蛍光プローブ
式（Ｉ）（Ｒ１及びＲ２はそれぞれフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示し、該アミノ基のいずれか１つはアルキル基を１個有していてもよく；Ｒ３及びＲ４は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｒ５及びＲ８はそれぞれ独立にＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ６及びＲ９はカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基、アルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基、スルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基、又はアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基を示し、Ｒ７及びＲ１０はＣ１−６アルキル基、アリール基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、ビニル基、チエニル基、又はピロリル基を示す）で表される化合物、及び該化合物を含む一酸化窒素測定用試薬。 広範囲なｐＨ領域において蛍光強度変化のない蛍光性物質を与えることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は蛍光プローブに関する。より具体的には一酸化窒素を捕捉して蛍光を発する蛍光プローブに関する。
【背景技術】
最近、それ自体はほとんど蛍光性を有しない特定のフルオレセイン誘導体が、中性条件下で一酸化窒素と容易に反応して高い蛍光強度を有するトリアゾール化合物を与え、該トリアゾール誘導体が４９５ｎｍ程度の長波長の励起光により５１５ｎｍ程度の強い蛍光を発することができることが報告された（米国特許第５，８７４，５９０号明細書）。このフルオレセイン誘導体を一酸化窒素測定試薬として用いると、汎用の蛍光顕微鏡に備えられた蛍光フィルターで励起光を容易に分光することができ、個々の細胞内の蛍光を測定することにより簡便に細胞内の一酸化窒素濃度を測定できる。
また、中性条件下において一酸化窒素と効率よく反応でき、蛍光強度に優れたトリアゾール誘導体を与えるジアミノローダミン誘導体が提案されている（米国特許第６，２０１，１３４号明細書）。このジアミノローダミン誘導体は上記フルオレセイン誘導体に比べて長波長側にシフトしており、細胞の自家蛍光領域とほとんどオーバーラップしないこと、並びに酸性領域においても蛍光の減弱がないことから、生体組織や細胞に対してダメージを与えず、細胞の自家蛍光領域よりも長波長の蛍光領域で一酸化窒素を測定することができる。
一方、アルカリ金属イオン又はカチオン測定のために有用なイオン取り込み部を有するインダセン誘導体が知られている（特開平１０−３３８６９５号公報及び特開平１１−５７９６号公報）。しかしながら、このインダセン誘導体の蛍光発色団を用いて一酸化窒素測定を測定する試みについては全く報告がない。
【発明の開示】
本発明者らは、一酸化窒素を特異的かつ効率的に捕捉して蛍光を発する蛍光プローブを提供すべく鋭意研究を行った結果、インダセン誘導体の蛍光発色団を用いることにより、中性条件下において一酸化窒素と効率よく反応でき、蛍光強度に優れた蛍光性物質を与える一酸化窒素測定試薬を提供することに成功した（特願２００２−８０２３０号明細書）。
本発明者らはさらに研究を進めた結果、インダセン誘導体の蛍光発色団にカルボキシ置換アルキル基などの置換基を導入することにより、さらに水溶性に優れた一酸化窒素測定用試薬を提供できること、及び該試薬が一酸化窒素をトラップして生成する蛍光性トリアゾール誘導体の蛍光強度がｐＨ変動によりほとんど影響を受けないことを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示し、該アミノ基のいずれか１つは置換基を有していてもよいアルキル基を１個有していてもよく；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｒ５及びＲ８はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ６及びＲ９はそれぞれ独立にカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基、アルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基、スルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基、又はアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基を示し、Ｒ７及びＲ１０はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す）で表される化合物又はその塩を提供するものである。
この発明の好ましい態様によれば、Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がメチル基である上記化合物又はその塩が提供される。また、本発明により、上記の化合物又はその塩を含む一酸化窒素測定用試薬が提供される。
別の観点からは、本発明により、下記の一般式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−（式中、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を示すか、又はＲ１１及びＲ１２はフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基（置換基を有していてもよいアルキル基又はアミノ基の保護基を有していてもよい）及びニトロ基の組み合わせを示し；Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｒ１５及びＲ１８はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ１６及びＲ１９はそれぞれ独立にカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基、アルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基、スルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基、又はアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基を示し、Ｒ１７及びＲ２０はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す］で表される化合物又はその塩が提供される。この発明の好ましい態様によれば、Ｒ１６及びＲ１９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ２０がメチル基である上記化合物又はその塩が提供される。
さらに別の観点からは、一酸化窒素の測定方法であって、（ａ）上記の一般式（Ｉ）で示される化合物を一酸化窒素と反応させる工程；及び、（ｂ）上記工程（ａ）において生成する一般式（ＩＩ）の化合物［ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−（式中、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を示す］を検出する工程を含む方法が本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、化合物（７）にＮＯＣ１３を添加して励起及び蛍光スペクトルの変化を測定した結果を示した図である。図中、（Ａ）は励起スペクトル（Ｅｍ：５３５ｎｍ）、（Ｂ）は蛍光スペクトル（Ｅｘ：５２０ｎｍ）を示す。蛍光強度の高い曲線から順にＮＯＣ１３濃度が５．０μＭ、２．０μＭ、１．０μＭ、０．５μＭ、及び０μＭの場合の結果を示す。
第２図は、化合物（７）にＮＯＣ１３を添加して反応生成物をＨＰＬＣで測定した結果を示した図である。
第３図は、種々のｐＨにおける化合物（７）及び（８）の蛍光強度を測定した結果を示した図である。
第４図は、化合物（９）のクロロホルム溶液にＮＯのクロロホルム溶液を添加した時の蛍光強度の変化を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本明細書において、特に言及しない場合にはアルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。アルキル部分を有する他の置換基（アルコキシ基）のアルキル部分についても同様である。また、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と言う場合には、置換基の種類、個数、置換位置は特に限定されないが、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよい）、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、アルキルスルホネート基などを置換基として有していてもよい。また、本明細書においてアリール基という場合には、単環性又は多環性のアリール基のいずれであってもよいが、好ましくはフェニル基を用いることができる。アリール環についても同様である。
一般式（Ｉ）において、Ｒ３及び／又はＲ４がＣ１−６アルキル基又はＣ１−６アルコキシ基を示す場合には、それらの基はベンゼン環上の２−位及び６−位に結合することが好ましい。これらの基が存在すると量子収率や反応速度が向上し検出感度を高めることができる場合がある。Ｒ３及びＲ４が示すアルキル基としてはメチル基が好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が好ましい。Ｒ３及びＲ４がともに水素原子であることも好ましい。一般式（ＩＩ）におけるＲ１３及びＲ１４についても同様である。
Ｒ６及びＲ９が示すカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基はモノカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基であることが好ましい。カルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基のＣ１−６アルキル部分の炭素数は１ないし４であることが好ましく、さらに好ましくは２又は３であり、特に好ましいのは炭素数２である。Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であることが最も好ましい。Ｒ６及びＲ９が示すアルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基としては、上記のカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基のＣ１−６アルキルエステルを例示することができる。好ましくはエトキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基などである。Ｒ６及びＲ９が示すスルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基としては、モノスルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基が好ましい。Ｒ６及びＲ９が示すアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基としては、モノアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基が好ましい。アルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基におけるアルキルスルホネート基としてはＣ１−６アルキルスルホネート（Ｃ１−６アルキル−Ｏ−ＳＯ２−）が好ましい。Ｒ６及びＲ９がモノカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基である場合、特にＲ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基である場合には、化合物の水溶性が著しく高まり、かつ一酸化窒素との反応により生じる一般式（ＩＩ）で表される化合物の蛍光強度がｐＨ変動により影響を受けないという優れた効果が得られる。
Ｒ７及びＲ１０が示すアリール基としてはフェニル基が好ましい。フェニル基が置換基を有する場合、該置換基としてはスルホン酸基又はスルホネート基などが好ましく、特に好ましいのはスルホン酸基である。Ｒ７及びＲ１０が示すＣ１−６アルコキシカルボニル基としてはエトキシカルボニル基が好ましい。Ｒ７及びＲ１０が示すビニル基に存在する置換基としてはフェニル基、モノアミノフェニル基、又はジアミノフェニル基（例えば３，４−ジアミノフェニル基）などを挙げることができる。Ｒ７及びＲ１０が示すチエニル基又はピロリル基としては、それぞれ２−チエニル基又は２−ピロリル基が好ましい。Ｒ７及びＲ１０がアルキル基以外の基である場合には、化合物の蛍光波長が長波長側にシフトする場合がある。
