＡ発現不均衡（ＡＥＩ）間の関連。調整Ｐ＜０．０５で、イントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］のみが、そしてはるかにより弱い強度でＳＮＰ ｒｓ２２４６７０９がＡＥＩと関連した。
【図５】[0054]ＣＹＰ３Ａ４における１３の多型に関するＬＤプロット。詳細なＳＮＰ情報を表１に提供する。ＳＮＰ６は、イントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］であり、ＳＮＰ ７ ｒｓ２２４６７０９とは部分的にしかＬＤでない。
【図６】[0055]図６Ａ〜６Ｄ：ヒト肝臓における４つの転写因子およびＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現間の相関。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
[0056]本発明は、ここで、本発明の特定の態様に時に言及しながら記載されるであろう。しかし、本発明は、異なる型で具体化可能であり、そして本明細書に示す態様に限定されると見なされてはならない。これらの態様はむしろ、本開示が徹底的でそして完全であり、そして本発明の範囲を当業者に完全に伝えるであろうように提供される。
【００５２】
[0057]本明細書に言及するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が本明細書に援用される。すべての特許、特許出願（およびそこから生じるいかなる特許、ならびに対応するいかなる刊行外国特許出願も）、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の寄託番号および関連データ、ならびに本説明全体で言及される刊行物は、本明細書に援用される。しかし、本明細書に援用されるいかなる文書も、本発明を解説するかまたは開示するとは、明らかに認められない。
【００５３】
[0058]本発明は、本発明の態様の以下の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することによってより容易に理解されうる。しかし、本方法、化合物および組成物を開示し、そして説明する前に、本発明が特定の方法、特定の細胞タイプ、特定の宿主細胞または特定の状態などに限定されず、これは、こうしたものが、もちろん、多様であることが可能であるためであり、そして多くの修飾および変動が当業者には明らかとなるであろうことが理解されるものとする。本明細書に用いる専門用語は、特定の態様を記載する目的のみのためのものであり、そして限定すると意図されないこともまた理解されるものとする。
【００５４】
[0059]広い側面において、本発明者らは、ここで、ヒト剖検肝臓において、対立遺伝子ｈｎＲＮＡ／ｍＲＮＡ発現を測定することによって、ＣＹＰ３Ａ４における一般的な多型を発見した。検出可能な対立遺伝子ＲＮＡ発現不均衡（ＡＥＩ）は、ＲＮＡ発現、プロセシング、または代謝回転に影響を及ぼす、ＣＹＰ３Ａ４中のシス作用性制御因子の直接の測定値である。
【００５５】
[0060]本明細書に記載する結果は、ＣＹＰ３Ａ４のイントロン６ ＳＮＰが、観察される対立遺伝子ｍＲＮＡ発現パターンを説明し、そしてヒト肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４酵素活性と相関する一方、以前示唆されていた多型がまったく影響を持たないことを示す。
【００５６】
[0061]さらに、イントロン６ ＳＮＰは、ＣＡＤ患者のコホートにおいて、コレステロール管理のために服用される安定スタチン投薬と、そして療法ＬＤＬ目標の達成と、有意に関連した。
【実施例】
【００５７】
[0062]実施例Ｉ
[0063]方法：
[0064]組織試料。１３３の肝臓剖検／生検試料を、オハイオ州立大学施設審査委員会（ＯＳＵ ＩＲＢ）によって認可されたプロトコルの元で、Ｔｈｅ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｍｉｄｗｅｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎから得た。
【００５８】
[0065]患者。被験体は、オハイオ州立大学冠動脈疾患研究の参加者であり、患者はＰＣＩコールを必要とする症候性心臓血管疾患でＯＳＵ心臓センターを受診している。脂質管理のため、安定用量のスタチンを服用していると立証される２７５人の患者を選択した。登録および試験条件は、ＯＳＵ ＩＲＢによって認可されており、各患者からは書面のインフォームドコンセントが得られている。研究集団は、オハイオ州のコロンバス地域および周辺の田舎地方の人口動態を反映する。
【００５９】
[0066]ＤＮＡおよびＲＮＡ調製。組織または血液試料からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製を記載されるように行った（１６〜１８）。
【００６０】
[0067]ＳＮａＰｓｈｏｔを用いた、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡにおける対立遺伝子比の定量的分析。詳細な方法が公表されている（１６、１７）。簡潔には、マーカーＳＮＰ周囲のＤＮＡまたはＲＮＡ（ｃＤＮＡに変換した後）の断片をＰＣＲ増幅した後、多型部位をターゲットとするプライマー伸張アッセイ（ＳＮａＰｓｈｏｔ）を行った。３’ＵＴＲ領域またはイントロン領域のいずれかに位置する７つのマーカーＳＮＰを用いて、少なくとも１つのマーカーＳＮＰに関してヘテロ接合性である、１３３の肝臓のうち７３において、成熟ｍＲＮＡ（３’ＵＴＲマーカー）またはｈｎＲＮＡ（イントロンマーカー）の対立遺伝子比を測定した。１に標準化されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）対立遺伝子比が内部対照として働き；いずれの被験体も、まとまりからの有意な偏差によって検出可能な、ｇＤＮＡコピー数変動を示さなかった。１からの対立遺伝子ＲＮＡ比の偏差（ＤＮＡ比に対する標準化後）、すなわち対立遺伝子発現不均衡（ＡＥＩ）は、ｍＲＮＡ発現レベルに影響を及ぼす、ＣＹＰ３Ａ４におけるシス作用性多型の存在を示す。
【００６１】
[0068]遺伝子型決定：表１に示すように、多重ＳＮａＰｓｈｏｔアッセイ（１９）または対立遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲ（２０）を用い、肝臓試料由来のｇＤＮＡにおいて、ＣＹＰ３Ａ４中の１３のＳＮＰ（７つのマーカーＳＮＰを含む）を遺伝子型決定した。
【００６２】
【表１】
【００６３】
[0069]表２に示すように、２７５人の患者から、ｇＤＮＡにおいて、ＣＹＰ３Ａ４／３Ａ５中の７つのＳＮＰを遺伝子型決定した。
【００６４】
【表２】
【００６５】
[0070]ＰＣＲ条件およびプライマー配列を表３、表４、表５に示す。
【００６６】
[0071]ヒト肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４ならびに転写因子ＰＸＲ、ＲＸＲａ、ＣＡＲ、およびＨＮＦ４ａの定量的ｍＲＮＡ分析： ＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡを内部対照として用い、遺伝子特異的プライマー（２２）（表３、表４、表５）およびＳＹＢＲグリーン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリアルタイムＰＣＲ（１６、２１）を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。
【００６７】
[0072]表３：遺伝子型決定またはＡＥＩアッセイ。「ＰＣＲプライマー配列およびアッセイ条件」と示す列は、提示順に、それぞれ、配列番号１〜４２を開示し、そして「プライマー伸張プライマーおよび条件」と示す列は、提示順に、それぞれ、配列番号４３〜５６を開示する。
【００６８】
【表３−１】
【００６９】
【表３−２】
【００７０】
【表３−３】
【００７１】
