蛍光寿命イメージング
一位置からの蛍光を測定する方法であって、該方法は、第１のデューティサイクルを有する第１の蛍光励起信号を上記位置に加えることと、第１の励起信号に応答して上記位置から発する蛍光を第１の結果として蓄積することと、第２のデューティサイクルを有する第２の蛍光励起信号を上記位置に加えることと、第２の励起信号に応答して上記位置から発する蛍光を第２の結果として蓄積することと、上記位置についての比較結果を提供するために第１の結果と第２の結果とを比較することとを含む。本発明は、また、この方法を実施するための装置にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル物質内の蛍光物質の蛍光寿命に基づいてサンプル物質を評価する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光寿命イメージング（ＦＬＩＭ）は、よく知られた顕微鏡検査技術である。ＦＬＩＭには、２つの主要タイプ、すなわち時間領域ＦＬＩＭと周波数領域ＦＬＩＭとがある。
【０００３】
時間領域ＦＬＩＭでは、顕微鏡検査サンプル内の蛍光を励起させるために、レーザエネルギの衝撃が使用されるのが通常である。次いで、結果得られた蛍光を抽出するために、高サンプリングレートの検出器が使用され、捕えられたサンプル配列に現れるであろう指数級数的減衰傾向から、寿命が抽出される。検出器のサンプリングレートは、通常１０９ヘルツの範囲でなければならず、このような性能を持つ構成要素は、比較的高価である。
【０００４】
周波数領域ＦＬＩＭでは、顕微鏡検査サンプル内の蛍光を励起させるために、正弦波状に変調された光線が使用されるのが通常である。時間領域ＦＬＩＭの場合と同様に、蛍光のサンプリングには、比較的高速な検出器が必要とされる。蛍光は、刺激レーザに加えられた変調と比べて位相はずれるが周波数は同じである正弦波変調を示すはずである。更に、刺激レーザの変調を、被検出蛍光の波形に同期化させるには、比較的高いクロックレートの電子機器が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、以下で参照にされる添付の特許請求の範囲によって定められる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】蛍光寿命イメージング顕微鏡（ＦＬＩＭ）の概略を示したブロック図である。
【図２】図１の顕微鏡によって作成された結果から計算されたパラメータの変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
添付の図面を参照にし、単なる例として、本発明の特定の実施形態が説明される。
【０００８】
図１は、高エネルギのパルスレーザ１２と、光入力システム１４と、光出力システム１６と、蛍光検出器１８と、コンピュータ２０とを含む光学システム１０を示している。図示されるように、システム１０のなかに、サンプル２２が設置される。この例では、サンプルは、サンプル２２に導入された蛍光ナノ結晶（量子ドット）状のフルオロフォア（蛍光標識試薬）で着色された細胞群を固定したスライドである。光入力システム１４は、レーザ１２からの光をサンプル２２内へ導く働きをし、そこで、光は、フルオロフォアを刺激する。フルオロフォアによって発せられた蛍光は、次いで、光出力システム１６によって集められ、検出器１８によって記録される。この例では、検出器１８は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラである。検出器によって生成されるデジタル信号は、処理のために、コンピュータ２０に供給される。
【０００９】
レーザ１２は、フルオロフォアを励起させるために、パルス状の放射を発する。レーザ１２によって発せられる放射のデューティサイクルは、最大数百ＭＨｚまで変化させられる繰り返し率でのピコ秒単位の幅のパルスによって特徴付けられる。
【００１０】
この例では、レーザ１２は、検査されている細胞よりも広いスライド上の一領域を照射し、検出器１８は、その被照射領域からの蛍光の画像を捕える。もちろん、ほかの実施形態では、光入力システム１４は、サンプル２２に対して点状の照射を供給し、その照射点をサンプル上で移動可能にするためのスキャン構成を含む。このような場合は、検出器１８は、より複雑なＣＣＤカメラではなく、比較的単純な光検出器を用いるのが通常である。
【００１１】
コンピュータ２０は、サンプル２２の被照射領域の画像用の対応するピクセルを作成するために、各ＣＣＤの出力を処理する。この処理を説明するための前触れとして、次に、蛍光励起及びフルオロフォア減衰の物理特性について簡単に論じる。
【００１２】