一般式（Ｉ）において、Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であることがより好ましい。また、一般式（Ｉ）において、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０が置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基であることが好ましく、例えば、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がいずれもメチル基である化合物は本発明の好適な態様である。一般式（ＩＩ）におけるＲ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、及びＲ２０についても上記のＲ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０と同様である。
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示す。Ｒ１及びＲ２が共に無置換のアミノ基であってもよいが、Ｒ１及びＲ２のうちのいずれかは１個のアルキル基で置換されていてもよく、該アルキル基は１個又は２個以上の置換基を有していてもよい。アミノ基上に置換するアルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖のＣ１−１８アルキル基（好ましくはＣ１−６アルキル基）を挙げることができ、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などを用いることができる。アルキル基が置換基を有する場合の例としては、例えば、置換若しくは無置換のアリール基が置換したＣ１−６アルキル基（アラルキル基）などを挙げることができる。アリール置換アルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、パラメトキシベンジル基、パラエトキシカルボニルベンジル基、パラカルボキシベンジル基などを用いることができる。
上記の一般式（ＩＩ）において、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−基を示す。ここで、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。該アルキル基としては、直鎖又は分枝鎖のＣ１−１８アルキル基（好ましくはＣ１−６アルキル基）を挙げることができ、該アルキル基が置換基を有する場合の例として、例えば、置換若しくは無置換のアラルキル基を挙げることができる。該アラルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、パラメトキシベンジル基、パラエトキシカルボニルベンジル基、パラカルボキシベンジル基などを用いることができる。
また、Ｒ１１及びＲ１２はフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基（１個の置換基を有していてもよい）及びニトロ基の組み合わせを示すが、Ｒ１１及びＲ１２のいずれか一方はアミノ基を示し、他方はニトロ基を示す。Ｒ１１及びＲ１２のいずれか一方が示すアミノ基は無置換であってもよいが、アルキル基、例えばＣ１−１８アルキル基、好ましくはＣ１−６アルキル基を１個有していてもよい。該アルキル基は置換基を有していてもよく、例えば、置換若しくは無置換のアラルキル基などがアミノ基に置換していてもよい。また、該アミノ基はアミノ基の保護基、例えば、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基などのアシル基；トリメチルシリル基などのアルキルシリル基などを有していてもよい。ベンジル基などのアラルキル基を保護基として利用してもよい。
上記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される本発明の化合物は塩を形成する場合もある。塩の種類は特に限定されず、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、クエン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。また、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はメチルアミン塩、トリエチルアミン塩などの有機アミン塩を挙げることができる。さらに、グリシンなどのアミノ酸の塩を形成する場合もある。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらの具体例に限定されることはない。
上記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される本発明の化合物は１個または２個以上の不斉炭素を有している場合がある。従って、１個または２個以上の不斉炭素に基づく光学的に純粋な形態の任意の光学異性体、光学異性体の任意の混合物、ラセミ体、純粋な形態のジアステレオ異性体、ジアステレオ異性体の混合物などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、本発明の化合物は水和物や溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。
上記の一般式（Ｉ）で表される化合物及び一般式（ＩＩ）で表される化合物（ただし、Ｒ１１及びＲ１２がフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基及びニトロ基の組み合わせを示す化合物）のうち、代表的化合物としてＲ３及びＲ４が水素原子であり、Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がいずれもメチル基である化合物、並びにＲ１３及びＲ１４が水素原子であり、Ｒ１６及びＲ１９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ２０がいずれもメチル基である化合物の製造例が本明細書の実施例に具体的に示されている。従って、上記の一般式（ＩＩ）で表される化合物が一般式（Ｉ）で表される化合物の製造中間体として有用であることが理解されよう。また、一般式（ＩＩ）で示される化合物のうち、Ｒ１１及びＲ１２が互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−基を示す化合物については、上記一般式（Ｉ）で表される化合物と一酸化窒素とを反応させることにより製造可能である。この化合物は、後述のように強い蛍光性を有しており、一酸化窒素の測定に有用である。
本明細書の実施例の具体的説明を参照することにより、一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）に包含される化合物を容易に製造できることが当業者には理解されよう。また、インダセン骨格については、例えば、特開平１０−３３８６９５号公報及び特開平１１−５７９６号公報のほか、Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２５，ｐｐ．２８９−２９２，２００１；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２，ｐｐ．６７１１−６７１３，２００１；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４０，ｐｐ．３８５−３８７，２００１；及び特願２００２−８０２３０号明細書などに合成方法が示されているので、これらの刊行物を参照することにより当業者は本発明の化合物をさらに容易に製造可能である。
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、中性条件下において一酸化窒素と効率的に反応して、収率よく一般式（ＩＩ）の化合物（ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−基を示す化合物）を生成する性質を有している。一般式（Ｉ）で表される化合物自体は、中性条件下において４８５ｎｍ程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記一般式（ＩＩ）の化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光を発する性質を有している。従って、一般式（Ｉ）で表される化合物を生体組織中や細胞内に取り込ませて一酸化窒素と反応させ、蛍光性の上記一般式（ＩＩ）の化合物を生成させてこの化合物の蛍光を測定することにより、生体組織中や細胞内の一酸化窒素を測定することができる。特に、本発明の一般式（Ｉ）の化合物は一酸化窒素との反応性に優れており、高感度かつ正確に一酸化窒素の測定を行なえるという優れた特徴を有している。
従って、本発明により提供される一酸化窒素の測定方法は、一般式（Ｉ）で表される化合物と一酸化窒素とを反応させて一般式（ＩＩ）の化合物を生成させ、一般式（ＩＩ）の化合物（ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−基を示す化合物）の蛍光を測定する工程を含んでいる。本明細書において「測定」という用語は、検出、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。上記反応は好ましくは中性条件下に行うことができ、例えば、ｐＨ６．０〜８．０の範囲、好ましくはｐＨ６．５〜７．８の範囲、より好ましくはｐＨ６．８〜７．６の範囲で行うことができる。もっとも、本発明の化合物を用いた一酸化窒素の測定は中性領域ないし弱酸性領域に限定されることはなく、例えば、胃の粘膜細胞など強酸性の条件においても測定が可能である。特に、本発明の一般式（ＩＩ）で表される化合物は広範囲なｐＨにおいて蛍光強度が変化しないという極めて優れた性質を有しており、ｐＨ変動の影響を受けずに正確な測定が可能である。
蛍光の測定は、従来公知の蛍光測定方法に準じて行うことができる（例えば、Ｗｉｅｒｓｍａ，Ｊ．Ｈ．，Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．，３，ｐｐ．１２３−１３２，１９７０；Ｓａｗｉｃｋｉ，Ｃ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．，４，ｐｐ．７６１−７７５，１９７１；Ｄａｍｉａｎｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｂｕｒｉｎｉ，Ｇ．，Ｔａｌａｎｔａ，８，ｐｐ．６４９−６５２，１９８６；Ｄａｍｉａｎｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｂｕｒｉｎｉ，Ｇ．，Ｔａｌａｎｔａ，８，ｐｐ．６４９−６５２，１９８６；Ｍｉｓｋｏ，Ｔ．Ｐ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４，ｐｐ．１１−１６，１９９３などの刊行物を参照）。本発明の一酸化窒素測定においては、例えば、励起光として５２０ｎｍ程度の光を照射し、５３５ｎｍ程度の蛍光を測定することが好ましい。本発明の一般式（ＩＩ）で表される化合物は、長波長の励起光によっても充分な蛍光強度を与えるという優れた性質があり、生体や組織、細胞などへの障害を軽減することが可能である。また、このような波長の光を用いると、汎用の蛍光顕微鏡に備えられた蛍光フィルターでも効率的に分光することができ、特殊なフィルターを用いずに高感度な測定が可能になる。
特に高感度な測定が必要な場合には、上記の一酸化窒素の測定を酸素源の存在下に行ってもよい。酸素源としては、例えば、酸素、オゾン、又はオキシド化合物などを用いることが可能である。酸素としては、一般的には溶存酸素を用いることができるが、必要に応じて、反応系内に酸素ガスを導入するか、酸素発生用試薬（例えば、過酸化水素など）を添加してもよい。オキシド化合物としてはＮ−Ｏ，Ｓ−Ｏ，Ｐ−Ｏなど容易に酸素原子が開裂されるオキシド結合を有する化合物であれば特に限定されないが、例えば、ＰＴＩＯ（２−フェニル−４，４，５，５−テトラメチルイミダゾリン−１−オキシル−３−オキシド：Ｍａｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．，５６，ｐｐ．５８８−５９２，１９９４；Ａｋａｉｋｅ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，ｐｐ．８２７−８３２，１９９３）またはその誘導体（ＰＴＩＯのフェニル基のｐ−位にカルボキシル基が導入されたカルボキシＰＴＩＯなど）、トリフェニルホスフィンオキサイド、トリエチルアミンオキサイドなどを用いることができる。
