蛍光測定装置及び蛍光測定方法
【課題】装置の調整に起因する蛍光寿命の測定精度の低下の有無を判別することができる蛍光測定装置を提供する。
【解決手段】測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置であって、強度変調したレーザ光を測定対象物に照射するレーザ光源と、測定対象物にレーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光部と、受光部が受光した蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理部と、受光部、又は、信号処理部が蛍光の信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別部と、を備えることを特徴とする蛍光測定装置。
【解決手段】測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置であって、強度変調したレーザ光を測定対象物に照射するレーザ光源と、測定対象物にレーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光部と、受光部が受光した蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理部と、受光部、又は、信号処理部が蛍光の信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別部と、を備えることを特徴とする蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置、蛍光測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
測定対象物にレーザ光を照射し、測定対象物が発する蛍光を受光して、測定対象物の情報を取得する蛍光測定装置が知られている。
蛍光測定装置を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素は蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を測定することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
【０００３】
また、所定の周波数で強度変調したレーザ光を測定対象物に照射し測定対象物が発する蛍光を受光することにより蛍光緩和時定数を取得する蛍光測定装置が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１０１３９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光測定装置が受光する蛍光はダイナミックレンジが広いため、蛍光が微弱である場合、蛍光測定装置は信号を増幅した後に、信号処理を行う。そのため、蛍光測定装置が受光した蛍光から蛍光寿命を求める際、受光した蛍光を電気信号に変換する光電子増倍管や、電気信号を増幅するアンプが用いられる。蛍光測定装置に用いられる光電子増倍管やアンプのゲインが適正な値でない場合、蛍光測定装置が求めた蛍光寿命の測定精度が低下する。そのため、光電子増倍管やアンプのゲインを適正な値に調整することが望ましい。
しかし、光電子増倍管やアンプのゲインが適正な値であるかどうかの判別は、必ずしも全てのユーザにとって容易であるとは限らない。そのため、光電子増倍管やアンプのゲインが適正な値であるかどうかをユーザが判別するのが困難である場合、蛍光測定装置により求められた蛍光寿命の測定精度が低下する可能性がある。
【０００６】
そこで、本発明は、装置の調整に起因する蛍光寿命の測定精度の低下の有無を判別することができる蛍光測定装置及び蛍光測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の蛍光測定装置は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置であって、強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源と、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光部と、前記受光部が受光した前記蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理部と、前記受光部、又は、前記信号処理部が前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別部と、を備えることを特徴とする。
【０００８】
また、前記受光部は、光電子増倍管を備え、前記信号処理部は、前記受光部が受光した前記蛍光の信号を増幅するアンプを備えることが好ましい。
【０００９】
また、前記判別部が判別した結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整部を備えることが好ましい。
【００１０】
また、前記判別部が判別した結果を出力する出力部を備えることが好ましい。
【００１１】
また、前記出力部は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力することが好ましい。
【００１２】
また、前記信号処理部は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光部が受光した前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求めることが好ましい。
【００１３】
本発明の蛍光測定方法は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定方法であって、強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射する工程と、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光工程と、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理工程と、前記受光工程、又は、前記信号処理工程で前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別工程と、を有することを特徴とする。
【００１４】
また、前記受光工程は、光電子増倍管によって前記蛍光を受光し、前記信号処理工程は、アンプによって、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号を増幅することが好ましい。
【００１５】
また、前記判別工程で判別された結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整工程を有することが好ましい。
【００１６】
また、前記判別工程で判別された結果を出力する出力工程を有することが好ましい。
【００１７】
また、前記出力工程は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力することが好ましい。
【００１８】
また、前記信号処理工程は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求めることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の蛍光測定装置、蛍光測定方法によれば、装置の調整に起因する蛍光寿命の測定精度の低下の有無を判別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。
【図２】図１に示される第２受光部の一例を示す図である。
【図３】図１に示される制御部の一例を示す図である。
【図４】図１に示される信号処理部の一例を示す図である。
【図５】参照信号に対する蛍光信号の位相差を示す図の一例である。
【図６】アンプのゲインが大きい場合の、参照信号に対する蛍光信号の位相差を示す図の一例である。
【図７】光電子増倍管のゲインが大きい場合の、参照信号に対する蛍光信号の位相差を示す図の一例である。
【図８】（ａ）〜（ｃ）は、変形例２において、参照信号に対する蛍光信号の位相差を示す図の一例である。
【図９】実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の蛍光測定装置、蛍光測定方法を適用したフローサイトメータについて、実施形態に基づいて説明する。
＜第１の実施形態＞
（フローサイトメータの構成）
まず、図１を参照して、本実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図１は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。フローサイトメータは、測定対象物にレーザ光を照射し、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光を受光することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
図１に示されるように、本実施形態のフローサイトメータは、フローセル１０と、レーザ光源２０と、第１受光部３０と、第２受光部３２と、制御部４０と、信号処理部５０と、判別部７０と、出力部８０と、ゲイン調整部９０と、を備える。また、フローセル１０の下流には、測定対象物を回収する容器１６が配置される。以下、各構成について詳細に説明する。
【００２２】
細胞１２などの測定対象物は、シース液に囲まれてフローセル１０の内部を流れる。後述するように、レーザ光源２０が測定対象物にレーザ光を照射し、その際に発せられる蛍光から測定対象物の情報を取得するため、細胞１２には、予め蛍光色素１４が付与されている。蛍光色素１４は、例えば、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）などが用いられる。フローセル１０の内部では、シース液に囲まれた測定対象物は流体力学的絞り込みを受け、細い液流となってフローセル１０の内部を流れる。
