融合タンパク質発現用新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを用いたタンパク質の製造方法
【課題】 融合タンパク質発現法における連結相手（融合パートナータンパク質をコードするＤＮＡ断片）として利用可能な新規ＤＮＡの開発。
【解決手段】 ＴＮＦ−α発現用ベクターで形質転換したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓの培養上清から分離した分子量４５ｋＤａの新規タンパク質（Ｐ４５タンパク質）をコードする遺伝子は、組換えタンパク質生産において、目的タンパク質の上流に連結することにより、従来発現されなかったりあるいは発現量が低かった目的タンパク質遺伝子の発現を高め、目的タンパク質の生産を顕著に高めることができる。
【解決手段】 ＴＮＦ−α発現用ベクターで形質転換したＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓの培養上清から分離した分子量４５ｋＤａの新規タンパク質（Ｐ４５タンパク質）をコードする遺伝子は、組換えタンパク質生産において、目的タンパク質の上流に連結することにより、従来発現されなかったりあるいは発現量が低かった目的タンパク質遺伝子の発現を高め、目的タンパク質の生産を顕著に高めることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
遺伝子組換えによるタンパク質の生産、特には、融合タンパク質発現法における連結相手として利用可能な新規ＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを融合タンパク質発現法における連結相手に用いた組換えタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術は、生体内に微量しか存在せず単離が難しいために従来は利用が著しく困難であったタンパク質、または、任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、細菌、真菌、または、動物細胞などを宿主に用いて大量に生産することを可能にした。
【０００３】
しかしながら、目的とするタンパク質またはポリペプチドによっては、それをコードする遺伝子の発現が起こらないか、もしくは、遺伝子が発現されたとしても目的とするタンパク質またはポリペプチドが極微量しか生産されず産業的な利用が不可能な場合も多かった。
【０００４】
そのため、当業者において、通常の遺伝子組換えによる方法では遺伝子の発現が起こらない遺伝子の発現を行うため、あるいは、通常の遺伝子組換えによる方法では微量しか生産されないタンパク質の生産量を増大させるための方法のひとつとして、融合タンパク質発現と呼ばれる手法が用いられている。この融合タンパク質発現とは、融合パートナーと呼ばれる特定のタンパク質をコードするＤＮＡ断片（以下、連結相手とする。）の下流に目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡを発現させ、融合パートナーと目的とするタンパク質が結合した融合タンパク質として生産した後、融合パートナー部分を切断することにより目的とするタンパク質を得る方法である。この際、融合パートナーと目的とするタンパク質コードするＤＮＡの間にトロンビン認識配列などの特異的に切断可能なペプチド鎖をコードするＤＮＡを挿入し、生産された融合タンパク質から融合パートナーの切断が行えるようにする。
【０００５】
この融合タンパク質発現法に用いられる融合パートナーとしては、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（特許文献１）などが知られている。また、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主とする組換えタンパク質生産においても融合タンパク質発現が試みられており、例えば、特許文献２においてｈＥＧＦを融合パートナーとして用いる方法が開示されている。
【特許文献１】特表平１−５０３４４１
【特許文献２】特開平６−２５３８６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、融合タンパク質発現の連結相手として知られている公知のＤＮＡの何れを用いても、それでも、発現が困難である遺伝子、または、微量しか生産されないタンパク質（またはポリペプチド）も多い。また、上記のｈＥＧＦのように融合パートナーがシステイン残基を含むたんぱく質である場合には、生産された融合タンパク質において、目的タンパク質に含まれるシステイン残基と融合パートナーに含まれるシステイン残基の間での不正なＳＳ結合が生じてしまうという問題があり、融合タンパク質発現法に適さない場合が多かった。
【０００７】
また、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主とする遺伝子組換えによるタンパク質生産において、融合パートナーとしての利用が試みられた他のタンパク質は、生産量自体があまり多くなかったり、分解されやすいものであったりしたため、融合パートナーに適しておらず、これまでブレビバチルス属細菌を宿主とする遺伝子組換えによるタンパク質生産において融合パートナーに適したタンパク質は知られていなかった。
【０００８】
そのため、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主とする融合タンパク質発現法によるタンパク質生産において、連結相手として利用可能な新規なＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを融合タンパク質発現の連結相手に用いた組換えタンパク質の生産方法の提供が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主に用いた遺伝子組換えによるタンパク質生産において、イヌ可溶性ＩｇＥ受容体などの特定のタンパク質の分泌生産を行った際、目的タンパク質の分泌生産と同時に分子量約４５ｋＤａの機能未知のタンパク質が大量に分泌されることを発見した。本発明者は、この機能未知の分泌タンパク質を、その分子量が約４５ｋＤであることからＰ４５と命名した。
【００１０】
本発明者は、この大量に分泌されるＰ４５タンパク質を融合タンパク質発現法における融合パートナーに用いることにより、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主とする遺伝子組換えによるタンパク質生産において、これまで全く発現がされなかった遺伝子の発現、及び、該遺伝子にコードされたタンパク質（またはポリペプチド）の生産、または、これまで微量しか生産されなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量の増大を可能にするのではないかとの新規着想を得た。
【００１１】
そこで、本発明者は、これまでブレビバチルス属細菌を宿主に用いた組換えタンパク質生産において目的とするタンパク質をコードする遺伝子を発現する形質転換体の構築が出来なかった遺伝子について、その上流にＰ４５タンパク質遺伝子を連結した融合タンパク質遺伝子（Ｐ４５融合タンパク質遺伝子）発現用ベクターを作製し、このベクターを用いて融合タンパク質発現を試みた。
【００１２】
その結果、本発明者は、Ｐ４５融合タンパク質遺伝子の発現、及び、著量のＰ４５融合タンパク質の生産に成功した。更に、得られたＰ４５タンパク質との融合タンパク質から活性を有する目的タンパク質を単離することに成功した。
【００１３】
また更に、本発明者は、これまでブレビバチルス属細菌を宿主細胞を用いた組換えタンパク質生産において微量しか生産することができなかったタンパク質について、その遺伝子の上流にＰ４５タンパク質遺伝子を連結した融合タンパク質遺伝子の発現を行うことにより、その生産量を顕著に増大させることに成功し、本発明を完成した。
【００１４】
本発明は、融合タンパク質発現法における連結相手として利用可能な新規ＤＮＡであるＰ４５タンパク質遺伝子を提供する。
更に、本発明は、Ｐ４５タンパク質遺伝子の下流に目的タンパク質遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだ融合タンパク質発現用ベクターを提供する。
【００１５】
また更に、本発明は、該融合タンパク質発現用ベクターを保持する宿主細胞を提供する。
また更に、本発明は、該融合タンパク質発現用ベクターを保持する宿主細胞を培養する工程を含むタンパク質の生産方法を提供する。
【００１６】
また更に、本発明は、ブレビバチルス・チョウシネンシス由来の新規タンパク質であるＰ４５タンパク質を提供する。このＰ４５タンパク質は、高い分泌性を有し、また、配列中にシステインを含まない、部位特異切断酵素として汎用されるトロンビンによる分解を受けないなどの性質により融合発現法における融合パートナーとして極めて優れている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＰ４５タンパク質遺伝子は、特にブレビバチルス属細菌を宿主細胞に用いた組換えタンパク質生産において、目的タンパク質遺伝子の上流に連結することにより、これまで通常の遺伝子組換えによる方法では、タンパク質（またはポリペプチド）をコードする遺伝子が発現されなかったため生産が不可能だったタンパク質（またはポリペプチド）の生産を可能し、また、これまで微量しか生産することができなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量を顕著に増大させる効果がある。
【００１８】
さらに、本発明のＰ４５タンパク質は、高い分泌性を有する、配列中にシステインを含まない、部位特異酵素として汎用されるトロンビンによる分解を受けないなどの性質により融合発現法における融合パートナーとして極めて優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明のＰ４５タンパク質遺伝子は、ブレビバチルス・チョウシネンシス由来の新規タンパク質である配列番号１：図１のＰ４５タンパク質をコードするＤＮＡである。そのＤＮＡ配列を配列番号４：図４に示す。
【００２１】
なお、配列番号４：図４のＰ４５タンパク質遺伝子の配列には、翻訳開始点と考えられるメチオニンをコードするＡＴＧが１から３塩基めと２２から２４塩基めの２ヶ所にある。融合タンパク質発現法における連結相手には、配列番号４：図４に示すメチオニンを２つとも含むＰ４５タンパク質遺伝子の全長を用いてもよいが、通常は、配列番号５：図５に示す、配列番号４：図４の２２番目以降の塩基からなるＤＮＡを用いる。本願明細書では、配列番号５：図５のＤＮＡについてもＰ４５タンパク質遺伝子とする。
【００２２】
配列番号４：図４、または、配列番号５：図５のＤＮＡ配列と７０％以上の相同性を有するものは知られておらず、したがって、本発明のＰ４５タンパク質遺伝子は新規ＤＮＡである。さらに配列番号１：図１のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸をコードするＤＮＡであっても、生産を目的とするタンパク質をコードする遺伝子の上流に連結することにより、これまで通常の遺伝子組換えによる方法では、発現がされなかった遺伝子の発現を可能にするか、または、微量しか生産されなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量を増大させる効果がある限り、全て本発明のＰ４５タンパク質遺伝子に包含される。
【００２３】
本発明のＰ４５タンパク質遺伝子は、例えば、後述の実施例２に示すようにブレビバチルス・チョウシネンシスのゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーから、配列番号４：図４、または、配列番号５：図５のＤＮＡ配列の一部を有するＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、上記のＤＮＡ断片をプライマーとして用いるＰＣＲ法により調製することができる。または、そのＤＮＡ配列を元に当業者に公知の核酸化学合成法などにより、本発明のＰ４５タンパク質遺伝子を得ることもできる。
【００２４】
本発明のＰ４５タンパク質は、配列番号４：図４のＰ４５タンパク質遺伝子によってコードされるポリペプチドである。その全長のアミノ酸配列を配列番号１：図１に示す。また、配列番号５：図５のＤＮＡ配列がコードする、配列番号１：図１のＰ４５タンパク質の８残基目のメチオニン以降からなるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２：図２に示す。この配列番号２：図２のタンパク質についてもＰ４５タンパク質とする。
【００２５】
配列番号１： 図１、または、配列番号３：図３のアミノ配列と７０％以上の相同性を有するものは知られておらず、したがって、本発明のＰ４５タンパク質は新規のタンパク質である。
【００２６】
