血中ＧＩＰ及び／又は血中インスリン上昇抑制剤
【課題】血糖を悪化させることのない血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤（糖尿病予防・改善剤）の提供。
【解決手段】β−キチンナノファイバーを含む、経口投与剤、血中GIP上昇抑制剤、血中インスリン上昇抑制剤、糖尿病予防・改善剤。β−キチンナノファイバーは、平均繊維幅が100mn以下のものが好ましい。
【解決手段】β−キチンナノファイバーを含む、経口投与剤、血中GIP上昇抑制剤、血中インスリン上昇抑制剤、糖尿病予防・改善剤。β−キチンナノファイバーは、平均繊維幅が100mn以下のものが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリンやＧＩＰ等の血中濃度を低減することができる血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
Gastric inhibitory polypeptide(ＧＩＰ)は、グルコース依存性インスリン分泌を増強する消化管ホルモンであり、摂食時、食餌中の脂質等によりその分泌が亢進されることが知られている。また、ＧＩＰは、胃酸分泌抑制作用や胃運動抑制作用を有することが知られている（非特許文献１〜３）ことから、血中ＧＩＰを低減する物質は、消化促進や胃もたれの改善に有用であると考えられる。そして、これまでの研究によって、ＧＩＰの機能を阻害する物質として、３−ブロモ−５−メチル−２−フェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンー７−オール（ＢＭＰＰ）が知られ、血中ＧＩＰ濃度を低減するものとして、グアガム等が知られている（特許文献１、非特許文献４〜９）。
【０００３】
しかしながら、ＢＭＰＰは、in vivoにおけるＧＩＰ機能阻害効果が確認されておらず、またグアガムは脂質摂取時の血中ＧＩＰ上昇抑制効果が検討されていないという問題があり、また、胃もたれ改善効果等の点で必ずしも十分なものとはいえない。
【０００４】
血糖が上昇すると膵臓の膵β細胞からインスリンが分泌され、脂肪・筋肉への糖の取り込みが促進され、脂肪組織・筋肉での脂肪合成の促進と、分解と燃焼の抑制が行われる。しかし、高血糖状態となり、インスリンの分泌が続くと、インスリンの標的臓器である骨格筋、肝臓、脂肪組織でのインスリンの感受性の低下（インスリン抵抗性）が生じ、さらに膵臓からインスリンがより多く分泌されるようになる。しかし、インスリン分泌が亢進しても、標的臓器はインスリン抵抗性を生じているため、高血糖状態が続く、という悪循環をたどる。
【０００５】
このようなインスリンの分泌が繰り返されると、最終的には膵臓が疲弊し、膵β細胞からのインスリンの分泌が低下するが、各標的臓器のインスリン抵抗性は増大したままの状態であり、高血糖状態となる。このようにインスリン作用機構がうまく機能しなくなると、結局、糖尿病等になりやすい体質になってしまうことや、糖尿病が悪化することが知られている。
【０００６】
一方、ＧＩＰの分泌が上昇すると、消化不良や胃もたれを引き起こすほか、インスリンの分泌を促進する要因にもなるため、やはりインスリン抵抗性や肥満等を引き起こすことが考えられる。
【０００７】
キチンには細胞免疫力賦活作用（非特許文献１０）や、糞便中への脂質排泄促進（非特許文献１１）、長期摂取による抗肥満作用（非特許文献１１）が知られている。また、キチンの構造を変えることによって得られる効果としては、例えばキチンを分解して得られる低分子化キチンには抗肥満作用（特許文献２）、烏賊骨由来のβ―キチンを脱アセチル化したキトサンには血中コレステロール抑制作用や肥満改善作用が見出されている（特許文献３）。しかし、キチンによる血中ＧＩＰやインスリン等のホルモンの上昇抑制効果や、それに伴う糖尿病予防・改善効果は知られていない。
【０００８】
繊維幅がミクロン／ナノオーダーのキチンを食品として用いる例としては、ジオトリカム属菌から得られるキチン・キトサンがあげられる。この菌体から得られる繊維の繊維幅は平均5μm、長さ1,000μmである（特許文献４）。また、特表2002-536507では、セルロースやキチンなどのポリサッカライドから立体的／静電気的に微小繊維を誘導する方法と、それを用いたマヨネーズやドレッシングの組成物について言及しているが、誘導体化されたものであり、繊維幅に関する記載もない（特許文献５）。さらに、いずれも、GIPやインスリン、糖尿病に対する生理的作用は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０１／８７３４１号パンフレット
【特許文献２】特許第２６０５３００号公報
【特許文献３】特許第３８０７４６４号公報
【特許文献４】特開２００７-１５９５６９号公報
【特許文献５】特開２００２-５３６５０７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J.C.Brownら、Canadian J Physiol Pharmacol 47 : 113-114, 1969
【非特許文献２】J. M. Falkoら、J Clin Endocrinol Metab 41(2) : 260-265, 1975
【非特許文献３】織田敏次ら、消化管 機能と病態、1981年、中外医学社、P205−216
【非特許文献４】Gagenby S Jら、Diabet Med. 1996 Apr; 13(4):358-64
【非特許文献５】Ellis PRら、Br J Nutr. 1995 Oct;74(4):539-56
【非特許文献６】Simoes Nunes Cら、Reprod Nutr Dev. 1992;32(1):11-20
【非特許文献７】Morgan LMら、Br J Nutr. 1990 Jul;64(1):103-10
【非特許文献８】Requejo Fら、Diabet Med. 1990 Jul;7(6):515-20
【非特許文献９】Morganら、Br J Nutr. 1985 May;53(3):467-75
【非特許文献１０】井上國世ら、機能性糖質素材の開発と食品への応用、2005年、シーエムシー出版、P387-393
【非特許文献１１】Han, L.-Kら、International Journal of Obesity. 1999 ;23 (2)：174-179
【非特許文献１２】原ら、I綜合臨牀. 2008.7 ;57 (7)：1094-1097
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、インスリンやＧＩＰ等の血中濃度を低減できる血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤を提供することを１つの課題とする。
【００１２】
本発明は、血糖を悪化させることなく血中インスリンを低減できる糖尿病予防・改善剤を提供することを他の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、β−キチンナノファイバーを含む、経口投与剤、血中GIP（Gastric inhibitory polypeptide）上昇抑制剤、血中インスリン上昇抑制剤、糖尿病予防・改善剤を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のβ−キチンナノファイバーを含む血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤は、インスリンやＧＩＰ等の血中濃度を低減することができる。
