蛍光観察装置および蛍光観察方法
【課題】実験小動物を蛍光観察する際の画像において、観察したい目的部位が微少な蛍光であっても鮮明に観察する。
【解決手段】励起光を発する光源９と、該光源９からの励起光を実験小動物Ａの撮像部位に照射する光学系１０と、実験小動物Ａの所定領域または当該所定領域像を遮光する遮光手段１１と、実験小動物Ａからの蛍光像を撮像する撮像手段１５と、該撮像手段１５により取得された実験小動物Ａの蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を認識し、認識された高蛍光領域を遮光するように遮光手段１１を制御する制御手段５とを備える蛍光観察装置１を提供する。
【解決手段】励起光を発する光源９と、該光源９からの励起光を実験小動物Ａの撮像部位に照射する光学系１０と、実験小動物Ａの所定領域または当該所定領域像を遮光する遮光手段１１と、実験小動物Ａからの蛍光像を撮像する撮像手段１５と、該撮像手段１５により取得された実験小動物Ａの蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を認識し、認識された高蛍光領域を遮光するように遮光手段１１を制御する制御手段５とを備える蛍光観察装置１を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体を観察するための蛍光観察装置および蛍光観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、マウス等の実験小動物に励起光を照射して、癌組織等の病変部から発生する蛍光を観察する蛍光観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
蛍光観察は発光観察と比較して、比較的高い輝度の蛍光を観察するので、観察画像が鮮明となり、観察しやすいという利点がある。
【０００３】
癌組織等の病変部を蛍光観察するために、腫瘍組織に高度に蓄積される性質のある蛍光造影剤や血管内において長時間の滞留性を有する蛍光造影剤を実験小動物に投与する方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。蛍光造影剤は、血管（静脈、動脈）内、経口内、腹腔内、皮下、皮内、膀胱内、気管支内等へ注入、噴霧もしくは塗布等により、生体内に投与することで、容易に目的部位を標識することができる。蛍光造影剤を用いた蛍光観察においては、Ｘ線造影、ＭＲＩ、超音波造影などによる画像診断に比べ、非常に簡便に病変部を検出することができるようになる。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５６５０１３５号明細書
【特許文献２】特開２００３−２６１４６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、蛍光造影剤を実験小動物へ投与する方法として多く用いられている、血管内に投与して目的部位を蛍光造影剤で標識して蛍光観察する方法の場合には、最終的に、腎臓の糸球体でろ過され、再吸収を受けなかった蛍光造影剤は、一時的に膀胱に蓄積されるため、膀胱から蛍光が検出されることがある。また、肝臓でも蛍光造影剤が蓄積されるため、肝臓からも蛍光が検出されることもある。
【０００６】
つまり、蛍光造影剤の性質上、観察したい対象の部位ではない膀胱や肝臓等から蛍光が検出されてしまうという問題がある。
さらに、実験小動物への蛍光造影剤の投与後の経過時間によっては、膀胱等に蓄積される量が多くなり、観察目的の部位である腫瘍組織や血管から検出される蛍光の方よりも、強い蛍光量の場合がある。
【０００７】
このような状態のときに蛍光画像を取得した場合、観察目的の部位ではない膀胱等が非常に強い蛍光を発しているために、腫瘍組織や血管の蛍光量に応じた露光時間で画像を取得することで、取得画像における膀胱等の部分がサチュレーションを起こしてしまい、膀胱付近の微小な血管などの蛍光は埋もれてしまうことがある。また、目的部位ではない膀胱等の蛍光の強い部分に合わせて画像取得時の露光時間を設定してしまうと、目的部位の微少な蛍光を鮮明に検出できないという問題がある。
【０００８】
また、蛍光造影剤の投与に限らず、小動物が食べた食物が胃や腸の中にある場合、その食物が持つ自家蛍光により胃や腸などが強く光ってしまうこともあり、この場合も同様の問題がある。さらには、小動物を固定するなどの目的で使用している器具の自家蛍光や反射光などでも同様の問題が発生する可能性がある。
【０００９】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、実験小動物を蛍光観察する際の画像において、観察したい目的部位が微少な蛍光であっても鮮明に観察ができる蛍光観察装置および蛍光観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、励起光を発する光源と、該光源からの励起光を実験小動物の撮像部位に照射する光学系と、前記実験小動物の所定領域または当該所定領域像を遮光する遮光手段と、前記実験小動物からの蛍光像を撮像する撮像手段と、該撮像手段により取得された前記実験小動物の蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を認識し、認識された高蛍光領域を遮光するように前記遮光手段を制御する制御手段とを備える蛍光観察装置を提供する。
【００１１】
上記発明においては、前記撮像手段により取得された前記実験小動物の蛍光画像を表示する表示手段と、該表示手段により表示された蛍光画像の前記高蛍光領域を指示する指示手段とを備えていてもよい。
また、前記遮光手段が、前記実験小動物の撮像部位と略共役な位置に配置されている液晶フィルタまたはデジタル・マイクロミラー・デバイスであってもよい。
また、前記遮光手段が、前記光学系の瞳位置と略共役な位置に配置されているガルバノミラーであってもよい。
【００１２】
また、本発明は、励起光を実験小動物の撮像部位に照射する照射工程と、前記実験小動物からの蛍光像を撮像する第１の撮像工程と、該第１の撮像工程において取得された蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を抽出する抽出工程と、該抽出工程において抽出された前記高蛍光領域に対応する実験小動物の高蛍光部位または当該高蛍光部位の像を遮光する遮光工程と、該遮光工程において前記高蛍光領域に対応する実験小動物の高蛍光部位または当該高蛍光部位の像を遮光した状態で当該実験小動物からの蛍光像を撮像する第２の撮像工程とを含む蛍光観察方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、実験小動物を蛍光観察する際の画像において、観察したい目的部位が微少な蛍光であっても鮮明な観察を行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の第１の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図１〜図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示されるように、観察装置本体２と、画像記憶部３と、表示部４と、これらを制御する制御部５とを備えている。
観察装置本体２は、実験小動物、例えば、マウスＡを搭載するステージ６と、観察光学系７と、該観察光学系７を収容して外部からの光を遮断するケース８とを備えている。
【００１５】
観察光学系７は、照明光を供給する照明装置９と、照明光を観察光学系７の光軸ａ上へ反射させるダイクロイックミラー１４と、照明光をリレーするリレー光学系１０と、マウスＡの観察部位と略共役位置に設けられ指定領域を遮光する遮光ユニット１１と、照明光をステージ６上のマウスＡに照射する一方、マウスＡから戻る反射光およびマウスＡからの蛍光を集光する対物レンズ１３と、対物レンズ１３により集光され、遮光ユニット１１、リレー光学系１０を通ってきた反射光を撮像手段１５に結像させる撮像光学系１２と、その像を撮影して蛍光画像を取得する撮像手段１５とを備えている。
【００１６】
照明装置９には、図示しない照明光を照射するための光源となるランプと特定の波長域のみを透過する特性を持つ励起フィルタおよび照明光を遮断するためのシャッタが備えられている。なお、励起フィルタは複数配置されており、光軸上に任意の一つを配置可能となっている。
撮像手段１５には、図示しない特定の波長域のみを透過する特性を持つ吸収フィルタが備えられている。
【００１７】
前記ケース８には、ステージ６近傍に開閉可能な扉１６が設けられている。扉１６には、該扉１６が閉じられたことを検出するセンサ１７が設けられている。符号１８は、センサ１７により検出する検出片である。
【００１８】
画像記憶部３は、照明装置９から出射された励起光をマウスＡに照射することにより、マウスＡの表面から発せられる蛍光を撮像手段１５によって撮影して得られたマウスＡの蛍光画像Ｇ１を記憶できるようになっている。