また、配列番号１：図１のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、そのタンパク質をコードするＤＮＡを、生産を目的とするタンパク質をコードする遺伝子の上流に連結することにより、これまで通常の遺伝子組換えによる方法では、発現がされなかった遺伝子の発現を可能にするか、または、微量しか生産されなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量を増大させる効果がある限り、全て本発明の新規タンパク質Ｐ４５に包含される。
【００２７】
また、Ｐ４５タンパク質から分泌シグナル部分が削除されたＰ４５タンパク質成熟体のアミノ酸配列を配列番号３：図３に示す。
【００２８】
次に、本発明のＰ４５タンパク質を融合パートナーに用いた融合タンパク質発現法による組換えタンパク質の生産方法（Ｐ４５融合タンパク質発現法）について説明する。
【００２９】
また、以下において、Ｘは、配列番号１：図１、または、配列番号２：図２によって示されるＰ４５タンパク質、または、そのアミノ酸配列、ｘは、配列番号４：図４、または、配列番号５：図５によって示されるＰ４５タンパク質遺伝子、並びに、それらの塩基配列を表わす。
【００３０】
更に、Ｘ’は、配列番号３：図３によって示されるＰ４５タンパク質成熟体、または、そのアミノ酸配列、ｘ’は、配列番号６：図６によって示されるＰ４５タンパク質成熟体をコードするＤＮＡ、または、その塩基配列を表わす。
【００３１】
更に、Ｒは酵素や化学物質等によって特異的に認識され切断される部位を含むペプチド鎖、または、そのアミノ酸配列を表し、ｒは該アミノ酸をコードする配列からなるＤＮＡまたはその塩基配列を表わす。
【００３２】
また更に、Ｚは任意の生産を目的とするタンパク質（またはポリペプチド）、または、そのアミノ酸配列を表し、ｚは該タンパク質（またはポリペプチド）をコードするＤＮＡまたはその塩基配列を表す。
【００３３】
また更に、Ｘ−Ｒは、上記のＸとＲがこの順序で連結されたポリペプチドまたはそのアミノ酸配列、Ｘ’−Ｒは、上記のＸ’とＲがこの順序で連結されたポリペプチドまたはそのアミノ酸配列、ｘ−ｒは、該ポリペプチドをコードする配列からなるＤＮＡまたはその塩基配列を表す。
【００３４】
また更に、Ｘ−Ｒ−ＺまたはＸ’−Ｒ−Ｚは、上記のＸ、Ｒ、Ｚがこの順序で連結された融合タンパクまたはそのアミノ酸配列、ｘ−ｒ−ｚは該融合タンパク質をコードするＤＮＡまたはその塩基配列を表す。
【００３５】
なお、本願明細書では、Ｘ−Ｒ−Ｚ、または、Ｘ’−Ｒ−ＺをＰ４５融合タンパク質、ｘ−ｒ−ｚをＰ４５融合タンパク質遺伝子と呼ぶ。
【００３６】
また、Ｘ’−Ｒ−ＺにおけるＸ’をＰ４５融合パートナー、または、Ｐ４５タンパク質と呼ぶ場合がある。
【００３７】
本発明のＰ４５融合タンパク質発現法は、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞として用いた場合、通常、以下の手順により行われる。なお、ブレビバチルス属細菌細胞を宿主細胞として用いた場合、通常、生産されたタンパク質は宿主細胞内に蓄積されず細胞外の培地中に分泌されるため、以下では培地中への分泌生産の場合について説明する。
【００３８】
（手順）
ａ）Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを組み込んだＰ４５融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを作製する。
ｂ）Ｐ４５融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを宿主細胞に導入し宿主細胞の形質転換体を作製する。
ｃ）宿主細胞の形質転換体を培養し、Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを発現させ、Ｐ４５融合タンパク質Ｘ’−Ｒ−Ｚを培地中に分泌生産させる。
ｄ）培養上清中からＰ４５融合タンパク質Ｘ’−Ｒ−Ｚを回収する。
ｅ）回収した融合タンパク質からＰ４５融合パートナーＸ’を切断処理し目的タンパク質Ｚを単離する。
ｆ）単離した目的タンパク質Ｚを精製する。
【００３９】
以下、上記した手順ａ）〜ｆ）について更に説明する。
【００４０】
（手順ａ）
まず、Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを組み込んだＰ４５融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを作製する。
【００４１】
ｘ、ｒ、ｚのそれぞれ、または、ｘ−ｒ、ｘ−ｒ−ｚなどの構造からなるＤＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ． ｅｔ ａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９））などに記載の当業者に公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を適宜選択し組み合わせて用いることにより得ることができる。例えば、化学的合成法またはクローニング法によって個々に調製することが可能である。
【００４２】
Ｐ４５融合タンパク質発現用ベクターは、Ｐ４５融合タンパク質をコードするｘ−ｒ−ｚを発現用ベクターのプロモーター領域の下流に組み込むことにより作製しても、予め、発現用ベクターのプロモーター領域の下流にｘ−ｒを組み込んだベクターを作製し、そのｘ−ｒの下流にｚを組み込むことにより作製してもよい。
【００４３】
なお、本発明において、Ｚの種類は特に限定されない。また、その用途も特に限定されない。その用途は医薬品、生化学試薬、産業用酵素などのいずれであってもよい。また、Ｒは、Ｚのアミノ酸配列中に存在しないアミノ酸配列からなるものであることが望ましく、したがって、ｒもそのようなＲをコードするＤＮＡであることが好ましい。
【００４４】
Ｐ４５融合タンパク質発現法に用いるベクターＤＮＡは、宿主細胞内でＰ４５融合タンパク質遺伝子の発現が可能なものであるならば特に限定されないが、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞に用いる場合には、特に好ましいものとしてｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号）またはｐＮＣＭＯ２（特開２００１−３７１６７号）、または、それらからそれらが予め含む分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを除去したベクターＤＮＡを例示することができる。
【００４５】
なお、生産されたタンパク質を細胞外に分泌させるためには、ベクターのプロモーター領域の下流側に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含有させる必要がある。Ｐ４５タンパク質自体が分泌タンパク質であるため、通常は、Ｐ４５タンパク質自身が有する分泌シグナルをコードするＤＮＡをそのまま用いることが好ましいが、上記のｐＮＹ３０１が含有するＭＷＰ型分泌シグナルをコードするＤＮＡ、または、ｐＮＣＭＯ２が含有する改変型のＭＷＰ分泌シグナルをコードするＤＮＡなどを用いてもよい。
【００４６】
Ｐ４５タンパク質遺伝子自身の分泌シグナルをコードするＤＮＡを用いる場合には、ｐＮＹ３０１やｐＮＣＭＯ２が含有する分泌シグナルをコードするＤＮＡを除去した上で、ｘ−ｒ−ｚを組込む。また、ｐＮＹ３０１やｐＮＣＭＯ２が含有する分泌シグナルをコードするＤＮＡを用いる場合には、ｘ’−ｒ−ｚを組込む。
【００４７】
ブレビバチルス属細菌からＰ４５融合タンパク質が分泌される際に、分泌シグナルが切断されるため、培地中に分泌生産されるＰ４５融合タンパク質は、Ｘ’−Ｒ−Ｚで表される構造からなる。
【００４８】
（手順ｂ）
ａ）で構築したＰ４５融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞の形質転換体を作製する。
【００４９】
Ｐ４５融合タンパク質遺伝子の発現に用いる宿主細胞は、ａ）で構築したベクター上のＰ４５融合タンパク質遺伝子の発現が行われるものであるならば特に限定されないが、主に細菌であり、好ましくは、バチルス属またはブレビバチルス属の細菌であり、特に好ましくは、ブレビバチルス属の細菌である。更に、特に好ましい宿主菌株としてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１）（バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株）や、その変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−Ｓ５）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）と同一菌株）を例示することができる。
【００５０】
Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを含有するベクターの宿主細胞への導入は、当業者に公知の遺伝子組換え技術を適宜選択することにより行うことができる。特にブレビバチルス属細菌を宿主に用いる場合には、特に好ましい方法としてエレクトロポレーション法を例示することができる。
【００５１】
（手順ｃ）
次に、ｂ）で作製した宿主細胞の形質転換体を培養し、Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを発現させ、Ｐ４５融合タンパク質Ｘ’−Ｒ−Ｚを培地中に分泌生産させる。
【００５２】
融合タンパク質の発現に用いる宿主細胞の培養方法は宿主細胞に応じて公知の方法を用いればよい。特にブレビバチルス属細菌を宿主として用いる場合には、後述の実施例に記載の方法を特に好ましい培養方法として例示することができる。
【００５３】
（手順ｄ）
次いで、培養上清中から融合タンパク質Ｘ’−Ｒ−Ｚを回収する。
【００５４】
培養上清中または培養細胞内から融合タンパク質を回収は、当業者に公知の方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより可能である。特に、融合タンパク質が菌体外に分泌生産される場合には、遠心分離、膜濾過などの一般的な方法で菌体と培養上清を分離した後、各種クロマトグラフィー、または、電気泳動法などの方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより行えばよいが、特に好ましいのは、融合パートナーを特異的に認識し吸着する物質（抗体）を利用したアフィニティークロマトグラフィーである。
【００５５】
（手順ｅ）
次いで、ｄ）で回収した融合タンパク質から融合パートナーＸ’を切断処理し目的とするタンパク質Ｚを単離する。
【００５６】
ｄ）で得られた融合タンパク質が目的タンパク質と同等の特性、生理活性を有する場合は、融合タンパク質をそのまま利用してもよいが、通常は、融合タンパク質から融合パートナーを切断、除去し、目的とするタンパク質の単離を行う。
【００５７】
融合パートナーと目的タンパク質を切断する方法には、特定のアミノ酸配列を認識し特定の部位でポリペプチド鎖を部位特異的に切断する酵素により切断する方法と化学物質による化学反応により切断する方法があるが、目的とするタンパク質を安定な状態で得るためには部位特異酵素を用いて切断する方法が好ましい。酵素により部位特異的切断を行う場合には、Ｒの配列に応じて、トロンビン、エンテロキナーゼ、トリプシン、血液凝固系第Ｘａ因子、コラゲナーゼなどの酵素を用いる。
【００５８】
（手順ｆ）
更に、ｅ）で単離した目的とするタンパク質Ｚを精製する。
【００５９】
単離した目的タンパク質の精製は、当業者に公知の方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより可能である。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法、または、電気泳動法などの方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより行うことができる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明をこれらの実施例のいずれかに限定することを意図するものでない。また、以下において、アミノ酸は、当業者が慣用している３文字表記もしくは１文字表記の略号を用いて表した。
【００６１】
（実施例１： Ｐ４５タンパク質遺伝子のクローニング）
Ｐ４５タンパク質の遺伝子を以下の手順によりクローン化した。
【００６２】
先ず、ｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号）にＴＮＦ−α遺伝子を組み込んだＴＮＦ−α発現用ベクターで形質転換したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を、ネオマイシンを５０μｇ／ｍｌ含有するＴＭ液体培地（ペプトン １％、肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．２％、グルコース１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０００１％、ｐＨ７．０）で３０℃、２０時間、振とう培養し、ＴＮＦ−α遺伝子を発現させることによりＰ４５タンパク質の分泌生産を誘導した。培養終了後、培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ＰＶＤＦ膜に転写して染色した後、ＰＶＤＦ膜からＰ４５タンパク質に相当する分子量４５ｋＤのバンドを切り出した。この切り出したバンドからＰ４５タンパク質成熟体のＮ末端と内部配列２個、計３個の断片についてアミノ酸配列の決定を行った。判明したアミノ酸配列の内、Ｐ４５タンパク質成熟体Ｎ末配列、内部配列１、内部配列２を、配列番号７（図９上段）、配列番号８（図９中段）、配列番号９（図９下段）にそれぞれ示した。