【００１５】
本発明のβ−キチンナノファイバーを含む糖尿病予防・改善剤は、血糖を悪化させることなく血中インスリンを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１におけるβ−キチンナノファイバーの血糖値への影響を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜β−キチンナノファイバーの製造＞
本発明で用いるβ−キチンナノファイバーは、β−キチンをｐＨ５以下の酸性液体に浸漬する工程と、酸性液体に浸漬された状態で前記β−キチンを解繊処理する工程を有する製造方法により得ることができる。
【００１８】
まず、β−キチンをｐＨ５以下の酸性液体に浸漬する工程について説明する。原料となるβ−キチンは、結晶化度が９０％以下の精製β−キチンが好ましく、結晶化度が６０〜８５％のβ−キチンがより好ましい。この場合の結晶化度はＸ線回折パターンの２０°のピーク強度をIaとし、１５°の非晶部分のピーク強度をIbとして、（Ia-Ib）/Ia×１００で表した結晶化度である。
【００１９】
前記精製β−キチンは、イカ由来のものであることが好ましく、特にイカの腱から得られるものが好ましい。
【００２０】
前記精製β−キチンとしては、下記のアルカリを用いて精製したアルカリ精製品又はアルカリ精製後にさらに酸精製をしたアルカリ精製−酸精製品を用いることができる。
【００２１】
アルカリ精製品は、β−キチンの粉砕品を０．１〜８mol／Ｌのアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム）水溶液中に１〜１００時間浸漬した後、メッシュ上で濾過し、メッシュ上のβ−キチンをイオン交換水で洗浄して得る。前記洗浄の目安は、洗浄液の導電率が０．５ｍ／ｓ以下になるまでが好ましい。
【００２２】
アルカリ精製−酸精製品は、上記方法で得られたアルカリ精製品を０．０１〜５mol／Ｌの酸（例えば、塩酸）水溶液中に１〜１００時間浸漬した後、メッシュ上で濾過し、メッシュ上のβ−キチンをイオン交換水で洗浄して得る。前記洗浄の目安は、洗浄液の導電率が０．５ｍ／ｓ以下になるまでが好ましい。
アルカリ精製−酸精製品に用いる酸は、特に制限はない。有機酸としてはギ酸、酢酸、クエン酸等を用いることができ、無機酸としては塩酸、硫酸、硝酸等を用いることができる。これらの酸は単独で用いても、混合して用いてもよい。
【００２３】
β-キチンをｐＨ５以下の酸性液体に浸漬する工程に用いる酸性溶液は、有機酸、無機酸から選ばれる水溶液であるが、有機酸としてはギ酸、酢酸、クエン酸等を用いることができ、無機酸としては塩酸、硫酸、硝酸等を用いることができる。ｐＨ５以下の酸性液体であれば制限はなく、単独で用いても、混合して用いてもよい。本工程に用いる酸性液体としては、特に酢酸、塩酸が好ましい。
【００２４】
前記β−キチンを解繊処理する際の酸性溶液のｐＨは５以下であればよいが、ｐＨは２〜４の範囲が好ましい。
【００２５】
β−キチンと酸性溶液の量比は特に制限されないが、酸性溶液中にβ−キチンが完全に浸漬された状態にすることが好ましく、後工程の解繊処理のしやすさも考慮して調整する。
【００２６】
酸性溶液の温度は特に制限されず、通常は室温（２０〜２５℃）でよいが、必要に応じて加温又は冷却してもよい。
【００２７】
次に、酸性溶液中に浸漬された状態で、前記β−キチンを解繊処理する工程について説明する。
【００２８】
解繊処理は、β−キチンに物理的な力を加えることにより、繊維を解くことができる方法であればよく、例えば、離解機、叩解機、低圧ホモジナイザー、高圧ホモジナイザー、グラインダー、カッターミル、ボールミル、ジェットミル、短軸押出機、２軸押出機、超音波攪拌機、家庭用ジューサーミキサー等を用いることができる。
【００２９】
解繊処理は、例えば、酸性溶液１００ｇ中に精製β−キチン０．５ｇを浸漬した状態にて、製造例１のホモジナイザーであれば、５０００〜２００００r/mで１〜３０分間撹拌する程度よい。
【００３０】
この解繊処理により、幅２〜１００nm、長さが５００nm以上（好ましくは７００ｎｍ以上）のβ−キチンナノファーバーを得ることができる。
【００３１】
上記の２つの工程を含む製造方法を適用した場合、次の理由により、β−キチンナノファーバーを得ることができるものと考えられる。
【００３２】
β−キチンをｐＨ５以下の酸性液体に浸漬する工程により、β−キチンを構成するキチンナノフィブリルの表面に存在すると考えられるグルコサミンにプラスの電荷が付与され、これにより、キチンナノフィブリル間に荷電反発を生じさせる。そして、続く解繊工程においてβ−キチンを解繊することにより、容易にキチンナノフィブリル間の結合が解け、β−キチンナノファーバーが得られるものである。
【００３３】
このような製造方法で得られたβ−キチンナノファーバーは、元々キチン中に存在しているグルコサミンユニット部分が荷電されただけで、化学変性しておらず、医学的にも安全であると考えられる。
【００３４】
＜β−キチンナノファイバーを含む血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤と、β−キチンナノファイバーを含む糖尿病予防・改善剤＞
以下、本発明の血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤と糖尿病予防・改善剤について説明するが、以下においては、これらを総称して「本発明の薬剤」とすることがある。
【００３５】
本発明の薬剤は、有効成分として上記製造方法で得られたβ−キチンナノファイバーを含むものである。
【００３６】
「ナノファイバー」の直径（幅）は、サブミクロンオーダー（100〜10000nm）やそれ以上の直径（幅）を有する繊維のこともナノファイバーと呼んでいる例がある（谷岡明彦、繊維と工業、P129-130、59（4） 2003）が、本発明で用いるβ−キチンナノファイバーは、０．１質量％懸濁液に調製して、目開き１６μmのガラスフィルター（２５Ｇ Ｐ１６，ＳＨＩＢＡＴＡ社製）で吸引ろ過したとき、前記懸濁液中に含まれているβ−キチンナノファイバーの１質量％以上がろ過されるものである。β−キチンナノファイバー同士が凝集している場合にはろ過され難くなるため、後述する実施例に記載した比較製造例１、２で得られたものは前記要件を満たさない。
【００３７】
本発明の薬剤に含まれるβ−キチンナノファイバーは、平均繊維幅が１００nm以下のものが好ましく、より好ましくは２〜８０nmのものであり、さらに好ましくは３〜６０nmのものである。
【００３８】
本発明の薬剤に含まれるβ−キチンナノファイバーは、平均繊維長さが４００００nm以下のものが好ましく、より好ましくは５００〜３００００nmのものであり、さらに好ましくは７００〜２００００nmのものである。
【００３９】
本発明の薬剤は、使用形態に応じて、錠剤状、顆粒状、粉末状、液状（懸濁液状）、ゲル状等の所望形態にすることができる。
【００４０】
錠剤状、顆粒状、粉末状等の固体状にする場合には、β−キチンナノファーバー単独でもよいし、食品や医薬品に使用できる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を配合し、所望の成形機（打錠機、顆粒製造機、噴霧乾燥機等）を用いて成形することができる。
