薬物およびアルコール依存症を治療するためのグリシン再取込みインヒビター
本発明はその必要がある患者に有効量のＧｌｙ−Ｔ１インヒビター、特にＮ−メチル−Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−メトキシ−１−フェニル−２−ナフタレニル］メチルグリシンまたは医薬的に許容されるその塩を投与するヒトの薬物中毒、特にアルコール中毒の治療または予防方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その必要がある患者に有効量の医薬を投与するヒトの薬物中毒の治療または予防方法に関する。より特定的に方法はアルコール中毒の治療に関する。方法はまたグリシン輸送体１型インヒビターの医薬使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物中毒、例えばアルコール中毒は、男女を問わず患者の近親者や社会に多くの負の結果を与えるので、新しい治療方針が緊急に必要とされている影響の大きい疾患である。実際、最近の数年間にナルトレキソンやアカンプロセートのような新しい薬理学的治療（Ｓａｓｓら，１９９６；Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉら，１９９２；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら，２００３）がアルコール依存症の治療に有効であることが立証された。これらの物質の有効性は、高アルコール消費量の動物モデルを使用した研究から予測されていた（Ｃｚａｃｈｏｗｓｋｉら，２００１；Ｏｌｉｖｅら，２００２；Ｐａｒｋｅｓ ａｎｄ Ｓｉｎｃｌａｉｒ，２０００）。しかしながら残念なことに、ナルトレキソンおよびアカンプロセートはすべてのアルコール中毒患者に有効というものではなく、従って新しい薬理学的治療が要望されている。
【０００３】
グリシン輸送体（ＧｌｙＴ）タンパク質を介するシナプス前部神経終末または近傍のグリア細胞へのグリシンの再取込みは、シナプス後部のグリシンの作用を終結させ細胞外グリシンレベルを基底値に戻す効果的なメカニズムを構成する。現在では２つの型のグリシン輸送体タンパク質、すなわち、グリア性輸送体（１型），ＧｌｙＴ１および神経性グリシン輸送体（２型），ＧｌｙＴ２が知られている。ＧｌｙＴ１はシナプス間隙からのグリシン除去を触媒し、ＧｌｙＴ２はシナプス小胞へのグリシンの再取込みおよび再充填のために必要である（Ｇｏｍｅｚａら，２００３；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ６（５）：６７５−８２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、その必要がある患者に有効量のＧｌｙＴ１インヒビターを投与するヒトの薬物中毒の治療または予防方法を提供する。より特定的に本発明方法は、ＧｌｙＴ１インヒビターの投与によるアルコール中毒の治療または予防方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の特定実施態様は、Ｎ−メチル−Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−メトキシ−１−フェニル−２−ナフタレニル］メチルグリシン（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンの遊離塩基）もしくは医薬的に許容されるその塩、または、４−［３−フルオロ−４−プロポキシフェニル］−スピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−１’−酢酸（ＦＰＰＳＢＰＡＡの遊離塩基）もしくは医薬的に許容されるその塩の使用である。これらの化合物は、グリシン再取込み１型インヒビターであり、脳血液関門を容易に通り抜け、主としてＧｌｙＴ１タンパク質に作用する。ＧｌｙＴ２タンパク質に対する作用は無視できる。双方の化合物のＨＣｌ塩が調製されており、これらはそれぞれＭＴＨＭＰＮＭグリシンおよびＦＰＰＳＢＰＡＡという記号を有している。これらの化合物はＧｌｙＴ１インヒビターであることが知られており、公知の方法で製造できる。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンのリチウム塩の製造はＷＯ００／０７９７８（Ｇｉｂｓｏｎら）に記載され、ＦＰＰＳＢＰＡＡの製造はＷＯ０１／３６４２３（Ｇｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ）に記載されている。その他の有用なＧｌｙＴインヒビターとしては、ＳＳＲ５０４７３４、ＡＬＸ５４０７、グリシルドデシルアミド、サルコシン、ＮＦＰＳおよびその他のサルコシン類似体、ＣＰ−８０２，０７９、Ｏｒｇ２４４６１およびＯｒｇ２４５９８がある。
【０００６】
このようなグリシン輸送体１型インヒビターが癲癇および統合失調症のような障害の治療に使用できることは以前から示唆されている（Ａｒａｇｏｎ ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ−Ｃｏｒｃｕｅｒａ，２００３）。
【０００７】
ＭＴＨＭＰＮＭグリシンはグリシン再取込みインヒビターであり、脳血液関門を容易に通り抜け、主としてＧｌｙＴ１タンパク質に作用する。ＧｌｙＴ２タンパク質に対する作用は無視できる。この化合物は、体重約５００ｇのラットに６ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与したときに、線条体の細胞外グリシンレベルを約５０−７０％増加させ約２．５時間維持すると期待されている。別の実験では、１３．５ｍｇ／ｋｇ以上の経口投与が目に見える行動変化を誘発した。
【０００８】
抗中毒効果は長い治療期間にわたって維持できる。これは、いくつかの他の物質、たとえば、選択的セロトニン再取込みインヒビター、５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニストおよびオピエートアンタゴニストで報告された抗中毒効果と対比を成す。これらの物質は通常、エタノール消費に対する作用を迅速に開始するが１または２週間の治療後に効果を失う（Ｈｅｄｌｕｎｄ ａｎｄ Ｗａｈｌｓｔｒｏｍ，１９９６；Ｈｅｄｌｕｎｄ ａｎｄ Ｗａｈｌｓｔｒｏｍ，１９９８）。
【０００９】
われわれの結果は、臨床状態の前兆値をもつラットモデルにおいて、選択的ＧｌｙＴ１インヒビター例えばＭＴＨＭＰＮＭグリシンによる内因性細胞外脳グリシンレベルの増加がエタノール摂取量の減少およびアルコール嗜好性の低下を堅実にかつ持続的および可逆的に生じさせることを示唆する。
【００１０】
選択的グリシン再取込みインヒビターによって生じたエタノール摂取量の有意な減少には、中脳辺縁のドーパミン活性の変調が介在する。ラットの中隔側坐核のドーパミン出量の増加は（Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔら，１９９３；Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔら，１９９７；Ｄｉ Ｃｈｉａｒａ ａｎｄ Ｉｍｐｅｒａｔｏ，１９８５；ｌｍｐｅｒａｔｏら，１９８６）、ヒトの場合と同様に（Ｂｏｉｌｅａｕら，２００３）、薬物中毒およびアルコール中毒の発症および発現に関係がある（Ｋｏｏｂ ａｎｄ Ｂｌｏｏｍ，１９８８；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，１９９３；Ｗｉｓｅ，１９８７；Ｗｉｓｅ ａｎｄ Ｒｏｍｐｒｅ，１９８９）。従って、ＧｌｙＴ１インヒビターは内因性グリシンレベルを向上させ、これが中隔側坐核および／または腹側被蓋エリアのグリシン受容体と干渉し、中脳辺縁のＤＡニューロンの脱抑制を生じる。このドーパミン活性化は引き続いてエタノール消費の低減に関与する。アヘン剤、コカインのような他の中毒剤および興奮剤乱用もドーパミンの交替速度の増加に左右される。このことは、アルコール依存症に関して論議および説明されているようなＧｌｙＴ１インヒビターの治療効果が他の薬物依存症、特にアヘン剤、コカインおよび興奮剤乱用に応用できることを実証する。
【００１１】
治療は物質乱用のエピソード中に開始し継続することができる。グリシン輸送インヒビターおよびそれらの可能な用途に関するこれまでに公表された文献では、多くの可能な用途のリストに、アルコール乱用またはアルコール禁断を原因とする問題の治療（ＷＯ２００４／０１３１００）、ニコチン依存症の治療（ＷＯ０３／０３１４３５）、または、ガンマビニルＧＡＢＡと併用したアルコール禁断に付随する痙攣性および非痙攣性発作の治療（ＧＢ ２ １３８ ６８０）などが記載されている。ニコチン禁断の治療に５−ヒドロキシトリプトファンを使用することを示唆したＷＯ２００４／０８０４５４では、Ｎ−モノメチルグリシンの併用が選択肢として言及されている。これらの文献の教示はいずれも単なる選択肢という言及にとどまっており、言及された選択肢の実証データまたは実用化につながるその他の動機、指示または証拠などは示されていない。
【００１２】