【００６３】
次いで、Ｐ４５タンパク質成熟体のＮ末配列（配列番号７）及び内部配列１（配列番号８）をもとに、デジェネレートプライマー、４５ＫＤＮ（ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号１０：図１０上段）及び４５ＫＤＣ（ｂａｃｋｗａｒｄ）（配列番号１１：図１０下段）を設計した。
【００６４】
（注）Ｂ＝Ｔ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｇ， Ｓ＝Ｃ ｏｒ Ｇ， Ｋ＝Ｔ ｏｒ Ｇ， Ｙ＝Ｃ ｏｒ Ｔ， Ｒ＝Ａ ｏｒ Ｇ， Ｈ＝Ａ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｃ， Ｗ＝Ａ ｏｒ Ｔ， Ｎ＝Ａ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｇ ｏｒ Ｔ， Ｄ＝Ａ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｇ， Ｖ＝Ａ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｇ， Ｍ＝Ａ ｏｒ Ｃ
【００６５】
これらの２本のプライマーを用い、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。このＰＣＲの結果、約２００塩基対のＤＮＡ断片が増幅された。更に、このＤＮＡ断片を元にジーンウオーキングの手法で残りの部分のＤＮＡ配列を解読し、最終的に１４１６塩基対から成るＰ４５タンパク質遺伝子の全ＤＮＡ配列を明らかにした。Ｐ４５タンパク質遺伝子の全ＤＮＡ配列を配列番号４：図４に示す。配列番号４：図４に示した配列は、翻訳開始点と考えられるメチオニンをコードするＡＴＧが１から３塩基目と２２から２４塩基目の２箇所に存在するＰ４５タンパク質遺伝子の全長である。
【００６６】
（実施例２： Ｐ４５融合発現用ベクターｐＮＹ−Ｐ４５の構築）
下記の２本の合成ＤＮＡをプライマーに用い、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５のゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行い、配列番号５：図５の配列に示す、Ｐ４５タンパク質の２番めのメチオニン以降をコードするＤＮＡ断片の増幅を行った。該２本のプライマーの内、Ｐ４５−Ｎ（ｆｏｒｗａｒｄ）を配列番号１２（図１１上段）及びＰ４５−Ｃ（ｂａｃｋｗａｒｄ）を配列番号１３（図１１下段）にそれぞれ示した。
【００６７】
なお、上記のＰ４５−Ｎプライマーには、ベクターＤＮＡに組み込むためにＢｓｐＨＩ制限酵素切断部位（ＴＣＡＴＧＡ）を設け、またＰ４５−ＣプライマーにはＢａｍＨＩ制限酵素切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）を設けた。更にＰ４５−Ｃプライマーには、目的とするタンパク質とＰ４５ポリペプチドの切断を行うために、トロンビンの認識アミノ酸配列であるＬＶＰＲＧＳをコードするＤＮＡ配列（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＧ−３’）を組み込んだ。
【００６８】
次いで、上記のＰＣＲで得たＰ４５タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで処理した。また、プラスミドベクターｐＮＹ３０１を同じ制限酵素で処理することにより、ｐＮＹ３０１からプロモーター領域とマルチクローニングサイトの間に含まれているＭＷＰ型分泌シグナルをコードするＤＮＡを除去した。次いで、上記のＰ４５タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡ断片をｐＮＹ３０１のプロモーター領域とマルチクローニングサイトの間に組み込んだ。以上により作製した融合タンパク質発現用ベクターをｐＮＹ−Ｐ４５とした。
【００６９】
なお、上記で用いたＰ４５−ＮプライマーにはＢｓｐＨＩ制限酵素切断部位が設けられているため、このｐＮＹ−Ｐ４５に目的タンパク質遺伝子を組込んだ発現ベクターにより生産されるＰ４５融合タンパク質は、その先頭の分泌シグナル部に配列番号２：図２が示す１残基めのメチオニンの前にもう一つメチオニンが付加されている。また、このｐＮＹ−Ｐ４５は、ｐＮＹ３０１が含有するＭＷＰ型分泌シグナルをコードするＤＮＡではなく、Ｐ４５タンパク質遺伝子自身の分泌シグナルをコードするＤＮＡを含有している。
【００７０】
（実施例３： ブタＩＦＮ−γのＰ４５融合タンパク質法による生産）
ブタＩＦＮ−γは、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞とする組換えタンパク質生産において生産が極めて困難なタンパク質であり、通常の遺伝子組換えによる方法では発現用ベクターの構築すら不可能だった。そこで、上記の実施例２で構築したＰ４５融合発現用ベクターｐＮＹ−Ｐ４５にブタＩＦＮ−γ遺伝子を組み込み、Ｐ４５融合タンパク質法によるブタＩＦＮ−γの生産を試みた。
【００７１】
３−１） Ｐ４５−ＩＦＮ−γ融合遺伝子発現用ベクターを保持するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体の作製
【００７２】
まず、下記の２つの合成ＤＮＡをプライマーに用い、ブタＩＦＮ−γ（ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ）のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ２１３９４８）を鋳型に用いてＰＣＲを行い、ブタＩＦＮ−γ遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行った。該２本のプライマーの内、ｇａｍｂａｍ （ｆｏｒｗａｒｄ）配列番号１４（図１２上段）及びｇａｍｓｍａ （ｂａｃｋｗａｒｄ）を配列番号１５（図１２下段）にそれぞれ示した。
【００７３】
なお、発現用ベクターに組み込むためにｇａｍｂａｍプライマーにはＢａｍＨＩ制限酵素切断部位、ｇａｍｓｍａプライマーにはＳｍａＩ制限酵素切断部位を設けた。
【００７４】
次いで、上記のＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで処理した後、同じ制限酵素で処理したｐＮＹ−Ｐ４５に結合した。得られたＰ４５タンパク質とブタＩＦＮ−γの融合遺伝子発現用ベクターをｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γとした。
【００７５】
更に、このｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５にエレクトロポレーション法により導入し、ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γを保持するＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を得た。
【００７６】
３−２） ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γの培養によるＰ４５融合タンパク質の生産、及び、ブタＩＦＮ−γの単離と精製
【００７７】
次いで、上記のｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γを保持するＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地を３ｍｌずつ分注した試験管１０本で、３０℃で２日間培養し、Ｐ４５タンパク質とＩＦＮ−γの融合タンパク質の培地中への分泌生産を行った。培養終了後、培養液の一部を採取し、遠心して得た培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図７に示す。図７に示されているとおり、Ｐ４５ポリペプチドとブタＩＦＮ−γの融合タンパク質は極めて効率良く分泌生産されており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの濃さから、その培地中への分泌生産量は、およそ１ｇ／ｌに達していると推定された。また、ブタＩＦＮ−γの実質の濃度は、Ｐ４５とブタＩＦＮ−γの分子量比が４５：１３ぐらいであることからおよそ２００ｍｇ／ｌ程度と推定された。
【００７８】
次いで、培養上清中のＰ４５−ＩＦＮ−γ融合タンパク質の回収を、５ｍｌのウサギ抗Ｐ４５タンパク質抗体を固定したＮＨＳ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（アマシャムバイオサイエンス）をアフィニティーカラムに用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行った。この際、前記のアフィニティーカラムの下流に補助カラムとして１ｍｌのＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを接続した。
【００７９】
まず、上記の培養後の培養液２０ｍｌを１ＮＨＣｌでｐＨ８．０に調整した後、遠心し培養上清を得た。次いで、平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ ｐＨ８．０， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）を流しカラムの平衡化を行い、前記の培養上清をカラムにかけた。その後、平衡化バッファーを３０ｍｌ流しカラムの洗浄を行った。
【００８０】
次いで、上記のアフィニティーカラムで回収したＰ４５−ＩＦＮ−γ融合タンパク質からＰ４５融合パートナー部を切断処理し、ブタＩＦＮ−γの単離と精製を行った。まず、トロンビン（アマシャムバイオサイエンス）を２０Ｕ／１０ｍｌになるように平衡化バッファーで希釈した。次いで、このトロンビン溶液をカラムに流し２２℃で１６時間消化した。消化後、上記の平衡化バッファーでブタＩＦＮ−γを溶出し、溶出液中のトロンビンを補助カラムで除去した。次いで、ブタＩＦＮ−γを含む溶出液を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で透析した。更に、凍結乾燥物の溶解を容易にするため安定剤としてＢＳＡを１ｍｇ添加し凍結乾燥を行った。最終的に培養液中から約４０％のブタＩＦＮ−γを回収した。
【００８１】
３−３） ブタＩＦＮ−γの活性測定
ｍａｄｉｎ−ｄａｒｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ（ＭＤＢＫ細胞）を９６穴マイクロプレート上で３７℃２日間培養した。次いで、３−２で得た凍結乾燥したブタＩＦＮ−γを溶解し希釈した希釈サンプルを培養細胞に加え３７℃２４時間培養した。更に、培養細胞にｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＶＳＶ）を加え３７℃で２４時間培養した。培養終了後、２０％ホルマリンを含むクリスタルバイオレット溶液で固定および生存している細胞の染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定した。この際、細胞を５０％生存させる時のブタＩＦＮ−γの量を抗ウィルス活性１ユニット（１Ｕ）と定義した。以上により測定したブタＩＦＮ−γの活性は６．０Ｕ／ｎｇであった。
【００８２】
＜参考例１：ｐＮＹ３０１−ＩＦＮ−γによるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換の試行＞
【００８３】
ｐＮＹ３０１のＭＷＰ型分泌シグナルをコードするＤＮＡの下流にブタＩＦＮ−γ遺伝子を組み込んだブタＩＦＮ−γ発現用ベクターを作製した。エレクトロポレーションにより、このブタＩＦＮ−γ発現用ベクターをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、次いで、このＨＰＤ３１−Ｓ５を、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ寒天培地に塗布することで、ｐＮＹ３０１−ＩＦＮ−γの導入によりネオマイシン耐性を示すＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を選択しようとしたが、ネオマイシン耐性を示すＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体が取得できなかった。
