血友病Ａモデルブタの作出
【課題】血友病の病態や効果的な治療方法を開発する上で有用な、自発性の出血症状を呈する血友病Ａモデルブタを提供すること。
【解決手段】（ａ）第VIII因子遺伝子のエキソン１６を標的としたターゲティングベクターを作製する工程；（ｂ）胎児線維芽細胞に、工程（ａ）で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程；（ｃ）採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程；（ｄ）工程（ｃ）で除核された卵子に、工程（ｃ）で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程；（ｅ）工程（ｄ）で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程；を備えた血友病Ａモデルブタの作出方法。
【解決手段】（ａ）第VIII因子遺伝子のエキソン１６を標的としたターゲティングベクターを作製する工程；（ｂ）胎児線維芽細胞に、工程（ａ）で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程；（ｃ）採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程；（ｄ）工程（ｃ）で除核された卵子に、工程（ｃ）で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程；（ｅ）工程（ｄ）で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程；を備えた血友病Ａモデルブタの作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子をノックアウトした血友病Ａモデルブタ、特に自発性の出血症状（自然出血症状）を呈する血友病Ａモデルブタに関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は血液凝固因子欠乏症の１つで、難治性の先天性出血性疾患である。Ｘ染色体に座する第VIII因子遺伝子異常による血友病Ａと第IX因子遺伝子異常による血友病Ｂに分けられる。１９世紀中頃まで重症血友病男児は成人する前に死亡していたが、診断の進歩や有効な治療法の進歩により患者の生活は向上した。特に血液製剤の開発は血友病治療の転換点であり現在の治療の基礎となった。血液製剤の出現はまさに画期的なことであったが、一方で、多くの血友病患者が血液製剤輸注により肝炎ウイルスやＨＩＶに感染し、患者は大きな犠牲を強いられることになった。その後、ウイルス不活化技術の向上と遺伝子組み換え凝固因子製剤の開発によりウイルス感染は激減し、既知のウイルスやプリオンへの暴露などの危険はほぼ無くなったと考えられる。現在は出血時に凝固因子製剤を投与するオンデマンド療法が中心であり、不測の致死的出血や傷害性出血を防ぐことは出来ない。また、補充する凝固因子の半減期が短いため（第VIII因子は８〜１２時間、第IX因子は１８〜２４時間）、重症患者では凝固因子製剤の輸注回数が多くなることで、補充した凝固因子に対する同種抗体（インヒビター）が発生することがあり、治療が極めて困難になる。この他、製剤療法には、凝固因子製剤のコストの問題、製剤への未知の病原物質の混入の問題なども残っている。こうした問題を解決し、患者のＱＯＬ（Quality of Life）を向上させ治癒へとつながる次世代の治療法として遺伝子治療が期待されている。
【０００３】
遺伝子治療の現在の技術レベルにおいて、治療レベルの遺伝子発現を得るためには、遺伝子導入にウイルスベクターを利用することが現実的である。ウイルスベクターの安全性については様々な改良がなされ、実用レベルに達している。しかし、各ベクターには搭載可能遺伝子サイズに制限があり、第VIII因子は遺伝子サイズが大きすぎる為、血友病Ａ遺伝子治療研究は遅れていた。生体内で活性化される際に分解除去される部分の遺伝子を除く等の改変第VIII因子が考案され、海外では臨床治験も行われるようになったが、いずれのトライアルも一年以上に及ぶ長期間の第VIII因子活性の上昇は見られず、造血障害や肝障害が出現した症例もあった。血友病Ａに対する遺伝子治療の臨床応用には、これらの課題をクリアすることが必須であり、更なる検討が必要であると考えられる。これまでの臨床治験は、第VIII因子遺伝子ノックアウトマウス（非特許文献１及び２参照）や自然発症の血友病イヌ（非特許文献３参照）を用いた実験結果を基に実施されている。
【０００４】
他方、本発明者らは体細胞核直接導入法によるクローンブタの作出について報告（非特許文献４参照）し、また、ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子及びｈＤＡＦ遺伝子からなる導入遺伝子を共発現する、超急性拒絶反応及び急性拒絶反応が抑制されたブタ臓器を提供しうるダブルトランスジェニックブタ（特許文献１参照）を報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２２０２２２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nat Genet.10(1):119-21.1995
