虚血の治療方法
虚血治療方法及び治療用組成物を含む虚血の治療システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血治療方法及び治療用組成物を含む虚血の治療システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
優先権出願に係るクロス・リファレンス
本出願は、２００４年９月１６日に出願された特許文献１に係る（パリ条約及び米国特許法第１１９条（ｅ）を含むがこれらに限定されない）米国法及び国際法に基づく優先権を主張するが、前記米国特許仮出願は、その全内容が全ての目的のために引用によって本明細書に取り込まれる。
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／６１１，２４１号明細書
【０００３】
政府の実施権
本発明は国立衛生研究所（ＮＩＨ）からのグラントＲ２１ ＮＳ４２７９９に基づく米国政府の支援でなされた。したがって米国政府は本発明に関して一定の実施権を有する場合がある。
【０００４】
脳卒中は、例えば脳へ血液を供給する血管内の凝固又は漏出に起因する、脳への血流の障害により引き起こされる場合がある。この血流の障害は、脳組織から酸素を奪い、しばしば局所的な脳組織の壊死（局所的梗塞）をもたらし、脳の永続的な損傷をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ニューロンへのイオン流入量の変化は、脳卒中によって生じる細胞死につながる場合がある。したがって、さまざまなイオンチャネルがこのイオン流入量の変化を仲介する候補となる場合があり、適切な治療標的の探索を混乱させる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、虚血治療方法及び治療用組成物を含む虚血の治療システムを提供する。
【０００７】
図表の簡単な説明
図１は、本発明の局面にしたがって虚血を治療する代表的な方法を示すフローチャートである。
図２は、本発明の局面にしたがって虚血の治療薬を同定する代表的な方法を示すフローチャートである。
図３は、本発明の局面にしたがって培養マウス皮質ニューロンにおける酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）タンパク質の電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを表す、一連のグラフである。
図４は、本発明の局面にしたがって培養マウス皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣタンパク質の電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを表す、付加的な一連のグラフである。
図５は、本発明の局面にしたがってモデル虚血がＡＳＩＣタンパク質の活性を上昇させる場合があることを示す代表的なデータを表す、グラフとトレース図の組である。
図６及び７は、本発明の局面にしたがって、皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣタンパク質がＣａ２＋透過性の場合があることと、Ｃａ２＋透過性がＡＳＩＣ１ａ依存性の場合があることとを示す、代表的なデータを表すグラフとトレース図の組である。
図８は、本発明の局面にしたがって、酸インキュベーションが、ＡＳＩＣ遮断により保護されるグルタミン酸受容体非依存性ニューロン損傷を誘発する場合があることを示す、代表的なデータを表す、一連のグラフである。
図９は、本発明の局面にしたがって、ＡＳＩＣ１ａがｉｎ ｖｉｔｒｏでの酸で誘発される損傷に関与する場合があることを示す、代表的なデータを表す一連のグラフである。
図１０は、本発明の局面にしたがって、ＡＳＩＣ１ａの遮断による、及び、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトによるｉｎ ｖｉｖｏでの脳虚血における神経保護を示す、データ付の一連のグラフである。
図１１は、本発明の局面にしたがって、動物モデル系での、時間と処置のタイプとの関連で示した脳卒中により生じる虚血性損傷の百分率についての代表的なデータをプロットしたグラフである。
図１２は、本発明の局面にしたがって、さまざまな代表的なペプチドの特徴が示された、代表的なシスチン・ノット・ペプチドであるＰｃＴｘ１の、一次アミノ酸配列の概観である。
図１３は、本発明の局面にしたがって、図１２のシスチン・ノット・ペプチドのさまざまな代表的な欠失誘導体とともに整列されたシスチン・ノット・ペプチドの比較図である。
図１４は、本発明の局面にしたがって、細胞中に発現されたＡＳＩＣファミリーのメンバーとの関連で示した、細胞中で測定されたカルシウム電流の振幅をプロットした代表的なグラフである。
図１５は、本発明の局面にしたがって、動物モデル系での虚血性損傷を低減する、経鼻的に投与されたＰｃＴｘ毒の有効性に関する代表的なデータを表すグラフである。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、虚血治療方法及び治療用組成物を含む虚血の治療システムを提供する。前記方法は、虚血に起因する損傷を低減させるためのアプローチ、及び／又は、虚血の治療薬を同定するためのアプローチを含む場合がある。前記方法は、虚血を標的とする治療方法を提供するために、酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーの１個又は２個以上のメンバーを選択的に阻害する場合がある。
【０００９】
図１は、虚血治療方法において実施される場合がある代表的なステップ２２及び２４を有するフローチャート２０を示す。前記ステップは、いずれかの適切な回数及びいずれかの適切な組合せで実施される場合がある。前記方法では、符号２２に示すように、単数又は複数の虚血患者が治療のために選択される場合がある。次に符号２４に示すように、ＡＳＩＣ選択的阻害剤が単数又は複数の虚血患者に投与される場合がある。前記虚血患者への阻害剤の投与量は、前記患者の虚血で誘発される損傷を低減させるため、例えば、脳卒中に起因する脳損傷の量を低減させるために、治療上の有効量の範囲内の場合がある。
【００１０】
図１の虚血治療方法の有効性についての可能性のある説明は、本発明（例えば、実施例１を参照）のデータによって提供される場合がある。具体的には、虚血の損傷効果はアシドーシスとは等しくない、すなわち、虚血を介する組織／細胞の酸性化は、虚血で誘発される損傷を発生させるには十分ではない。むしろ、虚血で誘発される損傷は、多くの場合、ＡＳＩＣファミリーの１個又は２個以上のメンバー、特に、ＡＳＩＣ１ａにより仲介される細胞内へのカルシウムの流入により引き起こされる。したがって、ＡＳＩＣ１ａのチャネル活性の選択的阻害は、この有害なカルシウム流入を低減させ、これにより虚血で誘発される損傷を低減させる場合がある。
【００１１】
図２は、虚血の治療薬を同定する方法において実施される場合がある代表的なステップ３２及び３４を有するフローチャート３０を示す。前記ステップは、いずれかの適切な回数及びいずれかの適切な組合せで実施される場合がある。前記方法では、符号３２に示すように、１個又は２個以上のＡＳＩＣ選択的阻害剤が得られる場合がある。次に符号３４に示すように、前記阻害剤は、虚血で誘発される損傷に対する効果について、虚血患者でテストされる場合がある。
【００１２】
本発明の方法は、他の虚血治療方法と比べて１つ又は２つ以上の利点を提供する場合がある。これらの利点は、（１）虚血で誘発される損傷が少ないこと、（２）（例えば、より特異的な治療標的を選択するために）治療の副作用が少ないこと、及び／又は、（３）治療効果がより長期間持続すること、等を含む場合がある。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、（Ｉ）虚血、（ＩＩ）虚血患者及び患者の選択、（ＩＩＩ）ＡＳＩＣ阻害剤、（ＩＶ）阻害剤の投与、（Ｖ）治療薬の同定、及び（ＶＩ）実施例、を含み、以下の節で述べられる。
【００１４】
Ｉ．虚血
本発明のシステムは、いずれかの適切な虚血治療方法に向けられる。本明細書で用いられるところの虚血とは、単数又は複数の器官及び／又は組織への血流減少をいう。前記血流減少は、前記器官及び／又は組織へ血液を供給する１本又は２本以上の血管の、部分的な若しくは完全な遮断（閉塞）、狭窄、及び／又は、漏出／破裂、等を含むいずれかの適切なメカニズムにより引き起こされる場合がある。したがって虚血は、血栓症、塞栓症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、出血、動脈瘤、外科手術、外傷、薬剤服用及び／又はこれらに類するものによって作出される場合がある。故に、前記血流減少は、慢性、一過性、急性、散発性及び／又はこれらに類するものの場合がある。
【００１５】
いずれの適切な器官又は組織でも、治療される虚血で血流減少を経験する場合がある。代表的な器官又は組織は、脳、動脈、心臓、腸、眼（例えば、視神経）等を含む場合がある。さまざまな虚血により生じる虚血で誘発される損傷（すなわち、病気及び／又は損傷）は、虚血性脊髄症、虚血性視神経症、虚血性結腸炎、冠状動脈性心臓病、及び／又は心性心臓病（ｃａｒｄｉａｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ、例えば、狭心症、心臓発作等）等を含む場合がある。故に、虚血で誘発される損傷は、例えば、人体の患部で、壊死（梗塞）組織、炎症、及び／又は組織の再構築等を生じさせて、細胞及び／又は組織を傷つけ、及び／又は、殺す場合がある。本発明の局面による治療は、この損傷の発生率、範囲、及び／又は重傷度を低減する場合がある。
【００１６】
本発明のシステムは、脳卒中の治療方法を提供する場合がある。本明細書で用いられるところの脳卒中とは、脳の一部又は全部への血液供給の減少により生じる脳の虚血をいう。脳卒中により生じる症状は、（意識喪失のように）突発的であるか、あるいは、数時間又は数日かけて緩やかに始まる場合がある。さらに脳卒中は、重度な虚血性発作（フル・ストローク（ａ ｆｕｌｌ ｓｔｒｏｋｅ））か、あるいは、より軽度な、一過性の虚血性発作等の場合がある。脳卒中により生じる症状は、例えば、片側不全麻痺、半身不随、片側無感覚、片側脱力、片側麻痺、一時的な四肢の脱力、四肢の痛み、精神錯乱、発話困難、会話理解困難、片目又は両目の視力低下、弱視、失明、歩行困難、目まい、転倒傾向、協調運動障害、突発的な重度の頭痛、騒々しい呼吸及び／又は意識喪失を含む場合がある。代替的に又は追加的に、前記症状は、例えば、（例えば、アルブミンの変化、特定のタンパク質アイソフォーム、損傷したタンパク質等を検査するための）虚血血液テスト、心電図、脳波図、運動負荷テスト、及び／又はこれらに類するものを通じて、より容易に検出できるか、前記テスト及び／又は機器を通じてのみ検出できる場合がある。
【００１７】
ＩＩ．虚血患者及び患者の選択
本発明のシステムは、患者への虚血性の損傷を低減するために、虚血患者の治療方法を提供する場合がある。本明細書で用いられるところの虚血患者とは、虚血、虚血に関連する症状、虚血の病歴、及び／又は、治療の開始後でありかつ治療が有効な期間内に虚血が進行する有意な可能性を有する人間（ヒト患者）又は動物（被験動物）のいずれかをいう。
【００１８】
前記虚血患者は動物の場合がある。本明細書で用いられるところの用語「動物」とは、ヒト以外のいずれかの動物を指す。適切かもしれない代表的な動物は、齧歯類（マウス、ラット等）、イヌ、ネコ、鳥類、ヒツジ、ヤギ、ヒト以外の霊長類、等のような血液循環を有する動物のいずれかを含む。前記動物は、該動物自体のために、例えば（ペットの治療のように）獣医学的な目的で、治療を受ける場合がある。代替的には前記動物は、ヒトが使用する治療薬候補の試験を促進するために、例えば候補薬の有効性、有効期間、副作用等を決定するために、虚血の動物モデルを提供する場合がある。動物モデル系で実施されるテストのさらなる局面は、以下の第Ｖ節で説明される。
【００１９】
虚血に関連する症状は、虚血のいずれかの結果の場合がある。前記結果は、虚血の開始と実質的に同時進行である場合があり（例えば、該虚血の直接の効果）、及び／又は、実質的に虚血の開始後に起こる場合、及び／又は、虚血の終了後であっても起こる場合（例えば、虚血終了後の組織再潅流のような、虚血の間接的な下流効果）がある。代表的な虚血に関連する症状は、上述の第Ｉ節にて列挙した症状（及び／又は病状）のいずれかの組合せを含む場合がある。代替的に又は追加的に、前記症状は、局所的な及び／又は全身のアシドーシス（ｐＨの低下）、低酸素症（酸素の減少）、フリーラジカルの発生、及び／又はこれらに類するものを含む場合がある。
【００２０】
治療対象の虚血患者は、いずれかの適切な基準により選択される場合がある。代表的な基準は、検出可能な虚血の症状のいずれか、虚血の病歴、（例えば、外科手術、外傷、薬剤服用等のような）虚血のリスクを増大させる（又は虚血を誘発させる）事象、及び／又はこれらに類するものを含む場合がある。虚血の病歴は、１回又は２回以上のより重要な虚血のエピソードを伴う場合がある。一部の実施例では、治療のために選択された患者は、治療開始の少なくとも約１、２又は３時間前に虚血が開始している場合があるか、又は、治療の開始前約１日、１２時間、又は６時間未満に起きた、（一過性の虚血性発作のような）複数の虚血のエピソードを有する場合がある。
【００２１】
ＩＩＩ．ＡＳＩＣ阻害剤
本明細書で用いられるところのＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害剤とは、ＡＳＩＣファミリー、すなわち、ＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３、ＡＳＩＣ４等のうち１個又は２個以上のメンバーの活性を低減させる（部分的に、実質的に、又は完全に阻害する）物質をいう。一部の実施例では、前記阻害剤は１個又は２個以上のメンバーのチャネル活性、例えば細胞膜を通じて（細胞の内側及び／又は外側へ）イオン（例えば、ナトリウムイオン、カルシウムイオン及び／又はカリウムイオン等）を流出入させるメンバーの活性、を低減させる場合がある。前記物質は、化合物（約１０ｋＤａ未満の小分子、ペプチド、核酸、脂質、その他）、２又は３以上の化合物の複合体、及び／又は混合物等の場合がある。さらに前記物質は、競合型、非競合型、不競合型、及び／又は混合型等を含むいずれかの適切なメカニズムによって、ＡＳＩＣファミリーのメンバーを阻害する場合がある。
【００２２】
前記阻害剤は、酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）を阻害するＡＳＩＣ１ａ阻害剤の場合がある。本明細書で用いられるところのＡＳＩＣ１ａとは、いずれかの生物種からのＡＳＩＣ１ａタンパク質又はチャネルを指す。例えば、代表的なヒトＡＳＩＣ１ａタンパク質／チャネルは、引用によって本明細書に取り込まれる、Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｒ．、ｅｔ ａｌ． １９９７、 Ｎａｔｕｒｅ ３８６、ｐｐ．１７３−１７７に説明されている。
【００２３】
「ＡＳＩＣ１ａ阻害剤」という表現は、適切な薬理学的判断の範囲内でＡＳＩＣ１ａの阻害剤として潜在的に又は実際的に医薬品として有用である製品を指す場合があり、医薬品として活性のある分子種を含み、及び、ＡＳＩＣ１ａ阻害剤として説明されているか、宣伝されているか、承認されている物質を指すことを含む。
【００２４】
ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は、ＡＳＩＣファミリーの範囲内でも選択的である場合がある。本明細書で用いられるところのＡＳＩＣ１ａ選択的阻害とは、（例えば、培養細胞において）同じ（最高以下の）濃度の阻害剤への各々の暴露の後で比較したときに、別のＡＳＩＣファミリーのメンバーに対してよりも、ＡＳＩＣ１ａに対して実質的により強く阻害することをいう。前記阻害剤は、少なくとも１個の他のＡＳＩＣファミリーのメンバー（ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３、ＡＳＩＣ４等）と比較して選択的に、及び／又は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較しても選択的に、ＡＳＩＣ１ａを阻害する場合がある。選択的阻害剤の阻害の強さは、異なるＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較した阻害の起きる阻害剤濃度（例えば、ＩＣ５０（最大阻害の５０％が起こる阻害剤濃度）又はＫｉ値（阻害定数又は解離定数））によって説明される場合がある。ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、少なくとも１個の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーの、又は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害に対してよりも、少なくとも約２倍か、４倍か、１０倍低い（２分の１か、４分の１か、１０分の１か、さらに低い）濃度で、ＡＳＩＣ１ａ活性を阻害する場合がある。したがってＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、少なくとも１個の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに対してよりも、及び／又は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害に対してよりも、ＡＳＩＣ１ａ阻害に対して、少なくとも約２倍か、４倍か、１０倍低い（２分の１か、４分の１か、１０分の１か、さらに少ない）ＩＣ５０及び／又はＫｉ値を有する場合がある。
【００２５】
ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、選択的であることに加えて、ＡＳＩＣ１ａに対して特異的である場合もある。本明細書で用いられるところのＡＳＩＣ１ａ特異的阻害とは、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較しても、ＡＳＩＣ１ａに対して実質的に独占的である阻害をいう。ＡＳＩＣ１ａ特異的阻害剤は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害に対してよりも、少なくとも約２０倍低い（５％以下の）阻害剤濃度で、ＡＳＩＣ１ａを阻害する場合がある。したがってＡＳＩＣ１ａ特異的阻害剤は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較しても、ＡＳＩＣ１ａに対して、少なくとも約２０倍低い（５％以下の）ＩＣ５０及び／又はＫｉ値を有する場合があり、その結果例えば、他のＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害は、少なくとも実質的に又は完全に検出できない。
【００２６】
いずれかの適切なＡＳＩＣ阻害剤又は阻害剤の組合せを使用してもかまわない。例えば患者は、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤と非選択的ＡＳＩＣ阻害剤とか、あるいは、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤と、ＡＳＩＣ以外のカルシウムチャネルのようなＡＳＩＣ以外のチャネルタンパク質の阻害剤とかで、治療される場合がある。一部の実施例では患者は、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤と、グルタミン酸アンタゴニストのようなＮＭＤＡ受容体の阻害剤とで、治療される場合がある。
【００２７】
前記阻害剤はペプチドであるか又はペプチドを含むかの場合がある。該ペプチドは、いずれかの適切な数の、一般的に少なくとも約１０個で、かつ約１，０００個未満の、アミノ酸サブユニットを有する場合がある。一部の実施例では、前記ペプチドはシスチン・ノット・モチーフ（ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｍｏｔｉｆ）を有する場合がある。本明細書で用いられるところのシスチン・ノットとは、６個又は７個以上のシステインの配置を含むものをいうのが一般的である。これらのシステインを有するペプチドは、（１）２個のジスルフィド結合とそれらが接続する主鎖セグメントとにより形成されるリングと、（２）該リングを通り抜ける３個目のジスルフィド結合と、を含む「ノット」を作り出す場合がある。一部の実施例では、前記ペプチドは、クモ形類動物及び／又はカタツムリ状の巻貝種（ｃｏｒｎ ｓｎａｉｌ）由来のコノトキシンの場合がある。例えば、前記ペプチドは、タランチュラ（Ｐｓａｌｍｏｐｏｅｕｓ ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ（Ｐｃ））由来の毒素であるＰｃＴｘ１（ｐｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ １）の場合がある。
【００２８】
一部の実施例では、前記ペプチドはＰｃＴｘ１と構造的に関連する場合があり、前記ペプチド及びＰｃＴｘ１は、１個又は２個以上のアミノ酸の、少なくとも１ヶ所の欠損、挿入及び／又は置換だけ異なっている。例えば前記ペプチドはＰｃＴｘ１と、少なくとも約２５％の又は少なくとも約５０％の、配列同一性及び／又は配列類似性を有する場合がある（下記参照）。阻害剤として適切な場合があるペプチドのさらなる局面は下記実施例３で述べられる。
【００２９】
アミノ酸配列の比較のためのアライメント方法と、同一性及び類似性スコアの算出方法とは当業者に周知である。適切な場合がある代表的なアライメント方法は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの方法（Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（ＧＡＰ）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似法（Ｔｆａｓｔａ ａｎｄ Ｆａｓｔａ）、及び／又はこれらに類するものを含む。適切な場合があるこれらその他のアプローチのコンピューターアルゴリズムは、ＣＬＵＳＴＡＬと、ＧＡＰと、ＢＥＳＴＦＩＴと、ＢＬＡＳＴＰと、ＦＡＳＴＡと、ＴＥＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で用いられるところの、２つのペプチドの文脈における「配列同一性」又は「同一性」とは、対応度が最大となるようにアライメントをとるときに同じである対応するペプチド配列中の残基の百分率に関する。一部の実施例では、同一でないペプチド残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なっている場合があり、ここでアミノ酸残基は、（例えば電荷や疎水性のような）化学特性が類似する他のアミノ酸残基に置換されるので、分子の機能特性に対する影響が小さいか又は全く影響が無いことが予想される。保存的置換により配列が異なる場合には、置換の保存的特性について訂正する配列の「類似性」を示すために、配列同一性の百分率が上方に修正される場合がある。例えば、各々の保存的置換は、全体的なミスマッチよりもむしろ部分的なミスマッチとして評価される場合があり、故に、類似性スコアを提供するために、配列同一性の百分率を訂正している。類似性スコアを得るための保存的置換のスコア方法は当業者に周知であり、いずれかの適切なアプローチにより、例えばＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）のプログラムで実施されるような、Ｍｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムにしたがって、計算される場合がある。
【００３１】
ＩＶ．阻害剤の投与
本明細書で用いられるところの投与とは、患者を阻害剤に曝すいずれかの経路、いずれかの適切な条件下で、及び、いずれかの適切な回数、を含む。投与は、自分自身による投与、又は、（例えば、医師、看護師等）保健実務家のような他人による投与の場合がある。投与は、（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、脳内、硬膜外、及び／又は髄腔内等への）注射により、（例えば、カプセル、トローチ、液体組成物等を用いた）経口摂取により、（例えば、経鼻的及び／又は経口的な（液滴直径が平均約１０ミクロン未満の）エアゾールの）吸入により、（例えば、皮膚用パッチ剤を用いる）経皮吸収及び／若しくは（例えば、口腔、鼻腔及び／又は肺粘膜等の）経粘膜吸収により、並びに／又はこれらに類するものによる場合がある。経粘膜投与は、例えば、（鼻腔用噴霧器のような）噴霧器、吸入されるエアゾール、及び／又はこれらに類するものを用いて実施される場合がある。噴霧は、（液滴の直径が平均約５０ミクロンより大きい）表面噴霧及び／又は（液滴の直径が平均約１０〜５０ミクロンである）空間噴霧の場合がある。一部の実施例では、虚血は虚血患者の血液脳関門に変化を起こす場合があり、故に、患者の血流に（例えば、注射及び／又は吸収によって）導入される阻害剤が脳へ到達できる効率を向上させている。投与は、治療を提供するために、１回又は複数回、かつ、虚血の診察結果に対応していずれかの適切な時間実施される場合がある。したがって投与は、虚血が（例えば予防的に）検出される前、主要でない虚血のエピソードが観察された後、慢性的な虚血の間、フル・ストロークの後、及び／又はこれらに類する場合に実施される場合がある。
【００３２】
阻害剤の治療上の有効量が投与される場合がある。本明細書で用いられるところの阻害剤の治療上の有効量とは、患者に投与されたときに、有意な数の患者において、該患者における虚血で誘発される損傷の程度、発生率及び／又は範囲を低減させる阻害剤のいずれかの量をいう。したがって治療上の有効量は、例えば、治験患者に対してさまざまな量の阻害剤が投与される（そして一般的には、対照群の患者と比較される）臨床研究において決定される場合がある。
【００３３】
前記阻害剤は、いずれかの適切な形状及びいずれかの適切な組成で患者に投与される場合がある。一部の実施例では前記阻害剤は、医薬品として許容される塩として構成される場合がある。上述の組成物は、例えば、流動体状のキャリアー（ｃａｒｒｉｅｒ）／溶媒（薬物送達手段（ｖｅｈｉｃｌｅ））、保存料、１種類か２種類以上の賦形剤、着色料、香料、塩、消泡剤及び／又はこれらに類するものを含めて設定される場合がある。前記阻害剤は、虚血患者に投与されたときに虚血の治療に対する阻害剤の治療上の有効量を提供する薬物送達手段中の濃度で存在する場合がある。
【００３４】
Ｖ．治療薬の同定
その他のＡＳＩＣ阻害剤が、虚血治療薬として使うために、同定される場合がある。同定は、（Ａ）１種類又は２種類以上のＡＳＩＣ阻害剤の取得と（Ｂ）虚血患者でのＡＳＩＣ阻害剤のテストとを含む。
【００３５】
Ａ．ＡＳＩＣ阻害剤の取得
１種類又は２種類以上のＡＳＩＣ阻害剤、特に上記のＡＳＩＣ１ａ阻害剤が取得される場合がある。前記阻害剤は、（例えば、２個又は３個以上の化合物のライブラリーのような）一組の候補阻害剤のスクリーニング及び／又は理論的な設計等のような、いずれかの適切なアプローチで、取得される場合がある。
【００３６】
スクリーニングは、ＡＳＩＣタンパク質と前記一組の候補阻害剤との間の相互作用を測定するいずれかの適切なアッセイ系を含む場合がある。代表的なアッセイ系は、（例えば、結合アッセイのように）生化学的に実施されるアッセイ、培養状態で増殖した細胞（培養細胞）を用いて行われるアッセイ、及び／又は生物個体を行われるアッセイ等を含む場合がある。
【００３７】
細胞を利用するアッセイ系は、各々の候補阻害剤の、細胞内のイオンの流出入、一般的には、酸感受性のイオン流出入に与える効果が存在するときには、これを測定する場合がある。一部の実施例では、前記イオン流出入は、カルシウム及び／又はナトリウム等の流出入の場合がある。前記アッセイ系は、ＡＳＩＣファミリーのメンバーに対する各々の阻害剤の選択性を決定するために、ＡＳＩＣ１ａのようなＡＳＩＣファミリーのメンバーを発現する細胞か、又は、ＡＳＩＣ１ａと別の１つ若しくは２つ以上のＡＳＩＣファミリーメンバーとのような、２つ又は３つ以上の相異なるＡＳＩＣファミリーのメンバーを発現する２つ又は３つ以上の相異なる組の細胞かを使用する場合がある。前記細胞は、内在的に、又は外来の核酸の導入を通じて、各々のＡＳＩＣファミリーのメンバーを発現する場合がある。一部の実施例では前記アッセイ系は、（パッチクランプ法のように）電気生理学的にか、（例えば、Ｆｕｒａ−２のようなカルシウム感受性色素のような）イオン感受性又は膜ポテンシャル感受性の色素を用いるか、膜ポテンシャル及び／又は（例えば、カルシウムのような）細胞内イオン濃度等の変化に対し感受性のある遺伝子を利用するレポーター系を介するかによって、イオン流出入を測定する場合がある。前記アッセイ系は、ＡＳＩＣファミリーのメンバー、特に、ＡＳＩＣ１ａの選択的及び／又は特異的阻害に対して候補阻害剤をテストするために使用される場合がある。
【００３８】
Ｂ．患者でのＡＳＩＣ阻害剤の治験
１個又は２個以上のＡＳＩＣ阻害剤が、虚血治療についての該阻害剤の薬効をテストするために、虚血患者に投与される場合がある。前記虚血患者はヒト又は動物の場合がある。一部の実施例では、前記虚血患者は、虚血及び／又は発作の動物モデル系を提供する場合がある。代表的な動物モデル系は、実験的に誘発された虚血を有する齧歯類（マウス及び／又はラット等）を含む。前記虚血は、機械的に（例えば外科的に）、及び／又は、薬剤の投与等により誘発される場合がある。一部の実施例では前記虚血は、中大脳動脈の狭窄のような血管の閉塞により誘発される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の選択された局面及び実施態様、特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＡＳＩＣ阻害効果と、阻害剤として使用される代表的なシスチン・ノット・ペプチドとを説明するデータを説明する。これらの実施例は、例示の目的で意図されており、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００４０】
カルシウム透過性酸感受性イオンチャネルを遮断する、虚血における神経保護
本実施例は、虚血性損傷を仲介するＡＳＩＣ１ａの役割と、虚血性損傷を低減させるＡＳＩＣ１ａ阻害剤の能力とを示す実験を説明する。図２−１０を参照せよ。
【００４１】
Ａ．概観