上記のオキシド化合物のうち、ＰＴＩＯ及びその誘導体（例えばカルボキシＰＴＩＯなど）は特に好ましい化合物であり、当業者に容易に入手可能な化合物である（東京化成株式会社、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃａｔａｌｏｇ，３２，１９９４などに記載されている）。なお、オキシド化合物はそれ自体を反応試薬として用いてもよいが、リポソーム等に封入したものを用いることもできる。酸素源の量は特に限定されないが、少なくとも測定すべき一酸化窒素に対して１μＭ以上、好ましくは１０〜３０μＭ、より好ましくは１０〜２０μＭ程度の量であることが好ましい。生体試料などの測定では、試料中に１０〜２０μＭ程度の量を添加することが好ましいが、一般的には、溶存酸素により必要量の酸素源が供給される。酸素源の量が極端に少ないと測定感度が低下する場合があり、酸素源の量が極端に多いと蛍光による発光に不都合を生じる場合がある。従って、測定すべき一酸化窒素の量を予試験若しくは公知の方法で予測して適宜の濃度範囲の酸素源を添加することが好ましい。反応は１０〜２５℃の温度範囲で行うことが可能である。なお、蛍光プローブを用いた一酸化窒素の測定方法に関しては長野哲雄ら、化学と教育、４７、ｐｐ．６６５−６６９、１９９９などに詳細に記載されているので、当業者は上記刊行物を参照しつつ、本発明の化合物を用いて高感度に一酸化窒素を測定することができる。
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
（１）４−アセトアミド−３−ニトロベンズアルデヒド
氷冷下、濃硫酸６ｍＬに発煙硝酸１ｍＬを３回に分けて加えて混酸を調製し、４−アセトアミドゼンズアルデヒド（１．９１ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。添加後、直ちに反応液を氷に注ぎ、固形物を濾取した。冷水でよく洗浄して乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ＣＨ２Ｃｌ２）で精製した後、水から再結晶して目的化合物を淡黄色の針状固体として得た（１．５７ｇ，ｙ．６４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
２．３６（３Ｈ，ｓ），８．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７９，１．６５Ｈｚ），８．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６５Ｈｚ），９．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ），９．９９（１Ｈ，ｓ），１０．６３（１Ｈ，ｓ）
ＭＳ（Ｅｌ）２０８（Ｍ＋）
ｍ．ｐ．１５６℃
（２）４−アミノ−３−ニトロベンズアルデヒド
４−アセトアミド−３−ニトロベンズアルデヒド（２．０８ｇ，１０ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍＬに溶解した。その溶液に２Ｎ ＨＣｌ水溶液５０ｍＬを加え、アルゴン気流下で８０℃で８時間加熱還流した。反応液を減圧濃縮してメタノールを除き、残渣を２Ｎ ＮａＯＨ水溶液で塩基性にしてジクロルメタンで５回抽出した。有機相を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮し、目的化合物を黄色固体として得た（１．６２ｇ，ｙ．９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
６．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５８Ｈｚ），７．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５８，２．０１Ｈｚ），８．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ），９．８２（１Ｈ，ｓ）
ＭＳ（Ｅｌ）１６６（Ｍ＋）
（３）３−（２−メトキシカルボニルエチル）−２，４−ジメチルピロール
メチル５−（ベンジルオキシカルボニル）−２，４−ジメチル−３−ピロールプロピオネート（３．１ｇ，９．８ｍｍｏｌ）をアセトン１００ｍＬに溶解した。この溶液に１０％Ｐｄ−Ｃを加えて水素ガス下で室温にて攪拌した。原料が消失したところで反応液をろ過し、母液を減圧蒸留した。残渣にトリフルオロ酢酸１０ｍＬを加え、アルゴン気流下で４０℃にて１０分間加熱した。反応混合物にクロロホルムを加えて水で１回洗浄し、水層をクロロホルムで２回抽出した。有機相を合わせてＮａ２ＣＯ３水溶液で１回、水で１回洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して目的化合物を褐色液体として得た（１．６ｇ，ｙ．９０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
２．０３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９０Ｈｚ），２．１８（３Ｈ，ｓ），２．４５（２Ｈ，ｍ），２．７２（２Ｈ，ｍ），３．６７（３Ｈ，ｓ），６．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９０Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｓ）
ＭＳ（Ｅｌ）１８１（Ｍ＋）
（４）６−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４’−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−３，３’，５，５’−テトラメチルピロメテン
４−アミノ−３−ニトロベンズアルデヒド（７６０ｍｇ，４．５８ｍｍｏｌ）と３−（２−メトキシカルボニルエチル）−２，４−ジメチルピロール（１．６ｇ，９．１６ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬのジクロルメタンに溶解した。アルゴン気流下でこの溶液に数滴のトリフルオロ酢酸を加え、室温で一晩遮光して攪拌した。薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロルメタン，シリカゲル）で原料消失を確認してジクロロジシアノパラベンゾキノン（ＤＤＱ，１．０７ｇ，４．５８ｍｍｏｌ）のジクロルメタン溶液１２０ｍＬを加えた。反応混合物を１５分攪拌した後に水で１回洗い、無水ＭｇＳＯ４で乾燥して減圧濃縮した。残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；メタノール／ジクロルメタン＝１／２０）で精製して目的化合物を得た（ｙ．７６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
１．３７（６Ｈ，ｓ），２．３３（６Ｈ，ｓ），２．３６（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４３，７．１４Ｈｚ），２．６３（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４３，７．１４Ｈｚ），３．６５（６Ｈ，ｓ），６．３２（２Ｈ，ｓ），６．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６１Ｈｚ），７．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６１，２．０１Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）５０８（Ｍ＋）
（５）８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４−ジフルオロ−２，６−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン
６−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４’−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−３，３’，５，５’−テトラメチルピロメテン（２１３ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのジクロルメタンに溶解した。アルゴン気流下でジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，１ｍＬ，５．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌した。さらにボロントリフルオライド・ジエチルエーテラート（１ｍＬ，７．９ｍｍｏｌ）を加えて４０分間攪拌した。添加して少しすると蛍光が出現した。反応終了後、反応混合物を水で１回、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液で２回洗浄し、水層とＮａＯＨ層を合わせてジクロルメタンで３回抽出した。有機相を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮し、残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；メタノール／ジクロルメタン＝１／２０）で精製して目的化合物を橙色固体として得た（７２ｍｇ，ｙ．３１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
１．４６（６Ｈ，ｓ），２．３７（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２５，７．３２Ｈｚ），２．５４（６Ｈ，ｓ），２．６５（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２５，７．３２Ｈｚ），３．６６（６Ｈ，ｓ），６．３２（２Ｈ，ｓ），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ），７．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４０，１．８３Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８３Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）５５６（Ｍ＋）
（６）８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−２，６−ビス−（２−カルボキシエチル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン
８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４−ジフルオロ−２，６−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（１８２．５ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）をメタノール１００ｍＬに溶解し、この溶液に０．２Ｎ ＮａＯＨ水溶液１０ｍＬを加えて８０℃で１時間加熱還流した。反応液を減圧濃縮してメタノールを除き、２ＮのＨＣｌ水溶液で酸性にして酢酸エチルで３回抽出した。有機相を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；メタノール／ジクロルメタン＝１／１０）で精製して目的化合物を得た（８７．１ｍｇ，ｙ．５０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）
１．４４（６Ｈ，ｓ），２．２６（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８６，７．３２Ｈｚ），２．４０（６Ｈ，ｓ），２．５７（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８６，７．３２Ｈｚ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６１Ｈｚ），７．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６１，２．０１Ｈｚ），７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ）５２８（Ｍ＋）
（７）８−（３，４−ジアミノフェニル）−２，６−ビス−（２−カルボキシエチル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＨ）
８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−２，６−ビス−（２−カルボキシエチル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（８７．１ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）をメタノール１００ｍＬに溶解し、この溶液に１０％Ｐｄ−Ｃを加えて水素ガス下で室温にて攪拌した。原料消失を確認した後、反応混合物をろ過して母液を減圧蒸留し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；Ｈ２Ｏ／アセトニトリル＝１／１０）で精製して目的化合物を茶褐色固体として得た（３１．５ｍｇ，ｙ．３８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）