表示部４は、制御部５によって制御され、画像記憶部３で記憶された蛍光画像Ｇ１を表示するようになっている。
【００１９】
制御部５は、観察装置本体２を駆動し、蛍光量に応じて露光時間を調整し、マウスＡの蛍光画像Ｇ１を画像記憶部３において取得させるようになっている。図２に示されるように蛍光画像Ｇ１は、表示部４上に表示される。さらに、制御部５は、表示部４に表示された蛍光画像Ｇ１について、制御部５内の図示しない指示部より遮光したい領域Ｃを指定することができるようになっている。
【００２０】
また、図３に示されるように、制御部５は、遮光ユニット１１を駆動して、指定された遮光領域Ｃに対応する遮光位置Ｄについて遮光することができるようになっている。
遮光ユニット１１は、液晶の性質を利用して光の透過と遮光をコントロールすることのできる液晶フィルタ（以下、液晶フィルタ１１とも言う。）であり、制御部５によって、遮光したい領域Ｃに指定された位置に対応する領域Ｄ部分の液晶を駆動し、遮光することができるようになっている。
画像記憶部３、表示部４、制御部５は、一般のパーソナルコンピュータ等の装置でもよい。
【００２１】
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いてマウスＡの蛍光観察を行うには、観察者は、蛍光造影剤を投与したマウスＡを睡眠させた状態で観察装置本体２のケース８内のステージ６上にテープ等の固定手段で固定し、ケース８の扉１６を閉じる。
ケース８の扉１６にはセンサ１７が設けられているので、扉１６が閉じられたことを示す信号がセンサ１７から制御部５に送られる。扉が閉じられたことで、ケース８は、外部からの光を遮断され、暗箱になるので、蛍光をより鮮明に検出することができる。
【００２２】
制御部５においては、観察装置本体２および画像記憶部３に起動信号が送られ、観察装置本体２により蛍光画像Ｇ１の取得が行われる。
すなわち、制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射されると、ダイクロイックミラー１４で反射され、リレー光学系１０、液晶フィルタ１１、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。このとき、液晶フィルタ１１は、ＯＦＦ状態になっており、励起光およびマウスＡからの反射光は、すべて透過する。
【００２３】
励起光を照射することで、マウスＡに投与した蛍光造影剤が励起されて蛍光を発し、発せられた蛍光が対物レンズ１３により集光され、液晶フィルタ１１、リレー光学系１０、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通ってきた蛍光が撮像手段１５により撮影されて蛍光画像Ｇ１が取得される。撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３に記憶され、表示部４において表示される。
【００２４】
蛍光画像Ｇ１は、腫瘍組織に集積している蛍光造影剤により、蛍光を発している病変部Ｂと、例えば、膀胱や肝臓などの目的部位ではないが蛍光造影剤が高度に集積して蛍光を発している部位Ｃを有している。
つまり、表示部４には、蛍光画像Ｇ１から目的部位Ｂと不必要な蛍光を発する目的部位以外の遮光したい領域Ｃとが表示される。
【００２５】
観察者は、保有知識や経験上、対象の実験小動物の臓器の位置を把握しており、腫瘍組織等の目的部位Ｂと、位置Ｃについて、識別することができる。
そこで、観察者が表示部４上の蛍光画像Ｇ１を見ながら、識別したＣを図示しない指示部より指定すると、制御部５は、図３に示される液晶フィルタ１１の領域Ｄの位置や面積等を計算し、領域ＤがＯＮ状態になるように制御する。
【００２６】
指示された遮光領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、液晶フィルタ１１が駆動される。液晶フィルタ１１の遮光領域Ｄに対応する位置における画素をＯＮ状態にし、光を透過しないようにする。
そして、液晶フィルタ１１の領域ＤをＯＮにした状態で、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射されると、ダイクロイックミラー１４で反射され、リレー光学系１０を通り、液晶フィルタ１１の遮光領域Ｄ以外の部分を透過した励起光が対物レンズ１３を通り、ステージ６上のマウスＡに照射される。このときマウスＡの目的部位ではない領域Ｃ部分には、励起光は、照射されていない。
【００２７】
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、液晶フィルタ１１、リレー光学系１０、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通り、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が撮影される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００２８】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３に記憶され、表示部４において表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
【００２９】
このように本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、膀胱や腎臓などの、不必要に強い蛍光を発生させないように遮光することにより、画像取得時のサチュレーションを起こすことがなく、観察したい必要な蛍光が埋もれてしまうことなく、蛍光画像を取得することができる。
また、画像取得時に、観察したい部分に適した露光時間を設定することで、細かい血管などを見落とすことなく、鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００３０】
また、実験小動物飼育用の餌に含まれる材料に自家蛍光成分を持つものが使用されている場合があり、この餌を食べることで、腸管に蓄積され、蛍光観察装置１で実験小動物を観察すると腸管から強い蛍光を検出することがある。このようなときも、同様な方法で、目的部位のみ観察することができる。
さらに、その他の自家蛍光成分をもつものに対しても同様に観察することができる。
【００３１】
なお、本実施形態においては、液晶フィルタ１１の遮光のための制御をＯＮ、ＯＦＦ状態の切り替えのみで行ったが、電圧の制御により中間の遮光状態を設けることにしても良い。
中間の状態を設けることで、目的部位ではない臓器などの蛍光を完全に遮光をせず減少させた状態で、取得することができる。目的部位ではない臓器の位置を観察位置の基準として、目的部位の蛍光と併せて取得しておくことで、蛍光画像において観察時の位置の把握をすることができる。
【００３２】
また、本実施形態においては、遮光ユニット１１を液晶フィルタとしたが、これに限定されるものではなく、これに加えて、指示部より指示された遮光領域に応じて形状が変形可能な遮光部材など他の任意の形態の遮光ユニットに適用してもよい。
【００３３】
また、本実施形態においては、遮光領域の指定は、観察者による操作での指示であったが、ほぼ一定の結果（蛍光量）を得られることが事前に分かっている蛍光観察を複数回繰り返し行うような観察の場合は、任意に設定した蛍光量以上の領域を制御部５から自動的に指定し、必要に応じて遮光するとしてもよい。さらに、露光時間の設定も観察したい領域の蛍光量によって、自動で設定可能としても良い。
これにより、観察効率が上がり、画像取得にかかる時間が短縮されるという利点もある。
【００３４】
次に、本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１の特徴は、第１の実施形態における遮光ユニット１１の代わりに、光反射部１９を設けているところにある。
蛍光観察装置１の基本構成は、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１（図１）と同様である。本実施形態において、上述した第１の実施形態と同じ構成のものには同符号を付けて表示し、説明を省略する。
【００３５】
光反射部１９は、一般的に知られているデジタル・マイクロミラー・デバイス（ＤＭＤ）１９であり、マウスＡの観察部位と略共役な位置に配置されている。ＤＭＤ１９は、図示しない微小なミラーの集合体で構成されている。それぞれのミラーの角度を調節することで、照明装置９から照射された照明光を投影したい位置にだけ反射させることができるようになっている。
【００３６】
図４に示されるように、制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、リレー光学系２０を通った励起光は、ＤＭＤ１９に当たり、それぞれのミラーの角度を調整することで、励起光を反射させる。このとき、ＤＭＤ１９のミラーは、すべて駆動しており、全領域において励起光を反射させる。ミラーにおいて反射された励起光は、ダイクロイックミラー１４で反射され、観察光学系７の光軸ａ方向へ導入され、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。