【００４１】
液状（懸濁液状）にするときには、水のみを使用したものでもよいし、水と共に、食品に使用できる他の有機溶媒（例えば、エタノール）、界面活性剤水溶液、酸水溶液、塩基水溶液等との混合溶媒を使用したものでもよい。ゲル状にするときは、増粘剤等を添加配合することができる。
【００４２】
本発明のGIP及び/又はインスリン上昇抑制剤は、食事の前に、又は、食事と共に又は食後に摂取することが望ましく、β−キチンナノファーバーとしての摂取量は、体重１ｋｇ当たり、約0.002〜２ｇ／日が好ましい。
【００４３】
本発明の糖尿病予防・改善剤は、食事の前に、又は、食事と共に又は食後に摂取することが望ましく、β−キチンナノファーバーとしての摂取量は、体重１ｋｇ当たり、約0.002〜２ｇ／日が好ましい。
【００４４】
本発明の薬剤は、ヒト及び動物に投与することができる他、各種飲食品、医薬品、医薬部外品、ペットフード等に配合して摂取することができる。食品としては、ホルモン分泌抑制効果又は、糖尿病予防・改善効果をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品に応用できる。飲料の形態は特に限定されないが、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等のあらゆる飲料に配合し、製造のために使用することが可能である。また、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、タブレット、カプセル、スープ類等のあらゆる食品形態で配合し、製造のために使用することが可能である。
【００４５】
本発明の薬剤は、医薬品として錠剤及び粉末のような固形投薬形態、あるいはエリキシロール、シロップ及び懸濁液のような液体投薬形態で経口投与される。なお、経口用固形製剤を調剤する場合には、本発明の薬剤に、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合には、矯味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて、常法により製造することができる。
【００４６】
また、本発明の薬剤は、適当量の栄養補給が困難な高齢者やベッドレスト状態の病者においては、経腸栄養剤等の栄養組成物の形態で投与される。
【実施例】
【００４７】
製造例１（β−キチンナノファイバーの製造）
（I）原料、精製剤
β−キチン：β−キチン粉砕品（製造会社：大日精化(株)）
水酸化ナトリウム（１ｍｏｌ／ｌ）：市販品（製造会社：和光純薬工業(株)
塩酸（０．１ｍｏｌ／ｌ）：市販品（製造会社：関東化学(株)）。
（II）製造手順
まず、上記のβ−キチン粉砕品３０ｇを５００ｇの1ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム中に２４時間浸漬後、メッシュでろ過し、メッシュの上に残ったβ−キチン粉砕品を、イオン交換水を用いて、そのろ液の導電率が０．５ｍｓ／ｓ以下になるまで十分洗浄し、β−キチンのアルカリ精製品を得た。
【００４８】
次に、β−キチンのアルカリ精製品０．５ｇとイオン交換水１００ｇの懸濁液のｐＨを塩酸にて３．０に調整後、ホモジナイザー（エクセルオートホモジナイザー、（株）日本精機製作所）にて、５分間攪拌することにより、粉砕品の微細化処理を行い、β−キチンナノファイバーの半透明な懸濁液を得た。そして、最後に懸濁液のｐＨを６．５に調整した。得られたβ−キチンナノファイバーの平均繊維幅は５４．５ｎｍ、平均繊維長さは１９.１μｍ、懸濁液中のβ−キチンナノファイバー含有率は１１．８％であった。
【００４９】
製造例２（β−キチンナノファイバーの製造）
製造例１で得られたβ−キチンのアルカリ精製品３０ｇを５００ｇの０．1ｍｏｌ／ｌの塩酸中に２４時間浸漬後、メッシュでろ過し、メッシュの上に残ったβ−キチンアルカリ精製品を、イオン交換水を用いて、そのろ液の導電率が０．５ｍｓ／ｓ以下になるまで十分洗浄し、β−キチンのアルカリ精製−酸精製品を得た。
【００５０】
次に、β−キチンのアルカリ精製−酸精製品０．５ｇとイオン交換水１００ｇの懸濁液のｐＨを塩酸にて３．０に調整後、ホモジナイザー（エクセルオートホモジナイザー、（株）日本精機製作所）にて、５分間攪拌することにより、粉砕品の微細化処理を行い、β−キチンナノファイバーの半透明な懸濁液を得た。そして、最後に懸濁液のｐＨを６．５に調整した。得られたβ−キチンナノファイバーの平均繊維幅は５１．９ｎｍ、平均繊維長さは１４.８μｍ、懸濁液中のβ−キチンナノファイバー含有率は２５％であった。
【００５１】
比較製造例１（β−キチン非ナノファイバーの製造）
製造例１で得られたβ−キチンナノファイバーの懸濁液を常温で約２ヶ月間保存し、経時凝集させた。得られたファイバーの平均繊維幅は１６０ｎｍ、平均繊維長さは５４.２μｍであり、製造例１のものの３倍程度あったことから、製造例１との対比からβ−キチン非ナノファイバーとした。懸濁液中のナノファイバー含有率は０％であった。
【００５２】
比較製造例２（β−キチン非ナノファイバーの製造）
製造例２で得られたβ−キチンナノファイバーの懸濁液を常温で約２ヶ月間保存し、経時凝集させた。得られたファイバーの平均繊維幅は１５２ｎｍ、平均繊維長さは４９.５μｍであり、製造例２のものの３倍程度あったことから、製造例２との対比からβ−キチン非ナノファイバーとした。懸濁液中のナノファイバー含有率は０％であった。
【００５３】
β−キチンナノファイバー及びβ−キチン非ナノファイバーの各物性の測定方法は以下の通りである。
【００５４】
（１）懸濁液の性質〔β−キチン懸濁液中のナノファイバーの質量分率（β−キチンナノファイバー含有率）（％）〕
β−キチン懸濁液を０．１質量％に調製して、その固形分濃度を精密測定した。続いて、そのβ−キチン懸濁液を目開き１６μmのガラスフィルター（２５Ｇ Ｐ１６，ＳＨＩＢＡＴＡ社製）で吸引ろ過した後、ろ液の固形分濃度を精密測定した。ろ液の固形分濃度（C1）をろ過前の懸濁液の固形分濃度(C2)で除した（C1/C2）値をナノファイバー含有率(％)として算出した。
【００５５】
（２）ファイバーの形状
（2-1）平均繊維幅
β−キチンナノファイバーの平均繊維幅は、0.0001質量％に希釈した懸濁液をマイカ上に滴下して乾燥したものを観察試料として、原子間力顕微鏡（Nanoscope III Tapping mode AFM、Digital instrument社製,プローブはナノセンサーズ社製Point Probe(NCH)使用）で繊維高さを測定した。β−キチン繊維が確認できる画像において、５本以上抽出し、その繊維高さから平均繊維幅を求めた。
【００５６】
（2-2）平均繊維長さ
平均繊維長さは、β−キチンナノファイバーを水で希釈した希薄懸濁液（0.005〜0.04質量％）の粘度から算出した。粘度の測定には、レオメーター（MCR300、DG42（二重円筒）、PHYSICA社製）を用いて、２０℃で測定した。β−キチンナノファイバーの質量濃度とβ−キチンナノファイバー懸濁液の水に対する比粘度の関係から、次式でβ−キチンナノファイバーのアスペクト比を逆算し、β−キチンナノファイバーの平均繊維長さとした。
【数１】