【非特許文献２】血栓止血誌８（６）：５１７〜５２０，１９９７
【非特許文献３】Mol Ther. 5: S289. 2000
【非特許文献４】Science,289,1118-1119,2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
凝固第VIII因子（ＦVIII）は種特異性が強いことから、よりヒトに近い実験動物を用いた前臨床試験で治療効果と安全性が評価された後にヒト臨床治験が行われるべきである。非ヒト霊長類であるサルには血友病が同定されておらず、導入したＢＤＤＦVIII抗原量の測定は可能になったが、ＦVIII活性の測定は不可能である。ヒト臨床試験開始前にはＢＤＤＦVIIIの止血能・治療効果の評価は必須であり、そのためにはヒトの類縁動物の欠損モデルが必要となる。しかし、霊長類で血友病モデルを作製するには、技術的にも倫理的にも大きな問題がある。
【０００８】
本発明の課題は、血友病Ａの病態や効果的な治療方法を開発する上で有用な、自然出血症状を呈する血友病Ａモデルブタを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、血友病Ａの根治に向けた治療研究を進め、臨床への展開を加速させるために、ヒトに近い病態モデルとして近年本発明者らのグループで開発されたクローンブタ作製技術を用い、ＦVIII遺伝子を破壊した血友病Ａブタの作製を検討した。種々の工夫をしてＦVIIIノックアウトブタを作出した。その結果、自発的な出血症状の発症頻度が低いＦVIII遺伝子欠損マウスに比べて、自発的な出血症状の発症頻度が極めて高いＦVIII遺伝子欠損ブタが得られることを見いだし、本発明を完成した。これら血友病モデルブタは、出産後１日以内にＦVIIIを投与し、その後２〜３日間隔でＦVIIIを投与する必要があり、その措置を行わなければ、自然出血が多く観察されるため、死亡したり重篤な症状が観察される。また、飼養管理する柵内の床に通常とは異なる柔らかい素材のゴムマットを敷くなどの措置も講じる必要があることがわかった。
【００１０】
すなわち、本発明は（１）Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われたことを特徴とする血友病Ａモデルブタや、（２）上記（１）記載の血友病Ａモデルブタに由来する臓器、組織又は細胞に関する。
【００１１】
また、本発明は、（３）以下の工程を備えた血友病Ａモデルブタの作出方法：
（ａ）第VIII因子遺伝子のエキソン１６を標的としたターゲティングベクターを作製する工程；
（ｂ）胎児線維芽細胞に、工程（ａ）で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程；
（ｃ）採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で除核された卵子に、工程（ｃ）で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程；
や、（４）Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を評価することを特徴とする血友病の予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
さらに、本発明は（５）ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体や、（６）ヒト第VIII因子により、Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタを免疫し、ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体を調製することを特徴とする抗第VIII因子抗体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
ヒトに近い病態モデルが作製されれば、遺伝子治療研究だけでなく、新規治療法や新規製剤開発、インヒビター治療研究に絶大な貢献をもたらし、血友病Ａ患者の望む治癒へ向けた治療研究が加速すると期待される。本発明によると、自然出血症状を呈する血友病Ａモデルブタを提供することができる。また、本発明の血友病Ａモデルブタに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を比較・評価することにより、血友病の予防・治療剤をスクリーニングすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ブタＦVIII遺伝子エキソン１４-エキソン２２制限酵素地図（Ｆ８）と遺伝子ターゲッティングベクター（Ｆ８−ＧＴＶ）を示す図である。ブタＦVIII遺伝子のエキソンは黒で示し、ＰＧＫ（phosphoglycerate kinase）プロモーターで発現させるネオマイシン耐性遺伝子ｃＤＮＡは斜線（右上から左下）で示している。ＨＳＶ−ＴＫ（Herpes simplex virus thymidine kinase）自殺遺伝子ｃＤＮＡは斜線（左上から右下）で示した。サザンブロットで用いたプローブの位置は二重下線で示した位置である。ＰＣＲスクリーニングで用いたプライマーの位置は鉤矢印で示した。また、制限酵素認識部位を矢印で示した。Ｆ８−ＧＴＶにおいてＮｅｏ下流のエキソン１６は１６塩基欠如させている。