【００８４】
以上により、これまでブレビバチルス属細菌を宿主とする遺伝子組換えによるタンパク質生産において、目的タンパク質遺伝子の発現用ベクターの構築すら不可能だったタンパク質について、Ｐ４５融合タンパク質発現法を用いることで、著量のＰ４５融合タンパク質の生産が可能になり、更に、Ｐ４５融合タンパク質の融合パートナー部分を切断、除去することにより活性を有する目的タンパク質が得られることが示された。
【００８５】
（実施例４： ウシＩＦＮ−τのＰ４５融合タンパク質法による生産）
ウシＩＦＮ−τは、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞とする通常の遺伝子組換えによる方法では、最も生産量が多い場合でも１０〜２０ｍｇ／ｌ程度の生産量しかなく、全く生産されない場合も多かった。
【００８６】
そこで、実施例２で作製した融合タンパク質発現用ベクターｐＮＹ−Ｐ４５にウシＩＦＮ−τ遺伝子を組み込み、Ｐ４５融合タンパク質法によるウシＩＦＮ−τの生産を試みた。
【００８７】
４−１） Ｐ４５−ＩＦＮ−γ融合遺伝子発現用ベクターを保持するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体の作製
【００８８】
まず、下記の２つの合成ＤＮＡをプライマーに用い、ウシＩＦＮ−τ（ｂｏｖｉｎｅＩＦＮ−ｔａｕ）のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ９９６０４８）を鋳型に用いてＰＣＲを行い、ウシＩＦＮ−τ遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行った。該２つのプライマーの内、ｔａｕｂａｍ （ｆｏｒｗａｒｄ）を配列番号１６（図１３上段）及びｔａｕｓｍａ （ｂａｃｋｗａｒｄ）を配列番号１７（図１３下段）にそれぞれ示した。
【００８９】
なお、発現用ベクターに組み込むためにｔａｕｂａｍプライマーにはＢａｍＨＩ制限酵素切断部位、ｔａｕｓｍａプライマーにはＳｍａＩ制限酵素切断部位を設けた。次いで、上記のＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで処理した後、同じ制限酵素で処理したｐＮＹ−Ｐ４５に結合し遺伝子発現用プラスミドベクターを作製した。このＰ４５タンパク質とウシＩＦＮ−τの融合遺伝子発現用プラスミドベクターをｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τとした。
【００９０】
次に、エレクトロポレーション法により、このｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τを保持するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を得た。
【００９１】
４−２） ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τの培養によるＰ４５融合タンパク質の生産、及び、ウシＩＦＮ−τの単離と精製
【００９２】
上記により得たｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τを保持するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有するＴＭ液体培地を３ｍｌずつ分注した試験管１０本で、３０℃で２日間培養した。培養終了後、培養液の一部を採取し、遠心して培養上清を得た。更に２回、同様に上記の形質転換体の培養を行い、３回分の培養上清を得、これら３回分の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図８に示す。図８に示されているとおり、ＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体は、３回ともＰ４５タンパク質とＩＦＮ−τの融合タンパク質を極めて効率良く分泌生産しており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの濃さから、その培地中への分泌生産量は、３回ともおよそ２ｇ／ｌに達していると推定された。また、ウシＩＦＮ−τの実質の濃度は、Ｐ４５とウシＩＦＮ−τの分子量比が４５：１５ぐらいであることからおよそ５００ｍｇ／ｌと推定された。
【００９３】
次いで、培養上清中のＰ４５−ＩＦＮ−τ融合タンパク質の回収を、５ｍｌのウサギ抗Ｐ４５タンパク質抗体を固定したＮＨＳ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（アマシャムバイオサイエンス）をアフィニティーカラムに用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行った。この際、前記のアフィニティーカラムの下流に補助カラムとして１ｍｌのＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを接続した。
【００９４】
まず、上記の培養後の培養液２０ｍｌを１ＮＨＣｌでｐＨ８．０に調整した後、遠心し培養上清を得た。次いで、平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ ｐＨ８．０， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）を流しカラムの平衡化を行い、前記の培養上清をカラムにかけた。その後、平衡化バッファーを３０ｍｌ流しカラムの洗浄を行った。
【００９５】
次いで、上記のアフィニティーカラムで回収したＰ４５−ＩＦＮ−τ融合タンパク質からＰ４５融合パートナー部を切断処理し、ウシＩＦＮ−τの単離と精製を行った。まず、トロンビン（アマシャムバイオサイエンス）を２０Ｕ／１０ｍｌになるように平衡化バッファーで希釈した。次いで、このトロンビン溶液をカラムに流し２２℃で１６時間消化した。消化後、上記の平衡化バッファーでウシＩＦＮ−τを溶出し、溶出液中のトロンビンを補助カラムで除去した。次いで、ウシＩＦＮ−τを含む溶出液を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で透析した。更に、凍結乾燥物の溶解を容易にするため安定剤としてＢＳＡを１ｍｇ添加し凍結乾燥を行った。最終的に培養液中から約３０％のウシＩＦＮ−τを回収した。
【００９６】
４−３） ウシＩＦＮ−τの活性測定
ｍａｄｉｎ−ｄａｒｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ（ＭＤＢＫ細胞）を９６穴マイクロプレート上で３７℃２日間培養した。次いで、４−２で得た凍結乾燥したウシＩＦＮ−τを溶解し希釈した希釈サンプルを培養細胞に加え３７℃２４時間培養した。更に、培養細胞にｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＶＳＶ）を加え３７℃で２４時間培養した。培養終了後、２０％ホルマリンを含むクリスタルバイオレット溶液で固定および生存している細胞の染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定した。この際、細胞を５０％生存させる時のウシＩＦＮ−τの量を抗ウィルス活性１ユニット（１Ｕ）と定義した。以上により測定したウシＩＦＮ−τの活性は４．０Ｕ／ｎｇであった。
【００９７】
＜参考例２： ウシＩＦＮ−τ発現用ベクターｐＮＹ３０１−ＩＦＮ−τを用いたウシＩＦＮ−τの生産＞
【００９８】
ｐＮＹ３０１の分泌シグナルをコードするＤＮＡの下流にウシＩＦＮ−τ遺伝子を組み込み、ウシＩＦＮ−τ発現用ベクターを作製した。次いで、このウシＩＦＮ−τ発現用ベクターをエレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、ウシＩＦＮ−τ発現用ベクターｐＮＹ３０１−ＩＦＮ−τを保持するＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を得た。
【００９９】
次いで、このＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を上記の４−２と同じ条件で培養し、培養終了後、培養液を遠心し培養上清を得た。同様に培養を更に４回行い５回分の培養上清を得た。次いで、これらの５回分の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いウシＩＦＮ−τの生産について確認した。
【０１００】
その結果、５回分の内、１回についてだけ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ウシＩＦＮ−τが分泌生産されたことを示すバンドが認められたが、バンドの濃さから、その分泌生産量は多くとも約１０〜２０ｍｇ／ｌ程度と推定された。また、他の４回については、ウシＩＦＮ−τが分泌生産されたことを示すバンドが認められなかった。
【０１０１】
以上により、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞を用いた組換えタンパク質生産において、本発明のＰ４５タンパク質遺伝子を目的タンパク質遺伝子の上流に連結することにより、通常の遺伝子組換えによる方法では微量しか生産されず、また、生産も安定しなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量を安定して顕著に増大させる効果があることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】Ｐ４５タンパク質全長のアミノ酸配列を示す。
【図２】図１のＰ４５タンパク質の８残基め以降からなるＰ４５タンパク質のアミノ酸配列
【図３】Ｐ４５タンパク質成熟体のアミノ酸配列を示す。
【図４】Ｐ４５タンパク質遺伝子全長のＤＮＡ配列を示す。
【図５】図４のＰ４５タンパク質遺伝子の２２塩基め以降からなるＰ４５タンパク質遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【図６】Ｐ４５タンパク質成熟体をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図７】ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γの培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して行ったＣＢＢ染色の結果を示す図面代用写真である。なお、レーンＣは、対照として用いたブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５の培養上清である。
【図８】ブレビバチルス・チョウシネンシＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τの培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して行ったＣＢＢ染色の結果を示す図面代用写真である。なお、レーンＣは、対照として用いたブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５の培養上清である。
【図９】Ｐ４５タンパク質成熟体のＮ末端アミノ酸配列（上段）、内部アミノ酸配列１（中段）、内部アミノ酸配列２（下段）を示す。
【図１０】プライマー４５ＫＤＮ（上段）及び４５ＫＤＣ（下段）を示す。
【図１１】プライマーＰ４５−Ｎ（上段）及びＰ４５−Ｃ（下段）を示す。
【図１２】プライマーｇａｍｂａｍ（上段）及びｇａｍｓｍａ（下段）を示す。
【図１３】プライマーｔａｕｂａｍ（上段）及びｔａｕｓｍａ（下段）を示す。
【技術分野】
【０００１】
遺伝子組換えによるタンパク質の生産、特には、融合タンパク質発現法における連結相手として利用可能な新規ＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを融合タンパク質発現法における連結相手に用いた組換えタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術は、生体内に微量しか存在せず単離が難しいために従来は利用が著しく困難であったタンパク質、または、任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、細菌、真菌、または、動物細胞などを宿主に用いて大量に生産することを可能にした。
【０００３】
しかしながら、目的とするタンパク質またはポリペプチドによっては、それをコードする遺伝子の発現が起こらないか、もしくは、遺伝子が発現されたとしても目的とするタンパク質またはポリペプチドが極微量しか生産されず産業的な利用が不可能な場合も多かった。
【０００４】