（The Theory of Polymer Dynamics, Ｍ.DOI and D.F.EDWARDS， CLARENDON PRESS・OXFORD,1986,P312に記載の剛直棒状分子の粘度式（８．１３８）を利用した（ここでは、剛直棒状分子＝β−キチンナノファイバーとした）。（８．１３８）式と Ｌｂ2×ρ0＝M/NAの関係から数式１が導出される。ここで、ηspは比粘度、πは円周率、lnは自然対数、Pはアスペクト比（L/ｂ）、γ＝0.8、ρsは分散媒の密度（ｋｇ/ｍ3）、ρ0はβ−キチンナノファイバー結晶の密度（ｋｇ/ｍ3）を1.5とし、Cはβ−キチンナノファイバーの質量濃度（C＝ρ/ρs）、Lは繊維長、ｂは繊維幅（β−キチンナノファイバー断面は正方形とする）、ρはβ−キチンナノファイバーの濃度（ｋｇ/ｍ3）、Ｍは分子量、NAはアボガドロ数を表す）。
【００５７】
実施例１ β−キチンナノファイバーの血中インスリン、血中GIP、血糖値への影響
β−キチンナノファイバーを血中GIP及び／又は後血中インスリン上昇抑制剤として提供した場合のＧＩＰとインスリンの上昇抑制効果を試験した。
【００５８】
1-1 試験試料
試験試料として、製造例１及び製造例２のβ−キチンナノファイバーを用いた。
【００５９】
1-2 試験動物
7週齢の雄性マウスC57BL/6J Jcl（日本クレア）を用いた。各群N=4とした。
【００６０】
1-3 投与サンプルの調製と投与量
グルコース（関東化学製）とトリオレイン（Glyceryl trioleate：Sigma製）をレシチン（卵製）（和光純薬製）とアルブミン(ウシ血清由来)（Sigma製）を用いて乳化し、乳液を調製した。この乳液をコントロールとし、本発明のβ−キチンナノファイバーを添加し、胃内投与サンプルを調製した。動物に対する投与量は表１のとおりである。
【表１】
1-4 胃内投与試験（血糖、血中インスリン、血中GIP測定）
16時間絶食させたマウスをエ−テル麻酔下、眼窩静脈よりヘパリン処理ヘマトクリット毛細管（VITREX製）を用い、初期採血を行った。その後、試験試料を経口ゾンデ針にて経口的に胃内投与し、10分、30分、1時間、2時間後にエーテル麻酔下、眼窩静脈より採血を行った。
【００６１】
採血後、血液の一部を用いてすみやかに血糖簡易測定器（グルコースデヒドロゲナーゼ/電位差測定法、ロシュ・ダイアノグスティック社製）を用いて血糖値を測定した。ヘパリン処理ヘマトクリット毛細管で採取した血液は、血漿分離まで氷冷下で保存後、11000rpmにて5分間遠心分離し、血漿を得た。得られた血漿から、GIP、インスリンを測定した。
【００６２】
血中ＧＩＰ濃度の測定は、Rat/Mouse GIP（Total）ELISA キット（Linco Research/Millipore co.製、ELISA法)、血中インスリン濃度の測定はインスリン測定キット（森永生化学研究所製、ELISA法）を用いて測定した。
【００６３】
1-5 結果
サンプル投与後の最大血中ＧＩＰ値及び最大血中インスリン値（血中ＧＩＰ、血中インスリンともに最大値は10分値）と初期値より、その差（Δ10分値）を算出し、表２、表３に示した。群間の統計学的有意差については、コントロール投与群に対するｔ検定（両側検定）を行い、有意水準10%未満の場合にはP値、10%以上の場合にはN.S.（Non-Significant）を表記した。
【表２】
【表３】
表２、表３の結果から、本発明品のβ-キチンナノファイバー投与群は、コントロール投与群に比べて食後の最大ＧＩＰ値（Δ10分値）及び最大インスリン値（Δ10分値）が低かった。この結果から、本発明品のβ-キチンナノファイバーは、血中ＧＩＰの上昇抑制、血中インスリンの上昇抑制効果を有することが分かった。
【００６４】
また、投与後血糖値の経時変化を図1に示した。製造例１、２のβ-キチンナノファイバー投与群は、いずれも、コントロール投与群に比べ、血糖値の顕著な上昇は認められなかった。
【００６５】
インスリンは血糖値を下げるホルモンであることから、血中インスリンを低減することは、血糖値が大幅に上がってしまうことが懸念される。しかしながら、図１に示すように、製造例１、２のβ-キチンナノファイバー投与群は、コントロール投与後とほぼ同程度の血糖値変化を示したことから、本発明品は血糖を悪化させることなく血中インスリンを低減できることが明らかとなった。
【００６６】
インスリン分泌亢進は、インスリン抵抗性（インスリン感受性低下）や、さらには膵臓のβ細胞（インスリン分泌細胞）の疲弊をまねき、糖尿病の進行の一因と考えられている。また、食後の高血糖は、糖尿病の合併症である血管系疾病のリスクを増大させることが、多くの疫学調査で明らかになっている（非特許文献１２）。
本発明品は、食後の血糖を悪化させることなく、インスリン分泌を低減しており、糖尿病の予防・改善にも有効であると考えられる。
【００６７】
比較例１ β−キチン非ナノファイバーの血中インスリン、血中GIPへの影響
β−キチン非ナノファイバーを血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤として提供した場合のＧＩＰとインスリンの上昇抑制効果を試験した。
【００６８】
1-1 比較試験試料
比較製造例１及び比較製造例２のβ−キチン非ナノファイバーを用いた。
【００６９】
1-2 試験動物
8週齢の雄性マウスC57BL/6J Jcl（日本クレア）を用いた。各群N=4とした。
【００７０】
1-3 投与サンプルの調製と投与量
実施例１に示す調製方法と全く同様に、β−キチン非ナノファイバーの胃内投与サンプルを調製した。動物に対する投与量は実施例１の1-3（表１）と同様で、β−キチンナノファイバーをβ−キチン非ナノファイバーに置き換えた量とした。
【００７１】
1-4 胃内投与試験（血中インスリン、血中GIP測定）
実施例１の1-4に示す胃内投与試験方法と全く同様に、動物に比較試験試料を投与し、血中インスリン、血中GIP測定を測定した。
【００７２】
1-5 結果
結果の集計方法は、実施例１の1-5に示した手法と全く同じ手法で、集計及び統計解析を行った。
【表４】
【表５】
表４、表５の結果から、比較例１のβ-キチン非ナノファイバー投与群の食後の最大ＧＩＰ値（Δ10分値）及び最大インスリン値（Δ10分値）は、コントロール投与群と差がなかった。この結果から、β-キチン非ナノファイバーには、血中ＧＩＰ低減、血中インスリン上昇抑制効果はなく、本発明品のβ-キチンナノファイバーにのみ得られる効果であると考えられた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリンやＧＩＰ等の血中濃度を低減することができる血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
Gastric inhibitory polypeptide(ＧＩＰ)は、グルコース依存性インスリン分泌を増強する消化管ホルモンであり、摂食時、食餌中の脂質等によりその分泌が亢進されることが知られている。また、ＧＩＰは、胃酸分泌抑制作用や胃運動抑制作用を有することが知られている（非特許文献１〜３）ことから、血中ＧＩＰを低減する物質は、消化促進や胃もたれの改善に有用であると考えられる。そして、これまでの研究によって、ＧＩＰの機能を阻害する物質として、３−ブロモ−５−メチル−２−フェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンー７−オール（ＢＭＰＰ）が知られ、血中ＧＩＰ濃度を低減するものとして、グアガム等が知られている（特許文献１、非特許文献４〜９）。