【００２３】
レーザ光源２０は、所定の周波数で強度変調したレーザ光を測定対象物に照射する。レーザ光源２０は、例えば、半導体レーザを用いることができる。レーザ光の出力は、例えば、５〜１００ｍＷである。レーザ光の波長は、例えば、３５０ｎｍ〜８００ｎｍである。
レーザ光源２０が照射するレーザ光の強度は、後述する制御部４０から出力される変調信号によって変調される。
【００２４】
第１受光部３０は、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を基準として、レーザ光源２０と反対側に配置される。第１受光部３０は、測定対象物にレーザ光が照射されたときに生じる前方散乱光を受光する。第１受光部３０は、例えば、フォトダイオードなどの光電変換器を備える。第１受光部３０は、受光した前方散乱光を電気信号に変換する。
第１受光部３０によって変換された電気信号は信号処理部５０へ出力され、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を測定対象物が通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
【００２５】
第２受光部３２は、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を基準として、レーザ光源２０からレーザ光が照射される方向とフローセル１０内を測定対象物が流れる方向の相互に垂直な方向に配置される。第２受光部３２は、測定対象物にレーザ光が照射されたときに発せられる蛍光を受光する。第２受光部３２は、受光した蛍光を電気信号（蛍光信号）に変換する。
【００２６】
ここで、図２を参照して、第２受光部３２の構成について説明する。図２は、第２受光部３２の一例を示す図である。図２に示されるように、第２受光部３２は、光電子増倍管（ＰＭＴ）３４を備える。
光電子増倍管３４によって変換された電気信号は信号処理部５０へ出力され、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を通過する測定対象物の情報として用いられる。また、光電子増倍管３４のゲインは、ゲイン調整部９０によって調整される。
【００２７】
次に、制御部４０について説明する。制御部４０は、レーザ光源２０が照射するレーザ光の変調周波数を制御する。ここで、図３を参照して、制御部４０の構成について説明する。図３は、制御部４０の一例を示す図である。図３に示されるように、制御部４０は、発振器４２と、パワースプリッタ４４と、アンプ４６，４８と、を備える。
【００２８】
発振器４２は、所定の周波数の正弦波信号を出力する。発振器４２から出力される正弦波信号は、レーザ光源２０から出力されるレーザ光の強度を変調するための変調信号として用いられる。正弦波信号の周波数は、例えば、１〜５０ＭＨｚである。
発振器４２から出力された所定の周波数の正弦波信号（変調信号）は、パワースプリッタ４４により、２つのアンプ４６，４８に分配される。アンプ４６で増幅された変調信号は、レーザ光源２０へ出力される。また、アンプ４８で増幅された変調信号は、信号処理部５０へ出力される。アンプ４８で増幅された変調信号を信号処理部５０へ出力するのは、後述するように、第２受光部３２から出力される信号を検波するための参照信号として用いるためである。
【００２９】
次に、信号処理部５０について説明する。信号処理部５０は、レーザ光の強度を変調する変調信号と、第２受光部３２が受光した蛍光の信号（蛍光信号）との位相差に基づいて、蛍光寿命を求める。ここで、図４を参照して、信号処理部５０の構成について説明する。図４は、信号処理部５０の一例を示す図である。図４に示されるように、信号処理部５０は、ＩＱミキサ５２と、アンプ５４と、ローパスフィルタ５６と、Ａ／Ｄ変換器５８と、演算部６０と、を備える。
【００３０】
ＩＱミキサ５２は、アンプ５４によって増幅された、第２受光部３２の光電子増倍管３４から出力された蛍光信号の入力を受ける。また、ＩＱミキサ５２は、制御部４０のアンプ４８から出力された参照信号の入力を受ける。
ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と参照信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。また、ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。この信号に基づいて、変調信号（参照信号）と蛍光信号との位相差を求めることができる。
なお、アンプ５４のゲインは、ゲイン調整部９０によって調整される。
【００３１】
ＩＱミキサ５２によって生成された信号の高周波成分は、ローパスフィルタ５６によって除去される。ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去された信号は、Ａ／Ｄ変換器５８によってデジタル信号（後述するｃｏｓθ、ｓｉｎθ）に変換される。Ａ／Ｄ変換器５８によってデジタル信号に変換された信号は、演算部６０へ出力される。
【００３２】
演算部６０は、変調信号（参照信号）と蛍光信号との位相差を求める。また、演算部６０は、求めた位相差を用いて、蛍光寿命を求める。演算部６０が行う詳細な処理については、後述する。
演算部６０が演算した結果は、判別部７０へ出力される。
【００３３】
図１に戻り、判別部７０について説明する。判別部７０は、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する。具体的には、判別部７０は、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値でないことに起因して、蛍光寿命のばらつきが所定の値より大きいか否かを判別する。このようにして、判別部７０は、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値であるか否かを判別することができる。
また、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきの大きさを求める。判別部７０が行う詳細な処理については、後述する。
判別部７０は、判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
【００３４】
出力部８０は、判別部７０が判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを出力する。出力部８０は、例えば、表示装置やプリンタである。
【００３５】
ゲイン調整部９０は、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別部７０が判別した結果に基づいて、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインを調整する。ゲイン調整部９０は、光電子増倍管３４、又は、アンプ５４のいずれか一方のゲインを調整してもよいし、両方のゲインを調整してもよい。ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインを調整する詳細な方法については、後述する。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
【００３６】
（信号処理方法）
次に、信号処理部５０による信号処理の流れを説明する。
まず、レーザ光の強度を変調するための変調信号が、制御部４０から信号処理部５０へ参照信号として出力される。信号処理部５０に入力される参照信号は、例えば、所定の周波数の正弦波信号である。
また、測定対象物にレーザ光が照射されたときに発せられる蛍光を第２受光部３２が受光する。第２受光部３２は、受光した蛍光信号を信号処理部５０へ出力する。
【００３７】
次に、ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と参照信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去される。
また、ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去される。
【００３８】
その後、演算部６０は、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分のそれぞれの時間平均を算出する。時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、図５に示される図にプロットされる。１つの測定対象物に対して上述した信号処理を行うことにより、プロットが１つなされる。
演算部６０は、複数（例えば、Ｎ個）の測定対象物に対して、時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分をプロットする。また、演算部６０は、時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の複数のプロットから、参照信号に対する蛍光信号の位相差を求める。例えば、図５に示される複数のプロットを、原点を通る直線で近似した直線の傾きから、演算部６０は参照信号に対する蛍光信号の位相差θを求めることができる。
【００３９】
ここで、変調信号の角周波数をω、測定対象物の蛍光寿命をτとすると、以下の式（１）により、位相差θから蛍光寿命τを求めることができる。
【数１】
演算部６０は、求めた位相差θを用いて、上記式（１）に基づいて、蛍光寿命を求める。
【００４０】
（判別方法）
次に、演算部６０が求めた蛍光寿命が、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが所定の値より大きい状況で求められたものか否かを、判別部７０が判別する。以下、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別部７０が判別する方法について説明する。光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値である場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、図５に示されるように、原点を通る直線Ｌ１に沿ってプロットされる。直線Ｌ１は、例えば、最小二乗法によって求められる。