そのため、当業者において、通常の遺伝子組換えによる方法では遺伝子の発現が起こらない遺伝子の発現を行うため、あるいは、通常の遺伝子組換えによる方法では微量しか生産されないタンパク質の生産量を増大させるための方法のひとつとして、融合タンパク質発現と呼ばれる手法が用いられている。この融合タンパク質発現とは、融合パートナーと呼ばれる特定のタンパク質をコードするＤＮＡ断片（以下、連結相手とする。）の下流に目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡを発現させ、融合パートナーと目的とするタンパク質が結合した融合タンパク質として生産した後、融合パートナー部分を切断することにより目的とするタンパク質を得る方法である。この際、融合パートナーと目的とするタンパク質コードするＤＮＡの間にトロンビン認識配列などの特異的に切断可能なペプチド鎖をコードするＤＮＡを挿入し、生産された融合タンパク質から融合パートナーの切断が行えるようにする。
【０００５】
この融合タンパク質発現法に用いられる融合パートナーとしては、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（特許文献１）などが知られている。また、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主とする組換えタンパク質生産においても融合タンパク質発現が試みられており、例えば、特許文献２においてｈＥＧＦを融合パートナーとして用いる方法が開示されている。
【特許文献１】特表平１−５０３４４１
【特許文献２】特開平６−２５３８６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、融合タンパク質発現の連結相手として知られている公知のＤＮＡの何れを用いても、それでも、発現が困難である遺伝子、または、微量しか生産されないタンパク質（またはポリペプチド）も多い。また、上記のｈＥＧＦのように融合パートナーがシステイン残基を含むたんぱく質である場合には、生産された融合タンパク質において、目的タンパク質に含まれるシステイン残基と融合パートナーに含まれるシステイン残基の間での不正なＳＳ結合が生じてしまうという問題があり、融合タンパク質発現法に適さない場合が多かった。
【０００７】
また、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主とする遺伝子組換えによるタンパク質生産において、融合パートナーとしての利用が試みられた他のタンパク質は、生産量自体があまり多くなかったり、分解されやすいものであったりしたため、融合パートナーに適しておらず、これまでブレビバチルス属細菌を宿主とする遺伝子組換えによるタンパク質生産において融合パートナーに適したタンパク質は知られていなかった。
【０００８】
そのため、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主とする融合タンパク質発現法によるタンパク質生産において、連結相手として利用可能な新規なＤＮＡ、及び、該ＤＮＡを融合タンパク質発現の連結相手に用いた組換えタンパク質の生産方法の提供が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主に用いた遺伝子組換えによるタンパク質生産において、イヌ可溶性ＩｇＥ受容体などの特定のタンパク質の分泌生産を行った際、目的タンパク質の分泌生産と同時に分子量約４５ｋＤａの機能未知のタンパク質が大量に分泌されることを発見した。本発明者は、この機能未知の分泌タンパク質を、その分子量が約４５ｋＤであることからＰ４５と命名した。
【００１０】
本発明者は、この大量に分泌されるＰ４５タンパク質を融合タンパク質発現法における融合パートナーに用いることにより、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主とする遺伝子組換えによるタンパク質生産において、これまで全く発現がされなかった遺伝子の発現、及び、該遺伝子にコードされたタンパク質（またはポリペプチド）の生産、または、これまで微量しか生産されなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量の増大を可能にするのではないかとの新規着想を得た。
【００１１】
そこで、本発明者は、これまでブレビバチルス属細菌を宿主に用いた組換えタンパク質生産において目的とするタンパク質をコードする遺伝子を発現する形質転換体の構築が出来なかった遺伝子について、その上流にＰ４５タンパク質遺伝子を連結した融合タンパク質遺伝子（Ｐ４５融合タンパク質遺伝子）発現用ベクターを作製し、このベクターを用いて融合タンパク質発現を試みた。
【００１２】
その結果、本発明者は、Ｐ４５融合タンパク質遺伝子の発現、及び、著量のＰ４５融合タンパク質の生産に成功した。更に、得られたＰ４５タンパク質との融合タンパク質から活性を有する目的タンパク質を単離することに成功した。
【００１３】
また更に、本発明者は、これまでブレビバチルス属細菌を宿主細胞を用いた組換えタンパク質生産において微量しか生産することができなかったタンパク質について、その遺伝子の上流にＰ４５タンパク質遺伝子を連結した融合タンパク質遺伝子の発現を行うことにより、その生産量を顕著に増大させることに成功し、本発明を完成した。
【００１４】
本発明は、融合タンパク質発現法における連結相手として利用可能な新規ＤＮＡであるＰ４５タンパク質遺伝子を提供する。
更に、本発明は、Ｐ４５タンパク質遺伝子の下流に目的タンパク質遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだ融合タンパク質発現用ベクターを提供する。
【００１５】
また更に、本発明は、該融合タンパク質発現用ベクターを保持する宿主細胞を提供する。
また更に、本発明は、該融合タンパク質発現用ベクターを保持する宿主細胞を培養する工程を含むタンパク質の生産方法を提供する。
【００１６】
また更に、本発明は、ブレビバチルス・チョウシネンシス由来の新規タンパク質であるＰ４５タンパク質を提供する。このＰ４５タンパク質は、高い分泌性を有し、また、配列中にシステインを含まない、部位特異切断酵素として汎用されるトロンビンによる分解を受けないなどの性質により融合発現法における融合パートナーとして極めて優れている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＰ４５タンパク質遺伝子は、特にブレビバチルス属細菌を宿主細胞に用いた組換えタンパク質生産において、目的タンパク質遺伝子の上流に連結することにより、これまで通常の遺伝子組換えによる方法では、タンパク質（またはポリペプチド）をコードする遺伝子が発現されなかったため生産が不可能だったタンパク質（またはポリペプチド）の生産を可能し、また、これまで微量しか生産することができなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量を顕著に増大させる効果がある。
【００１８】
さらに、本発明のＰ４５タンパク質は、高い分泌性を有する、配列中にシステインを含まない、部位特異酵素として汎用されるトロンビンによる分解を受けないなどの性質により融合発現法における融合パートナーとして極めて優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明のＰ４５タンパク質遺伝子は、ブレビバチルス・チョウシネンシス由来の新規タンパク質である配列番号１：図１のＰ４５タンパク質をコードするＤＮＡである。そのＤＮＡ配列を配列番号４：図４に示す。
【００２１】
なお、配列番号４：図４のＰ４５タンパク質遺伝子の配列には、翻訳開始点と考えられるメチオニンをコードするＡＴＧが１から３塩基めと２２から２４塩基めの２ヶ所にある。融合タンパク質発現法における連結相手には、配列番号４：図４に示すメチオニンを２つとも含むＰ４５タンパク質遺伝子の全長を用いてもよいが、通常は、配列番号５：図５に示す、配列番号４：図４の２２番目以降の塩基からなるＤＮＡを用いる。本願明細書では、配列番号５：図５のＤＮＡについてもＰ４５タンパク質遺伝子とする。
【００２２】
配列番号４：図４、または、配列番号５：図５のＤＮＡ配列と７０％以上の相同性を有するものは知られておらず、したがって、本発明のＰ４５タンパク質遺伝子は新規ＤＮＡである。さらに配列番号１：図１のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸をコードするＤＮＡであっても、生産を目的とするタンパク質をコードする遺伝子の上流に連結することにより、これまで通常の遺伝子組換えによる方法では、発現がされなかった遺伝子の発現を可能にするか、または、微量しか生産されなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量を増大させる効果がある限り、全て本発明のＰ４５タンパク質遺伝子に包含される。
【００２３】
本発明のＰ４５タンパク質遺伝子は、例えば、後述の実施例２に示すようにブレビバチルス・チョウシネンシスのゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーから、配列番号４：図４、または、配列番号５：図５のＤＮＡ配列の一部を有するＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、上記のＤＮＡ断片をプライマーとして用いるＰＣＲ法により調製することができる。または、そのＤＮＡ配列を元に当業者に公知の核酸化学合成法などにより、本発明のＰ４５タンパク質遺伝子を得ることもできる。
【００２４】
本発明のＰ４５タンパク質は、配列番号４：図４のＰ４５タンパク質遺伝子によってコードされるポリペプチドである。その全長のアミノ酸配列を配列番号１：図１に示す。また、配列番号５：図５のＤＮＡ配列がコードする、配列番号１：図１のＰ４５タンパク質の８残基目のメチオニン以降からなるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２：図２に示す。この配列番号２：図２のタンパク質についてもＰ４５タンパク質とする。
【００２５】
配列番号１： 図１、または、配列番号３：図３のアミノ配列と７０％以上の相同性を有するものは知られておらず、したがって、本発明のＰ４５タンパク質は新規のタンパク質である。
【００２６】
また、配列番号１：図１のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、そのタンパク質をコードするＤＮＡを、生産を目的とするタンパク質をコードする遺伝子の上流に連結することにより、これまで通常の遺伝子組換えによる方法では、発現がされなかった遺伝子の発現を可能にするか、または、微量しか生産されなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量を増大させる効果がある限り、全て本発明の新規タンパク質Ｐ４５に包含される。
【００２７】
また、Ｐ４５タンパク質から分泌シグナル部分が削除されたＰ４５タンパク質成熟体のアミノ酸配列を配列番号３：図３に示す。
【００２８】
次に、本発明のＰ４５タンパク質を融合パートナーに用いた融合タンパク質発現法による組換えタンパク質の生産方法（Ｐ４５融合タンパク質発現法）について説明する。
【００２９】
また、以下において、Ｘは、配列番号１：図１、または、配列番号２：図２によって示されるＰ４５タンパク質、または、そのアミノ酸配列、ｘは、配列番号４：図４、または、配列番号５：図５によって示されるＰ４５タンパク質遺伝子、並びに、それらの塩基配列を表わす。
【００３０】
更に、Ｘ’は、配列番号３：図３によって示されるＰ４５タンパク質成熟体、または、そのアミノ酸配列、ｘ’は、配列番号６：図６によって示されるＰ４５タンパク質成熟体をコードするＤＮＡ、または、その塩基配列を表わす。
【００３１】
更に、Ｒは酵素や化学物質等によって特異的に認識され切断される部位を含むペプチド鎖、または、そのアミノ酸配列を表し、ｒは該アミノ酸をコードする配列からなるＤＮＡまたはその塩基配列を表わす。
【００３２】
また更に、Ｚは任意の生産を目的とするタンパク質（またはポリペプチド）、または、そのアミノ酸配列を表し、ｚは該タンパク質（またはポリペプチド）をコードするＤＮＡまたはその塩基配列を表す。
【００３３】
また更に、Ｘ−Ｒは、上記のＸとＲがこの順序で連結されたポリペプチドまたはそのアミノ酸配列、Ｘ’−Ｒは、上記のＸ’とＲがこの順序で連結されたポリペプチドまたはそのアミノ酸配列、ｘ−ｒは、該ポリペプチドをコードする配列からなるＤＮＡまたはその塩基配列を表す。
【００３４】
また更に、Ｘ−Ｒ−ＺまたはＸ’−Ｒ−Ｚは、上記のＸ、Ｒ、Ｚがこの順序で連結された融合タンパクまたはそのアミノ酸配列、ｘ−ｒ−ｚは該融合タンパク質をコードするＤＮＡまたはその塩基配列を表す。
【００３５】
なお、本願明細書では、Ｘ−Ｒ−Ｚ、または、Ｘ’−Ｒ−ＺをＰ４５融合タンパク質、ｘ−ｒ−ｚをＰ４５融合タンパク質遺伝子と呼ぶ。
【００３６】
また、Ｘ’−Ｒ−ＺにおけるＸ’をＰ４５融合パートナー、または、Ｐ４５タンパク質と呼ぶ場合がある。
【００３７】
本発明のＰ４５融合タンパク質発現法は、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞として用いた場合、通常、以下の手順により行われる。なお、ブレビバチルス属細菌細胞を宿主細胞として用いた場合、通常、生産されたタンパク質は宿主細胞内に蓄積されず細胞外の培地中に分泌されるため、以下では培地中への分泌生産の場合について説明する。