グリシン輸送１型インヒビターの入手には文献を利用できる。具体的には、選択的ＧｌｙＴ１インヒビターはＷＯ００／０７９７８およびＷＯ０１／３６４２３に開示されている。これらの特許にはそれぞれ、Ｎ−メチル−Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−メトキシ−１−フェニル−２−ナフタレニル］メチルグリシン（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンの遊離塩基）および４−［３−フルオロ−４−プロポキシフェニル］−スピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−１’−酢酸（ＦＰＰＳＢＰＡＡの遊離塩基）の製造方法が見出される。
【００１３】
物質中毒問題の治療を要する患者に投与する組成物は薬学分野の標準技術に従って調製できる。化合物は、体重１ｋｇあたり０．００１−５０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり０．０１−２０ｍｇの用量で使用でき、最適用量は、投与経路、所望の作用持続時間、配合物のタイプ（持続放出性または即効性）、患者のタイプ、必要な化合物の種類、化合物の効力、治療レシピエントの他の身体的特性、例えば、他の疾患の併発、肝代謝能力などの要因に従って決定できる。ＧｌｙＴ１インヒビターによる治療を中毒の治療に適した他の薬剤と併用することもできる。これは任意選択であるから、ＧｌｙＴ１インヒビターを物質中毒治療用医薬の単一有効成分として使用することもできる。
【００１４】
選択的輸送阻害およびこのような生物効果の定量方法はグリシン生化学で公知の技術に従って決定できる。具体的な方法は後出の実施例に記載する。この実施例に基づいて、グリシン輸送１型インヒビターという用語の意味を明確にするために基準ｐＩＣ５０値を少なくとも６．０、または好ましくは６．５、またはより好ましくは７．０とする。
【００１５】
薬物依存症、アルコール依存症などの診断基準に関してはＤＳＭ ＩＶ改訂版を参照するとよい。
【００１６】
参考文献
【００１７】
【表１】
【実施例】
【００１８】
ヒトＧｌｙＴ−１ｂ輸送体を異種発現しているＣＨＯ細胞中のグリシン取込みの定量方法
Ａ：クローニング：Ｋｉｍ，Ｋ．−Ｍ．ら Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９４，４５，６０８−６１７に記載の方法に従いＰＣＲによってｃＤＮＡを作製した。ＡＬＦ ＤＮＡシークエンサーＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用するジデオキシ配列決定によって配列を検証し、発現構築物ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【００１９】
Ｂ：トランスフェクション：ＣＨＯ細胞へのｈＧｌｙＴ−１ｂのトランスフェクションはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載された標準リン酸カルシウム法を使用して行った。
【００２０】
Ｃ：選択：安定にトランスフェクトした細胞を、１ｍｇ．ｃｍ−３のゲネチシン含有の増殖培地で１週間選択した。個々のクローンを採取して以後の解析に使用し、陽性クローンを後述するように常法で継代培養した。
【００２１】
Ｄ：培養条件：ｈＧｌｙＴ−１ｂ遺伝子を安定に発現している細胞を、ゲネチシン（０．５ｍｇ．ｃｍ−３，Ｇｉｂｃｏ）含有のＧｌｕｔａｍａｘ−１（Ｇｉｂｃｏ）を含み１０％Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅ Ｉｌ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ−ＮＵＴ．ＭＩＸ．Ｆ１２に入れ、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で培養した。維持培養は標準８０ｃｍ２通風フラスコ（２×１０−６ｍフィルター，Ｎｕｎｃ）で行い、集密状態になったときにトリプシン処理（Ｓｉｇｍａ）によって細胞を継代培養した。
【００２２】
Ｅ：アッセイ手順：取込み試験用細胞をゲネチシン非存在下の９６ウェルプレートに平板培養し（１７，０００細胞／ウェル）、使用前に４８時間培養した。グリシン輸送を測定するために、予め３７℃に加温したハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で細胞を２回洗浄し、余剰の流体を除去した後、０．２００ｃｍ３のＨＢＳＳに溶解した試験化合物を添加した。プレートを３７℃で５分間インキュベートした後、［３Ｈ］グリシン（０．０５０ｃｍ３，１５０×１０−６Ｍ，２４８Ｂｑ．ｎｍｏｌ−１，ＮＥＮ）を添加し、インキュベーションをさらに１０分間継続した。細胞を氷冷ＨＢＳＳで洗浄することによって取込みを終了させた後、余剰の流体を除去し、０．２００ｃｍ３のシンチレーションカクテルを各ウェルに加えた。プレートを粘着フィルムでシールし、サンプルが確実に均質になるまで振盪した後、プレートカウンターでシンチレーションカウンティングを行った。
Ｆ：データ解析：活性化合物のｐＩＣ５０値を得るために標準曲線適合手順を使用してデータを解析した（ｐＩＣ５０は、５０％の取込み阻害を生じる試験化合物の濃度の負対数である）。
Ｇ：結果：
この記載でグリシン輸送１型インヒビターであることを意味した化合物のｐＩＣ５０値は、少なくとも６．０のｐＩＣ５０値を有している。
【００２３】
ラットのアルコール中毒に対する効果
材料および方法
動物
体重２５０−３００ｇ（約５０日齢）の雄のウィスターラット成体はＢｅｅｋａｙ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）から供給された。動物を４匹ずつのグループにして一定の温度（２５℃）および湿度（６５％）に維持したケージに収容した。動物を新しい環境に１週間適応させた後、実験（エタノール嗜好に基づくスクリーニング）を行った。ラットを正常な明暗条件下（午前７：００に点灯し、午後１９：００に消灯する）に維持し、ラット標準食（Ｂｅｅｋａｙ ｆｅｅｄ）および水道水には自由に接近できるようにした。この試験はＥｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎによって認可された。
【００２４】
エタノール嗜好に基づくスクリーニング
ラットがエタノール溶液および水の双方のボトルに常時接近できるようにしておいた。２週間の期間中にエタノール濃度を次第に増加した（２−４−６％ｖ／ｖ）。その後、動物を一匹ずつプラスチックケージに入れた。動物が水道水または６％エタノール溶液を入れた２つのボトルに常時接近できるようにしておいた。ウィスターラットを使用した従来の観察は、エタノール消費がほぼこの濃度で最大であることを示していた（Ｆａｈｌｋｅ，１９９４）。６−７週間の期間の水およびエタノールの摂取量を測定した。流体の全摂取量（ｇ）に対するエタノール溶液消費量（ｇ）のパーセントをエタノール嗜好指数として使用した。ラットを、それらのエタノール嗜好に基づいて、低（＜２０％エタノール）、中（２０−６０％エタノール）または高（＞６０％エタノール）嗜好群に分類した。
【００２５】
薬剤
エタノール（ＡＢ Ｓｖｅｎｓｋ ｓｐｒｉｔ）は普通の水道水に溶解し（２−４−６％ｖ／ｖ）普通の３００ｍｌプラスチックボトルに充填したものである。主としてＧｌｙＴ１に作用する（すなわち、ＧｌｙＴ２に対する作用は無視できる）グリシン再取込みインヒビターであるＭＴＨＭＰＮＭグリシンはＮＶ Ｏｒｇａｎｏｎの好意によって提供されたものを、ＮａＣｌ（０．９％）に溶解して投与した（ｉ．ｐ．）。ＮａＣｌ（０．９％）をビヒクルとして使用した。
【００２６】
実験手順
実験手順に適応させるために、約８０日齢のエタノール高嗜好性雄ウィスターラットに対してエタノール（６％ｖ／ｖ）および水の飲用を３時間／日だけに制限して１週間維持した。いわゆる飲料制限接近（制限接近）である。その後、毎日のＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルの投与を開始した。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルをｉ．ｐ．注射し、ラットを約４０分間休息させ、その後３時間はエタノールおよび水を自由に選択して飲めるようにした。第一の実験ではラットにＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを２週間投与し、アルコールおよび水の摂取量をモニターした。実験の最初と最後は制限接近期間とした。
【００２７】
第二の実験では、グリシン再取込みインヒビターの効果が再現されるか否かを検討するために新しいラット群を使用した。この場合にもラットをＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルで１３日間処理した。さらに、その後の２週間はラットのアルコール遮断期間（制限接近）とし、この期間はラットが水だけを１日に３時間飲むことができるようにした。制限接近期間後、ラットに再びＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルを投与し、さらに追加の１３日間をラットのエタノール接触期間とした。観察された効果が用量関連性であるか否かを検討するために実験のこの後半部の終了時にＭＴＨＭＰＮＭグリシンの投与量を次第に減少させた（６−３−１．５ｍｇ／ｋｇ）。