【００４１】
しかし、アンプ５４のゲインが大き過ぎる場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、例えば、図６に示されるようにプロットされる。図６に示される例では、図中にＡで示される領域において、原点を通る直線から外れた位置に時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分がプロットされている。これは、アンプ５４のゲインが大き過ぎることにより、蛍光信号のｃｏｓ成分がＡ／Ｄ変換器５８の入力範囲の上限を超えたことにより生じる。
【００４２】
図６に示される例のように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合に、複数のプロットを近似した直線をＬ２とする。図６に示される例では、図中にＡで示される領域において、ｃｏｓ成分が飽和しているため、直線Ｌ２の傾き（ｔａｎθ）は、実際の蛍光寿命に対応する値よりも大きくなる。そのため、上記式（１）に基づいて求まる蛍光寿命τは、実際の値よりも大きな値として求まる。これは、蛍光寿命τの測定精度が低下することを意味する。
また、図６に示されるように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合の直線Ｌ２に対する各プロットの分散は、図５に示されるアンプ５４のゲインが適正な値である場合の直線Ｌ１に対する各プロットの分散よりも大きくなる。
【００４３】
また、光電子増倍管３４のゲインが大き過ぎる場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、例えば、図７に示されるようにプロットされる。図７に示される例では、図中にＢで示される領域において、原点を通る直線から外れた位置に時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分がプロットされている。これは、光電子増倍管３４のゲインが大き過ぎることにより、光電子増倍管３４で飽和現象が生じたことによるものである。
【００４４】
図７に示される例のように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合に、複数のプロットを近似した直線をＬ３とする。図７に示される例では、図中にＢで示される領域において光電子増倍管３４に飽和現象が生じているため、直線Ｌ３の傾き（ｔａｎθ）は、実際の蛍光寿命に対応する値よりも大きくなる。そのため、上記式（１）に基づいて求まる蛍光寿命τは、実際の値よりも大きな値として求まる。これは、蛍光寿命τの測定精度が低下することを意味する。
また、図７に示されるように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合の直線Ｌ３に対する各プロットの分散は、図５に示される光電子増倍管３４のゲインが適正な値である場合の直線Ｌ１に対する各プロットの分散よりも大きくなる。
【００４５】
本実施形態の判別部７０は、複数のプロットを最小二乗法によって原点を通る直線で近似した際の分散を求める。次に、判別部７０は、求めた分散が所定の値より大きいか否かを判別する。
分散が所定の値より大きい場合、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも大きいことを示す信号を、判別結果として、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。また、分散が所定の値より小さい場合、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも小さいことを示す信号を、判別結果として、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
また、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきの大きさ（分散）、蛍光寿命などを、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
【００４６】
以上説明したように、本実施形態の蛍光測定装置は、判別部７０が複数のプロットを最小二乗法によって原点を通る直線で近似した際の分散を求め、求めた分散が所定の値より大きいか否かを判別するため、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値であるか否かを判別することができる。
【００４７】
（ゲイン調整方法）
次に、ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインを調整する方法について説明する。
ゲイン調整部９０は、判別部７０から出力された判別結果に基づいて、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインを調整する。本実施形態では、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも大きいことを示す信号が、判別結果としてゲイン調整部９０に入力されると、ゲイン調整部９０は、光電子増倍管３４とアンプ５４の両方のゲインを低下させるように、ゲインを調整する。
【００４８】
ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４とアンプ５４のゲインを調整した後、上述した信号処理方法により、演算部６０は、複数（例えば、Ｎ個）の測定対象物に対する時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分をプロットから、参照信号に対する蛍光信号の位相差θを求める。また、演算部６０は、求めた位相差θを用いて、蛍光寿命を求める。
なお、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも小さいことを示す信号が、判別結果としてゲイン調整部９０に入力された場合は、ゲイン調整部９０は、光電子増倍管３４とアンプ５４のゲインをそのままの値に保つ。
【００４９】
光電子増倍管３４とアンプ５４のゲインの調整量は、判別部７０から出力される、蛍光寿命のばらつきの大きさに基づいて定められる。具体的には、蛍光寿命のばらつきが大きいほど、ゲインの調整量は大きくなる。
【００５０】
以上説明したように、本実施形態の蛍光測定装置は、蛍光寿命のばらつきの大きさに基づいて、ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４とアンプ５４のゲインを調整するため、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきを所定の値以下とすることができる。
【００５１】
（変形例１）
第１の実施形態においては、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、判別部７０が原点を通る直線で近似した際の分散によって、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する方法について説明した。本変形例においては、判別部７０による判別方法が第１の実施形態とは異なる。
本変形例の判別部７０は、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさが所定の値より大きいか否かを判別する。
また、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきの大きさ（二次の係数）、蛍光寿命などを、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
【００５２】
光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値である場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、図５に示されるように、原点を通る直線Ｌ１に沿ってプロットされる。そのため、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさは所定の値より小さくなる。
しかし、図６に示される例のように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合や、図７に示される例のように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合は、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさは所定の値より大きくなる。
【００５３】
従って、本変形例のように、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさが所定の値より大きいか否かを判別部７０が判別することにより、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別部７０が判別することができる。
【００５４】
（変形例２）
本変形例の蛍光測定装置は、判別部７０による判別方法が第１の実施形態とは異なる。
本変形例の判別部７０は、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分の最大値と最小値との間を５つの区間に分ける。また、判別部７０は、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、各区間において直線で近似する。また、判別部７０は、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きいか否かを判別する。また、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きい場合、判別部７０は、直線の傾きが変化した区間を特定する。
【００５５】