Ｃａ２＋の毒性は、虚血脳損傷において中心的な役割を果たす場合がある。虚血脳において細胞への有毒なＣａ２＋の取り込みが起きるメカニズムは、グルタミン酸アンタゴニストの複数回のヒト治験が発作における有効な神経保護を示すことに失敗してきたために、不明確になった。アシドーシスは虚血の共通の特徴である場合があり、脳損傷において重大な役割を果たす場合があるが、そのメカニズムは特定されないままである。ここで我々は、アシドーシスがＣａ２＋透過性酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣｓ）を活性化する場合があり、それがグルタミン酸受容体非依存性で、Ｃａ２＋依存性の、ＡＳＩＣブロッカーにより阻害されるニューロン損傷を誘発する場合があることを示す。Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａのトランスフェクションが感受性を確立する場合があるのに対して、内在性ＡＳＩＣｓを欠損している細胞は、酸損傷に耐性の場合がある。局所的虚血においては、ＡＳＩＣ１ａブロッカーの脳室内注射又はＡＳＩＣ１ａ遺伝子のノックアウトが、虚血性損傷から脳を保護する場合があり、かつ、グルタミン酸の拮抗作用よりも強く脳を保護する場合がある。したがってアシドーシスは、結果的に生ずる［Ｃａ２＋］ｉ（細胞内カルシウム）の毒性による膜受容体を基づくメカニズムを介して脳を損傷する場合があり、発作に対する新しい潜在的治療標的を開示する。
【００４２】
Ｂ．序論
細胞内へのＣａ２＋過剰取り込みは、脳虚血を含む、神経病理学的症候群に関連するニューロン損傷に対して重要な場合がある（Ｃｈｏｉ １９９５及びＣｈｏｉ １９８８ａ）。過剰な細胞内Ｃａ２＋は、タンパク質、脂質及び核酸を分解する酵素の活性化を導く細胞障害反応のカスケードを活性化する場合がある。中枢神経系における最も重要な興奮性神経伝達物質受容体の場合がある（ＭｃＬｅｎｎａｎ １９８３及びＤｉｎｇｌｅｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．１９９９）ＮＭＤＡ受容体は、虚血脳におけるＣａ２＋過剰取り込みに関与する主要な標的であると長い間考えられてきた（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｒｏｔｈｍａｎ ａｎｄ Ｏｌｎｅｙ １９８６；Ｃｈｏｉ １９８８ｂ及びＭｅｌｄｒｕｍ １９９５）。しかし、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの治療上の使用を通じて脳損傷を予防するための近年の臨床治療の努力は期待外れであった（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９９及びＷａｈｌｇｒｅｎ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ ２００４）。治療の早期開始の困難さを含めて、多数の要因が治験の失敗に寄与したかもしれないが、グルタミン酸受容体非依存性Ｃａ２＋毒性も、追加的又は代替的に、虚血脳損傷に関与している場合がある。
【００４３】
正常な脳は、そのエネルギー要求を満足させるために、グルコースの完全酸化を必要とする場合がある。虚血の際には、酸素の枯渇が脳に嫌気的解糖への切り替えを強要する場合がある。解糖の副生成物としての乳酸と、ＡＴＰの加水分解により生成されるプロトンとの蓄積が、虚血脳におけるｐＨの低下を引き起こす場合もある（Ｒｅｈｎｃｒｏｎａ １９８５及びＳｉｅｓｊｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）。その結果組織ｐＨは、正常血糖の条件下での虚血の際に６．５−６．０へ低下するのが典型的で、重度の虚血の際又は高血糖の条件下では、６．０より下に低下する場合がある（Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｒｅｈｎｃｒｏｎａ １９８５及びＳｉｅｓｊｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）。ほとんど全てのｉｎ ｖｉｖｏの研究は、アシドーシスが虚血脳損傷を悪化させることを示す（Ｔｏｍｂａｕｇｈ ａｎｄ Ｓａｐｏｌｓｋｙ １９９３及びＳｉｅｓｊｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）。しかし、多くの可能性が示唆されているものの、このプロセスのメカニズムは不透明なままである（Ｓｉｅｓｊｏ ｅｔ ａｌ．１９９６；ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９５及びＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９９）。
【００４４】
新規に記載されたリガンド依存性（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ）チャネルのクラスである（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ及びＫｒｉｓｈｔａｌ ２００３）酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣｓ）は、哺乳類の中枢及び末梢の神経系ニューロンの到るところに発現されることが示された（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ；Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｗａｌｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ １９９８；Ｋｒｉｓｈｔａｌ ２００３；Ａｌｖａｒｅｚ ｄｅ ｌａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２００２及びＡｌｖａｒｅｚ ｄｅ ｌａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２００３）。これらのチャネルは、ｄｅｇｅｎｅｒｉｎ／上皮ナトリウムチャネル（Ｄｅｇ／ＥＮａＣ）スーパーファミリーのメンバーである（Ｂｅｎｏｓ ａｎｄ Ｓｔａｎｔｏｎ １９９９；Ｂｉａｎｃｈｉ ａｎｄ Ｄｒｉｓｃｏｌｌ ２００２及びＫｒｉｓｈｔａｌ ２００３）。虚血に関連して、ＡＳＩＣｓもＣａ２＋を流入させる場合がある（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．２００２及びＹｅｒｍｏｌａｉｅｖａ ｅｔ ａｌ．２００４）。
【００４５】
今まで、６種類のＡＳＩＣサブユニットがクローニングされている。これらのサブユニットのうち４種類は、酸性のｐＨで活性化され、ナトリウム選択性でアミロリド感受性の陽イオン流を導通させる機能的なホモ多量体チャネルを形成する場合がある。これらのチャネルの最大活性の半分の活性が得られるｐＨ（ｐＨ０．５）は異なる。ＡＳＩＣ１ａではｐＨ０．５＝６．２であり（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ａ）、ＡＳＩＣ１ａのスプライス変異体であり独特なＮ末端を有するＡＳＩＣ１β（ＡＳＩＣ１ｂともいう。）ではｐＨ０．５＝５．９であり（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ＡＳＩＣ２ａではｐＨ０．５＝４．４であり（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、ＡＳＩＣ３ではｐＨ０．５＝６．５である（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ｂ）。ＡＳＩＣ２ｂもＡＳＩＣ４も機能的なホモ多量体チャネルを形成できない（Ａｋｏｐｉａｎ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｇｒｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００及びＬｉｎｇｕｅｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．１９９７）が、ＡＳＩＣ２ｂは他のサブユニットと会合し活性を調節することが示されている（Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｎａ＋透過性に加えて、ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａはＣａ２＋を流入させる場合がある（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．２００２及びＹｅｒｍｏｌａｉｅｖａ ｅｔ ａｌ．２００４）。ネイティブのニューロンにおけるＡＳＩＣｓの正確なサブユニット組成は決定されていないが、ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ２ａ両方のサブユニットは脳の中に豊富に存在することが示されている（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｂａｓｓｉｌａｎａ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．２００２及びＡｌｖａｒｅｚ ｄｅ ｌａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２００３）。
【００４６】
末梢及び中枢両方の神経系におけるＡＳＩＣｓの詳細な機能は、未決定のままである。末梢感覚ニューロンにおいてＡＳＩＣｓは、特にＡＳＩＣｓが狭心痛を伝達する可能性がある（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）虚血心筋における、機械的感覚（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．２０００及びＰｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．２００１）と、組織アシドーシスの間の痛みの認知（Ｂｅｖａｎ ａｎｄ Ｙｅａｔｓ １９９１；Ｋｒｉｓｈｔａｌ ａｎｄ Ｐｉｄｏｐｌｉｃｈｋｏ １９８１；Ｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｓｌｕｋａ ｅｔ ａｌ．２００３及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００２）とに関与する。痛覚受容器が欠けている脳におけるＡＳＩＣｓの存在は、これらのチャネルが痛覚を越える機能を有する場合があることを示唆する。確かに近年の研究はＡＳＩＣ１ａがシナプスの可塑性、学習／記憶、及び恐怖条件づけに関与する場合があることを示した（Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．２００２及びＷｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．２００３）。ここで、パッチクランプ法と、Ｃａ２＋イメージング法と、受容体サブユニットトランスフェクションと、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害アッセイと、遺伝子ノックアウト法を併用するｉｎ ｖｉｖｏ虚血モデルとの組合せを用いて、我々は、グルタミン酸非依存性で、アシドーシスに仲介される、虚血脳損傷の主な原因としてのＣａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａの活性化を証明する。
【００４７】
Ｃ．結果
１．アシドーシスはマウスの皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣｓを活性化する
図３及び４は、培養マウス皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣｓの電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを示す。図３Ａ及び３Ｂは、７．４から表示されたｐＨ値までのｐＨの低下により活性化されるＡＳＩＣ電流（ＡＳＩＣ ｃｕｒｒｅｎｔｓ）のｐＨ依存性を示すグラフである。容量反応曲線は、平均ｐＨ０．５＝６．１８±０．０６（ｎ＝１０）を用いてＨｉｌｌの式に当てはめられた。図３Ｃ及び３Ｄは、ＡＳＩＣｓ（ｎ＝５）の電流・電圧の関係を示すグラフである。さまざまな電圧におけるＡＳＩＣ電流の振幅は、−６０ｍＶで記録された振幅に正規化された。図４Ａ及び４Ｂは、アミロリドによる容量依存的なＡＳＩＣ電流の遮断を示すグラフである。Ｎ＝８で、ＩＣ５０＝１６．４±４．１μＭであった。図４Ｃ及び４Ｄは、ＰｃＴＸ毒によるＡＳＩＣ電流の遮断（＊＊ｐ＜０．０１）を示すグラフである。
【００４８】
我々は最初に、細胞毒性の研究（Ｋｏｈ ａｎｄ Ｃｈｏｉ １９８７及びＳａｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）に一般的に使用される標品である培養マウス皮質ニューロンにおいてＡＳＩＣ電流を記録した。図３を参照せよ。−６０ｍＶの保持電位で、細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）の７．０より下への迅速な低下が、ニューロンの大多数において、小さな定常状態成分を有する大きな一過性内向き電流を引き起こした（図３Ａ）。内向き電流の振幅は、ｐＨｅが減少するにつれて、Ｓ字状に増大し、ｐＨ０．５＝６．１８±０．０６（ｎ＝１０、図３Ｂ）と算出された。直線的なＩ−Ｖ関係と、Ｎａ＋平衡電位に近い逆転が得られた（ｎ＝６、図３Ｃ及び３Ｄ）。これらのデータは、ｐＨｅの低下がマウス皮質ニューロンにおいて典型的なＡＳＩＣｓを活性化する場合があることを証明する。
【００４９】
我々は次に、ＡＳＩＣｓの非特異的ブロッカーである（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ａ）アミロリドの、酸により活性化される電流に対する影響をテストした。図４を参照せよ。主に感覚ニューロンにおける過去の研究（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ；Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８及びＶａｒｍｉｎｇ １９９９）と同様に、アミロリドは皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣ電流を、ＩＣ５０＝１６．４±４．１μＭで容量依存的に遮断した（ｎ＝８、図４Ａ及び４Ｂ）。タランチュラＰｓａｌｍｏｐｏｅｕｓ ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉの毒（ＰｃＴｘ毒）由来のＰｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ １（又はＰｃＴｘ１）は、特異的なＡＳＩＣ１ａブロッカーの場合がある（Ｅｓｃｏｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。我々の研究は、ＰｃＴＸ毒自体が２５ｎｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、ＣＯＳ−７細胞で発現されたホモ多量体ＡＳＩＣ１ａにより媒介される電流を〜７０％遮断する可能性があることを示す（ｎ＝４、引用によって本明細書に取り込まれるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／１１８／６／６８７／ＤＣ１に存在する追補図Ｓ１を参照せよ。）。しかしＰｃＴＸ毒は、５００ｎｇ／ｍＬでも、ヘテロ多量体ＡＳＩＣ１ａ／２ａか、ホモ多量体ＡＳＩＣ２ａか、ホモ多量体ＡＳＩＣ３かのチャネルにより媒介される電流には影響を及ぼさない（ｎ＝４−６）。加えて、ＰｃＴＸ毒は５００ｎｇ／ｍＬでも、既知の電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）及びリガンド依存性チャネルを通じた電流には影響を及ぼさず、ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａに対する特異性をさらに示す（ｎ＝４−５、引用によって本明細書に取り込まれる追補図Ｓ２及び追補データ（上記引用のウェブサイトにて））。
【００５０】
我々は次に、皮質ニューロンにおける酸により活性化される電流に対するＰｃＴＸ毒の影響をテストした。１００ｎｇ／ｍＬで、ＰｃＴＸ毒はＡＳＩＣ電流のピーク振幅を、４７％±７％まで可逆的に遮断し（ｎ＝１５、図４Ｃ及び４Ｄ）、酸により活性化される電流全体に対するホモ多量体ＡＳＩＣ１ａの顕著な貢献を示した。ＰｃＴＸ濃度の増大は、皮質ニューロンの主要部においてＡＳＩＣ電流の振幅のさらなる低減を誘発せず（ｎ＝８、データは示していない）、これらのニューロンにおいてＰｃＴＸ非感受性のＡＳＩＣｓ（例えば、ヘテロ多量体ＡＳＩＣ１ａ／２ａ）が共存することを示した。
【００５１】
２．ＡＳＩＣ応答はモデル虚血により増強される
図５は、モデル虚血がＡＳＩＣｓの活性を上昇させる場合があることを示す代表的なデータを示す。図５Ａは、１時間のＯＧＤ後のＡＳＩＣ電流の振幅増大と脱感作減少を示す一連の代表的なトレース図である。図５Ｂは、ＯＧＤニューロンにおけるＡＳＩＣ電流の振幅増大を示す要約データのグラフである（Ｎ＝４０及び４４、＊ｐ＜０．０５）。図５Ｃは、ＯＧＤニューロンにおけるＡＳＩＣ電流の脱感作の減少を示す一連の代表的なトレース図及び要約データである（Ｎ＝６、＊＊ｐ＜０．０１）。図５Ｄは、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンでは、ｐＨ６．０、対照条件と１時間のＯＧＤ後とにおいて、酸により活性化される電流が生じないことを示す１対の代表的なトレース図である（ｎ＝１２及び１３）。
【００５２】
アシドーシスは脳虚血の中心的な特徴の場合があるので、我々は、ＡＳＩＣｓが虚血状態で活性化される場合があるかどうか、及び、虚血がこれらのチャネルの特性を変化させる場合があるかどうかを決定した。図５を参照せよ。我々は、一般的なｉｎ ｖｉｔｒｏの虚血モデルである、酸素グルコース除去処置（ＯＧＤ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｈｏｉ，１９９３）を１時間実施した後で、ニューロンにおけるＡＳＩＣ電流を記録した。１組の培養がグルコースを含まない細胞外溶液（ＥＣＦ）で３回洗浄されてＯＧＤ処置を施される一方で、対照の培養はグルコースを含むＥＣＦで洗浄され従来の細胞培養器でインキュベーションされた。ＯＧＤは、１時間後に、グルコースを含まないＥＣＦをＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地に置換すること、及び、その培養を従来の培養器でインキュベーションすることにより終了した。その後ＡＳＩＣ電流がＯＧＤの後でニューロンの形態学的変化が無いときに１時間記録された。ＯＧＤ処置はＡＳＩＣ電流の振幅の中程度の増大を誘発した（対照群では１５２０±１３８ｐＡ、Ｎ＝４４であり、１時間のＯＧＤ後のニューロン群では１８８６±１８５ｐＡ、Ｎ＝４０であった。ｐ＜０．０５、図５Ａ及び５Ｂ）。さらに重要なことにＯＧＤは、電流減少の時定数の増大により示されたように、ＡＳＩＣの脱感作の劇的な減少を誘発した（対照ニューロンでは８１４．７±５８．９ｍｓ、Ｎ＝６であり、ＯＧＤ後のニューロンでは１９２８．９±３１５．７ｍｓ、Ｎ＝６であった。ｐ＜０．０１、図Ａ及び図Ｃ）。ＡＳＩＣ１−／−マウス由来の培養皮質ニューロンでは、７．４から６．０へのｐＨの低下は、海馬ニューロンにおける過去の研究（Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）と同様に、いかなる内向き電流も活性化しなかった（ｎ＝５２）。これらのニューロンにおいては１時間のＯＧＤは、酸で誘発される応答を活性化又は増強しなかった（図５Ｄ、ｎ＝１２及び１３）。
【００５３】
３．アシドーシスはＡＳＩＣ１ａを介してグルタミン酸非依存性のＣａ２＋流入を誘発する
図６及び７は、皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣｓがＣａ２＋透過性の場合があること、及び、Ｃａ２＋透過性がＡＳＩＣ１ａ依存性の場合があることを示唆する代表的なデータを示す。図６Ａは、唯一の電荷担体として１０ｍＭ Ｃａ２＋を含む、Ｎａ＋を含まないＥＣＦを用いて得られた代表的なトレース図を示す。ｐＨ６．０で内向き電流が記録された。液間電位補正後の平均的な逆転電位は〜−１７ｍＶである（ｎ＝５）。図６ＢはＣａ２＋に仲介される電流の、アミロリド及びＰｃＴＸ毒による遮断を示す代表的なトレース図と要約データとを示す。Ｃａ２＋に仲介される電流のピーク振幅は、１００μＭのアミロリドにより比較対照値の２６％±２％まで（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）減少し、１００ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸ毒により２２％±０．９％まで（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）減少した。図７Ａは、代表的な３４０／３８０ｎｍ比をｐＨの関数として示し、ｐＨの６．０への低下による［Ｃａ２＋］ｉの増加を示している。ニューロンは、電位依存性Ｃａ２＋チャネルのブロッカー（５μＭ ニモジピン及び１μＭ ω−コノトキシンＭＶＩＩＣ）と、グルタミン酸受容体のブロッカー（１０μＭ ＭＫ８０１及び２０μＭ ＣＮＱＸ）とともに、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２を含む通常のＥＣＦに浸漬された。図７Ａの挿入図は、酸で誘発される［Ｃａ２＋］ｉの増加の、１００μＭのアミロリドによる代表的な阻害を示す。図７Ｂは、酸で誘発される［Ｃａ２＋］ｉの増加の、アミロリド及びＰｃＴＸ毒による阻害を示す代表的な要約データを示す。Ｎ＝６−８で、ｐＨ６．０群と比較して＊＊ｐ＜０．０１であった。図７Ｃは代表的な３４０／３８０ｎｍ比を、ｐＨ及びＮＭＤＡの有／無との関連で示し、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンでは酸誘発性の［Ｃａ２＋］ｉの増加が生じないことを示す。ニューロンはＮＭＤＡには通常の応答を示した（ｎ＝８）。図７Ｄは、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンではｐＨ６．０でも、酸により活性化される電流が生じないことを示す代表的なトレース図を示す。
【００５４】
標準的なイオン置換プロトコール（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）と、Ｆｕｒａ−２蛍光Ｃａ２＋イメージング法（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）とを用いて、我々は、皮質ニューロンのＡＳＩＣｓがＣａ２＋透過性であるのかどうかを決定した。図６及び７を参照せよ。唯一の電荷担体として１０ｍＭ Ｃａ２＋を含む（Ｎａ＋及びＫ＋は含まない）溶液へ浸漬し、−６０ｍＶの保持電位で、我々は１８本のニューロンのうち１５本において５０ｐＡより大きい内向き電流を記録し、皮質ニューロンの大部分におけるＡＳＩＣｓの顕著なＣａ２＋透過性を示した（図６Ａ）。ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａチャネルの活性化に矛盾せず、１０ｍＭ Ｃａ２＋により導通される電流は、非特異的ＡＳＩＣブロッカーであるアミロリドと、ＡＳＩＣ１ａ特異的ブロッカーであるＰｃＴＸ毒との両方によって強く遮断された（図６Ｂ）。Ｃａ２＋に仲介される電流のピーク振幅は、１００μＭのアミロリドにより比較対照の２６％±２％まで（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）減少し、１００ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸ毒により２２％±０．９％まで（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）減少した。他の主要なＣａ２＋流入経路のブロッカー（グルタミン酸受容体に対するＭＫ８０１ １０μＭ及びＣＮＱＸ ２０μＭ、電位依存性Ｃａ２＋チャネルに対するニモジピン ５μＭ及びω−コノトキシンＭＶＩＩＣ １μＭ）の存在下におけるＣａ２＋イメージング法は、２０本のニューロンのうち１８本が、ｐＨの低下に対して細胞外Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の検出可能な増加で応答することを示した（図７Ａ）。一般的に、低ｐＨ溶液の長期的潅流の際、［Ｃａ２＋］ｉは上昇したままである。いくつかの細胞では、［Ｃａ２＋］ｉの増大は、酸潅流の期間よりもさらに長く持続した（図７Ａ）。長く持続するＣａ２＋応答は、無傷のニューロンにおけるＡＳＩＣ応答が全細胞記録におけるＡＳＩＣ応答よりも脱感作されにくい場合があることか、ＡＳＩＣｓを通じたＣａ２＋流入がその後に細胞内貯蔵からのＣａ２＋の放出を誘発する場合があることかを示唆する。１μＭタプシガルギンでのニューロンの前培養はＣａ２＋の増大の持続的部分を部分的に阻害し、細胞内貯蔵からのＣａ２＋の放出が酸誘発性の細胞内Ｃａ２＋蓄積に寄与している場合もあることを示唆した（ｎ＝６、データは示していない）。Ｃａ２＋イオンにより導通される電流（図６Ｂ）と同様に、［Ｃａ２＋］ｉのピークと維持的な増大の両方がアミロリド及びＰｃＴＸ毒により強く阻害され（図７Ａ及び７Ｂ、ｎ＝６−８）、酸で誘発される［Ｃａ２＋］ｉの増大におけるホモ多量体ＡＳＩＣ１ａの関与と矛盾しない。ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトは、全てのニューロンにおいて、ＮＭＤＡ受容体に仲介されるＣａ２＋応答に影響を与えることなく、酸で誘発される［Ｃａ２＋］ｉの増大を除去した（図７Ｃ、ｎ＝８）。パッチクランプ法は、５２本中５２本のＡＳＩＣ１−／−ニューロンでｐＨ６．０では酸により活性化される電流が生じないことを証明したが、これはＡＳＩＣ１ａサブユニットが存在しないことと矛盾しない。しかし５．０又は４．０へのｐＨ低下は５２本中２４本のＡＳＩＣ１−／−ニューロンで検出可能な電流を活性化し、これらのニューロンにおけるＡＳＩＣ２ａサブユニットの存在を証明した（図７Ｄ）。さらなる電気生理学的研究は、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンが、さまざまな電位依存性チャネルと、ＮＭＤＡ、ＧＡＢＡ受容体依存性チャネルとに対して通常の応答をすることを証明した（データは示していない）。
【００５５】
４．ＡＳＩＣ遮断はアシドーシスで誘発されるグルタミン酸非依存性ニューロン損傷から保護する
図８は、酸とのインキュベーションがＡＳＩＣ遮断により保護されるグルタミン酸受容体非依存性ニューロン損傷を誘発する場合があることを示唆する代表的なデータを示す。図８Ａ及び８Ｂは、ｐＨ７．４（黒い棒グラフ）又は６．０（白い棒グラフ）のＥＣＦ中での、１時間（図８Ａ）又は２４時間（図８Ｂ）の、皮質ニューロンのインキュベーションにより誘発される経時的なＬＤＨ放出に対する代表的なデータを表すグラフを示す。Ｎ＝２０−２５ウェル、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１、同一の時点でｐＨ７．４の群と比較した。（生きたニューロンの細胞体のフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）染色と、死細胞の核のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色とにより、酸で誘発されるニューロン損傷も分析された。）図８Ｃは酸で誘発されるＬＤＨ放出の、１００μＭ アミロリド又は１００ｎｇ／ｍＬ ＰｃＴＸ毒による阻害を示すグラフを示す（ｎ＝２０−２７、＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１）。ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ及びニモジピンは、全ての実験についてＥＣＦ中に添加された（図８Ａ−Ｃ）。
【００５６】
酸で誘発される損傷は、ｐＨ７．４か６．０かのどちらかの、ＭＫ８０１とＣＮＱＸとニモジピンとを含むＥＣＦ中でインキュベートされた２４ウェルのプレート上で増殖したニューロンで研究された。図８を参照せよ。細胞の損傷は、さまざまな時点での乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出の測定（図８Ａ及び８Ｂ、Ｋｏｈ ａｎｄ Ｃｈｏｉ，１９８７）と、生／死細胞の蛍光染色とによりアッセイされた。ｐＨ７．４で処理されたニューロンと比較して、１時間の酸インキュベーション（ｐＨ６．０）はＬＤＨ放出の経時的な増加を誘発した（図８Ａ）。２４時間後、最大のＬＤＨ放出の４５．７％±５．４％が誘発された（ｎ＝２５ウェル）。ｐＨ６．０での連続処理は、より激しい細胞損傷を誘発した（図８Ｂ、ｎ＝２０）。ＬＤＨアッセイに矛盾せず、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ、青）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ、赤）とでの生／死染色は、１時間の酸処理による細胞死の同様の増大を示した（引用によって本明細書に取り込まれる（上記引用のウェブサイトの）追補図Ｓ３を参照せよ。）。ｐＨ６．５のＥＣＦとの１時間のインキュベーションも、顕著だがｐＨ６．０のＥＣＦとのインキュベーションよりは少ないＬＤＨ放出を誘発した（ｎ＝８ウェル）。
【００５７】
ＡＳＩＣｓの活性化が、酸で誘発されるグルタミン酸受容体非依存性ニューロン損傷に関わっているかどうかを決定するために、我々は酸で誘発されるＬＤＨ放出に対するアミロリド及びＰｘＴＸ毒の影響をテストした。１時間の酸インキュベーションの１０分前と、インキュベーション期間中との１００μＭ アミロリドか１００ｎｇ／ｍＬ ＰｃＴＸ毒かいずれかの添加が、ＬＤＨ放出を有意に低減させた（図８Ｃ）。２４時間では、ＬＤＨ放出は４５．３％±３．８％からアミロリドにより３１．１％±２．５％へ、ＰｃＴＸ毒により２７．９％±２．６％へ減少した（ｎ＝２０−２７、ｐ＜０．０１）。アミロリドだけを添加した（例えば５時間の）長期間のインキュベーションは、ＬＤＨ放出を増大させた（ｎ＝８）が、ｐＨ７．４ＥＣＦ中での１時間のアミロリド又はＰｃＴＸ毒の添加は、ＬＤＨ放出のベースラインに影響を与えなかった。
【００５８】
５．ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａの活性化は、アシドーシスで誘発される損傷の原因となる場合がある
