蛍光試薬
【課題】蛍光試薬を提供する。
【解決手段】２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出するための蛍光試薬であって、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの誘導体、及び上記誘導体が、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ、又はＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆである誘導体。
【効果】本発明により、プロテオーム解析において、異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出することが可能な新規蛍光試薬を提供することができる。
【解決手段】２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出するための蛍光試薬であって、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの誘導体、及び上記誘導体が、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ、又はＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆである誘導体。
【効果】本発明により、プロテオーム解析において、異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出することが可能な新規蛍光試薬を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出することを可能とする新規蛍光試薬に関するものであり、更に詳しくは、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの新規誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより検出する蛍光試薬として、本発明者は、先に、ＳＢＤ−Ｆ、ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆを開発している（非特許文献１−２）。
【０００３】
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，７５，３７２５−３７３０
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５，１５，２８６５−２８７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまでに本発明者らは、チオール基選択的水溶性ベンゾフラザン蛍光誘導体化試薬である７−Ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）及び４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）を開発し、これを用いてタンパク質を誘導体化し、ＨＰＬＣ−蛍光検出法及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータベース検索により同定するプロテオーム解析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）を開発した。一方、異なる試料の同時分析を可能とするためＤＡＡＢＤ−Ｃｌと異なる蛍光特性を持ちベンゾセレナジアゾール骨格をする７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）の開発を行い、それぞれの誘導体の二波長同時検出法の開発を試みたが、誘導体の保持時間は大きく異なっていた。本発明では、６種の化合物を新規に合成し、それらを組み合わせた二波長同時検出法の構築に成功した。
本発明は、プロテオーム解析において、異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出することが可能な新規蛍光試薬を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出するための蛍光試薬であって、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの誘導体。
（２）上記誘導体が、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ、又はＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆである前記（１）記載の誘導体。
【０００６】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
１．新規蛍光試薬の合成
本発明では、４−ｃｈｌｏｒｏ−７−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｃｌ）をトリエチルアミン存在下でＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅと室温又は０℃でそれぞれ反応させて、
７−Ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ，２）
７−Ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−［２−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ，３）
７−Ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−［３−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ，４）
を合成した。また、２−Ｆｌｕｏｒｏ−６−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅを出発材料とし、パラジウム−活性炭触媒で接触還元を行い、３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅを得た。これをＳｅＯ２と反応させ、４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅを得た。これをクロロスルホン酸と反応させ、４−ｃｈｌｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＳｅＤ−Ｆ）を得た。ＣＢＳｅＤ−ＦをＣＢＤ−Ｃｌと同様に反応させ、
７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ，６）
７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［２−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ，７）
７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［３−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ，８）
をそれぞれ合成した。
【０００７】
２．誘導体の蛍光特性の検討
ペプチド及びタンパク質との反応性
２．５μＭオキシトシンと０．３μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを１２０μＬの５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ・５ｍＭ ＴＣＥＰ・１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合液、６０μＬの８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）、１０μＬの１４０ｍＭ化合物１−８各溶液をそれぞれ混合し、４０℃・１０−８０分間反応させた。化合物１−８はそれぞれアセトニトリルに、オキシトシンは純水に、それ以外の物質は８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）にそれぞれ溶解させた。反応液の１０μＬを蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、蛍光強度を測定した。
【０００８】
各誘導体の蛍光スペクトル測定