【図２】薬剤耐性コロニーのＰＣＲスクリーニングの結果を示す図である。エキソン１４−１８で＃１３４は野生型と同様のバンドと共に長いバンドが確認された。Ｎｅｏ−エキソン２２により＃１３４はＮｅｏの挿入が示された。継代した３ウェルについてもエキソン１４−１８において２本のバンドが確認できる。Ｎｅｏの挿入がエキソン１４−Ｎｅｏ、Ｎｅｏ−エキソン２２、エキソン１４−１８のStuIの切断によっても示された。Ｃ；野生型ブタゲノムＤＮＡ
【図３】＃１３４細胞核移植由来クローンブタ胎仔ゲノムＤＮＡの解析結果を示す図である。Ａ）ＰＣＲによる解析：エキソン１４−１８のＰＣＲにおいてＮＴはＣに比べてＮｅｏの挿入とみられる長いバンドのみが認められた。Ｎｅｏ−エキソン２２、エキソン１４−ＮｅｏではＮＴにのみバンドが検出された。Ｂ）エキソン１４プローブを用いたサザンブロット：SacIはエキソン１４、イントロン１８に存在するため、Ｃ（野生型ブタゲノムＤＮＡ）において７．７ｋｂのバンドが検出され、ＮＴ（＃１３４細胞核移植由来ブタ胎仔ゲノムＤＮＡ）ではＮｅｏが挿入されたため、９．５ｋｂにバンドがシフトしている。StuIはＮｅｏにのみ存在するので、SacI＋StuIではＮＴは７ｋｂにバンドがシフトした。Ｃ）エキソン２２プローブを用いたサザンブロット：EcoRIはＮｅｏの３’に存在するため、ＮＴでは僅かにバンドのシフトが認められる。SphIは５’−アームとＮｅｏに、XbaIはＮｅｏにのみ存在するのでＮＴにおいて減少するバンドのシフトが認められる。
【図４】ＦVIII−ＫＯブタ新生仔の解剖像の写真である。Ａ）ＦVIII−ＫＯブタ＃１：全身に多くの内出血箇所が認められる。Ｂ）ＦVIII−ＫＯブタ＃１の臓器所見：臓器には異常は認められない。Ｃ）ＦVIII−ＫＯブタ＃１の内出血部位切開：内出血部位には血腫が認められた。Ｄ）ＦVIII−ＫＯブタ＃２の頭蓋内切開と臓器所見：頭蓋内には出血は認められず、皮下には出血が認められた。臓器に異常は認められない。
【図５】５ブタ血漿中ＦVIIIの解析結果を示す図である。Ａ）ブタ血漿におけるＦVIII抗原の検出：ブタ血漿ではＦVIIIの検出はされなかった。ヒト血漿との混和（ブタ血漿／ヒト血漿：５０／５０、３０／５０、２０／５０、１０／５０、５／５０、３／５０、２／５０、１／５０、０／５０）においてヒトＦVIIIの検出はほぼ変化なく検出可能であった。Ｂ）ブタ血漿におけるＡＰＰＴとＦVIII活性：ヒト血漿を１００％とした場合、ブタ血漿は約３〜３．５倍のＦVIII比活性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の血友病Ａモデルブタとしては、Ｘ染色体上のＦVIII遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＦVIIIを発現する機能が失われたブタであれば特に制限されず、より具体的には雄ヘミ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｙ）や雌ホモ接合体（ＦVIII：Ｘ−／Ｘ−）を例示することができるが、これらの中でも自発性の出血症状を呈する血友病モデルブタを好適に例示することができる。上記雌ホモ接合体は、雌ヘテロ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｘ＋）と雄ヘミ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｙ）を掛け合わせると、２５％の産生比率で出生する。
【００１６】
上記血友病モデルブタは、（ａ）ＦVIII遺伝子のエキソン１６を標的としたターゲティングベクターを作製する工程；（ｂ）胎児線維芽細胞に、工程（ａ）で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程；（ｃ）採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程；（ｄ）工程（ｃ）で除核された卵子に、工程（ｃ）で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程；（ｅ）工程（ｄ）で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程；の各工程を備えたＦVIIIノックアウトブタの作出方法により得ることができる。
【００１７】
上記工程（ａ）における血友病モデルブタの作出に用いられるターゲティングベクターとしては、相同組換えによりＦVIII遺伝子を破壊し、ＦVIII遺伝子機能を欠失させうるもので、ＦVIIIをコードする遺伝子中のエキソン１６を含む領域が改変されたポリヌクレオチドを含有し、かつ該ポリヌクレオチドが、ＦVIIIの生理活性を欠損した産物を生じるものを挙げることができ、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞をスクリーニングしやすくするために、エキソン１６の中にネオマイシン耐性遺伝子（ＰＧＫ−Ｎｅｏ）等の抗生物質耐性遺伝子やβガラクトシダーゼ遺伝子等の陽性選択マーカーを挿入させることができる他、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）遺伝子等の陰性選択マーカーを有するベクターが好ましい。