【０００３】
しかしながら、ＢＭＰＰは、in vivoにおけるＧＩＰ機能阻害効果が確認されておらず、またグアガムは脂質摂取時の血中ＧＩＰ上昇抑制効果が検討されていないという問題があり、また、胃もたれ改善効果等の点で必ずしも十分なものとはいえない。
【０００４】
血糖が上昇すると膵臓の膵β細胞からインスリンが分泌され、脂肪・筋肉への糖の取り込みが促進され、脂肪組織・筋肉での脂肪合成の促進と、分解と燃焼の抑制が行われる。しかし、高血糖状態となり、インスリンの分泌が続くと、インスリンの標的臓器である骨格筋、肝臓、脂肪組織でのインスリンの感受性の低下（インスリン抵抗性）が生じ、さらに膵臓からインスリンがより多く分泌されるようになる。しかし、インスリン分泌が亢進しても、標的臓器はインスリン抵抗性を生じているため、高血糖状態が続く、という悪循環をたどる。
【０００５】
このようなインスリンの分泌が繰り返されると、最終的には膵臓が疲弊し、膵β細胞からのインスリンの分泌が低下するが、各標的臓器のインスリン抵抗性は増大したままの状態であり、高血糖状態となる。このようにインスリン作用機構がうまく機能しなくなると、結局、糖尿病等になりやすい体質になってしまうことや、糖尿病が悪化することが知られている。
【０００６】
一方、ＧＩＰの分泌が上昇すると、消化不良や胃もたれを引き起こすほか、インスリンの分泌を促進する要因にもなるため、やはりインスリン抵抗性や肥満等を引き起こすことが考えられる。
【０００７】
キチンには細胞免疫力賦活作用（非特許文献１０）や、糞便中への脂質排泄促進（非特許文献１１）、長期摂取による抗肥満作用（非特許文献１１）が知られている。また、キチンの構造を変えることによって得られる効果としては、例えばキチンを分解して得られる低分子化キチンには抗肥満作用（特許文献２）、烏賊骨由来のβ―キチンを脱アセチル化したキトサンには血中コレステロール抑制作用や肥満改善作用が見出されている（特許文献３）。しかし、キチンによる血中ＧＩＰやインスリン等のホルモンの上昇抑制効果や、それに伴う糖尿病予防・改善効果は知られていない。
【０００８】
繊維幅がミクロン／ナノオーダーのキチンを食品として用いる例としては、ジオトリカム属菌から得られるキチン・キトサンがあげられる。この菌体から得られる繊維の繊維幅は平均5μm、長さ1,000μmである（特許文献４）。また、特表2002-536507では、セルロースやキチンなどのポリサッカライドから立体的／静電気的に微小繊維を誘導する方法と、それを用いたマヨネーズやドレッシングの組成物について言及しているが、誘導体化されたものであり、繊維幅に関する記載もない（特許文献５）。さらに、いずれも、GIPやインスリン、糖尿病に対する生理的作用は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０１／８７３４１号パンフレット
【特許文献２】特許第２６０５３００号公報
【特許文献３】特許第３８０７４６４号公報
【特許文献４】特開２００７-１５９５６９号公報
【特許文献５】特開２００２-５３６５０７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J.C.Brownら、Canadian J Physiol Pharmacol 47 : 113-114, 1969
【非特許文献２】J. M. Falkoら、J Clin Endocrinol Metab 41(2) : 260-265, 1975
【非特許文献３】織田敏次ら、消化管 機能と病態、1981年、中外医学社、P205−216
【非特許文献４】Gagenby S Jら、Diabet Med. 1996 Apr; 13(4):358-64
【非特許文献５】Ellis PRら、Br J Nutr. 1995 Oct;74(4):539-56
【非特許文献６】Simoes Nunes Cら、Reprod Nutr Dev. 1992;32(1):11-20
【非特許文献７】Morgan LMら、Br J Nutr. 1990 Jul;64(1):103-10
【非特許文献８】Requejo Fら、Diabet Med. 1990 Jul;7(6):515-20
【非特許文献９】Morganら、Br J Nutr. 1985 May;53(3):467-75
【非特許文献１０】井上國世ら、機能性糖質素材の開発と食品への応用、2005年、シーエムシー出版、P387-393
【非特許文献１１】Han, L.-Kら、International Journal of Obesity. 1999 ;23 (2)：174-179
【非特許文献１２】原ら、I綜合臨牀. 2008.7 ;57 (7)：1094-1097
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、インスリンやＧＩＰ等の血中濃度を低減できる血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤を提供することを１つの課題とする。
【００１２】
本発明は、血糖を悪化させることなく血中インスリンを低減できる糖尿病予防・改善剤を提供することを他の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、β−キチンナノファイバーを含む、経口投与剤、血中GIP（Gastric inhibitory polypeptide）上昇抑制剤、血中インスリン上昇抑制剤、糖尿病予防・改善剤を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のβ−キチンナノファイバーを含む血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤は、インスリンやＧＩＰ等の血中濃度を低減することができる。
【００１５】
本発明のβ−キチンナノファイバーを含む糖尿病予防・改善剤は、血糖を悪化させることなく血中インスリンを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１におけるβ−キチンナノファイバーの血糖値への影響を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜β−キチンナノファイバーの製造＞
本発明で用いるβ−キチンナノファイバーは、β−キチンをｐＨ５以下の酸性液体に浸漬する工程と、酸性液体に浸漬された状態で前記β−キチンを解繊処理する工程を有する製造方法により得ることができる。
【００１８】
まず、β−キチンをｐＨ５以下の酸性液体に浸漬する工程について説明する。原料となるβ−キチンは、結晶化度が９０％以下の精製β−キチンが好ましく、結晶化度が６０〜８５％のβ−キチンがより好ましい。この場合の結晶化度はＸ線回折パターンの２０°のピーク強度をIaとし、１５°の非晶部分のピーク強度をIbとして、（Ia-Ib）/Ia×１００で表した結晶化度である。
【００１９】
前記精製β−キチンは、イカ由来のものであることが好ましく、特にイカの腱から得られるものが好ましい。
【００２０】
前記精製β−キチンとしては、下記のアルカリを用いて精製したアルカリ精製品又はアルカリ精製後にさらに酸精製をしたアルカリ精製−酸精製品を用いることができる。