図９は、ＡＳＩＣ１ａがｉｎ ｖｉｔｒｏでの酸で誘発される損傷に関与する場合があることを示す代表的なデータを提示する一連のグラフである。図９Ａは、［Ｃａ２＋］ｅの減少によって酸で誘発されるＬＤＨ放出が阻害されることを示す代表的なデータを示す（ｎ＝１１−１２、ｐＨ６．０、１．３Ｃａ２＋と比較して＊＊ｐ＜０．０１）。図９Ｂは酸インキュベーションが、ＡＳＩＣ１ａをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞ではＬＤＨ放出の増大を誘発したが、トランスフェクションしないＣＯＳ−７細胞では誘発しなかったことを示す代表的なデータを示す（ｎ＝８−２０）。アミロリド（１００μＭ）は、ＡＳＩＣ１ａをトランスフェクションした細胞では、酸で誘発されるＬＤＨ放出を阻害した。７．４対６．０と、６．０対６．０＋アミロリドとについて、＊ｐ＜０．０５であった。図９Ｃは、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンでは、酸で誘発される損傷が生じないこと、及び、アミロリド及びＰｃＴＸ毒による保護が生じないことを示す代表的なデータを示す（各々のグループでｎ＝８、ｐ＞０．０５）。図９Ｄは、ＯＧＤ処置を施した培養皮質ニューロンにおける酸で誘発されるＬＤＨ放出の増大を示す代表的なデータを示す（ｎ＝５）。１時間のＯＧＤ／アシドーシスの併用により誘発されたＬＤＨ放出は、トロロクス及びＬ−ＮＡＭＥによって阻害されなかった（ｎ＝８−１１）。ＡＳＩＣ１−／−ニューロンでは、ＯＧＤは酸に誘導されるＬＤＨ放出を増強しなかった。ｐＨ７．４対ｐＨ６．０については＊＊ｐ＜０．０１であり、ｐＨ６．０対６．０＋ＰｃＴＸ毒については＊ｐ＜０．０５であった。ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ及びニモジピンは、全ての実験についてＥＣＦ中に添加された（図９Ａ−Ｄ）。
【００５９】
Ｃａ２＋流入が酸で誘発される損傷に対して役割を果たすかどうかを決定するために、我々はニューロンを通常の又は減少した［Ｃａ２＋］ｅの存在下において、ｐＨ６．０のＥＣＦで処理した。図９を参照せよ。１．３ｍＭから０．２ｍＭへのＣａ２＋の減少は、ＰｃＴＸ毒でのＡＳＩＣ１ａ遮断と同様に、酸で誘発されるＬＤＨ放出を阻害した（４０．０％±４．１％から２１．９％±２．５％へ。ｎ＝１１−１２、ｐ＜０．０１、図９Ａ）。完全な［Ｃａ２＋］ｅの除去は、Ｃａ２＋感受性陽イオンチャネルを通じて大きな内向き電流を活性化する場合があり、むしろデータ解釈を複雑化するかもしれない（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）ので、Ｃａ２＋を含まない溶液はテストされなかった。非特異的及び特異的ＡＳＩＣ１ａブロッカーであるアミロリド及びＰｃＴＸとの両方と、［Ｃａ２＋］ｅの低減とによる酸損傷の阻害は、Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａの活性化が酸で誘発されるニューロン損傷に関与する場合があることを示唆する。
【００６０】
ＡＳＩＣ１ａの活性化が酸損傷に関与するというさらなる証拠を提供するために、我々は、トランスフェクションを施していないＣＯＳ−７細胞と、ＡＳＩＣ１ａをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞との酸損傷を研究したが、ＣＯＳ−７細胞は、内在性のチャネルが欠損しているためにＡＳＩＣｓの発現に慣用される培養細胞株である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｉｍｍｋｅ ａｎｄ ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ ２００１及びＥｓｃｏｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．２０００）。（プレーティングの３６−４８時間後の）コンフルエンスの後で、細胞は、ｐＨ７．４かｐＨ６．０かどちらかのＥＣＦで１時間処理された。ＬＤＨ放出は酸インキュベーションの２４時間後に測定された。トランスフェクションを施していないＣＯＳ−７細胞のｐＨ６．０ ＥＣＦでの処理は、ｐＨ７．４で処理した細胞と比較すると、ＬＤＨ放出の増大を誘発しなかった（ｐＨ７．４では１０．３％±０．８％であり（Ｎ＝１９ウェル）、ｐＨ６．０では９．４％±０．７％であった（Ｎ＝２０ウェル）。ｐ＞０．０５。図９Ｂ）。しかし、ＡＳＩＣ１ａを安定的にトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞では、ｐＨ６．０での１時間のインキュベーションはＬＤＨ放出を１５．５％±２．４％から２４．０％±２．９％まで有意に増加させた（ｎ＝８ウェル、ｐ＜０．０５）。これらの細胞におけるアミロリド（１００μＭ）の添加は、酸で誘発されるＬＤＨ放出を阻害した（図９Ｂ）。
【００６１】
我々は、ＧＦＰのみか、ＧＦＰ及びＡＳＩＣ１ａかをエンコードするｃＤＮＡで一時的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の酸損傷も研究した。トランスフェクションの（２４−３６時間）後、細胞は（ｐＨ６．０の）酸性溶液で１時間インキュベーションされ、該酸インキュベーションの２４時間後に細胞損傷がアッセイされた。引用によって本明細書に取り込まれる（上記引用のウェブサイトの）追補図Ｓ４に示されるように、１時間の酸インキュベーションは、ＧＦＰ／ＡＳＩＣ１ａ群において生残するＧＦＰ陽性細胞を大きく減少させたが、ＧＦＰのみをトランスフェクションした群においては減少させなかった（各々の群につきｎ＝ディッシュ３枚であった）。
【００６２】
酸で誘発されるニューロン損傷におけるＡＳＩＣ１ａの関与をさらに証明するために、我々は、ＡＳＩＣ＋／＋マウス及びＡＳＩＣ１−／−マウス由来の培養皮質ニューロン（Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）について細胞毒性実験を実施した。この場合でもまた、ＡＳＩＣ＋／＋ニューロンをｐＨ６．０で１時間酸インキュベーションすると、アミロリド及びＰｃＴＸ毒により低減される実質的なＬＤＨ放出を誘発した（ｎ＝８−１２）。しかしＡＳＩＣ１−／−ニューロンを１時間酸処理しても、２４時間でのＬＤＨ放出の有意な増加を誘発せず（ｐＨ７．４では１３．８％±０．９％であり、ｐＨ６．０では１４．２％±１．３％であった。Ｎ＝８、ｐ＞０．０５）、これらのニューロンの酸損傷への耐性を示した（図９Ｃ）。加えて、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトは、酸で誘発されるＬＤＨ放出に対するアミロリド及びＰｃＴＸ毒の影響も除去し（図９Ｃ、各々でｎ＝８）、酸で誘発される皮質ニューロンの損傷のアミロリド及びＰｃＴＸ毒による阻害（図８Ｃ）はＡＳＩＣ１サブユニットの遮断によることをさらに示唆した。酸インキュベーションとは対照的に、（Ｍｇ２＋を含まないｐＨ７．４のＥＣＦ中における）１ｍＭ ＮＭＤＡ＋１０μＭグリシンでＡＳＩＣ１−／−ニューロンを１時間処理すると、２４時間で最大のＬＤＨ放出の８４．８％±１．４％を誘発し（ｎ＝４、図９Ｃ）、他の細胞損傷過程には正常な応答を示した。
【００６３】
６．モデル虚血は、アシドーシスで誘発されるグルタミン酸非依存性のニューロン損傷をＡＳＩＣｓ経由で増強する
ＡＳＩＣ電流の大きさは、脳虚血の細胞及び神経化学的な要素――細胞の膨張、アラキドン酸及び乳酸――により増強される場合があり（Ａｌｌｅｎ ａｎｄ Ａｔｔｗｅｌｌ ２００２及びＩｍｍｋｅ ａｎｄ ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ ２００１）、さらに重要なことに、ＡＳＩＣ電流の脱感作がモデル虚血により劇的に低減される場合がある（図５Ａ及び５Ｃを参照せよ。）ので、我々は、虚血状態におけるＡＳＩＣｓの活性化がより重度のニューロン損傷を生み出すはずであると予想した。この仮説をテストするために、我々はニューロンに酸素グルコース除去処置（ＯＧＤ）下での１時間の酸処理を施した。ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ及びニモジピンは、電位依存性Ｃａ２＋チャネルと、グルタミン酸受容体とに仲介される、ＯＧＤと関連する細胞損傷を抑制するために全ての溶液に添加された（Ｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＯＧＤ条件下でｐＨ７．４のＥＣＦとの１時間のインキュベーションは、２４時間で最大のＬＤＨ放出の２７．１％±３．５％しか誘発しなかった（ｎ＝５、図９Ｄ）。この発見は、グルタミン酸受容体と電位依存性Ｃａ２＋チャネルとを遮断すると、１時間のＯＧＤが有意な細胞損傷を誘発しないとする報告（Ａａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）と一致する。しかし、（ｐＨ６．０の）アシドーシスと組合せた１時間のＯＧＤは、ＯＧＤを実施しない場合の酸で誘発されるＬＤＨ放出よりも有意に大きい（図８Ａを参照せよ。ｐ＜０．０５）、最大のＬＤＨ放出の７３．９％±４．３％を誘発した（ｎ＝５、図９Ｄ、ｐ＜０．０１）。ＡＳＩＣ１ａブロッカーであるＰｃＴＸ毒（１００ｎｇ／ｍＬ）の添加は、酸／ＯＧＤ誘発性のＬＤＨ放出を、４４．３％±５．３％まで有意に低減した（ｎ＝５、ｐ＜０．０５、図９Ｄ）。
【００６４】
我々は、ＡＳＩＣ１−／−マウス由来の培養ニューロンでも同じ実験を実施した。しかしＡＳＩＣ１を含むニューロンとは異なり、ＯＧＤと酸の組合せでの１時間の処理は、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンにおけるＬＤＨ放出をわずかに増加させたのみであった（２６．１％±２．７％から３０．４％±３．５％へ。Ｎ＝１０−１２、図９Ｄ）。この発見は、酸で誘発される損傷のＯＧＤによる増強が、主にＡＳＩＣ１に仲介される毒性をＯＧＤが増強するためであるかもしれないことを示唆する。
【００６５】
Ａａｒｔｓら（２００３）は、長期間のＯＧＤ（２時間）により形成される（ｍｏｌｄｅｄ）がアシドーシスを起さない虚血を近年研究した。このモデル系において彼らは、反応性の酸素／窒素分子種により活性化され、グルタミン酸受容体非依存性のニューロン損傷をもたらす、Ｃａ２＋透過性の非選択的陽イオン導通の活性化を証明した。Ａａｒｔｓらによりモデル化された長期間のＯＧＤで誘発される細胞損傷は、（例えばトロロクスのように）フリーラジカルを直接的に捕捉する薬剤か、又は、（例えばＬ−ＮＡＭＥのように）フリーラジカルの産生を抑制する薬剤かのいずれかにより劇的に減少する場合がある（Ａａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ニューロン損傷で誘発される短期間のＯＧＤとアシドーシスの組合せが同様のメカニズムに関与するかどうかを決定するために、我々はトロロクス及びＬ−ＮＡＭＥのＯＧＤ／酸誘発性のＬＤＨ放出に対する影響をテストした。図９Ｄに示されたように、トロロクス（５００μＭ）もＬ−ＮＡＭＥ（３００μＭ）も、１時間のＯＧＤ／アシドーシスの組合せで誘発されるニューロン損傷に対して有意な効果がなかった（ｎ＝８−１１）。追加の実験は、長期間のＯＧＤで誘発されるニューロン損傷の原因となることがＡａｒｔｓら（２００３）により報告されているＴＲＰＭ７チャネルのイオン導通に対して、ＡＳＩＣブロッカーであるアミロリド及びＰｃＴＸ毒の効果がないことを証明した（引用によって本明細書に取り込まれる追補図Ｓ５（上記引用のウェブサイトを参照せよ。））。一緒にするとこれらの発見は、ＴＲＰＭ７チャネルでなくＡＳＩＣｓの活性化が、我々の研究における１時間のＯＧＤ／アシドーシスの組合せで誘発されるニューロン損傷の主要な原因となる場合があることを強く示唆する。
【００６６】
７．ｉｎ ｖｉｖｏでの虚血脳損傷におけるＡＳＩＣ１ａの活性化
図１０は、ｉｎ ｖｉｖｏでの脳虚血におけるＡＳＩＣ１の遮断と、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトとによる神経保護を示すデータを示す。図１０Ａは、ａＣＳＦを注射したラット（ｎ＝７）か、アミロリドを注射したラット（ｎ＝１１）か、ＰｃＴＸ毒を注射したラット（ｎ＝５）かに由来する脳における、染色された体積（梗塞体積）を示す、ＴＴＣ染色脳切片から得られる代表的なデータのグラフを示す。ａＣＳＦを注射した群と比較して、＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１である。図１０Ｂは、ＡＳＩＣ１−／−マウス由来の脳梗塞体積の減少を示す代表的なデータ（各群につきｎ＝６）のグラフを示す。ＡＳＩＣ１＋／＋群と比較して、＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１である。図１０Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇメマンチン（Ｍｅｍ）を腹腔内注射したマウスか、ＰｃＴＸ毒（５００ｎｇ／ｍＬ）の脳室内注射とともににメマンチンの腹腔内注射を施したマウスかに由来する脳梗塞体積の減少を示す代表的なデータのグラフを示す。ａＣＳＦを注射した群と比較して＊＊ｐ＜０．０１であり、メマンチンを注射した群とメマンチン＋ＰｃＴＸ毒を注射した群を比較して＊＊ｐ＜０．０１である（各群につきｎ＝５である）。図１０Ｄは、メマンチンを腹腔内注射したＡＳＩＣ１＋／＋マウス（ｗｔ）か、ＡＳＩＣ１−／−マウスかのいずれかに由来する脳梗塞体積の減少を示す代表的なデータ（各群につきｎ＝５）のグラフを示す。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１である。
【００６７】
ＡＳＩＣ１ａの活性化が虚血脳損傷に関与する場合があることの証拠を提供するために、我々は最初に、一過性の局所的虚血のラットモデル（Ｌｏｎｇａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）におけるアミロリド及びＰｃＴＸ毒の保護効果をテストした。虚血（１００分）は一過性の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により誘発された。計６μＬの人工的ＣＳＦ（ａＣＳＦ）のみか、ａＣＳＦを含むアミロリド（１ｍＭ）か、ａＣＳＦを含むＰｃＴＸ毒（５００ｎｇ／ｍＬ）かが、虚血の３０分前と３０分後とに脳室内に注射された。Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９６９）による研究に基づき、４週齢のラットに対する脳髄液及び脊髄液の体積は、〜６０μＬと算出された。注射されたアミロリドとＰｃＴＸとがＣＳＦ中に均一に分布したと仮定すると、我々は、我々の細胞培養実験において効果的であることが判明した濃度である、〜１００μＭのアミロリド、及び、〜５０ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸという濃度を予想してもかまわない。梗塞体積は虚血の２４時間後にＴＴＣ染色（Ｂｅｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）により決定された。虚血（１００分）は、ａＣＳＦを注射したラットにおいては３２９．５±２５．６ｍｍ３（ｎ＝７）の梗塞体積を生じたが、アミロリドを注射したラットでは２２９．７±４１．１ｍｍ３（ｎ＝１１、ｐ＜０．０５）だけ、ＰｃＴＸ毒を注射したラットでは１３０．４±５５．０ｍｍ３（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）（〜６０％の減少）だけしか生じなかった（図１０Ａ）。
【００６８】
我々は次に、ｉｎ ｖｉｖｏでの虚血脳損傷におけるＡＳＩＣ１ａの関与をさらに証明するためにＡＳＩＣ１−／−マウスを使用した。オスのＡＳＩＣ１＋／＋マウスと、ＡＳＩＣ１＋／−マウスと、ＡＳＩＣ１−／−マウス（〜２５ｇ、コンジェニックＣ５７ＢＬ６バックグラウンド）とが、上述した６０分のＭＣＡＯ（Ｓｔｅｎｚｅｌ−Ｐｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）を施された。ＡＳＩＣ１ａの薬理的な遮断による保護（上述）に矛盾せず、ＡＳＩＣ１−／−マウスは、ＡＳＩＣ１＋／＋マウス（８４．６±１０．６ｍｍ３、Ｎ＝６、ｐ＜０．０１）と比較して有意に小さい（〜６１％の減少）梗塞体積（３２．９±４．７ｍｍ３、Ｎ＝６）を示した。ＡＳＩＣ１＋／−マウスも梗塞体積の減少を示した（５６．９±６．７ｍｍ３、Ｎ＝６、ｐ＜０．０５）（図１０Ｂ）。
【００６９】
我々は次に、ＡＳＩＣ１ａチャネルの遮断か、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトかが、ｉｎ ｖｉｖｏでのグルタミン酸受容体遮断の場面でさらなる保護を提供できるかどうかを決定した。我々は、近年成功した臨床試験で使用された（Ｔａｒｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）、不競合型ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるメマンチンを選択した。６０分のＭＣＡＯの直後にメマンチン（１０ｍｇ／ｋｇ）がＣ５７ＢＬ６マウスに腹腔内注射され、虚血の１５分前と１５分後とに、総量０．４μＬの、ａＣＳＦのみか、ＰｃＴＸ毒（５００ｎｇ／ｍＬ）を含むａＣＳＦかの脳室内注射も行われた。生理食塩水の腹腔内注射とａＣＳＦの脳室内注射とを受けた対照マウスでは、６０分のＭＣＡＯが１２３．６±５．３ｍｍ３の梗塞体積を誘発した（ｎ＝５、図１０Ｃ）。メマンチンの腹腔内注射とａＣＳＦの脳室内注射とを受けたマウスでは、同じ期間の虚血が７３．８±６．９ｍｍ３の梗塞体積を誘発した（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。しかし、メマンチンとＰｃＴＸ毒とを注射されたマウスでは、４７．０±１．１ｍｍ３の梗塞体積だけしか誘発されなかった（ｎ＝５、対照群とメマンチン群との両方と比較してｐ＜０．０１、図１０Ｃ）。これらのデータは、ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａの遮断が、ＮＭＤＡ受容体遮断の場面で、ｉｎ ｖｉｖｏでの虚血においてさらなる保護を提供する場合があることを示唆する。さらなる保護は、薬理的なＮＭＤＡ遮断処理を施したＡＳＩＣ１−／−マウスにおいても観察された（図１０Ｄ）。生理食塩水か１０ｍｇ／ｋｇメマンチンかを腹腔内注射されたＡＳＩＣ１＋／＋マウスでは、６０分のＭＣＡＯは、それぞれ１０１．４±９．４ｍｍ３か６１．６±１２．７ｍｍ３かの梗塞体積を誘発した（各群でｎ＝５、図１０Ｄ）。しかしメマンチンを注射したＡＳＩＣ１−／−マウスでは、同じ虚血期間が、２７．７±１．６ｍｍ３の梗塞体積を誘発し（ｎ＝５）、メマンチンを注射したＡＳＩＣ１＋／＋マウスにおける梗塞体積よりも有意に小さかった（ｐ＜０．０５）。
【００７０】
Ｄ．考察
虚血に対する脳の細胞及び分子の応答を特定する大進歩にも関わらず、脳卒中患者に対する効果的な治療方法はない。最も注目すべきなのは、グルタミン酸アンタゴニストの多施設臨床試験の失敗である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９９及びＷａｈｌｇｒｅｎ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ ２００４）。ここで我々は、虚血脳損傷の新しいメカニズムと、この生物学的メカニズムにおける虚血性アシドーシスの役割とを証明する。我々は、新規に記載されたリガンド依存性チャネルのクラスであるＣａ２＋透過性ＡＳＩＣｓ（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ａ及びＷａｌｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ，１９９８）の活性化を介して、アシドーシスの場面で虚血性損傷が起こる場合があることを示す。このＣａ２＋の毒性はグルタミン酸受容体又は電位依存性Ｃａ２＋チャネルに依存しない場合がある。
【００７１】
混合皮質培養において全細胞パッチクランプ法を使用し、我々は、虚血において通常起こるｐＨｅ（細胞外ｐＨ）の範囲におけるＡＳＩＣ電流の活性化を証明する。Ｆｕｒａ−２蛍光イメージング法とイオン置換プロトコールとを用いて、我々は、ＡＳＩＣｓがＣａ２＋を皮質ニューロンに流入させる場合があること、及び、ＮＭＤＡと、ＡＭＰＡと、電位依存性Ｃａ２＋チャネルとの遮断があるときＣａ２＋を皮質ニューロンに流入させる場合があることを示す。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞毒性モデルを使用して、我々は、アシドーシスがグルタミン酸非依存性ニューロン損傷を誘発する場合があることを証明するが、該ニューロン損傷は、非特異性及び特異性ＡＳＩＣ１ａアンタゴニストの両方と、［Ｃａ２＋］ｅの減少とにより低減される場合がある。加えて我々は、Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａでＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションすることが酸感受性をもたらす場合があるのに対して、ＡＳＩＣ１ａを欠損しているニューロン及びＣＯＳ−７細胞は酸損傷に耐性の場合があることを示す。Ｉｎ ｖｉｖｏの局所的虚血モデルを使用して、我々は、ＡＳＩＣ１ａチャネルの薬理的な遮断とＡＳＩＣ１ａ遺伝子のノックアウトとが、ともに脳を虚血性損傷から保護する場合があること、及び、ＮＭＤＡ遮断の存在下でともに脳を虚血性損傷から保護する場合があることを証明する。
【００７２】
局所的な［Ｈ＋］は、脳における正常なシナプス伝達の際に機能するＡＳＩＣｓに対するアゴニストの場合がある（Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）。このシグナル伝達は傷害性でない場合がある。しかしＡＳＩＣｓは、虚血脳において起こる場合がある広範囲で顕著なｐＨ低下に応答する場合もある。広範囲な虚血の１分以内に、ｐＨｅは７．２から６．５まで低下する（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５）が、これはｐＨ０．５が６．２であるＡＳＩＣ１ａチャネルを活性化するのに十分な場合があるレベルである。注目すべきことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでモデル化された虚血自体が、一定のレベルのアシドーシスでＡＳＩＣ応答の大きさを著しく増強して、虚血ニューロンにおける有毒なＣａ２＋の取り込みを増強する場合がある。さらに、虚血はＡＳＩＣ電流の脱感作を劇的に低減するが、これは、ｉｎ ｖｉｖｏでの長期間の虚血性アシドーシスの際にＡＳＩＣｓ活性が長期持続する可能性があることを意味する。
【００７３】
脳ｐＨの６．５への短時間での広範囲の低下だけでは、脳損傷を生じず（Ｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、低酸素症だけでも脳損傷を生じない（Ｍｉｙａｍｏｔｏ ａｎｄ Ａｕｅｒ，２０００及びＰｅａｒｉｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）ことが、無傷な（ｉｎｔａｃｔ）動物において示された。しかし我々のｉｎ ｖｉｔｒｏのデータは、アシドーシス（虚血性アシドーシス）と虚血（低酸素症）との組合せが、ＡＳＩＣ１ａチャネルの毒性効果を増強する虚血を通じて、ｉｎ ｖｉｖｏの場合と同様に、顕著な脳損傷を引き起こす場合があることを示唆する。この考察は、ＡＳＩＣ１ａの遮断とＡＳＩＣ１ａ遺伝子のノックアウトとの両方が梗塞体積の実質的な（〜６０％）減少を生じるという知見によって強力に支持される。
【００７４】
アシドーシスは、ＡＳＩＣｓを介した虚血脳損傷に影響を与えるのとは別に、他のチャネルの機能にも同様に影響を与える場合がある。虚血と特に関連するかもしれないのは、ＮＭＤＡチャネルの酸遮断で（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９０及びＴｒａｙｎｅｌｉｓ ａｎｄ Ｃｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ １９９０）、該酸遮断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの虚血ニューロン損傷に対して保護する場合がある（Ｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．１９９３及びＧｉｆｆａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９０）。虚血脳におけるアシドーシスによるこのＮＭＤＡ遮断は、ヒト脳卒中の臨床試験におけるＮＭＤＡアンタゴニストの失敗を部分的に説明するかもしれない。虚血性アシドーシスはＮＭＤＡ機能を遮断することにより付加的な治療方法としての役割を果たす場合があるので、ＡＳＩＣ１ａ遮断で脳卒中を治療することは特に効果的かもしれない。
【００７５】
ＡＳＩＣ１ａ遮断の保護効果を示す我々のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ＮＭＤＡと、ＡＭＰＡと、電位依存性Ｃａ２＋チャネルとのアンタゴニストの存在下で実施されたので、ここで報告する知見は、単独か、他の治療方法（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）との併用かのいずれかで、脳卒中に対する新しく強力な神経保護戦略を提供するかもしれない。さらに我々は、薬理的なＡＳＩＣ１ａ遮断かＡＳＩＣ１ａ遺伝子除去かが、脳卒中に対して、ＮＭＤＡ拮抗作用よりも強力な神経保護を提供する場合があることをｉｎ ｖｉｖｏで証明する。
【００７６】
以上をまとめると、我々の研究は、Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａの活性化が、虚血脳損傷の基礎となる、新規なグルタミン酸非依存性の生物学的メカニズムである可能性があることを示唆する。虚血脳においては他の保護的である可能性のあるＡＳＩＣサブユニットの調節も起きる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）ため、これらの発見は、脳虚血に対する新規な神経保護治療戦略の策定の助けとなるだろう。
【００７７】
Ｅ．実験手順
１．ニューロン培養
ハロタン麻酔後、Ｅ１６ Ｓｗｉｓｓマウスか、Ｐ１ ＡＳＩＣ１＋／＋マウス及びＰ１ ＡＳＩＣ１−／−マウスかから大脳皮質が切り出され、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで３７°Ｃ、１０分間インキュベートされた。組織は次に先端熱加工されたガラスピペットでほぐされ、ポリ−Ｌ−オルニチンでコーティングされた２４ウェルのプレートか、２５×２５ｍｍのカバーガラスかに、１ウェル当たり細胞２．５×１０５個の密度か１カバーガラス当たり細胞１０６個かの密度で蒔かれた。ニューロンは、１０％ウマ血清を添加したＭＥＭ（Ｅ１６培養用）か、Ｂ２７を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（Ｐ１培養用）かで培養され、１２日後に電気生理学的研究及び毒性研究に用いられた。グリア増殖は、５−フルオロ−２−デオキシウリジン及びウリジンの添加により抑制され、ＮｅｕＮ染色法及びＧＦＡＰ染色法により決定されたところでは（データは示していない）、ニューロンが〜９０％の培養細胞が得られた。
【００７８】
２．電気生理学
ＡＳＩＣ電流は全細胞パッチクランプ法及び高速潅流法で記録された。通常の細胞外溶液（ＥＣＦ）は、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭグルコース、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０００５ｍＭ ＴＴＸ（ｐＨ７．４）を含み、３２０−３３５ｍＯｓｍであった。低ｐＨ溶液については、さまざまな量のＨＣｌが添加された。ｐＨ＜６．０の溶液については、ＨＥＰＥＳの代わりにＭＥＳがより信頼性のあるｐＨ緩衝作用のために使用された。パッチ電極は、１４０ｍＭ ＣｓＦ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１１ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ（ｐＨ７．３）を含み、３００ｍＯｓｍであった。Ｎａ＋を含まない溶液は、浸透圧を等しくする濃度のＮＭＤＧ又はスクロースでＮａＣｌを置換して、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳからなった（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）。多槽式の（ｍｕｌｔｉｂａｒｒｅｌ）潅流システム（ＳＦ−７７Ｂ、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）が、迅速な溶液交換のために用いられた。
【００７９】
３．細胞損傷アッセイ――ＬＤＨ測定
細胞はＥＣＦで３回洗浄され、複数の処理群に無作為に分割された。ＭＫ８０１（１０μＭ）と、ＣＮＱＸ（２０μＭ）と、ニモジピン（５μＭ）とが、グルタミン酸受容体及び電位依存性Ｃａ２＋チャネルの二次的な活性化の可能性を排除するために、全ての群に添加された。酸インキュベーション後、ニューロンは洗浄され、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地中、３７°Ｃでインキュベーションされた。培地へのＬＤＨ放出は、ＬＤＨアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して測定された。培地（１００μＬ）が培養ウェルから９６ウェルプレートへ移し替えられ、キットにより提供される１００μＬの反応溶液と混合された。３０分後に、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４９２ｎｍで光学濃度が測定された。６２０ｎｍでのバックグラウンドの吸光度は差し引かれた。各々のウェルにおける最大の放出可能なＬＤＨは、各々の実験の最後で１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分インキュベーションすることにより得られた。
【００８０】
４．Ｃａ２＋イメージング法