【００３７】
マウスＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通り、撮像手段１５により撮像され、蛍光画像Ｇ１が取得される。図４に示されるように、撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。表示された蛍光画像Ｇ１から膀胱等の目的部位以外の遮光したい領域Ｄを指定することができる。指定された領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、ＤＭＤ１９が駆動される。
【００３８】
そして、同様に、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射される。励起光は、リレー光学系２０を通り、ＤＭＤ１９の指定された遮光領域Ｄ以外の位置におけるミラー１９ａによって反射され、さらにダイクロイックミラー１４で反射され、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。このときマウスＡの目的部位ではない領域Ｃ部分には、励起光は、照射されていない。
【００３９】
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通り、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が撮影される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００４０】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
【００４１】
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１は、第１の実施形態の効果に加えて、ＤＭＤを用いているので、励起光の損失がより少ないという効果がある。
なお、本実施形態においては、光反射部をＤＭＤ１９としたが、これに限定されるものではなく、他の任意の形態の光反射部材を適用してもよい。
【００４２】
次に、本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１の特徴は、第２の実施形態における光反射部の代わりに、光走査部２１および高速シャッタ２２を設けているところにある。
蛍光観察装置１の基本構成は、第１の実施形態（図１）と同様である。第３の実施形態において、第１の実施形態と同じ構成のものには同符号を付けて表示しているので説明は省略する。
【００４３】
光走査部２１は、一般に知られているガルバノミラーであり、例えば、１軸回りに揺動させられる２台のガルバノミラーを対物レンズ１３の瞳位置と略共役な面に近接させ、２軸を直交させて配置した、いわゆる近接ガルバノミラーである。ガルバノミラー（以下、ガルバノミラー２１とも言う。）は、制御部５からの制御信号により、直交する２軸回りに高速で揺動させられるようになっている。これにより、２台のガルバノミラー２１に入射された照明光をそれぞれ所定の角度範囲にわたって振ることで、マウスＡ上の観察したい領域にわたって照明光を走査させることができる。
【００４４】
高速シャッタ２２は、例えば、一般に知られている音響光学素子である。高速シャッタ２２の開閉を制御することで、照明装置９から照射された照明光を光走査部２１の任意の位置にのみ照射することができる。
照明光学系２７は、光走査部２１からの照明光をダイクロイックミラー１４、対物レンズ１３を通って、マウスＡに照射するための光学系である。
【００４５】
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、例えば、レーザ走査型顕微鏡１であって、照明装置９は、例えば、レーザーダイオードなどを用いたレーザ光源装置９であり、撮像手段１５は、例えば、高感度ＣＣＤカメラを用いる光電子増倍管を用いた光検出器である。
【００４６】
制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、高速シャッタ２２を通過し、光走査部２１に入射される。ガルバノミラー２１を揺動させ、入射された励起光を所定の角度範囲内で偏向する。このとき、高速シャッタ２２は、開いた状態であり、ガルバノミラー２１は、全領域において励起光を走査させる。そして、励起光は、照明光学系２７を通り、ダイクロイックミラー１４で反射され、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。
【００４７】
マウスＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通り、撮像手段１５により撮像され、蛍光画像Ｇ１が取得される。撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。
【００４８】
表示された蛍光画像Ｇ１から膀胱等の目的部位以外の遮光したい領域Ｄを指定することができる。指定された領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、高速シャッタ２２とガルバノミラー２１を駆動し、指定領域にのみ励起光を照射する。
【００４９】
そして、同様に、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射される。高速シャッタ２２を通過した励起光は、ガルバノミラー２１の指定された遮光領域Ｄ以外の位置のみガルバノミラー２１によって反射され、照明光学系２７を通り、ダイクロイックミラー１４で反射され、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。このときマウスＡの目的部位ではない領域Ｃ部分には、励起光は、照射されていない。
【００５０】
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通って、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が撮影される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００５１】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
【００５２】
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１は、ガルバノミラー２１を用いているので、第１、第２の実施形態の効果に加えて、Ｚ方向に走査することができるという効果がある。
なお、本実施形態においては、高速シャッタ２２を音響光学素子としたが、これに限定されるものではなく、他の任意の形態の高速で制御可能な部材を適用してもよい。
【００５３】
次に、本発明の第４の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１の特徴は、第１の実施形態における照明装置および観察光学系を斜照明による配置にしたところにある。
【００５４】
蛍光観察装置１の基本構成は、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１（図１）と同様である。第４の実施形態において、第１の実施形態と同じ構成のものには同符号を付けて表示しているので説明は省略する。
【００５５】
遮光ユニット１１は、例えば、第１の実施形態と同様な液晶フィルタ１１であり、ＯＮ、ＯＦＦ状態の切り替えにより、光の透過する範囲を制御させることができ、マウスＡの観察部位と略共役な位置に配置されている。
照明光学系２３は、マウスＡに励起光を照射するための光学系である。
【００５６】
リレー光学系２４は、遮光ユニット１１を含み、対物レンズ１３によって集光されたマウスＡからの蛍光を撮像光学系１２へ導入するための光学系である。
図６に示されるように、制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、照明光学系２３へ導入される。導入された励起光は、ステージ６上のマウスＡに照射される。
【００５７】
マウスＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１３により集光され、リレー光学系２４、液晶フィルタ１１、撮像光学系１２を通り、蛍光を撮像手段１５により撮像され、蛍光画像Ｇ１が取得される。このとき、液晶フィルタ１１は、ＯＦＦ状態になっており、励起光およびマウスＡからの反射光は、すべて透過する。
【００５８】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。表示された蛍光画像Ｇ１から膀胱等の目的部位以外の遮光したい領域Ｄを指定することができる。指定された領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、液晶フィルタ１１が駆動される。液晶フィルタ１１の遮光領域Ｃに対応する位置における画素をＯＮ状態にし、光を透過しないようにする。