１００μＭオキシトシンと１０μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを６０μＬの５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ・５ｍＭ ＴＣＥＰ・１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合液、２５μＬの８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）、５μＬの１４０ｍＭ化合物１−８各溶液をそれぞれ混合し、４０℃・４０分間反応させた。化合物１−８はそれぞれアセトニトリルに、オキシトシンは純水に、それ以外の物質は８Ｍ塩酸グアニジンを含むビシン緩衝溶液（ｐＨ８．５）にそれぞれ溶解させた。３μＬの１０％トリフルオロ酢酸を加えて反応を停止させた後、反応液の１０μＬを蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、オキシトシンとＢＳＡに相当する部分を分取した。各分画について蛍光光度計で励起・蛍光波長を測定した。
【０００９】
各誘導体の保持時間の測定
２．５μＭオキシトシン・５．０μＭソマトスタチン・２．５μＭカルシトニン・２．５μＭトリプシンインヒビター及び０．５μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを［各誘導体の蛍光スペクトル測定］と同様の方法で蛍光誘導体化反応を行った。反応液の２０μＬを蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、各誘導体の保持時間を測定した。（表２）
【００１０】
ＨＰＬＣ条件：
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｍｔａｋｔ ＷＰ−ＲＰ（２５０ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：（ａ）１０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ （ｂ）７０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｔｉｍｅ：０→３６（ｍｉｎ），（ｂ）：０→６０％
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．７０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６０℃
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：
３９５ｎｍ（Ｅｍ），５０５ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ １−４
４２２ｎｍ（Ｅｍ），５４２ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ５−８
【００１１】
３．二波長同時測定法の検討
５．０μＭオキシトシン及び０．５μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬ［各誘導体の蛍光スペクトル測定］と同様の方法でＤＡＡＢＤ−Ｃｌ（１）又はＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）とそれぞれ蛍光標識化反応を行った。反応液を当量ずつ混合しその２０μＬを蛍光検出器２台を直列に接続したＨＰＬＣに注入し二波長同時測定を行った。
【００１２】
ＨＰＬＣ条件：
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｍｔａｋｔ ＷＰ−ＲＰ（２５０ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：（ａ）１０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ （ｂ）７０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｔｉｍｅ：０→３６（ｍｉｎ），（ｂ）：０→６０％
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．７０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６０℃
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：
４５０ｎｍ（Ｅｍ），５７０ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ １ｓｔ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
３７５ｎｍ（Ｅｍ），４８０ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ２ｎｄ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
【００１３】
本発明でベンゾキサジアゾール骨格及びベンゾセレナジアゾール骨格を持つ蛍光試薬６種を新たに合成した。各試薬の反応性を検討したところ、いずれも反応時間４０分で最大の蛍光強度を与えた。また、各試薬誘導体の励起・蛍光波長は骨格に依存し、側鎖部分の変化は蛍光特性に大きな影響は与えなかった。
ペプチド及びタンパク質で各試薬誘導体の保持時間を測定したところ、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ（１）とＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）及びＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ（２）とＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（８）の組合せでそれぞれの誘導体が異なる蛍光特性とほぼ同じ保持時間を示し、二波長同時測定法への適用が可能であることが示唆された。
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ（１）とＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）の組合せでペプチドとタンパク質を用いて二波長同時検出法の検討を行った。その結果、それぞれの試薬に対して特異的なクロマトグラムが類似した形で得ることができた。この試薬の組合せは、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ（５）を用いた場合よりもピークの比較同定が容易であることから、二波長同時測定法を用いた変異タンパク質の発見など、プロテオーム解析への様々な応用が期待できる。
【００１４】
誘導体の蛍光特性
誘導体のフルオレッセンススペクトルを測定し、新しく合成された試薬（２−４，６−８）は同時検出実験に利用可能であることが確認された。本発明では、誘導体はＨＰＬＣで分離され、スペクトルを直接測定した。ベンゾキサジアゾール試薬（１−４）誘導体は、最大励起波長がペプチド（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）で３８６から３８９ｎｍ及びプロテイン（ＢＳＡ）で３８９から３９２ｎｍの範囲であり、また、最大発光波長は、５０３から５０５ｎｍ及び５０２から５０３ｎｍであった。
一方、ベンゾキサジアゾール試薬（５−８）誘導体は、最大励起波長は４１０から４１２ｎｍ及び４１８から４２３ｎｍの範囲であり、また、最大発光波長は、５３１から５３５ｎｍ及び５３５から５３７ｎｍの範囲であった（表１）。
【００１５】
【表１】
【００１６】
ペプチド及びプロテインの蛍光誘導体の分離
各誘導体のリテンションタイムは、表２に示される。
ＤＡＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎは、ＤＡＡＢＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎの約２分前に溶出された。一方、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ（５）のＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン部分をＮ，Ｎ−ジメチルプロピレンジアミンで置換した、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆで誘導体化されたＤＡＰＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎは、ＤＡＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎの０．７分後に溶出された。
ＤＡＡＢＳｅＤ−ＦのＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン部分をＮ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミンで置換した、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）で誘導体化されたＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎは、ＤＡＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎの約２．９分後に溶出した。