２５×２５ｍｍカバーガラス上で成長した皮質ニューロンは、ＥＣＦで３回洗浄され、５μＭ ｆｕｒａ−２−アセトキシメチル・エステルで２２°Ｃ、４０分インキュベーションされ、３回洗浄され、通常のＥＣＦ中で３０分インキュベーションされた。カバーガラスは倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ３００）上の潅流チャンバーに移された。細胞はキセノンランプを使用して照射され、４０×ＵＶ蛍光油浸対物レンズで観察され、ビデオ画像は冷却ＣＣＤカメラ（Ｓｅｎｓｙｓ ＫＡＦ １４０１、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して得られた。デジタル画像は、Ａｘｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により制御されるＰＣにより得られ解析された。シャッター及びフィルターホイール（Ｌａｍｂｄａ １０−２）は、３４０又は３８０ｎｍの励起波長で細胞の定期的な照明を可能にするソフトウェアにより制御された。Ｆｕｒａ−２蛍光発光は５１０ｎｍの発光波長で検出された。３４０／３８０ｎｍ比の画像は、視野内の細胞の限局した領域におけるピクセル比の値を平均することにより解析された。該ピクセル比の値は、さらなる解析のためにＳｉｇｍａＰｌｏｔへエクスポートされた。
【００８１】
５．フルオレセイン二酢酸染色と、ヨウ化プロピジウムの取り込み
細胞は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）（５μＭ）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（２μＭ）とを含むＥＣＦ中で３０分インキュベーションされ、続いて色素を含まないＥＣＦで洗浄された。生きた（ＦＤＡ陽性の）細胞及び死んだ（ＰＩ陽性の）細胞は、落射蛍光を備えた顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）上で、ＰＩについては５８０／６３０ｎｍの励起波長／蛍光波長で、ＦＤＡについては５００／５５０ｎｍの励起波長／蛍光波長で、観察と計測とが行われた。画像は、ＢＱ ８０００ ｓＶＧＡフレームグラバーを備えたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ ＤＥＩ−７３０カメラを使用して収集され、コンピュータソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ，ＴＮ）を使用して解析された。
【００８２】
６．ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
ＣＯＳ−７細胞は、１０％ＨＳ及び１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）を含むＭＥＭ中で培養された。〜５０％コンフルエンスの時点で細胞は、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、ｐｃＤＮＡ３ベクター中のＡＳＩＣｓ及びＧＦＰのｃＤＮＡｓでコ・トランスフェクションされた。各３５ｍｍディッシュに対し、ＡＳＩＣｓについての０．７５μｇＤＮＡ及びＧＦＰについての０．２５μｇＤＮＡが使用された。トランスフェクションの４８時間後、パッチクランプ記録のためにＧＦＰ陽性細胞が選択された。ＡＳＩＣ１ａの安定的なトランスフェクションのために、トランスフェクションの１週間後に５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８が培地に添加された。生き残ったＧ４１８耐性細胞は、さらにプレーティングされ、Ｇ４１８の存在下で５代より長く継代された。細胞は次に、ＡＳＩＣ１ａの発現について、パッチクランプ法及び免疫蛍光染色で確認された。
【００８３】
７．酸素グルコース除去処置
ニューロンは３回洗浄され、３５°Ｃで８５％窒素、１０％水素及び５％二酸化炭素の雰囲気に設定した嫌気性チャンバー（Ｍｏｄｅｌ １０２５，Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、ｐＨ７．４又はｐＨ６．０のグルコースを含まないＥＣＦでインキュベーションされた。酸素グルコース除去処置（ＯＧＤ）は、１時間後に、グルコースを含まないＥＣＦをＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地で置換すること、及び、その培養を従来の培養器でインキュベーションすることにより終了した。ＨＥＰＥＳをバッファーとするＥＣＦの使用で、１時間のＯＧＤは、ｐＨを７．３８から７．２８へ（ｎ＝３）、及び、６．０から５．９６へ（ｎ＝４）、わずかに低下させた。
【００８４】
８．局所的虚血
一過性の局所的虚血は、挿管及び換気を行いながら１．５％イソフルラン、７０％Ｎ２Ｏ及び２８．５％Ｏ２を使用して麻酔されたオスのラット（ＳＤ、２５０−３００ｇ）及びマウス（コンジェニックＣ５７ＢＬ６バックグラウンド、〜２５ｇ）における中大脳動脈の縫合閉塞（ＭＣＡＯ）により誘発された。直腸及び側頭筋の温度は、サーモスタット制御の加温パッド及びランプで３７°Ｃ±０．５°Ｃに維持された。脳血流は経頭蓋レーザードップラー血流計によりモニターされた。血流が２０％未満に減少しない動物は除外された。
【００８５】
動物は虚血の２４時間後に抱水クロラールで殺された。脳は迅速に除去され、１ｍｍ（マウス）又は２ｍｍ（ラット）間隔で冠状断切片が作成され、生体染色色素である（２％）２、３、５−トリフェニルテトラゾリウム塩酸塩（ＴＴＣ）への浸漬により染色された。梗塞面積は、非虚血性の半球の面積から虚血性の半球においてＴＴＣで染色された正常な面積を差し引くことにより計算された。梗塞体積は、全ての切片の梗塞面積を加算することと、切片の厚さを乗算することとにより計算された。ラットの脳室内注射は、ブレグマの０．８ｍｍ後方、正中線の１．５ｍｍ側方及び硬膜の３．８ｍｍ腹側に定位的に挿入されたカニューレ付きのマイクロシリンジポンプを使用して、定位固定法により実施された。全ての操作及び解析は、処理群について盲検化された作業者により実施された。
【００８６】
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【実施例２】
【００８７】
ＰｃＴＸ神経保護のタイム・ウィンドウ
本実施例は、齧歯類での脳卒中の開始後さまざまな時間におけるＰｃＴＸ毒の神経保護効果を測定する代表的な実験を説明する。図１１を参照せよ。脳虚血（脳卒中）は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって齧歯類で誘発された。誘発後の示された時間で、人工的脳脊髄液（ａＣＳＦ）か、ＰｃＴＸ毒（０．５μＬ、総タンパク質量として５００ｎｇ／ｍＬ）か、不活性化された（煮沸処理された）毒かが、各々の齧歯類の側脳室に注入された。ＰｃＴＸ毒の投与は、脳卒中の開始後１時間及び３時間の両方で、虚血体積（ｓｔｒｏｋｅ ｖｏｌｕｍｅ）において６０％の減少を提供した。さらに、実質的な虚血体積の減少が、ＭＣＡＯの開始後５時間で処置を中断した場合でも維持される場合がある。したがって、ＡＳＩＣ阻害による神経保護は、脳卒中開始後のタイム・ウィンドウを延長し、脳卒中患者が脳卒中開始数時間後に実施された治療の利益を享受することを可能とする場合がある。脳卒中神経保護に対するこのＡＳＩＣ遮断の効果は、グルタミン酸アンタゴニストを使用するＮＭＤＡ受容体（実験的な脳卒中治療にとっての主要な標的）のカルシウムチャネル遮断の神経保護効果よりもはるかに強力である。今のところ、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害についてここで示したような望ましい効果を有するグルタミン酸アンタゴニストはない。
【実施例３】
【００８８】
代表的なシスチン・ノット・ペプチド
本実施例は、完全長のＰｃＴｘ１と、ＰｃＴｘの欠失誘導体とを含む代表的なシスチン・ノット・ペプチドを説明するが、該ペプチドは、培養細胞でスクリーニングされ、虚血動物（例えば、マウス又はラットのような齧歯類）でテストされ、及び／又は、虚血のヒト患者に投与される場合がある。図１２及び１３を参照せよ。
【００８９】
図１２は、符号５０で示された、代表的なシスチン・ノット・ペプチドであるＰｃＴｘ１の、一文字コードによる一次アミノ酸配列（配列番号１）と、位置１−４０のアミノ酸に関するさまざまな代表的ペプチド特徴とを示す。ペプチド５０は、シスチン結合５２、５４、５６を形成しシスチン・ノット・モチーフ５８を作り出す６個のシステイン残基を含む場合がある。前記ペプチドは、１個又は２個以上のベータシート領域６０と、正に帯電した領域６２とを含む場合もある。Ｎ末領域６４とＣ末領域６６とはシスチン・ノット・モチーフを挟む場合がある。
【００９０】
図１３は、図１２のＰｃＴｘ１ペプチド５０のさまざまな代表的な欠失誘導体とともに整列されたＰｃＴｘ１ペプチド５０の比較を示す。これらの誘導体は、Ｎ末欠失誘導体７０（配列番号２）と、部分的なＣ末欠失誘導体７２（配列番号３）と、完全なＣ末欠失誘導体７４（配列番号４）と、Ｎ末／Ｃ末欠失誘導体７６（配列番号５）とを含む場合がある。他のＰｃＴｘ１の誘導体は、本来のＰｃＴｘ１配列に対して少なくとも約２５％又は約５０％の配列の類似性又は同一性を維持しながら、例えば、１個又は２個以上のアミノ酸の欠失か、挿入か、置換かのいずれかを含む場合がある。
【００９１】
各々のＰｃＴｘ１誘導体は、そのＡＳＩＣタンパク質を選択的に阻害する能力について、及び／又は、虚血に対する効果があるときにはその効果について、テストされる場合がある。いずれかの適切な試験系が、本明細書のどこかで説明した細胞を用いるアッセイ系及び／又は動物モデル系のいずれかを含むこのテストを実施するために使用される場合がある。前記ＰｃＴｘ１誘導体は、付加的に又は代替的に、虚血のヒト患者でテストされる場合がある。
【実施例４】
【００９２】
ＰｃＴＸ毒のＡＳＩＣ１ａに対する選択性
本実施例は、培養細胞で発現された他のＡＳＩＣタンパク質又はＡＳＩＣタンパク質の組合せの関係で、ＡＳＩＣ１ａだけに対する、ＰｃＴＸ毒（つまりＰｃＴｘ１毒）の選択性を測定する実験を説明する。図１４を参照せよ。図に表示されたＡＳＩＣタンパク質を発現しているＣＯＳ−７細胞は、（ＡＳＩＣ１ａを発現している細胞には２５ｎｇ／ｍＬの、ＡＳＩＣ２ａかＡＳＩＣ３かＡＳＩＣ１ａ＋２ａかを発現している細胞には５００ｎｇ／ｍＬの）ＰｃＴＸ毒で処理された。チャネル電流は、最大チャネル活性の半分の活性が得られるｐＨ（ｐＨ０．５）で測定された。５００ｎｇ／ｍＬのタンパク質濃度のＰｃＴＸ毒は、ホモ多量体ＡＳＩＣ２ａか、ホモ多量体ＡＳＩＣ３か、ヘテロ多量体ＡＳＩＣ１ａ／ＡＳＩＣ２ａかにより仲介される電流に対して影響を及ぼさなかったが、２５ｎｇ／ｍＬのタンパク質濃度でＡＳＩＣ１ａホモ多量体チャネルにより仲介される電流を大幅に遮断した（ｎ＝３−６、図１４）。５００ｎｇ／ｍＬでＰｃＴＸ毒は、（例えば、ＮＭＤＡ及びＧＡＢＡ受容体依存性チャネルのような）他のリガンド依存性チャネルと、（例えば、Ｎａ＋、Ｃａ２＋及びＫ＋チャネルのような）電位依存性チャネルとにより仲介される電流に対しても影響を及ぼさなかった（ｎ＝４−５）。これらの実験は、ＰｃＴＸ毒つまりＰｃＴｘ１ペプチドが、ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａに対する特異的なブロッカーであることを示す。細胞を用いるアッセイ系を使用して、さまざまな合成ペプチド又は他の候補阻害剤（例えば、実施例３を参照せよ。）について、ＡＳＩＣ阻害の有効性と選択性が測定される場合がある。
【実施例５】
【００９３】
ＰｃＴＸ毒の経鼻投与は神経を保護する
本実施例は、脳卒中の動物モデル系で虚血に誘発される損傷を低減する、経鼻的に投与されたＰｃＴＸ毒の有効性を示す代表的なデータを説明する。図１５を参照せよ。脳虚血はオスのマウスで中大脳動脈閉塞により誘発された。閉塞が開始して１時間後、動物は対照として処置されるか、又は、ＰｃＴＸ毒で処置された。（５ｎｇ／ｍＬ（総タンパク質として）のＰｃＴｘ毒５０μＬが、経鼻的に導入された。）ＰｃＴＸ毒の経鼻投与は、梗塞体積により定義される虚血で誘発される損傷（虚血性損傷）において、対照処置と比較して５５％の減少をもたらした。経鼻投与は、肺内に吸入されるよりもむしろ鼻腔内に実質的に付着する噴霧器を介する場合があり、及び／又は、肺内に少なくとも部分的に吸入されるエアゾールを介する場合がある。一部の実施例では、経鼻投与は他の投与経路に比べて、脳へのより効率的な到達及び／又は虚血患者による自分自身での投与への適合性のような多数の利点を有する場合がある。
【実施例６】
【００９４】
選択的な実施態様
本実施例は、番号を付された一連の段落として提供される本発明の選択的な実施態様を説明する。
１．虚血で誘発される損傷の治療方法であって、酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーの阻害剤の治療上の有効量を、該阻害剤を必要とする患者に投与するステップを含む、治療方法。
２．前記投与するステップは脳卒中の患者に対して実施される、段落１に記載の治療方法。
３．前記投与するステップは、将来の虚血のエピソードに対する患者のリスクに基づいて実施されるか、あるいは、慢性的虚血に基づいて、又は、慢性的虚血を原因として実施される、段落１に記載の治療方法。
４．前記投与するステップは虚血性心臓病により誘発される損傷を治療するために実施される、段落１に記載の治療方法。
５．前記投与するステップはさまざまな時間に複数の用量の阻害剤を患者に投与することを含む、段落１に記載の治療方法。
６．前記投与するステップは阻害剤の注射によって実施される、段落１に記載の治療方法。
７．前記投与するステップは阻害剤の経口摂取又は吸入によって実施される、段落１に記載の治療方法。
８．前記投与するステップはＡＳＩＣ１ファミリーのメンバーの阻害剤を投与することを含む、段落１に記載の治療方法。
９．前記投与するステップは、他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに比べてＡＳＩＣ１ファミリーのメンバーに対して選択的な阻害剤を投与することを含む、段落８に記載の治療方法。
１０．前記投与するステップはＡＳＩＣ１ａの阻害剤を投与することを含む、段落１に記載の治療方法。
１１．前記投与するステップは、他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに比べてＡＳＩＣ１ａに対して選択的な阻害剤を投与することを含む、段落１０に記載の治療方法。
１２．前記投与するステップは、他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに比べてＡＳＩＣ１ａに対して特異的な阻害剤を投与することを含む、段落１１に記載の治療方法。
１３．前記投与するステップはシスチン・ノット・モチーフを有するペプチドを投与することを含む、段落１に記載の治療方法。
１４．前記投与するステップはタランチュラ種由来の毒性ペプチドであるＰｃＴｘ１を投与することを含む、段落１３に記載の治療方法。
１５．虚血に誘発される損傷を治療するための薬剤のスクリーニング方法であって、
ＡＳＩＣ１ａとの相互作用を測定するためにアッセイ系を選択するステップと、
該アッセイ系でＡＳＩＣ１ａとの相互作用を示す化合物を少なくとも１個同定するために、相互作用について化合物の組をテストするステップと、
虚血に誘発される損傷の治療のために前記少なくとも１個の化合物か、該化合物と構造上関連のある物質（ｒｅｌａｔｉｖｅ）かの有効性をテストするために虚血患者に前記少なくとも１個の化合物か、該化合物と構造上関連のある物質かを投与するステップとを含む、スクリーニング方法。
１６．前記アッセイ系を選択するステップは、ＡＳＩＣ１ａにより仲介されるイオン流入を測定するアッセイ系を選択することを含む、段落１５に記載のスクリーニング方法。
１７．前記アッセイ系を選択するステップは、ＡＳＩＣ１ａにより仲介されるカルシウムの流入を測定するアッセイ系を選択することを含む、段落１６に記載のスクリーニング方法。
１８．前記化合物の組をテストするステップは、イオン流入の阻害について化合物をテストすることを含む、段落１６に記載のスクリーニング方法。
１９．前記化合物の組をテストするステップは、少なくとも１個の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーとの関係でＡＳＩＣ１ａの選択的又は特異的阻害について一連の化合物をテストするステップを含む、段落１５に記載のスクリーニング方法。
２０．ヒト患者への投与のための薬剤として構成されたＡＳＩＣ１ａ阻害剤を含む虚血に誘発される損傷を治療するための組成物。
２１．前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は、各々の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに対してＡＳＩＣ１ａについて選択的又は特異的である、段落２０に記載の組成物。
２２．前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤はシスチン・ノット・モチーフを有するペプチドである、段落２０に記載の組成物。
２３．前記ペプチドはタランチュラ種由来の毒ＰｃＴｘ１である、段落２２に記載の組成物。
【００９５】
上記の開示内容は、１個又は２個以上の、独立して有用な明確な発明を包含する場合がある。これらの発明の各々は、その好ましい形態で開示される。本明細書で開示され例証された具体的な実施態様を含むこれらの好ましい形態は、多数の変更の可能性があるため、限定的な意味で考えられることは意図されない。本発明の主題は、本明細書で開示されるさまざまな要素、特徴、機能及び／又は特性の、全ての新規性及び進歩性のある組合せ及びサブコンビネーションを含む。添付する請求の範囲は、新規性及び進歩性があると見なされる特定の組合せ及びサブコンビネーションを特に指摘する。本出願又は関連出願に基づき優先権を主張する出願において、特徴、機能、要素及び／又は特性の、他の組合せ及びサブコンビネーションを実施態様とする発明が特許請求に係る発明である場合がある。そのような請求の範囲は、異なる発明に向けられるか、同じ発明に向けられるかを問わず、及び、本来の請求の範囲と比べて範囲が広いか、狭いか、等しいか、異なっているかを問わず、発明の主題の範囲内に含まれるものと見なされる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明の虚血を治療する代表的な方法を示すフローチャート。
【図２】本発明の虚血治療薬を同定する代表的な方法を示すフローチャート。
【図３】培養マウス皮質ニューロンにおける酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）タンパク質の電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを表す一連のグラフ。
【図４】培養マウス皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣタンパク質の電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを表す付加的な一連のグラフ。
【図５】モデル虚血がＡＳＩＣタンパク質の活性を上昇させる場合があることを示す代表的なデータを表す一連のグラフ及びトレース図。
【図６】皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣタンパク質がＣａ２＋透過性の場合があることを示す代表的なデータを表す一連のグラフとトレース図。
【図７】皮質ニューロンにおけるＣａ２＋透過性がＡＳＩＣ１ａ依存性の場合があることとを示す代表的なデータを表す一連のグラフとトレース図。
【図８】酸インキュベーションが、ＡＳＩＣ遮断により保護されるグルタミン酸受容体非依存性ニューロン損傷を誘発する場合があることを示す代表的なデータを表す一連のグラフ。
【図９】ＡＳＩＣ１ａがｉｎ ｖｉｔｒｏでの酸で誘発される損傷に関与する場合があることを示す代表的なデータを表す一連のグラフ。
【図１０】ＡＳＩＣ１ａの遮断による、及び、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトによるｉｎ ｖｉｖｏでの脳虚血における神経保護を示すデータを表す一連のグラフ。
【図１１】動物モデル系での、時間と処置のタイプとの関連で示される脳卒中により生じる虚血性損傷の割合についての代表的なデータをプロットしたグラフ。
【図１２】さまざまな代表的なペプチドの特徴が示された、代表的なシスチン・ノット・ペプチドであるＰｃＴｘ１の、一次アミノ酸配列の概念図。
【図１３】図１２のシスチン・ノット・ペプチドのさまざまな代表的な欠失誘導体とともに整列されたシスチン・ノット・ペプチドの比較図。
【図１４】細胞中に発現されたＡＳＩＣファミリーのメンバーとの関連で示される、細胞内で測定されたカルシウム電流の振幅をプロットした代表的なグラフ。
【図１５】動物モデル系での虚血性損傷を低減する、経鼻的に投与されたＰｃＴｘ毒の有効性に関する代表的なデータを表すグラフ。
【符号の説明】
【００９７】
２０ 本発明の虚血を治療する代表的な方法を示すフローチャート
２２ 虚血患者の選択ステップ
２４ 虚血患者へのＡＳＩＣ選択的阻害剤の投与ステップ
３０ 本発明の虚血治療薬を同定する代表的な方法を示すフローチャート
３２ ＡＳＩＣ選択的阻害剤の取得ステップ
３４ 虚血患者に対する阻害剤の効果テストのステップ
５０ ＰｃＴｘ１ペプチドのアミノ酸配列
５２、５４、５６ シスチン結合
５８ シスチン・ノット・モチーフ
６０ ベータシート領域
６２ 正に帯電した領域
６４ Ｎ末領域
６６ Ｃ末領域
７０ Ｎ末欠失誘導体のアミノ酸配列
７２ 部分的Ｃ末欠失誘導体のアミノ酸配列
７４ 完全Ｃ末欠失誘導体のアミノ酸配列
７６ Ｎ末／Ｃ末欠失誘導体のアミノ酸配列
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血治療方法及び治療用組成物を含む虚血の治療システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
優先権出願に係るクロス・リファレンス
本出願は、２００４年９月１６日に出願された特許文献１に係る（パリ条約及び米国特許法第１１９条（ｅ）を含むがこれらに限定されない）米国法及び国際法に基づく優先権を主張するが、前記米国特許仮出願は、その全内容が全ての目的のために引用によって本明細書に取り込まれる。
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／６１１，２４１号明細書
【０００３】
政府の実施権
本発明は国立衛生研究所（ＮＩＨ）からのグラントＲ２１ ＮＳ４２７９９に基づく米国政府の支援でなされた。したがって米国政府は本発明に関して一定の実施権を有する場合がある。
【０００４】
脳卒中は、例えば脳へ血液を供給する血管内の凝固又は漏出に起因する、脳への血流の障害により引き起こされる場合がある。この血流の障害は、脳組織から酸素を奪い、しばしば局所的な脳組織の壊死（局所的梗塞）をもたらし、脳の永続的な損傷をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ニューロンへのイオン流入量の変化は、脳卒中によって生じる細胞死につながる場合がある。したがって、さまざまなイオンチャネルがこのイオン流入量の変化を仲介する候補となる場合があり、適切な治療標的の探索を混乱させる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、虚血治療方法及び治療用組成物を含む虚血の治療システムを提供する。
【０００７】
図表の簡単な説明
図１は、本発明の局面にしたがって虚血を治療する代表的な方法を示すフローチャートである。
図２は、本発明の局面にしたがって虚血の治療薬を同定する代表的な方法を示すフローチャートである。
図３は、本発明の局面にしたがって培養マウス皮質ニューロンにおける酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）タンパク質の電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを表す、一連のグラフである。
図４は、本発明の局面にしたがって培養マウス皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣタンパク質の電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを表す、付加的な一連のグラフである。
図５は、本発明の局面にしたがってモデル虚血がＡＳＩＣタンパク質の活性を上昇させる場合があることを示す代表的なデータを表す、グラフとトレース図の組である。
図６及び７は、本発明の局面にしたがって、皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣタンパク質がＣａ２＋透過性の場合があることと、Ｃａ２＋透過性がＡＳＩＣ１ａ依存性の場合があることとを示す、代表的なデータを表すグラフとトレース図の組である。
図８は、本発明の局面にしたがって、酸インキュベーションが、ＡＳＩＣ遮断により保護されるグルタミン酸受容体非依存性ニューロン損傷を誘発する場合があることを示す、代表的なデータを表す、一連のグラフである。
図９は、本発明の局面にしたがって、ＡＳＩＣ１ａがｉｎ ｖｉｔｒｏでの酸で誘発される損傷に関与する場合があることを示す、代表的なデータを表す一連のグラフである。
図１０は、本発明の局面にしたがって、ＡＳＩＣ１ａの遮断による、及び、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトによるｉｎ ｖｉｖｏでの脳虚血における神経保護を示す、データ付の一連のグラフである。
図１１は、本発明の局面にしたがって、動物モデル系での、時間と処置のタイプとの関連で示した脳卒中により生じる虚血性損傷の百分率についての代表的なデータをプロットしたグラフである。
図１２は、本発明の局面にしたがって、さまざまな代表的なペプチドの特徴が示された、代表的なシスチン・ノット・ペプチドであるＰｃＴｘ１の、一次アミノ酸配列の概観である。
図１３は、本発明の局面にしたがって、図１２のシスチン・ノット・ペプチドのさまざまな代表的な欠失誘導体とともに整列されたシスチン・ノット・ペプチドの比較図である。
図１４は、本発明の局面にしたがって、細胞中に発現されたＡＳＩＣファミリーのメンバーとの関連で示した、細胞中で測定されたカルシウム電流の振幅をプロットした代表的なグラフである。
図１５は、本発明の局面にしたがって、動物モデル系での虚血性損傷を低減する、経鼻的に投与されたＰｃＴｘ毒の有効性に関する代表的なデータを表すグラフである。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、虚血治療方法及び治療用組成物を含む虚血の治療システムを提供する。前記方法は、虚血に起因する損傷を低減させるためのアプローチ、及び／又は、虚血の治療薬を同定するためのアプローチを含む場合がある。前記方法は、虚血を標的とする治療方法を提供するために、酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーの１個又は２個以上のメンバーを選択的に阻害する場合がある。
【０００９】
図１は、虚血治療方法において実施される場合がある代表的なステップ２２及び２４を有するフローチャート２０を示す。前記ステップは、いずれかの適切な回数及びいずれかの適切な組合せで実施される場合がある。前記方法では、符号２２に示すように、単数又は複数の虚血患者が治療のために選択される場合がある。次に符号２４に示すように、ＡＳＩＣ選択的阻害剤が単数又は複数の虚血患者に投与される場合がある。前記虚血患者への阻害剤の投与量は、前記患者の虚血で誘発される損傷を低減させるため、例えば、脳卒中に起因する脳損傷の量を低減させるために、治療上の有効量の範囲内の場合がある。
【００１０】
図１の虚血治療方法の有効性についての可能性のある説明は、本発明（例えば、実施例１を参照）のデータによって提供される場合がある。具体的には、虚血の損傷効果はアシドーシスとは等しくない、すなわち、虚血を介する組織／細胞の酸性化は、虚血で誘発される損傷を発生させるには十分ではない。むしろ、虚血で誘発される損傷は、多くの場合、ＡＳＩＣファミリーの１個又は２個以上のメンバー、特に、ＡＳＩＣ１ａにより仲介される細胞内へのカルシウムの流入により引き起こされる。したがって、ＡＳＩＣ１ａのチャネル活性の選択的阻害は、この有害なカルシウム流入を低減させ、これにより虚血で誘発される損傷を低減させる場合がある。
【００１１】
図２は、虚血の治療薬を同定する方法において実施される場合がある代表的なステップ３２及び３４を有するフローチャート３０を示す。前記ステップは、いずれかの適切な回数及びいずれかの適切な組合せで実施される場合がある。前記方法では、符号３２に示すように、１個又は２個以上のＡＳＩＣ選択的阻害剤が得られる場合がある。次に符号３４に示すように、前記阻害剤は、虚血で誘発される損傷に対する効果について、虚血患者でテストされる場合がある。
【００１２】
本発明の方法は、他の虚血治療方法と比べて１つ又は２つ以上の利点を提供する場合がある。これらの利点は、（１）虚血で誘発される損傷が少ないこと、（２）（例えば、より特異的な治療標的を選択するために）治療の副作用が少ないこと、及び／又は、（３）治療効果がより長期間持続すること、等を含む場合がある。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、（Ｉ）虚血、（ＩＩ）虚血患者及び患者の選択、（ＩＩＩ）ＡＳＩＣ阻害剤、（ＩＶ）阻害剤の投与、（Ｖ）治療薬の同定、及び（ＶＩ）実施例、を含み、以下の節で述べられる。
【００１４】
Ｉ．虚血
本発明のシステムは、いずれかの適切な虚血治療方法に向けられる。本明細書で用いられるところの虚血とは、単数又は複数の器官及び／又は組織への血流減少をいう。前記血流減少は、前記器官及び／又は組織へ血液を供給する１本又は２本以上の血管の、部分的な若しくは完全な遮断（閉塞）、狭窄、及び／又は、漏出／破裂、等を含むいずれかの適切なメカニズムにより引き起こされる場合がある。したがって虚血は、血栓症、塞栓症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、出血、動脈瘤、外科手術、外傷、薬剤服用及び／又はこれらに類するものによって作出される場合がある。故に、前記血流減少は、慢性、一過性、急性、散発性及び／又はこれらに類するものの場合がある。
【００１５】
いずれの適切な器官又は組織でも、治療される虚血で血流減少を経験する場合がある。代表的な器官又は組織は、脳、動脈、心臓、腸、眼（例えば、視神経）等を含む場合がある。さまざまな虚血により生じる虚血で誘発される損傷（すなわち、病気及び／又は損傷）は、虚血性脊髄症、虚血性視神経症、虚血性結腸炎、冠状動脈性心臓病、及び／又は心性心臓病（ｃａｒｄｉａｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ、例えば、狭心症、心臓発作等）等を含む場合がある。故に、虚血で誘発される損傷は、例えば、人体の患部で、壊死（梗塞）組織、炎症、及び／又は組織の再構築等を生じさせて、細胞及び／又は組織を傷つけ、及び／又は、殺す場合がある。本発明の局面による治療は、この損傷の発生率、範囲、及び／又は重傷度を低減する場合がある。