フルオロフォアは、レーザパルスからの光を吸収するときに、基底状態から励起状態に移行し、その幾らか後に、基底状態に戻り、その過程において蛍光を発する。したがって、レーザパルスによる励起後、サンプル２２によって発せられた蛍光は、減衰し、蛍光寿命τによって特徴付けられる指数関数を使用して記述することができる。要するに、励起パルスから時間ｔの経過後、蛍光の強度は、ｅ−ｔ／τに比例する。
【００１３】
レーザ１２のパルスは、連続する２つのパルスの開始と開始との間の幅がＴであるような繰り返し周波数ｆを有するものとする。もしＴがτ未満である場合は、フルオロフォアの大半は、励起状態から基底状態へ減衰する時間が無く、励起状態のフルオロフォアの亜集団が常在する結果となる。この状況では、フルオロフォアによるパルスレーザ放射の全体的な吸収が飽和し、これは、フルオロフォアの励起効率の低下、及びレーザのデューティサイクルＴにわたって積分される蛍光の減少を招く。
【００１４】
数学的には、レーザ１２の１デューティサイクルの間に検出器１８のＣＣＤに入射する蛍光のエネルギＥは、
【数１】
である。ここで、κは、ボルツマン定数であり、αＰは、サイクルごとの励起事象の数に関係している。カメラのＣＣＤからの出力値は、カメラによるサンプリング時間内のＥの蓄積に比例する（又は別の言い方ではその積分に比例する）。
【００１５】
図２は、ＥがＴによってどのように変化するかを明らかにしており、フルオロフォアがレーザ１２によって励起されるときのＥを１／Ｔ（すなわちｆ）に対して示したものである。実線２４は、蛍光寿命がτ１であるときの結果を表わしており、破線２６は、蛍光寿命がτ２であるときの結果を表わしている。ここで、τ１＞τ２である。τ１及びτ２のいずれの場合も、Ｅは、ｆが低いところでは定常状態にあり、ｆの増大とともに低下することが明らかであり、この低下は、τ１の場合に、より早く（すなわちｆがより低いところで）生じる。いずれの場合も、平坦域からの離脱は、Ｔが蛍光寿命のおよそ２倍を切ったときに始まる。
【００１６】
コンピュータ２０は、それぞれのレーザパルス周波数ｆ１及びｆ２において、サンプル２２の第１及び第２の画像を捕える。カメラ内におけるｊ番目のＣＣＤの場合、第１の画
像に対応する（すなわちレーザパルス周波数がｆ１であるときの）その出力値は、Ｓ１，ｊであり、第２の画像（すなわちレーザパルス周波数がｆ２であるときの）に対応するその出力値はＳ２，ｊである。コンピュータ２０は、
【数２】
として定義されるｊ番目のＣＣＤの場合の比率Ｒを計算する。これは、励起パルス周波数ｆ１とｆ２との差を打ち消すための正規化を経た後における値Ｓ１，ｊとＳ２，ｊとの比率である。このスケーリングが実施されないと、比率は、Ｓ２，ｊがＳ１，ｊよりもｆ２／ｆ１上回る励起サイクルにわたる積分の測定値であるという事実によって偏りを示す。周波数ｆ１及びｆ２は、イメージングされているフルオロフォアのＥがｆ１とｆ２とで顕著に異なることによってコントラスト写真が作成可能であるように選択される。ｆ１及びｆ２がともに、図２に示されたＥ関数の平坦域内にあるときは、明らかに、コントラストを得ることが概して不可能である。したがって、通常は、１／ｆ１は、フルオロフォア寿命の２倍より大きく設定され、１／ｆ２は、フルオロフォア寿命より小さく設定される。
【００１７】
コンピュータ２０は、検出器１８のカメラの各ＣＣＤについて値Ｒを計算する。この一連のＲ値は、次いで、サンプルの画像を構成するピクセルの配列として表示される。
【００１８】
したがって、（時間領域ＦＬＩＭ及び周波数領域ＦＬＩＭで必要とされる電子機器と比べて）応答の遅いＣＣＤカメラを使用し、カメラの各ＣＣＤによって、受信された蛍光をレーザ１２の多数デューティサイクルにわたって積分した結果である出力値を生成することによって、サンプルのコントラスト画像を得ることができる。
【００１９】
別の一実施形態では、レーザ１２に代わってパルスＬＥＤが使用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル物質内の蛍光物質の蛍光寿命に基づいてサンプル物質を評価する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光寿命イメージング（ＦＬＩＭ）は、よく知られた顕微鏡検査技術である。ＦＬＩＭには、２つの主要タイプ、すなわち時間領域ＦＬＩＭと周波数領域ＦＬＩＭとがある。
【０００３】
時間領域ＦＬＩＭでは、顕微鏡検査サンプル内の蛍光を励起させるために、レーザエネルギの衝撃が使用されるのが通常である。次いで、結果得られた蛍光を抽出するために、高サンプリングレートの検出器が使用され、捕えられたサンプル配列に現れるであろう指数級数的減衰傾向から、寿命が抽出される。検出器のサンプリングレートは、通常１０９ヘルツの範囲でなければならず、このような性能を持つ構成要素は、比較的高価である。