光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値である場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、各区間において近似した直線は図８（ａ）のように示される。図８（ａ）に示される直線は、理想的には、図５に示される直線Ｌ１と同一である。そのため、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、各区間において直線で近似したとき、各区間の直線の傾きの大きさの差は所定の値より小さくなる。
【００５６】
図６に示される例のように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、各区間において近似した直線は図８（ｂ）のように示される。図８（ｂ）においては、例えば、原点に近い区間から４つ目までの区間においては、各区間の直線の傾きの大きさの差は所定の値より小さい。しかし、５つ目の区間（原点から最も離れた区間）における直線の傾きは、他の区間における直線の傾きとは大きく異なる。そのため、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きくなる。
また、図７に示される例のように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、各区間において近似した直線は図８（ｃ）のように示される。図８（ｃ）においては、例えば、原点に近い区間から２つ目までの区間における直線の傾きは、４つ目と５つ目の区間における直線の傾きとは異なる。そのため、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きくなる。
【００５７】
本変形例の判別部７０は、直線の傾きが変化した区間を特定するため、図６に示される例のように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合と、図７に示される例のように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合とを区別することができる。そのため、本変形例の判別部７０は、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値ではない場合、光電子増倍管３４とアンプ５４のどちらのゲインが適正な値ではないのかを示す信号を、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
本変形例のゲイン調整部９０は、判別部７０が判別した結果に基づいて、光電子増倍管３４、又は、アンプ５４のいずれか一方のゲインを低下させるように、ゲインを調整する。
【００５８】
従って、本変形例のように、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、複数の区間の各区間において直線で近似することにより、第２受光部３２、又は、信号処理部５０のいずれに起因して、蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きくなっているのかを、判別部７０が判別することができる。
なお、本変形例では５つの区間に分ける構成を説明したが、区間の数はこれに限定されるものではない。
【００５９】
＜第２の実施形態＞
上述した実施形態や変形例のフローサイトメータでは、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値でない場合、ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインの調整を行うことができる。しかし、熟練したユーザの場合、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインの調整はユーザ自身が行うことが望ましい場合がある。本実施形態のフローサイトメータは、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインの調整はユーザ自身が行うことを前提とし、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値でないことをユーザが見落とすのを防ぐことを目的とする。
【００６０】
ここで、図９を参照して、第２の実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図９は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。本実施形態のフローサイトメータの基本的な構成は、上述した第１の実施形態と同様である。そのため、以下の説明では、第１の実施形態と同様の構成については説明を省略し、第１の実施形態と構成が異なる部分について説明する。
【００６１】
図９に示されるように、本実施形態のフローサイトメータは、フローセル１０と、レーザ光源２０と、第１受光部３０と、第２受光部３２と、制御部４０と、信号処理部５０と、判別部７０と、出力部８０と、を備える。本実施形態のフローサイトメータは、ゲイン調整部を備えない点を除いて、第１の実施形態と同様である。
第２受光部３２が備える光電子増倍管３４のゲインは、ユーザによって調整される。また、アンプ５４のゲインは、ユーザによって調整される。
判別部７０は、判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを、出力部８０に出力する。
また、出力部８０は、判別部７０が判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを出力する。
【００６２】
本実施形態では、判別部７０が判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などが出力部８０に出力されるため、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値でないことをユーザが見落とすのを防ぐことができる。
【００６３】
以上、本発明の蛍光測定装置及び蛍光測定方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態や変形例に限定されるものではない。また、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００６４】
１０ フローセル
１２ 細胞
１４ 蛍光色素
１６ 容器
２０ レーザ光源
３０ 第１受光部
３２ 第２受光部
３４ 光電子増倍管
４０ 制御部
４２ 発振器
４４ パワースプリッタ
４６，４８ アンプ
５０ 信号処理部
５２ ＩＱミキサ
５４ アンプ
５６ ローパスフィルタ
５８ Ａ／Ｄ変換器
６０ 演算部
７０ 判別部
８０ 出力部
９０ ゲイン調整部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置、蛍光測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
測定対象物にレーザ光を照射し、測定対象物が発する蛍光を受光して、測定対象物の情報を取得する蛍光測定装置が知られている。
蛍光測定装置を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素は蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を測定することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
【０００３】
また、所定の周波数で強度変調したレーザ光を測定対象物に照射し測定対象物が発する蛍光を受光することにより蛍光緩和時定数を取得する蛍光測定装置が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１０１３９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光測定装置が受光する蛍光はダイナミックレンジが広いため、蛍光が微弱である場合、蛍光測定装置は信号を増幅した後に、信号処理を行う。そのため、蛍光測定装置が受光した蛍光から蛍光寿命を求める際、受光した蛍光を電気信号に変換する光電子増倍管や、電気信号を増幅するアンプが用いられる。蛍光測定装置に用いられる光電子増倍管やアンプのゲインが適正な値でない場合、蛍光測定装置が求めた蛍光寿命の測定精度が低下する。そのため、光電子増倍管やアンプのゲインを適正な値に調整することが望ましい。
しかし、光電子増倍管やアンプのゲインが適正な値であるかどうかの判別は、必ずしも全てのユーザにとって容易であるとは限らない。そのため、光電子増倍管やアンプのゲインが適正な値であるかどうかをユーザが判別するのが困難である場合、蛍光測定装置により求められた蛍光寿命の測定精度が低下する可能性がある。
【０００６】
そこで、本発明は、装置の調整に起因する蛍光寿命の測定精度の低下の有無を判別することができる蛍光測定装置及び蛍光測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の蛍光測定装置は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置であって、強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源と、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光部と、前記受光部が受光した前記蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理部と、前記受光部、又は、前記信号処理部が前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別部と、を備えることを特徴とする。
【０００８】
また、前記受光部は、光電子増倍管を備え、前記信号処理部は、前記受光部が受光した前記蛍光の信号を増幅するアンプを備えることが好ましい。
【０００９】