【００２８】
薬剤投与後の約４０分間はラットに水およびエタノール（６％ｖ／ｖ）のボトルを与えておいた。３時間という可飲期間は、６ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．投与したＭＴＨＭＰＮＭグリシンが線条体のグリシンレベルを約５０−８０％増加させ、その効果が約２．５−３時間持続するという予測に基づいて選択した。
【００２９】
統計
エタノールおよび水の消費量データは、反復測定値の分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびフィッシャーの制限付き最小有意差（ＰＬＳＤ）検定によるポストホック解析を順次に使用して解析した。異なる時点で得られた値間の従属比較のために対応のあるｔ検定を使用した。全ての値を平均±ＳＥＭとして表す。確率値（Ｐ）＜０．０５で統計的有意差があるとした。
【００３０】
結果
実験１
実験自体に先行する制限接近期間（ｄａｙ１−３）にはグループ間のエタノール摂取量に差はなかったのに、ＭＴＨＭＰＮＭグリシンはエタノール摂取量を有意に減少させた（群作用［Ｆ（１，１０）＝９．２３９ ｐ＝０．０１２５］，時間作用［Ｆ（１０，１００）＝１．７６５，ｐ＝０．０７６９］および交互作用項［Ｆ（１０，１００）＝０．７２１，ｐ＝０．７０３１］，ｄａｙ４−１４）。
【００３１】
ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理グループとビヒクル処理グループの間で水の摂取量に差はなかった（群作用［Ｆ（１，１０）＝０．０２８ ｐ＝０．８７１３］，時間作用［Ｆ（１０，１００）＝３．０３１，ｐ＝０．００２２］および交互作用項［Ｆ（１０，１００）＝１．１６４，ｐ＝０．３２４３］，ｄａｙ４−１４）。
【００３２】
反復測定値のＡＮＯＶＡは、エタノール嗜好に関して群作用なし［Ｆ（１，１０）＝１．９７８，ｐ＝０．１８９９］，時間作用［Ｆ（１０，１００）＝２．４９５，ｐ＝０．０１０２］、交互作用項なし［Ｆ（１０，１００）＝０．７６４，ｐ＝０．６６３１］を示した（ｄａｙ４−１４）。
【００３３】
流体の全摂取量は、ビヒクル処理グループに比べてＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理グループで有意に減少していた（群作用［Ｆ（１，１０）＝２６．５１６，ｐ＝０．０００４］，時間作用［Ｆ（１０，１００）＝１．６２２，ｐ＝０．１１１０］および交互作用項［Ｆ（１０，１００）＝１．２４７，ｐ＝０．２７１０］，ｄａｙ４−１４。しかしながら、制限接近期間中も２つのグループ間の流体の全摂取量に有意な差が存在した（群作用［Ｆ（１，１０）＝６．２５４ ｐ＝０．０３１４］，時間作用［Ｆ（２，２０）＝１．８１３，ｐ＝０．１８９０］および交互作用項［Ｆ（２，２０）＝０．７５１，ｐ＝０．４８４５］，ｄａｙ１−３。
【００３４】
実験２
新しいエタノール高嗜好性雄ウィスターラット群にＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルをｉ．ｐ．注射した。注射の約４０分後、全てのラットがエタノール（６％ｖ／ｖ）および水を自由に選択できるようにして３時間維持した。最初に全部のラットにＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを１３日間投与した。この期間の後は１４日間のアルコール遮断期間（制限接近）とし、期間中に全部のラットが水だけを飲めるようにした（３時間／日）。制限接近期間の最終４日間は再びラットにＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）またはビヒクルを毎日投与したが、水だけを飲める状態は維持した。制限接近期間が終了すると、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルの注射の約４０分後から再びラットがエタノールおよび水を選択できるようにした。この期間の最初の７日間（ｄａｙ１７−２３）はラットに６ｍｇ／ｋｇのＭＴＨＭＰＮＭグリシンを投与し、続く４日間（ｄａｙ２４−２７）は投与量を３ｍｇ／ｋｇに減らし、最後の２日間（ｄａｙ２８−２９）は最終的に１．５ｍｇ／ｋｇに減らした。実験の最初および最後は薬剤またはビヒクルを投与しない制限接近期間（３日）とし、ラットが１日に３時間だけエタノール（６％ｖ／ｖ）および水のいずれかを自由に選択して摂取できるようにした。
【００３５】
最初の６日間のＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理中にエタノール摂取量が既に有意に減少していることが観察された（群作用［Ｆ（１，１３）＝１９．０１３ ｐ＝０．０００８］，時間作用［Ｆ（５，６５）＝４．７７２，ｐ＝０．０００９］および交互作用項［Ｆ（５，６５）＝３．９１９，ｐ＝０．００３６］，ｄａｙ４−１０）。この減少は１週間の処理後にいっそう顕著になった（群作用［Ｆ（１，１３）＝２９．３６２ ｐ＝０，０００１］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝１２．８０９，ｐ＜０，０００１］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝３．１３１，ｐ＝０．００８４］，ｄａｙ１１−１７）。２週間の制限接近後、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）後のエタノール摂取量はビヒクル後に比べて有意に減少したままであった（群作用［Ｆ（１，１３）＝５．５５４ ｐ＝０．０３４８］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝１．９５４ ｐ＝０．０８２４］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝０．５８２，ｐ＝０．７４３９］，ｄａｙ１７−２３）。しかしながら、アルコール遮断期間後のエタノール摂取量は双方のグループで有意に増加していた（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンｄａｙ１４対ｄａｙ１９，ｐ＝０．０１３５，対応のあるｔ−検定；ビヒクルｄａｙ１４対ｄａｙ１９，ｐ＝０．０００６，対応のあるｔ−検定）。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンを３ｍｇ／ｋｇに切り替えた後、グループ間の差は縮小し（群作用［Ｆ（１，１３）＝１．１７９ ｐ＝０．２９７３］，時間作用［Ｆ（３，３９）＝６．０９２ ｐ＝０．００１７］および交互作用項［Ｆ（３，３９）＝１．３９８，ｐ＝０．２５７９］，ｄａｙ２４−２７）、投与量を１．５ｍｇ／ｋｇに減少させた後はこの差が全くなかった（群作用［Ｆ（１，１３）＝０．０３２ ｐ＝０．８６１４］，時間作用［Ｆ（１，１３）＝４．３４９ ｐ＝０．０５７３］および交互作用項［Ｆ（１，１３）＝２．８３９，ｐ＝０．１１５８］，ｄａｙ２８−２９）。実験の開始当時と同様に、最終制限接近期間（ｄａｙ３０−３２）中のエタノール摂取量には２つのグループ間で差がなかった。
【００３６】
ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理中の水の摂取量は、実験の前半部（制限接近前）では２つのグループ間で有意な差はなかった。制限接近期間後、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットは対照ラットに比べて水摂取量の増加傾向を示した（群作用［Ｆ（１，１３）＝４．０３２ ｐ＝０．０６５９］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝３．３２８，ｐ＝０．００５７］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝１．０３１，ｐ＝０．４１１４］，ｄａｙ１７−２３）。ビヒクルグループでは、制限接近前の水摂取量は制限接近後に比べて有意な差はなかった（ｐ＝０．０９４９，ｄａｙ１４対ｄａｙ１９，対応のあるｔ−検定）。これに対して、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットでは制限接近期間後の水摂取量が有意に増加していた（ｐ＝０．０１８８，ｄａｙ１４対ｄａｙ１９，対応のあるｔ−検定）。
【００３７】