[0073]表４： ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ４Ａ５ ＳＮＰ遺伝子型決定に関する多重ＰＣＲおよびＳｎａｐｓｈｏｔアッセイ。「ＰＣＲプライマー配列」と示す列は、提示順に、それぞれ、配列番号５７〜６８を開示し、そして「プライマー伸張プライマー」と示す列は、提示順に、それぞれ、配列番号６９〜７５を開示する。
【００７２】
【表４】
【００７３】
[0074]表５：プライマーおよび配列決定プライマー。ＰＣＲプライマーは、提示順に、それぞれ、配列番号７６〜９５として開示され、そして配列決定プライマーは、提示順に、それぞれ、配列番号９６〜１５１として開示される。
【００７４】
【表５−１】
【００７５】
【表５−２】
【００７６】
【表５−３】
【００７７】
【表５−４】
【００７８】
[0075]ＣＹＰ３Ａの配列決定：転写開始部位の〜１０，０００ｂｐ上流から最後のエクソンまでの領域（ＡＦ２８０１０７の５００１３〜８９４１０、全長３９，３９７ｂｐ）を、対立遺伝子特異的ＲＮＡ発現を示す２つの肝臓試料において配列決定した。ＰＣＲおよび配列決定プライマーを図１６−表１０に示す。
【００７９】
[0076]ＣＹＰ３Ａ４酵素活性アッセイ：記載されるように（２３）、プローブとしてテストステロンを用いて、肝臓ミクロソーム由来のＣＹＰ３Ａ４活性を定量化した。
【００８０】
[0077]データ分析：別個の変数および遺伝子型の間の関連を、Ｈｅｌｉｘ−Ｔｒｅｅソフトウェア（Ｇｏｌｄｅｎ Ｈｅｌｉｘ、モンタナ州ボーズマン）を用いて分析した。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗを用いて、ＬＤプロットを生成した。ＳＰＳＳまたはＭｉｎｉｔａｂソフトウェアを用いて、ＲＮＡ発現、酵素活性、およびスタチン用量必要性に対する遺伝子型の影響を試験するために、重回帰分析を用いた。
【００８１】
[0078]結果：
[0079]ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼすシス作用性ＣＹＰ３Ａ４多型に関するスキャニング：
[0080]３つの頻繁な３’ＵＴＲマーカーＳＮＰを用いて、ヒト肝臓において、ＣＹＰ３Ａ４の対立遺伝子ｍＲＮＡ発現を測定した（図３）。ＣＹＰ３Ａ４が高発現であるため、４つのイントロンＳＮＰもまた、ＣＹＰ３Ａ４ ｈｎＲＮＡの対立遺伝子発現を測定するのに利用した（２４）。スクリーニングした１３３の肝臓試料のうち、７３が７つのマーカーＳＮＰの少なくとも１つに関してヘテロ接合性であり、そしてしたがって、ＡＥＩ測定に適していた。７３の試料のうち、７つが、強い対立遺伝子発現不均衡（ＡＥＩ）を示すと同定され、メインの対立遺伝子がマイナーな対立遺伝子より少なく発現され（０．２〜０．５倍）、これはイントロンおよびエクソンマーカーＳＮＰの両方で観察された（図１Ａ）。したがって、ＣＹＰ３Ａ４中のシス作用性多型（単数または複数）は、ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡレベル両方に等しく影響を及ぼす。
【００８２】
[0081]関与する多型（単数または複数）を検索するため、１３のＣＹＰ３Ａ４多型（表１）を遺伝子型決定し、そして対立遺伝子ＲＮＡ比および遺伝子型間の関連を試験した。
【００８３】
[0082]イントロン６に位置する単一ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）は、ＡＥＩと非常に有意な関連を示し（調整ｐ値９．１２ｘ１０−１０）（図４）、一方、別のＳＮＰ ｒｓ２２４６７０９もまた、中程度の有意性（Ｐ＝０．０３４）をスコアリングし、これはおそらくイントロン６ ＳＮＰと部分的な連鎖不平衡（ＬＤ）にある結果であった（図５）。
【００８４】
[0083]先に同定されたプロモーターＳＮＰ ｒｓ２７４０５７４、ＴＧＴ挿入、ｒｓ２７３７４１８、およびｒｓ４６４６４３７を含む他のＳＮＰは、有意な関連を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。これらの結果は、イントロン６ ＳＮＰが機能性であるか、または機能性ＳＮＰと非常にＬＤであることを示した。これをさらに試験するため、イントロン６ ＳＮＰをマーカーとして用いて、そしてイントロン６ ＳＮＰに関してのみヘテロ接合性である３つを含めて、１０のヘテロ接合性試料において、ＡＥＩを測定した。１０の試料はすべて、ＡＥＩを示し、対立遺伝子比（マイナーＴ対立遺伝子／メジャーＣ対立遺伝子）は０．１６〜０．６２の範囲であり（図１Ｂ）、男性および女性の間で相違はなかった（Ｐ＝０．３１４）。したがって、イントロン６ ＳＮＰのマイナーＴ対立遺伝子は、ｍＲＮＡ／ｈｎＲＮＡレベル減少と関連している（メジャーＣ／マイナーＴの逆対立遺伝子ｍＲＮＡ比は１．６〜６．２５）。マイナーＴ対立遺伝子は、ｒｓ２２４６７０９との低いＬＤを除いて、もっぱら、メインのＣＹＰ３Ａ４ハプロタイプに連鎖している（図１２−表６；ＬＤプロット図５）。
【００８５】
[0084]表６：ハプロタイプ構造、および肝臓において試験された１３のＳＮＰの概算頻度。詳細なＳＮＰ情報を表１に提供する。ハプロタイプ５において、イントロン６ ＳＮＰ（左から６番目）のマイナーＴ対立遺伝子は、メジャー・ハプロタイプ１（太字）にもっぱら連鎖しており、一方、他のＳＮＰいずれとも検出可能なＬＤを持たない。
【００８６】
【表６】
【００８７】
[0085]２つのＡＥＩ陽性試料中の全ＣＹＰ３Ａ４遺伝子座の配列決定は、どちらの試料においてもヘテロ接合性でなければならない他の多型いずれかが関係しているとは見なされず、イントロン６ ＳＮＰが機能性であることが示された。
【００８８】
[0086]イントロン６ ＳＮＰは、ヒト肝臓において、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベルおよび酵素活性の減少と関連する：
[0087]９３の肝臓試料において、総ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベルを測定した。ｍＲＮＡレベルは、コーカソイドおよびアフリカ系アメリカ人の間で異ならなかったが、報告されるように（２５）、女性は男性よりも１．３倍より高いレベルを有した（９５％ＣＬ １．００〜１．６８、両側Ｐ＝０．０４２）。イントロン６ ＳＮＰのメインのＣＣ遺伝子型を持つ肝臓は、ＣＴ／ＴＴキャリアーよりも１．７１倍（９５％信頼区間（ＣＩ）１．０６〜２．７６）高いレベルを有し（ｔ検定、両側Ｐ＝０．０２８）、遺伝子型および性別の間に関係はなかった。ＣＹＰ３Ａ４転写因子（２６〜２９）の影響を試験するため、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ、ＮＲ１１２）、恒常的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ、ＮＲ１１３）、レチノイド受容体（ＲＸＲａ）、および肝細胞核因子（ＨＮＦ４α１Ａ）に関してもまた、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ発現は、報告されるように（２６〜２９）、すべての４つの転写因子と正に相関した（図６Ａ〜６Ｄ）。
【００８９】
[0088]年齢および転写因子に関して調整した後、イントロン６ ＳＮＰは、ＣＹＰ３Ａ４発現と有意に関連したままであり（ＣＴ／ＴＴよりもＣＣが１．６７倍（９５％ＣＩ １．１１〜２．４６、ｐ＝０．０１４）（図２Ａ））、遺伝子型の影響が転写因子とは独立であることが示された。
【００９０】
[0089]年齢（＜１５歳は小児、＞１５歳は成人）、性別、および誘導剤（フェノバルビタール、カルバマゼピン、ニフェジピンおよびデキサメタゾン）の使用に関して調整した後、２３の肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４酵素活性（テストステロン６βヒドロキシル化）は、ＣＴキャリアーよりもイントロン６ ＳＮＰ ＣＣに関して、２．４６倍高かった（両側ｐ＝０．０３７、９５％ＣＩ １．０７〜５．６２）（図２Ｂ）。
【００９１】