【０００４】
周波数領域ＦＬＩＭでは、顕微鏡検査サンプル内の蛍光を励起させるために、正弦波状に変調された光線が使用されるのが通常である。時間領域ＦＬＩＭの場合と同様に、蛍光のサンプリングには、比較的高速な検出器が必要とされる。蛍光は、刺激レーザに加えられた変調と比べて位相はずれるが周波数は同じである正弦波変調を示すはずである。更に、刺激レーザの変調を、被検出蛍光の波形に同期化させるには、比較的高いクロックレートの電子機器が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、以下で参照にされる添付の特許請求の範囲によって定められる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】蛍光寿命イメージング顕微鏡（ＦＬＩＭ）の概略を示したブロック図である。
【図２】図１の顕微鏡によって作成された結果から計算されたパラメータの変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
添付の図面を参照にし、単なる例として、本発明の特定の実施形態が説明される。
【０００８】
図１は、高エネルギのパルスレーザ１２と、光入力システム１４と、光出力システム１６と、蛍光検出器１８と、コンピュータ２０とを含む光学システム１０を示している。図示されるように、システム１０のなかに、サンプル２２が設置される。この例では、サンプルは、サンプル２２に導入された蛍光ナノ結晶（量子ドット）状のフルオロフォア（蛍光標識試薬）で着色された細胞群を固定したスライドである。光入力システム１４は、レーザ１２からの光をサンプル２２内へ導く働きをし、そこで、光は、フルオロフォアを刺激する。フルオロフォアによって発せられた蛍光は、次いで、光出力システム１６によって集められ、検出器１８によって記録される。この例では、検出器１８は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラである。検出器によって生成されるデジタル信号は、処理のために、コンピュータ２０に供給される。
【０００９】
レーザ１２は、フルオロフォアを励起させるために、パルス状の放射を発する。レーザ１２によって発せられる放射のデューティサイクルは、最大数百ＭＨｚまで変化させられる繰り返し率でのピコ秒単位の幅のパルスによって特徴付けられる。
【００１０】
この例では、レーザ１２は、検査されている細胞よりも広いスライド上の一領域を照射し、検出器１８は、その被照射領域からの蛍光の画像を捕える。もちろん、ほかの実施形態では、光入力システム１４は、サンプル２２に対して点状の照射を供給し、その照射点をサンプル上で移動可能にするためのスキャン構成を含む。このような場合は、検出器１８は、より複雑なＣＣＤカメラではなく、比較的単純な光検出器を用いるのが通常である。
【００１１】
コンピュータ２０は、サンプル２２の被照射領域の画像用の対応するピクセルを作成するために、各ＣＣＤの出力を処理する。この処理を説明するための前触れとして、次に、蛍光励起及びフルオロフォア減衰の物理特性について簡単に論じる。
【００１２】
フルオロフォアは、レーザパルスからの光を吸収するときに、基底状態から励起状態に移行し、その幾らか後に、基底状態に戻り、その過程において蛍光を発する。したがって、レーザパルスによる励起後、サンプル２２によって発せられた蛍光は、減衰し、蛍光寿命τによって特徴付けられる指数関数を使用して記述することができる。要するに、励起パルスから時間ｔの経過後、蛍光の強度は、ｅ−ｔ／τに比例する。
【００１３】
レーザ１２のパルスは、連続する２つのパルスの開始と開始との間の幅がＴであるような繰り返し周波数ｆを有するものとする。もしＴがτ未満である場合は、フルオロフォアの大半は、励起状態から基底状態へ減衰する時間が無く、励起状態のフルオロフォアの亜集団が常在する結果となる。この状況では、フルオロフォアによるパルスレーザ放射の全体的な吸収が飽和し、これは、フルオロフォアの励起効率の低下、及びレーザのデューティサイクルＴにわたって積分される蛍光の減少を招く。
【００１４】
数学的には、レーザ１２の１デューティサイクルの間に検出器１８のＣＣＤに入射する蛍光のエネルギＥは、
【数１】
である。ここで、κは、ボルツマン定数であり、αＰは、サイクルごとの励起事象の数に関係している。カメラのＣＣＤからの出力値は、カメラによるサンプリング時間内のＥの蓄積に比例する（又は別の言い方ではその積分に比例する）。
【００１５】