【００１６】
本発明のシステムは、脳卒中の治療方法を提供する場合がある。本明細書で用いられるところの脳卒中とは、脳の一部又は全部への血液供給の減少により生じる脳の虚血をいう。脳卒中により生じる症状は、（意識喪失のように）突発的であるか、あるいは、数時間又は数日かけて緩やかに始まる場合がある。さらに脳卒中は、重度な虚血性発作（フル・ストローク（ａ ｆｕｌｌ ｓｔｒｏｋｅ））か、あるいは、より軽度な、一過性の虚血性発作等の場合がある。脳卒中により生じる症状は、例えば、片側不全麻痺、半身不随、片側無感覚、片側脱力、片側麻痺、一時的な四肢の脱力、四肢の痛み、精神錯乱、発話困難、会話理解困難、片目又は両目の視力低下、弱視、失明、歩行困難、目まい、転倒傾向、協調運動障害、突発的な重度の頭痛、騒々しい呼吸及び／又は意識喪失を含む場合がある。代替的に又は追加的に、前記症状は、例えば、（例えば、アルブミンの変化、特定のタンパク質アイソフォーム、損傷したタンパク質等を検査するための）虚血血液テスト、心電図、脳波図、運動負荷テスト、及び／又はこれらに類するものを通じて、より容易に検出できるか、前記テスト及び／又は機器を通じてのみ検出できる場合がある。
【００１７】
ＩＩ．虚血患者及び患者の選択
本発明のシステムは、患者への虚血性の損傷を低減するために、虚血患者の治療方法を提供する場合がある。本明細書で用いられるところの虚血患者とは、虚血、虚血に関連する症状、虚血の病歴、及び／又は、治療の開始後でありかつ治療が有効な期間内に虚血が進行する有意な可能性を有する人間（ヒト患者）又は動物（被験動物）のいずれかをいう。
【００１８】
前記虚血患者は動物の場合がある。本明細書で用いられるところの用語「動物」とは、ヒト以外のいずれかの動物を指す。適切かもしれない代表的な動物は、齧歯類（マウス、ラット等）、イヌ、ネコ、鳥類、ヒツジ、ヤギ、ヒト以外の霊長類、等のような血液循環を有する動物のいずれかを含む。前記動物は、該動物自体のために、例えば（ペットの治療のように）獣医学的な目的で、治療を受ける場合がある。代替的には前記動物は、ヒトが使用する治療薬候補の試験を促進するために、例えば候補薬の有効性、有効期間、副作用等を決定するために、虚血の動物モデルを提供する場合がある。動物モデル系で実施されるテストのさらなる局面は、以下の第Ｖ節で説明される。
【００１９】
虚血に関連する症状は、虚血のいずれかの結果の場合がある。前記結果は、虚血の開始と実質的に同時進行である場合があり（例えば、該虚血の直接の効果）、及び／又は、実質的に虚血の開始後に起こる場合、及び／又は、虚血の終了後であっても起こる場合（例えば、虚血終了後の組織再潅流のような、虚血の間接的な下流効果）がある。代表的な虚血に関連する症状は、上述の第Ｉ節にて列挙した症状（及び／又は病状）のいずれかの組合せを含む場合がある。代替的に又は追加的に、前記症状は、局所的な及び／又は全身のアシドーシス（ｐＨの低下）、低酸素症（酸素の減少）、フリーラジカルの発生、及び／又はこれらに類するものを含む場合がある。
【００２０】
治療対象の虚血患者は、いずれかの適切な基準により選択される場合がある。代表的な基準は、検出可能な虚血の症状のいずれか、虚血の病歴、（例えば、外科手術、外傷、薬剤服用等のような）虚血のリスクを増大させる（又は虚血を誘発させる）事象、及び／又はこれらに類するものを含む場合がある。虚血の病歴は、１回又は２回以上のより重要な虚血のエピソードを伴う場合がある。一部の実施例では、治療のために選択された患者は、治療開始の少なくとも約１、２又は３時間前に虚血が開始している場合があるか、又は、治療の開始前約１日、１２時間、又は６時間未満に起きた、（一過性の虚血性発作のような）複数の虚血のエピソードを有する場合がある。
【００２１】
ＩＩＩ．ＡＳＩＣ阻害剤
本明細書で用いられるところのＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害剤とは、ＡＳＩＣファミリー、すなわち、ＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３、ＡＳＩＣ４等のうち１個又は２個以上のメンバーの活性を低減させる（部分的に、実質的に、又は完全に阻害する）物質をいう。一部の実施例では、前記阻害剤は１個又は２個以上のメンバーのチャネル活性、例えば細胞膜を通じて（細胞の内側及び／又は外側へ）イオン（例えば、ナトリウムイオン、カルシウムイオン及び／又はカリウムイオン等）を流出入させるメンバーの活性、を低減させる場合がある。前記物質は、化合物（約１０ｋＤａ未満の小分子、ペプチド、核酸、脂質、その他）、２又は３以上の化合物の複合体、及び／又は混合物等の場合がある。さらに前記物質は、競合型、非競合型、不競合型、及び／又は混合型等を含むいずれかの適切なメカニズムによって、ＡＳＩＣファミリーのメンバーを阻害する場合がある。
【００２２】
前記阻害剤は、酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）を阻害するＡＳＩＣ１ａ阻害剤の場合がある。本明細書で用いられるところのＡＳＩＣ１ａとは、いずれかの生物種からのＡＳＩＣ１ａタンパク質又はチャネルを指す。例えば、代表的なヒトＡＳＩＣ１ａタンパク質／チャネルは、引用によって本明細書に取り込まれる、Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｒ．、ｅｔ ａｌ． １９９７、 Ｎａｔｕｒｅ ３８６、ｐｐ．１７３−１７７に説明されている。
【００２３】
「ＡＳＩＣ１ａ阻害剤」という表現は、適切な薬理学的判断の範囲内でＡＳＩＣ１ａの阻害剤として潜在的に又は実際的に医薬品として有用である製品を指す場合があり、医薬品として活性のある分子種を含み、及び、ＡＳＩＣ１ａ阻害剤として説明されているか、宣伝されているか、承認されている物質を指すことを含む。
【００２４】
ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は、ＡＳＩＣファミリーの範囲内でも選択的である場合がある。本明細書で用いられるところのＡＳＩＣ１ａ選択的阻害とは、（例えば、培養細胞において）同じ（最高以下の）濃度の阻害剤への各々の暴露の後で比較したときに、別のＡＳＩＣファミリーのメンバーに対してよりも、ＡＳＩＣ１ａに対して実質的により強く阻害することをいう。前記阻害剤は、少なくとも１個の他のＡＳＩＣファミリーのメンバー（ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３、ＡＳＩＣ４等）と比較して選択的に、及び／又は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較しても選択的に、ＡＳＩＣ１ａを阻害する場合がある。選択的阻害剤の阻害の強さは、異なるＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較した阻害の起きる阻害剤濃度（例えば、ＩＣ５０（最大阻害の５０％が起こる阻害剤濃度）又はＫｉ値（阻害定数又は解離定数））によって説明される場合がある。ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、少なくとも１個の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーの、又は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害に対してよりも、少なくとも約２倍か、４倍か、１０倍低い（２分の１か、４分の１か、１０分の１か、さらに低い）濃度で、ＡＳＩＣ１ａ活性を阻害する場合がある。したがってＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、少なくとも１個の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに対してよりも、及び／又は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害に対してよりも、ＡＳＩＣ１ａ阻害に対して、少なくとも約２倍か、４倍か、１０倍低い（２分の１か、４分の１か、１０分の１か、さらに少ない）ＩＣ５０及び／又はＫｉ値を有する場合がある。
【００２５】
ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤は、選択的であることに加えて、ＡＳＩＣ１ａに対して特異的である場合もある。本明細書で用いられるところのＡＳＩＣ１ａ特異的阻害とは、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較しても、ＡＳＩＣ１ａに対して実質的に独占的である阻害をいう。ＡＳＩＣ１ａ特異的阻害剤は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害に対してよりも、少なくとも約２０倍低い（５％以下の）阻害剤濃度で、ＡＳＩＣ１ａを阻害する場合がある。したがってＡＳＩＣ１ａ特異的阻害剤は、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較しても、ＡＳＩＣ１ａに対して、少なくとも約２０倍低い（５％以下の）ＩＣ５０及び／又はＫｉ値を有する場合があり、その結果例えば、他のＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害は、少なくとも実質的に又は完全に検出できない。
【００２６】
いずれかの適切なＡＳＩＣ阻害剤又は阻害剤の組合せを使用してもかまわない。例えば患者は、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤と非選択的ＡＳＩＣ阻害剤とか、あるいは、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤と、ＡＳＩＣ以外のカルシウムチャネルのようなＡＳＩＣ以外のチャネルタンパク質の阻害剤とかで、治療される場合がある。一部の実施例では患者は、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害剤と、グルタミン酸アンタゴニストのようなＮＭＤＡ受容体の阻害剤とで、治療される場合がある。
【００２７】
前記阻害剤はペプチドであるか又はペプチドを含むかの場合がある。該ペプチドは、いずれかの適切な数の、一般的に少なくとも約１０個で、かつ約１，０００個未満の、アミノ酸サブユニットを有する場合がある。一部の実施例では、前記ペプチドはシスチン・ノット・モチーフ（ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｍｏｔｉｆ）を有する場合がある。本明細書で用いられるところのシスチン・ノットとは、６個又は７個以上のシステインの配置を含むものをいうのが一般的である。これらのシステインを有するペプチドは、（１）２個のジスルフィド結合とそれらが接続する主鎖セグメントとにより形成されるリングと、（２）該リングを通り抜ける３個目のジスルフィド結合と、を含む「ノット」を作り出す場合がある。一部の実施例では、前記ペプチドは、クモ形類動物及び／又はカタツムリ状の巻貝種（ｃｏｒｎ ｓｎａｉｌ）由来のコノトキシンの場合がある。例えば、前記ペプチドは、タランチュラ（Ｐｓａｌｍｏｐｏｅｕｓ ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉ（Ｐｃ））由来の毒素であるＰｃＴｘ１（ｐｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ １）の場合がある。
【００２８】
一部の実施例では、前記ペプチドはＰｃＴｘ１と構造的に関連する場合があり、前記ペプチド及びＰｃＴｘ１は、１個又は２個以上のアミノ酸の、少なくとも１ヶ所の欠損、挿入及び／又は置換だけ異なっている。例えば前記ペプチドはＰｃＴｘ１と、少なくとも約２５％の又は少なくとも約５０％の、配列同一性及び／又は配列類似性を有する場合がある（下記参照）。阻害剤として適切な場合があるペプチドのさらなる局面は下記実施例３で述べられる。
【００２９】
アミノ酸配列の比較のためのアライメント方法と、同一性及び類似性スコアの算出方法とは当業者に周知である。適切な場合がある代表的なアライメント方法は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの方法（Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（ＧＡＰ）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似法（Ｔｆａｓｔａ ａｎｄ Ｆａｓｔａ）、及び／又はこれらに類するものを含む。適切な場合があるこれらその他のアプローチのコンピューターアルゴリズムは、ＣＬＵＳＴＡＬと、ＧＡＰと、ＢＥＳＴＦＩＴと、ＢＬＡＳＴＰと、ＦＡＳＴＡと、ＴＥＡＳＴＡを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で用いられるところの、２つのペプチドの文脈における「配列同一性」又は「同一性」とは、対応度が最大となるようにアライメントをとるときに同じである対応するペプチド配列中の残基の百分率に関する。一部の実施例では、同一でないペプチド残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なっている場合があり、ここでアミノ酸残基は、（例えば電荷や疎水性のような）化学特性が類似する他のアミノ酸残基に置換されるので、分子の機能特性に対する影響が小さいか又は全く影響が無いことが予想される。保存的置換により配列が異なる場合には、置換の保存的特性について訂正する配列の「類似性」を示すために、配列同一性の百分率が上方に修正される場合がある。例えば、各々の保存的置換は、全体的なミスマッチよりもむしろ部分的なミスマッチとして評価される場合があり、故に、類似性スコアを提供するために、配列同一性の百分率を訂正している。類似性スコアを得るための保存的置換のスコア方法は当業者に周知であり、いずれかの適切なアプローチにより、例えばＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）のプログラムで実施されるような、Ｍｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムにしたがって、計算される場合がある。
【００３１】
ＩＶ．阻害剤の投与
本明細書で用いられるところの投与とは、患者を阻害剤に曝すいずれかの経路、いずれかの適切な条件下で、及び、いずれかの適切な回数、を含む。投与は、自分自身による投与、又は、（例えば、医師、看護師等）保健実務家のような他人による投与の場合がある。投与は、（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、脳内、硬膜外、及び／又は髄腔内等への）注射により、（例えば、カプセル、トローチ、液体組成物等を用いた）経口摂取により、（例えば、経鼻的及び／又は経口的な（液滴直径が平均約１０ミクロン未満の）エアゾールの）吸入により、（例えば、皮膚用パッチ剤を用いる）経皮吸収及び／若しくは（例えば、口腔、鼻腔及び／又は肺粘膜等の）経粘膜吸収により、並びに／又はこれらに類するものによる場合がある。経粘膜投与は、例えば、（鼻腔用噴霧器のような）噴霧器、吸入されるエアゾール、及び／又はこれらに類するものを用いて実施される場合がある。噴霧は、（液滴の直径が平均約５０ミクロンより大きい）表面噴霧及び／又は（液滴の直径が平均約１０〜５０ミクロンである）空間噴霧の場合がある。一部の実施例では、虚血は虚血患者の血液脳関門に変化を起こす場合があり、故に、患者の血流に（例えば、注射及び／又は吸収によって）導入される阻害剤が脳へ到達できる効率を向上させている。投与は、治療を提供するために、１回又は複数回、かつ、虚血の診察結果に対応していずれかの適切な時間実施される場合がある。したがって投与は、虚血が（例えば予防的に）検出される前、主要でない虚血のエピソードが観察された後、慢性的な虚血の間、フル・ストロークの後、及び／又はこれらに類する場合に実施される場合がある。
【００３２】
阻害剤の治療上の有効量が投与される場合がある。本明細書で用いられるところの阻害剤の治療上の有効量とは、患者に投与されたときに、有意な数の患者において、該患者における虚血で誘発される損傷の程度、発生率及び／又は範囲を低減させる阻害剤のいずれかの量をいう。したがって治療上の有効量は、例えば、治験患者に対してさまざまな量の阻害剤が投与される（そして一般的には、対照群の患者と比較される）臨床研究において決定される場合がある。
【００３３】
前記阻害剤は、いずれかの適切な形状及びいずれかの適切な組成で患者に投与される場合がある。一部の実施例では前記阻害剤は、医薬品として許容される塩として構成される場合がある。上述の組成物は、例えば、流動体状のキャリアー（ｃａｒｒｉｅｒ）／溶媒（薬物送達手段（ｖｅｈｉｃｌｅ））、保存料、１種類か２種類以上の賦形剤、着色料、香料、塩、消泡剤及び／又はこれらに類するものを含めて設定される場合がある。前記阻害剤は、虚血患者に投与されたときに虚血の治療に対する阻害剤の治療上の有効量を提供する薬物送達手段中の濃度で存在する場合がある。
【００３４】
Ｖ．治療薬の同定
その他のＡＳＩＣ阻害剤が、虚血治療薬として使うために、同定される場合がある。同定は、（Ａ）１種類又は２種類以上のＡＳＩＣ阻害剤の取得と（Ｂ）虚血患者でのＡＳＩＣ阻害剤のテストとを含む。
【００３５】
Ａ．ＡＳＩＣ阻害剤の取得
１種類又は２種類以上のＡＳＩＣ阻害剤、特に上記のＡＳＩＣ１ａ阻害剤が取得される場合がある。前記阻害剤は、（例えば、２個又は３個以上の化合物のライブラリーのような）一組の候補阻害剤のスクリーニング及び／又は理論的な設計等のような、いずれかの適切なアプローチで、取得される場合がある。
【００３６】
スクリーニングは、ＡＳＩＣタンパク質と前記一組の候補阻害剤との間の相互作用を測定するいずれかの適切なアッセイ系を含む場合がある。代表的なアッセイ系は、（例えば、結合アッセイのように）生化学的に実施されるアッセイ、培養状態で増殖した細胞（培養細胞）を用いて行われるアッセイ、及び／又は生物個体を行われるアッセイ等を含む場合がある。
【００３７】
細胞を利用するアッセイ系は、各々の候補阻害剤の、細胞内のイオンの流出入、一般的には、酸感受性のイオン流出入に与える効果が存在するときには、これを測定する場合がある。一部の実施例では、前記イオン流出入は、カルシウム及び／又はナトリウム等の流出入の場合がある。前記アッセイ系は、ＡＳＩＣファミリーのメンバーに対する各々の阻害剤の選択性を決定するために、ＡＳＩＣ１ａのようなＡＳＩＣファミリーのメンバーを発現する細胞か、又は、ＡＳＩＣ１ａと別の１つ若しくは２つ以上のＡＳＩＣファミリーメンバーとのような、２つ又は３つ以上の相異なるＡＳＩＣファミリーのメンバーを発現する２つ又は３つ以上の相異なる組の細胞かを使用する場合がある。前記細胞は、内在的に、又は外来の核酸の導入を通じて、各々のＡＳＩＣファミリーのメンバーを発現する場合がある。一部の実施例では前記アッセイ系は、（パッチクランプ法のように）電気生理学的にか、（例えば、Ｆｕｒａ−２のようなカルシウム感受性色素のような）イオン感受性又は膜ポテンシャル感受性の色素を用いるか、膜ポテンシャル及び／又は（例えば、カルシウムのような）細胞内イオン濃度等の変化に対し感受性のある遺伝子を利用するレポーター系を介するかによって、イオン流出入を測定する場合がある。前記アッセイ系は、ＡＳＩＣファミリーのメンバー、特に、ＡＳＩＣ１ａの選択的及び／又は特異的阻害に対して候補阻害剤をテストするために使用される場合がある。
【００３８】
Ｂ．患者でのＡＳＩＣ阻害剤の治験
１個又は２個以上のＡＳＩＣ阻害剤が、虚血治療についての該阻害剤の薬効をテストするために、虚血患者に投与される場合がある。前記虚血患者はヒト又は動物の場合がある。一部の実施例では、前記虚血患者は、虚血及び／又は発作の動物モデル系を提供する場合がある。代表的な動物モデル系は、実験的に誘発された虚血を有する齧歯類（マウス及び／又はラット等）を含む。前記虚血は、機械的に（例えば外科的に）、及び／又は、薬剤の投与等により誘発される場合がある。一部の実施例では前記虚血は、中大脳動脈の狭窄のような血管の閉塞により誘発される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の選択された局面及び実施態様、特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＡＳＩＣ阻害効果と、阻害剤として使用される代表的なシスチン・ノット・ペプチドとを説明するデータを説明する。これらの実施例は、例示の目的で意図されており、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００４０】
カルシウム透過性酸感受性イオンチャネルを遮断する、虚血における神経保護
本実施例は、虚血性損傷を仲介するＡＳＩＣ１ａの役割と、虚血性損傷を低減させるＡＳＩＣ１ａ阻害剤の能力とを示す実験を説明する。図２−１０を参照せよ。
【００４１】
Ａ．概観
Ｃａ２＋の毒性は、虚血脳損傷において中心的な役割を果たす場合がある。虚血脳において細胞への有毒なＣａ２＋の取り込みが起きるメカニズムは、グルタミン酸アンタゴニストの複数回のヒト治験が発作における有効な神経保護を示すことに失敗してきたために、不明確になった。アシドーシスは虚血の共通の特徴である場合があり、脳損傷において重大な役割を果たす場合があるが、そのメカニズムは特定されないままである。ここで我々は、アシドーシスがＣａ２＋透過性酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣｓ）を活性化する場合があり、それがグルタミン酸受容体非依存性で、Ｃａ２＋依存性の、ＡＳＩＣブロッカーにより阻害されるニューロン損傷を誘発する場合があることを示す。Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａのトランスフェクションが感受性を確立する場合があるのに対して、内在性ＡＳＩＣｓを欠損している細胞は、酸損傷に耐性の場合がある。局所的虚血においては、ＡＳＩＣ１ａブロッカーの脳室内注射又はＡＳＩＣ１ａ遺伝子のノックアウトが、虚血性損傷から脳を保護する場合があり、かつ、グルタミン酸の拮抗作用よりも強く脳を保護する場合がある。したがってアシドーシスは、結果的に生ずる［Ｃａ２＋］ｉ（細胞内カルシウム）の毒性による膜受容体を基づくメカニズムを介して脳を損傷する場合があり、発作に対する新しい潜在的治療標的を開示する。
【００４２】
Ｂ．序論
細胞内へのＣａ２＋過剰取り込みは、脳虚血を含む、神経病理学的症候群に関連するニューロン損傷に対して重要な場合がある（Ｃｈｏｉ １９９５及びＣｈｏｉ １９８８ａ）。過剰な細胞内Ｃａ２＋は、タンパク質、脂質及び核酸を分解する酵素の活性化を導く細胞障害反応のカスケードを活性化する場合がある。中枢神経系における最も重要な興奮性神経伝達物質受容体の場合がある（ＭｃＬｅｎｎａｎ １９８３及びＤｉｎｇｌｅｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．１９９９）ＮＭＤＡ受容体は、虚血脳におけるＣａ２＋過剰取り込みに関与する主要な標的であると長い間考えられてきた（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８４；Ｒｏｔｈｍａｎ ａｎｄ Ｏｌｎｅｙ １９８６；Ｃｈｏｉ １９８８ｂ及びＭｅｌｄｒｕｍ １９９５）。しかし、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの治療上の使用を通じて脳損傷を予防するための近年の臨床治療の努力は期待外れであった（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９９及びＷａｈｌｇｒｅｎ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ ２００４）。治療の早期開始の困難さを含めて、多数の要因が治験の失敗に寄与したかもしれないが、グルタミン酸受容体非依存性Ｃａ２＋毒性も、追加的又は代替的に、虚血脳損傷に関与している場合がある。
【００４３】
正常な脳は、そのエネルギー要求を満足させるために、グルコースの完全酸化を必要とする場合がある。虚血の際には、酸素の枯渇が脳に嫌気的解糖への切り替えを強要する場合がある。解糖の副生成物としての乳酸と、ＡＴＰの加水分解により生成されるプロトンとの蓄積が、虚血脳におけるｐＨの低下を引き起こす場合もある（Ｒｅｈｎｃｒｏｎａ １９８５及びＳｉｅｓｊｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）。その結果組織ｐＨは、正常血糖の条件下での虚血の際に６．５−６．０へ低下するのが典型的で、重度の虚血の際又は高血糖の条件下では、６．０より下に低下する場合がある（Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｒｅｈｎｃｒｏｎａ １９８５及びＳｉｅｓｊｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）。ほとんど全てのｉｎ ｖｉｖｏの研究は、アシドーシスが虚血脳損傷を悪化させることを示す（Ｔｏｍｂａｕｇｈ ａｎｄ Ｓａｐｏｌｓｋｙ １９９３及びＳｉｅｓｊｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）。しかし、多くの可能性が示唆されているものの、このプロセスのメカニズムは不透明なままである（Ｓｉｅｓｊｏ ｅｔ ａｌ．１９９６；ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９５及びＹｉｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９９）。
【００４４】
新規に記載されたリガンド依存性（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ）チャネルのクラスである（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ及びＫｒｉｓｈｔａｌ ２００３）酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣｓ）は、哺乳類の中枢及び末梢の神経系ニューロンの到るところに発現されることが示された（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ；Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｗａｌｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ １９９８；Ｋｒｉｓｈｔａｌ ２００３；Ａｌｖａｒｅｚ ｄｅ ｌａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２００２及びＡｌｖａｒｅｚ ｄｅ ｌａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２００３）。これらのチャネルは、ｄｅｇｅｎｅｒｉｎ／上皮ナトリウムチャネル（Ｄｅｇ／ＥＮａＣ）スーパーファミリーのメンバーである（Ｂｅｎｏｓ ａｎｄ Ｓｔａｎｔｏｎ １９９９；Ｂｉａｎｃｈｉ ａｎｄ Ｄｒｉｓｃｏｌｌ ２００２及びＫｒｉｓｈｔａｌ ２００３）。虚血に関連して、ＡＳＩＣｓもＣａ２＋を流入させる場合がある（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．２００２及びＹｅｒｍｏｌａｉｅｖａ ｅｔ ａｌ．２００４）。
【００４５】
今まで、６種類のＡＳＩＣサブユニットがクローニングされている。これらのサブユニットのうち４種類は、酸性のｐＨで活性化され、ナトリウム選択性でアミロリド感受性の陽イオン流を導通させる機能的なホモ多量体チャネルを形成する場合がある。これらのチャネルの最大活性の半分の活性が得られるｐＨ（ｐＨ０．５）は異なる。ＡＳＩＣ１ａではｐＨ０．５＝６．２であり（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ａ）、ＡＳＩＣ１ａのスプライス変異体であり独特なＮ末端を有するＡＳＩＣ１β（ＡＳＩＣ１ｂともいう。）ではｐＨ０．５＝５．９であり（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ＡＳＩＣ２ａではｐＨ０．５＝４．４であり（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、ＡＳＩＣ３ではｐＨ０．５＝６．５である（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ｂ）。ＡＳＩＣ２ｂもＡＳＩＣ４も機能的なホモ多量体チャネルを形成できない（Ａｋｏｐｉａｎ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｇｒｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００及びＬｉｎｇｕｅｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．１９９７）が、ＡＳＩＣ２ｂは他のサブユニットと会合し活性を調節することが示されている（Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。Ｎａ＋透過性に加えて、ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａはＣａ２＋を流入させる場合がある（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．２００２及びＹｅｒｍｏｌａｉｅｖａ ｅｔ ａｌ．２００４）。ネイティブのニューロンにおけるＡＳＩＣｓの正確なサブユニット組成は決定されていないが、ＡＳＩＣ１ａ及びＡＳＩＣ２ａ両方のサブユニットは脳の中に豊富に存在することが示されている（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｂａｓｓｉｌａｎａ ｅｔ ａｌ．１９９７；Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．２００２及びＡｌｖａｒｅｚ ｄｅ ｌａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．２００３）。
【００４６】