また、前記判別部が判別した結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整部を備えることが好ましい。
【００１０】
また、前記判別部が判別した結果を出力する出力部を備えることが好ましい。
【００１１】
また、前記出力部は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力することが好ましい。
【００１２】
また、前記信号処理部は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光部が受光した前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求めることが好ましい。
【００１３】
本発明の蛍光測定方法は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定方法であって、強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射する工程と、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光工程と、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理工程と、前記受光工程、又は、前記信号処理工程で前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別工程と、を有することを特徴とする。
【００１４】
また、前記受光工程は、光電子増倍管によって前記蛍光を受光し、前記信号処理工程は、アンプによって、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号を増幅することが好ましい。
【００１５】
また、前記判別工程で判別された結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整工程を有することが好ましい。
【００１６】
また、前記判別工程で判別された結果を出力する出力工程を有することが好ましい。
【００１７】
また、前記出力工程は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力することが好ましい。
【００１８】
また、前記信号処理工程は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求めることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の蛍光測定装置、蛍光測定方法によれば、装置の調整に起因する蛍光寿命の測定精度の低下の有無を判別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。
【図２】図１に示される第２受光部の一例を示す図である。
【図３】図１に示される制御部の一例を示す図である。
【図４】図１に示される信号処理部の一例を示す図である。
【図５】参照信号に対する蛍光信号の位相差を示す図の一例である。
【図６】アンプのゲインが大きい場合の、参照信号に対する蛍光信号の位相差を示す図の一例である。
【図７】光電子増倍管のゲインが大きい場合の、参照信号に対する蛍光信号の位相差を示す図の一例である。
【図８】（ａ）〜（ｃ）は、変形例２において、参照信号に対する蛍光信号の位相差を示す図の一例である。
【図９】実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の蛍光測定装置、蛍光測定方法を適用したフローサイトメータについて、実施形態に基づいて説明する。
＜第１の実施形態＞
（フローサイトメータの構成）
まず、図１を参照して、本実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図１は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。フローサイトメータは、測定対象物にレーザ光を照射し、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光を受光することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
図１に示されるように、本実施形態のフローサイトメータは、フローセル１０と、レーザ光源２０と、第１受光部３０と、第２受光部３２と、制御部４０と、信号処理部５０と、判別部７０と、出力部８０と、ゲイン調整部９０と、を備える。また、フローセル１０の下流には、測定対象物を回収する容器１６が配置される。以下、各構成について詳細に説明する。
【００２２】
細胞１２などの測定対象物は、シース液に囲まれてフローセル１０の内部を流れる。後述するように、レーザ光源２０が測定対象物にレーザ光を照射し、その際に発せられる蛍光から測定対象物の情報を取得するため、細胞１２には、予め蛍光色素１４が付与されている。蛍光色素１４は、例えば、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）などが用いられる。フローセル１０の内部では、シース液に囲まれた測定対象物は流体力学的絞り込みを受け、細い液流となってフローセル１０の内部を流れる。
【００２３】
レーザ光源２０は、所定の周波数で強度変調したレーザ光を測定対象物に照射する。レーザ光源２０は、例えば、半導体レーザを用いることができる。レーザ光の出力は、例えば、５〜１００ｍＷである。レーザ光の波長は、例えば、３５０ｎｍ〜８００ｎｍである。
レーザ光源２０が照射するレーザ光の強度は、後述する制御部４０から出力される変調信号によって変調される。
【００２４】
第１受光部３０は、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を基準として、レーザ光源２０と反対側に配置される。第１受光部３０は、測定対象物にレーザ光が照射されたときに生じる前方散乱光を受光する。第１受光部３０は、例えば、フォトダイオードなどの光電変換器を備える。第１受光部３０は、受光した前方散乱光を電気信号に変換する。
第１受光部３０によって変換された電気信号は信号処理部５０へ出力され、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を測定対象物が通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
【００２５】
第２受光部３２は、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を基準として、レーザ光源２０からレーザ光が照射される方向とフローセル１０内を測定対象物が流れる方向の相互に垂直な方向に配置される。第２受光部３２は、測定対象物にレーザ光が照射されたときに発せられる蛍光を受光する。第２受光部３２は、受光した蛍光を電気信号（蛍光信号）に変換する。
【００２６】
ここで、図２を参照して、第２受光部３２の構成について説明する。図２は、第２受光部３２の一例を示す図である。図２に示されるように、第２受光部３２は、光電子増倍管（ＰＭＴ）３４を備える。
光電子増倍管３４によって変換された電気信号は信号処理部５０へ出力され、フローセル１０にレーザ光が照射される位置を通過する測定対象物の情報として用いられる。また、光電子増倍管３４のゲインは、ゲイン調整部９０によって調整される。
【００２７】
次に、制御部４０について説明する。制御部４０は、レーザ光源２０が照射するレーザ光の変調周波数を制御する。ここで、図３を参照して、制御部４０の構成について説明する。図３は、制御部４０の一例を示す図である。図３に示されるように、制御部４０は、発振器４２と、パワースプリッタ４４と、アンプ４６，４８と、を備える。
【００２８】
発振器４２は、所定の周波数の正弦波信号を出力する。発振器４２から出力される正弦波信号は、レーザ光源２０から出力されるレーザ光の強度を変調するための変調信号として用いられる。正弦波信号の周波数は、例えば、１〜５０ＭＨｚである。
発振器４２から出力された所定の周波数の正弦波信号（変調信号）は、パワースプリッタ４４により、２つのアンプ４６，４８に分配される。アンプ４６で増幅された変調信号は、レーザ光源２０へ出力される。また、アンプ４８で増幅された変調信号は、信号処理部５０へ出力される。アンプ４８で増幅された変調信号を信号処理部５０へ出力するのは、後述するように、第２受光部３２から出力される信号を検波するための参照信号として用いるためである。
【００２９】
次に、信号処理部５０について説明する。信号処理部５０は、レーザ光の強度を変調する変調信号と、第２受光部３２が受光した蛍光の信号（蛍光信号）との位相差に基づいて、蛍光寿命を求める。ここで、図４を参照して、信号処理部５０の構成について説明する。図４は、信号処理部５０の一例を示す図である。図４に示されるように、信号処理部５０は、ＩＱミキサ５２と、アンプ５４と、ローパスフィルタ５６と、Ａ／Ｄ変換器５８と、演算部６０と、を備える。
【００３０】
ＩＱミキサ５２は、アンプ５４によって増幅された、第２受光部３２の光電子増倍管３４から出力された蛍光信号の入力を受ける。また、ＩＱミキサ５２は、制御部４０のアンプ４８から出力された参照信号の入力を受ける。
ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と参照信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。また、ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。この信号に基づいて、変調信号（参照信号）と蛍光信号との位相差を求めることができる。
なお、アンプ５４のゲインは、ゲイン調整部９０によって調整される。
【００３１】
ＩＱミキサ５２によって生成された信号の高周波成分は、ローパスフィルタ５６によって除去される。ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去された信号は、Ａ／Ｄ変換器５８によってデジタル信号（後述するｃｏｓθ、ｓｉｎθ）に変換される。Ａ／Ｄ変換器５８によってデジタル信号に変換された信号は、演算部６０へ出力される。