【００２１】
アルカリ精製品は、β−キチンの粉砕品を０．１〜８mol／Ｌのアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム）水溶液中に１〜１００時間浸漬した後、メッシュ上で濾過し、メッシュ上のβ−キチンをイオン交換水で洗浄して得る。前記洗浄の目安は、洗浄液の導電率が０．５ｍ／ｓ以下になるまでが好ましい。
【００２２】
アルカリ精製−酸精製品は、上記方法で得られたアルカリ精製品を０．０１〜５mol／Ｌの酸（例えば、塩酸）水溶液中に１〜１００時間浸漬した後、メッシュ上で濾過し、メッシュ上のβ−キチンをイオン交換水で洗浄して得る。前記洗浄の目安は、洗浄液の導電率が０．５ｍ／ｓ以下になるまでが好ましい。
アルカリ精製−酸精製品に用いる酸は、特に制限はない。有機酸としてはギ酸、酢酸、クエン酸等を用いることができ、無機酸としては塩酸、硫酸、硝酸等を用いることができる。これらの酸は単独で用いても、混合して用いてもよい。
【００２３】
β-キチンをｐＨ５以下の酸性液体に浸漬する工程に用いる酸性溶液は、有機酸、無機酸から選ばれる水溶液であるが、有機酸としてはギ酸、酢酸、クエン酸等を用いることができ、無機酸としては塩酸、硫酸、硝酸等を用いることができる。ｐＨ５以下の酸性液体であれば制限はなく、単独で用いても、混合して用いてもよい。本工程に用いる酸性液体としては、特に酢酸、塩酸が好ましい。
【００２４】
前記β−キチンを解繊処理する際の酸性溶液のｐＨは５以下であればよいが、ｐＨは２〜４の範囲が好ましい。
【００２５】
β−キチンと酸性溶液の量比は特に制限されないが、酸性溶液中にβ−キチンが完全に浸漬された状態にすることが好ましく、後工程の解繊処理のしやすさも考慮して調整する。
【００２６】
酸性溶液の温度は特に制限されず、通常は室温（２０〜２５℃）でよいが、必要に応じて加温又は冷却してもよい。
【００２７】
次に、酸性溶液中に浸漬された状態で、前記β−キチンを解繊処理する工程について説明する。
【００２８】
解繊処理は、β−キチンに物理的な力を加えることにより、繊維を解くことができる方法であればよく、例えば、離解機、叩解機、低圧ホモジナイザー、高圧ホモジナイザー、グラインダー、カッターミル、ボールミル、ジェットミル、短軸押出機、２軸押出機、超音波攪拌機、家庭用ジューサーミキサー等を用いることができる。
【００２９】
解繊処理は、例えば、酸性溶液１００ｇ中に精製β−キチン０．５ｇを浸漬した状態にて、製造例１のホモジナイザーであれば、５０００〜２００００r/mで１〜３０分間撹拌する程度よい。
【００３０】
この解繊処理により、幅２〜１００nm、長さが５００nm以上（好ましくは７００ｎｍ以上）のβ−キチンナノファーバーを得ることができる。
【００３１】
上記の２つの工程を含む製造方法を適用した場合、次の理由により、β−キチンナノファーバーを得ることができるものと考えられる。
【００３２】
β−キチンをｐＨ５以下の酸性液体に浸漬する工程により、β−キチンを構成するキチンナノフィブリルの表面に存在すると考えられるグルコサミンにプラスの電荷が付与され、これにより、キチンナノフィブリル間に荷電反発を生じさせる。そして、続く解繊工程においてβ−キチンを解繊することにより、容易にキチンナノフィブリル間の結合が解け、β−キチンナノファーバーが得られるものである。
【００３３】
このような製造方法で得られたβ−キチンナノファーバーは、元々キチン中に存在しているグルコサミンユニット部分が荷電されただけで、化学変性しておらず、医学的にも安全であると考えられる。
【００３４】
＜β−キチンナノファイバーを含む血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤と、β−キチンナノファイバーを含む糖尿病予防・改善剤＞
以下、本発明の血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤と糖尿病予防・改善剤について説明するが、以下においては、これらを総称して「本発明の薬剤」とすることがある。
【００３５】
本発明の薬剤は、有効成分として上記製造方法で得られたβ−キチンナノファイバーを含むものである。
【００３６】
「ナノファイバー」の直径（幅）は、サブミクロンオーダー（100〜10000nm）やそれ以上の直径（幅）を有する繊維のこともナノファイバーと呼んでいる例がある（谷岡明彦、繊維と工業、P129-130、59（4） 2003）が、本発明で用いるβ−キチンナノファイバーは、０．１質量％懸濁液に調製して、目開き１６μmのガラスフィルター（２５Ｇ Ｐ１６，ＳＨＩＢＡＴＡ社製）で吸引ろ過したとき、前記懸濁液中に含まれているβ−キチンナノファイバーの１質量％以上がろ過されるものである。β−キチンナノファイバー同士が凝集している場合にはろ過され難くなるため、後述する実施例に記載した比較製造例１、２で得られたものは前記要件を満たさない。
【００３７】
本発明の薬剤に含まれるβ−キチンナノファイバーは、平均繊維幅が１００nm以下のものが好ましく、より好ましくは２〜８０nmのものであり、さらに好ましくは３〜６０nmのものである。
【００３８】
本発明の薬剤に含まれるβ−キチンナノファイバーは、平均繊維長さが４００００nm以下のものが好ましく、より好ましくは５００〜３００００nmのものであり、さらに好ましくは７００〜２００００nmのものである。
【００３９】
本発明の薬剤は、使用形態に応じて、錠剤状、顆粒状、粉末状、液状（懸濁液状）、ゲル状等の所望形態にすることができる。
【００４０】
錠剤状、顆粒状、粉末状等の固体状にする場合には、β−キチンナノファーバー単独でもよいし、食品や医薬品に使用できる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を配合し、所望の成形機（打錠機、顆粒製造機、噴霧乾燥機等）を用いて成形することができる。
【００４１】
液状（懸濁液状）にするときには、水のみを使用したものでもよいし、水と共に、食品に使用できる他の有機溶媒（例えば、エタノール）、界面活性剤水溶液、酸水溶液、塩基水溶液等との混合溶媒を使用したものでもよい。ゲル状にするときは、増粘剤等を添加配合することができる。
【００４２】
本発明のGIP及び/又はインスリン上昇抑制剤は、食事の前に、又は、食事と共に又は食後に摂取することが望ましく、β−キチンナノファーバーとしての摂取量は、体重１ｋｇ当たり、約0.002〜２ｇ／日が好ましい。
【００４３】
本発明の糖尿病予防・改善剤は、食事の前に、又は、食事と共に又は食後に摂取することが望ましく、β−キチンナノファーバーとしての摂取量は、体重１ｋｇ当たり、約0.002〜２ｇ／日が好ましい。
【００４４】
本発明の薬剤は、ヒト及び動物に投与することができる他、各種飲食品、医薬品、医薬部外品、ペットフード等に配合して摂取することができる。食品としては、ホルモン分泌抑制効果又は、糖尿病予防・改善効果をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品に応用できる。飲料の形態は特に限定されないが、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等のあらゆる飲料に配合し、製造のために使用することが可能である。また、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、タブレット、カプセル、スープ類等のあらゆる食品形態で配合し、製造のために使用することが可能である。