[0090]対立遺伝子ｍＲＮＡ発現と一致して、これらの結果は、イントロン６ ＳＮＰがｉｎ ｖｉｖｏでＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを減少させることを示す。対照的に、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ、ＴＧＴ挿入、ｒｓ２７３７４１８、およびｒｓ４６４６４３７は、総ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡレベルまたは酵素活性にまったく影響を及ぼさなかった（Ｐ＞０．０５）。
【００９２】
[0091]イントロン６ ＳＮＰ（Ｃ＞Ｔ）は、スタチン用量必要性および脂質管理転帰と関連する：
[0092]あらかじめ決定されたＬＤＬ目標に到達するのに必要なＣＹＰ３Ａ４が代謝するスタチンの投薬量として、イントロン６ ＳＮＰのｉｎ ｖｉｖｏ効果を評価した。安定用量のアトルバスタチン、ロバスタチン、およびシンバスタチン、または非ＣＹＰ３Ａ４基質ロスバスタチンおよびプラバスタチンを投与されている２７５人の患者において、イントロン６ ＳＮＰを遺伝子型決定した。ＣＹＰ３Ａ４（＊１Ｂ ｒｓ２７４０５７４、ＴＧＴ挿入、＊１７ ｒｓ４９８７１６１、および＊１８ ｒｓ２８３７１７５９）およびＣＹＰ３Ａ５（＊３ ｒｓ７７６７４６および＊５ ｒｓ４１３０３３４３）（図１１−表５）中のさらなるＳＮＰもまた遺伝子型決定した。３つのＳＮＰがＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡（ＨＷＥ）から逸脱し、これは、コーカソイドおよびアフリカ系アメリカ人集団において、異なる対立遺伝子頻度があるためであり、集団中で別個に分析すると、すべてのＳＮＰがＨＷＥにしたがう（表７）。
【００９３】
【表７】
【００９４】
[0093]イントロン６ ＳＮＰの対立遺伝子頻度は〜５％であり、ＮＣＢＩデータベースで報告されるものと一致する。ＣＹＰ３Ａ４ ＳＮＰ＊１７および＊１８の不在は、報告される対立遺伝子低頻度と一致する。
【００９５】
[0094]２３７人の患者のサブセットは、５ｍｇ〜８０ｍｇの範囲の用量のＣＹＰ３Ａ４が代謝するスタチン（アトルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン）を投与されていた。スタチンを一緒に、または別個に評価して、有効性相違を説明した。すべてのスタチンを投与されている患者を、低用量（２０ｍｇ以下、平均１６±５ｍｇ）および高用量（４０ｍｇ以上、平均５３±１９ｍｇ）（Ｐ＜０．００１）群に分けた。ベースライン特性および脂質レベルは、最大トリグリセリドおよび安定ＨＤＬレベル（Ｐ＜０．０５）を除いて、低用量および高用量群間で異ならなかった（表８）。表８は、ＣＹＰ３Ａ４が代謝するスタチン（アトルバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチン）を投与されている患者のベースライン特性を示す。
【００９６】
【表８】
【００９７】
[0095]マイナーイントロン６ ＳＮＰ Ｔ対立遺伝子は、より低い安定スタチン用量と有意に関連した（オッズ比＝３．８０、Ｐ＝０．００５）。他のＳＮＰはいずれも有意ではなかった。表９は、スタチン用量必要性およびコレステロール管理転帰とＣＹＰ３Ａ４／３Ａ５ ＳＮＰ遺伝子型の関連を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００９８】
【表９】
【００９９】
[0096]重回帰分析は、イントロン６ Ｔ対立遺伝子キャリアーに関する安定スタチン用量が、最大脂質レベルに関する調整後、非Ｔキャリアーに関するものに対してわずか０．２７であった（Ｐ＝０．０１９）ことを示す（表１０）。患者をアトルバスタチンおよびシンバスタチンに対して別個に分析した際、類似の結果が得られた（表１０）。したがって、イントロン６ ＳＮＰは、スタチン用量必要性の減少と関連する。
【０１００】
【表１０】
【０１０１】
[0097]コレステロール管理転帰とイントロン６ ＳＮＰの関連を試験するため、入手可能なＬＤＬデータを伴う１９８人の患者を、成人治療パネルＩＩＩ指針（３０）にしたがって、コレステロール目標に到達したもの（ＬＤＬコレステロール＜７０ｍｇ／ｄｌ；または７１〜９９ｍｇ／ｄｌであって、低リスク／中程度のリスク；または１００〜１２９ｍｇ／ｄｌであって、低リスク）および到達しなかったもの（＞１３０ｍｇ／ｄｌ；または１００〜１２９ｍｇ／ｄｌであって、中程度／高リスク；または７１〜９９ｍｇ／ｄｌであって、高リスク）に分けた。イントロン６ ＳＮＰのＴ対立遺伝子を所持する個体は、非Ｔキャリアーよりも、目標のコレステロール管理に到達する可能性が３．５倍高かった（Ｐ＝０．０３９）（表２）。対照的に、他のＳＮＰは、こうした関連を示さなかった。
【０１０２】
[0098]実施例Ｉの考察：
[0099]実施例Ｉは、イントロン６ ＳＮＰ ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］が、ヒト肝臓において、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ発現および酵素活性減少に有意に関連しており、そしてさらに、完全に対立遺伝子ｍＲＮＡ発現における相違を説明することを示す。
【０１０３】
[00100]イントロン６ ＳＮＰは、ＣＹＰ３Ａ４のメイン・ハプロタイプ中に包埋されており、いかなる他のＳＮＰとも実質的なＬＤを欠くため、ハプロタイプタグＳＮＰを用いた関連研究（１４、１５）による検出を逃れてきた。プロモーター＊１Ｂ、エンハンサーＴＧＴ挿入、エンハンサーｒｓ２７３７４１８、およびイントロン７ ＳＮＰ ｒｓ４６４６４３７を含む、以前報告されたＣＹＰ３Ａ４ ＳＮＰはいずれも、対立遺伝子ｍＲＮＡ発現、ｍＲＮＡ、および酵素活性に検出可能な影響を持たず、ＣＹＰ３Ａ４変動性に対するこれらのＳＮＰの寄与に反論する。
【０１０４】
[00101]調べたコホート中のイントロン６ ＳＮＰの対立遺伝子頻度は〜５％であり、〜１０％のヘテロ接合性を生じた。先に報告された対立遺伝子頻度（３５）は、アフリカ系アメリカ人、中国人、およびコーカソイドに関して、それぞれ、０．０４３、０．０４３、および０．０８３であり、イントロン６ ＳＮＰ対立遺伝子頻度が、多様な民族群において、４〜８％の範囲であることが示される。
【０１０５】
[00102]イントロンＳＮＰがｍＲＮＡレベルを改変する一般的な分子機構は、ＲＮＡ発現、伸長、スプライシング、または成熟に影響を及ぼすことである。対立遺伝子比は、エクソンおよびイントロンマーカーＳＮＰの両方に関してヘテロ接合体である肝臓において、ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡで類似であったため、スプライシングおよびｍＲＮＡ代謝回転は、主な機構からは排除されうる。さらに、ＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡレベルは、ヒト肝臓において、並行して、多様であることが示され（３６）、発現およびプロセシングの初期の事象であることを支持する。例えば、イントロン６ ＳＮＰは、発生期ＲＮＡのフォールディング、そしてしたがって伸長に影響を及ぼしうる。
【０１０６】
[00103]インシリコＲＮＡフォールディング分析によって、イントロン６ ＳＮＰは、ループからステムへの構造変化を促進することが示されており（未提示）、これはおそらく、制御タンパク質の結合を妨害する。
【０１０７】
[00104]マイナー対立遺伝子の発現減少と一致して、イントロン６ ＳＮＰは、ＣＹＰ３Ａ４によって主に代謝されるスタチン薬剤（アトルバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチン）の安定用量必要性の減少と有意に関連した。スタチン用量は、望ましいＬＤＬに到達するよう用量設定されているため、代謝減少を伝達するイントロン６ ＳＮＰ Ｔ対立遺伝子のキャリアーでは、より低い用量が達成可能である。本発明者らの考えを支持して、薬物動態研究によって、ＣＹＰ３Ａ４活性阻害は、シンバスタチンおよびロバスタチンの血漿濃度を劇的に増加させることが示され（３１、３２）、ＣＹＰ３Ａ４活性がＣＹＰ３Ａ４が代謝するスタチンの血清濃度の主な決定要因であることが示唆される。
【０１０８】