１．５１（６Ｈ，ｓ），２．２８（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４０．７．１４Ｈｚ），２．４７（６Ｈ，ｓ），２．６４（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４０，７．１４Ｈｚ），６．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８６，２．０１Ｈｚ），６．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ），６．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８６Ｈｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ）４９８（Ｍ＋）
（８）８−（５−ベンゾトリアゾリル）−２，６−ビス−（２−カルボキシエチル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＨ−Ｔ）
ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＨ（１７．４ｍｇ，０．０３５ｍｍｏｌ）に１ＮのＨＣｌ水溶液を２０ｍＬ加え、この溶液を氷冷下で攪拌しながらＮａＮＯ２（２．５ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）の水溶液を少量ずつ加えた。添加終了後に反応液を室温に戻し、１５分間攪拌した。溶液を酢酸エチルで３回抽出し、有機相を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；Ｈ２Ｏ／アセトニトリル＝１／１０）で精製して目的化合物を赤褐色固体として得た（１４．６ｍｇ，ｙ．８２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）
１．２４（６Ｈ，ｓ），２．３０（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２５，７．１４Ｈｚ），２．５１（６Ｈ，ｓ），２．６３（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２５，７．１４Ｈｚ），７．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４３Ｈｚ），７．８９（１Ｈ，ｓ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４３Ｈｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ）５０９（Ｍ＋）
（９）８−（３，４−ジアミノフェニル）−４，４−ジフルオロ−２，６−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＭｅ）
８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４−ジフルオロ−２，６−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（１３１ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのジクロルメタンに溶解し，さらにメタノール１００ｍｌを加えた。この溶液に１０％Ｐｄ−Ｃを加えて水素ガス下で室温にて一晩攪拌した。アルミナＴＬＣ（展開溶媒；ジクロルメタン）で原料消失を確認した後、反応混合物をろ過して母液を減圧濃縮し、残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロルメタン）で精製した（８５ｍｇ，ｙ．６８％）。ヘキサン／クロロホルムより再結晶を行った。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
１．４４（６Ｈ，ｓ），２．３５（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６１，７．３２Ｈｚ），２．５３（６Ｈ，ｓ），２．６４（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６１，７．３２Ｈｚ），３．４６（２Ｈ，ｓ），３．５４（２Ｈ，ｓ），３．６６（６Ｈ，ｓ），６．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３９Ｈｚ），６．５６（ｓ，１Ｈ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３９Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳｌ）５４９（［Ｍ＋Ｎａ］＋）
例２：試験例
（ａ）蛍光スペクトル
化合物（７）及び化合物（８）の蛍光特性を測定した。量子収率はＦ−４５００（日立）、それ以外のスペクトルはＬＳ５０Ｂ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。０．２％未満のジメチルスルホキシドを共溶媒として０．１Ｍナトリウム−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に溶解して２０℃で測定した。量子収率は０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液中でのフルオレセインを０．８５として算出した。結果を表１に示す。対照として一般式（Ｉ）においてＲ６及びＲ９が水素原子である化合物（ｐ−ＤＡＭＢＯ）及び一般式（ＩＩ）においてＲ１６及びＲ１９が水素原子である化合物（ｐ−ＤＡＭＢＯ−Ｔ）について同様に量子収率の測定を行ったところ、それぞれ０．００１及び０．４０であり、本発明の化合物では大きな量子収率が得られることが分かった。また、本発明の化合物ではストークスシフトが１６ｎｍであり、対照として用いたｐ−ＤＡＭＢＯ及びｐ−ＤＡＭＢＯ−Ｔよりも大きく、フルオレセインとほぼ同程度の大きなストークスシフトが得られた（ｐ−ＤＡＭＢＯ及びｐ−ＤＡＭＢＯ−Ｔのストークスシフトはともに９ｎｍである）。
（ｂ）一酸化窒素との反応
化合物（７）に一酸化窒素発生試薬であるＮＯＣ１３を添加して励起及び蛍光スペクトルの変化を測定した。０．１Ｍナトリウム−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で化合物（７）５μＭ（０．１％ＤＭＳＯ共溶媒）とＮＯＣ１３を３７℃で１時間インキュベートしてから励起及び蛍光スペクトルを測定した。測定はスリット幅をＥｘ／Ｅｍ＝２．５／２．５ｎｍとし、励起波長を５２０ｎｍ、蛍光波長を５３５ｎｍとして行った。結果を図１に示す。ＮＯＣ１３の添加濃度に依存して蛍光の増加が認められた。また、０．１Ｍナトリウム−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で化合物（７）５μＭ（０．１％ＤＭＳＯ共溶媒）とＮＯＣ１３（２０μＭ）を３７℃で１時間インキュベートしてから、反応物をＨＰＬＣで分析した結果を図２に示す。ＨＰＬＣ条件はカラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３４．６×２５０ｍｍ、溶出液：０．１％Ｈ３ＰＯ４水溶液／アセトニトリル＝５５／４５（ｖ／ｖ）、検出：ＵＶ−ｖｉｓ（５２０ｎｍ）／蛍光（５２０／５３５ｎｍ）、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、試料容量：５μＬとした。化合物（７）と一酸化窒素との反応が極めて速やかに起こることが確認できた。
（ｃ）蛍光強度のｐＨによる変動
化合物（７）及び（８）を種々のｐＨに調整した０．１Ｍナトリウム−リン酸バッファー（０．１％ＤＭＳＯ共溶媒）に溶解して、上記（ｂ）と同様にして蛍光を測定した。結果を図３に示す。化合物（８）はｐＨ３から１３に至る極めて広範囲なｐＨにおいて蛍光強度がほとんど変化していないことが確認できた。従って、本発明の化合物を用いた一酸化窒素の測定では、ｐＨ変動を伴う生体試料においても極めて精度の高い測定が可能である。
（ｄ）化合物（９）（ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＭｅ）の有機溶媒中におけるＮＯとの反応による蛍光の変化を測定した。１μＭ ＤＡＭＢＯ−ＰＭｅクロロホルム溶液に、ＮＯのクロロホルム溶液（クロロホルムにアルゴンガスを１０分バブル後、ＮＯガスを３分バブルして作成した）を１分に５μＬ添加して、１０分測定した。スリット幅は、Ｅｘ／Ｅｍ＝５．０／０ｎｍ、励起波長５２０ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで測定した。結果を図４に示す。ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＭｅを用いることにより、有機溶媒中でのＮＯの測定が可能であることが図４に示されている。これより、本発明の化合物は細胞膜透過性を有し、生体膜などの脂溶性環境でもＮＯを効率よく検出することが可能であることが分かる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【技術分野】
本発明は蛍光プローブに関する。より具体的には一酸化窒素を捕捉して蛍光を発する蛍光プローブに関する。
【背景技術】
最近、それ自体はほとんど蛍光性を有しない特定のフルオレセイン誘導体が、中性条件下で一酸化窒素と容易に反応して高い蛍光強度を有するトリアゾール化合物を与え、該トリアゾール誘導体が４９５ｎｍ程度の長波長の励起光により５１５ｎｍ程度の強い蛍光を発することができることが報告された（米国特許第５，８７４，５９０号明細書）。このフルオレセイン誘導体を一酸化窒素測定試薬として用いると、汎用の蛍光顕微鏡に備えられた蛍光フィルターで励起光を容易に分光することができ、個々の細胞内の蛍光を測定することにより簡便に細胞内の一酸化窒素濃度を測定できる。
また、中性条件下において一酸化窒素と効率よく反応でき、蛍光強度に優れたトリアゾール誘導体を与えるジアミノローダミン誘導体が提案されている（米国特許第６，２０１，１３４号明細書）。このジアミノローダミン誘導体は上記フルオレセイン誘導体に比べて長波長側にシフトしており、細胞の自家蛍光領域とほとんどオーバーラップしないこと、並びに酸性領域においても蛍光の減弱がないことから、生体組織や細胞に対してダメージを与えず、細胞の自家蛍光領域よりも長波長の蛍光領域で一酸化窒素を測定することができる。
一方、アルカリ金属イオン又はカチオン測定のために有用なイオン取り込み部を有するインダセン誘導体が知られている（特開平１０−３３８６９５号公報及び特開平１１−５７９６号公報）。しかしながら、このインダセン誘導体の蛍光発色団を用いて一酸化窒素測定を測定する試みについては全く報告がない。
【発明の開示】
本発明者らは、一酸化窒素を特異的かつ効率的に捕捉して蛍光を発する蛍光プローブを提供すべく鋭意研究を行った結果、インダセン誘導体の蛍光発色団を用いることにより、中性条件下において一酸化窒素と効率よく反応でき、蛍光強度に優れた蛍光性物質を与える一酸化窒素測定試薬を提供することに成功した（特願２００２−８０２３０号明細書）。
本発明者らはさらに研究を進めた結果、インダセン誘導体の蛍光発色団にカルボキシ置換アルキル基などの置換基を導入することにより、さらに水溶性に優れた一酸化窒素測定用試薬を提供できること、及び該試薬が一酸化窒素をトラップして生成する蛍光性トリアゾール誘導体の蛍光強度がｐＨ変動によりほとんど影響を受けないことを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示し、該アミノ基のいずれか１つは置換基を有していてもよいアルキル基を１個有していてもよく；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｒ５及びＲ８はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ６及びＲ９はそれぞれ独立にカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基、アルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基、スルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基、又はアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基を示し、Ｒ７及びＲ１０はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す）で表される化合物又はその塩を提供するものである。
この発明の好ましい態様によれば、Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がメチル基である上記化合物又はその塩が提供される。また、本発明により、上記の化合物又はその塩を含む一酸化窒素測定用試薬が提供される。