ＤＡＡＢＳｅＤ−ＦのＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン部分をＮ，Ｎ−ジエチルプロピレンジアミンで置換した、ＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（８）で誘導体化されたＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎは、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−及びＤＥＡＥＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎの約２．６分後に溶出された。
【００１７】
【表２】
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、プロテオーム解析において、異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出することが可能な新規蛍光試薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
試薬
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ，１及びＮ−ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ，５は、文献（非特許文献１−２）に記載の方法に従って合成した。４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾールは市販品（東京化成工業）を購入し、それ以上精製しないで使用した。トリプシン阻害剤（ｓｏｙｂｅａｎ：ＭＷ２４０４９）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン及びＮ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミンは市販品（和光純薬工業）を購入し、それ以上精製しないで使用した。
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン ハイドロクロライド（ＴＣＥＰ）、８Ｍグアニジン ハイドロクロライド（ｂｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．５）及び子牛血清アルブミン（ＢＳＡ，ＭＷ６６３８５）は市販品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を購入した。
【００２０】
オキシトシン（ＭＷ１００７）及びカルシトニン（ヒト；ＭＷ３４１８）は市販品（ペプチド工業）を購入した。
ソマトスタチン（ＭＷ１６３８）は市販品（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を購入した。３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）及びエチレンジアミンテトラアセチック アシド ジソジウム塩（Ｎａ２ＥＤＴＡ）は市販品（Ｄｏｊｉｎｄｏ研究所）を購入した。ＨＰＬＣ実験のために、アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）及びトリフルオロアセチック アシド（アミノ酸配列グレード）は市販品（和光純薬工業）を購入した。Ｑｕｉｋ Ｓｔａｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔは市販品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を購入した。その他の全ての試薬は、分析用又は保障付試薬を使用した。
【実施例１】
【００２１】
７−クロロ−Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ，２）
４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾールのアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．１８ｍｌ，１．４３モル）及びトリエチルアミン（０．２０ｍｌ，１．４３モル）を室温で加えた。反応混合物を３０分撹拌し、真空下で濃縮した。得られた残渣をクロロホルムに溶解し、飽和アンモニウムクロライド溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４：１）で精製し、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ（２）を黄色結晶として得た。
【００２２】
（８７．５ｍｇ，２８％；ｍｐ１３６．８−１３８．４℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ７．９５（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．２７（ｓ，６Ｈ），１．６８（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ１４８．８５，１４５．１０，１３３．３４，１２９．１８，１２８．２３，１２７．１８，５９．１０，４５．０４，４４．１９，２４．６３；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４４６，２９５１，２８０６，１５２７，１３４０，１１５１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ１５ＣｌＮ４Ｏ３Ｓ （Ｍ＋）３１８．０５５３，ｆｏｕｎｄ ３１８．０５６４．
【実施例２】
【００２３】
７−クロロ−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ，３）
４−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（０．２５ｇ，０．９９モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（０．２１ｍｌ，１．４９モル）及びトリエチルアミン（０．２１ｍｌ，１．４９モル）を室温で加えた。反応混合物を３０分撹拌し、真空下で濃縮した。得られた残渣をクロロホルムに溶解し、アンモニウムクロライド水溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し、黄色固体を得た。メチレンクロライド及びジイソプロピルエーテルからの再結晶化により、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ，（３）を明黄色の板状体として得た。
【００２４】
（０．２２ｇ，６７％；ｍｐ８８．８−９０．４℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ７．９７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．４８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ１４８．７７，１４５．００，１３３．４０，１２９．１５，１２７．８８，１２７．４７，５１．１４，４６．０９，４０．４５，１１．３６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４４６，３２０９，３１０１，２９７６，２８１７，１５２５，１３４７，１１６４；Ａｎａｌ．ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ１７ＣｌＮ４Ｏ３Ｓ：Ｃ，４３．３１；Ｈ，５．１５；Ｎ，１６．８３．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，４３．４５；Ｈ，５．０３；Ｎ，１６．９３．
【実施例３】
【００２５】
７−クロロ−Ｎ−［３−（ジエチルアミノ）プロピル］−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ，４）
４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（０．２１ｇ，０．８３モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミン（０．２０ｍｌ，１．２５モル）及びトリエチルアミン（０．１７ｍｌ，１．２５モル）を０℃で加えた。反応混合物を同一温度で３０分撹拌し、真空下で濃縮した。得られた残渣をクロロホルムに溶解し、飽和アンモニウムクロライド溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ（４）を明るい黄色の結晶として得た。