[00105]イントロン６ Ｔ対立遺伝子を所持する患者はまた、ＬＤＬ目標に到達する可能性がより高いという発見を、正常ＣＹＰ３Ａ４代謝を持つ被験体における不十分な投薬量の用量設定に、またはＴ対立遺伝子キャリアーにおける用量間のスタチンレベルにおける変動がより少ないことに、関連づけることも可能である。先に同定されたＣＹＰ３Ａ４プロモーターＳＮＰ（＊１Ｂ、−３９２Ａ＞Ｇ）は、シンバスタチン治療の脂質低下有効性および安全性に関連せず（３３）、このプロモーターＳＮＰが肝臓ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼさないことを示す本明細書の結果と一致する。さらに、現在の結果は、ＣＹＰ３Ａ５におけるＳＮＰが、スタチン用量または治療転帰に影響を及ぼさず、ＣＹＰ３Ａ５がスタチン代謝に大きな役割を果たさないという報告と一致する（３４）。したがって、イントロン６ ＳＮＰは、スタチン療法に影響を及ぼすことが示された唯一のＣＹＰ３Ａ多型である。
【０１０９】
[00106]ＣＹＰ３Ａ４活性は、かなりの個体間変動を示すが、新規薬剤は、しばしば、ＣＹＰ３Ａ４による代謝に関してターゲティングされ、ＣＹＰ２Ｄ６などの他の薬剤代謝性ＣＹＰ酵素のヌル突然変異から生じる問題を回避する。
【０１１０】
[00107]本明細書に示す結果は、ＣＹＰ３Ａ４の変動性の一部が、イントロン６ ＳＮＰによって説明可能であることを示す。この発見の臨床的関連性は、その排出に関してＣＹＰ３Ａ４に依存する２つのスタチン薬剤の設定用量に対するイントロン６ ＳＮＰの影響によって立証される。ＣＹＰ３Ａ４は、すべての臨床的に用いられる薬剤のおよそ半分の代謝に関与するため、現在、本発明者らは本明細書において、イントロン６ ＳＮＰは、狭く定義された投薬措置を持つ抗癌剤を含めて、多数の薬剤の投薬必要性、反応、および毒性に影響を及ぼすと考えている。
【０１１１】
[00108]したがって、ＣＹＰ３Ａ４イントロン６ ＳＮＰは、臨床実施において、そして薬剤発見および発展において、価値あるバイオマーカーである。
【０１１２】
[00109]実施例ＩＩ
[00110]細胞から単離されたＤＮＡを、特にヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子に関して、陽性ヒトゲノム参照対照（すなわち突然変異が存在する）または陰性対照（すなわち正常または野生型に相当する）として用いてもよい。これは、これらの遺伝子に関して、正確でそして信頼可能な臨床診断試験を確実にしうる。
【０１１３】
[00111]例えば、臨床試験中に行われる遺伝子型決定アッセイにおいて、参照対照を用いてもよい。参照対照に、療法に反応しない患者に典型的な遺伝子変異が含まれる場合、参照対照を使用すると、非反応者が適切に同定され、そして非反応者に対する研究療法が無効であることに関するデータが適切に同定されるように、用いる遺伝子型決定アッセイが信頼性を持って行われるのが確実になるよう補助される。同様に、参照対照に、正常患者とは異なる速度で薬剤を代謝する患者（すなわち突然変異体チトクロムＰ４５０遺伝子を持つ患者）に典型的な遺伝子変異が含まれる場合、参照対照を使用すると、これらの患者が適切に同定され、そして適切に投薬され、そして不都合な薬剤反応または無効な療法が回避されるように、遺伝子変異の有効性が確実になるよう補助される。
【０１１４】
[00112]参照対照はまた、患者治療においても使用可能である。臨床試験におけるその使用と同様に、適切な療法が開始される前に、患者の状態が悪化しないように、有効な療法が時間に制約がある方式で同定されることが必須である。適切な投薬措置を選択する事もまた必須である。
【０１１５】
[00113]したがって、本発明の１つの側面は、特定の療法に反応する遺伝的素因に関して、複数の患者を試験する方法に関する。この側面において、１以上の参照対照を、既知の予期される結果を持つ「試料」として試験する。これらの対照には、療法に反応しない素因を示す患者（陽性対照）に関連する遺伝子変異体が含まれてもよいし、または療法に反応する素因を示す患者に関連する正常／野生型変異体（陰性対照）が含まれてもよい。
【０１１６】
[00114]したがって、診断アッセイが正確に実施されていることを確実にし、そして薬剤療法に対する耐性または減少した代謝状態を伝達する遺伝子変異を同定するため、試験実験室は参照対照を用いてもよい。非反応者が適切に同定されるのを確実にするため、試験実験室には、アッセイ、そしてしたがって患者の結果の有効性を決定するため、各アッセイ中に参照対照が含まれてもよい。参照対照をランダムにまたはあらかじめ決定された間隔で用いてもよい。同じ観点で、試験実験室は、実験室スタッフの正確さを評価するためのパネルとして参照対照を用いてもよい。
【０１１７】
[00115]したがって、本発明の別の側面は、適切な投薬措置を設定可能であるように、迅速なまたは緩慢になった代謝を示す遺伝子素因に関して、複数の患者を試験する方法に関する。この側面において、試験する１以上の試料は、「迅速な」または「緩慢な」代謝者である素因を有する患者と関連する遺伝子変異を含む、参照対照である。
【０１１８】
[00116]これらの多型は、例えば、「劣った」代謝者、「中間の」代謝者、「高」代謝者、および「超迅速」代謝者などの集団において、多数の表現型で発現される。特定の状況において、「高」代謝者は、少なくとも１つ、そして２より多くない正常な機能性対立遺伝子を有してもよく；「中間の」代謝者は、活性が低下した１つの対立遺伝子および１つのヌル対立遺伝子を所持してもよく；そして「劣った」代謝者は、酵素活性の完全な喪失を生じる、２つの突然変異体対立遺伝子を所持してもよい。特定の状況において、超迅速代謝者は、多数コピーの機能性対立遺伝子を所持し、そしてしたがって過剰な酵素活性を生じてもよい。したがって、特定の薬剤を投与する場合、「劣った」代謝者は、薬剤から有意な利益を得ずに、むしろ、標準用量を投与された際に、過剰な薬剤反応および副作用を経験する可能性もある。すなわち、代謝産物が活性療法部分である場合、「劣った」代謝者は療法的反応を示さない可能性もある。他方、「超迅速」代謝者は、標準的用量に反応するのに失敗しうる。
【０１１９】
[00117]試料をプレスクリーニングするための多様な方法を用いてもよい。例えば、生物学的試料をプレスクリーニングして、試料が関心対象の突然変異を有することを確実にしてもよい。患者集団を多様な要因に基づいてプレスクリーニングして、試料サイズを、突然変異体を含む個体の同定に必要な最小限にしてもよい。関心対象の突然変異を含む１以上の試料を同定する、試料に対する最初のゲノムスクリーニングを実行した後、これらの突然変異を持つ患者は、さらなる生物学的材料を得るため、場合によって召還されうる。場合によって、この材料を完全に配列決定して、関心対象の突然変異の存在を確認してもよい。生物学的材料は不死化されていてもよく、したがって、該材料は、参照対照の安定で、要望に応じた供給源を提供してもよく、あるいは、細胞はそれ自体、参照対照であってもよい。当該技術分野によく確立されたプロトコルを用いて、限定されるわけではないが、組織、体液（例えば血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、精液、膣分泌物、リンパ液、脳脊髄液または粘膜分泌物）の核酸を含有する試料いずれかの中に存在する、ヒトゲノムＤＮＡ、個々の細胞または供給源の核酸を含有するこうした供給源の抽出物、ならびに細胞内構造、例えばミトコンドリアまたは葉緑体などを用いてもよい。
【０１２０】
[00118]特定の態様において、医学的状態または疾患に関して診断可能であるか、または被験体を医学的状態または疾患に罹患しやすくしうる、１またはそれより多くの遺伝子配列の存在に関して、プレスクリーニングしようとするヒトから、核酸が得られている。患者集団のプレスクリーニングの代替法として、関心対象の遺伝子配列に関して、一般的に利用可能な細胞培養をスクリーニングして、そして次いで、将来、連続して供給するために、細胞クローンを拡大し、そして保存してもよい。
【０１２１】