【００４５】
本発明の薬剤は、医薬品として錠剤及び粉末のような固形投薬形態、あるいはエリキシロール、シロップ及び懸濁液のような液体投薬形態で経口投与される。なお、経口用固形製剤を調剤する場合には、本発明の薬剤に、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合には、矯味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて、常法により製造することができる。
【００４６】
また、本発明の薬剤は、適当量の栄養補給が困難な高齢者やベッドレスト状態の病者においては、経腸栄養剤等の栄養組成物の形態で投与される。
【実施例】
【００４７】
製造例１（β−キチンナノファイバーの製造）
（I）原料、精製剤
β−キチン：β−キチン粉砕品（製造会社：大日精化(株)）
水酸化ナトリウム（１ｍｏｌ／ｌ）：市販品（製造会社：和光純薬工業(株)
塩酸（０．１ｍｏｌ／ｌ）：市販品（製造会社：関東化学(株)）。
（II）製造手順
まず、上記のβ−キチン粉砕品３０ｇを５００ｇの1ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム中に２４時間浸漬後、メッシュでろ過し、メッシュの上に残ったβ−キチン粉砕品を、イオン交換水を用いて、そのろ液の導電率が０．５ｍｓ／ｓ以下になるまで十分洗浄し、β−キチンのアルカリ精製品を得た。
【００４８】
次に、β−キチンのアルカリ精製品０．５ｇとイオン交換水１００ｇの懸濁液のｐＨを塩酸にて３．０に調整後、ホモジナイザー（エクセルオートホモジナイザー、（株）日本精機製作所）にて、５分間攪拌することにより、粉砕品の微細化処理を行い、β−キチンナノファイバーの半透明な懸濁液を得た。そして、最後に懸濁液のｐＨを６．５に調整した。得られたβ−キチンナノファイバーの平均繊維幅は５４．５ｎｍ、平均繊維長さは１９.１μｍ、懸濁液中のβ−キチンナノファイバー含有率は１１．８％であった。
【００４９】
製造例２（β−キチンナノファイバーの製造）
製造例１で得られたβ−キチンのアルカリ精製品３０ｇを５００ｇの０．1ｍｏｌ／ｌの塩酸中に２４時間浸漬後、メッシュでろ過し、メッシュの上に残ったβ−キチンアルカリ精製品を、イオン交換水を用いて、そのろ液の導電率が０．５ｍｓ／ｓ以下になるまで十分洗浄し、β−キチンのアルカリ精製−酸精製品を得た。
【００５０】
次に、β−キチンのアルカリ精製−酸精製品０．５ｇとイオン交換水１００ｇの懸濁液のｐＨを塩酸にて３．０に調整後、ホモジナイザー（エクセルオートホモジナイザー、（株）日本精機製作所）にて、５分間攪拌することにより、粉砕品の微細化処理を行い、β−キチンナノファイバーの半透明な懸濁液を得た。そして、最後に懸濁液のｐＨを６．５に調整した。得られたβ−キチンナノファイバーの平均繊維幅は５１．９ｎｍ、平均繊維長さは１４.８μｍ、懸濁液中のβ−キチンナノファイバー含有率は２５％であった。
【００５１】
比較製造例１（β−キチン非ナノファイバーの製造）
製造例１で得られたβ−キチンナノファイバーの懸濁液を常温で約２ヶ月間保存し、経時凝集させた。得られたファイバーの平均繊維幅は１６０ｎｍ、平均繊維長さは５４.２μｍであり、製造例１のものの３倍程度あったことから、製造例１との対比からβ−キチン非ナノファイバーとした。懸濁液中のナノファイバー含有率は０％であった。
【００５２】
比較製造例２（β−キチン非ナノファイバーの製造）
製造例２で得られたβ−キチンナノファイバーの懸濁液を常温で約２ヶ月間保存し、経時凝集させた。得られたファイバーの平均繊維幅は１５２ｎｍ、平均繊維長さは４９.５μｍであり、製造例２のものの３倍程度あったことから、製造例２との対比からβ−キチン非ナノファイバーとした。懸濁液中のナノファイバー含有率は０％であった。
【００５３】
β−キチンナノファイバー及びβ−キチン非ナノファイバーの各物性の測定方法は以下の通りである。
【００５４】
（１）懸濁液の性質〔β−キチン懸濁液中のナノファイバーの質量分率（β−キチンナノファイバー含有率）（％）〕
β−キチン懸濁液を０．１質量％に調製して、その固形分濃度を精密測定した。続いて、そのβ−キチン懸濁液を目開き１６μmのガラスフィルター（２５Ｇ Ｐ１６，ＳＨＩＢＡＴＡ社製）で吸引ろ過した後、ろ液の固形分濃度を精密測定した。ろ液の固形分濃度（C1）をろ過前の懸濁液の固形分濃度(C2)で除した（C1/C2）値をナノファイバー含有率(％)として算出した。
【００５５】
（２）ファイバーの形状
（2-1）平均繊維幅
β−キチンナノファイバーの平均繊維幅は、0.0001質量％に希釈した懸濁液をマイカ上に滴下して乾燥したものを観察試料として、原子間力顕微鏡（Nanoscope III Tapping mode AFM、Digital instrument社製,プローブはナノセンサーズ社製Point Probe(NCH)使用）で繊維高さを測定した。β−キチン繊維が確認できる画像において、５本以上抽出し、その繊維高さから平均繊維幅を求めた。
【００５６】
（2-2）平均繊維長さ
平均繊維長さは、β−キチンナノファイバーを水で希釈した希薄懸濁液（0.005〜0.04質量％）の粘度から算出した。粘度の測定には、レオメーター（MCR300、DG42（二重円筒）、PHYSICA社製）を用いて、２０℃で測定した。β−キチンナノファイバーの質量濃度とβ−キチンナノファイバー懸濁液の水に対する比粘度の関係から、次式でβ−キチンナノファイバーのアスペクト比を逆算し、β−キチンナノファイバーの平均繊維長さとした。
【数１】
（The Theory of Polymer Dynamics, Ｍ.DOI and D.F.EDWARDS， CLARENDON PRESS・OXFORD,1986,P312に記載の剛直棒状分子の粘度式（８．１３８）を利用した（ここでは、剛直棒状分子＝β−キチンナノファイバーとした）。（８．１３８）式と Ｌｂ2×ρ0＝M/NAの関係から数式１が導出される。ここで、ηspは比粘度、πは円周率、lnは自然対数、Pはアスペクト比（L/ｂ）、γ＝0.8、ρsは分散媒の密度（ｋｇ/ｍ3）、ρ0はβ−キチンナノファイバー結晶の密度（ｋｇ/ｍ3）を1.5とし、Cはβ−キチンナノファイバーの質量濃度（C＝ρ/ρs）、Lは繊維長、ｂは繊維幅（β−キチンナノファイバー断面は正方形とする）、ρはβ−キチンナノファイバーの濃度（ｋｇ/ｍ3）、Ｍは分子量、NAはアボガドロ数を表す）。
【００５７】
実施例１ β−キチンナノファイバーの血中インスリン、血中GIP、血糖値への影響
β−キチンナノファイバーを血中GIP及び／又は後血中インスリン上昇抑制剤として提供した場合のＧＩＰとインスリンの上昇抑制効果を試験した。
【００５８】
1-1 試験試料
試験試料として、製造例１及び製造例２のβ−キチンナノファイバーを用いた。
【００５９】
1-2 試験動物
7週齢の雄性マウスC57BL/6J Jcl（日本クレア）を用いた。各群N=4とした。
【００６０】
1-3 投与サンプルの調製と投与量