【００５９】
そして、同様に、液晶フィルタ１１の領域ＤをＯＮ状態で、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、照明光学系２３を通り、ステージ６上のマウスＡに照射される。
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、リレー光学系２４を通り、液晶フィルタ１１の遮光領域Ｄ以外の部分を透過した励起光は、撮像光学系１２を通過し、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が取得される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００６０】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
【００６１】
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１は、第１〜第３の実施形態の効果に加えて、斜照明を用いているので、広い照野を設けることができるという効果がある。
なお、本実施形態においては、照明光をある一方向から照射したが、これに限定されるものではなく、これに加えて、任意の方向、角度から照明光を照射しても良い。
【００６２】
また、本実施形態においては、照明装置と照明光学系を１組みとしたが、これに限定されるものではなく、さらに明るい照明光を照射するために複数組み設けても良い。
また、本実施形態においては、遮光するために、第１の実施形態と同様に遮光ユニットとして、液晶フィルタを用いたが、第２の実施形態のような光反射部や、第３の実施形態のような光走査部を用いたシステムを本実施形態の斜照明を併用させても同様の効果を得ることができる。
【００６３】
次に、本発明の第５の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図７を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置の特徴は、第１の実施形態における遮光ユニット１１を照明光の光路上ではなく、蛍光の光路上の撮像手段１５の前に配置したところにある。
【００６４】
本実施形態に係る蛍光観察装置１の基本構成は、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１（図１）と同様である。第５の実施形態において、第１の実施形態と同じ構成のものには同符号を付けて表示しているので説明は省略する。
【００６５】
遮光ユニット１１は、例えば、第１の実施形態と同様な液晶フィルタ１１であり、ＯＮ、ＯＦＦ状態の切り替えにより、光の透過する範囲を制御させることができ、マウスＡの観察部位と略共役な位置に配置されている。
リレー光学系２５は、対物レンズ１３によって集光されたマウスＡからの蛍光をダイクロイックミラー１４、液晶フィルタ１１、撮像光学系２６へ導入するための光学系である。撮像光学系２６は、遮光ユニット１１を透過した蛍光を撮像手段１５に結像させる位置に配置されている。
【００６６】
図７に示されるように、制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、ダイクロイックミラー１４で反射され、観察光学系７の光軸ａ方向へ導入され、リレー光学系２５を通り、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。
【００６７】
マウスＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１３により集光され、リレー光学系２５を通り、ダイクロイックミラー１４を透過し、液晶フィルタ１１、撮像光学系２６を通ってきた蛍光を撮像手段１５により撮像され、蛍光画像Ｇ１が取得される。このとき、液晶フィルタ２４は、ＯＦＦ状態になっており、マウスＡからの蛍光は、すべて透過する。
【００６８】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３において、記憶され、表示部４において表示される。表示された蛍光画像Ｇ１から膀胱等の目的部位以外の遮光したい領域Ｄを指定することができる。指定された領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、液晶フィルタ１１を駆動する。液晶フィルタ１１の遮光領域Ｃに対応する位置における画素をＯＮ状態にし、光を透過しないようにする。
【００６９】
そして、同様に、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、ダイクロイックミラー１４で反射され、リレー光学系２５を通り、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、リレー光学系２５を通り、ダイクロイックミラー１４を透過し、液晶フィルタ１１の遮光領域Ｄ以外の部分を透過した励起光は、撮像光学系２６を通り、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が取得される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００７０】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３において、記憶され、表示部４において表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１は、第１の実施形態の効果に加えて、遮光ユニット１１を撮像手段１５の直前に配置しており、照明光からの励起光は、遮光ユニット１１を透過しないため、蛍光の損失がより少ないという効果がある。
【００７１】
なお、以上の実施形態においては、実験小動物としてマウスＡを例示したが、これに限定されるものではなく、ラットやウサギなど他の任意の実験小動物の蛍光観察に適用してもよい。
また、以上の実施形態においては、生きたままの実験小動物の蛍光画像について述べたが、本発明はこれに捉われるものではなく、例えば、実験小動物のｅｘ ｖｉｖｏ観察等にも適宜適用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【図２】図１の蛍光観察装置の表示部に表示された蛍光画像を示す図である。
【図３】図１の蛍光観察装置の遮光ユニットの遮光部を示す図である。
【図４】本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【図５】本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【図６】本発明の第４の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【図７】本発明の第５の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【符号の説明】
【００７３】
Ａ 実験小動物
１ 蛍光観察装置
４ 表示部（表示手段）
５ 制御部（制御手段）
９ 照明装置（光源）
１０ リレー光学系（光学系）
１１ 遮光ユニット、液晶フィルタ、ＤＭＤ（遮光手段）
１５ 撮像手段
１９ ガルバノミラー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体を観察するための蛍光観察装置および蛍光観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、マウス等の実験小動物に励起光を照射して、癌組織等の病変部から発生する蛍光を観察する蛍光観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
蛍光観察は発光観察と比較して、比較的高い輝度の蛍光を観察するので、観察画像が鮮明となり、観察しやすいという利点がある。
【０００３】
癌組織等の病変部を蛍光観察するために、腫瘍組織に高度に蓄積される性質のある蛍光造影剤や血管内において長時間の滞留性を有する蛍光造影剤を実験小動物に投与する方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。蛍光造影剤は、血管（静脈、動脈）内、経口内、腹腔内、皮下、皮内、膀胱内、気管支内等へ注入、噴霧もしくは塗布等により、生体内に投与することで、容易に目的部位を標識することができる。蛍光造影剤を用いた蛍光観察においては、Ｘ線造影、ＭＲＩ、超音波造影などによる画像診断に比べ、非常に簡便に病変部を検出することができるようになる。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５６５０１３５号明細書