末梢及び中枢両方の神経系におけるＡＳＩＣｓの詳細な機能は、未決定のままである。末梢感覚ニューロンにおいてＡＳＩＣｓは、特にＡＳＩＣｓが狭心痛を伝達する可能性がある（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）虚血心筋における、機械的感覚（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．２０００及びＰｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．２００１）と、組織アシドーシスの間の痛みの認知（Ｂｅｖａｎ ａｎｄ Ｙｅａｔｓ １９９１；Ｋｒｉｓｈｔａｌ ａｎｄ Ｐｉｄｏｐｌｉｃｈｋｏ １９８１；Ｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｓｌｕｋａ ｅｔ ａｌ．２００３及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００２）とに関与する。痛覚受容器が欠けている脳におけるＡＳＩＣｓの存在は、これらのチャネルが痛覚を越える機能を有する場合があることを示唆する。確かに近年の研究はＡＳＩＣ１ａがシナプスの可塑性、学習／記憶、及び恐怖条件づけに関与する場合があることを示した（Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．２００２及びＷｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．２００３）。ここで、パッチクランプ法と、Ｃａ２＋イメージング法と、受容体サブユニットトランスフェクションと、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害アッセイと、遺伝子ノックアウト法を併用するｉｎ ｖｉｖｏ虚血モデルとの組合せを用いて、我々は、グルタミン酸非依存性で、アシドーシスに仲介される、虚血脳損傷の主な原因としてのＣａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａの活性化を証明する。
【００４７】
Ｃ．結果
１．アシドーシスはマウスの皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣｓを活性化する
図３及び４は、培養マウス皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣｓの電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを示す。図３Ａ及び３Ｂは、７．４から表示されたｐＨ値までのｐＨの低下により活性化されるＡＳＩＣ電流（ＡＳＩＣ ｃｕｒｒｅｎｔｓ）のｐＨ依存性を示すグラフである。容量反応曲線は、平均ｐＨ０．５＝６．１８±０．０６（ｎ＝１０）を用いてＨｉｌｌの式に当てはめられた。図３Ｃ及び３Ｄは、ＡＳＩＣｓ（ｎ＝５）の電流・電圧の関係を示すグラフである。さまざまな電圧におけるＡＳＩＣ電流の振幅は、−６０ｍＶで記録された振幅に正規化された。図４Ａ及び４Ｂは、アミロリドによる容量依存的なＡＳＩＣ電流の遮断を示すグラフである。Ｎ＝８で、ＩＣ５０＝１６．４±４．１μＭであった。図４Ｃ及び４Ｄは、ＰｃＴＸ毒によるＡＳＩＣ電流の遮断（＊＊ｐ＜０．０１）を示すグラフである。
【００４８】
我々は最初に、細胞毒性の研究（Ｋｏｈ ａｎｄ Ｃｈｏｉ １９８７及びＳａｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）に一般的に使用される標品である培養マウス皮質ニューロンにおいてＡＳＩＣ電流を記録した。図３を参照せよ。−６０ｍＶの保持電位で、細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）の７．０より下への迅速な低下が、ニューロンの大多数において、小さな定常状態成分を有する大きな一過性内向き電流を引き起こした（図３Ａ）。内向き電流の振幅は、ｐＨｅが減少するにつれて、Ｓ字状に増大し、ｐＨ０．５＝６．１８±０．０６（ｎ＝１０、図３Ｂ）と算出された。直線的なＩ−Ｖ関係と、Ｎａ＋平衡電位に近い逆転が得られた（ｎ＝６、図３Ｃ及び３Ｄ）。これらのデータは、ｐＨｅの低下がマウス皮質ニューロンにおいて典型的なＡＳＩＣｓを活性化する場合があることを証明する。
【００４９】
我々は次に、ＡＳＩＣｓの非特異的ブロッカーである（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ａ）アミロリドの、酸により活性化される電流に対する影響をテストした。図４を参照せよ。主に感覚ニューロンにおける過去の研究（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９７ａ；Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８及びＶａｒｍｉｎｇ １９９９）と同様に、アミロリドは皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣ電流を、ＩＣ５０＝１６．４±４．１μＭで容量依存的に遮断した（ｎ＝８、図４Ａ及び４Ｂ）。タランチュラＰｓａｌｍｏｐｏｅｕｓ ｃａｍｂｒｉｄｇｅｉの毒（ＰｃＴｘ毒）由来のＰｓａｌｍｏｔｏｘｉｎ １（又はＰｃＴｘ１）は、特異的なＡＳＩＣ１ａブロッカーの場合がある（Ｅｓｃｏｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。我々の研究は、ＰｃＴＸ毒自体が２５ｎｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、ＣＯＳ−７細胞で発現されたホモ多量体ＡＳＩＣ１ａにより媒介される電流を〜７０％遮断する可能性があることを示す（ｎ＝４、引用によって本明細書に取り込まれるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／１１８／６／６８７／ＤＣ１に存在する追補図Ｓ１を参照せよ。）。しかしＰｃＴＸ毒は、５００ｎｇ／ｍＬでも、ヘテロ多量体ＡＳＩＣ１ａ／２ａか、ホモ多量体ＡＳＩＣ２ａか、ホモ多量体ＡＳＩＣ３かのチャネルにより媒介される電流には影響を及ぼさない（ｎ＝４−６）。加えて、ＰｃＴＸ毒は５００ｎｇ／ｍＬでも、既知の電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）及びリガンド依存性チャネルを通じた電流には影響を及ぼさず、ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａに対する特異性をさらに示す（ｎ＝４−５、引用によって本明細書に取り込まれる追補図Ｓ２及び追補データ（上記引用のウェブサイトにて））。
【００５０】
我々は次に、皮質ニューロンにおける酸により活性化される電流に対するＰｃＴＸ毒の影響をテストした。１００ｎｇ／ｍＬで、ＰｃＴＸ毒はＡＳＩＣ電流のピーク振幅を、４７％±７％まで可逆的に遮断し（ｎ＝１５、図４Ｃ及び４Ｄ）、酸により活性化される電流全体に対するホモ多量体ＡＳＩＣ１ａの顕著な貢献を示した。ＰｃＴＸ濃度の増大は、皮質ニューロンの主要部においてＡＳＩＣ電流の振幅のさらなる低減を誘発せず（ｎ＝８、データは示していない）、これらのニューロンにおいてＰｃＴＸ非感受性のＡＳＩＣｓ（例えば、ヘテロ多量体ＡＳＩＣ１ａ／２ａ）が共存することを示した。
【００５１】
２．ＡＳＩＣ応答はモデル虚血により増強される
図５は、モデル虚血がＡＳＩＣｓの活性を上昇させる場合があることを示す代表的なデータを示す。図５Ａは、１時間のＯＧＤ後のＡＳＩＣ電流の振幅増大と脱感作減少を示す一連の代表的なトレース図である。図５Ｂは、ＯＧＤニューロンにおけるＡＳＩＣ電流の振幅増大を示す要約データのグラフである（Ｎ＝４０及び４４、＊ｐ＜０．０５）。図５Ｃは、ＯＧＤニューロンにおけるＡＳＩＣ電流の脱感作の減少を示す一連の代表的なトレース図及び要約データである（Ｎ＝６、＊＊ｐ＜０．０１）。図５Ｄは、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンでは、ｐＨ６．０、対照条件と１時間のＯＧＤ後とにおいて、酸により活性化される電流が生じないことを示す１対の代表的なトレース図である（ｎ＝１２及び１３）。
【００５２】
アシドーシスは脳虚血の中心的な特徴の場合があるので、我々は、ＡＳＩＣｓが虚血状態で活性化される場合があるかどうか、及び、虚血がこれらのチャネルの特性を変化させる場合があるかどうかを決定した。図５を参照せよ。我々は、一般的なｉｎ ｖｉｔｒｏの虚血モデルである、酸素グルコース除去処置（ＯＧＤ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｈｏｉ，１９９３）を１時間実施した後で、ニューロンにおけるＡＳＩＣ電流を記録した。１組の培養がグルコースを含まない細胞外溶液（ＥＣＦ）で３回洗浄されてＯＧＤ処置を施される一方で、対照の培養はグルコースを含むＥＣＦで洗浄され従来の細胞培養器でインキュベーションされた。ＯＧＤは、１時間後に、グルコースを含まないＥＣＦをＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地に置換すること、及び、その培養を従来の培養器でインキュベーションすることにより終了した。その後ＡＳＩＣ電流がＯＧＤの後でニューロンの形態学的変化が無いときに１時間記録された。ＯＧＤ処置はＡＳＩＣ電流の振幅の中程度の増大を誘発した（対照群では１５２０±１３８ｐＡ、Ｎ＝４４であり、１時間のＯＧＤ後のニューロン群では１８８６±１８５ｐＡ、Ｎ＝４０であった。ｐ＜０．０５、図５Ａ及び５Ｂ）。さらに重要なことにＯＧＤは、電流減少の時定数の増大により示されたように、ＡＳＩＣの脱感作の劇的な減少を誘発した（対照ニューロンでは８１４．７±５８．９ｍｓ、Ｎ＝６であり、ＯＧＤ後のニューロンでは１９２８．９±３１５．７ｍｓ、Ｎ＝６であった。ｐ＜０．０１、図Ａ及び図Ｃ）。ＡＳＩＣ１−／−マウス由来の培養皮質ニューロンでは、７．４から６．０へのｐＨの低下は、海馬ニューロンにおける過去の研究（Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）と同様に、いかなる内向き電流も活性化しなかった（ｎ＝５２）。これらのニューロンにおいては１時間のＯＧＤは、酸で誘発される応答を活性化又は増強しなかった（図５Ｄ、ｎ＝１２及び１３）。
【００５３】
３．アシドーシスはＡＳＩＣ１ａを介してグルタミン酸非依存性のＣａ２＋流入を誘発する
図６及び７は、皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣｓがＣａ２＋透過性の場合があること、及び、Ｃａ２＋透過性がＡＳＩＣ１ａ依存性の場合があることを示唆する代表的なデータを示す。図６Ａは、唯一の電荷担体として１０ｍＭ Ｃａ２＋を含む、Ｎａ＋を含まないＥＣＦを用いて得られた代表的なトレース図を示す。ｐＨ６．０で内向き電流が記録された。液間電位補正後の平均的な逆転電位は〜−１７ｍＶである（ｎ＝５）。図６ＢはＣａ２＋に仲介される電流の、アミロリド及びＰｃＴＸ毒による遮断を示す代表的なトレース図と要約データとを示す。Ｃａ２＋に仲介される電流のピーク振幅は、１００μＭのアミロリドにより比較対照値の２６％±２％まで（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）減少し、１００ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸ毒により２２％±０．９％まで（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）減少した。図７Ａは、代表的な３４０／３８０ｎｍ比をｐＨの関数として示し、ｐＨの６．０への低下による［Ｃａ２＋］ｉの増加を示している。ニューロンは、電位依存性Ｃａ２＋チャネルのブロッカー（５μＭ ニモジピン及び１μＭ ω−コノトキシンＭＶＩＩＣ）と、グルタミン酸受容体のブロッカー（１０μＭ ＭＫ８０１及び２０μＭ ＣＮＱＸ）とともに、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２を含む通常のＥＣＦに浸漬された。図７Ａの挿入図は、酸で誘発される［Ｃａ２＋］ｉの増加の、１００μＭのアミロリドによる代表的な阻害を示す。図７Ｂは、酸で誘発される［Ｃａ２＋］ｉの増加の、アミロリド及びＰｃＴＸ毒による阻害を示す代表的な要約データを示す。Ｎ＝６−８で、ｐＨ６．０群と比較して＊＊ｐ＜０．０１であった。図７Ｃは代表的な３４０／３８０ｎｍ比を、ｐＨ及びＮＭＤＡの有／無との関連で示し、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンでは酸誘発性の［Ｃａ２＋］ｉの増加が生じないことを示す。ニューロンはＮＭＤＡには通常の応答を示した（ｎ＝８）。図７Ｄは、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンではｐＨ６．０でも、酸により活性化される電流が生じないことを示す代表的なトレース図を示す。
【００５４】
標準的なイオン置換プロトコール（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）と、Ｆｕｒａ−２蛍光Ｃａ２＋イメージング法（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）とを用いて、我々は、皮質ニューロンのＡＳＩＣｓがＣａ２＋透過性であるのかどうかを決定した。図６及び７を参照せよ。唯一の電荷担体として１０ｍＭ Ｃａ２＋を含む（Ｎａ＋及びＫ＋は含まない）溶液へ浸漬し、−６０ｍＶの保持電位で、我々は１８本のニューロンのうち１５本において５０ｐＡより大きい内向き電流を記録し、皮質ニューロンの大部分におけるＡＳＩＣｓの顕著なＣａ２＋透過性を示した（図６Ａ）。ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａチャネルの活性化に矛盾せず、１０ｍＭ Ｃａ２＋により導通される電流は、非特異的ＡＳＩＣブロッカーであるアミロリドと、ＡＳＩＣ１ａ特異的ブロッカーであるＰｃＴＸ毒との両方によって強く遮断された（図６Ｂ）。Ｃａ２＋に仲介される電流のピーク振幅は、１００μＭのアミロリドにより比較対照の２６％±２％まで（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）減少し、１００ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸ毒により２２％±０．９％まで（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）減少した。他の主要なＣａ２＋流入経路のブロッカー（グルタミン酸受容体に対するＭＫ８０１ １０μＭ及びＣＮＱＸ ２０μＭ、電位依存性Ｃａ２＋チャネルに対するニモジピン ５μＭ及びω−コノトキシンＭＶＩＩＣ １μＭ）の存在下におけるＣａ２＋イメージング法は、２０本のニューロンのうち１８本が、ｐＨの低下に対して細胞外Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の検出可能な増加で応答することを示した（図７Ａ）。一般的に、低ｐＨ溶液の長期的潅流の際、［Ｃａ２＋］ｉは上昇したままである。いくつかの細胞では、［Ｃａ２＋］ｉの増大は、酸潅流の期間よりもさらに長く持続した（図７Ａ）。長く持続するＣａ２＋応答は、無傷のニューロンにおけるＡＳＩＣ応答が全細胞記録におけるＡＳＩＣ応答よりも脱感作されにくい場合があることか、ＡＳＩＣｓを通じたＣａ２＋流入がその後に細胞内貯蔵からのＣａ２＋の放出を誘発する場合があることかを示唆する。１μＭタプシガルギンでのニューロンの前培養はＣａ２＋の増大の持続的部分を部分的に阻害し、細胞内貯蔵からのＣａ２＋の放出が酸誘発性の細胞内Ｃａ２＋蓄積に寄与している場合もあることを示唆した（ｎ＝６、データは示していない）。Ｃａ２＋イオンにより導通される電流（図６Ｂ）と同様に、［Ｃａ２＋］ｉのピークと維持的な増大の両方がアミロリド及びＰｃＴＸ毒により強く阻害され（図７Ａ及び７Ｂ、ｎ＝６−８）、酸で誘発される［Ｃａ２＋］ｉの増大におけるホモ多量体ＡＳＩＣ１ａの関与と矛盾しない。ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトは、全てのニューロンにおいて、ＮＭＤＡ受容体に仲介されるＣａ２＋応答に影響を与えることなく、酸で誘発される［Ｃａ２＋］ｉの増大を除去した（図７Ｃ、ｎ＝８）。パッチクランプ法は、５２本中５２本のＡＳＩＣ１−／−ニューロンでｐＨ６．０では酸により活性化される電流が生じないことを証明したが、これはＡＳＩＣ１ａサブユニットが存在しないことと矛盾しない。しかし５．０又は４．０へのｐＨ低下は５２本中２４本のＡＳＩＣ１−／−ニューロンで検出可能な電流を活性化し、これらのニューロンにおけるＡＳＩＣ２ａサブユニットの存在を証明した（図７Ｄ）。さらなる電気生理学的研究は、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンが、さまざまな電位依存性チャネルと、ＮＭＤＡ、ＧＡＢＡ受容体依存性チャネルとに対して通常の応答をすることを証明した（データは示していない）。
【００５５】
４．ＡＳＩＣ遮断はアシドーシスで誘発されるグルタミン酸非依存性ニューロン損傷から保護する
図８は、酸とのインキュベーションがＡＳＩＣ遮断により保護されるグルタミン酸受容体非依存性ニューロン損傷を誘発する場合があることを示唆する代表的なデータを示す。図８Ａ及び８Ｂは、ｐＨ７．４（黒い棒グラフ）又は６．０（白い棒グラフ）のＥＣＦ中での、１時間（図８Ａ）又は２４時間（図８Ｂ）の、皮質ニューロンのインキュベーションにより誘発される経時的なＬＤＨ放出に対する代表的なデータを表すグラフを示す。Ｎ＝２０−２５ウェル、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１、同一の時点でｐＨ７．４の群と比較した。（生きたニューロンの細胞体のフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）染色と、死細胞の核のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色とにより、酸で誘発されるニューロン損傷も分析された。）図８Ｃは酸で誘発されるＬＤＨ放出の、１００μＭ アミロリド又は１００ｎｇ／ｍＬ ＰｃＴＸ毒による阻害を示すグラフを示す（ｎ＝２０−２７、＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１）。ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ及びニモジピンは、全ての実験についてＥＣＦ中に添加された（図８Ａ−Ｃ）。
【００５６】
酸で誘発される損傷は、ｐＨ７．４か６．０かのどちらかの、ＭＫ８０１とＣＮＱＸとニモジピンとを含むＥＣＦ中でインキュベートされた２４ウェルのプレート上で増殖したニューロンで研究された。図８を参照せよ。細胞の損傷は、さまざまな時点での乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出の測定（図８Ａ及び８Ｂ、Ｋｏｈ ａｎｄ Ｃｈｏｉ，１９８７）と、生／死細胞の蛍光染色とによりアッセイされた。ｐＨ７．４で処理されたニューロンと比較して、１時間の酸インキュベーション（ｐＨ６．０）はＬＤＨ放出の経時的な増加を誘発した（図８Ａ）。２４時間後、最大のＬＤＨ放出の４５．７％±５．４％が誘発された（ｎ＝２５ウェル）。ｐＨ６．０での連続処理は、より激しい細胞損傷を誘発した（図８Ｂ、ｎ＝２０）。ＬＤＨアッセイに矛盾せず、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ、青）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ、赤）とでの生／死染色は、１時間の酸処理による細胞死の同様の増大を示した（引用によって本明細書に取り込まれる（上記引用のウェブサイトの）追補図Ｓ３を参照せよ。）。ｐＨ６．５のＥＣＦとの１時間のインキュベーションも、顕著だがｐＨ６．０のＥＣＦとのインキュベーションよりは少ないＬＤＨ放出を誘発した（ｎ＝８ウェル）。
【００５７】
ＡＳＩＣｓの活性化が、酸で誘発されるグルタミン酸受容体非依存性ニューロン損傷に関わっているかどうかを決定するために、我々は酸で誘発されるＬＤＨ放出に対するアミロリド及びＰｘＴＸ毒の影響をテストした。１時間の酸インキュベーションの１０分前と、インキュベーション期間中との１００μＭ アミロリドか１００ｎｇ／ｍＬ ＰｃＴＸ毒かいずれかの添加が、ＬＤＨ放出を有意に低減させた（図８Ｃ）。２４時間では、ＬＤＨ放出は４５．３％±３．８％からアミロリドにより３１．１％±２．５％へ、ＰｃＴＸ毒により２７．９％±２．６％へ減少した（ｎ＝２０−２７、ｐ＜０．０１）。アミロリドだけを添加した（例えば５時間の）長期間のインキュベーションは、ＬＤＨ放出を増大させた（ｎ＝８）が、ｐＨ７．４ＥＣＦ中での１時間のアミロリド又はＰｃＴＸ毒の添加は、ＬＤＨ放出のベースラインに影響を与えなかった。
【００５８】
５．ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａの活性化は、アシドーシスで誘発される損傷の原因となる場合がある
図９は、ＡＳＩＣ１ａがｉｎ ｖｉｔｒｏでの酸で誘発される損傷に関与する場合があることを示す代表的なデータを提示する一連のグラフである。図９Ａは、［Ｃａ２＋］ｅの減少によって酸で誘発されるＬＤＨ放出が阻害されることを示す代表的なデータを示す（ｎ＝１１−１２、ｐＨ６．０、１．３Ｃａ２＋と比較して＊＊ｐ＜０．０１）。図９Ｂは酸インキュベーションが、ＡＳＩＣ１ａをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞ではＬＤＨ放出の増大を誘発したが、トランスフェクションしないＣＯＳ−７細胞では誘発しなかったことを示す代表的なデータを示す（ｎ＝８−２０）。アミロリド（１００μＭ）は、ＡＳＩＣ１ａをトランスフェクションした細胞では、酸で誘発されるＬＤＨ放出を阻害した。７．４対６．０と、６．０対６．０＋アミロリドとについて、＊ｐ＜０．０５であった。図９Ｃは、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンでは、酸で誘発される損傷が生じないこと、及び、アミロリド及びＰｃＴＸ毒による保護が生じないことを示す代表的なデータを示す（各々のグループでｎ＝８、ｐ＞０．０５）。図９Ｄは、ＯＧＤ処置を施した培養皮質ニューロンにおける酸で誘発されるＬＤＨ放出の増大を示す代表的なデータを示す（ｎ＝５）。１時間のＯＧＤ／アシドーシスの併用により誘発されたＬＤＨ放出は、トロロクス及びＬ−ＮＡＭＥによって阻害されなかった（ｎ＝８−１１）。ＡＳＩＣ１−／−ニューロンでは、ＯＧＤは酸に誘導されるＬＤＨ放出を増強しなかった。ｐＨ７．４対ｐＨ６．０については＊＊ｐ＜０．０１であり、ｐＨ６．０対６．０＋ＰｃＴＸ毒については＊ｐ＜０．０５であった。ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ及びニモジピンは、全ての実験についてＥＣＦ中に添加された（図９Ａ−Ｄ）。
【００５９】
Ｃａ２＋流入が酸で誘発される損傷に対して役割を果たすかどうかを決定するために、我々はニューロンを通常の又は減少した［Ｃａ２＋］ｅの存在下において、ｐＨ６．０のＥＣＦで処理した。図９を参照せよ。１．３ｍＭから０．２ｍＭへのＣａ２＋の減少は、ＰｃＴＸ毒でのＡＳＩＣ１ａ遮断と同様に、酸で誘発されるＬＤＨ放出を阻害した（４０．０％±４．１％から２１．９％±２．５％へ。ｎ＝１１−１２、ｐ＜０．０１、図９Ａ）。完全な［Ｃａ２＋］ｅの除去は、Ｃａ２＋感受性陽イオンチャネルを通じて大きな内向き電流を活性化する場合があり、むしろデータ解釈を複雑化するかもしれない（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）ので、Ｃａ２＋を含まない溶液はテストされなかった。非特異的及び特異的ＡＳＩＣ１ａブロッカーであるアミロリド及びＰｃＴＸとの両方と、［Ｃａ２＋］ｅの低減とによる酸損傷の阻害は、Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａの活性化が酸で誘発されるニューロン損傷に関与する場合があることを示唆する。
【００６０】
ＡＳＩＣ１ａの活性化が酸損傷に関与するというさらなる証拠を提供するために、我々は、トランスフェクションを施していないＣＯＳ−７細胞と、ＡＳＩＣ１ａをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞との酸損傷を研究したが、ＣＯＳ−７細胞は、内在性のチャネルが欠損しているためにＡＳＩＣｓの発現に慣用される培養細胞株である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｉｍｍｋｅ ａｎｄ ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ ２００１及びＥｓｃｏｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．２０００）。（プレーティングの３６−４８時間後の）コンフルエンスの後で、細胞は、ｐＨ７．４かｐＨ６．０かどちらかのＥＣＦで１時間処理された。ＬＤＨ放出は酸インキュベーションの２４時間後に測定された。トランスフェクションを施していないＣＯＳ−７細胞のｐＨ６．０ ＥＣＦでの処理は、ｐＨ７．４で処理した細胞と比較すると、ＬＤＨ放出の増大を誘発しなかった（ｐＨ７．４では１０．３％±０．８％であり（Ｎ＝１９ウェル）、ｐＨ６．０では９．４％±０．７％であった（Ｎ＝２０ウェル）。ｐ＞０．０５。図９Ｂ）。しかし、ＡＳＩＣ１ａを安定的にトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞では、ｐＨ６．０での１時間のインキュベーションはＬＤＨ放出を１５．５％±２．４％から２４．０％±２．９％まで有意に増加させた（ｎ＝８ウェル、ｐ＜０．０５）。これらの細胞におけるアミロリド（１００μＭ）の添加は、酸で誘発されるＬＤＨ放出を阻害した（図９Ｂ）。
【００６１】
我々は、ＧＦＰのみか、ＧＦＰ及びＡＳＩＣ１ａかをエンコードするｃＤＮＡで一時的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の酸損傷も研究した。トランスフェクションの（２４−３６時間）後、細胞は（ｐＨ６．０の）酸性溶液で１時間インキュベーションされ、該酸インキュベーションの２４時間後に細胞損傷がアッセイされた。引用によって本明細書に取り込まれる（上記引用のウェブサイトの）追補図Ｓ４に示されるように、１時間の酸インキュベーションは、ＧＦＰ／ＡＳＩＣ１ａ群において生残するＧＦＰ陽性細胞を大きく減少させたが、ＧＦＰのみをトランスフェクションした群においては減少させなかった（各々の群につきｎ＝ディッシュ３枚であった）。
【００６２】
酸で誘発されるニューロン損傷におけるＡＳＩＣ１ａの関与をさらに証明するために、我々は、ＡＳＩＣ＋／＋マウス及びＡＳＩＣ１−／−マウス由来の培養皮質ニューロン（Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）について細胞毒性実験を実施した。この場合でもまた、ＡＳＩＣ＋／＋ニューロンをｐＨ６．０で１時間酸インキュベーションすると、アミロリド及びＰｃＴＸ毒により低減される実質的なＬＤＨ放出を誘発した（ｎ＝８−１２）。しかしＡＳＩＣ１−／−ニューロンを１時間酸処理しても、２４時間でのＬＤＨ放出の有意な増加を誘発せず（ｐＨ７．４では１３．８％±０．９％であり、ｐＨ６．０では１４．２％±１．３％であった。Ｎ＝８、ｐ＞０．０５）、これらのニューロンの酸損傷への耐性を示した（図９Ｃ）。加えて、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトは、酸で誘発されるＬＤＨ放出に対するアミロリド及びＰｃＴＸ毒の影響も除去し（図９Ｃ、各々でｎ＝８）、酸で誘発される皮質ニューロンの損傷のアミロリド及びＰｃＴＸ毒による阻害（図８Ｃ）はＡＳＩＣ１サブユニットの遮断によることをさらに示唆した。酸インキュベーションとは対照的に、（Ｍｇ２＋を含まないｐＨ７．４のＥＣＦ中における）１ｍＭ ＮＭＤＡ＋１０μＭグリシンでＡＳＩＣ１−／−ニューロンを１時間処理すると、２４時間で最大のＬＤＨ放出の８４．８％±１．４％を誘発し（ｎ＝４、図９Ｃ）、他の細胞損傷過程には正常な応答を示した。
【００６３】
６．モデル虚血は、アシドーシスで誘発されるグルタミン酸非依存性のニューロン損傷をＡＳＩＣｓ経由で増強する
ＡＳＩＣ電流の大きさは、脳虚血の細胞及び神経化学的な要素――細胞の膨張、アラキドン酸及び乳酸――により増強される場合があり（Ａｌｌｅｎ ａｎｄ Ａｔｔｗｅｌｌ ２００２及びＩｍｍｋｅ ａｎｄ ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ ２００１）、さらに重要なことに、ＡＳＩＣ電流の脱感作がモデル虚血により劇的に低減される場合がある（図５Ａ及び５Ｃを参照せよ。）ので、我々は、虚血状態におけるＡＳＩＣｓの活性化がより重度のニューロン損傷を生み出すはずであると予想した。この仮説をテストするために、我々はニューロンに酸素グルコース除去処置（ＯＧＤ）下での１時間の酸処理を施した。ＭＫ８０１、ＣＮＱＸ及びニモジピンは、電位依存性Ｃａ２＋チャネルと、グルタミン酸受容体とに仲介される、ＯＧＤと関連する細胞損傷を抑制するために全ての溶液に添加された（Ｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＯＧＤ条件下でｐＨ７．４のＥＣＦとの１時間のインキュベーションは、２４時間で最大のＬＤＨ放出の２７．１％±３．５％しか誘発しなかった（ｎ＝５、図９Ｄ）。この発見は、グルタミン酸受容体と電位依存性Ｃａ２＋チャネルとを遮断すると、１時間のＯＧＤが有意な細胞損傷を誘発しないとする報告（Ａａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）と一致する。しかし、（ｐＨ６．０の）アシドーシスと組合せた１時間のＯＧＤは、ＯＧＤを実施しない場合の酸で誘発されるＬＤＨ放出よりも有意に大きい（図８Ａを参照せよ。ｐ＜０．０５）、最大のＬＤＨ放出の７３．９％±４．３％を誘発した（ｎ＝５、図９Ｄ、ｐ＜０．０１）。ＡＳＩＣ１ａブロッカーであるＰｃＴＸ毒（１００ｎｇ／ｍＬ）の添加は、酸／ＯＧＤ誘発性のＬＤＨ放出を、４４．３％±５．３％まで有意に低減した（ｎ＝５、ｐ＜０．０５、図９Ｄ）。
【００６４】
我々は、ＡＳＩＣ１−／−マウス由来の培養ニューロンでも同じ実験を実施した。しかしＡＳＩＣ１を含むニューロンとは異なり、ＯＧＤと酸の組合せでの１時間の処理は、ＡＳＩＣ１−／−ニューロンにおけるＬＤＨ放出をわずかに増加させたのみであった（２６．１％±２．７％から３０．４％±３．５％へ。Ｎ＝１０−１２、図９Ｄ）。この発見は、酸で誘発される損傷のＯＧＤによる増強が、主にＡＳＩＣ１に仲介される毒性をＯＧＤが増強するためであるかもしれないことを示唆する。