[00119]いくつかの既知のゲノムアッセイ法があり、該アッセイ法のため、試験において参照対照を用いてもよく、ここで大部分は、関心対象のＳＮＰを含んでもまたは含まなくてもよいＤＮＡ試料とプライマーをハイブリダイズさせることを伴う。診断プライマーおよび／またはプローブにタグを付けて、迅速な同定を可能にしてもよい。ハイブリダイゼーションが起こったら、ＤＮＡを増幅してもよく、そしてタグ付けされたプライマーおよび／またはプローブを検出する。検証されたプライマーを用いて、参照対照の有効性を確認してもよい。参照対照が有効とされたら、これらを参照対照として商業的に入手可能なアッセイで用いてもよく、そして特定の突然変異の存在または非存在を決定する、これらのまたは他のアッセイで使用するために設計されるプライマーを確認するのに用いてもよい。したがって、本明細書に例示的なアッセイ法を記載する一方、本発明はこうしたものに限定されない。
【０１２２】
[00120]本発明は、多様なそして好ましい態様に言及して記載されてきているが、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、多様な変化を行ってもよく、そしてその要素を同等物で置換してもよいことが、当業者には理解されなければならない。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の解説に対して、特定の状況または材料を適応させるよう、多くの修飾を行ってもよい。したがって、本発明は、本発明を実施するために意図される、本明細書に開示する特定の態様に限定されず、本発明には、請求項の範囲内に属するすべての態様が含まれると意図される。
【０１２３】
[00121]本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、こうした参考文献が本発明に対して先行技術として利用可能であることの承認ではない。本明細書に言及するいかなる刊行物も本明細書に援用される。本明細書に含まれている文書、条例、材料、デバイス、物品等のいかなる議論も、単に、本発明の背景を提供する目的のためである。あらゆるこれらの事項が本出願の各請求項の優先日以前に存在していたために、先行技術の基礎の一部を形成するか、または本発明が関連する分野において、共通の一般的な知識であったことの承認であるとは解釈されないものとする。
【０１２４】
参考文献
【０１２５】
【化１−１】
【０１２６】
【化１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する少なくとも１つの化合物に対する被験体の反応を予測するための方法であって、被験体の核酸試料において、１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出する工程を含み、多型が：
ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；または
ｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；
の１またはそれより多くの多型である、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態は、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するものである、前記方法。
【請求項２】
ＣＹＰ３Ａ４関連障害の予後バイオマーカーに関して、被験体をスクリーニングする方法であって、被験体の核酸試料において、１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出する工程を含み、多型が：
ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；または
ｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；
の１またはそれより多くの多型である、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態は、ＣＹＰ３Ａ４関連障害の予後転帰を予測するものである、前記方法。
【請求項３】
被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害のより重度かまたはより重度でない表現型を有するかどうか予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項５】
被験体における障害の予後転帰を予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項６】
治療に対する被験体の反応を予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項７】
ＣＹＰ３Ａ４関連障害が代謝関連障害を含む、請求項１または２の方法。
【請求項８】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物が、肝臓で代謝される１以上の薬剤を含む、請求項１または２の方法。
【請求項９】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物が１以上のスタチン薬剤を含む、請求項１または２の方法。
【請求項１０】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物がアトルバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチンの１以上を含む、請求項１または２の方法。
【請求項１１】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物が：ＣＹＰ３Ａ４阻害剤またはＣＹＰ３Ａ４増進剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）の１またはそれより多くを含む、請求項１または２の方法。
【請求項１２】
多型が、イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、請求項１または２のいずれかの方法。
【請求項１３】
多型が、ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］を含み、ここで被験体における該多型の存在が、ＣＹＰ３Ａ４関連障害の増加したリスクを予測するものである、請求項１または２の方法。
【請求項１４】
多型のマイナー対立遺伝子の存在が、ターゲット組織におけるＣＹＰ３Ａ４のより低いレベルを予測するものであり、そしてＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ発現減少と関連する、請求項１または２の方法。
【請求項１５】
生物学的試料における酵素特異的代謝産物の存在を検出するためのアッセイ系であって、試料が、少なくとも１つのＣＹＰ３Ａ４代謝可能化合物に関する少なくとも１つのプローブ基質の既知の量で処置された個体から得られ、該プローブ基質が代謝産物の代謝経路に特異的であり、アッセイが：
ｉ）含有される複数のアフィニティ複合体形成剤を含む、生物学的試料を受け取るための手段；
ｉｉ）アフィニティ複合体形成剤に結合した酵素特異的代謝産物の存在を検出するための手段；および
ｉｉｉ）代謝産物の比を定量化して、対応する表現型決定因子を提供するための手段であって；表現型決定因子が個体の代謝表現型プロファイルを提供する、前記手段；
を含む、前記アッセイ系。
【請求項１６】
工程ｉｉ）または工程ｉｉｉ）が：
ａ）ＣＹＰ３Ａ４が代謝する薬剤に関する代謝経路（単数または複数）に特異的なプローブ基質を個体に投与し；
ｂ）プローブ基質に反応した個体由来の生物学的試料において、代謝経路（単数または複数）の代謝産物を検出し；そして
ｃ）検出された代謝産物に基づいて、複数決定因子代謝表現型のそれぞれの表現型決定因子を性質決定する；ここで、プローブ基質は、代謝経路によって代謝されることが知られる少なくとも１つの基質であり、そしてプローブ基質は代謝経路の誘導剤または阻害剤以外のものである
工程を含む方法にしたがって達成される、請求項１５のアッセイ系。
【請求項１７】
アッセイがリガンド結合アッセイである、請求項１６のアッセイ系。
【請求項１８】
リガンド結合アッセイが、イムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、マイクロアレイ形式イムノアッセイおよびマイクロアレイ形式ＥＬＩＳＡからなる群より選択される、請求項１７のアッセイ系。