【００３８】
（手順）
ａ）Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを組み込んだＰ４５融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを作製する。
ｂ）Ｐ４５融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを宿主細胞に導入し宿主細胞の形質転換体を作製する。
ｃ）宿主細胞の形質転換体を培養し、Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを発現させ、Ｐ４５融合タンパク質Ｘ’−Ｒ−Ｚを培地中に分泌生産させる。
ｄ）培養上清中からＰ４５融合タンパク質Ｘ’−Ｒ−Ｚを回収する。
ｅ）回収した融合タンパク質からＰ４５融合パートナーＸ’を切断処理し目的タンパク質Ｚを単離する。
ｆ）単離した目的タンパク質Ｚを精製する。
【００３９】
以下、上記した手順ａ）〜ｆ）について更に説明する。
【００４０】
（手順ａ）
まず、Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを組み込んだＰ４５融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを作製する。
【００４１】
ｘ、ｒ、ｚのそれぞれ、または、ｘ−ｒ、ｘ−ｒ−ｚなどの構造からなるＤＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ． ｅｔ ａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９））などに記載の当業者に公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を適宜選択し組み合わせて用いることにより得ることができる。例えば、化学的合成法またはクローニング法によって個々に調製することが可能である。
【００４２】
Ｐ４５融合タンパク質発現用ベクターは、Ｐ４５融合タンパク質をコードするｘ−ｒ−ｚを発現用ベクターのプロモーター領域の下流に組み込むことにより作製しても、予め、発現用ベクターのプロモーター領域の下流にｘ−ｒを組み込んだベクターを作製し、そのｘ−ｒの下流にｚを組み込むことにより作製してもよい。
【００４３】
なお、本発明において、Ｚの種類は特に限定されない。また、その用途も特に限定されない。その用途は医薬品、生化学試薬、産業用酵素などのいずれであってもよい。また、Ｒは、Ｚのアミノ酸配列中に存在しないアミノ酸配列からなるものであることが望ましく、したがって、ｒもそのようなＲをコードするＤＮＡであることが好ましい。
【００４４】
Ｐ４５融合タンパク質発現法に用いるベクターＤＮＡは、宿主細胞内でＰ４５融合タンパク質遺伝子の発現が可能なものであるならば特に限定されないが、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞に用いる場合には、特に好ましいものとしてｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号）またはｐＮＣＭＯ２（特開２００１−３７１６７号）、または、それらからそれらが予め含む分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを除去したベクターＤＮＡを例示することができる。
【００４５】
なお、生産されたタンパク質を細胞外に分泌させるためには、ベクターのプロモーター領域の下流側に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含有させる必要がある。Ｐ４５タンパク質自体が分泌タンパク質であるため、通常は、Ｐ４５タンパク質自身が有する分泌シグナルをコードするＤＮＡをそのまま用いることが好ましいが、上記のｐＮＹ３０１が含有するＭＷＰ型分泌シグナルをコードするＤＮＡ、または、ｐＮＣＭＯ２が含有する改変型のＭＷＰ分泌シグナルをコードするＤＮＡなどを用いてもよい。
【００４６】
Ｐ４５タンパク質遺伝子自身の分泌シグナルをコードするＤＮＡを用いる場合には、ｐＮＹ３０１やｐＮＣＭＯ２が含有する分泌シグナルをコードするＤＮＡを除去した上で、ｘ−ｒ−ｚを組込む。また、ｐＮＹ３０１やｐＮＣＭＯ２が含有する分泌シグナルをコードするＤＮＡを用いる場合には、ｘ’−ｒ−ｚを組込む。
【００４７】
ブレビバチルス属細菌からＰ４５融合タンパク質が分泌される際に、分泌シグナルが切断されるため、培地中に分泌生産されるＰ４５融合タンパク質は、Ｘ’−Ｒ−Ｚで表される構造からなる。
【００４８】
（手順ｂ）
ａ）で構築したＰ４５融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞の形質転換体を作製する。
【００４９】
Ｐ４５融合タンパク質遺伝子の発現に用いる宿主細胞は、ａ）で構築したベクター上のＰ４５融合タンパク質遺伝子の発現が行われるものであるならば特に限定されないが、主に細菌であり、好ましくは、バチルス属またはブレビバチルス属の細菌であり、特に好ましくは、ブレビバチルス属の細菌である。更に、特に好ましい宿主菌株としてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１）（バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株）や、その変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−Ｓ５）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）と同一菌株）を例示することができる。
【００５０】
Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを含有するベクターの宿主細胞への導入は、当業者に公知の遺伝子組換え技術を適宜選択することにより行うことができる。特にブレビバチルス属細菌を宿主に用いる場合には、特に好ましい方法としてエレクトロポレーション法を例示することができる。
【００５１】
（手順ｃ）
次に、ｂ）で作製した宿主細胞の形質転換体を培養し、Ｐ４５融合タンパク質遺伝子ｘ−ｒ−ｚを発現させ、Ｐ４５融合タンパク質Ｘ’−Ｒ−Ｚを培地中に分泌生産させる。
【００５２】
融合タンパク質の発現に用いる宿主細胞の培養方法は宿主細胞に応じて公知の方法を用いればよい。特にブレビバチルス属細菌を宿主として用いる場合には、後述の実施例に記載の方法を特に好ましい培養方法として例示することができる。
【００５３】
（手順ｄ）
次いで、培養上清中から融合タンパク質Ｘ’−Ｒ−Ｚを回収する。
【００５４】
培養上清中または培養細胞内から融合タンパク質を回収は、当業者に公知の方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより可能である。特に、融合タンパク質が菌体外に分泌生産される場合には、遠心分離、膜濾過などの一般的な方法で菌体と培養上清を分離した後、各種クロマトグラフィー、または、電気泳動法などの方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより行えばよいが、特に好ましいのは、融合パートナーを特異的に認識し吸着する物質（抗体）を利用したアフィニティークロマトグラフィーである。
【００５５】
（手順ｅ）
次いで、ｄ）で回収した融合タンパク質から融合パートナーＸ’を切断処理し目的とするタンパク質Ｚを単離する。
【００５６】
ｄ）で得られた融合タンパク質が目的タンパク質と同等の特性、生理活性を有する場合は、融合タンパク質をそのまま利用してもよいが、通常は、融合タンパク質から融合パートナーを切断、除去し、目的とするタンパク質の単離を行う。
【００５７】
融合パートナーと目的タンパク質を切断する方法には、特定のアミノ酸配列を認識し特定の部位でポリペプチド鎖を部位特異的に切断する酵素により切断する方法と化学物質による化学反応により切断する方法があるが、目的とするタンパク質を安定な状態で得るためには部位特異酵素を用いて切断する方法が好ましい。酵素により部位特異的切断を行う場合には、Ｒの配列に応じて、トロンビン、エンテロキナーゼ、トリプシン、血液凝固系第Ｘａ因子、コラゲナーゼなどの酵素を用いる。
【００５８】
（手順ｆ）
更に、ｅ）で単離した目的とするタンパク質Ｚを精製する。
【００５９】
単離した目的タンパク質の精製は、当業者に公知の方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより可能である。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法、または、電気泳動法などの方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより行うことができる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明をこれらの実施例のいずれかに限定することを意図するものでない。また、以下において、アミノ酸は、当業者が慣用している３文字表記もしくは１文字表記の略号を用いて表した。
【００６１】
（実施例１： Ｐ４５タンパク質遺伝子のクローニング）
Ｐ４５タンパク質の遺伝子を以下の手順によりクローン化した。
【００６２】
先ず、ｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号）にＴＮＦ−α遺伝子を組み込んだＴＮＦ−α発現用ベクターで形質転換したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５を、ネオマイシンを５０μｇ／ｍｌ含有するＴＭ液体培地（ペプトン １％、肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．２％、グルコース１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０００１％、ｐＨ７．０）で３０℃、２０時間、振とう培養し、ＴＮＦ−α遺伝子を発現させることによりＰ４５タンパク質の分泌生産を誘導した。培養終了後、培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ＰＶＤＦ膜に転写して染色した後、ＰＶＤＦ膜からＰ４５タンパク質に相当する分子量４５ｋＤのバンドを切り出した。この切り出したバンドからＰ４５タンパク質成熟体のＮ末端と内部配列２個、計３個の断片についてアミノ酸配列の決定を行った。判明したアミノ酸配列の内、Ｐ４５タンパク質成熟体Ｎ末配列、内部配列１、内部配列２を、配列番号７（図９上段）、配列番号８（図９中段）、配列番号９（図９下段）にそれぞれ示した。
【００６３】
次いで、Ｐ４５タンパク質成熟体のＮ末配列（配列番号７）及び内部配列１（配列番号８）をもとに、デジェネレートプライマー、４５ＫＤＮ（ｆｏｒｗａｒｄ）（配列番号１０：図１０上段）及び４５ＫＤＣ（ｂａｃｋｗａｒｄ）（配列番号１１：図１０下段）を設計した。
【００６４】
（注）Ｂ＝Ｔ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｇ， Ｓ＝Ｃ ｏｒ Ｇ， Ｋ＝Ｔ ｏｒ Ｇ， Ｙ＝Ｃ ｏｒ Ｔ， Ｒ＝Ａ ｏｒ Ｇ， Ｈ＝Ａ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｃ， Ｗ＝Ａ ｏｒ Ｔ， Ｎ＝Ａ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｇ ｏｒ Ｔ， Ｄ＝Ａ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｇ， Ｖ＝Ａ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｇ， Ｍ＝Ａ ｏｒ Ｃ
【００６５】
これらの２本のプライマーを用い、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。このＰＣＲの結果、約２００塩基対のＤＮＡ断片が増幅された。更に、このＤＮＡ断片を元にジーンウオーキングの手法で残りの部分のＤＮＡ配列を解読し、最終的に１４１６塩基対から成るＰ４５タンパク質遺伝子の全ＤＮＡ配列を明らかにした。Ｐ４５タンパク質遺伝子の全ＤＮＡ配列を配列番号４：図４に示す。配列番号４：図４に示した配列は、翻訳開始点と考えられるメチオニンをコードするＡＴＧが１から３塩基目と２２から２４塩基目の２箇所に存在するＰ４５タンパク質遺伝子の全長である。
【００６６】
（実施例２： Ｐ４５融合発現用ベクターｐＮＹ−Ｐ４５の構築）
下記の２本の合成ＤＮＡをプライマーに用い、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５のゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行い、配列番号５：図５の配列に示す、Ｐ４５タンパク質の２番めのメチオニン以降をコードするＤＮＡ断片の増幅を行った。該２本のプライマーの内、Ｐ４５−Ｎ（ｆｏｒｗａｒｄ）を配列番号１２（図１１上段）及びＰ４５−Ｃ（ｂａｃｋｗａｒｄ）を配列番号１３（図１１下段）にそれぞれ示した。