グルコース（関東化学製）とトリオレイン（Glyceryl trioleate：Sigma製）をレシチン（卵製）（和光純薬製）とアルブミン(ウシ血清由来)（Sigma製）を用いて乳化し、乳液を調製した。この乳液をコントロールとし、本発明のβ−キチンナノファイバーを添加し、胃内投与サンプルを調製した。動物に対する投与量は表１のとおりである。
【表１】
1-4 胃内投与試験（血糖、血中インスリン、血中GIP測定）
16時間絶食させたマウスをエ−テル麻酔下、眼窩静脈よりヘパリン処理ヘマトクリット毛細管（VITREX製）を用い、初期採血を行った。その後、試験試料を経口ゾンデ針にて経口的に胃内投与し、10分、30分、1時間、2時間後にエーテル麻酔下、眼窩静脈より採血を行った。
【００６１】
採血後、血液の一部を用いてすみやかに血糖簡易測定器（グルコースデヒドロゲナーゼ/電位差測定法、ロシュ・ダイアノグスティック社製）を用いて血糖値を測定した。ヘパリン処理ヘマトクリット毛細管で採取した血液は、血漿分離まで氷冷下で保存後、11000rpmにて5分間遠心分離し、血漿を得た。得られた血漿から、GIP、インスリンを測定した。
【００６２】
血中ＧＩＰ濃度の測定は、Rat/Mouse GIP（Total）ELISA キット（Linco Research/Millipore co.製、ELISA法)、血中インスリン濃度の測定はインスリン測定キット（森永生化学研究所製、ELISA法）を用いて測定した。
【００６３】
1-5 結果
サンプル投与後の最大血中ＧＩＰ値及び最大血中インスリン値（血中ＧＩＰ、血中インスリンともに最大値は10分値）と初期値より、その差（Δ10分値）を算出し、表２、表３に示した。群間の統計学的有意差については、コントロール投与群に対するｔ検定（両側検定）を行い、有意水準10%未満の場合にはP値、10%以上の場合にはN.S.（Non-Significant）を表記した。
【表２】
【表３】
表２、表３の結果から、本発明品のβ-キチンナノファイバー投与群は、コントロール投与群に比べて食後の最大ＧＩＰ値（Δ10分値）及び最大インスリン値（Δ10分値）が低かった。この結果から、本発明品のβ-キチンナノファイバーは、血中ＧＩＰの上昇抑制、血中インスリンの上昇抑制効果を有することが分かった。
【００６４】
また、投与後血糖値の経時変化を図1に示した。製造例１、２のβ-キチンナノファイバー投与群は、いずれも、コントロール投与群に比べ、血糖値の顕著な上昇は認められなかった。
【００６５】
インスリンは血糖値を下げるホルモンであることから、血中インスリンを低減することは、血糖値が大幅に上がってしまうことが懸念される。しかしながら、図１に示すように、製造例１、２のβ-キチンナノファイバー投与群は、コントロール投与後とほぼ同程度の血糖値変化を示したことから、本発明品は血糖を悪化させることなく血中インスリンを低減できることが明らかとなった。
【００６６】
インスリン分泌亢進は、インスリン抵抗性（インスリン感受性低下）や、さらには膵臓のβ細胞（インスリン分泌細胞）の疲弊をまねき、糖尿病の進行の一因と考えられている。また、食後の高血糖は、糖尿病の合併症である血管系疾病のリスクを増大させることが、多くの疫学調査で明らかになっている（非特許文献１２）。
本発明品は、食後の血糖を悪化させることなく、インスリン分泌を低減しており、糖尿病の予防・改善にも有効であると考えられる。
【００６７】
比較例１ β−キチン非ナノファイバーの血中インスリン、血中GIPへの影響
β−キチン非ナノファイバーを血中GIP及び／又は血中インスリン上昇抑制剤として提供した場合のＧＩＰとインスリンの上昇抑制効果を試験した。
【００６８】
1-1 比較試験試料
比較製造例１及び比較製造例２のβ−キチン非ナノファイバーを用いた。
【００６９】
1-2 試験動物
8週齢の雄性マウスC57BL/6J Jcl（日本クレア）を用いた。各群N=4とした。
【００７０】
1-3 投与サンプルの調製と投与量
実施例１に示す調製方法と全く同様に、β−キチン非ナノファイバーの胃内投与サンプルを調製した。動物に対する投与量は実施例１の1-3（表１）と同様で、β−キチンナノファイバーをβ−キチン非ナノファイバーに置き換えた量とした。
【００７１】
1-4 胃内投与試験（血中インスリン、血中GIP測定）
実施例１の1-4に示す胃内投与試験方法と全く同様に、動物に比較試験試料を投与し、血中インスリン、血中GIP測定を測定した。
【００７２】
1-5 結果
結果の集計方法は、実施例１の1-5に示した手法と全く同じ手法で、集計及び統計解析を行った。
【表４】
【表５】
表４、表５の結果から、比較例１のβ-キチン非ナノファイバー投与群の食後の最大ＧＩＰ値（Δ10分値）及び最大インスリン値（Δ10分値）は、コントロール投与群と差がなかった。この結果から、β-キチン非ナノファイバーには、血中ＧＩＰ低減、血中インスリン上昇抑制効果はなく、本発明品のβ-キチンナノファイバーにのみ得られる効果であると考えられた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−キチンナノファイバーを含む経口投与剤。
【請求項２】
β−キチンナノファイバーを含む血中GIP（Gastric inhibitory polypeptide）上昇抑制剤。
【請求項３】
β−キチンナノファイバーを含む血中インスリン上昇抑制剤。
【請求項４】
β−キチンナノファイバーを含む糖尿病予防・改善剤。
【請求項５】
β−キチンナノファイバーが、平均繊維幅が100nm以下である、請求項１の経口投与剤。
【請求項６】
β−キチンナノファイバーが、平均繊維幅が100nm以下である、請求項２の血中GIP抑制剤。
【請求項７】
β−キチンナノファイバーが、平均繊維幅が100nm以下である、請求項３の血中インスリン上昇抑制剤。
【請求項８】
β−キチンナノファイバーが、平均繊維幅が100nm以下である、請求項４の糖尿病予防・改善剤。
【請求項１】
β−キチンナノファイバーを含む経口投与剤。
【請求項２】
β−キチンナノファイバーを含む血中GIP（Gastric inhibitory polypeptide）上昇抑制剤。
【請求項３】
β−キチンナノファイバーを含む血中インスリン上昇抑制剤。
【請求項４】
β−キチンナノファイバーを含む糖尿病予防・改善剤。
【請求項５】
β−キチンナノファイバーが、平均繊維幅が100nm以下である、請求項１の経口投与剤。
【請求項６】
β−キチンナノファイバーが、平均繊維幅が100nm以下である、請求項２の血中GIP抑制剤。
【請求項７】
β−キチンナノファイバーが、平均繊維幅が100nm以下である、請求項３の血中インスリン上昇抑制剤。
【請求項８】
β−キチンナノファイバーが、平均繊維幅が100nm以下である、請求項４の糖尿病予防・改善剤。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２４１７１３（Ｐ２０１０−２４１７１３Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９０６３６（Ｐ２００９−９０６３６）
【出願日】平成２１年４月３日（２００９．４．３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３日（２００９．４．３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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