【特許文献２】特開２００３−２６１４６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、蛍光造影剤を実験小動物へ投与する方法として多く用いられている、血管内に投与して目的部位を蛍光造影剤で標識して蛍光観察する方法の場合には、最終的に、腎臓の糸球体でろ過され、再吸収を受けなかった蛍光造影剤は、一時的に膀胱に蓄積されるため、膀胱から蛍光が検出されることがある。また、肝臓でも蛍光造影剤が蓄積されるため、肝臓からも蛍光が検出されることもある。
【０００６】
つまり、蛍光造影剤の性質上、観察したい対象の部位ではない膀胱や肝臓等から蛍光が検出されてしまうという問題がある。
さらに、実験小動物への蛍光造影剤の投与後の経過時間によっては、膀胱等に蓄積される量が多くなり、観察目的の部位である腫瘍組織や血管から検出される蛍光の方よりも、強い蛍光量の場合がある。
【０００７】
このような状態のときに蛍光画像を取得した場合、観察目的の部位ではない膀胱等が非常に強い蛍光を発しているために、腫瘍組織や血管の蛍光量に応じた露光時間で画像を取得することで、取得画像における膀胱等の部分がサチュレーションを起こしてしまい、膀胱付近の微小な血管などの蛍光は埋もれてしまうことがある。また、目的部位ではない膀胱等の蛍光の強い部分に合わせて画像取得時の露光時間を設定してしまうと、目的部位の微少な蛍光を鮮明に検出できないという問題がある。
【０００８】
また、蛍光造影剤の投与に限らず、小動物が食べた食物が胃や腸の中にある場合、その食物が持つ自家蛍光により胃や腸などが強く光ってしまうこともあり、この場合も同様の問題がある。さらには、小動物を固定するなどの目的で使用している器具の自家蛍光や反射光などでも同様の問題が発生する可能性がある。
【０００９】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、実験小動物を蛍光観察する際の画像において、観察したい目的部位が微少な蛍光であっても鮮明に観察ができる蛍光観察装置および蛍光観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、励起光を発する光源と、該光源からの励起光を実験小動物の撮像部位に照射する光学系と、前記実験小動物の所定領域または当該所定領域像を遮光する遮光手段と、前記実験小動物からの蛍光像を撮像する撮像手段と、該撮像手段により取得された前記実験小動物の蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を認識し、認識された高蛍光領域を遮光するように前記遮光手段を制御する制御手段とを備える蛍光観察装置を提供する。
【００１１】
上記発明においては、前記撮像手段により取得された前記実験小動物の蛍光画像を表示する表示手段と、該表示手段により表示された蛍光画像の前記高蛍光領域を指示する指示手段とを備えていてもよい。
また、前記遮光手段が、前記実験小動物の撮像部位と略共役な位置に配置されている液晶フィルタまたはデジタル・マイクロミラー・デバイスであってもよい。
また、前記遮光手段が、前記光学系の瞳位置と略共役な位置に配置されているガルバノミラーであってもよい。
【００１２】
また、本発明は、励起光を実験小動物の撮像部位に照射する照射工程と、前記実験小動物からの蛍光像を撮像する第１の撮像工程と、該第１の撮像工程において取得された蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を抽出する抽出工程と、該抽出工程において抽出された前記高蛍光領域に対応する実験小動物の高蛍光部位または当該高蛍光部位の像を遮光する遮光工程と、該遮光工程において前記高蛍光領域に対応する実験小動物の高蛍光部位または当該高蛍光部位の像を遮光した状態で当該実験小動物からの蛍光像を撮像する第２の撮像工程とを含む蛍光観察方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、実験小動物を蛍光観察する際の画像において、観察したい目的部位が微少な蛍光であっても鮮明な観察を行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の第１の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図１〜図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示されるように、観察装置本体２と、画像記憶部３と、表示部４と、これらを制御する制御部５とを備えている。
観察装置本体２は、実験小動物、例えば、マウスＡを搭載するステージ６と、観察光学系７と、該観察光学系７を収容して外部からの光を遮断するケース８とを備えている。
【００１５】
観察光学系７は、照明光を供給する照明装置９と、照明光を観察光学系７の光軸ａ上へ反射させるダイクロイックミラー１４と、照明光をリレーするリレー光学系１０と、マウスＡの観察部位と略共役位置に設けられ指定領域を遮光する遮光ユニット１１と、照明光をステージ６上のマウスＡに照射する一方、マウスＡから戻る反射光およびマウスＡからの蛍光を集光する対物レンズ１３と、対物レンズ１３により集光され、遮光ユニット１１、リレー光学系１０を通ってきた反射光を撮像手段１５に結像させる撮像光学系１２と、その像を撮影して蛍光画像を取得する撮像手段１５とを備えている。
【００１６】
照明装置９には、図示しない照明光を照射するための光源となるランプと特定の波長域のみを透過する特性を持つ励起フィルタおよび照明光を遮断するためのシャッタが備えられている。なお、励起フィルタは複数配置されており、光軸上に任意の一つを配置可能となっている。
撮像手段１５には、図示しない特定の波長域のみを透過する特性を持つ吸収フィルタが備えられている。
【００１７】
前記ケース８には、ステージ６近傍に開閉可能な扉１６が設けられている。扉１６には、該扉１６が閉じられたことを検出するセンサ１７が設けられている。符号１８は、センサ１７により検出する検出片である。
【００１８】
画像記憶部３は、照明装置９から出射された励起光をマウスＡに照射することにより、マウスＡの表面から発せられる蛍光を撮像手段１５によって撮影して得られたマウスＡの蛍光画像Ｇ１を記憶できるようになっている。
表示部４は、制御部５によって制御され、画像記憶部３で記憶された蛍光画像Ｇ１を表示するようになっている。
【００１９】
制御部５は、観察装置本体２を駆動し、蛍光量に応じて露光時間を調整し、マウスＡの蛍光画像Ｇ１を画像記憶部３において取得させるようになっている。図２に示されるように蛍光画像Ｇ１は、表示部４上に表示される。さらに、制御部５は、表示部４に表示された蛍光画像Ｇ１について、制御部５内の図示しない指示部より遮光したい領域Ｃを指定することができるようになっている。
【００２０】
また、図３に示されるように、制御部５は、遮光ユニット１１を駆動して、指定された遮光領域Ｃに対応する遮光位置Ｄについて遮光することができるようになっている。
遮光ユニット１１は、液晶の性質を利用して光の透過と遮光をコントロールすることのできる液晶フィルタ（以下、液晶フィルタ１１とも言う。）であり、制御部５によって、遮光したい領域Ｃに指定された位置に対応する領域Ｄ部分の液晶を駆動し、遮光することができるようになっている。
画像記憶部３、表示部４、制御部５は、一般のパーソナルコンピュータ等の装置でもよい。
【００２１】
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いてマウスＡの蛍光観察を行うには、観察者は、蛍光造影剤を投与したマウスＡを睡眠させた状態で観察装置本体２のケース８内のステージ６上にテープ等の固定手段で固定し、ケース８の扉１６を閉じる。
ケース８の扉１６にはセンサ１７が設けられているので、扉１６が閉じられたことを示す信号がセンサ１７から制御部５に送られる。扉が閉じられたことで、ケース８は、外部からの光を遮断され、暗箱になるので、蛍光をより鮮明に検出することができる。
【００２２】
制御部５においては、観察装置本体２および画像記憶部３に起動信号が送られ、観察装置本体２により蛍光画像Ｇ１の取得が行われる。
すなわち、制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射されると、ダイクロイックミラー１４で反射され、リレー光学系１０、液晶フィルタ１１、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。このとき、液晶フィルタ１１は、ＯＦＦ状態になっており、励起光およびマウスＡからの反射光は、すべて透過する。
【００２３】
励起光を照射することで、マウスＡに投与した蛍光造影剤が励起されて蛍光を発し、発せられた蛍光が対物レンズ１３により集光され、液晶フィルタ１１、リレー光学系１０、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通ってきた蛍光が撮像手段１５により撮影されて蛍光画像Ｇ１が取得される。撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３に記憶され、表示部４において表示される。