【００１８】
上記工程（ｂ）において、胎児線維芽細胞におけるターゲティングベクターによるＦVIIIをコードする遺伝子の相同組換えは、ターゲティングベクターをブタ胎児線維芽細胞に導入することにより達成される。ターゲティングベクターを胎児線維芽細胞に導入する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等を挙げることができる。ターゲティングベクター導入後の胎児線維芽細胞を、細胞内での相同組換えが起こっているかを確認するためのサザンブロッティング法やＰＣＲ法等の常法によりスクリーニングすることにより、ＦVIIIをコードする遺伝子が欠損した胎児線維芽細胞（遺伝子組換え細胞）が得られる。上記胎児線維芽細胞はトリプシン処理で細胞を分散させたものが好ましく、また、培養細胞が線維芽細胞であることを、サイトケラチンとＳＳＥＡ−１との陰性反応、ビメンチンでの陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーによるＰＣＲ分析等により確認することが好ましい。また、レシピエントや仮親と毛色の異なる品種のブタの線維芽細胞を核移植用ドナーとすると、毛色からノックアウトブタであるかどうかを簡便に判定することができる。
【００１９】
また、核移植に用いるドナー線維芽細胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期Ｇ0／Ｇ01期に同調させた細胞が好ましい。細胞周期Ｇ0／Ｇ01期に同調させた細胞は、例えばコンフルエントな状態で培養液の交換なしに、線維芽細胞を１６日間前後培養し続けることによって得ることができる。
【００２０】
上記工程（ｃ）におけるブタの卵子（レシピエント卵子）としては、ブタの成熟卵子であれば特に制限されるものではなく、ＰＧＦ２α、ＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール、ｅＣＧ等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外成熟させたものも使用できるが、着床率の点からして体内成熟卵子、特に性成熟した雌ブタ、例えば生後１６０〜１９４日齢の春期発動前の雌ブタから採取した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子は、過排卵処理により得られる雌ブタの子宮及び卵巣を、ＰＢＳ溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取することができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
【００２１】
上記ブタのレシピエント卵子からの除核は、細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢ処理を施したブタの卵子から除核することが好ましく、より具体的にはサイトカラシンＢを含有するＰＺＭ３液、ＮＣＳＵ２３等の培地で体外成熟卵子等のレシピエント卵子を処理した後、除核操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移してホールディングピペットで保定し、透明帯を迅速・的確に貫通することができる除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ）を用いて、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと吸引することにより行われる。なお、吸引した極体を調べることにより除核できていることを確認することが好ましく、また除核卵子からはサイトカラシンＢを除去することが好ましい。
【００２２】
上記工程（ｄ）において、除核された卵子にブタ胎児遺伝子組換え線維芽細胞核を注入する方法としては、ブタ胎児遺伝子組換え線維芽細胞の核を除核されたレシピエント卵母細胞に直接注入（インジェクション）する方法を特に好適に例示することができる。かかる核の直接注入には、例えば、プライムテック株式会社製のＰＭＭ三次元マイクロマニピュレーションシステムを用いることができる。特に、インジェクションピペットとしては、透明帯の貫通が迅速・精確かつ簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができるものが好ましく、かかるインジェクションピペットとしてはピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径２５〜３０μｍ、先端を３０〜４５度の角度で研磨）を具体的に例示することができる。
【００２３】