【００２６】
（０．１０ｇ，３５％；ｍｐ９９．７−１０１．９℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）δ８．０６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｍ，８Ｈ），１．９３（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ）δ１５０．３９，１４６．６６，１３５．５８，１３１．３３，１２９．３３，１２８．１０，５０．４１，４１．２１，２５．６９，９．２６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３５０１，３４２８，３２０９，２９７３，２７３３，２６７５，１５２４，１３３８，１１６０；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ１９ＣｌＮ４Ｏ３Ｓ（Ｍ＋）３４６．０８６６，ｆｏｕｎｄ ３４６．０８３８．
【実施例４】
【００２７】
７−フルオロ−Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ，６）
７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホニルクロライド（０．３０ｇ，０．９８モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．１２ｍｌ，０．９８モル）及びトリエチルアミン（０．１４ｍｌ，０．９８モル）を０℃で加え、反応混合物を同じ温度で１５分撹拌した。飽和アンモニウムクロライド水溶液を混合物に加え、全体をメチレンクロライドで３回抽出した。有機相を合わせて、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４：１）で精製し、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（６）をオレンジ色の結晶として得た。
【００２８】
（０．３２ｇ，８８％；ｍｐ１００．９−１０２．１℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ８．１７（ｄｄ，Ｊ＝５．２，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄｄ，Ｊ＝８．０，９．６Ｈｚ，１Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．２５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．１３（ｓ，６Ｈ），１．５８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１００ＭＨｚ）δ１５８．８８，１５６．８８，１５６．８６，１５６．２０，１５３．０１，１５２．８６，１３３．５２，１３３．４３，１３１．１５，１３１．０９，１１１．０１，１１０．８３，５７．９０，４５．３０，４２．５３，２８．２６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）１５３１，１３３０，１１５０，１０９６；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ１５ＦＮ４Ｏ２ＳＳｅ（Ｍ＋）３６６．００６５，ｆｏｕｎｄ ３６６．００５４．
【実施例５】
【００２９】
７−フルオロ−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ，７）
７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホニルクロライド（０．３１ｇ，１．０３モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン（０．１５ｍｌ，１．０３モル）及びトリエチルアミン（０．１４ｍｌ，１．０３モル）を０℃で加えた。反応混合物を同じ温度で２０分撹拌し、上述の方法と同様にして、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）をオレンジ色の結晶として得た。
【００３０】
（０．３３ｇ，８４％；ｍｐ７０．５−７１．１℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ８．１８（ｄｄ，Ｊ＝４．８，８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１０．０Ｈｚ，１Ｈ），２．９９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．５１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），２．４０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１００ＭＨｚ）δ１５８．９１，１５６．８３，１５６．２２，１５２．９５，１５２．８１，１３３．５０，１３３．４１，１３０．８７，１３０．８２，１１１．０２，１１０．８４，５２．９７，４７．７９，４１．５４，１１．３７；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）１５２６，１３３３，１１４９；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ１７ＦＮ４Ｏ２ＳＳｅ（Ｍ＋）３８０．０２２１，ｆｏｕｎｄ ３８０．０２４０．
【実施例６】
【００３１】
７−フルオロ−Ｎ−［３−（ジエチルアミノ）プロピル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ，８）
７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホニルクロライド（０．３０ｇ，０．９９モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミン（０．１６ｍｌ，０．９９モル）及びトリエチルアミン（０．１４ｍｌ，０．９９モル）を０℃で加えた。反応混合物を同じ温度で２０分撹拌し、上述の方法と同様にして、ＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（８）をオレンジ色の結晶として得た。
【００３２】
（０．３３ｇ，８５％；ｍｐ１４２．７−１４３．２℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ８．１７（ｄｄ，Ｊ＝５．２，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝８．０，９．６Ｈｚ，１Ｈ），３．３０（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．４５−２．３６（ｍ，６Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），１．６３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１００ＭＨｚ）δ１５８．８７，１５６．９０，１５６．８８，１５６．１８，１５３．０２，１５２．８７，１３３．４７，１３３．３９，１３１．２５，１３１．２０，１１１．０３，１１０．８４，５１．２３，４７．５９，４２．７９，２７．２８，１１．１７；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）１６１５，１５２６，１３２１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ１９ＦＮ４Ｏ２ＳＳｅ（Ｍ＋）３９４．０３７８，ｆｏｕｎｄ ３９４．０３３３．
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上詳述したように、本発明は、蛍光試薬に係るものであり、本発明により、プロテオーム解析において、２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出してペプチド又はプロテインのプロファイルを高精度に解析することを可能とする新規蛍光試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】蛍光試薬の化学構造を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出することを可能とする新規蛍光試薬に関するものであり、更に詳しくは、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの新規誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより検出する蛍光試薬として、本発明者は、先に、ＳＢＤ−Ｆ、ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆを開発している（非特許文献１−２）。