別の観点からは、本発明により、下記の一般式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−（式中、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を示すか、又はＲ１１及びＲ１２はフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基（置換基を有していてもよいアルキル基又はアミノ基の保護基を有していてもよい）及びニトロ基の組み合わせを示し；Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｒ１５及びＲ１８はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ１６及びＲ１９はそれぞれ独立にカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基、アルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基、スルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基、又はアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基を示し、Ｒ１７及びＲ２０はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す］で表される化合物又はその塩が提供される。この発明の好ましい態様によれば、Ｒ１６及びＲ１９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ２０がメチル基である上記化合物又はその塩が提供される。
さらに別の観点からは、一酸化窒素の測定方法であって、（ａ）上記の一般式（Ｉ）で示される化合物を一酸化窒素と反応させる工程；及び、（ｂ）上記工程（ａ）において生成する一般式（ＩＩ）の化合物［ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−（式中、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を示す］を検出する工程を含む方法が本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、化合物（７）にＮＯＣ１３を添加して励起及び蛍光スペクトルの変化を測定した結果を示した図である。図中、（Ａ）は励起スペクトル（Ｅｍ：５３５ｎｍ）、（Ｂ）は蛍光スペクトル（Ｅｘ：５２０ｎｍ）を示す。蛍光強度の高い曲線から順にＮＯＣ１３濃度が５．０μＭ、２．０μＭ、１．０μＭ、０．５μＭ、及び０μＭの場合の結果を示す。
第２図は、化合物（７）にＮＯＣ１３を添加して反応生成物をＨＰＬＣで測定した結果を示した図である。
第３図は、種々のｐＨにおける化合物（７）及び（８）の蛍光強度を測定した結果を示した図である。
第４図は、化合物（９）のクロロホルム溶液にＮＯのクロロホルム溶液を添加した時の蛍光強度の変化を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本明細書において、特に言及しない場合にはアルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよい。アルキル部分を有する他の置換基（アルコキシ基）のアルキル部分についても同様である。また、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と言う場合には、置換基の種類、個数、置換位置は特に限定されないが、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれでもよい）、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、アルキルスルホネート基などを置換基として有していてもよい。また、本明細書においてアリール基という場合には、単環性又は多環性のアリール基のいずれであってもよいが、好ましくはフェニル基を用いることができる。アリール環についても同様である。
一般式（Ｉ）において、Ｒ３及び／又はＲ４がＣ１−６アルキル基又はＣ１−６アルコキシ基を示す場合には、それらの基はベンゼン環上の２−位及び６−位に結合することが好ましい。これらの基が存在すると量子収率や反応速度が向上し検出感度を高めることができる場合がある。Ｒ３及びＲ４が示すアルキル基としてはメチル基が好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が好ましい。Ｒ３及びＲ４がともに水素原子であることも好ましい。一般式（ＩＩ）におけるＲ１３及びＲ１４についても同様である。
Ｒ６及びＲ９が示すカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基はモノカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基であることが好ましい。カルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基のＣ１−６アルキル部分の炭素数は１ないし４であることが好ましく、さらに好ましくは２又は３であり、特に好ましいのは炭素数２である。Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であることが最も好ましい。Ｒ６及びＲ９が示すアルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基としては、上記のカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基のＣ１−６アルキルエステルを例示することができる。好ましくはエトキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基などである。Ｒ６及びＲ９が示すスルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基としては、モノスルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基が好ましい。Ｒ６及びＲ９が示すアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基としては、モノアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基が好ましい。アルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基におけるアルキルスルホネート基としてはＣ１−６アルキルスルホネート（Ｃ１−６アルキル−Ｏ−ＳＯ２−）が好ましい。Ｒ６及びＲ９がモノカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基である場合、特にＲ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基である場合には、化合物の水溶性が著しく高まり、かつ一酸化窒素との反応により生じる一般式（ＩＩ）で表される化合物の蛍光強度がｐＨ変動により影響を受けないという優れた効果が得られる。
Ｒ７及びＲ１０が示すアリール基としてはフェニル基が好ましい。フェニル基が置換基を有する場合、該置換基としてはスルホン酸基又はスルホネート基などが好ましく、特に好ましいのはスルホン酸基である。Ｒ７及びＲ１０が示すＣ１−６アルコキシカルボニル基としてはエトキシカルボニル基が好ましい。Ｒ７及びＲ１０が示すビニル基に存在する置換基としてはフェニル基、モノアミノフェニル基、又はジアミノフェニル基（例えば３，４−ジアミノフェニル基）などを挙げることができる。Ｒ７及びＲ１０が示すチエニル基又はピロリル基としては、それぞれ２−チエニル基又は２−ピロリル基が好ましい。Ｒ７及びＲ１０がアルキル基以外の基である場合には、化合物の蛍光波長が長波長側にシフトする場合がある。
一般式（Ｉ）において、Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であることがより好ましい。また、一般式（Ｉ）において、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０が置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基であることが好ましく、例えば、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がいずれもメチル基である化合物は本発明の好適な態様である。一般式（ＩＩ）におけるＲ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、及びＲ２０についても上記のＲ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０と同様である。
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示す。Ｒ１及びＲ２が共に無置換のアミノ基であってもよいが、Ｒ１及びＲ２のうちのいずれかは１個のアルキル基で置換されていてもよく、該アルキル基は１個又は２個以上の置換基を有していてもよい。アミノ基上に置換するアルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖のＣ１−１８アルキル基（好ましくはＣ１−６アルキル基）を挙げることができ、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などを用いることができる。アルキル基が置換基を有する場合の例としては、例えば、置換若しくは無置換のアリール基が置換したＣ１−６アルキル基（アラルキル基）などを挙げることができる。アリール置換アルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、パラメトキシベンジル基、パラエトキシカルボニルベンジル基、パラカルボキシベンジル基などを用いることができる。
上記の一般式（ＩＩ）において、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−基を示す。ここで、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す。該アルキル基としては、直鎖又は分枝鎖のＣ１−１８アルキル基（好ましくはＣ１−６アルキル基）を挙げることができ、該アルキル基が置換基を有する場合の例として、例えば、置換若しくは無置換のアラルキル基を挙げることができる。該アラルキル基としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、パラメトキシベンジル基、パラエトキシカルボニルベンジル基、パラカルボキシベンジル基などを用いることができる。
また、Ｒ１１及びＲ１２はフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基（１個の置換基を有していてもよい）及びニトロ基の組み合わせを示すが、Ｒ１１及びＲ１２のいずれか一方はアミノ基を示し、他方はニトロ基を示す。Ｒ１１及びＲ１２のいずれか一方が示すアミノ基は無置換であってもよいが、アルキル基、例えばＣ１−１８アルキル基、好ましくはＣ１−６アルキル基を１個有していてもよい。該アルキル基は置換基を有していてもよく、例えば、置換若しくは無置換のアラルキル基などがアミノ基に置換していてもよい。また、該アミノ基はアミノ基の保護基、例えば、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基などのアシル基；トリメチルシリル基などのアルキルシリル基などを有していてもよい。ベンジル基などのアラルキル基を保護基として利用してもよい。
上記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される本発明の化合物は塩を形成する場合もある。塩の種類は特に限定されず、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、クエン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。また、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はメチルアミン塩、トリエチルアミン塩などの有機アミン塩を挙げることができる。さらに、グリシンなどのアミノ酸の塩を形成する場合もある。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらの具体例に限定されることはない。
上記一般式（Ｉ）又は一般式（ＩＩ）で表される本発明の化合物は１個または２個以上の不斉炭素を有している場合がある。従って、１個または２個以上の不斉炭素に基づく光学的に純粋な形態の任意の光学異性体、光学異性体の任意の混合物、ラセミ体、純粋な形態のジアステレオ異性体、ジアステレオ異性体の混合物などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、本発明の化合物は水和物や溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。