かかる工程（ｄ）において体細胞核が注入された卵子には、上記工程（ｅ）において活性化処理を施すことが好ましい。かかる活性化処理としては、従来公知の核移植胚の活性化処理方法であれば特に制限されるものではないが、電気パルス活性化処理を好適に例示することができる。電気パルス活性化処理としては、電荷の大きい１回の電気パルス、例えば１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回を印加する方がそれより小さい電荷の電気パルスを２回印加するよりも胚活性の点で好ましく、また、電気パルス活性化処理における培地としてはＮＣＳＵ２３（J.Reprod.Fertil.Suppl.,48,61,1993）を用いることが高い胚盤胞形成率の点で好ましい。また、電気パルスによる活性化処理の場合、体内成熟卵子の方が体外成熟卵子に比べて胚盤胞の発生能の点で好ましい。さらに、レシピエント細胞として体内成熟卵子を用いる場合には、過排卵処理のために使用した最初のｈＣＧ投与後、５０〜６０時間後、好ましくは５４〜５５時間後に活性化処理をすることが望ましい。
【００２４】
また、卵細胞からの除核時及び該除核細胞への体細胞核の直接注入時の２回にわたって損傷を受けた核移植胚の胚盤胞への発生率を高め、クローンブタを効率よく作出するために、活性化処理後の核移植胚は、卵管又は子宮への移植前に、包埋剤により包埋処理を施すこともできる。かかる包埋剤による包埋処理は、複数回の包埋処理を行い、複数被膜で包埋した核移植胚とすることが好ましく、特に３重包埋処理を行い、３重被膜核移植胚とすることが好ましい。また、かかる複数回の包埋処理を行うに際しては、包埋剤の濃度を順次高めていく包埋処理、すなわち外層膜ほど高濃度の包埋剤を用いて包埋し、その物理的強度を内層から外層へと順次高めていくことが好ましい。
【００２５】
包埋処理に用いられる包埋剤としては、核移植胚を包埋することにより、２回にわたって損傷を受けた核移植胚の桑実胚や胚盤胞への発生率を高め、クローンブタを効率よく作出することができるものであれば特に制限されるものではないが、損傷を受けた透明帯の修復・保護機能を有するものや、包埋処理後の核移植胚を卵管及び子宮に移植した後、生体内での分解機能を有するものや、卵管及び子宮の膜運動による損耗からの保護機能を有するものや、白血球の攻撃からの防御機能を有するものや、包埋皮膜を通しての栄養分の透過・排泄物の排出機能を有するものの他、包埋処理時に核移植胚に影響を与えることなく包埋処理することができるものや、顕微鏡下で包埋皮膜が確認しやすいものや、顕微鏡下で包埋胚の操作がし易くなるものなどが好ましい。かかる包埋剤としては、アルギン酸、寒天等の天然多糖類の他、ムコタンパク質、ポリアミノ酸などの蛋白質、生分解性有機高分子等を例示することができるが、上記包埋剤としての好ましい機能を備えたアルギン酸が特に好ましい。その他、包埋剤の使用濃度についても特に制限されるものではないが、上記包埋剤としての好ましい機能を十分発揮しうる濃度が好ましい。なお、複数回の包埋処理を行う場合、例えばアルギン酸と寒天等、包埋剤の種類を変えて包埋処理をすることもできる。
【００２６】
例えば、アルギン酸を包埋剤として３重包埋処理する方法としては、アルギン酸ナトリウムを所定濃度（例えば０．５％、１．５％、２．０％）となるようにリンゲル液等に溶解し、あらかじめ滅菌しておき、この滅菌済みのアルギン酸ナトリウム溶液（例えば０．５％）に核移植胚を浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル包埋胚とした後、この包埋胚を前記アルギン酸ナトリウム溶液よりも高濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば１．５％）に浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル２重包埋胚とし、次いでこの２重包埋胚を上記アルギン酸ナトリウム溶液よりも高濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば２．０％）に浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル３重包埋核移植胚とする方法を具体的に示すことができる。
【００２７】
活性化処理後に、必要に応じて包埋剤による包埋処理をした核移植胚を、卵管又は子宮に移植する雌ブタとしては特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠２１〜４０日目にプロスタグランジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った雌ブタを用いることが好ましい。また、核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植するに際し、複数個の受精卵を核移植胚に混合して雌ブタの卵管又は子宮に移植する追い移植法を用いることが好ましい。
【００２８】
また産仔したブタが、ＦVIIIノックアウトブタであることの確認は、産仔の毛色の他、ＦVIIIノックアウトクローンブタ、ＦVIIIノックアウトクローンブタの仮親の耳から採取したＤＮＡ並びにＦVIIIノックアウトクローンブタを作出するために用いた線維芽細胞のＤＮＡを採取し、ＰＣＲを行い、ＦVIIIノックアウトクローンブタが線維芽細胞と同一の遺伝子をもち、ＦVIII遺伝子が破壊され、自然出血症状を呈するかどうかを確認することにより同定することができる。
【００２９】