【請求項１９】
生物学的試料を受け取るための手段が、各ウェル中の複数のアフィニティ複合体形成剤を含む、マルチウェルマイクロプレートである、請求項１５のアッセイ系。
【請求項２０】
複数のアフィニティ複合体形成剤がアレイに基づく形式で各ウェルに結合している、請求項１９のアッセイ系。
【請求項２１】
結合剤に結合した代謝産物の存在を検出するための手段が電荷結合素子（ＣＣＤ）画像化装置である、請求項１５のアッセイ系。
【請求項２２】
代謝産物の比を定量化するための手段が濃度計（densitometer）である、請求項１５のアッセイ系。
【請求項２３】
被験体の核酸試料における１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出するためのアッセイを含むキットであって、多型が：
ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；または
ｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ
の１またはそれより多くの多型である、前記キット。
【請求項２４】
アッセイ結果と、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを相関させるための指示をさらに含む、請求項２３のキット。
【請求項２５】
アッセイ結果と、障害に関する被験体の予後転帰を相関させるための指示をさらに含む、請求項２３のキット。
【請求項２６】
アッセイ結果と、被験体における特定の薬剤治療の成功または失敗の可能性を相関させるための指示をさらに含む、請求項２３のキット。
【請求項２７】
ＣＹＰ３Ａ４関連障害に関与するターゲット遺伝子における機能的多型を発見するための方法であって：
ｉ）ターゲット遺伝子を発現しているターゲット組織の試料を提供し；
ｉｉ）
ａ）ターゲット遺伝子の転写領域中の２つの対立遺伝子各々から生じるｍＲＮＡの相対量を定量的に測定し、そして
ｂ）他方の対立遺伝子に対して一方の対立遺伝子のｍＲＮＡ発現を比較して、対立遺伝子ｍＲＮＡ発現不均衡（ＡＥＩ）比を得る
ことによって、ターゲット遺伝子のＡＥＩを測定し；そして
ｉｉｉ）ＡＥＩ比を、多型を含有する領域に関してターゲット遺伝子をスキャンするための表現型として用いる、
ここで、ＡＥＩ比および多型の間に有意な関連がある場合、多型がＣＹＰ３Ａ４関連障害に関するバイオマーカーとして働きうる機能性多型であることを示す
工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
多型がエクソン領域にある、請求項２７の方法。
【請求項２９】
多型がＳＮＰである、請求項２７の方法。
【請求項３０】
バイオマーカーが、遺伝子転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡスプライシング、またはその組み合わせに影響を及ぼす、請求項２７の方法。
【請求項３１】
バイオマーカーが、タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳に影響を及ぼす、請求項２７の方法。
【請求項３２】
ターゲット遺伝子が、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子座である、請求項２７の方法。
【請求項３３】
イントロン６ ＳＮＰに関するスクリーニングを含む、スタチン薬剤の代謝を決定するための方法。
【請求項３４】
イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）に関するスクリーニングを含む、スタチン薬剤の代謝を決定するための方法。
【請求項３５】
イントロン６ ＳＮＰを含む、ＣＹＰ３Ａ４における変動性を検出するためのバイオマーカー。
【請求項３６】
イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４における変動性を検出するためのバイオマーカー。
【請求項３７】
イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の投薬必要量を決定するためのバイオマーカー。
【請求項３８】
イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の反応を決定するためのバイオマーカー。
【請求項３９】
イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の毒性を決定するためのバイオマーカー。
【請求項４０】
療法剤がスタチン薬剤である、請求項３５〜３９の一項のバイオマーカー。
【請求項４１】
療法剤が抗癌薬剤である、請求項３５〜３９の一項のバイオマーカー。
【請求項４２】
療法剤が、狭く定義された投薬措置を有する薬剤である、請求項３５〜３９のいずれか一項のバイオマーカー。
【請求項４３】
臨床的薬理ゲノミクススクリーニングの方法であって：
ａ）請求項３５〜３９の少なくとも１以上のバイオマーカーの存在に関して試料をスクリーニングし、ここで、１以上のバイオマーカーの存在が、患者が改変された代謝を有する指標となり；そして
ｂ）スクリーニングにおいて、ランダムな方式またはあらかじめ決定された方式で、参照対照を含む、ここで、参照対照は、改変された代謝を有する患者の指標となるバイオマーカーを含むＤＮＡを含む
工程を含み、
参照対照中、１またはそれより多くの薬剤代謝遺伝子における１またはそれより多くのバイオマーカーの存在が検出されると、試料中の１またはそれより多くの薬剤代謝遺伝子において、同じ１またはそれより多くのバイオマーカーを検出するのにスクリーニングが有効であることが検証される
前記方法。
【請求項４４】
個別化医学的療法であって：
ｉ）ターゲット患者集団由来の試料に対して、請求項４３のスクリーニング法を行って、ＣＹＰ３Ａ４または薬剤代謝に関連する他の遺伝子における１またはそれより多くの突然変異体を含む遺伝子プロファイルを持つ患者を同定し；そして
ｉｉ）工程ｉ）において、特定の遺伝子プロファイルを所持すると同定された患者を、同定された遺伝子プロファイルに特有の関心対象の療法で治療する；
工程を含む、前記方法。
【請求項４５】
遺伝子プロファイルが、改変された代謝を持つ患者の指標である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
改変された代謝が：劣った代謝者、中間代謝者、高代謝者、および超迅速代謝者からなる群より選択される、請求項４４の方法。
【請求項４７】
遺伝子プロファイルが、患者における関心対象の療法の有効性の指標となる、請求項４４の方法。
【請求項４８】
遺伝子プロファイルが、遺伝的障害を持つ患者の指標となる、請求項４４の方法。
【請求項４９】
遺伝子プロファイルが、特定の療法で治療してはならない患者の指標となる、請求項４４の方法。
【請求項５０】
関心対象の療法が：癌、心臓疾患、神経学的障害、精神障害、自己免疫障害、および代謝障害からなる群より選択される、疾患または障害を治療するために用いられる、請求項４４の方法。
【請求項５１】
１以上の突然変異がＣＹＰ３Ａ４における突然変異を含み、そして関心対象の療法が、患者への少なくとも１つのスタチンの投与を含む、請求項４４の方法。
【請求項５２】
参照対照として使用するのに適した単離ゲノムＤＮＡを生成するのに使用可能な細胞を同定するための方法であって：
ａ）特定の療法に対する患者の反応の予測される度合いを決定する遺伝子素因に関連する、志願者核酸試料中の１以上の多型を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列の存在に関してヒト志願者を前向きに（prospectively）スクリーニングし；ここで多型は：
ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；または
ｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；
の１またはそれより多くの多型であり、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態が、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するものである；