【００２４】
蛍光画像Ｇ１は、腫瘍組織に集積している蛍光造影剤により、蛍光を発している病変部Ｂと、例えば、膀胱や肝臓などの目的部位ではないが蛍光造影剤が高度に集積して蛍光を発している部位Ｃを有している。
つまり、表示部４には、蛍光画像Ｇ１から目的部位Ｂと不必要な蛍光を発する目的部位以外の遮光したい領域Ｃとが表示される。
【００２５】
観察者は、保有知識や経験上、対象の実験小動物の臓器の位置を把握しており、腫瘍組織等の目的部位Ｂと、位置Ｃについて、識別することができる。
そこで、観察者が表示部４上の蛍光画像Ｇ１を見ながら、識別したＣを図示しない指示部より指定すると、制御部５は、図３に示される液晶フィルタ１１の領域Ｄの位置や面積等を計算し、領域ＤがＯＮ状態になるように制御する。
【００２６】
指示された遮光領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、液晶フィルタ１１が駆動される。液晶フィルタ１１の遮光領域Ｄに対応する位置における画素をＯＮ状態にし、光を透過しないようにする。
そして、液晶フィルタ１１の領域ＤをＯＮにした状態で、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射されると、ダイクロイックミラー１４で反射され、リレー光学系１０を通り、液晶フィルタ１１の遮光領域Ｄ以外の部分を透過した励起光が対物レンズ１３を通り、ステージ６上のマウスＡに照射される。このときマウスＡの目的部位ではない領域Ｃ部分には、励起光は、照射されていない。
【００２７】
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、液晶フィルタ１１、リレー光学系１０、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通り、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が撮影される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００２８】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３に記憶され、表示部４において表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
【００２９】
このように本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、膀胱や腎臓などの、不必要に強い蛍光を発生させないように遮光することにより、画像取得時のサチュレーションを起こすことがなく、観察したい必要な蛍光が埋もれてしまうことなく、蛍光画像を取得することができる。
また、画像取得時に、観察したい部分に適した露光時間を設定することで、細かい血管などを見落とすことなく、鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００３０】
また、実験小動物飼育用の餌に含まれる材料に自家蛍光成分を持つものが使用されている場合があり、この餌を食べることで、腸管に蓄積され、蛍光観察装置１で実験小動物を観察すると腸管から強い蛍光を検出することがある。このようなときも、同様な方法で、目的部位のみ観察することができる。
さらに、その他の自家蛍光成分をもつものに対しても同様に観察することができる。
【００３１】
なお、本実施形態においては、液晶フィルタ１１の遮光のための制御をＯＮ、ＯＦＦ状態の切り替えのみで行ったが、電圧の制御により中間の遮光状態を設けることにしても良い。
中間の状態を設けることで、目的部位ではない臓器などの蛍光を完全に遮光をせず減少させた状態で、取得することができる。目的部位ではない臓器の位置を観察位置の基準として、目的部位の蛍光と併せて取得しておくことで、蛍光画像において観察時の位置の把握をすることができる。
【００３２】
また、本実施形態においては、遮光ユニット１１を液晶フィルタとしたが、これに限定されるものではなく、これに加えて、指示部より指示された遮光領域に応じて形状が変形可能な遮光部材など他の任意の形態の遮光ユニットに適用してもよい。
【００３３】
また、本実施形態においては、遮光領域の指定は、観察者による操作での指示であったが、ほぼ一定の結果（蛍光量）を得られることが事前に分かっている蛍光観察を複数回繰り返し行うような観察の場合は、任意に設定した蛍光量以上の領域を制御部５から自動的に指定し、必要に応じて遮光するとしてもよい。さらに、露光時間の設定も観察したい領域の蛍光量によって、自動で設定可能としても良い。
これにより、観察効率が上がり、画像取得にかかる時間が短縮されるという利点もある。
【００３４】
次に、本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１の特徴は、第１の実施形態における遮光ユニット１１の代わりに、光反射部１９を設けているところにある。
蛍光観察装置１の基本構成は、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１（図１）と同様である。本実施形態において、上述した第１の実施形態と同じ構成のものには同符号を付けて表示し、説明を省略する。
【００３５】
光反射部１９は、一般的に知られているデジタル・マイクロミラー・デバイス（ＤＭＤ）１９であり、マウスＡの観察部位と略共役な位置に配置されている。ＤＭＤ１９は、図示しない微小なミラーの集合体で構成されている。それぞれのミラーの角度を調節することで、照明装置９から照射された照明光を投影したい位置にだけ反射させることができるようになっている。
【００３６】
図４に示されるように、制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、リレー光学系２０を通った励起光は、ＤＭＤ１９に当たり、それぞれのミラーの角度を調整することで、励起光を反射させる。このとき、ＤＭＤ１９のミラーは、すべて駆動しており、全領域において励起光を反射させる。ミラーにおいて反射された励起光は、ダイクロイックミラー１４で反射され、観察光学系７の光軸ａ方向へ導入され、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。
【００３７】
マウスＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通り、撮像手段１５により撮像され、蛍光画像Ｇ１が取得される。図４に示されるように、撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。表示された蛍光画像Ｇ１から膀胱等の目的部位以外の遮光したい領域Ｄを指定することができる。指定された領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、ＤＭＤ１９が駆動される。
【００３８】
そして、同様に、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射される。励起光は、リレー光学系２０を通り、ＤＭＤ１９の指定された遮光領域Ｄ以外の位置におけるミラー１９ａによって反射され、さらにダイクロイックミラー１４で反射され、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。このときマウスＡの目的部位ではない領域Ｃ部分には、励起光は、照射されていない。
【００３９】
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通り、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が撮影される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００４０】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
【００４１】
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１は、第１の実施形態の効果に加えて、ＤＭＤを用いているので、励起光の損失がより少ないという効果がある。
なお、本実施形態においては、光反射部をＤＭＤ１９としたが、これに限定されるものではなく、他の任意の形態の光反射部材を適用してもよい。
【００４２】
次に、本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１の特徴は、第２の実施形態における光反射部の代わりに、光走査部２１および高速シャッタ２２を設けているところにある。
蛍光観察装置１の基本構成は、第１の実施形態（図１）と同様である。第３の実施形態において、第１の実施形態と同じ構成のものには同符号を付けて表示しているので説明は省略する。
【００４３】