上記の一般式（Ｉ）で表される化合物及び一般式（ＩＩ）で表される化合物（ただし、Ｒ１１及びＲ１２がフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基及びニトロ基の組み合わせを示す化合物）のうち、代表的化合物としてＲ３及びＲ４が水素原子であり、Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がいずれもメチル基である化合物、並びにＲ１３及びＲ１４が水素原子であり、Ｒ１６及びＲ１９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ２０がいずれもメチル基である化合物の製造例が本明細書の実施例に具体的に示されている。従って、上記の一般式（ＩＩ）で表される化合物が一般式（Ｉ）で表される化合物の製造中間体として有用であることが理解されよう。また、一般式（ＩＩ）で示される化合物のうち、Ｒ１１及びＲ１２が互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−基を示す化合物については、上記一般式（Ｉ）で表される化合物と一酸化窒素とを反応させることにより製造可能である。この化合物は、後述のように強い蛍光性を有しており、一酸化窒素の測定に有用である。
本明細書の実施例の具体的説明を参照することにより、一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）に包含される化合物を容易に製造できることが当業者には理解されよう。また、インダセン骨格については、例えば、特開平１０−３３８６９５号公報及び特開平１１−５７９６号公報のほか、Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，２５，ｐｐ．２８９−２９２，２００１；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２，ｐｐ．６７１１−６７１３，２００１；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４０，ｐｐ．３８５−３８７，２００１；及び特願２００２−８０２３０号明細書などに合成方法が示されているので、これらの刊行物を参照することにより当業者は本発明の化合物をさらに容易に製造可能である。
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、中性条件下において一酸化窒素と効率的に反応して、収率よく一般式（ＩＩ）の化合物（ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−基を示す化合物）を生成する性質を有している。一般式（Ｉ）で表される化合物自体は、中性条件下において４８５ｎｍ程度の励起光を照射した場合にはほとんど蛍光を発しないが、上記一般式（ＩＩ）の化合物は同じ条件下において極めて強い蛍光を発する性質を有している。従って、一般式（Ｉ）で表される化合物を生体組織中や細胞内に取り込ませて一酸化窒素と反応させ、蛍光性の上記一般式（ＩＩ）の化合物を生成させてこの化合物の蛍光を測定することにより、生体組織中や細胞内の一酸化窒素を測定することができる。特に、本発明の一般式（Ｉ）の化合物は一酸化窒素との反応性に優れており、高感度かつ正確に一酸化窒素の測定を行なえるという優れた特徴を有している。
従って、本発明により提供される一酸化窒素の測定方法は、一般式（Ｉ）で表される化合物と一酸化窒素とを反応させて一般式（ＩＩ）の化合物を生成させ、一般式（ＩＩ）の化合物（ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−基を示す化合物）の蛍光を測定する工程を含んでいる。本明細書において「測定」という用語は、検出、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。上記反応は好ましくは中性条件下に行うことができ、例えば、ｐＨ６．０〜８．０の範囲、好ましくはｐＨ６．５〜７．８の範囲、より好ましくはｐＨ６．８〜７．６の範囲で行うことができる。もっとも、本発明の化合物を用いた一酸化窒素の測定は中性領域ないし弱酸性領域に限定されることはなく、例えば、胃の粘膜細胞など強酸性の条件においても測定が可能である。特に、本発明の一般式（ＩＩ）で表される化合物は広範囲なｐＨにおいて蛍光強度が変化しないという極めて優れた性質を有しており、ｐＨ変動の影響を受けずに正確な測定が可能である。
蛍光の測定は、従来公知の蛍光測定方法に準じて行うことができる（例えば、Ｗｉｅｒｓｍａ，Ｊ．Ｈ．，Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．，３，ｐｐ．１２３−１３２，１９７０；Ｓａｗｉｃｋｉ，Ｃ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．，４，ｐｐ．７６１−７７５，１９７１；Ｄａｍｉａｎｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｂｕｒｉｎｉ，Ｇ．，Ｔａｌａｎｔａ，８，ｐｐ．６４９−６５２，１９８６；Ｄａｍｉａｎｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｂｕｒｉｎｉ，Ｇ．，Ｔａｌａｎｔａ，８，ｐｐ．６４９−６５２，１９８６；Ｍｉｓｋｏ，Ｔ．Ｐ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４，ｐｐ．１１−１６，１９９３などの刊行物を参照）。本発明の一酸化窒素測定においては、例えば、励起光として５２０ｎｍ程度の光を照射し、５３５ｎｍ程度の蛍光を測定することが好ましい。本発明の一般式（ＩＩ）で表される化合物は、長波長の励起光によっても充分な蛍光強度を与えるという優れた性質があり、生体や組織、細胞などへの障害を軽減することが可能である。また、このような波長の光を用いると、汎用の蛍光顕微鏡に備えられた蛍光フィルターでも効率的に分光することができ、特殊なフィルターを用いずに高感度な測定が可能になる。
特に高感度な測定が必要な場合には、上記の一酸化窒素の測定を酸素源の存在下に行ってもよい。酸素源としては、例えば、酸素、オゾン、又はオキシド化合物などを用いることが可能である。酸素としては、一般的には溶存酸素を用いることができるが、必要に応じて、反応系内に酸素ガスを導入するか、酸素発生用試薬（例えば、過酸化水素など）を添加してもよい。オキシド化合物としてはＮ−Ｏ，Ｓ−Ｏ，Ｐ−Ｏなど容易に酸素原子が開裂されるオキシド結合を有する化合物であれば特に限定されないが、例えば、ＰＴＩＯ（２−フェニル−４，４，５，５−テトラメチルイミダゾリン−１−オキシル−３−オキシド：Ｍａｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．，５６，ｐｐ．５８８−５９２，１９９４；Ａｋａｉｋｅ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，ｐｐ．８２７−８３２，１９９３）またはその誘導体（ＰＴＩＯのフェニル基のｐ−位にカルボキシル基が導入されたカルボキシＰＴＩＯなど）、トリフェニルホスフィンオキサイド、トリエチルアミンオキサイドなどを用いることができる。
上記のオキシド化合物のうち、ＰＴＩＯ及びその誘導体（例えばカルボキシＰＴＩＯなど）は特に好ましい化合物であり、当業者に容易に入手可能な化合物である（東京化成株式会社、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃａｔａｌｏｇ，３２，１９９４などに記載されている）。なお、オキシド化合物はそれ自体を反応試薬として用いてもよいが、リポソーム等に封入したものを用いることもできる。酸素源の量は特に限定されないが、少なくとも測定すべき一酸化窒素に対して１μＭ以上、好ましくは１０〜３０μＭ、より好ましくは１０〜２０μＭ程度の量であることが好ましい。生体試料などの測定では、試料中に１０〜２０μＭ程度の量を添加することが好ましいが、一般的には、溶存酸素により必要量の酸素源が供給される。酸素源の量が極端に少ないと測定感度が低下する場合があり、酸素源の量が極端に多いと蛍光による発光に不都合を生じる場合がある。従って、測定すべき一酸化窒素の量を予試験若しくは公知の方法で予測して適宜の濃度範囲の酸素源を添加することが好ましい。反応は１０〜２５℃の温度範囲で行うことが可能である。なお、蛍光プローブを用いた一酸化窒素の測定方法に関しては長野哲雄ら、化学と教育、４７、ｐｐ．６６５−６６９、１９９９などに詳細に記載されているので、当業者は上記刊行物を参照しつつ、本発明の化合物を用いて高感度に一酸化窒素を測定することができる。
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
（１）４−アセトアミド−３−ニトロベンズアルデヒド
氷冷下、濃硫酸６ｍＬに発煙硝酸１ｍＬを３回に分けて加えて混酸を調製し、４−アセトアミドゼンズアルデヒド（１．９１ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。添加後、直ちに反応液を氷に注ぎ、固形物を濾取した。冷水でよく洗浄して乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ＣＨ２Ｃｌ２）で精製した後、水から再結晶して目的化合物を淡黄色の針状固体として得た（１．５７ｇ，ｙ．６４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
２．３６（３Ｈ，ｓ），８．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７９，１．６５Ｈｚ），８．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６５Ｈｚ），９．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ），９．９９（１Ｈ，ｓ），１０．６３（１Ｈ，ｓ）
ＭＳ（Ｅｌ）２０８（Ｍ＋）
ｍ．ｐ．１５６℃
（２）４−アミノ−３−ニトロベンズアルデヒド
４−アセトアミド−３−ニトロベンズアルデヒド（２．０８ｇ，１０ｍｍｏｌ）をメタノール２００ｍＬに溶解した。その溶液に２Ｎ ＨＣｌ水溶液５０ｍＬを加え、アルゴン気流下で８０℃で８時間加熱還流した。反応液を減圧濃縮してメタノールを除き、残渣を２Ｎ ＮａＯＨ水溶液で塩基性にしてジクロルメタンで５回抽出した。有機相を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮し、目的化合物を黄色固体として得た（１．６２ｇ，ｙ．９８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
６．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５８Ｈｚ），７．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５８，２．０１Ｈｚ），８．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ），９．８２（１Ｈ，ｓ）
ＭＳ（Ｅｌ）１６６（Ｍ＋）
（３）３−（２−メトキシカルボニルエチル）−２，４−ジメチルピロール
メチル５−（ベンジルオキシカルボニル）−２，４−ジメチル−３−ピロールプロピオネート（３．１ｇ，９．８ｍｍｏｌ）をアセトン１００ｍＬに溶解した。この溶液に１０％Ｐｄ−Ｃを加えて水素ガス下で室温にて攪拌した。原料が消失したところで反応液をろ過し、母液を減圧蒸留した。残渣にトリフルオロ酢酸１０ｍＬを加え、アルゴン気流下で４０℃にて１０分間加熱した。反応混合物にクロロホルムを加えて水で１回洗浄し、水層をクロロホルムで２回抽出した。有機相を合わせてＮａ２ＣＯ３水溶液で１回、水で１回洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して目的化合物を褐色液体として得た（１．６ｇ，ｙ．９０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
２．０３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９０Ｈｚ），２．１８（３Ｈ，ｓ），２．４５（２Ｈ，ｍ），２．７２（２Ｈ，ｍ），３．６７（３Ｈ，ｓ），６．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．９０Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｓ）
ＭＳ（Ｅｌ）１８１（Ｍ＋）
（４）６−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４’−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−３，３’，５，５’−テトラメチルピロメテン