ｂ）関心対象の１以上の突然変異を所持する志願者由来の細胞を単離し；そして
ｃ）複数の有効なゲノムスクリーニングアッセイに細胞由来のＤＮＡを供する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する少なくとも１つの化合物に対する被験体の反応を予測するための方法であって、被験体の核酸試料において、１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出する工程を含み、多型が：
ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；または
ｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；
の１またはそれより多くの多型である、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態は、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するものである、前記方法。
【請求項２】
ＣＹＰ３Ａ４関連障害の予後バイオマーカーに関して、被験体をスクリーニングする方法であって、被験体の核酸試料において、１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出する工程を含み、多型が：
ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；または
ｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；
の１またはそれより多くの多型である、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態は、ＣＹＰ３Ａ４関連障害の予後転帰を予測するものである、前記方法。
【請求項３】
被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害のより重度かまたはより重度でない表現型を有するかどうか予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項５】
被験体における障害の予後転帰を予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項６】
治療に対する被験体の反応を予測するために、被験体における多型の対立遺伝子状態を、参照集団における多型の対立遺伝子状態と相関させる工程をさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項７】
ＣＹＰ３Ａ４関連障害が代謝関連障害を含む、請求項１または２の方法。
【請求項８】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物が、肝臓で代謝される１以上の薬剤を含む、請求項１または２の方法。
【請求項９】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物が１以上のスタチン薬剤を含む、請求項１または２の方法。
【請求項１０】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物がアトルバスタチン、ロバスタチンおよびシンバスタチンの１以上を含む、請求項１または２の方法。
【請求項１１】
ＣＹＰ３Ａ４が代謝する化合物が：ＣＹＰ３Ａ４阻害剤またはＣＹＰ３Ａ４増進剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）の１またはそれより多くを含む、請求項１または２の方法。
【請求項１２】
多型が、イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、請求項１または２のいずれかの方法。
【請求項１３】
多型が、ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］を含み、ここで被験体における該多型の存在が、ＣＹＰ３Ａ４関連障害の増加したリスクを予測するものである、請求項１または２の方法。
【請求項１４】
多型のマイナー対立遺伝子の存在が、ターゲット組織におけるＣＹＰ３Ａ４のより低いレベルを予測するものであり、そしてＣＹＰ３Ａ４ ｍＲＮＡ発現減少と関連する、請求項１または２の方法。
【請求項１５】
生物学的試料における酵素特異的代謝産物の存在を検出するためのアッセイ系であって、試料が、少なくとも１つのＣＹＰ３Ａ４代謝可能化合物に関する少なくとも１つのプローブ基質の既知の量で処置された個体から得られ、該プローブ基質が代謝産物の代謝経路に特異的であり、アッセイが：
ｉ）含有される複数のアフィニティ複合体形成剤を含む、生物学的試料を受け取るための手段；
ｉｉ）アフィニティ複合体形成剤に結合した酵素特異的代謝産物の存在を検出するための手段；および
ｉｉｉ）代謝産物の比を定量化して、対応する表現型決定因子を提供するための手段であって；表現型決定因子が個体の代謝表現型プロファイルを提供する、前記手段；
を含む、前記アッセイ系。
【請求項１６】
工程ｉｉ）または工程ｉｉｉ）が：
ａ）ＣＹＰ３Ａ４が代謝する薬剤に関する代謝経路（単数または複数）に特異的なプローブ基質を個体に投与し；
ｂ）プローブ基質に反応した個体由来の生物学的試料において、代謝経路（単数または複数）の代謝産物を検出し；そして
ｃ）検出された代謝産物に基づいて、複数決定因子代謝表現型のそれぞれの表現型決定因子を性質決定する；ここで、プローブ基質は、代謝経路によって代謝されることが知られる少なくとも１つの基質であり、そしてプローブ基質は代謝経路の誘導剤または阻害剤以外のものである
工程を含む方法にしたがって達成される、請求項１５のアッセイ系。
【請求項１７】
アッセイがリガンド結合アッセイである、請求項１６のアッセイ系。
【請求項１８】
リガンド結合アッセイが、イムノアッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、マイクロアレイ形式イムノアッセイおよびマイクロアレイ形式ＥＬＩＳＡからなる群より選択される、請求項１７のアッセイ系。
【請求項１９】
生物学的試料を受け取るための手段が、各ウェル中の複数のアフィニティ複合体形成剤を含む、マルチウェルマイクロプレートである、請求項１５のアッセイ系。
【請求項２０】
複数のアフィニティ複合体形成剤がアレイに基づく形式で各ウェルに結合している、請求項１９のアッセイ系。
【請求項２１】
結合剤に結合した代謝産物の存在を検出するための手段が電荷結合素子（ＣＣＤ）画像化装置である、請求項１５のアッセイ系。
【請求項２２】
代謝産物の比を定量化するための手段が濃度計（densitometer）である、請求項１５のアッセイ系。
【請求項２３】
被験体の核酸試料における１またはそれより多くの多型の対立遺伝子状態を検出するためのアッセイを含むキットであって、多型が：
ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；または
ｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ
の１またはそれより多くの多型である、前記キット。
【請求項２４】
アッセイ結果と、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを相関させるための指示をさらに含む、請求項２３のキット。
【請求項２５】
アッセイ結果と、障害に関する被験体の予後転帰を相関させるための指示をさらに含む、請求項２３のキット。
【請求項２６】
アッセイ結果と、被験体における特定の薬剤治療の成功または失敗の可能性を相関させるための指示をさらに含む、請求項２３のキット。
【請求項２７】
ＣＹＰ３Ａ４関連障害に関与するターゲット遺伝子における機能的多型を発見するための方法であって：
ｉ）ターゲット遺伝子を発現しているターゲット組織の試料を提供し；
ｉｉ）
ａ）ターゲット遺伝子の転写領域中の２つの対立遺伝子各々から生じるｍＲＮＡの相対量を定量的に測定し、そして