【０００３】
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，７５，３７２５−３７３０
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５，１５，２８６５−２８７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまでに本発明者らは、チオール基選択的水溶性ベンゾフラザン蛍光誘導体化試薬である７−Ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）及び４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）を開発し、これを用いてタンパク質を誘導体化し、ＨＰＬＣ−蛍光検出法及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータベース検索により同定するプロテオーム解析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）を開発した。一方、異なる試料の同時分析を可能とするためＤＡＡＢＤ−Ｃｌと異なる蛍光特性を持ちベンゾセレナジアゾール骨格をする７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）の開発を行い、それぞれの誘導体の二波長同時検出法の開発を試みたが、誘導体の保持時間は大きく異なっていた。本発明では、６種の化合物を新規に合成し、それらを組み合わせた二波長同時検出法の構築に成功した。
本発明は、プロテオーム解析において、異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出することが可能な新規蛍光試薬を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出するための蛍光試薬であって、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの誘導体。
（２）上記誘導体が、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ、又はＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆである前記（１）記載の誘導体。
【０００６】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
１．新規蛍光試薬の合成
本発明では、４−ｃｈｌｏｒｏ−７−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｃｌ）をトリエチルアミン存在下でＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、Ｎ，Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅと室温又は０℃でそれぞれ反応させて、
７−Ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ，２）
７−Ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−［２−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ，３）
７−Ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−［３−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ，４）
を合成した。また、２−Ｆｌｕｏｒｏ−６−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅを出発材料とし、パラジウム−活性炭触媒で接触還元を行い、３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅを得た。これをＳｅＯ２と反応させ、４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅを得た。これをクロロスルホン酸と反応させ、４−ｃｈｌｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＳｅＤ−Ｆ）を得た。ＣＢＳｅＤ−ＦをＣＢＤ−Ｃｌと同様に反応させ、
７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ，６）
７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［２−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ，７）
７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［３−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ，８）
をそれぞれ合成した。
【０００７】
２．誘導体の蛍光特性の検討
ペプチド及びタンパク質との反応性
２．５μＭオキシトシンと０．３μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを１２０μＬの５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ・５ｍＭ ＴＣＥＰ・１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合液、６０μＬの８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）、１０μＬの１４０ｍＭ化合物１−８各溶液をそれぞれ混合し、４０℃・１０−８０分間反応させた。化合物１−８はそれぞれアセトニトリルに、オキシトシンは純水に、それ以外の物質は８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）にそれぞれ溶解させた。反応液の１０μＬを蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、蛍光強度を測定した。
【０００８】
各誘導体の蛍光スペクトル測定
１００μＭオキシトシンと１０μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを６０μＬの５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ・５ｍＭ ＴＣＥＰ・１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合液、２５μＬの８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）、５μＬの１４０ｍＭ化合物１−８各溶液をそれぞれ混合し、４０℃・４０分間反応させた。化合物１−８はそれぞれアセトニトリルに、オキシトシンは純水に、それ以外の物質は８Ｍ塩酸グアニジンを含むビシン緩衝溶液（ｐＨ８．５）にそれぞれ溶解させた。３μＬの１０％トリフルオロ酢酸を加えて反応を停止させた後、反応液の１０μＬを蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、オキシトシンとＢＳＡに相当する部分を分取した。各分画について蛍光光度計で励起・蛍光波長を測定した。
【０００９】
各誘導体の保持時間の測定
２．５μＭオキシトシン・５．０μＭソマトスタチン・２．５μＭカルシトニン・２．５μＭトリプシンインヒビター及び０．５μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを［各誘導体の蛍光スペクトル測定］と同様の方法で蛍光誘導体化反応を行った。反応液の２０μＬを蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、各誘導体の保持時間を測定した。（表２）
【００１０】
ＨＰＬＣ条件：
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｍｔａｋｔ ＷＰ−ＲＰ（２５０ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：（ａ）１０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ （ｂ）７０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｔｉｍｅ：０→３６（ｍｉｎ），（ｂ）：０→６０％