図２は、ＥがＴによってどのように変化するかを明らかにしており、フルオロフォアがレーザ１２によって励起されるときのＥを１／Ｔ（すなわちｆ）に対して示したものである。実線２４は、蛍光寿命がτ１であるときの結果を表わしており、破線２６は、蛍光寿命がτ２であるときの結果を表わしている。ここで、τ１＞τ２である。τ１及びτ２のいずれの場合も、Ｅは、ｆが低いところでは定常状態にあり、ｆの増大とともに低下することが明らかであり、この低下は、τ１の場合に、より早く（すなわちｆがより低いところで）生じる。いずれの場合も、平坦域からの離脱は、Ｔが蛍光寿命のおよそ２倍を切ったときに始まる。
【００１６】
コンピュータ２０は、それぞれのレーザパルス周波数ｆ１及びｆ２において、サンプル２２の第１及び第２の画像を捕える。カメラ内におけるｊ番目のＣＣＤの場合、第１の画
像に対応する（すなわちレーザパルス周波数がｆ１であるときの）その出力値は、Ｓ１，ｊであり、第２の画像（すなわちレーザパルス周波数がｆ２であるときの）に対応するその出力値はＳ２，ｊである。コンピュータ２０は、
【数２】
として定義されるｊ番目のＣＣＤの場合の比率Ｒを計算する。これは、励起パルス周波数ｆ１とｆ２との差を打ち消すための正規化を経た後における値Ｓ１，ｊとＳ２，ｊとの比率である。このスケーリングが実施されないと、比率は、Ｓ２，ｊがＳ１，ｊよりもｆ２／ｆ１上回る励起サイクルにわたる積分の測定値であるという事実によって偏りを示す。周波数ｆ１及びｆ２は、イメージングされているフルオロフォアのＥがｆ１とｆ２とで顕著に異なることによってコントラスト写真が作成可能であるように選択される。ｆ１及びｆ２がともに、図２に示されたＥ関数の平坦域内にあるときは、明らかに、コントラストを得ることが概して不可能である。したがって、通常は、１／ｆ１は、フルオロフォア寿命の２倍より大きく設定され、１／ｆ２は、フルオロフォア寿命より小さく設定される。
【００１７】
コンピュータ２０は、検出器１８のカメラの各ＣＣＤについて値Ｒを計算する。この一連のＲ値は、次いで、サンプルの画像を構成するピクセルの配列として表示される。
【００１８】
したがって、（時間領域ＦＬＩＭ及び周波数領域ＦＬＩＭで必要とされる電子機器と比べて）応答の遅いＣＣＤカメラを使用し、カメラの各ＣＣＤによって、受信された蛍光をレーザ１２の多数デューティサイクルにわたって積分した結果である出力値を生成することによって、サンプルのコントラスト画像を得ることができる。
【００１９】
別の一実施形態では、レーザ１２に代わってパルスＬＥＤが使用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一位置からの蛍光を測定する方法であって、
ａ）第１のデューティサイクルを有する第１の蛍光励起信号を前記位置に加えることと、
ｂ）前記第１の励起信号に応答して前記位置から発する蛍光を第１の結果として蓄積することと、
ｃ）第２のデューティサイクルを有する第２の蛍光励起信号を前記位置に加えることと、
ｄ）前記第２の励起信号に応答して前記位置から発する蛍光を第２の結果として蓄積することと、
ｅ）前記位置についての比較結果を提供するために前記第１の結果と前記第２の結果とを比較することと、
を備える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１の結果と前記第２の結果との比較は、レシオメトリック（比率）比較である、方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記第１の結果と前記第２の結果とを比較することは、前記第１の結果と前記第２の結果との比率をそれらの各デューティサイクルの長さを反映した重み付けでとることを含む、方法。
【請求項４】
サンプルの画像を形成する方法であって、
ａ）前記サンプル内の複数の位置の各位置について請求項１ないし３のいずれかに記載の方法を使用してそれぞれの比較結果を決定することと、
ｂ）前記比較結果を画像ピクセルとして表示しそれによって前記サンプルの少なくとも一部分の画像を作成することと、
を備える方法。
【請求項５】
一位置からの蛍光を測定するための装置であって、
ａ）第１のデューティサイクルを有する第１の蛍光励起信号を前記位置に加えるための手段と、
ｂ）前記第１の励起信号に応答して前記位置から発する蛍光を第１の結果として蓄積するための手段と、
ｃ）第２のデューティサイクルを有する第２の蛍光励起信号を前記位置に加えるための手段と、
ｄ）前記第２の励起信号に応答して前記位置から発する蛍光を第２の結果として蓄積するための手段と、
ｅ）前記位置についての比較結果を提供するために前記第１の結果と前記第２の結果とを比較するための手段と、
を備える装置。
【請求項６】
請求項５に記載の装置であって、
前記比較するための手段は、前記第１の結果と前記第２の結果とのレシオメトリック比較を行うように構成される、装置。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の装置であって、