ｂ）他方の対立遺伝子に対して一方の対立遺伝子のｍＲＮＡ発現を比較して、対立遺伝子ｍＲＮＡ発現不均衡（ＡＥＩ）比を得る
ことによって、ターゲット遺伝子のＡＥＩを測定し；そして
ｉｉｉ）ＡＥＩ比を、多型を含有する領域に関してターゲット遺伝子をスキャンするための表現型として用いる、
ここで、ＡＥＩ比および多型の間に有意な関連がある場合、多型がＣＹＰ３Ａ４関連障害に関するバイオマーカーとして働きうる機能性多型であることを示す
工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
多型がエクソン領域にある、請求項２７の方法。
【請求項２９】
多型がＳＮＰである、請求項２７の方法。
【請求項３０】
バイオマーカーが、遺伝子転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡスプライシング、またはその組み合わせに影響を及ぼす、請求項２７の方法。
【請求項３１】
バイオマーカーが、タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳に影響を及ぼす、請求項２７の方法。
【請求項３２】
ターゲット遺伝子が、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子座である、請求項２７の方法。
【請求項３３】
イントロン６ ＳＮＰに関するスクリーニングを含む、スタチン薬剤の代謝を決定するための方法。
【請求項３４】
イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）に関するスクリーニングを含む、スタチン薬剤の代謝を決定するための方法。
【請求項３５】
イントロン６ ＳＮＰを含む、ＣＹＰ３Ａ４における変動性を検出するためのバイオマーカー。
【請求項３６】
イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４における変動性を検出するためのバイオマーカー。
【請求項３７】
イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の投薬必要量を決定するためのバイオマーカー。
【請求項３８】
イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の反応を決定するためのバイオマーカー。
【請求項３９】
イントロン６に位置するＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）を含む、ＣＹＰ３Ａ４代謝性療法剤の毒性を決定するためのバイオマーカー。
【請求項４０】
療法剤がスタチン薬剤である、請求項３５〜３９の一項のバイオマーカー。
【請求項４１】
療法剤が抗癌薬剤である、請求項３５〜３９の一項のバイオマーカー。
【請求項４２】
療法剤が、狭く定義された投薬措置を有する薬剤である、請求項３５〜３９のいずれか一項のバイオマーカー。
【請求項４３】
臨床的薬理ゲノミクススクリーニングの方法であって：
ａ）請求項３５〜３９の少なくとも１以上のバイオマーカーの存在に関して試料をスクリーニングし、ここで、１以上のバイオマーカーの存在が、患者が改変された代謝を有する指標となり；そして
ｂ）スクリーニングにおいて、ランダムな方式またはあらかじめ決定された方式で、参照対照を含む、ここで、参照対照は、改変された代謝を有する患者の指標となるバイオマーカーを含むＤＮＡを含む
工程を含み、
参照対照中、１またはそれより多くの薬剤代謝遺伝子における１またはそれより多くのバイオマーカーの存在が検出されると、試料中の１またはそれより多くの薬剤代謝遺伝子において、同じ１またはそれより多くのバイオマーカーを検出するのにスクリーニングが有効であることが検証される
前記方法。
【請求項４４】
個別化医学的療法であって：
ｉ）ターゲット患者集団由来の試料に対して、請求項４３のスクリーニング法を行って、ＣＹＰ３Ａ４または薬剤代謝に関連する他の遺伝子における１またはそれより多くの突然変異体を含む遺伝子プロファイルを持つ患者を同定し；そして
ｉｉ）工程ｉ）において、特定の遺伝子プロファイルを所持すると同定された患者を、同定された遺伝子プロファイルに特有の関心対象の療法で治療する；
工程を含む、前記方法。
【請求項４５】
遺伝子プロファイルが、改変された代謝を持つ患者の指標である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
改変された代謝が：劣った代謝者、中間代謝者、高代謝者、および超迅速代謝者からなる群より選択される、請求項４４の方法。
【請求項４７】
遺伝子プロファイルが、患者における関心対象の療法の有効性の指標となる、請求項４４の方法。
【請求項４８】
遺伝子プロファイルが、遺伝的障害を持つ患者の指標となる、請求項４４の方法。
【請求項４９】
遺伝子プロファイルが、特定の療法で治療してはならない患者の指標となる、請求項４４の方法。
【請求項５０】
関心対象の療法が：癌、心臓疾患、神経学的障害、精神障害、自己免疫障害、および代謝障害からなる群より選択される、疾患または障害を治療するために用いられる、請求項４４の方法。
【請求項５１】
１以上の突然変異がＣＹＰ３Ａ４における突然変異を含み、そして関心対象の療法が、患者への少なくとも１つのスタチンの投与を含む、請求項４４の方法。
【請求項５２】
参照対照として使用するのに適した単離ゲノムＤＮＡを生成するのに使用可能な細胞を同定するための方法であって：
ａ）特定の療法に対する患者の反応の予測される度合いを決定する遺伝子素因に関連する、志願者核酸試料中の１以上の多型を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列の存在に関してヒト志願者を前向きに（prospectively）スクリーニングし；ここで多型は：
ｉ）イントロン６に位置するＣＹＰ３Ａ４関連ＳＮＰ（ｒｓ３５５９９３６７［配列番号１５２］）（Ｃ＞Ｔ）；または
ｉｉ）それと連鎖不平衡にあるＳＮＰ；
の１またはそれより多くの多型であり、ここで被験体における多型の対立遺伝子状態が、被験体がＣＹＰ３Ａ４関連障害を有するかまたは発症するリスクを予測するものである；
ｂ）関心対象の１以上の突然変異を所持する志願者由来の細胞を単離し；そして
ｃ）複数の有効なゲノムスクリーニングアッセイに細胞由来のＤＮＡを供する；
工程を含む、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２１７６７（Ｐ２０１２−５２１７６７Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２２８７（Ｐ２０１２−５０２２８７）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８８４２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１６００
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５９３１７２０５０）ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション (33)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＯＨＩＯ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８８４２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１６００
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５９３１７２０５０）ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション (33)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＯＨＩＯ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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