【００６７】
なお、上記のＰ４５−Ｎプライマーには、ベクターＤＮＡに組み込むためにＢｓｐＨＩ制限酵素切断部位（ＴＣＡＴＧＡ）を設け、またＰ４５−ＣプライマーにはＢａｍＨＩ制限酵素切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）を設けた。更にＰ４５−Ｃプライマーには、目的とするタンパク質とＰ４５ポリペプチドの切断を行うために、トロンビンの認識アミノ酸配列であるＬＶＰＲＧＳをコードするＤＮＡ配列（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＧ−３’）を組み込んだ。
【００６８】
次いで、上記のＰＣＲで得たＰ４５タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで処理した。また、プラスミドベクターｐＮＹ３０１を同じ制限酵素で処理することにより、ｐＮＹ３０１からプロモーター領域とマルチクローニングサイトの間に含まれているＭＷＰ型分泌シグナルをコードするＤＮＡを除去した。次いで、上記のＰ４５タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡ断片をｐＮＹ３０１のプロモーター領域とマルチクローニングサイトの間に組み込んだ。以上により作製した融合タンパク質発現用ベクターをｐＮＹ−Ｐ４５とした。
【００６９】
なお、上記で用いたＰ４５−ＮプライマーにはＢｓｐＨＩ制限酵素切断部位が設けられているため、このｐＮＹ−Ｐ４５に目的タンパク質遺伝子を組込んだ発現ベクターにより生産されるＰ４５融合タンパク質は、その先頭の分泌シグナル部に配列番号２：図２が示す１残基めのメチオニンの前にもう一つメチオニンが付加されている。また、このｐＮＹ−Ｐ４５は、ｐＮＹ３０１が含有するＭＷＰ型分泌シグナルをコードするＤＮＡではなく、Ｐ４５タンパク質遺伝子自身の分泌シグナルをコードするＤＮＡを含有している。
【００７０】
（実施例３： ブタＩＦＮ−γのＰ４５融合タンパク質法による生産）
ブタＩＦＮ−γは、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞とする組換えタンパク質生産において生産が極めて困難なタンパク質であり、通常の遺伝子組換えによる方法では発現用ベクターの構築すら不可能だった。そこで、上記の実施例２で構築したＰ４５融合発現用ベクターｐＮＹ−Ｐ４５にブタＩＦＮ−γ遺伝子を組み込み、Ｐ４５融合タンパク質法によるブタＩＦＮ−γの生産を試みた。
【００７１】
３−１） Ｐ４５−ＩＦＮ−γ融合遺伝子発現用ベクターを保持するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体の作製
【００７２】
まず、下記の２つの合成ＤＮＡをプライマーに用い、ブタＩＦＮ−γ（ｐｏｒｃｉｎｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ）のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ２１３９４８）を鋳型に用いてＰＣＲを行い、ブタＩＦＮ−γ遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行った。該２本のプライマーの内、ｇａｍｂａｍ （ｆｏｒｗａｒｄ）配列番号１４（図１２上段）及びｇａｍｓｍａ （ｂａｃｋｗａｒｄ）を配列番号１５（図１２下段）にそれぞれ示した。
【００７３】
なお、発現用ベクターに組み込むためにｇａｍｂａｍプライマーにはＢａｍＨＩ制限酵素切断部位、ｇａｍｓｍａプライマーにはＳｍａＩ制限酵素切断部位を設けた。
【００７４】
次いで、上記のＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで処理した後、同じ制限酵素で処理したｐＮＹ−Ｐ４５に結合した。得られたＰ４５タンパク質とブタＩＦＮ−γの融合遺伝子発現用ベクターをｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γとした。
【００７５】
更に、このｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５にエレクトロポレーション法により導入し、ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γを保持するＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を得た。
【００７６】
３−２） ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γの培養によるＰ４５融合タンパク質の生産、及び、ブタＩＦＮ−γの単離と精製
【００７７】
次いで、上記のｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γを保持するＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地を３ｍｌずつ分注した試験管１０本で、３０℃で２日間培養し、Ｐ４５タンパク質とＩＦＮ−γの融合タンパク質の培地中への分泌生産を行った。培養終了後、培養液の一部を採取し、遠心して得た培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図７に示す。図７に示されているとおり、Ｐ４５ポリペプチドとブタＩＦＮ−γの融合タンパク質は極めて効率良く分泌生産されており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの濃さから、その培地中への分泌生産量は、およそ１ｇ／ｌに達していると推定された。また、ブタＩＦＮ−γの実質の濃度は、Ｐ４５とブタＩＦＮ−γの分子量比が４５：１３ぐらいであることからおよそ２００ｍｇ／ｌ程度と推定された。
【００７８】
次いで、培養上清中のＰ４５−ＩＦＮ−γ融合タンパク質の回収を、５ｍｌのウサギ抗Ｐ４５タンパク質抗体を固定したＮＨＳ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（アマシャムバイオサイエンス）をアフィニティーカラムに用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行った。この際、前記のアフィニティーカラムの下流に補助カラムとして１ｍｌのＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを接続した。
【００７９】
まず、上記の培養後の培養液２０ｍｌを１ＮＨＣｌでｐＨ８．０に調整した後、遠心し培養上清を得た。次いで、平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ ｐＨ８．０， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）を流しカラムの平衡化を行い、前記の培養上清をカラムにかけた。その後、平衡化バッファーを３０ｍｌ流しカラムの洗浄を行った。
【００８０】
次いで、上記のアフィニティーカラムで回収したＰ４５−ＩＦＮ−γ融合タンパク質からＰ４５融合パートナー部を切断処理し、ブタＩＦＮ−γの単離と精製を行った。まず、トロンビン（アマシャムバイオサイエンス）を２０Ｕ／１０ｍｌになるように平衡化バッファーで希釈した。次いで、このトロンビン溶液をカラムに流し２２℃で１６時間消化した。消化後、上記の平衡化バッファーでブタＩＦＮ−γを溶出し、溶出液中のトロンビンを補助カラムで除去した。次いで、ブタＩＦＮ−γを含む溶出液を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で透析した。更に、凍結乾燥物の溶解を容易にするため安定剤としてＢＳＡを１ｍｇ添加し凍結乾燥を行った。最終的に培養液中から約４０％のブタＩＦＮ−γを回収した。
【００８１】
３−３） ブタＩＦＮ−γの活性測定
ｍａｄｉｎ−ｄａｒｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ（ＭＤＢＫ細胞）を９６穴マイクロプレート上で３７℃２日間培養した。次いで、３−２で得た凍結乾燥したブタＩＦＮ−γを溶解し希釈した希釈サンプルを培養細胞に加え３７℃２４時間培養した。更に、培養細胞にｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＶＳＶ）を加え３７℃で２４時間培養した。培養終了後、２０％ホルマリンを含むクリスタルバイオレット溶液で固定および生存している細胞の染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定した。この際、細胞を５０％生存させる時のブタＩＦＮ−γの量を抗ウィルス活性１ユニット（１Ｕ）と定義した。以上により測定したブタＩＦＮ−γの活性は６．０Ｕ／ｎｇであった。
【００８２】
＜参考例１：ｐＮＹ３０１−ＩＦＮ−γによるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換の試行＞
【００８３】
ｐＮＹ３０１のＭＷＰ型分泌シグナルをコードするＤＮＡの下流にブタＩＦＮ−γ遺伝子を組み込んだブタＩＦＮ−γ発現用ベクターを作製した。エレクトロポレーションにより、このブタＩＦＮ−γ発現用ベクターをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、次いで、このＨＰＤ３１−Ｓ５を、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ寒天培地に塗布することで、ｐＮＹ３０１−ＩＦＮ−γの導入によりネオマイシン耐性を示すＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を選択しようとしたが、ネオマイシン耐性を示すＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体が取得できなかった。
【００８４】
以上により、これまでブレビバチルス属細菌を宿主とする遺伝子組換えによるタンパク質生産において、目的タンパク質遺伝子の発現用ベクターの構築すら不可能だったタンパク質について、Ｐ４５融合タンパク質発現法を用いることで、著量のＰ４５融合タンパク質の生産が可能になり、更に、Ｐ４５融合タンパク質の融合パートナー部分を切断、除去することにより活性を有する目的タンパク質が得られることが示された。
【００８５】
（実施例４： ウシＩＦＮ−τのＰ４５融合タンパク質法による生産）
ウシＩＦＮ−τは、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞とする通常の遺伝子組換えによる方法では、最も生産量が多い場合でも１０〜２０ｍｇ／ｌ程度の生産量しかなく、全く生産されない場合も多かった。
【００８６】
そこで、実施例２で作製した融合タンパク質発現用ベクターｐＮＹ−Ｐ４５にウシＩＦＮ−τ遺伝子を組み込み、Ｐ４５融合タンパク質法によるウシＩＦＮ−τの生産を試みた。
【００８７】
４−１） Ｐ４５−ＩＦＮ−γ融合遺伝子発現用ベクターを保持するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体の作製
【００８８】
まず、下記の２つの合成ＤＮＡをプライマーに用い、ウシＩＦＮ−τ（ｂｏｖｉｎｅＩＦＮ−ｔａｕ）のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ９９６０４８）を鋳型に用いてＰＣＲを行い、ウシＩＦＮ−τ遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅を行った。該２つのプライマーの内、ｔａｕｂａｍ （ｆｏｒｗａｒｄ）を配列番号１６（図１３上段）及びｔａｕｓｍａ （ｂａｃｋｗａｒｄ）を配列番号１７（図１３下段）にそれぞれ示した。
【００８９】
なお、発現用ベクターに組み込むためにｔａｕｂａｍプライマーにはＢａｍＨＩ制限酵素切断部位、ｔａｕｓｍａプライマーにはＳｍａＩ制限酵素切断部位を設けた。次いで、上記のＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで処理した後、同じ制限酵素で処理したｐＮＹ−Ｐ４５に結合し遺伝子発現用プラスミドベクターを作製した。このＰ４５タンパク質とウシＩＦＮ−τの融合遺伝子発現用プラスミドベクターをｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τとした。
【００９０】
次に、エレクトロポレーション法により、このｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τを保持するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を得た。
【００９１】
４−２） ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τの培養によるＰ４５融合タンパク質の生産、及び、ウシＩＦＮ−τの単離と精製