最初の制限接近期間中にはＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理グループとビヒクル処理グループとの間にエタノール嗜好の差は存在しなかった。ＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルによる処理の最初の６日間も２つのグループ間に有意な差はなかった（群作用［Ｆ（１，１３）＝２．６１３ ｐ＝０．１３００］，時間作用［Ｆ（５，６５）＝０．９８１，ｐ＝０．４３６０］および交互作用項［Ｆ（５，６５）＝１．５１５，ｐ＝０．１９７４］，ｄａｙ４−１０）。ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理の約１週後、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットのエタノール嗜好に有意な低下が観察された（群作用［Ｆ（１，１３）＝３５．０３８ ｐ＜０，０００１］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝１．４９５，ｐ＝０．１９１０］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝０．５８３，ｐ＝０．７４３１］，ｄａｙ１１−１６）。制限接近の２週後（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルによるプレ処理４日間を含む）、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理中のエタノール嗜好はビヒクル処理中に比べて有意ではないが低下を維持した（群作用［Ｆ（１，１３）＝４．３５３ ｐ＝０．０５７２］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝０．２２５ ｐ＝０．９６７６］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝０．２１９，ｐ＝０．９６９５］，ｄａｙ１７−２３）。ＭＴＨＭＰＮＭグリシン投与量を３ｍｇ／ｋｇに減らすとグループ間の差が縮小し（群作用［Ｆ（１，１３）＝２．２７４ ｐ＝０．１５５５］，時間作用［Ｆ（３，３９）＝７．２０２ ｐ＝０．００６］および交互作用項［Ｆ（３，３９）＝１．８２５，ｐ＝１．１５８６］，ｄａｙ２４−２７）、ＭＴＨＭＰＮＭグリシンの投与量を１．５ｍｇ／ｋｇに減らすとこの差が完全に無くなった（群作用［Ｆ（１，１３）＝１．７２６ ｐ＝０．２１１７］，時間作用［Ｆ（１，１３）＝０．３５５ ｐ＝０．５６１８］および交互作用項［Ｆ（１，１３）＝０．２６９，ｐ＝０．６１２７］，ｄａｙ２８−２９）。実験の開始当時と同様に、最終制限接近期間（ｄａｙ３０−３２）中のエタノール摂取量はグループ間に差はなかった。
【００３８】
４日間のＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理の後、流体の全摂取量は対照グループに比べて有意に減少していた（群作用［Ｆ（１，１３）＝４６．１８１ ｐ＜０．０００１］，時間作用［Ｆ（８，１０４）＝１４．０５４，ｐ＜０．０００１］および交互作用項［Ｆ（８，１０４）＝３．６３３，ｐ＝０．０００９］，ｄａｙ８−１６）。制限接近期間の最終部分中の流体の全摂取量とエタノールまたは水を再び選択できるようにした期間後の流体の全摂取量とを比較すると、ビヒクル処理動物およびＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理動物の双方が流体の全摂取量の有意な増加を示した（ビヒクル：ｄａｙ１４対ｄａｙ１９，ｐ＜０．０００１，対応のあるｔ−検定；ＭＴＨＭＰＮＭグリシン：ｄａｙ１４対ｄａｙ１９，ｐ＜０．０００１，対応のあるｔ−検定）。２つのグループを互いに比較すると制限接近期間後の流体の全摂取量に差はなかった。
【００３９】
考察
この試験は、選択的グリシン再取込みインヒビターがエタノール高嗜好性ラットの自発的エタノール摂取量を用量依存的に減少させることを証明する。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンのエタノール摂取量減少効果は次第に進行し、第二実験では４−６日の処理後に最も顕著であった。効果はその後も処理の全期間を通じて維持されていた。最も高い投与量のＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）だけがエタノール摂取量に有意な効果を与えた。投与量を減少させると（３および１．５ｍｇ／ｋｇ）、３ｍｇ／ｋｇ後にエタノール摂取量の僅かな減少は観察されたとしても有意な結果には達しなかった。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンのエタノール摂取抑制効果は堅実で用量関連的および可逆的であり、これは、観察された効果が特徴的なものでありエタノール摂取量の偶然的な変動によるものではないことを示す。
【００４０】
第二の実験では、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）処理ラットおよびビヒクル処理ラットを１４日間のアルコール遮断期間に維持した（制限接近）。ビヒクル処理およびＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理の双方の動物が制限接近期間後にエタノール摂取量の明らかな増加を示したので制限接近期間はエタノール摂取量に影響を及ぼしていた。注目すべきは、制限接近期間後にもＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理グループのエタノール摂取量がビヒクル処理グループの対応する量に比べて、その差が前ほど顕著でないにしても有意な減少を保っていたことである。いくから予想外ではあったが、制限接近期間は特にＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットの水摂取量も増加させ、これは、制限接近期間後のＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットがエタノール摂取量の減少を水の摂取量で補償する傾向にあることを示している。このような結果については他にも、何らかの特定できない環境変化によって制限接近期間中の流体摂取レベルが変化した、または、エタノールが誘発した脱水が水摂取量の増加を誘発した、などと説明できる。
【００４１】
ＭＴＨＭＰＮＭグリシンはエタノール嗜好性にも影響を及ぼした。第一実験で、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットではビヒクル処理グループに比べてエタノール嗜好性が低下していることが観察された。但しその差は統計的有意性には達していなかった。第二実験で、ＭＴＨＭＰＮＭグリシングループのエタノール嗜好性は制限接近期間の前後双方で対照に比べて有意に低下していた。制限接近期間は双方のグループのエタノール嗜好性を増進しなかった。その理由は恐らく、この試験に使用したラットがすでに極めてエタノール高嗜好性（約９０％）であり、従ってこれらの動物のエタノール嗜好性がさらに上昇することは難しかったためであろう。
【００４２】
水摂取量に関してはＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットと対照との間に有意差はなかったが、第一実験および第二実験の前半部でＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットの流体の全摂取量は有意に減少していた。グループ間のこの差は主としてエタノール摂取量の減少に起因すると考えられ、制限接近期間後に水摂取量が増加したときに差は縮小していた。従って、流体の全摂取量の減少は必ずしも常にＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理中に生じるとは限らない。総合的に考察すると、これらの結果は、ラットが化合物によって与えられた中毒作用をこうむってはいないと考え得ることを示している。また、全般的行動から判断して、この試験に使用したＭＴＨＭＰＮＭグリシンの投与量は動物の行動に影響を及ぼすことはなかった。投与量を知るためのパイロット実験では、投与量１０ｍｇ／ｋｇのＭＴＨＭＰＮＭグリシンが、１０匹中の１匹のラットの行動変化を誘発し、この変化は約１０−１５分間持続した。ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットは、制限接近／実験時間中の平均体重がビヒクル処理ラットに比べて有意に減少していた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その必要がある患者に有効量の医薬を投与するヒトの薬物中毒の治療または予防方法に関する。より特定的に方法はアルコール中毒の治療に関する。方法はまたグリシン輸送体１型インヒビターの医薬使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物中毒、例えばアルコール中毒は、男女を問わず患者の近親者や社会に多くの負の結果を与えるので、新しい治療方針が緊急に必要とされている影響の大きい疾患である。実際、最近の数年間にナルトレキソンやアカンプロセートのような新しい薬理学的治療（Ｓａｓｓら，１９９６；Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉら，１９９２；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら，２００３）がアルコール依存症の治療に有効であることが立証された。これらの物質の有効性は、高アルコール消費量の動物モデルを使用した研究から予測されていた（Ｃｚａｃｈｏｗｓｋｉら，２００１；Ｏｌｉｖｅら，２００２；Ｐａｒｋｅｓ ａｎｄ Ｓｉｎｃｌａｉｒ，２０００）。しかしながら残念なことに、ナルトレキソンおよびアカンプロセートはすべてのアルコール中毒患者に有効というものではなく、従って新しい薬理学的治療が要望されている。