【００６５】
Ａａｒｔｓら（２００３）は、長期間のＯＧＤ（２時間）により形成される（ｍｏｌｄｅｄ）がアシドーシスを起さない虚血を近年研究した。このモデル系において彼らは、反応性の酸素／窒素分子種により活性化され、グルタミン酸受容体非依存性のニューロン損傷をもたらす、Ｃａ２＋透過性の非選択的陽イオン導通の活性化を証明した。Ａａｒｔｓらによりモデル化された長期間のＯＧＤで誘発される細胞損傷は、（例えばトロロクスのように）フリーラジカルを直接的に捕捉する薬剤か、又は、（例えばＬ−ＮＡＭＥのように）フリーラジカルの産生を抑制する薬剤かのいずれかにより劇的に減少する場合がある（Ａａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ニューロン損傷で誘発される短期間のＯＧＤとアシドーシスの組合せが同様のメカニズムに関与するかどうかを決定するために、我々はトロロクス及びＬ−ＮＡＭＥのＯＧＤ／酸誘発性のＬＤＨ放出に対する影響をテストした。図９Ｄに示されたように、トロロクス（５００μＭ）もＬ−ＮＡＭＥ（３００μＭ）も、１時間のＯＧＤ／アシドーシスの組合せで誘発されるニューロン損傷に対して有意な効果がなかった（ｎ＝８−１１）。追加の実験は、長期間のＯＧＤで誘発されるニューロン損傷の原因となることがＡａｒｔｓら（２００３）により報告されているＴＲＰＭ７チャネルのイオン導通に対して、ＡＳＩＣブロッカーであるアミロリド及びＰｃＴＸ毒の効果がないことを証明した（引用によって本明細書に取り込まれる追補図Ｓ５（上記引用のウェブサイトを参照せよ。））。一緒にするとこれらの発見は、ＴＲＰＭ７チャネルでなくＡＳＩＣｓの活性化が、我々の研究における１時間のＯＧＤ／アシドーシスの組合せで誘発されるニューロン損傷の主要な原因となる場合があることを強く示唆する。
【００６６】
７．ｉｎ ｖｉｖｏでの虚血脳損傷におけるＡＳＩＣ１ａの活性化
図１０は、ｉｎ ｖｉｖｏでの脳虚血におけるＡＳＩＣ１の遮断と、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトとによる神経保護を示すデータを示す。図１０Ａは、ａＣＳＦを注射したラット（ｎ＝７）か、アミロリドを注射したラット（ｎ＝１１）か、ＰｃＴＸ毒を注射したラット（ｎ＝５）かに由来する脳における、染色された体積（梗塞体積）を示す、ＴＴＣ染色脳切片から得られる代表的なデータのグラフを示す。ａＣＳＦを注射した群と比較して、＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１である。図１０Ｂは、ＡＳＩＣ１−／−マウス由来の脳梗塞体積の減少を示す代表的なデータ（各群につきｎ＝６）のグラフを示す。ＡＳＩＣ１＋／＋群と比較して、＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１である。図１０Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇメマンチン（Ｍｅｍ）を腹腔内注射したマウスか、ＰｃＴＸ毒（５００ｎｇ／ｍＬ）の脳室内注射とともににメマンチンの腹腔内注射を施したマウスかに由来する脳梗塞体積の減少を示す代表的なデータのグラフを示す。ａＣＳＦを注射した群と比較して＊＊ｐ＜０．０１であり、メマンチンを注射した群とメマンチン＋ＰｃＴＸ毒を注射した群を比較して＊＊ｐ＜０．０１である（各群につきｎ＝５である）。図１０Ｄは、メマンチンを腹腔内注射したＡＳＩＣ１＋／＋マウス（ｗｔ）か、ＡＳＩＣ１−／−マウスかのいずれかに由来する脳梗塞体積の減少を示す代表的なデータ（各群につきｎ＝５）のグラフを示す。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１である。
【００６７】
ＡＳＩＣ１ａの活性化が虚血脳損傷に関与する場合があることの証拠を提供するために、我々は最初に、一過性の局所的虚血のラットモデル（Ｌｏｎｇａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）におけるアミロリド及びＰｃＴＸ毒の保護効果をテストした。虚血（１００分）は一過性の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により誘発された。計６μＬの人工的ＣＳＦ（ａＣＳＦ）のみか、ａＣＳＦを含むアミロリド（１ｍＭ）か、ａＣＳＦを含むＰｃＴＸ毒（５００ｎｇ／ｍＬ）かが、虚血の３０分前と３０分後とに脳室内に注射された。Ｗｅｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９６９）による研究に基づき、４週齢のラットに対する脳髄液及び脊髄液の体積は、〜６０μＬと算出された。注射されたアミロリドとＰｃＴＸとがＣＳＦ中に均一に分布したと仮定すると、我々は、我々の細胞培養実験において効果的であることが判明した濃度である、〜１００μＭのアミロリド、及び、〜５０ｎｇ／ｍＬのＰｃＴＸという濃度を予想してもかまわない。梗塞体積は虚血の２４時間後にＴＴＣ染色（Ｂｅｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）により決定された。虚血（１００分）は、ａＣＳＦを注射したラットにおいては３２９．５±２５．６ｍｍ３（ｎ＝７）の梗塞体積を生じたが、アミロリドを注射したラットでは２２９．７±４１．１ｍｍ３（ｎ＝１１、ｐ＜０．０５）だけ、ＰｃＴＸ毒を注射したラットでは１３０．４±５５．０ｍｍ３（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）（〜６０％の減少）だけしか生じなかった（図１０Ａ）。
【００６８】
我々は次に、ｉｎ ｖｉｖｏでの虚血脳損傷におけるＡＳＩＣ１ａの関与をさらに証明するためにＡＳＩＣ１−／−マウスを使用した。オスのＡＳＩＣ１＋／＋マウスと、ＡＳＩＣ１＋／−マウスと、ＡＳＩＣ１−／−マウス（〜２５ｇ、コンジェニックＣ５７ＢＬ６バックグラウンド）とが、上述した６０分のＭＣＡＯ（Ｓｔｅｎｚｅｌ−Ｐｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）を施された。ＡＳＩＣ１ａの薬理的な遮断による保護（上述）に矛盾せず、ＡＳＩＣ１−／−マウスは、ＡＳＩＣ１＋／＋マウス（８４．６±１０．６ｍｍ３、Ｎ＝６、ｐ＜０．０１）と比較して有意に小さい（〜６１％の減少）梗塞体積（３２．９±４．７ｍｍ３、Ｎ＝６）を示した。ＡＳＩＣ１＋／−マウスも梗塞体積の減少を示した（５６．９±６．７ｍｍ３、Ｎ＝６、ｐ＜０．０５）（図１０Ｂ）。
【００６９】
我々は次に、ＡＳＩＣ１ａチャネルの遮断か、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトかが、ｉｎ ｖｉｖｏでのグルタミン酸受容体遮断の場面でさらなる保護を提供できるかどうかを決定した。我々は、近年成功した臨床試験で使用された（Ｔａｒｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）、不競合型ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるメマンチンを選択した。６０分のＭＣＡＯの直後にメマンチン（１０ｍｇ／ｋｇ）がＣ５７ＢＬ６マウスに腹腔内注射され、虚血の１５分前と１５分後とに、総量０．４μＬの、ａＣＳＦのみか、ＰｃＴＸ毒（５００ｎｇ／ｍＬ）を含むａＣＳＦかの脳室内注射も行われた。生理食塩水の腹腔内注射とａＣＳＦの脳室内注射とを受けた対照マウスでは、６０分のＭＣＡＯが１２３．６±５．３ｍｍ３の梗塞体積を誘発した（ｎ＝５、図１０Ｃ）。メマンチンの腹腔内注射とａＣＳＦの脳室内注射とを受けたマウスでは、同じ期間の虚血が７３．８±６．９ｍｍ３の梗塞体積を誘発した（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。しかし、メマンチンとＰｃＴＸ毒とを注射されたマウスでは、４７．０±１．１ｍｍ３の梗塞体積だけしか誘発されなかった（ｎ＝５、対照群とメマンチン群との両方と比較してｐ＜０．０１、図１０Ｃ）。これらのデータは、ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａの遮断が、ＮＭＤＡ受容体遮断の場面で、ｉｎ ｖｉｖｏでの虚血においてさらなる保護を提供する場合があることを示唆する。さらなる保護は、薬理的なＮＭＤＡ遮断処理を施したＡＳＩＣ１−／−マウスにおいても観察された（図１０Ｄ）。生理食塩水か１０ｍｇ／ｋｇメマンチンかを腹腔内注射されたＡＳＩＣ１＋／＋マウスでは、６０分のＭＣＡＯは、それぞれ１０１．４±９．４ｍｍ３か６１．６±１２．７ｍｍ３かの梗塞体積を誘発した（各群でｎ＝５、図１０Ｄ）。しかしメマンチンを注射したＡＳＩＣ１−／−マウスでは、同じ虚血期間が、２７．７±１．６ｍｍ３の梗塞体積を誘発し（ｎ＝５）、メマンチンを注射したＡＳＩＣ１＋／＋マウスにおける梗塞体積よりも有意に小さかった（ｐ＜０．０５）。
【００７０】
Ｄ．考察
虚血に対する脳の細胞及び分子の応答を特定する大進歩にも関わらず、脳卒中患者に対する効果的な治療方法はない。最も注目すべきなのは、グルタミン酸アンタゴニストの多施設臨床試験の失敗である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９９及びＷａｈｌｇｒｅｎ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ ２００４）。ここで我々は、虚血脳損傷の新しいメカニズムと、この生物学的メカニズムにおける虚血性アシドーシスの役割とを証明する。我々は、新規に記載されたリガンド依存性チャネルのクラスであるＣａ２＋透過性ＡＳＩＣｓ（Ｗａｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ａ及びＷａｌｄｍａｎｎ ａｎｄ Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ，１９９８）の活性化を介して、アシドーシスの場面で虚血性損傷が起こる場合があることを示す。このＣａ２＋の毒性はグルタミン酸受容体又は電位依存性Ｃａ２＋チャネルに依存しない場合がある。
【００７１】
混合皮質培養において全細胞パッチクランプ法を使用し、我々は、虚血において通常起こるｐＨｅ（細胞外ｐＨ）の範囲におけるＡＳＩＣ電流の活性化を証明する。Ｆｕｒａ−２蛍光イメージング法とイオン置換プロトコールとを用いて、我々は、ＡＳＩＣｓがＣａ２＋を皮質ニューロンに流入させる場合があること、及び、ＮＭＤＡと、ＡＭＰＡと、電位依存性Ｃａ２＋チャネルとの遮断があるときＣａ２＋を皮質ニューロンに流入させる場合があることを示す。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞毒性モデルを使用して、我々は、アシドーシスがグルタミン酸非依存性ニューロン損傷を誘発する場合があることを証明するが、該ニューロン損傷は、非特異性及び特異性ＡＳＩＣ１ａアンタゴニストの両方と、［Ｃａ２＋］ｅの減少とにより低減される場合がある。加えて我々は、Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａでＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションすることが酸感受性をもたらす場合があるのに対して、ＡＳＩＣ１ａを欠損しているニューロン及びＣＯＳ−７細胞は酸損傷に耐性の場合があることを示す。Ｉｎ ｖｉｖｏの局所的虚血モデルを使用して、我々は、ＡＳＩＣ１ａチャネルの薬理的な遮断とＡＳＩＣ１ａ遺伝子のノックアウトとが、ともに脳を虚血性損傷から保護する場合があること、及び、ＮＭＤＡ遮断の存在下でともに脳を虚血性損傷から保護する場合があることを証明する。
【００７２】
局所的な［Ｈ＋］は、脳における正常なシナプス伝達の際に機能するＡＳＩＣｓに対するアゴニストの場合がある（Ｗｅｍｍｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）。このシグナル伝達は傷害性でない場合がある。しかしＡＳＩＣｓは、虚血脳において起こる場合がある広範囲で顕著なｐＨ低下に応答する場合もある。広範囲な虚血の１分以内に、ｐＨｅは７．２から６．５まで低下する（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５）が、これはｐＨ０．５が６．２であるＡＳＩＣ１ａチャネルを活性化するのに十分な場合があるレベルである。注目すべきことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでモデル化された虚血自体が、一定のレベルのアシドーシスでＡＳＩＣ応答の大きさを著しく増強して、虚血ニューロンにおける有毒なＣａ２＋の取り込みを増強する場合がある。さらに、虚血はＡＳＩＣ電流の脱感作を劇的に低減するが、これは、ｉｎ ｖｉｖｏでの長期間の虚血性アシドーシスの際にＡＳＩＣｓ活性が長期持続する可能性があることを意味する。
【００７３】
脳ｐＨの６．５への短時間での広範囲の低下だけでは、脳損傷を生じず（Ｌｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、低酸素症だけでも脳損傷を生じない（Ｍｉｙａｍｏｔｏ ａｎｄ Ａｕｅｒ，２０００及びＰｅａｒｉｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）ことが、無傷な（ｉｎｔａｃｔ）動物において示された。しかし我々のｉｎ ｖｉｔｒｏのデータは、アシドーシス（虚血性アシドーシス）と虚血（低酸素症）との組合せが、ＡＳＩＣ１ａチャネルの毒性効果を増強する虚血を通じて、ｉｎ ｖｉｖｏの場合と同様に、顕著な脳損傷を引き起こす場合があることを示唆する。この考察は、ＡＳＩＣ１ａの遮断とＡＳＩＣ１ａ遺伝子のノックアウトとの両方が梗塞体積の実質的な（〜６０％）減少を生じるという知見によって強力に支持される。
【００７４】
アシドーシスは、ＡＳＩＣｓを介した虚血脳損傷に影響を与えるのとは別に、他のチャネルの機能にも同様に影響を与える場合がある。虚血と特に関連するかもしれないのは、ＮＭＤＡチャネルの酸遮断で（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９０及びＴｒａｙｎｅｌｉｓ ａｎｄ Ｃｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ １９９０）、該酸遮断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの虚血ニューロン損傷に対して保護する場合がある（Ｋａｋｕ ｅｔ ａｌ．１９９３及びＧｉｆｆａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９０）。虚血脳におけるアシドーシスによるこのＮＭＤＡ遮断は、ヒト脳卒中の臨床試験におけるＮＭＤＡアンタゴニストの失敗を部分的に説明するかもしれない。虚血性アシドーシスはＮＭＤＡ機能を遮断することにより付加的な治療方法としての役割を果たす場合があるので、ＡＳＩＣ１ａ遮断で脳卒中を治療することは特に効果的かもしれない。
【００７５】
ＡＳＩＣ１ａ遮断の保護効果を示す我々のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ＮＭＤＡと、ＡＭＰＡと、電位依存性Ｃａ２＋チャネルとのアンタゴニストの存在下で実施されたので、ここで報告する知見は、単独か、他の治療方法（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）との併用かのいずれかで、脳卒中に対する新しく強力な神経保護戦略を提供するかもしれない。さらに我々は、薬理的なＡＳＩＣ１ａ遮断かＡＳＩＣ１ａ遺伝子除去かが、脳卒中に対して、ＮＭＤＡ拮抗作用よりも強力な神経保護を提供する場合があることをｉｎ ｖｉｖｏで証明する。
【００７６】
以上をまとめると、我々の研究は、Ｃａ２＋透過性ＡＳＩＣ１ａの活性化が、虚血脳損傷の基礎となる、新規なグルタミン酸非依存性の生物学的メカニズムである可能性があることを示唆する。虚血脳においては他の保護的である可能性のあるＡＳＩＣサブユニットの調節も起きる（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）ため、これらの発見は、脳虚血に対する新規な神経保護治療戦略の策定の助けとなるだろう。
【００７７】
Ｅ．実験手順
１．ニューロン培養
ハロタン麻酔後、Ｅ１６ Ｓｗｉｓｓマウスか、Ｐ１ ＡＳＩＣ１＋／＋マウス及びＰ１ ＡＳＩＣ１−／−マウスかから大脳皮質が切り出され、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで３７°Ｃ、１０分間インキュベートされた。組織は次に先端熱加工されたガラスピペットでほぐされ、ポリ−Ｌ−オルニチンでコーティングされた２４ウェルのプレートか、２５×２５ｍｍのカバーガラスかに、１ウェル当たり細胞２．５×１０５個の密度か１カバーガラス当たり細胞１０６個かの密度で蒔かれた。ニューロンは、１０％ウマ血清を添加したＭＥＭ（Ｅ１６培養用）か、Ｂ２７を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地（Ｐ１培養用）かで培養され、１２日後に電気生理学的研究及び毒性研究に用いられた。グリア増殖は、５−フルオロ−２−デオキシウリジン及びウリジンの添加により抑制され、ＮｅｕＮ染色法及びＧＦＡＰ染色法により決定されたところでは（データは示していない）、ニューロンが〜９０％の培養細胞が得られた。
【００７８】
２．電気生理学
ＡＳＩＣ電流は全細胞パッチクランプ法及び高速潅流法で記録された。通常の細胞外溶液（ＥＣＦ）は、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭグルコース、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０００５ｍＭ ＴＴＸ（ｐＨ７．４）を含み、３２０−３３５ｍＯｓｍであった。低ｐＨ溶液については、さまざまな量のＨＣｌが添加された。ｐＨ＜６．０の溶液については、ＨＥＰＥＳの代わりにＭＥＳがより信頼性のあるｐＨ緩衝作用のために使用された。パッチ電極は、１４０ｍＭ ＣｓＦ、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１１ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ（ｐＨ７．３）を含み、３００ｍＯｓｍであった。Ｎａ＋を含まない溶液は、浸透圧を等しくする濃度のＮＭＤＧ又はスクロースでＮａＣｌを置換して、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳからなった（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）。多槽式の（ｍｕｌｔｉｂａｒｒｅｌ）潅流システム（ＳＦ−７７Ｂ、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）が、迅速な溶液交換のために用いられた。
【００７９】
３．細胞損傷アッセイ――ＬＤＨ測定
細胞はＥＣＦで３回洗浄され、複数の処理群に無作為に分割された。ＭＫ８０１（１０μＭ）と、ＣＮＱＸ（２０μＭ）と、ニモジピン（５μＭ）とが、グルタミン酸受容体及び電位依存性Ｃａ２＋チャネルの二次的な活性化の可能性を排除するために、全ての群に添加された。酸インキュベーション後、ニューロンは洗浄され、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地中、３７°Ｃでインキュベーションされた。培地へのＬＤＨ放出は、ＬＤＨアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して測定された。培地（１００μＬ）が培養ウェルから９６ウェルプレートへ移し替えられ、キットにより提供される１００μＬの反応溶液と混合された。３０分後に、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４９２ｎｍで光学濃度が測定された。６２０ｎｍでのバックグラウンドの吸光度は差し引かれた。各々のウェルにおける最大の放出可能なＬＤＨは、各々の実験の最後で１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分インキュベーションすることにより得られた。
【００８０】
４．Ｃａ２＋イメージング法
２５×２５ｍｍカバーガラス上で成長した皮質ニューロンは、ＥＣＦで３回洗浄され、５μＭ ｆｕｒａ−２−アセトキシメチル・エステルで２２°Ｃ、４０分インキュベーションされ、３回洗浄され、通常のＥＣＦ中で３０分インキュベーションされた。カバーガラスは倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ３００）上の潅流チャンバーに移された。細胞はキセノンランプを使用して照射され、４０×ＵＶ蛍光油浸対物レンズで観察され、ビデオ画像は冷却ＣＣＤカメラ（Ｓｅｎｓｙｓ ＫＡＦ １４０１、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用して得られた。デジタル画像は、Ａｘｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により制御されるＰＣにより得られ解析された。シャッター及びフィルターホイール（Ｌａｍｂｄａ １０−２）は、３４０又は３８０ｎｍの励起波長で細胞の定期的な照明を可能にするソフトウェアにより制御された。Ｆｕｒａ−２蛍光発光は５１０ｎｍの発光波長で検出された。３４０／３８０ｎｍ比の画像は、視野内の細胞の限局した領域におけるピクセル比の値を平均することにより解析された。該ピクセル比の値は、さらなる解析のためにＳｉｇｍａＰｌｏｔへエクスポートされた。
【００８１】
５．フルオレセイン二酢酸染色と、ヨウ化プロピジウムの取り込み
細胞は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）（５μＭ）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（２μＭ）とを含むＥＣＦ中で３０分インキュベーションされ、続いて色素を含まないＥＣＦで洗浄された。生きた（ＦＤＡ陽性の）細胞及び死んだ（ＰＩ陽性の）細胞は、落射蛍光を備えた顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）上で、ＰＩについては５８０／６３０ｎｍの励起波長／蛍光波長で、ＦＤＡについては５００／５５０ｎｍの励起波長／蛍光波長で、観察と計測とが行われた。画像は、ＢＱ ８０００ ｓＶＧＡフレームグラバーを備えたＯｐｔｒｏｎｉｃｓ ＤＥＩ−７３０カメラを使用して収集され、コンピュータソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ，ＴＮ）を使用して解析された。
【００８２】
６．ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
ＣＯＳ−７細胞は、１０％ＨＳ及び１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ）を含むＭＥＭ中で培養された。〜５０％コンフルエンスの時点で細胞は、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、ｐｃＤＮＡ３ベクター中のＡＳＩＣｓ及びＧＦＰのｃＤＮＡｓでコ・トランスフェクションされた。各３５ｍｍディッシュに対し、ＡＳＩＣｓについての０．７５μｇＤＮＡ及びＧＦＰについての０．２５μｇＤＮＡが使用された。トランスフェクションの４８時間後、パッチクランプ記録のためにＧＦＰ陽性細胞が選択された。ＡＳＩＣ１ａの安定的なトランスフェクションのために、トランスフェクションの１週間後に５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８が培地に添加された。生き残ったＧ４１８耐性細胞は、さらにプレーティングされ、Ｇ４１８の存在下で５代より長く継代された。細胞は次に、ＡＳＩＣ１ａの発現について、パッチクランプ法及び免疫蛍光染色で確認された。
【００８３】
７．酸素グルコース除去処置
ニューロンは３回洗浄され、３５°Ｃで８５％窒素、１０％水素及び５％二酸化炭素の雰囲気に設定した嫌気性チャンバー（Ｍｏｄｅｌ １０２５，Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、ｐＨ７．４又はｐＨ６．０のグルコースを含まないＥＣＦでインキュベーションされた。酸素グルコース除去処置（ＯＧＤ）は、１時間後に、グルコースを含まないＥＣＦをＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地で置換すること、及び、その培養を従来の培養器でインキュベーションすることにより終了した。ＨＥＰＥＳをバッファーとするＥＣＦの使用で、１時間のＯＧＤは、ｐＨを７．３８から７．２８へ（ｎ＝３）、及び、６．０から５．９６へ（ｎ＝４）、わずかに低下させた。
【００８４】
８．局所的虚血
一過性の局所的虚血は、挿管及び換気を行いながら１．５％イソフルラン、７０％Ｎ２Ｏ及び２８．５％Ｏ２を使用して麻酔されたオスのラット（ＳＤ、２５０−３００ｇ）及びマウス（コンジェニックＣ５７ＢＬ６バックグラウンド、〜２５ｇ）における中大脳動脈の縫合閉塞（ＭＣＡＯ）により誘発された。直腸及び側頭筋の温度は、サーモスタット制御の加温パッド及びランプで３７°Ｃ±０．５°Ｃに維持された。脳血流は経頭蓋レーザードップラー血流計によりモニターされた。血流が２０％未満に減少しない動物は除外された。
【００８５】
動物は虚血の２４時間後に抱水クロラールで殺された。脳は迅速に除去され、１ｍｍ（マウス）又は２ｍｍ（ラット）間隔で冠状断切片が作成され、生体染色色素である（２％）２、３、５−トリフェニルテトラゾリウム塩酸塩（ＴＴＣ）への浸漬により染色された。梗塞面積は、非虚血性の半球の面積から虚血性の半球においてＴＴＣで染色された正常な面積を差し引くことにより計算された。梗塞体積は、全ての切片の梗塞面積を加算することと、切片の厚さを乗算することとにより計算された。ラットの脳室内注射は、ブレグマの０．８ｍｍ後方、正中線の１．５ｍｍ側方及び硬膜の３．８ｍｍ腹側に定位的に挿入されたカニューレ付きのマイクロシリンジポンプを使用して、定位固定法により実施された。全ての操作及び解析は、処理群について盲検化された作業者により実施された。
【００８６】
Ｆ．参考文献
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【実施例２】
【００８７】
ＰｃＴＸ神経保護のタイム・ウィンドウ
本実施例は、齧歯類での脳卒中の開始後さまざまな時間におけるＰｃＴＸ毒の神経保護効果を測定する代表的な実験を説明する。図１１を参照せよ。脳虚血（脳卒中）は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって齧歯類で誘発された。誘発後の示された時間で、人工的脳脊髄液（ａＣＳＦ）か、ＰｃＴＸ毒（０．５μＬ、総タンパク質量として５００ｎｇ／ｍＬ）か、不活性化された（煮沸処理された）毒かが、各々の齧歯類の側脳室に注入された。ＰｃＴＸ毒の投与は、脳卒中の開始後１時間及び３時間の両方で、虚血体積（ｓｔｒｏｋｅ ｖｏｌｕｍｅ）において６０％の減少を提供した。さらに、実質的な虚血体積の減少が、ＭＣＡＯの開始後５時間で処置を中断した場合でも維持される場合がある。したがって、ＡＳＩＣ阻害による神経保護は、脳卒中開始後のタイム・ウィンドウを延長し、脳卒中患者が脳卒中開始数時間後に実施された治療の利益を享受することを可能とする場合がある。脳卒中神経保護に対するこのＡＳＩＣ遮断の効果は、グルタミン酸アンタゴニストを使用するＮＭＤＡ受容体（実験的な脳卒中治療にとっての主要な標的）のカルシウムチャネル遮断の神経保護効果よりもはるかに強力である。今のところ、ＡＳＩＣ１ａ選択的阻害についてここで示したような望ましい効果を有するグルタミン酸アンタゴニストはない。
【実施例３】
【００８８】
代表的なシスチン・ノット・ペプチド
本実施例は、完全長のＰｃＴｘ１と、ＰｃＴｘの欠失誘導体とを含む代表的なシスチン・ノット・ペプチドを説明するが、該ペプチドは、培養細胞でスクリーニングされ、虚血動物（例えば、マウス又はラットのような齧歯類）でテストされ、及び／又は、虚血のヒト患者に投与される場合がある。図１２及び１３を参照せよ。
【００８９】
図１２は、符号５０で示された、代表的なシスチン・ノット・ペプチドであるＰｃＴｘ１の、一文字コードによる一次アミノ酸配列（配列番号１）と、位置１−４０のアミノ酸に関するさまざまな代表的ペプチド特徴とを示す。ペプチド５０は、シスチン結合５２、５４、５６を形成しシスチン・ノット・モチーフ５８を作り出す６個のシステイン残基を含む場合がある。前記ペプチドは、１個又は２個以上のベータシート領域６０と、正に帯電した領域６２とを含む場合もある。Ｎ末領域６４とＣ末領域６６とはシスチン・ノット・モチーフを挟む場合がある。
【００９０】
図１３は、図１２のＰｃＴｘ１ペプチド５０のさまざまな代表的な欠失誘導体とともに整列されたＰｃＴｘ１ペプチド５０の比較を示す。これらの誘導体は、Ｎ末欠失誘導体７０（配列番号２）と、部分的なＣ末欠失誘導体７２（配列番号３）と、完全なＣ末欠失誘導体７４（配列番号４）と、Ｎ末／Ｃ末欠失誘導体７６（配列番号５）とを含む場合がある。他のＰｃＴｘ１の誘導体は、本来のＰｃＴｘ１配列に対して少なくとも約２５％又は約５０％の配列の類似性又は同一性を維持しながら、例えば、１個又は２個以上のアミノ酸の欠失か、挿入か、置換かのいずれかを含む場合がある。
【００９１】
各々のＰｃＴｘ１誘導体は、そのＡＳＩＣタンパク質を選択的に阻害する能力について、及び／又は、虚血に対する効果があるときにはその効果について、テストされる場合がある。いずれかの適切な試験系が、本明細書のどこかで説明した細胞を用いるアッセイ系及び／又は動物モデル系のいずれかを含むこのテストを実施するために使用される場合がある。前記ＰｃＴｘ１誘導体は、付加的に又は代替的に、虚血のヒト患者でテストされる場合がある。
【実施例４】
【００９２】
ＰｃＴＸ毒のＡＳＩＣ１ａに対する選択性