【００９２】
上記により得たｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τを保持するブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有するＴＭ液体培地を３ｍｌずつ分注した試験管１０本で、３０℃で２日間培養した。培養終了後、培養液の一部を採取し、遠心して培養上清を得た。更に２回、同様に上記の形質転換体の培養を行い、３回分の培養上清を得、これら３回分の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図８に示す。図８に示されているとおり、ＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体は、３回ともＰ４５タンパク質とＩＦＮ−τの融合タンパク質を極めて効率良く分泌生産しており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの濃さから、その培地中への分泌生産量は、３回ともおよそ２ｇ／ｌに達していると推定された。また、ウシＩＦＮ−τの実質の濃度は、Ｐ４５とウシＩＦＮ−τの分子量比が４５：１５ぐらいであることからおよそ５００ｍｇ／ｌと推定された。
【００９３】
次いで、培養上清中のＰ４５−ＩＦＮ−τ融合タンパク質の回収を、５ｍｌのウサギ抗Ｐ４５タンパク質抗体を固定したＮＨＳ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（アマシャムバイオサイエンス）をアフィニティーカラムに用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行った。この際、前記のアフィニティーカラムの下流に補助カラムとして１ｍｌのＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを接続した。
【００９４】
まず、上記の培養後の培養液２０ｍｌを１ＮＨＣｌでｐＨ８．０に調整した後、遠心し培養上清を得た。次いで、平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ ｐＨ８．０， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２．５ｍＭ ＣａＣｌ2）を流しカラムの平衡化を行い、前記の培養上清をカラムにかけた。その後、平衡化バッファーを３０ｍｌ流しカラムの洗浄を行った。
【００９５】
次いで、上記のアフィニティーカラムで回収したＰ４５−ＩＦＮ−τ融合タンパク質からＰ４５融合パートナー部を切断処理し、ウシＩＦＮ−τの単離と精製を行った。まず、トロンビン（アマシャムバイオサイエンス）を２０Ｕ／１０ｍｌになるように平衡化バッファーで希釈した。次いで、このトロンビン溶液をカラムに流し２２℃で１６時間消化した。消化後、上記の平衡化バッファーでウシＩＦＮ−τを溶出し、溶出液中のトロンビンを補助カラムで除去した。次いで、ウシＩＦＮ−τを含む溶出液を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で透析した。更に、凍結乾燥物の溶解を容易にするため安定剤としてＢＳＡを１ｍｇ添加し凍結乾燥を行った。最終的に培養液中から約３０％のウシＩＦＮ−τを回収した。
【００９６】
４−３） ウシＩＦＮ−τの活性測定
ｍａｄｉｎ−ｄａｒｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ（ＭＤＢＫ細胞）を９６穴マイクロプレート上で３７℃２日間培養した。次いで、４−２で得た凍結乾燥したウシＩＦＮ−τを溶解し希釈した希釈サンプルを培養細胞に加え３７℃２４時間培養した。更に、培養細胞にｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＶＳＶ）を加え３７℃で２４時間培養した。培養終了後、２０％ホルマリンを含むクリスタルバイオレット溶液で固定および生存している細胞の染色を行い、５７０ｎｍの吸収を測定した。この際、細胞を５０％生存させる時のウシＩＦＮ−τの量を抗ウィルス活性１ユニット（１Ｕ）と定義した。以上により測定したウシＩＦＮ−τの活性は４．０Ｕ／ｎｇであった。
【００９７】
＜参考例２： ウシＩＦＮ−τ発現用ベクターｐＮＹ３０１−ＩＦＮ−τを用いたウシＩＦＮ−τの生産＞
【００９８】
ｐＮＹ３０１の分泌シグナルをコードするＤＮＡの下流にウシＩＦＮ−τ遺伝子を組み込み、ウシＩＦＮ−τ発現用ベクターを作製した。次いで、このウシＩＦＮ−τ発現用ベクターをエレクトロポレーション法によりブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、ウシＩＦＮ−τ発現用ベクターｐＮＹ３０１−ＩＦＮ−τを保持するＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を得た。
【００９９】
次いで、このＨＰＤ３１−Ｓ５の形質転換体を上記の４−２と同じ条件で培養し、培養終了後、培養液を遠心し培養上清を得た。同様に培養を更に４回行い５回分の培養上清を得た。次いで、これらの５回分の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いウシＩＦＮ−τの生産について確認した。
【０１００】
その結果、５回分の内、１回についてだけ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ウシＩＦＮ−τが分泌生産されたことを示すバンドが認められたが、バンドの濃さから、その分泌生産量は多くとも約１０〜２０ｍｇ／ｌ程度と推定された。また、他の４回については、ウシＩＦＮ−τが分泌生産されたことを示すバンドが認められなかった。
【０１０１】
以上により、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞を用いた組換えタンパク質生産において、本発明のＰ４５タンパク質遺伝子を目的タンパク質遺伝子の上流に連結することにより、通常の遺伝子組換えによる方法では微量しか生産されず、また、生産も安定しなかったタンパク質（またはポリペプチド）の生産量を安定して顕著に増大させる効果があることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】Ｐ４５タンパク質全長のアミノ酸配列を示す。
【図２】図１のＰ４５タンパク質の８残基め以降からなるＰ４５タンパク質のアミノ酸配列
【図３】Ｐ４５タンパク質成熟体のアミノ酸配列を示す。
【図４】Ｐ４５タンパク質遺伝子全長のＤＮＡ配列を示す。
【図５】図４のＰ４５タンパク質遺伝子の２２塩基め以降からなるＰ４５タンパク質遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【図６】Ｐ４５タンパク質成熟体をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図７】ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−γの培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して行ったＣＢＢ染色の結果を示す図面代用写真である。なお、レーンＣは、対照として用いたブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５の培養上清である。
【図８】ブレビバチルス・チョウシネンシＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５−ＩＦＮ−τの培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して行ったＣＢＢ染色の結果を示す図面代用写真である。なお、レーンＣは、対照として用いたブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ−Ｐ４５の培養上清である。
【図９】Ｐ４５タンパク質成熟体のＮ末端アミノ酸配列（上段）、内部アミノ酸配列１（中段）、内部アミノ酸配列２（下段）を示す。
【図１０】プライマー４５ＫＤＮ（上段）及び４５ＫＤＣ（下段）を示す。
【図１１】プライマーＰ４５−Ｎ（上段）及びＰ４５−Ｃ（下段）を示す。
【図１２】プライマーｇａｍｂａｍ（上段）及びｇａｍｓｍａ（下段）を示す。
【図１３】プライマーｔａｕｂａｍ（上段）及びｔａｕｓｍａ（下段）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４または５の配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項1に記載のＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ。
【請求項３】
請求項1に記載のＤＮＡ、及び、該請求項1に記載のＤＮＡの３’末端側に結合され、特異的に認識され切断される部位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ。
【請求項４】
請求項1に記載のＤＮＡ、該請求項1に記載のＤＮＡの３’末端側に結合され、特異的に認識され切断される部位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び、該特異的に認識され切断される部位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡの３’末端側に結合され、生産を目的とするタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターＤＮＡを保持する宿主細胞。
【請求項６】
ブレビバチルス属細菌である請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項５または６に記載の宿主細胞を培養する工程を含むこと、を特徴とするタンパク質またはポリペプチドを生産する方法。
【請求項８】
配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項９】
融合タンパク質発現法における融合パートナーであること、を特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１】
配列番号４または５の配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項1に記載のＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ。
【請求項３】
請求項1に記載のＤＮＡ、及び、該請求項1に記載のＤＮＡの３’末端側に結合され、特異的に認識され切断される部位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡからなるＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ。
【請求項４】
請求項1に記載のＤＮＡ、該請求項1に記載のＤＮＡの３’末端側に結合され、特異的に認識され切断される部位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び、該特異的に認識され切断される部位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡの３’末端側に結合され、生産を目的とするタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターＤＮＡを保持する宿主細胞。
【請求項６】
ブレビバチルス属細菌である請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項５または６に記載の宿主細胞を培養する工程を含むこと、を特徴とするタンパク質またはポリペプチドを生産する方法。
【請求項８】
配列番号１または２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項９】
融合タンパク質発現法における融合パートナーであること、を特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−２８９２２（Ｐ２００７−２８９２２Ａ）
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２１２９５５（Ｐ２００５−２１２９５５）
【出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【出願人】（０００１１２０６０）ヒゲタ醤油株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２２日（２００５．７．２２）
【出願人】（０００１１２０６０）ヒゲタ醤油株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
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