【０００３】
グリシン輸送体（ＧｌｙＴ）タンパク質を介するシナプス前部神経終末または近傍のグリア細胞へのグリシンの再取込みは、シナプス後部のグリシンの作用を終結させ細胞外グリシンレベルを基底値に戻す効果的なメカニズムを構成する。現在では２つの型のグリシン輸送体タンパク質、すなわち、グリア性輸送体（１型），ＧｌｙＴ１および神経性グリシン輸送体（２型），ＧｌｙＴ２が知られている。ＧｌｙＴ１はシナプス間隙からのグリシン除去を触媒し、ＧｌｙＴ２はシナプス小胞へのグリシンの再取込みおよび再充填のために必要である（Ｇｏｍｅｚａら，２００３；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ ６（５）：６７５−８２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、その必要がある患者に有効量のＧｌｙＴ１インヒビターを投与するヒトの薬物中毒の治療または予防方法を提供する。より特定的に本発明方法は、ＧｌｙＴ１インヒビターの投与によるアルコール中毒の治療または予防方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の特定実施態様は、Ｎ−メチル−Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−メトキシ−１−フェニル−２−ナフタレニル］メチルグリシン（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンの遊離塩基）もしくは医薬的に許容されるその塩、または、４−［３−フルオロ−４−プロポキシフェニル］−スピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−１’−酢酸（ＦＰＰＳＢＰＡＡの遊離塩基）もしくは医薬的に許容されるその塩の使用である。これらの化合物は、グリシン再取込み１型インヒビターであり、脳血液関門を容易に通り抜け、主としてＧｌｙＴ１タンパク質に作用する。ＧｌｙＴ２タンパク質に対する作用は無視できる。双方の化合物のＨＣｌ塩が調製されており、これらはそれぞれＭＴＨＭＰＮＭグリシンおよびＦＰＰＳＢＰＡＡという記号を有している。これらの化合物はＧｌｙＴ１インヒビターであることが知られており、公知の方法で製造できる。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンのリチウム塩の製造はＷＯ００／０７９７８（Ｇｉｂｓｏｎら）に記載され、ＦＰＰＳＢＰＡＡの製造はＷＯ０１／３６４２３（Ｇｉｂｓｏｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ）に記載されている。その他の有用なＧｌｙＴインヒビターとしては、ＳＳＲ５０４７３４、ＡＬＸ５４０７、グリシルドデシルアミド、サルコシン、ＮＦＰＳおよびその他のサルコシン類似体、ＣＰ−８０２，０７９、Ｏｒｇ２４４６１およびＯｒｇ２４５９８がある。
【０００６】
このようなグリシン輸送体１型インヒビターが癲癇および統合失調症のような障害の治療に使用できることは以前から示唆されている（Ａｒａｇｏｎ ａｎｄ Ｌｏｐｅｚ−Ｃｏｒｃｕｅｒａ，２００３）。
【０００７】
ＭＴＨＭＰＮＭグリシンはグリシン再取込みインヒビターであり、脳血液関門を容易に通り抜け、主としてＧｌｙＴ１タンパク質に作用する。ＧｌｙＴ２タンパク質に対する作用は無視できる。この化合物は、体重約５００ｇのラットに６ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与したときに、線条体の細胞外グリシンレベルを約５０−７０％増加させ約２．５時間維持すると期待されている。別の実験では、１３．５ｍｇ／ｋｇ以上の経口投与が目に見える行動変化を誘発した。
【０００８】
抗中毒効果は長い治療期間にわたって維持できる。これは、いくつかの他の物質、たとえば、選択的セロトニン再取込みインヒビター、５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニストおよびオピエートアンタゴニストで報告された抗中毒効果と対比を成す。これらの物質は通常、エタノール消費に対する作用を迅速に開始するが１または２週間の治療後に効果を失う（Ｈｅｄｌｕｎｄ ａｎｄ Ｗａｈｌｓｔｒｏｍ，１９９６；Ｈｅｄｌｕｎｄ ａｎｄ Ｗａｈｌｓｔｒｏｍ，１９９８）。
【０００９】
われわれの結果は、臨床状態の前兆値をもつラットモデルにおいて、選択的ＧｌｙＴ１インヒビター例えばＭＴＨＭＰＮＭグリシンによる内因性細胞外脳グリシンレベルの増加がエタノール摂取量の減少およびアルコール嗜好性の低下を堅実にかつ持続的および可逆的に生じさせることを示唆する。
【００１０】
選択的グリシン再取込みインヒビターによって生じたエタノール摂取量の有意な減少には、中脳辺縁のドーパミン活性の変調が介在する。ラットの中隔側坐核のドーパミン出量の増加は（Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔら，１９９３；Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔら，１９９７；Ｄｉ Ｃｈｉａｒａ ａｎｄ Ｉｍｐｅｒａｔｏ，１９８５；ｌｍｐｅｒａｔｏら，１９８６）、ヒトの場合と同様に（Ｂｏｉｌｅａｕら，２００３）、薬物中毒およびアルコール中毒の発症および発現に関係がある（Ｋｏｏｂ ａｎｄ Ｂｌｏｏｍ，１９８８；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，１９９３；Ｗｉｓｅ，１９８７；Ｗｉｓｅ ａｎｄ Ｒｏｍｐｒｅ，１９８９）。従って、ＧｌｙＴ１インヒビターは内因性グリシンレベルを向上させ、これが中隔側坐核および／または腹側被蓋エリアのグリシン受容体と干渉し、中脳辺縁のＤＡニューロンの脱抑制を生じる。このドーパミン活性化は引き続いてエタノール消費の低減に関与する。アヘン剤、コカインのような他の中毒剤および興奮剤乱用もドーパミンの交替速度の増加に左右される。このことは、アルコール依存症に関して論議および説明されているようなＧｌｙＴ１インヒビターの治療効果が他の薬物依存症、特にアヘン剤、コカインおよび興奮剤乱用に応用できることを実証する。
【００１１】
治療は物質乱用のエピソード中に開始し継続することができる。グリシン輸送インヒビターおよびそれらの可能な用途に関するこれまでに公表された文献では、多くの可能な用途のリストに、アルコール乱用またはアルコール禁断を原因とする問題の治療（ＷＯ２００４／０１３１００）、ニコチン依存症の治療（ＷＯ０３／０３１４３５）、または、ガンマビニルＧＡＢＡと併用したアルコール禁断に付随する痙攣性および非痙攣性発作の治療（ＧＢ ２ １３８ ６８０）などが記載されている。ニコチン禁断の治療に５−ヒドロキシトリプトファンを使用することを示唆したＷＯ２００４／０８０４５４では、Ｎ−モノメチルグリシンの併用が選択肢として言及されている。これらの文献の教示はいずれも単なる選択肢という言及にとどまっており、言及された選択肢の実証データまたは実用化につながるその他の動機、指示または証拠などは示されていない。
【００１２】
グリシン輸送１型インヒビターの入手には文献を利用できる。具体的には、選択的ＧｌｙＴ１インヒビターはＷＯ００／０７９７８およびＷＯ０１／３６４２３に開示されている。これらの特許にはそれぞれ、Ｎ−メチル−Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−メトキシ−１−フェニル−２−ナフタレニル］メチルグリシン（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンの遊離塩基）および４−［３−フルオロ−４−プロポキシフェニル］−スピロ［２Ｈ−１−ベンゾピラン−２，４’−ピペリジン］−１’−酢酸（ＦＰＰＳＢＰＡＡの遊離塩基）の製造方法が見出される。
【００１３】
物質中毒問題の治療を要する患者に投与する組成物は薬学分野の標準技術に従って調製できる。化合物は、体重１ｋｇあたり０．００１−５０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり０．０１−２０ｍｇの用量で使用でき、最適用量は、投与経路、所望の作用持続時間、配合物のタイプ（持続放出性または即効性）、患者のタイプ、必要な化合物の種類、化合物の効力、治療レシピエントの他の身体的特性、例えば、他の疾患の併発、肝代謝能力などの要因に従って決定できる。ＧｌｙＴ１インヒビターによる治療を中毒の治療に適した他の薬剤と併用することもできる。これは任意選択であるから、ＧｌｙＴ１インヒビターを物質中毒治療用医薬の単一有効成分として使用することもできる。
【００１４】