【００３２】
演算部６０は、変調信号（参照信号）と蛍光信号との位相差を求める。また、演算部６０は、求めた位相差を用いて、蛍光寿命を求める。演算部６０が行う詳細な処理については、後述する。
演算部６０が演算した結果は、判別部７０へ出力される。
【００３３】
図１に戻り、判別部７０について説明する。判別部７０は、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する。具体的には、判別部７０は、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値でないことに起因して、蛍光寿命のばらつきが所定の値より大きいか否かを判別する。このようにして、判別部７０は、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値であるか否かを判別することができる。
また、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきの大きさを求める。判別部７０が行う詳細な処理については、後述する。
判別部７０は、判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
【００３４】
出力部８０は、判別部７０が判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを出力する。出力部８０は、例えば、表示装置やプリンタである。
【００３５】
ゲイン調整部９０は、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別部７０が判別した結果に基づいて、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインを調整する。ゲイン調整部９０は、光電子増倍管３４、又は、アンプ５４のいずれか一方のゲインを調整してもよいし、両方のゲインを調整してもよい。ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインを調整する詳細な方法については、後述する。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
【００３６】
（信号処理方法）
次に、信号処理部５０による信号処理の流れを説明する。
まず、レーザ光の強度を変調するための変調信号が、制御部４０から信号処理部５０へ参照信号として出力される。信号処理部５０に入力される参照信号は、例えば、所定の周波数の正弦波信号である。
また、測定対象物にレーザ光が照射されたときに発せられる蛍光を第２受光部３２が受光する。第２受光部３２は、受光した蛍光信号を信号処理部５０へ出力する。
【００３７】
次に、ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と参照信号とを乗算することにより、蛍光信号のｃｏｓ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去される。
また、ＩＱミキサ５２は、蛍光信号と、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、ローパスフィルタ５６によって高周波成分が除去される。
【００３８】
その後、演算部６０は、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分のそれぞれの時間平均を算出する。時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、図５に示される図にプロットされる。１つの測定対象物に対して上述した信号処理を行うことにより、プロットが１つなされる。
演算部６０は、複数（例えば、Ｎ個）の測定対象物に対して、時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分をプロットする。また、演算部６０は、時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の複数のプロットから、参照信号に対する蛍光信号の位相差を求める。例えば、図５に示される複数のプロットを、原点を通る直線で近似した直線の傾きから、演算部６０は参照信号に対する蛍光信号の位相差θを求めることができる。
【００３９】
ここで、変調信号の角周波数をω、測定対象物の蛍光寿命をτとすると、以下の式（１）により、位相差θから蛍光寿命τを求めることができる。
【数１】
演算部６０は、求めた位相差θを用いて、上記式（１）に基づいて、蛍光寿命を求める。
【００４０】
（判別方法）
次に、演算部６０が求めた蛍光寿命が、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが所定の値より大きい状況で求められたものか否かを、判別部７０が判別する。以下、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別部７０が判別する方法について説明する。光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値である場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、図５に示されるように、原点を通る直線Ｌ１に沿ってプロットされる。直線Ｌ１は、例えば、最小二乗法によって求められる。
【００４１】
しかし、アンプ５４のゲインが大き過ぎる場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、例えば、図６に示されるようにプロットされる。図６に示される例では、図中にＡで示される領域において、原点を通る直線から外れた位置に時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分がプロットされている。これは、アンプ５４のゲインが大き過ぎることにより、蛍光信号のｃｏｓ成分がＡ／Ｄ変換器５８の入力範囲の上限を超えたことにより生じる。
【００４２】
図６に示される例のように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合に、複数のプロットを近似した直線をＬ２とする。図６に示される例では、図中にＡで示される領域において、ｃｏｓ成分が飽和しているため、直線Ｌ２の傾き（ｔａｎθ）は、実際の蛍光寿命に対応する値よりも大きくなる。そのため、上記式（１）に基づいて求まる蛍光寿命τは、実際の値よりも大きな値として求まる。これは、蛍光寿命τの測定精度が低下することを意味する。
また、図６に示されるように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合の直線Ｌ２に対する各プロットの分散は、図５に示されるアンプ５４のゲインが適正な値である場合の直線Ｌ１に対する各プロットの分散よりも大きくなる。
【００４３】
また、光電子増倍管３４のゲインが大き過ぎる場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、例えば、図７に示されるようにプロットされる。図７に示される例では、図中にＢで示される領域において、原点を通る直線から外れた位置に時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分がプロットされている。これは、光電子増倍管３４のゲインが大き過ぎることにより、光電子増倍管３４で飽和現象が生じたことによるものである。
【００４４】
図７に示される例のように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合に、複数のプロットを近似した直線をＬ３とする。図７に示される例では、図中にＢで示される領域において光電子増倍管３４に飽和現象が生じているため、直線Ｌ３の傾き（ｔａｎθ）は、実際の蛍光寿命に対応する値よりも大きくなる。そのため、上記式（１）に基づいて求まる蛍光寿命τは、実際の値よりも大きな値として求まる。これは、蛍光寿命τの測定精度が低下することを意味する。
また、図７に示されるように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合の直線Ｌ３に対する各プロットの分散は、図５に示される光電子増倍管３４のゲインが適正な値である場合の直線Ｌ１に対する各プロットの分散よりも大きくなる。
【００４５】
本実施形態の判別部７０は、複数のプロットを最小二乗法によって原点を通る直線で近似した際の分散を求める。次に、判別部７０は、求めた分散が所定の値より大きいか否かを判別する。
分散が所定の値より大きい場合、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも大きいことを示す信号を、判別結果として、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。また、分散が所定の値より小さい場合、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも小さいことを示す信号を、判別結果として、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
また、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきの大きさ（分散）、蛍光寿命などを、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
【００４６】
以上説明したように、本実施形態の蛍光測定装置は、判別部７０が複数のプロットを最小二乗法によって原点を通る直線で近似した際の分散を求め、求めた分散が所定の値より大きいか否かを判別するため、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値であるか否かを判別することができる。
【００４７】
（ゲイン調整方法）