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．７０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６０℃
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：
３９５ｎｍ（Ｅｍ），５０５ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ １−４
４２２ｎｍ（Ｅｍ），５４２ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ５−８
【００１１】
３．二波長同時測定法の検討
５．０μＭオキシトシン及び０．５μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬ［各誘導体の蛍光スペクトル測定］と同様の方法でＤＡＡＢＤ−Ｃｌ（１）又はＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）とそれぞれ蛍光標識化反応を行った。反応液を当量ずつ混合しその２０μＬを蛍光検出器２台を直列に接続したＨＰＬＣに注入し二波長同時測定を行った。
【００１２】
ＨＰＬＣ条件：
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｍｔａｋｔ ＷＰ−ＲＰ（２５０ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：（ａ）１０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ （ｂ）７０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｔｉｍｅ：０→３６（ｍｉｎ），（ｂ）：０→６０％
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．７０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６０℃
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：
４５０ｎｍ（Ｅｍ），５７０ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ １ｓｔ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
３７５ｎｍ（Ｅｍ），４８０ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ２ｎｄ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
【００１３】
本発明でベンゾキサジアゾール骨格及びベンゾセレナジアゾール骨格を持つ蛍光試薬６種を新たに合成した。各試薬の反応性を検討したところ、いずれも反応時間４０分で最大の蛍光強度を与えた。また、各試薬誘導体の励起・蛍光波長は骨格に依存し、側鎖部分の変化は蛍光特性に大きな影響は与えなかった。
ペプチド及びタンパク質で各試薬誘導体の保持時間を測定したところ、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ（１）とＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）及びＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ（２）とＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（８）の組合せでそれぞれの誘導体が異なる蛍光特性とほぼ同じ保持時間を示し、二波長同時測定法への適用が可能であることが示唆された。
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ（１）とＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）の組合せでペプチドとタンパク質を用いて二波長同時検出法の検討を行った。その結果、それぞれの試薬に対して特異的なクロマトグラムが類似した形で得ることができた。この試薬の組合せは、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ（５）を用いた場合よりもピークの比較同定が容易であることから、二波長同時測定法を用いた変異タンパク質の発見など、プロテオーム解析への様々な応用が期待できる。
【００１４】
誘導体の蛍光特性
誘導体のフルオレッセンススペクトルを測定し、新しく合成された試薬（２−４，６−８）は同時検出実験に利用可能であることが確認された。本発明では、誘導体はＨＰＬＣで分離され、スペクトルを直接測定した。ベンゾキサジアゾール試薬（１−４）誘導体は、最大励起波長がペプチド（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）で３８６から３８９ｎｍ及びプロテイン（ＢＳＡ）で３８９から３９２ｎｍの範囲であり、また、最大発光波長は、５０３から５０５ｎｍ及び５０２から５０３ｎｍであった。
一方、ベンゾキサジアゾール試薬（５−８）誘導体は、最大励起波長は４１０から４１２ｎｍ及び４１８から４２３ｎｍの範囲であり、また、最大発光波長は、５３１から５３５ｎｍ及び５３５から５３７ｎｍの範囲であった（表１）。
【００１５】
【表１】
【００１６】
ペプチド及びプロテインの蛍光誘導体の分離
各誘導体のリテンションタイムは、表２に示される。
ＤＡＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎは、ＤＡＡＢＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎの約２分前に溶出された。一方、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ（５）のＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン部分をＮ，Ｎ−ジメチルプロピレンジアミンで置換した、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆで誘導体化されたＤＡＰＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎは、ＤＡＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎの０．７分後に溶出された。
ＤＡＡＢＳｅＤ−ＦのＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン部分をＮ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミンで置換した、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）で誘導体化されたＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎは、ＤＡＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎの約２．９分後に溶出した。
ＤＡＡＢＳｅＤ−ＦのＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン部分をＮ，Ｎ−ジエチルプロピレンジアミンで置換した、ＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（８）で誘導体化されたＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎは、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−及びＤＥＡＥＢＳｅＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎの約２．６分後に溶出された。
【００１７】
【表２】
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、プロテオーム解析において、異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出することが可能な新規蛍光試薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
試薬