選択的輸送阻害およびこのような生物効果の定量方法はグリシン生化学で公知の技術に従って決定できる。具体的な方法は後出の実施例に記載する。この実施例に基づいて、グリシン輸送１型インヒビターという用語の意味を明確にするために基準ｐＩＣ５０値を少なくとも６．０、または好ましくは６．５、またはより好ましくは７．０とする。
【００１５】
薬物依存症、アルコール依存症などの診断基準に関してはＤＳＭ ＩＶ改訂版を参照するとよい。
【００１６】
参考文献
【００１７】
【表１】
【実施例】
【００１８】
ヒトＧｌｙＴ−１ｂ輸送体を異種発現しているＣＨＯ細胞中のグリシン取込みの定量方法
Ａ：クローニング：Ｋｉｍ，Ｋ．−Ｍ．ら Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９４，４５，６０８−６１７に記載の方法に従いＰＣＲによってｃＤＮＡを作製した。ＡＬＦ ＤＮＡシークエンサーＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用するジデオキシ配列決定によって配列を検証し、発現構築物ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【００１９】
Ｂ：トランスフェクション：ＣＨＯ細胞へのｈＧｌｙＴ−１ｂのトランスフェクションはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載された標準リン酸カルシウム法を使用して行った。
【００２０】
Ｃ：選択：安定にトランスフェクトした細胞を、１ｍｇ．ｃｍ−３のゲネチシン含有の増殖培地で１週間選択した。個々のクローンを採取して以後の解析に使用し、陽性クローンを後述するように常法で継代培養した。
【００２１】
Ｄ：培養条件：ｈＧｌｙＴ−１ｂ遺伝子を安定に発現している細胞を、ゲネチシン（０．５ｍｇ．ｃｍ−３，Ｇｉｂｃｏ）含有のＧｌｕｔａｍａｘ−１（Ｇｉｂｃｏ）を含み１０％Ｆｅｔａｌｃｌｏｎｅ Ｉｌ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ−ＮＵＴ．ＭＩＸ．Ｆ１２に入れ、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で培養した。維持培養は標準８０ｃｍ２通風フラスコ（２×１０−６ｍフィルター，Ｎｕｎｃ）で行い、集密状態になったときにトリプシン処理（Ｓｉｇｍａ）によって細胞を継代培養した。
【００２２】
Ｅ：アッセイ手順：取込み試験用細胞をゲネチシン非存在下の９６ウェルプレートに平板培養し（１７，０００細胞／ウェル）、使用前に４８時間培養した。グリシン輸送を測定するために、予め３７℃に加温したハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で細胞を２回洗浄し、余剰の流体を除去した後、０．２００ｃｍ３のＨＢＳＳに溶解した試験化合物を添加した。プレートを３７℃で５分間インキュベートした後、［３Ｈ］グリシン（０．０５０ｃｍ３，１５０×１０−６Ｍ，２４８Ｂｑ．ｎｍｏｌ−１，ＮＥＮ）を添加し、インキュベーションをさらに１０分間継続した。細胞を氷冷ＨＢＳＳで洗浄することによって取込みを終了させた後、余剰の流体を除去し、０．２００ｃｍ３のシンチレーションカクテルを各ウェルに加えた。プレートを粘着フィルムでシールし、サンプルが確実に均質になるまで振盪した後、プレートカウンターでシンチレーションカウンティングを行った。
Ｆ：データ解析：活性化合物のｐＩＣ５０値を得るために標準曲線適合手順を使用してデータを解析した（ｐＩＣ５０は、５０％の取込み阻害を生じる試験化合物の濃度の負対数である）。
Ｇ：結果：
この記載でグリシン輸送１型インヒビターであることを意味した化合物のｐＩＣ５０値は、少なくとも６．０のｐＩＣ５０値を有している。
【００２３】
ラットのアルコール中毒に対する効果
材料および方法
動物
体重２５０−３００ｇ（約５０日齢）の雄のウィスターラット成体はＢｅｅｋａｙ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）から供給された。動物を４匹ずつのグループにして一定の温度（２５℃）および湿度（６５％）に維持したケージに収容した。動物を新しい環境に１週間適応させた後、実験（エタノール嗜好に基づくスクリーニング）を行った。ラットを正常な明暗条件下（午前７：００に点灯し、午後１９：００に消灯する）に維持し、ラット標準食（Ｂｅｅｋａｙ ｆｅｅｄ）および水道水には自由に接近できるようにした。この試験はＥｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎによって認可された。
【００２４】
エタノール嗜好に基づくスクリーニング
ラットがエタノール溶液および水の双方のボトルに常時接近できるようにしておいた。２週間の期間中にエタノール濃度を次第に増加した（２−４−６％ｖ／ｖ）。その後、動物を一匹ずつプラスチックケージに入れた。動物が水道水または６％エタノール溶液を入れた２つのボトルに常時接近できるようにしておいた。ウィスターラットを使用した従来の観察は、エタノール消費がほぼこの濃度で最大であることを示していた（Ｆａｈｌｋｅ，１９９４）。６−７週間の期間の水およびエタノールの摂取量を測定した。流体の全摂取量（ｇ）に対するエタノール溶液消費量（ｇ）のパーセントをエタノール嗜好指数として使用した。ラットを、それらのエタノール嗜好に基づいて、低（＜２０％エタノール）、中（２０−６０％エタノール）または高（＞６０％エタノール）嗜好群に分類した。
【００２５】
薬剤
エタノール（ＡＢ Ｓｖｅｎｓｋ ｓｐｒｉｔ）は普通の水道水に溶解し（２−４−６％ｖ／ｖ）普通の３００ｍｌプラスチックボトルに充填したものである。主としてＧｌｙＴ１に作用する（すなわち、ＧｌｙＴ２に対する作用は無視できる）グリシン再取込みインヒビターであるＭＴＨＭＰＮＭグリシンはＮＶ Ｏｒｇａｎｏｎの好意によって提供されたものを、ＮａＣｌ（０．９％）に溶解して投与した（ｉ．ｐ．）。ＮａＣｌ（０．９％）をビヒクルとして使用した。
【００２６】
実験手順
実験手順に適応させるために、約８０日齢のエタノール高嗜好性雄ウィスターラットに対してエタノール（６％ｖ／ｖ）および水の飲用を３時間／日だけに制限して１週間維持した。いわゆる飲料制限接近（制限接近）である。その後、毎日のＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルの投与を開始した。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルをｉ．ｐ．注射し、ラットを約４０分間休息させ、その後３時間はエタノールおよび水を自由に選択して飲めるようにした。第一の実験ではラットにＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを２週間投与し、アルコールおよび水の摂取量をモニターした。実験の最初と最後は制限接近期間とした。
【００２７】
第二の実験では、グリシン再取込みインヒビターの効果が再現されるか否かを検討するために新しいラット群を使用した。この場合にもラットをＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルで１３日間処理した。さらに、その後の２週間はラットのアルコール遮断期間（制限接近）とし、この期間はラットが水だけを１日に３時間飲むことができるようにした。制限接近期間後、ラットに再びＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルを投与し、さらに追加の１３日間をラットのエタノール接触期間とした。観察された効果が用量関連性であるか否かを検討するために実験のこの後半部の終了時にＭＴＨＭＰＮＭグリシンの投与量を次第に減少させた（６−３−１．５ｍｇ／ｋｇ）。
【００２８】
薬剤投与後の約４０分間はラットに水およびエタノール（６％ｖ／ｖ）のボトルを与えておいた。３時間という可飲期間は、６ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．投与したＭＴＨＭＰＮＭグリシンが線条体のグリシンレベルを約５０−８０％増加させ、その効果が約２．５−３時間持続するという予測に基づいて選択した。
【００２９】
統計
エタノールおよび水の消費量データは、反復測定値の分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびフィッシャーの制限付き最小有意差（ＰＬＳＤ）検定によるポストホック解析を順次に使用して解析した。異なる時点で得られた値間の従属比較のために対応のあるｔ検定を使用した。全ての値を平均±ＳＥＭとして表す。確率値（Ｐ）＜０．０５で統計的有意差があるとした。
【００３０】
結果
実験１
実験自体に先行する制限接近期間（ｄａｙ１−３）にはグループ間のエタノール摂取量に差はなかったのに、ＭＴＨＭＰＮＭグリシンはエタノール摂取量を有意に減少させた（群作用［Ｆ（１，１０）＝９．２３９ ｐ＝０．０１２５］，時間作用［Ｆ（１０，１００）＝１．７６５，ｐ＝０．０７６９］および交互作用項［Ｆ（１０，１００）＝０．７２１，ｐ＝０．７０３１］，ｄａｙ４−１４）。
【００３１】
ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理グループとビヒクル処理グループの間で水の摂取量に差はなかった（群作用［Ｆ（１，１０）＝０．０２８ ｐ＝０．８７１３］，時間作用［Ｆ（１０，１００）＝３．０３１，ｐ＝０．００２２］および交互作用項［Ｆ（１０，１００）＝１．１６４，ｐ＝０．３２４３］，ｄａｙ４−１４）。
【００３２】
反復測定値のＡＮＯＶＡは、エタノール嗜好に関して群作用なし［Ｆ（１，１０）＝１．９７８，ｐ＝０．１８９９］，時間作用［Ｆ（１０，１００）＝２．４９５，ｐ＝０．０１０２］、交互作用項なし［Ｆ（１０，１００）＝０．７６４，ｐ＝０．６６３１］を示した（ｄａｙ４−１４）。
【００３３】
流体の全摂取量は、ビヒクル処理グループに比べてＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理グループで有意に減少していた（群作用［Ｆ（１，１０）＝２６．５１６，ｐ＝０．０００４］，時間作用［Ｆ（１０，１００）＝１．６２２，ｐ＝０．１１１０］および交互作用項［Ｆ（１０，１００）＝１．２４７，ｐ＝０．２７１０］，ｄａｙ４−１４。しかしながら、制限接近期間中も２つのグループ間の流体の全摂取量に有意な差が存在した（群作用［Ｆ（１，１０）＝６．２５４ ｐ＝０．０３１４］，時間作用［Ｆ（２，２０）＝１．８１３，ｐ＝０．１８９０］および交互作用項［Ｆ（２，２０）＝０．７５１，ｐ＝０．４８４５］，ｄａｙ１−３。
【００３４】
実験２
新しいエタノール高嗜好性雄ウィスターラット群にＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルをｉ．ｐ．注射した。注射の約４０分後、全てのラットがエタノール（６％ｖ／ｖ）および水を自由に選択できるようにして３時間維持した。最初に全部のラットにＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを１３日間投与した。この期間の後は１４日間のアルコール遮断期間（制限接近）とし、期間中に全部のラットが水だけを飲めるようにした（３時間／日）。制限接近期間の最終４日間は再びラットにＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）またはビヒクルを毎日投与したが、水だけを飲める状態は維持した。制限接近期間が終了すると、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルの注射の約４０分後から再びラットがエタノールおよび水を選択できるようにした。この期間の最初の７日間（ｄａｙ１７−２３）はラットに６ｍｇ／ｋｇのＭＴＨＭＰＮＭグリシンを投与し、続く４日間（ｄａｙ２４−２７）は投与量を３ｍｇ／ｋｇに減らし、最後の２日間（ｄａｙ２８−２９）は最終的に１．５ｍｇ／ｋｇに減らした。実験の最初および最後は薬剤またはビヒクルを投与しない制限接近期間（３日）とし、ラットが１日に３時間だけエタノール（６％ｖ／ｖ）および水のいずれかを自由に選択して摂取できるようにした。
【００３５】
最初の６日間のＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理中にエタノール摂取量が既に有意に減少していることが観察された（群作用［Ｆ（１，１３）＝１９．０１３ ｐ＝０．０００８］，時間作用［Ｆ（５，６５）＝４．７７２，ｐ＝０．０００９］および交互作用項［Ｆ（５，６５）＝３．９１９，ｐ＝０．００３６］，ｄａｙ４−１０）。この減少は１週間の処理後にいっそう顕著になった（群作用［Ｆ（１，１３）＝２９．３６２ ｐ＝０，０００１］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝１２．８０９，ｐ＜０，０００１］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝３．１３１，ｐ＝０．００８４］，ｄａｙ１１−１７）。２週間の制限接近後、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）後のエタノール摂取量はビヒクル後に比べて有意に減少したままであった（群作用［Ｆ（１，１３）＝５．５５４ ｐ＝０．０３４８］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝１．９５４ ｐ＝０．０８２４］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝０．５８２，ｐ＝０．７４３９］，ｄａｙ１７−２３）。しかしながら、アルコール遮断期間後のエタノール摂取量は双方のグループで有意に増加していた（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンｄａｙ１４対ｄａｙ１９，ｐ＝０．０１３５，対応のあるｔ−検定；ビヒクルｄａｙ１４対ｄａｙ１９，ｐ＝０．０００６，対応のあるｔ−検定）。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンを３ｍｇ／ｋｇに切り替えた後、グループ間の差は縮小し（群作用［Ｆ（１，１３）＝１．１７９ ｐ＝０．２９７３］，時間作用［Ｆ（３，３９）＝６．０９２ ｐ＝０．００１７］および交互作用項［Ｆ（３，３９）＝１．３９８，ｐ＝０．２５７９］，ｄａｙ２４−２７）、投与量を１．５ｍｇ／ｋｇに減少させた後はこの差が全くなかった（群作用［Ｆ（１，１３）＝０．０３２ ｐ＝０．８６１４］，時間作用［Ｆ（１，１３）＝４．３４９ ｐ＝０．０５７３］および交互作用項［Ｆ（１，１３）＝２．８３９，ｐ＝０．１１５８］，ｄａｙ２８−２９）。実験の開始当時と同様に、最終制限接近期間（ｄａｙ３０−３２）中のエタノール摂取量には２つのグループ間で差がなかった。
【００３６】
ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理中の水の摂取量は、実験の前半部（制限接近前）では２つのグループ間で有意な差はなかった。制限接近期間後、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットは対照ラットに比べて水摂取量の増加傾向を示した（群作用［Ｆ（１，１３）＝４．０３２ ｐ＝０．０６５９］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝３．３２８，ｐ＝０．００５７］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝１．０３１，ｐ＝０．４１１４］，ｄａｙ１７−２３）。ビヒクルグループでは、制限接近前の水摂取量は制限接近後に比べて有意な差はなかった（ｐ＝０．０９４９，ｄａｙ１４対ｄａｙ１９，対応のあるｔ−検定）。これに対して、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットでは制限接近期間後の水摂取量が有意に増加していた（ｐ＝０．０１８８，ｄａｙ１４対ｄａｙ１９，対応のあるｔ−検定）。
【００３７】
最初の制限接近期間中にはＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理グループとビヒクル処理グループとの間にエタノール嗜好の差は存在しなかった。ＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルによる処理の最初の６日間も２つのグループ間に有意な差はなかった（群作用［Ｆ（１，１３）＝２．６１３ ｐ＝０．１３００］，時間作用［Ｆ（５，６５）＝０．９８１，ｐ＝０．４３６０］および交互作用項［Ｆ（５，６５）＝１．５１５，ｐ＝０．１９７４］，ｄａｙ４−１０）。ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理の約１週後、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットのエタノール嗜好に有意な低下が観察された（群作用［Ｆ（１，１３）＝３５．０３８ ｐ＜０，０００１］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝１．４９５，ｐ＝０．１９１０］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝０．５８３，ｐ＝０．７４３１］，ｄａｙ１１−１６）。制限接近の２週後（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンまたはビヒクルによるプレ処理４日間を含む）、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理中のエタノール嗜好はビヒクル処理中に比べて有意ではないが低下を維持した（群作用［Ｆ（１，１３）＝４．３５３ ｐ＝０．０５７２］，時間作用［Ｆ（６，７８）＝０．２２５ ｐ＝０．９６７６］および交互作用項［Ｆ（６，７８）＝０．２１９，ｐ＝０．９６９５］，ｄａｙ１７−２３）。ＭＴＨＭＰＮＭグリシン投与量を３ｍｇ／ｋｇに減らすとグループ間の差が縮小し（群作用［Ｆ（１，１３）＝２．２７４ ｐ＝０．１５５５］，時間作用［Ｆ（３，３９）＝７．２０２ ｐ＝０．００６］および交互作用項［Ｆ（３，３９）＝１．８２５，ｐ＝１．１５８６］，ｄａｙ２４−２７）、ＭＴＨＭＰＮＭグリシンの投与量を１．５ｍｇ／ｋｇに減らすとこの差が完全に無くなった（群作用［Ｆ（１，１３）＝１．７２６ ｐ＝０．２１１７］，時間作用［Ｆ（１，１３）＝０．３５５ ｐ＝０．５６１８］および交互作用項［Ｆ（１，１３）＝０．２６９，ｐ＝０．６１２７］，ｄａｙ２８−２９）。実験の開始当時と同様に、最終制限接近期間（ｄａｙ３０−３２）中のエタノール摂取量はグループ間に差はなかった。