前記比較するための手段は、前記第１の結果と前記第２の結果との比率をそれらの各デ
ューティサイクルの長さを反映した重み付けでとるように構成される、装置。
【請求項８】
サンプルの画像を形成するための装置であって、
ａ）前記サンプル内の複数の位置の各位置についてそれぞれの比較結果を決定するための請求項５、６、又は７に記載の装置と、
ｂ）前記比較結果を画像ピクセルとして表示しそれによって前記サンプルの少なくとも一部分の画像を作成するための手段と、
を備える装置。
【請求項１】
一位置からの蛍光を測定する方法であって、
ａ）第１のデューティサイクルを有する第１の蛍光励起信号を前記位置に加えることと、
ｂ）前記第１の励起信号に応答して前記位置から発する蛍光を第１の結果として蓄積することと、
ｃ）第２のデューティサイクルを有する第２の蛍光励起信号を前記位置に加えることと、
ｄ）前記第２の励起信号に応答して前記位置から発する蛍光を第２の結果として蓄積することと、
ｅ）前記位置についての比較結果を提供するために前記第１の結果と前記第２の結果とを比較することと、
を備える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記第１の結果と前記第２の結果との比較は、レシオメトリック（比率）比較である、方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、
前記第１の結果と前記第２の結果とを比較することは、前記第１の結果と前記第２の結果との比率をそれらの各デューティサイクルの長さを反映した重み付けでとることを含む、方法。
【請求項４】
サンプルの画像を形成する方法であって、
ａ）前記サンプル内の複数の位置の各位置について請求項１ないし３のいずれかに記載の方法を使用してそれぞれの比較結果を決定することと、
ｂ）前記比較結果を画像ピクセルとして表示しそれによって前記サンプルの少なくとも一部分の画像を作成することと、
を備える方法。
【請求項５】
一位置からの蛍光を測定するための装置であって、
ａ）第１のデューティサイクルを有する第１の蛍光励起信号を前記位置に加えるための手段と、
ｂ）前記第１の励起信号に応答して前記位置から発する蛍光を第１の結果として蓄積するための手段と、
ｃ）第２のデューティサイクルを有する第２の蛍光励起信号を前記位置に加えるための手段と、
ｄ）前記第２の励起信号に応答して前記位置から発する蛍光を第２の結果として蓄積するための手段と、
ｅ）前記位置についての比較結果を提供するために前記第１の結果と前記第２の結果とを比較するための手段と、
を備える装置。
【請求項６】
請求項５に記載の装置であって、
前記比較するための手段は、前記第１の結果と前記第２の結果とのレシオメトリック比較を行うように構成される、装置。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の装置であって、
前記比較するための手段は、前記第１の結果と前記第２の結果との比率をそれらの各デ
ューティサイクルの長さを反映した重み付けでとるように構成される、装置。
【請求項８】
サンプルの画像を形成するための装置であって、
ａ）前記サンプル内の複数の位置の各位置についてそれぞれの比較結果を決定するための請求項５、６、又は７に記載の装置と、
ｂ）前記比較結果を画像ピクセルとして表示しそれによって前記サンプルの少なくとも一部分の画像を作成するための手段と、
を備える装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５２２９８０（Ｐ２０１２−５２２９８０Ａ）
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２８０５（Ｐ２０１２−５０２８０５）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０５３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１２９１３
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５０４０４３４６２）ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０５３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１２９１３
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５０４０４３４６２）ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]