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ，１及びＮ−ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ，５は、文献（非特許文献１−２）に記載の方法に従って合成した。４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾールは市販品（東京化成工業）を購入し、それ以上精製しないで使用した。トリプシン阻害剤（ｓｏｙｂｅａｎ：ＭＷ２４０４９）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン及びＮ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミンは市販品（和光純薬工業）を購入し、それ以上精製しないで使用した。
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン ハイドロクロライド（ＴＣＥＰ）、８Ｍグアニジン ハイドロクロライド（ｂｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．５）及び子牛血清アルブミン（ＢＳＡ，ＭＷ６６３８５）は市販品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を購入した。
【００２０】
オキシトシン（ＭＷ１００７）及びカルシトニン（ヒト；ＭＷ３４１８）は市販品（ペプチド工業）を購入した。
ソマトスタチン（ＭＷ１６３８）は市販品（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を購入した。３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）及びエチレンジアミンテトラアセチック アシド ジソジウム塩（Ｎａ２ＥＤＴＡ）は市販品（Ｄｏｊｉｎｄｏ研究所）を購入した。ＨＰＬＣ実験のために、アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）及びトリフルオロアセチック アシド（アミノ酸配列グレード）は市販品（和光純薬工業）を購入した。Ｑｕｉｋ Ｓｔａｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔは市販品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を購入した。その他の全ての試薬は、分析用又は保障付試薬を使用した。
【実施例１】
【００２１】
７−クロロ−Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ，２）
４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾールのアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．１８ｍｌ，１．４３モル）及びトリエチルアミン（０．２０ｍｌ，１．４３モル）を室温で加えた。反応混合物を３０分撹拌し、真空下で濃縮した。得られた残渣をクロロホルムに溶解し、飽和アンモニウムクロライド溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４：１）で精製し、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ（２）を黄色結晶として得た。
【００２２】
（８７．５ｍｇ，２８％；ｍｐ１３６．８−１３８．４℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ７．９５（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．２７（ｓ，６Ｈ），１．６８（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ１４８．８５，１４５．１０，１３３．３４，１２９．１８，１２８．２３，１２７．１８，５９．１０，４５．０４，４４．１９，２４．６３；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４４６，２９５１，２８０６，１５２７，１３４０，１１５１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ１５ＣｌＮ４Ｏ３Ｓ （Ｍ＋）３１８．０５５３，ｆｏｕｎｄ ３１８．０５６４．
【実施例２】
【００２３】
７−クロロ−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ，３）
４−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（０．２５ｇ，０．９９モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（０．２１ｍｌ，１．４９モル）及びトリエチルアミン（０．２１ｍｌ，１．４９モル）を室温で加えた。反応混合物を３０分撹拌し、真空下で濃縮した。得られた残渣をクロロホルムに溶解し、アンモニウムクロライド水溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し、黄色固体を得た。メチレンクロライド及びジイソプロピルエーテルからの再結晶化により、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ，（３）を明黄色の板状体として得た。
【００２４】
（０．２２ｇ，６７％；ｍｐ８８．８−９０．４℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ７．９７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．４８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ１４８．７７，１４５．００，１３３．４０，１２９．１５，１２７．８８，１２７．４７，５１．１４，４６．０９，４０．４５，１１．３６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４４６，３２０９，３１０１，２９７６，２８１７，１５２５，１３４７，１１６４；Ａｎａｌ．ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ１７ＣｌＮ４Ｏ３Ｓ：Ｃ，４３．３１；Ｈ，５．１５；Ｎ，１６．８３．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，４３．４５；Ｈ，５．０３；Ｎ，１６．９３．
【実施例３】
【００２５】
７−クロロ−Ｎ−［３−（ジエチルアミノ）プロピル］−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ，４）
４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（０．２１ｇ，０．８３モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミン（０．２０ｍｌ，１．２５モル）及びトリエチルアミン（０．１７ｍｌ，１．２５モル）を０℃で加えた。反応混合物を同一温度で３０分撹拌し、真空下で濃縮した。得られた残渣をクロロホルムに溶解し、飽和アンモニウムクロライド溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ（４）を明るい黄色の結晶として得た。
【００２６】
（０．１０ｇ，３５％；ｍｐ９９．７−１０１．９℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）δ８．０６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｍ，８Ｈ），１．９３（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ）δ１５０．３９，１４６．６６，１３５．５８，１３１．３３，１２９．３３，１２８．１０，５０．４１，４１．２１，２５．６９，９．２６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３５０１，３４２８，３２０９，２９７３，２７３３，２６７５，１５２４，１３３８，１１６０；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ１９ＣｌＮ４Ｏ３Ｓ（Ｍ＋）３４６．０８６６，ｆｏｕｎｄ ３４６．０８３８．
【実施例４】
【００２７】
７−フルオロ−Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ，６）
７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホニルクロライド（０．３０ｇ，０．９８モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．１２ｍｌ，０．９８モル）及びトリエチルアミン（０．１４ｍｌ，０．９８モル）を０℃で加え、反応混合物を同じ温度で１５分撹拌した。飽和アンモニウムクロライド水溶液を混合物に加え、全体をメチレンクロライドで３回抽出した。有機相を合わせて、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４：１）で精製し、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（６）をオレンジ色の結晶として得た。