【００３８】
４日間のＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理の後、流体の全摂取量は対照グループに比べて有意に減少していた（群作用［Ｆ（１，１３）＝４６．１８１ ｐ＜０．０００１］，時間作用［Ｆ（８，１０４）＝１４．０５４，ｐ＜０．０００１］および交互作用項［Ｆ（８，１０４）＝３．６３３，ｐ＝０．０００９］，ｄａｙ８−１６）。制限接近期間の最終部分中の流体の全摂取量とエタノールまたは水を再び選択できるようにした期間後の流体の全摂取量とを比較すると、ビヒクル処理動物およびＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理動物の双方が流体の全摂取量の有意な増加を示した（ビヒクル：ｄａｙ１４対ｄａｙ１９，ｐ＜０．０００１，対応のあるｔ−検定；ＭＴＨＭＰＮＭグリシン：ｄａｙ１４対ｄａｙ１９，ｐ＜０．０００１，対応のあるｔ−検定）。２つのグループを互いに比較すると制限接近期間後の流体の全摂取量に差はなかった。
【００３９】
考察
この試験は、選択的グリシン再取込みインヒビターがエタノール高嗜好性ラットの自発的エタノール摂取量を用量依存的に減少させることを証明する。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンのエタノール摂取量減少効果は次第に進行し、第二実験では４−６日の処理後に最も顕著であった。効果はその後も処理の全期間を通じて維持されていた。最も高い投与量のＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）だけがエタノール摂取量に有意な効果を与えた。投与量を減少させると（３および１．５ｍｇ／ｋｇ）、３ｍｇ／ｋｇ後にエタノール摂取量の僅かな減少は観察されたとしても有意な結果には達しなかった。ＭＴＨＭＰＮＭグリシンのエタノール摂取抑制効果は堅実で用量関連的および可逆的であり、これは、観察された効果が特徴的なものでありエタノール摂取量の偶然的な変動によるものではないことを示す。
【００４０】
第二の実験では、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン（６ｍｇ／ｋｇ）処理ラットおよびビヒクル処理ラットを１４日間のアルコール遮断期間に維持した（制限接近）。ビヒクル処理およびＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理の双方の動物が制限接近期間後にエタノール摂取量の明らかな増加を示したので制限接近期間はエタノール摂取量に影響を及ぼしていた。注目すべきは、制限接近期間後にもＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理グループのエタノール摂取量がビヒクル処理グループの対応する量に比べて、その差が前ほど顕著でないにしても有意な減少を保っていたことである。いくから予想外ではあったが、制限接近期間は特にＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットの水摂取量も増加させ、これは、制限接近期間後のＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットがエタノール摂取量の減少を水の摂取量で補償する傾向にあることを示している。このような結果については他にも、何らかの特定できない環境変化によって制限接近期間中の流体摂取レベルが変化した、または、エタノールが誘発した脱水が水摂取量の増加を誘発した、などと説明できる。
【００４１】
ＭＴＨＭＰＮＭグリシンはエタノール嗜好性にも影響を及ぼした。第一実験で、ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットではビヒクル処理グループに比べてエタノール嗜好性が低下していることが観察された。但しその差は統計的有意性には達していなかった。第二実験で、ＭＴＨＭＰＮＭグリシングループのエタノール嗜好性は制限接近期間の前後双方で対照に比べて有意に低下していた。制限接近期間は双方のグループのエタノール嗜好性を増進しなかった。その理由は恐らく、この試験に使用したラットがすでに極めてエタノール高嗜好性（約９０％）であり、従ってこれらの動物のエタノール嗜好性がさらに上昇することは難しかったためであろう。
【００４２】
水摂取量に関してはＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットと対照との間に有意差はなかったが、第一実験および第二実験の前半部でＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットの流体の全摂取量は有意に減少していた。グループ間のこの差は主としてエタノール摂取量の減少に起因すると考えられ、制限接近期間後に水摂取量が増加したときに差は縮小していた。従って、流体の全摂取量の減少は必ずしも常にＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理中に生じるとは限らない。総合的に考察すると、これらの結果は、ラットが化合物によって与えられた中毒作用をこうむってはいないと考え得ることを示している。また、全般的行動から判断して、この試験に使用したＭＴＨＭＰＮＭグリシンの投与量は動物の行動に影響を及ぼすことはなかった。投与量を知るためのパイロット実験では、投与量１０ｍｇ／ｋｇのＭＴＨＭＰＮＭグリシンが、１０匹中の１匹のラットの行動変化を誘発し、この変化は約１０−１５分間持続した。ＭＴＨＭＰＮＭグリシン処理ラットは、制限接近／実験時間中の平均体重がビヒクル処理ラットに比べて有意に減少していた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの薬物中毒の治療または予防方法であり、その必要がある患者に有効量のＧｌｙ−Ｔ１インヒビターを投与することを含む方法。
【請求項２】
薬物中毒がアルコール中毒である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物がＮ−メチル−Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−メトキシ−１−フェニル−２−ナフタレニル］メチルグリシンまたは医薬的に許容されるその塩である請求項１または２に記載の方法。
【請求項１】
ヒトの薬物中毒の治療または予防方法であり、その必要がある患者に有効量のＧｌｙ−Ｔ１インヒビターを投与することを含む方法。
【請求項２】
薬物中毒がアルコール中毒である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物がＮ−メチル−Ｎ−［［（１Ｒ，２Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−メトキシ−１−フェニル−２−ナフタレニル］メチルグリシンまたは医薬的に許容されるその塩である請求項１または２に記載の方法。
【公表番号】特表２００８−５２６９２４（Ｐ２００８−５２６９２４Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５０７９０（Ｐ２００７−５５０７９０）
【出願日】平成１８年１月１１日（２００６．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０１６３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７５０１１
【国際公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【出願人】（３９８０５７２８２）ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン (93)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１１日（２００６．１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０５０１６３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７５０１１
【国際公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【出願人】（３９８０５７２８２）ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン (93)
【Ｆターム（参考）】
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