次に、ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインを調整する方法について説明する。
ゲイン調整部９０は、判別部７０から出力された判別結果に基づいて、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインを調整する。本実施形態では、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも大きいことを示す信号が、判別結果としてゲイン調整部９０に入力されると、ゲイン調整部９０は、光電子増倍管３４とアンプ５４の両方のゲインを低下させるように、ゲインを調整する。
【００４８】
ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４とアンプ５４のゲインを調整した後、上述した信号処理方法により、演算部６０は、複数（例えば、Ｎ個）の測定対象物に対する時間平均された蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分をプロットから、参照信号に対する蛍光信号の位相差θを求める。また、演算部６０は、求めた位相差θを用いて、蛍光寿命を求める。
なお、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも小さいことを示す信号が、判別結果としてゲイン調整部９０に入力された場合は、ゲイン調整部９０は、光電子増倍管３４とアンプ５４のゲインをそのままの値に保つ。
【００４９】
光電子増倍管３４とアンプ５４のゲインの調整量は、判別部７０から出力される、蛍光寿命のばらつきの大きさに基づいて定められる。具体的には、蛍光寿命のばらつきが大きいほど、ゲインの調整量は大きくなる。
【００５０】
以上説明したように、本実施形態の蛍光測定装置は、蛍光寿命のばらつきの大きさに基づいて、ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４とアンプ５４のゲインを調整するため、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきを所定の値以下とすることができる。
【００５１】
（変形例１）
第１の実施形態においては、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、判別部７０が原点を通る直線で近似した際の分散によって、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する方法について説明した。本変形例においては、判別部７０による判別方法が第１の実施形態とは異なる。
本変形例の判別部７０は、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさが所定の値より大きいか否かを判別する。
また、判別部７０は、蛍光寿命のばらつきの大きさ（二次の係数）、蛍光寿命などを、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
【００５２】
光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値である場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、図５に示されるように、原点を通る直線Ｌ１に沿ってプロットされる。そのため、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさは所定の値より小さくなる。
しかし、図６に示される例のように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合や、図７に示される例のように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合は、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさは所定の値より大きくなる。
【００５３】
従って、本変形例のように、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさが所定の値より大きいか否かを判別部７０が判別することにより、第２受光部３２、又は、信号処理部５０が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別部７０が判別することができる。
【００５４】
（変形例２）
本変形例の蛍光測定装置は、判別部７０による判別方法が第１の実施形態とは異なる。
本変形例の判別部７０は、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分の最大値と最小値との間を５つの区間に分ける。また、判別部７０は、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、各区間において直線で近似する。また、判別部７０は、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きいか否かを判別する。また、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きい場合、判別部７０は、直線の傾きが変化した区間を特定する。
【００５５】
光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値である場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、各区間において近似した直線は図８（ａ）のように示される。図８（ａ）に示される直線は、理想的には、図５に示される直線Ｌ１と同一である。そのため、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、各区間において直線で近似したとき、各区間の直線の傾きの大きさの差は所定の値より小さくなる。
【００５６】
図６に示される例のように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、各区間において近似した直線は図８（ｂ）のように示される。図８（ｂ）においては、例えば、原点に近い区間から４つ目までの区間においては、各区間の直線の傾きの大きさの差は所定の値より小さい。しかし、５つ目の区間（原点から最も離れた区間）における直線の傾きは、他の区間における直線の傾きとは大きく異なる。そのため、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きくなる。
また、図７に示される例のように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分は、各区間において近似した直線は図８（ｃ）のように示される。図８（ｃ）においては、例えば、原点に近い区間から２つ目までの区間における直線の傾きは、４つ目と５つ目の区間における直線の傾きとは異なる。そのため、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きくなる。
【００５７】
本変形例の判別部７０は、直線の傾きが変化した区間を特定するため、図６に示される例のように、アンプ５４のゲインが適正な値ではない場合と、図７に示される例のように、光電子増倍管３４のゲインが適正な値ではない場合とを区別することができる。そのため、本変形例の判別部７０は、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値ではない場合、光電子増倍管３４とアンプ５４のどちらのゲインが適正な値ではないのかを示す信号を、出力部８０とゲイン調整部９０に出力する。
本変形例のゲイン調整部９０は、判別部７０が判別した結果に基づいて、光電子増倍管３４、又は、アンプ５４のいずれか一方のゲインを低下させるように、ゲインを調整する。
【００５８】
従って、本変形例のように、演算部６０により求められた蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分を、複数の区間の各区間において直線で近似することにより、第２受光部３２、又は、信号処理部５０のいずれに起因して、蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きくなっているのかを、判別部７０が判別することができる。
なお、本変形例では５つの区間に分ける構成を説明したが、区間の数はこれに限定されるものではない。
【００５９】
＜第２の実施形態＞
上述した実施形態や変形例のフローサイトメータでは、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値でない場合、ゲイン調整部９０が光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインの調整を行うことができる。しかし、熟練したユーザの場合、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインの調整はユーザ自身が行うことが望ましい場合がある。本実施形態のフローサイトメータは、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインの調整はユーザ自身が行うことを前提とし、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値でないことをユーザが見落とすのを防ぐことを目的とする。
【００６０】
ここで、図９を参照して、第２の実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図９は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。本実施形態のフローサイトメータの基本的な構成は、上述した第１の実施形態と同様である。そのため、以下の説明では、第１の実施形態と同様の構成については説明を省略し、第１の実施形態と構成が異なる部分について説明する。
【００６１】