【００２８】
（０．３２ｇ，８８％；ｍｐ１００．９−１０２．１℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ８．１７（ｄｄ，Ｊ＝５．２，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄｄ，Ｊ＝８．０，９．６Ｈｚ，１Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．２５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．１３（ｓ，６Ｈ），１．５８（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１００ＭＨｚ）δ１５８．８８，１５６．８８，１５６．８６，１５６．２０，１５３．０１，１５２．８６，１３３．５２，１３３．４３，１３１．１５，１３１．０９，１１１．０１，１１０．８３，５７．９０，４５．３０，４２．５３，２８．２６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）１５３１，１３３０，１１５０，１０９６；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ１５ＦＮ４Ｏ２ＳＳｅ（Ｍ＋）３６６．００６５，ｆｏｕｎｄ ３６６．００５４．
【実施例５】
【００２９】
７−フルオロ−Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ，７）
７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホニルクロライド（０．３１ｇ，１．０３モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン（０．１５ｍｌ，１．０３モル）及びトリエチルアミン（０．１４ｍｌ，１．０３モル）を０℃で加えた。反応混合物を同じ温度で２０分撹拌し、上述の方法と同様にして、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ（７）をオレンジ色の結晶として得た。
【００３０】
（０．３３ｇ，８４％；ｍｐ７０．５−７１．１℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ８．１８（ｄｄ，Ｊ＝４．８，８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１０．０Ｈｚ，１Ｈ），２．９９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．５１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ），２．４０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１００ＭＨｚ）δ１５８．９１，１５６．８３，１５６．２２，１５２．９５，１５２．８１，１３３．５０，１３３．４１，１３０．８７，１３０．８２，１１１．０２，１１０．８４，５２．９７，４７．７９，４１．５４，１１．３７；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）１５２６，１３３３，１１４９；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ１７ＦＮ４Ｏ２ＳＳｅ（Ｍ＋）３８０．０２２１，ｆｏｕｎｄ ３８０．０２４０．
【実施例６】
【００３１】
７−フルオロ−Ｎ−［３−（ジエチルアミノ）プロピル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホンアミド（ＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ，８）
７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルホニルクロライド（０．３０ｇ，０．９９モル）のアセトニトリル（８ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミン（０．１６ｍｌ，０．９９モル）及びトリエチルアミン（０．１４ｍｌ，０．９９モル）を０℃で加えた。反応混合物を同じ温度で２０分撹拌し、上述の方法と同様にして、ＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（８）をオレンジ色の結晶として得た。
【００３２】
（０．３３ｇ，８５％；ｍｐ１４２．７−１４３．２℃）． １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ８．１７（ｄｄ，Ｊ＝５．２，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝８．０，９．６Ｈｚ，１Ｈ），３．３０（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．４５−２．３６（ｍ，６Ｈ），１．５５（ｍ，１Ｈ），１．６３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１００ＭＨｚ）δ１５８．８７，１５６．９０，１５６．８８，１５６．１８，１５３．０２，１５２．８７，１３３．４７，１３３．３９，１３１．２５，１３１．２０，１１１．０３，１１０．８４，５１．２３，４７．５９，４２．７９，２７．２８，１１．１７；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）１６１５，１５２６，１３２１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ１９ＦＮ４Ｏ２ＳＳｅ（Ｍ＋）３９４．０３７８，ｆｏｕｎｄ ３９４．０３３３．
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上詳述したように、本発明は、蛍光試薬に係るものであり、本発明により、プロテオーム解析において、２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出してペプチド又はプロテインのプロファイルを高精度に解析することを可能とする新規蛍光試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】蛍光試薬の化学構造を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出するための蛍光試薬であって、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの誘導体。
【請求項２】
上記誘導体が、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ、又はＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆである請求項１記載の誘導体。
【請求項１】
２つの異なるサンプル中のペプチド又はプロテインをＨＰＬＣにより同時検出するための蛍光試薬であって、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの誘導体。
【請求項２】
上記誘導体が、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ、又はＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆである請求項１記載の誘導体。
【図１】
【公開番号】特開２００７−３０９７０７（Ｐ２００７−３０９７０７Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３７１０６（Ｐ２００６−１３７１０６）
【出願日】平成１８年５月１６日（２００６．５．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年３月２８日 社団法人日本薬学会主催の「日本薬学会第１２６年会」において文書をもって発表
【出願人】（５９２１９１７９３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１６日（２００６．５．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年３月２８日 社団法人日本薬学会主催の「日本薬学会第１２６年会」において文書をもって発表
【出願人】（５９２１９１７９３）
【Ｆターム（参考）】
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