４−アミノ−３−ニトロベンズアルデヒド（７６０ｍｇ，４．５８ｍｍｏｌ）と３−（２−メトキシカルボニルエチル）−２，４−ジメチルピロール（１．６ｇ，９．１６ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬのジクロルメタンに溶解した。アルゴン気流下でこの溶液に数滴のトリフルオロ酢酸を加え、室温で一晩遮光して攪拌した。薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロルメタン，シリカゲル）で原料消失を確認してジクロロジシアノパラベンゾキノン（ＤＤＱ，１．０７ｇ，４．５８ｍｍｏｌ）のジクロルメタン溶液１２０ｍＬを加えた。反応混合物を１５分攪拌した後に水で１回洗い、無水ＭｇＳＯ４で乾燥して減圧濃縮した。残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；メタノール／ジクロルメタン＝１／２０）で精製して目的化合物を得た（ｙ．７６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
１．３７（６Ｈ，ｓ），２．３３（６Ｈ，ｓ），２．３６（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４３，７．１４Ｈｚ），２．６３（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４３，７．１４Ｈｚ），３．６５（６Ｈ，ｓ），６．３２（２Ｈ，ｓ），６．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６１Ｈｚ），７．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６１，２．０１Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）５０８（Ｍ＋）
（５）８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４−ジフルオロ−２，６−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン
６−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４’−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−３，３’，５，５’−テトラメチルピロメテン（２１３ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのジクロルメタンに溶解した。アルゴン気流下でジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，１ｍＬ，５．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌した。さらにボロントリフルオライド・ジエチルエーテラート（１ｍＬ，７．９ｍｍｏｌ）を加えて４０分間攪拌した。添加して少しすると蛍光が出現した。反応終了後、反応混合物を水で１回、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液で２回洗浄し、水層とＮａＯＨ層を合わせてジクロルメタンで３回抽出した。有機相を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮し、残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；メタノール／ジクロルメタン＝１／２０）で精製して目的化合物を橙色固体として得た（７２ｍｇ，ｙ．３１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
１．４６（６Ｈ，ｓ），２．３７（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２５，７．３２Ｈｚ），２．５４（６Ｈ，ｓ），２．６５（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２５，７．３２Ｈｚ），３．６６（６Ｈ，ｓ），６．３２（２Ｈ，ｓ），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４０Ｈｚ），７．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４０，１．８３Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８３Ｈｚ）
ＭＳ（Ｅｌ）５５６（Ｍ＋）
（６）８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−２，６−ビス−（２−カルボキシエチル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン
８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４−ジフルオロ−２，６−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（１８２．５ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）をメタノール１００ｍＬに溶解し、この溶液に０．２Ｎ ＮａＯＨ水溶液１０ｍＬを加えて８０℃で１時間加熱還流した。反応液を減圧濃縮してメタノールを除き、２ＮのＨＣｌ水溶液で酸性にして酢酸エチルで３回抽出した。有機相を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；メタノール／ジクロルメタン＝１／１０）で精製して目的化合物を得た（８７．１ｍｇ，ｙ．５０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）
１．４４（６Ｈ，ｓ），２．２６（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８６，７．３２Ｈｚ），２．４０（６Ｈ，ｓ），２．５７（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８６，７．３２Ｈｚ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６１Ｈｚ），７．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６１，２．０１Ｈｚ），７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ）５２８（Ｍ＋）
（７）８−（３，４−ジアミノフェニル）−２，６−ビス−（２−カルボキシエチル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＨ）
８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−２，６−ビス−（２−カルボキシエチル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（８７．１ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）をメタノール１００ｍＬに溶解し、この溶液に１０％Ｐｄ−Ｃを加えて水素ガス下で室温にて攪拌した。原料消失を確認した後、反応混合物をろ過して母液を減圧蒸留し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；Ｈ２Ｏ／アセトニトリル＝１／１０）で精製して目的化合物を茶褐色固体として得た（３１．５ｍｇ，ｙ．３８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）
１．５１（６Ｈ，ｓ），２．２８（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４０．７．１４Ｈｚ），２．４７（６Ｈ，ｓ），２．６４（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．４０，７．１４Ｈｚ），６．４６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８６，２．０１Ｈｚ），６．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．０１Ｈｚ），６．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８６Ｈｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ）４９８（Ｍ＋）
（８）８−（５−ベンゾトリアゾリル）−２，６−ビス−（２−カルボキシエチル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＨ−Ｔ）
ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＨ（１７．４ｍｇ，０．０３５ｍｍｏｌ）に１ＮのＨＣｌ水溶液を２０ｍＬ加え、この溶液を氷冷下で攪拌しながらＮａＮＯ２（２．５ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）の水溶液を少量ずつ加えた。添加終了後に反応液を室温に戻し、１５分間攪拌した。溶液を酢酸エチルで３回抽出し、有機相を合わせて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；Ｈ２Ｏ／アセトニトリル＝１／１０）で精製して目的化合物を赤褐色固体として得た（１４．６ｍｇ，ｙ．８２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）
１．２４（６Ｈ，ｓ），２．３０（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２５，７．１４Ｈｚ），２．５１（６Ｈ，ｓ），２．６３（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２５，７．１４Ｈｚ），７．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４３Ｈｚ），７．８９（１Ｈ，ｓ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４３Ｈｚ）
ＭＳ（ＦＡＢ）５０９（Ｍ＋）
（９）８−（３，４−ジアミノフェニル）−４，４−ジフルオロ−２，６−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＭｅ）
８−（４−アミノ−３−ニトロフェニル）−４，４−ジフルオロ−２，６−ビス−（２−メトキシカルボニルエチル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（１３１ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのジクロルメタンに溶解し，さらにメタノール１００ｍｌを加えた。この溶液に１０％Ｐｄ−Ｃを加えて水素ガス下で室温にて一晩攪拌した。アルミナＴＬＣ（展開溶媒；ジクロルメタン）で原料消失を確認した後、反応混合物をろ過して母液を減圧濃縮し、残渣をアルミナカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロルメタン）で精製した（８５ｍｇ，ｙ．６８％）。ヘキサン／クロロホルムより再結晶を行った。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
１．４４（６Ｈ，ｓ），２．３５（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６１，７．３２Ｈｚ），２．５３（６Ｈ，ｓ），２．６４（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６１，７．３２Ｈｚ），３．４６（２Ｈ，ｓ），３．５４（２Ｈ，ｓ），３．６６（６Ｈ，ｓ），６．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３９Ｈｚ），６．５６（ｓ，１Ｈ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３９Ｈｚ）
ＭＳ（ＥＳｌ）５４９（［Ｍ＋Ｎａ］＋）
例２：試験例
（ａ）蛍光スペクトル
化合物（７）及び化合物（８）の蛍光特性を測定した。量子収率はＦ−４５００（日立）、それ以外のスペクトルはＬＳ５０Ｂ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。０．２％未満のジメチルスルホキシドを共溶媒として０．１Ｍナトリウム−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に溶解して２０℃で測定した。量子収率は０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液中でのフルオレセインを０．８５として算出した。結果を表１に示す。対照として一般式（Ｉ）においてＲ６及びＲ９が水素原子である化合物（ｐ−ＤＡＭＢＯ）及び一般式（ＩＩ）においてＲ１６及びＲ１９が水素原子である化合物（ｐ−ＤＡＭＢＯ−Ｔ）について同様に量子収率の測定を行ったところ、それぞれ０．００１及び０．４０であり、本発明の化合物では大きな量子収率が得られることが分かった。また、本発明の化合物ではストークスシフトが１６ｎｍであり、対照として用いたｐ−ＤＡＭＢＯ及びｐ−ＤＡＭＢＯ−Ｔよりも大きく、フルオレセインとほぼ同程度の大きなストークスシフトが得られた（ｐ−ＤＡＭＢＯ及びｐ−ＤＡＭＢＯ−Ｔのストークスシフトはともに９ｎｍである）。