光走査部２１は、一般に知られているガルバノミラーであり、例えば、１軸回りに揺動させられる２台のガルバノミラーを対物レンズ１３の瞳位置と略共役な面に近接させ、２軸を直交させて配置した、いわゆる近接ガルバノミラーである。ガルバノミラー（以下、ガルバノミラー２１とも言う。）は、制御部５からの制御信号により、直交する２軸回りに高速で揺動させられるようになっている。これにより、２台のガルバノミラー２１に入射された照明光をそれぞれ所定の角度範囲にわたって振ることで、マウスＡ上の観察したい領域にわたって照明光を走査させることができる。
【００４４】
高速シャッタ２２は、例えば、一般に知られている音響光学素子である。高速シャッタ２２の開閉を制御することで、照明装置９から照射された照明光を光走査部２１の任意の位置にのみ照射することができる。
照明光学系２７は、光走査部２１からの照明光をダイクロイックミラー１４、対物レンズ１３を通って、マウスＡに照射するための光学系である。
【００４５】
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、例えば、レーザ走査型顕微鏡１であって、照明装置９は、例えば、レーザーダイオードなどを用いたレーザ光源装置９であり、撮像手段１５は、例えば、高感度ＣＣＤカメラを用いる光電子増倍管を用いた光検出器である。
【００４６】
制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、高速シャッタ２２を通過し、光走査部２１に入射される。ガルバノミラー２１を揺動させ、入射された励起光を所定の角度範囲内で偏向する。このとき、高速シャッタ２２は、開いた状態であり、ガルバノミラー２１は、全領域において励起光を走査させる。そして、励起光は、照明光学系２７を通り、ダイクロイックミラー１４で反射され、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。
【００４７】
マウスＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通り、撮像手段１５により撮像され、蛍光画像Ｇ１が取得される。撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。
【００４８】
表示された蛍光画像Ｇ１から膀胱等の目的部位以外の遮光したい領域Ｄを指定することができる。指定された領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、高速シャッタ２２とガルバノミラー２１を駆動し、指定領域にのみ励起光を照射する。
【００４９】
そして、同様に、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射される。高速シャッタ２２を通過した励起光は、ガルバノミラー２１の指定された遮光領域Ｄ以外の位置のみガルバノミラー２１によって反射され、照明光学系２７を通り、ダイクロイックミラー１４で反射され、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。このときマウスＡの目的部位ではない領域Ｃ部分には、励起光は、照射されていない。
【００５０】
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、ダイクロイックミラー１４を透過し、撮像光学系１２を通って、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が撮影される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００５１】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
【００５２】
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１は、ガルバノミラー２１を用いているので、第１、第２の実施形態の効果に加えて、Ｚ方向に走査することができるという効果がある。
なお、本実施形態においては、高速シャッタ２２を音響光学素子としたが、これに限定されるものではなく、他の任意の形態の高速で制御可能な部材を適用してもよい。
【００５３】
次に、本発明の第４の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１の特徴は、第１の実施形態における照明装置および観察光学系を斜照明による配置にしたところにある。
【００５４】
蛍光観察装置１の基本構成は、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１（図１）と同様である。第４の実施形態において、第１の実施形態と同じ構成のものには同符号を付けて表示しているので説明は省略する。
【００５５】
遮光ユニット１１は、例えば、第１の実施形態と同様な液晶フィルタ１１であり、ＯＮ、ＯＦＦ状態の切り替えにより、光の透過する範囲を制御させることができ、マウスＡの観察部位と略共役な位置に配置されている。
照明光学系２３は、マウスＡに励起光を照射するための光学系である。
【００５６】
リレー光学系２４は、遮光ユニット１１を含み、対物レンズ１３によって集光されたマウスＡからの蛍光を撮像光学系１２へ導入するための光学系である。
図６に示されるように、制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、照明光学系２３へ導入される。導入された励起光は、ステージ６上のマウスＡに照射される。
【００５７】
マウスＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１３により集光され、リレー光学系２４、液晶フィルタ１１、撮像光学系１２を通り、蛍光を撮像手段１５により撮像され、蛍光画像Ｇ１が取得される。このとき、液晶フィルタ１１は、ＯＦＦ状態になっており、励起光およびマウスＡからの反射光は、すべて透過する。
【００５８】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。表示された蛍光画像Ｇ１から膀胱等の目的部位以外の遮光したい領域Ｄを指定することができる。指定された領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、液晶フィルタ１１が駆動される。液晶フィルタ１１の遮光領域Ｃに対応する位置における画素をＯＮ状態にし、光を透過しないようにする。
【００５９】
そして、同様に、液晶フィルタ１１の領域ＤをＯＮ状態で、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、照明光学系２３を通り、ステージ６上のマウスＡに照射される。
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、リレー光学系２４を通り、液晶フィルタ１１の遮光領域Ｄ以外の部分を透過した励起光は、撮像光学系１２を通過し、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が取得される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００６０】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３に記憶され、表示部４に表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
【００６１】
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１は、第１〜第３の実施形態の効果に加えて、斜照明を用いているので、広い照野を設けることができるという効果がある。
なお、本実施形態においては、照明光をある一方向から照射したが、これに限定されるものではなく、これに加えて、任意の方向、角度から照明光を照射しても良い。
【００６２】
また、本実施形態においては、照明装置と照明光学系を１組みとしたが、これに限定されるものではなく、さらに明るい照明光を照射するために複数組み設けても良い。
また、本実施形態においては、遮光するために、第１の実施形態と同様に遮光ユニットとして、液晶フィルタを用いたが、第２の実施形態のような光反射部や、第３の実施形態のような光走査部を用いたシステムを本実施形態の斜照明を併用させても同様の効果を得ることができる。
【００６３】
次に、本発明の第５の実施形態に係る蛍光観察装置１について、図７を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置の特徴は、第１の実施形態における遮光ユニット１１を照明光の光路上ではなく、蛍光の光路上の撮像手段１５の前に配置したところにある。
【００６４】
本実施形態に係る蛍光観察装置１の基本構成は、第１の実施形態に係る蛍光観察装置１（図１）と同様である。第５の実施形態において、第１の実施形態と同じ構成のものには同符号を付けて表示しているので説明は省略する。