図９に示されるように、本実施形態のフローサイトメータは、フローセル１０と、レーザ光源２０と、第１受光部３０と、第２受光部３２と、制御部４０と、信号処理部５０と、判別部７０と、出力部８０と、を備える。本実施形態のフローサイトメータは、ゲイン調整部を備えない点を除いて、第１の実施形態と同様である。
第２受光部３２が備える光電子増倍管３４のゲインは、ユーザによって調整される。また、アンプ５４のゲインは、ユーザによって調整される。
判別部７０は、判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを、出力部８０に出力する。
また、出力部８０は、判別部７０が判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを出力する。
【００６２】
本実施形態では、判別部７０が判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などが出力部８０に出力されるため、光電子増倍管３４やアンプ５４のゲインが適正な値でないことをユーザが見落とすのを防ぐことができる。
【００６３】
以上、本発明の蛍光測定装置及び蛍光測定方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態や変形例に限定されるものではない。また、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００６４】
１０ フローセル
１２ 細胞
１４ 蛍光色素
１６ 容器
２０ レーザ光源
３０ 第１受光部
３２ 第２受光部
３４ 光電子増倍管
４０ 制御部
４２ 発振器
４４ パワースプリッタ
４６，４８ アンプ
５０ 信号処理部
５２ ＩＱミキサ
５４ アンプ
５６ ローパスフィルタ
５８ Ａ／Ｄ変換器
６０ 演算部
７０ 判別部
８０ 出力部
９０ ゲイン調整部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光部と、
前記受光部が受光した前記蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理部と、
前記受光部、又は、前記信号処理部が前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別部と、
を備えることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記受光部は、光電子増倍管を備え、
前記信号処理部は、前記受光部が受光した前記蛍光の信号を増幅するアンプを備える、請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記判別部が判別した結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整部を備える、請求項２に記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記判別部が判別した結果を出力する出力部を備える、請求項１乃至３のいずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
前記出力部は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力する、請求項４に記載の蛍光測定装置。
【請求項６】
前記信号処理部は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光部が受光した前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求める、請求項１乃至５のいずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項７】
測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定方法であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射する工程と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光工程と、
前記受光工程で受光された前記蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理工程と、
前記受光工程、又は、前記信号処理工程で前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別工程と、
を有することを特徴とする蛍光測定方法。
【請求項８】
前記受光工程は、光電子増倍管によって前記蛍光を受光し、
前記信号処理工程は、アンプによって、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号を増幅する、請求項７に記載の蛍光測定方法。
【請求項９】
前記判別工程で判別された結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整工程を有する、請求項８に記載の蛍光測定方法。
【請求項１０】
前記判別工程で判別された結果を出力する出力工程を有する、請求項７乃至９のいずれかに記載の蛍光測定方法。
【請求項１１】
前記出力工程は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力する、請求項１０に記載の蛍光測定方法。
【請求項１２】
前記信号処理工程は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求める、請求項７乃至１１のいずれかに記載の蛍光測定方法。
【請求項１】
測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光部と、
前記受光部が受光した前記蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理部と、
前記受光部、又は、前記信号処理部が前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別部と、
を備えることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記受光部は、光電子増倍管を備え、
前記信号処理部は、前記受光部が受光した前記蛍光の信号を増幅するアンプを備える、請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記判別部が判別した結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整部を備える、請求項２に記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記判別部が判別した結果を出力する出力部を備える、請求項１乃至３のいずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
前記出力部は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力する、請求項４に記載の蛍光測定装置。
【請求項６】
前記信号処理部は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光部が受光した前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求める、請求項１乃至５のいずれかに記載の蛍光測定装置。
【請求項７】
測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定方法であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射する工程と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光工程と、
前記受光工程で受光された前記蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理工程と、
前記受光工程、又は、前記信号処理工程で前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する判別工程と、
を有することを特徴とする蛍光測定方法。
【請求項８】
前記受光工程は、光電子増倍管によって前記蛍光を受光し、
前記信号処理工程は、アンプによって、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号を増幅する、請求項７に記載の蛍光測定方法。
【請求項９】
前記判別工程で判別された結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整工程を有する、請求項８に記載の蛍光測定方法。
【請求項１０】
前記判別工程で判別された結果を出力する出力工程を有する、請求項７乃至９のいずれかに記載の蛍光測定方法。
【請求項１１】
前記出力工程は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力する、請求項１０に記載の蛍光測定方法。
【請求項１２】
前記信号処理工程は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求める、請求項７乃至１１のいずれかに記載の蛍光測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−１４９８９１（Ｐ２０１１−１４９８９１Ａ）
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２８９８（Ｐ２０１０−１２８９８）
【出願日】平成２２年１月２５日（２０１０．１．２５）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２５日（２０１０．１．２５）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
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