（ｂ）一酸化窒素との反応
化合物（７）に一酸化窒素発生試薬であるＮＯＣ１３を添加して励起及び蛍光スペクトルの変化を測定した。０．１Ｍナトリウム−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で化合物（７）５μＭ（０．１％ＤＭＳＯ共溶媒）とＮＯＣ１３を３７℃で１時間インキュベートしてから励起及び蛍光スペクトルを測定した。測定はスリット幅をＥｘ／Ｅｍ＝２．５／２．５ｎｍとし、励起波長を５２０ｎｍ、蛍光波長を５３５ｎｍとして行った。結果を図１に示す。ＮＯＣ１３の添加濃度に依存して蛍光の増加が認められた。また、０．１Ｍナトリウム−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で化合物（７）５μＭ（０．１％ＤＭＳＯ共溶媒）とＮＯＣ１３（２０μＭ）を３７℃で１時間インキュベートしてから、反応物をＨＰＬＣで分析した結果を図２に示す。ＨＰＬＣ条件はカラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３４．６×２５０ｍｍ、溶出液：０．１％Ｈ３ＰＯ４水溶液／アセトニトリル＝５５／４５（ｖ／ｖ）、検出：ＵＶ−ｖｉｓ（５２０ｎｍ）／蛍光（５２０／５３５ｎｍ）、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、試料容量：５μＬとした。化合物（７）と一酸化窒素との反応が極めて速やかに起こることが確認できた。
（ｃ）蛍光強度のｐＨによる変動
化合物（７）及び（８）を種々のｐＨに調整した０．１Ｍナトリウム−リン酸バッファー（０．１％ＤＭＳＯ共溶媒）に溶解して、上記（ｂ）と同様にして蛍光を測定した。結果を図３に示す。化合物（８）はｐＨ３から１３に至る極めて広範囲なｐＨにおいて蛍光強度がほとんど変化していないことが確認できた。従って、本発明の化合物を用いた一酸化窒素の測定では、ｐＨ変動を伴う生体試料においても極めて精度の高い測定が可能である。
（ｄ）化合物（９）（ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＭｅ）の有機溶媒中におけるＮＯとの反応による蛍光の変化を測定した。１μＭ ＤＡＭＢＯ−ＰＭｅクロロホルム溶液に、ＮＯのクロロホルム溶液（クロロホルムにアルゴンガスを１０分バブル後、ＮＯガスを３分バブルして作成した）を１分に５μＬ添加して、１０分測定した。スリット幅は、Ｅｘ／Ｅｍ＝５．０／０ｎｍ、励起波長５２０ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで測定した。結果を図４に示す。ｐ−ＤＡＭＢＯ−ＰＭｅを用いることにより、有機溶媒中でのＮＯの測定が可能であることが図４に示されている。これより、本発明の化合物は細胞膜透過性を有し、生体膜などの脂溶性環境でもＮＯを効率よく検出することが可能であることが分かる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示し、該アミノ基のいずれか１つは置換基を有していてもよいアルキル基を１個有していてもよく；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｒ５及びＲ８はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ６及びＲ９はそれぞれ独立にカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基、アルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基、スルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基、又はアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基を示し、Ｒ７及びＲ１０はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す）で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がメチル基である請求の範囲第１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ６及びＲ９が２−メトキシカルボニル−１−エチル基であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がメチル基である請求の範囲第１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含む一酸化窒素測定用試薬。
【請求項５】
下記の一般式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−（式中、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を示すか、又はＲ１１及びＲ１２はフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基（置換基を有していてもよいアルキル基又はアミノ基の保護基を有していてもよい）及びニトロ基の組み合わせを示し；Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｒ１５及びＲ１８はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ１６及びＲ１９はそれぞれ独立にカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基、アルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基、スルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基、又はアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基を示し、Ｒ１７及びＲ２０はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す］で表される化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｒ１６及びＲ１９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ２０がメチル基である請求の範囲第５項に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
Ｒ１６及びＲ１９が２−メトキシカルボニル−１−エチル基であり、Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ２０がメチル基である請求の範囲第５項に記載の化合物又はその塩。
【請求項８】
一酸化窒素の測定方法であって、（ａ）請求の範囲第１項に記載の一般式（Ｉ）で示される化合物を一酸化窒素と反応させる工程；及び、（ｂ）上記工程（ａ）において生成する請求の範囲第５項に記載の一般式（ＩＩ）の化合物［ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−（式中、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を示す］を検出する工程を含む方法。
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基を示し、該アミノ基のいずれか１つは置換基を有していてもよいアルキル基を１個有していてもよく；Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｒ５及びＲ８はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ６及びＲ９はそれぞれ独立にカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基、アルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基、スルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基、又はアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基を示し、Ｒ７及びＲ１０はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す）で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｒ６及びＲ９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がメチル基である請求の範囲第１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
Ｒ６及びＲ９が２−メトキシカルボニル−１−エチル基であり、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ１０がメチル基である請求の範囲第１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求の範囲第１項から第３項のいずれか一項に記載の化合物又はその塩を含む一酸化窒素測定用試薬。
【請求項５】
下記の一般式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−（式中、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を示すか、又はＲ１１及びＲ１２はフェニル環上の隣接した位置に置換するアミノ基（置換基を有していてもよいアルキル基又はアミノ基の保護基を有していてもよい）及びニトロ基の組み合わせを示し；Ｒ１３及びＲ１４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はＣ１−６アルコキシ基を示し、Ｒ１５及びＲ１８はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を示し、Ｒ１６及びＲ１９はそれぞれ独立にカルボキシ置換Ｃ１−６アルキル基、アルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルキル基、スルホン酸置換Ｃ１−６アルキル基、又はアルキルスルホネート置換Ｃ１−６アルキル基を示し、Ｒ１７及びＲ２０はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいＣ１−６アルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいビニル基、置換基を有していてもよいチエニル基、又は置換基を有していてもよいピロリル基を示す］で表される化合物又はその塩。
【請求項６】
Ｒ１６及びＲ１９が２−カルボキシ−１−エチル基であり、Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ２０がメチル基である請求の範囲第５項に記載の化合物又はその塩。
【請求項７】
Ｒ１６及びＲ１９が２−メトキシカルボニル−１−エチル基であり、Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８、及びＲ２０がメチル基である請求の範囲第５項に記載の化合物又はその塩。
【請求項８】
一酸化窒素の測定方法であって、（ａ）請求の範囲第１項に記載の一般式（Ｉ）で示される化合物を一酸化窒素と反応させる工程；及び、（ｂ）上記工程（ａ）において生成する請求の範囲第５項に記載の一般式（ＩＩ）の化合物［ただし、Ｒ１１及びＲ１２は互いに結合してフェニル環上の隣接した位置に環を形成する−Ｎ＝Ｎ−ＮＲ３０−（式中、Ｒ３０は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基を示す］を検出する工程を含む方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７６４６６
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０２９６５（Ｐ２００５−５０２９６５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２４０７
【国際出願日】平成１６年２月２７日（２００４．２．２７）
【出願人】（５９５１０８０４４）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２４０７
【国際出願日】平成１６年２月２７日（２００４．２．２７）
【出願人】（５９５１０８０４４）
【出願人】（３９００３７３２７）第一化学薬品株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
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