【００６５】
遮光ユニット１１は、例えば、第１の実施形態と同様な液晶フィルタ１１であり、ＯＮ、ＯＦＦ状態の切り替えにより、光の透過する範囲を制御させることができ、マウスＡの観察部位と略共役な位置に配置されている。
リレー光学系２５は、対物レンズ１３によって集光されたマウスＡからの蛍光をダイクロイックミラー１４、液晶フィルタ１１、撮像光学系２６へ導入するための光学系である。撮像光学系２６は、遮光ユニット１１を透過した蛍光を撮像手段１５に結像させる位置に配置されている。
【００６６】
図７に示されるように、制御部５からの起動信号に応じて、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、ダイクロイックミラー１４で反射され、観察光学系７の光軸ａ方向へ導入され、リレー光学系２５を通り、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。
【００６７】
マウスＡから発せられた蛍光は、対物レンズ１３により集光され、リレー光学系２５を通り、ダイクロイックミラー１４を透過し、液晶フィルタ１１、撮像光学系２６を通ってきた蛍光を撮像手段１５により撮像され、蛍光画像Ｇ１が取得される。このとき、液晶フィルタ２４は、ＯＦＦ状態になっており、マウスＡからの蛍光は、すべて透過する。
【００６８】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ１は、画像記憶部３において、記憶され、表示部４において表示される。表示された蛍光画像Ｇ１から膀胱等の目的部位以外の遮光したい領域Ｄを指定することができる。指定された領域Ｄは、制御部５から観察装置本体２に通信され、液晶フィルタ１１を駆動する。液晶フィルタ１１の遮光領域Ｃに対応する位置における画素をＯＮ状態にし、光を透過しないようにする。
【００６９】
そして、同様に、観察装置本体２の照明装置９から励起光が出射され、ダイクロイックミラー１４で反射され、リレー光学系２５を通り、対物レンズ１３によって、ステージ６上のマウスＡに照射される。
マウスＡからの蛍光は、対物レンズ１３により集光され、リレー光学系２５を通り、ダイクロイックミラー１４を透過し、液晶フィルタ１１の遮光領域Ｄ以外の部分を透過した励起光は、撮像光学系２６を通り、撮像手段１５により領域Ｃが遮光されている蛍光画像Ｇ２が取得される。画像取得時には、目的部位Ｂに適した露光時間を設定し、蛍光画像Ｇ２を取得する。
【００７０】
撮像手段１５により取得された蛍光画像Ｇ２は、画像記憶部３において、記憶され、表示部４において表示される。取得された蛍光画像Ｇ２の目的部位ではない領域Ｃ部分の蛍光は遮光されているので、目的部位Ｂの蛍光のみを有している。
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１は、第１の実施形態の効果に加えて、遮光ユニット１１を撮像手段１５の直前に配置しており、照明光からの励起光は、遮光ユニット１１を透過しないため、蛍光の損失がより少ないという効果がある。
【００７１】
なお、以上の実施形態においては、実験小動物としてマウスＡを例示したが、これに限定されるものではなく、ラットやウサギなど他の任意の実験小動物の蛍光観察に適用してもよい。
また、以上の実施形態においては、生きたままの実験小動物の蛍光画像について述べたが、本発明はこれに捉われるものではなく、例えば、実験小動物のｅｘ ｖｉｖｏ観察等にも適宜適用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【図２】図１の蛍光観察装置の表示部に表示された蛍光画像を示す図である。
【図３】図１の蛍光観察装置の遮光ユニットの遮光部を示す図である。
【図４】本発明の第２の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【図５】本発明の第３の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【図６】本発明の第４の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【図７】本発明の第５の実施形態に係る蛍光観察装置の概略構成を示す図である。
【符号の説明】
【００７３】
Ａ 実験小動物
１ 蛍光観察装置
４ 表示部（表示手段）
５ 制御部（制御手段）
９ 照明装置（光源）
１０ リレー光学系（光学系）
１１ 遮光ユニット、液晶フィルタ、ＤＭＤ（遮光手段）
１５ 撮像手段
１９ ガルバノミラー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を発する光源と、
該光源からの励起光を実験小動物の撮像部位に照射する光学系と、
前記実験小動物の所定領域または当該所定領域像を遮光する遮光手段と、
前記実験小動物からの蛍光像を撮像する撮像手段と、
該撮像手段により取得された前記実験小動物の蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を認識し、認識された高蛍光領域を遮光するように前記遮光手段を制御する制御手段とを備える蛍光観察装置。
【請求項２】
前記撮像手段により取得された前記実験小動物の蛍光画像を表示する表示手段と、
該表示手段により表示された蛍光画像の前記高蛍光領域を指示する指示手段とを備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
前記遮光手段が、前記実験小動物の撮像部位と略共役な位置に配置されている液晶フィルタまたはデジタル・マイクロミラー・デバイスである請求項１または請求項２に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
前記遮光手段が、前記光学系の瞳位置と略共役な位置に配置されているガルバノミラーである請求項１または請求項２に記載の蛍光観察装置。
【請求項５】
励起光を実験小動物の撮像部位に照射する照射工程と、
前記実験小動物からの蛍光像を撮像する第１の撮像工程と、
該第１の撮像工程において取得された蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を抽出する抽出工程と、
該抽出工程において抽出された前記高蛍光領域に対応する実験小動物の高蛍光部位または当該高蛍光部位の像を遮光する遮光工程と、
該遮光工程において前記高蛍光領域に対応する実験小動物の高蛍光部位または当該高蛍光部位の像を遮光した状態で当該実験小動物からの蛍光像を撮像する第２の撮像工程とを含む蛍光観察方法。
【請求項１】
励起光を発する光源と、
該光源からの励起光を実験小動物の撮像部位に照射する光学系と、
前記実験小動物の所定領域または当該所定領域像を遮光する遮光手段と、
前記実験小動物からの蛍光像を撮像する撮像手段と、
該撮像手段により取得された前記実験小動物の蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を認識し、認識された高蛍光領域を遮光するように前記遮光手段を制御する制御手段とを備える蛍光観察装置。
【請求項２】
前記撮像手段により取得された前記実験小動物の蛍光画像を表示する表示手段と、
該表示手段により表示された蛍光画像の前記高蛍光領域を指示する指示手段とを備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
前記遮光手段が、前記実験小動物の撮像部位と略共役な位置に配置されている液晶フィルタまたはデジタル・マイクロミラー・デバイスである請求項１または請求項２に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
前記遮光手段が、前記光学系の瞳位置と略共役な位置に配置されているガルバノミラーである請求項１または請求項２に記載の蛍光観察装置。
【請求項５】
励起光を実験小動物の撮像部位に照射する照射工程と、
前記実験小動物からの蛍光像を撮像する第１の撮像工程と、
該第１の撮像工程において取得された蛍光画像における所定の蛍光量以上の高蛍光領域を抽出する抽出工程と、
該抽出工程において抽出された前記高蛍光領域に対応する実験小動物の高蛍光部位または当該高蛍光部位の像を遮光する遮光工程と、
該遮光工程において前記高蛍光領域に対応する実験小動物の高蛍光部位または当該高蛍光部位の像を遮光した状態で当該実験小動物からの蛍光像を撮像する第２の撮像工程とを含む蛍光観察方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−２５７９６７（Ｐ２００９−２５７９６７Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１０８０３６（Ｐ２００８−１０８０３６）
【出願日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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