本実施例は、培養細胞で発現された他のＡＳＩＣタンパク質又はＡＳＩＣタンパク質の組合せの関係で、ＡＳＩＣ１ａだけに対する、ＰｃＴＸ毒（つまりＰｃＴｘ１毒）の選択性を測定する実験を説明する。図１４を参照せよ。図に表示されたＡＳＩＣタンパク質を発現しているＣＯＳ−７細胞は、（ＡＳＩＣ１ａを発現している細胞には２５ｎｇ／ｍＬの、ＡＳＩＣ２ａかＡＳＩＣ３かＡＳＩＣ１ａ＋２ａかを発現している細胞には５００ｎｇ／ｍＬの）ＰｃＴＸ毒で処理された。チャネル電流は、最大チャネル活性の半分の活性が得られるｐＨ（ｐＨ０．５）で測定された。５００ｎｇ／ｍＬのタンパク質濃度のＰｃＴＸ毒は、ホモ多量体ＡＳＩＣ２ａか、ホモ多量体ＡＳＩＣ３か、ヘテロ多量体ＡＳＩＣ１ａ／ＡＳＩＣ２ａかにより仲介される電流に対して影響を及ぼさなかったが、２５ｎｇ／ｍＬのタンパク質濃度でＡＳＩＣ１ａホモ多量体チャネルにより仲介される電流を大幅に遮断した（ｎ＝３−６、図１４）。５００ｎｇ／ｍＬでＰｃＴＸ毒は、（例えば、ＮＭＤＡ及びＧＡＢＡ受容体依存性チャネルのような）他のリガンド依存性チャネルと、（例えば、Ｎａ＋、Ｃａ２＋及びＫ＋チャネルのような）電位依存性チャネルとにより仲介される電流に対しても影響を及ぼさなかった（ｎ＝４−５）。これらの実験は、ＰｃＴＸ毒つまりＰｃＴｘ１ペプチドが、ホモ多量体ＡＳＩＣ１ａに対する特異的なブロッカーであることを示す。細胞を用いるアッセイ系を使用して、さまざまな合成ペプチド又は他の候補阻害剤（例えば、実施例３を参照せよ。）について、ＡＳＩＣ阻害の有効性と選択性が測定される場合がある。
【実施例５】
【００９３】
ＰｃＴＸ毒の経鼻投与は神経を保護する
本実施例は、脳卒中の動物モデル系で虚血に誘発される損傷を低減する、経鼻的に投与されたＰｃＴＸ毒の有効性を示す代表的なデータを説明する。図１５を参照せよ。脳虚血はオスのマウスで中大脳動脈閉塞により誘発された。閉塞が開始して１時間後、動物は対照として処置されるか、又は、ＰｃＴＸ毒で処置された。（５ｎｇ／ｍＬ（総タンパク質として）のＰｃＴｘ毒５０μＬが、経鼻的に導入された。）ＰｃＴＸ毒の経鼻投与は、梗塞体積により定義される虚血で誘発される損傷（虚血性損傷）において、対照処置と比較して５５％の減少をもたらした。経鼻投与は、肺内に吸入されるよりもむしろ鼻腔内に実質的に付着する噴霧器を介する場合があり、及び／又は、肺内に少なくとも部分的に吸入されるエアゾールを介する場合がある。一部の実施例では、経鼻投与は他の投与経路に比べて、脳へのより効率的な到達及び／又は虚血患者による自分自身での投与への適合性のような多数の利点を有する場合がある。
【実施例６】
【００９４】
選択的な実施態様
本実施例は、番号を付された一連の段落として提供される本発明の選択的な実施態様を説明する。
１．虚血で誘発される損傷の治療方法であって、酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーの阻害剤の治療上の有効量を、該阻害剤を必要とする患者に投与するステップを含む、治療方法。
２．前記投与するステップは脳卒中の患者に対して実施される、段落１に記載の治療方法。
３．前記投与するステップは、将来の虚血のエピソードに対する患者のリスクに基づいて実施されるか、あるいは、慢性的虚血に基づいて、又は、慢性的虚血を原因として実施される、段落１に記載の治療方法。
４．前記投与するステップは虚血性心臓病により誘発される損傷を治療するために実施される、段落１に記載の治療方法。
５．前記投与するステップはさまざまな時間に複数の用量の阻害剤を患者に投与することを含む、段落１に記載の治療方法。
６．前記投与するステップは阻害剤の注射によって実施される、段落１に記載の治療方法。
７．前記投与するステップは阻害剤の経口摂取又は吸入によって実施される、段落１に記載の治療方法。
８．前記投与するステップはＡＳＩＣ１ファミリーのメンバーの阻害剤を投与することを含む、段落１に記載の治療方法。
９．前記投与するステップは、他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに比べてＡＳＩＣ１ファミリーのメンバーに対して選択的な阻害剤を投与することを含む、段落８に記載の治療方法。
１０．前記投与するステップはＡＳＩＣ１ａの阻害剤を投与することを含む、段落１に記載の治療方法。
１１．前記投与するステップは、他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに比べてＡＳＩＣ１ａに対して選択的な阻害剤を投与することを含む、段落１０に記載の治療方法。
１２．前記投与するステップは、他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに比べてＡＳＩＣ１ａに対して特異的な阻害剤を投与することを含む、段落１１に記載の治療方法。
１３．前記投与するステップはシスチン・ノット・モチーフを有するペプチドを投与することを含む、段落１に記載の治療方法。
１４．前記投与するステップはタランチュラ種由来の毒性ペプチドであるＰｃＴｘ１を投与することを含む、段落１３に記載の治療方法。
１５．虚血に誘発される損傷を治療するための薬剤のスクリーニング方法であって、
ＡＳＩＣ１ａとの相互作用を測定するためにアッセイ系を選択するステップと、
該アッセイ系でＡＳＩＣ１ａとの相互作用を示す化合物を少なくとも１個同定するために、相互作用について化合物の組をテストするステップと、
虚血に誘発される損傷の治療のために前記少なくとも１個の化合物か、該化合物と構造上関連のある物質（ｒｅｌａｔｉｖｅ）かの有効性をテストするために虚血患者に前記少なくとも１個の化合物か、該化合物と構造上関連のある物質かを投与するステップとを含む、スクリーニング方法。
１６．前記アッセイ系を選択するステップは、ＡＳＩＣ１ａにより仲介されるイオン流入を測定するアッセイ系を選択することを含む、段落１５に記載のスクリーニング方法。
１７．前記アッセイ系を選択するステップは、ＡＳＩＣ１ａにより仲介されるカルシウムの流入を測定するアッセイ系を選択することを含む、段落１６に記載のスクリーニング方法。
１８．前記化合物の組をテストするステップは、イオン流入の阻害について化合物をテストすることを含む、段落１６に記載のスクリーニング方法。
１９．前記化合物の組をテストするステップは、少なくとも１個の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーとの関係でＡＳＩＣ１ａの選択的又は特異的阻害について一連の化合物をテストするステップを含む、段落１５に記載のスクリーニング方法。
２０．ヒト患者への投与のための薬剤として構成されたＡＳＩＣ１ａ阻害剤を含む虚血に誘発される損傷を治療するための組成物。
２１．前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は、各々の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーに対してＡＳＩＣ１ａについて選択的又は特異的である、段落２０に記載の組成物。
２２．前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤はシスチン・ノット・モチーフを有するペプチドである、段落２０に記載の組成物。
２３．前記ペプチドはタランチュラ種由来の毒ＰｃＴｘ１である、段落２２に記載の組成物。
【００９５】
上記の開示内容は、１個又は２個以上の、独立して有用な明確な発明を包含する場合がある。これらの発明の各々は、その好ましい形態で開示される。本明細書で開示され例証された具体的な実施態様を含むこれらの好ましい形態は、多数の変更の可能性があるため、限定的な意味で考えられることは意図されない。本発明の主題は、本明細書で開示されるさまざまな要素、特徴、機能及び／又は特性の、全ての新規性及び進歩性のある組合せ及びサブコンビネーションを含む。添付する請求の範囲は、新規性及び進歩性があると見なされる特定の組合せ及びサブコンビネーションを特に指摘する。本出願又は関連出願に基づき優先権を主張する出願において、特徴、機能、要素及び／又は特性の、他の組合せ及びサブコンビネーションを実施態様とする発明が特許請求に係る発明である場合がある。そのような請求の範囲は、異なる発明に向けられるか、同じ発明に向けられるかを問わず、及び、本来の請求の範囲と比べて範囲が広いか、狭いか、等しいか、異なっているかを問わず、発明の主題の範囲内に含まれるものと見なされる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明の虚血を治療する代表的な方法を示すフローチャート。
【図２】本発明の虚血治療薬を同定する代表的な方法を示すフローチャート。
【図３】培養マウス皮質ニューロンにおける酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）タンパク質の電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを表す一連のグラフ。
【図４】培養マウス皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣタンパク質の電気生理学及び薬理学に関する代表的なデータを表す付加的な一連のグラフ。
【図５】モデル虚血がＡＳＩＣタンパク質の活性を上昇させる場合があることを示す代表的なデータを表す一連のグラフ及びトレース図。
【図６】皮質ニューロンにおけるＡＳＩＣタンパク質がＣａ２＋透過性の場合があることを示す代表的なデータを表す一連のグラフとトレース図。
【図７】皮質ニューロンにおけるＣａ２＋透過性がＡＳＩＣ１ａ依存性の場合があることとを示す代表的なデータを表す一連のグラフとトレース図。
【図８】酸インキュベーションが、ＡＳＩＣ遮断により保護されるグルタミン酸受容体非依存性ニューロン損傷を誘発する場合があることを示す代表的なデータを表す一連のグラフ。
【図９】ＡＳＩＣ１ａがｉｎ ｖｉｔｒｏでの酸で誘発される損傷に関与する場合があることを示す代表的なデータを表す一連のグラフ。
【図１０】ＡＳＩＣ１ａの遮断による、及び、ＡＳＩＣ１遺伝子のノックアウトによるｉｎ ｖｉｖｏでの脳虚血における神経保護を示すデータを表す一連のグラフ。
【図１１】動物モデル系での、時間と処置のタイプとの関連で示される脳卒中により生じる虚血性損傷の割合についての代表的なデータをプロットしたグラフ。
【図１２】さまざまな代表的なペプチドの特徴が示された、代表的なシスチン・ノット・ペプチドであるＰｃＴｘ１の、一次アミノ酸配列の概念図。
【図１３】図１２のシスチン・ノット・ペプチドのさまざまな代表的な欠失誘導体とともに整列されたシスチン・ノット・ペプチドの比較図。
【図１４】細胞中に発現されたＡＳＩＣファミリーのメンバーとの関連で示される、細胞内で測定されたカルシウム電流の振幅をプロットした代表的なグラフ。
【図１５】動物モデル系での虚血性損傷を低減する、経鼻的に投与されたＰｃＴｘ毒の有効性に関する代表的なデータを表すグラフ。
【符号の説明】
【００９７】
２０ 本発明の虚血を治療する代表的な方法を示すフローチャート
２２ 虚血患者の選択ステップ
２４ 虚血患者へのＡＳＩＣ選択的阻害剤の投与ステップ
３０ 本発明の虚血治療薬を同定する代表的な方法を示すフローチャート
３２ ＡＳＩＣ選択的阻害剤の取得ステップ
３４ 虚血患者に対する阻害剤の効果テストのステップ
５０ ＰｃＴｘ１ペプチドのアミノ酸配列
５２、５４、５６ シスチン結合
５８ シスチン・ノット・モチーフ
６０ ベータシート領域
６２ 正に帯電した領域
６４ Ｎ末領域
６６ Ｃ末領域
７０ Ｎ末欠失誘導体のアミノ酸配列
７２ 部分的Ｃ末欠失誘導体のアミノ酸配列
７４ 完全Ｃ末欠失誘導体のアミノ酸配列
７６ Ｎ末／Ｃ末欠失誘導体のアミノ酸配列
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血に起因する損傷を低減させるために酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤の治療上の有効量を虚血患者に投与するステップを含む、虚血の治療方法。
【請求項２】
前記投与するステップは、１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較して選択的にＡＳＩＣ１ａを阻害するＡＳＩＣ１ａ阻害剤を投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項３】
前記投与するステップは、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａに対して選択的である阻害剤を投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項４】
前記投与するステップは、脳卒中に起因する損傷を低減させるために、脳卒中を患っている患者に対して実施される、請求項１に記載の治療方法。
【請求項５】
前記投与するステップは、経鼻的に、髄腔内に及び／又は硬膜外に阻害剤を投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項６】
前記投与するステップは、シスチン・ノットを含むペプチドを投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項７】
前記投与するステップは、ＰｃＴｘ１（配列番号１）と同一のペプチドか、ＰｃＴｘ１の誘導体かを投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項８】
前記ペプチドは、１個又は２個以上のアミノ酸の、欠失、置換及び／又は付加の少なくとも１つによりＰｃＴｘ１と異なる誘導体である、請求項７に記載の治療方法。
【請求項９】
酸感受性イオンチャネルファミリーのメンバーではない少なくとも１個の他のチャネルを選択的に阻害するために構成される阻害剤を患者に投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項１０】
前記投与するステップは、別のＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害に対してよりも、少なくとも約１０倍低い阻害剤濃度でＡＳＩＣ１ａチャネル活性を阻害するように構成された阻害剤を投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項１１】
前記虚血は脳卒中であり、前記投与するステップは脳卒中により誘発される損傷を低減するために虚血患者での脳卒中開始から少なくとも約２時間後に実施される、請求項１の治療方法。
【請求項１２】
虚血に起因する損傷を低減するためにシスチン・ノット・ペプチドの治療上の有効量を虚血患者に投与するステップを含む、虚血の治療方法。
【請求項１３】
前記シスチン・ノット・ペプチドはＰｃＴｘ１（配列番号１）との類似性が少なくとも約２５％あるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の治療方法。
【請求項１４】
前記投与するステップは脳卒中を患っている患者に前記シスチン・ノット・ペプチドを投与するステップを含む、請求項１２に記載の治療方法。
【請求項１５】
１個又は２個以上の酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤を取得するステップと、虚血患者に対する効果について前記１個又は２個以上のＡＳＩＣ１ａ阻害剤をテストするステップとを含む、虚血の治療薬の同定方法。
【請求項１６】
前記取得するステップは、１個又は２個以上の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較して選択的にＡＳＩＣ１ａを阻害するＡＳＩＣ１ａ阻害剤を取得するステップを含む、請求項１５に記載の同定方法。
【請求項１７】
前記取得するステップは、ＡＳＩＣ１ａの選択的阻害について複数の化合物をスクリーニングするステップを含む、請求項１５に記載の同定方法。
【請求項１８】
前記スクリーニングするステップは、前記複数の化合物を培養細胞に接触させるステップを含む、請求項１７に記載の同定方法。
【請求項１９】
前記スクリーニングするステップは、前記培養細胞内へのＣａ２＋流入を検出するステップを含む、請求項１７に記載の同定方法。
【請求項２０】
前記Ｃａ２＋流入を検出するステップは、Ｃａ２＋感受性色素で、及び／又は、膜ポテンシャル感受性色素で、電気生理学的に実施される、請求項１９に記載の同定方法。
【請求項２１】
前記スクリーニングするステップは、複数の異なるペプチドをスクリーニングするステップを含む、請求項１７に記載の同定方法。
【請求項２２】
前記スクリーニングするステップは、１個又は２個以上の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害との関係でＡＳＩＣ１ａの阻害を測定するステップを含む、請求項１７に記載の同定方法。
【請求項２３】
前記テストするステップは、（１）少なくとも１頭の動物で虚血を誘発させるステップと、（２）該少なくとも１頭の動物に前記１個又は２個以上の阻害剤を投与するステップと、（３）前記動物への虚血に起因する損傷を検出するステップとを含む、請求項１５に記載の同定方法。
【請求項２４】
前記虚血を誘発させるステップは、前記動物の大脳動脈を通じる血流を変化させるステップを含む、請求項２３に記載の同定方法。
【請求項２５】
前記テストするステップは、（１）脳卒中を患っている複数のヒトの患者を選択するステップと、（２）該ヒトの患者に、脳卒中に起因する損傷に対する前記１個又は２個以上のＡＳＩＣ１ａ阻害剤の効果を測定するために、前記１個又は２個以上のＡＳＩＣ１ａ阻害剤を投与するステップとを含む、請求項１５に記載の同定方法。
【請求項２６】
虚血患者に投与されるときに虚血治療に対する治療上の有効量の酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤を提供する濃度で薬物送達手段中に配合される前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤を含む、虚血治療用組成物。
【請求項２７】
前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は、１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害する、請求項２６に記載の治療用組成物。
【請求項２８】
前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤はシスチン・ノットを含むペプチドである、請求項２６に記載の治療用組成物。
【請求項２９】
前記阻害剤はＰｃＴｘ１（配列番号１）又はＰｃＴｘ１の誘導体である、請求項２６に記載の治療用組成物。
【請求項３０】
酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤を取得するステップと、虚血治療用に虚血患者に投与するための、前記阻害剤の治療上の有効濃度を有する治療薬を製造するべく、前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤を薬物送達手段と組合せるステップとを含む、虚血治療薬の製造方法。
【請求項３１】
前記取得するステップは、１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較して、ＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害するＡＳＩＣ１ａ阻害剤を取得するステップを含む、請求項３０に記載の製造方法。
【請求項３２】
前記取得するステップはＰｃＴｘ１（配列番号１）又はＰｃＴｘ１の誘導体を取得するステップを含む、請求項３０に記載の製造方法。
【請求項３３】
前記取得するステップは、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害する阻害剤を取得するステップを含む、請求項３０に記載の製造方法。
【請求項３４】
前記虚血治療薬の製造のための、酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤の使用。
【請求項３５】
前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は、１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害するために構成される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記阻害剤は脳卒中の治療薬の製造のために使用される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
虚血治療薬の中にＡＳＩＣ１ａ阻害剤を処方することを含む、虚血治療薬の製造方法。
【請求項３８】
前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害する、請求項３７に記載の製造方法。
【請求項１】
虚血に起因する損傷を低減させるために酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤の治療上の有効量を虚血患者に投与するステップを含む、虚血の治療方法。
【請求項２】
前記投与するステップは、１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較して選択的にＡＳＩＣ１ａを阻害するＡＳＩＣ１ａ阻害剤を投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項３】
前記投与するステップは、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａに対して選択的である阻害剤を投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項４】
前記投与するステップは、脳卒中に起因する損傷を低減させるために、脳卒中を患っている患者に対して実施される、請求項１に記載の治療方法。
【請求項５】
前記投与するステップは、経鼻的に、髄腔内に及び／又は硬膜外に阻害剤を投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項６】
前記投与するステップは、シスチン・ノットを含むペプチドを投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項７】
前記投与するステップは、ＰｃＴｘ１（配列番号１）と同一のペプチドか、ＰｃＴｘ１の誘導体かを投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項８】
前記ペプチドは、１個又は２個以上のアミノ酸の、欠失、置換及び／又は付加の少なくとも１つによりＰｃＴｘ１と異なる誘導体である、請求項７に記載の治療方法。
【請求項９】
酸感受性イオンチャネルファミリーのメンバーではない少なくとも１個の他のチャネルを選択的に阻害するために構成される阻害剤を患者に投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項１０】
前記投与するステップは、別のＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害に対してよりも、少なくとも約１０倍低い阻害剤濃度でＡＳＩＣ１ａチャネル活性を阻害するように構成された阻害剤を投与するステップを含む、請求項１に記載の治療方法。
【請求項１１】
前記虚血は脳卒中であり、前記投与するステップは脳卒中により誘発される損傷を低減するために虚血患者での脳卒中開始から少なくとも約２時間後に実施される、請求項１の治療方法。
【請求項１２】
虚血に起因する損傷を低減するためにシスチン・ノット・ペプチドの治療上の有効量を虚血患者に投与するステップを含む、虚血の治療方法。
【請求項１３】
前記シスチン・ノット・ペプチドはＰｃＴｘ１（配列番号１）との類似性が少なくとも約２５％あるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の治療方法。
【請求項１４】
前記投与するステップは脳卒中を患っている患者に前記シスチン・ノット・ペプチドを投与するステップを含む、請求項１２に記載の治療方法。
【請求項１５】
１個又は２個以上の酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤を取得するステップと、虚血患者に対する効果について前記１個又は２個以上のＡＳＩＣ１ａ阻害剤をテストするステップとを含む、虚血の治療薬の同定方法。
【請求項１６】
前記取得するステップは、１個又は２個以上の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較して選択的にＡＳＩＣ１ａを阻害するＡＳＩＣ１ａ阻害剤を取得するステップを含む、請求項１５に記載の同定方法。
【請求項１７】
前記取得するステップは、ＡＳＩＣ１ａの選択的阻害について複数の化合物をスクリーニングするステップを含む、請求項１５に記載の同定方法。
【請求項１８】
前記スクリーニングするステップは、前記複数の化合物を培養細胞に接触させるステップを含む、請求項１７に記載の同定方法。
【請求項１９】
前記スクリーニングするステップは、前記培養細胞内へのＣａ２＋流入を検出するステップを含む、請求項１７に記載の同定方法。
【請求項２０】
前記Ｃａ２＋流入を検出するステップは、Ｃａ２＋感受性色素で、及び／又は、膜ポテンシャル感受性色素で、電気生理学的に実施される、請求項１９に記載の同定方法。
【請求項２１】
前記スクリーニングするステップは、複数の異なるペプチドをスクリーニングするステップを含む、請求項１７に記載の同定方法。
【請求項２２】
前記スクリーニングするステップは、１個又は２個以上の他のＡＳＩＣファミリーのメンバーの阻害との関係でＡＳＩＣ１ａの阻害を測定するステップを含む、請求項１７に記載の同定方法。
【請求項２３】
前記テストするステップは、（１）少なくとも１頭の動物で虚血を誘発させるステップと、（２）該少なくとも１頭の動物に前記１個又は２個以上の阻害剤を投与するステップと、（３）前記動物への虚血に起因する損傷を検出するステップとを含む、請求項１５に記載の同定方法。
【請求項２４】
前記虚血を誘発させるステップは、前記動物の大脳動脈を通じる血流を変化させるステップを含む、請求項２３に記載の同定方法。
【請求項２５】
前記テストするステップは、（１）脳卒中を患っている複数のヒトの患者を選択するステップと、（２）該ヒトの患者に、脳卒中に起因する損傷に対する前記１個又は２個以上のＡＳＩＣ１ａ阻害剤の効果を測定するために、前記１個又は２個以上のＡＳＩＣ１ａ阻害剤を投与するステップとを含む、請求項１５に記載の同定方法。
【請求項２６】
虚血患者に投与されるときに虚血治療に対する治療上の有効量の酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤を提供する濃度で薬物送達手段中に配合される前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤を含む、虚血治療用組成物。
【請求項２７】
前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は、１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害する、請求項２６に記載の治療用組成物。
【請求項２８】
前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤はシスチン・ノットを含むペプチドである、請求項２６に記載の治療用組成物。
【請求項２９】
前記阻害剤はＰｃＴｘ１（配列番号１）又はＰｃＴｘ１の誘導体である、請求項２６に記載の治療用組成物。
【請求項３０】
酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤を取得するステップと、虚血治療用に虚血患者に投与するための、前記阻害剤の治療上の有効濃度を有する治療薬を製造するべく、前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤を薬物送達手段と組合せるステップとを含む、虚血治療薬の製造方法。
【請求項３１】
前記取得するステップは、１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較して、ＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害するＡＳＩＣ１ａ阻害剤を取得するステップを含む、請求項３０に記載の製造方法。
【請求項３２】
前記取得するステップはＰｃＴｘ１（配列番号１）又はＰｃＴｘ１の誘導体を取得するステップを含む、請求項３０に記載の製造方法。
【請求項３３】
前記取得するステップは、他の全てのＡＳＩＣファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害する阻害剤を取得するステップを含む、請求項３０に記載の製造方法。
【請求項３４】
前記虚血治療薬の製造のための、酸感受性イオンチャネル１ａ（ＡＳＩＣ１ａ）阻害剤の使用。
【請求項３５】
前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は、１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害するために構成される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記阻害剤は脳卒中の治療薬の製造のために使用される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
虚血治療薬の中にＡＳＩＣ１ａ阻害剤を処方することを含む、虚血治療薬の製造方法。
【請求項３８】
前記ＡＳＩＣ１ａ阻害剤は１個又は２個以上の他の酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）ファミリーのメンバーと比較してＡＳＩＣ１ａを選択的に阻害する、請求項３７に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００８−５１３４７７（Ｐ２００８−５１３４７７Ａ）
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３２５００（Ｐ２００７−５３２５００）
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３３１７１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３４０３５
【国際公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０７０８６３３２）バイロゲノミックス インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３３１７１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３４０３５
【国際公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０７０８６３３２）バイロゲノミックス インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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