核移植用ドナーとして雄の胎児線維芽細胞を用いたときには雄ヘミ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｙ）からなる血友病モデルブタを作出することができるが、雌の胎児線維芽細胞を用いたときには血友病症状を呈さない雌ヘテロ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｘ＋）が得られる。この場合、雄ヘミ接合体ブタと雌ヘテロ接合体ブタを掛け合わせると、血友病症状を呈する２５％の雌ホモ接合体、２５％の雌ヘテロ接合体、血友病症状を呈する２５％の雄ヘミ接合体ブタ、２５％の雄の正常ブタの出生割合で産仔が得られる。前記非特許文献２によると、雄ヘミ接合体マウスで約１１％、雌ホモ接合体マウスで約７％が自発性の出血症状を呈するに過ぎず、８〜１０週を経過したＦVIIIＫＯマウスでは、尾を切断したり、尾を火傷させた場合でも全マウスが生存すると報告されているが、本発明によると、雄ヘミ接合体ブタで１００％自発性の出血症状を呈し、５週を経過した後でも自然出血症状を維持していた。
【００３０】
本発明はまた、本発明の血友病モデルブタに由来する臓器、組織又は細胞に関し、かかる臓器、組織又は細胞は、血友病モデルブタと同様に、血友病の予防・治療剤のスクリーニングに有利に用いることができる。また、臓器、組織または生殖細胞を含む細胞を用いることで、後代を含む個体作出に利用できる。
【００３１】
本発明の血友病の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、上記本発明の血友病モデルブタ（ＦVIIIノックアウトブタ）をに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を、被検物質を投与しない場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、上記血液凝固機能の程度とは、自然出血や怪我等の外因性要因による出血の症状の止血の程度や止血の持続期間の程度をいい、血液凝固機能の程度を既存の血友病の予防・治療剤と比較・評価することができる。上記被検物質としては、ＦVIII遺伝子やその一部、又はＦVIII遺伝子改変体が組み込まれたＤＮＡベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus：ＡＡＶ）ベクター、組換えレンチウイルス（lentivirus）ベクター、組換えアデノウイルス（adeno virus）ベクター、ネイキッドＤＮＡベクター等を好適に例示することができる。本発明は、上記本発明のスクリーニング方法により得られた血友病Ａの予防・治療剤をも包含する。
【００３２】
本発明の抗ＦVIII抗体としては、ヒトＦVIIIとブタＦVIIIとに交差反応性を有する抗体であれば特に制限されず、抗ＦVIIIモノクローナル抗体が好ましい。本発明の抗ＦVIII抗体は、ヒトＦVIIIでＦVIIIノックアウトブタを免疫することにより調製することができる。かかる本発明のヒトＦVIIIとブタＦVIIIとに交差反応性を有する抗体は、ＦVIIIインヒビターである抗ＦVIII抗体を無力化あるいは回避する血友病の予防・治療剤のスクリーニングに使用することができる。
【実施例１】
【００３３】
［ＦVIII遺伝子ＫＯクローンブタの作出］
１．ＦVIII遺伝子ターゲティングベクターの作製（ベクター名：Ｆ８−ＧＴＶ）
胎齢６５日目の雄ブタ胎仔線維芽細胞からDNAzol（Invitrogen社製）を用いてブタゲノムＤＮＡを分離し、このゲノムＤＮＡからＦVIII遺伝子のエキソン１６を標的とするベクターを構築した。Sus scrofa coagulation factor VIII cDNA sequence（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ；ＮＭ＿２１４１６７）をもとにプライマーを作製し（表１）、エキソン１４からエキソン２１までと、エキソン１６からエキソン２２までをExpand Long Template PCR System（Roche Diagnostics社製）を用いたＰＣＲにて増幅させ、pCR2.1-TOPO Cloning Kit（Invitrogen社製）またはpCRBluntII-TOPO Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いてクローニング後、ABI PRISM Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）によるＤＮＡ塩基配列決定と、エキソン部位とｃＤＮＡ配列とを照合した。さらにイントロン１４部位におけるXhoI認識配列を付加したプライマー（表１）とエキソン２１プライマーのＰＣＲによりクローニングしたイントロン１４−エキソン２１をエキソン１６内にあるXhoIで処理したイントロン１４−エキソン１６の５’−アームを、エキソン１６プライマーとイントロン２１部位におけるXbaI認識配列を付加したプライマー（表１）によりエキソン１６−イントロン２１の３’−アームをクローニングし、pBS-HSVTK-PGKNeo（京都大学ウイルス研究所 生田宏一教授からの供与）のXhoIとXbaI部位へ組み込み、エキソン１６の中にＰＧＫ−Ｎｅｏを挿入させ、５’−アーム上流に自殺遺伝子であるＨＳＶ−ＴＫを配したＦVIII遺伝子ターゲティングベクターを作製した。エレクトロポレーションに用いるため、NotI（TOYOBO社製）の消化により線状化し、フェノール／クロロフォルムによる精製後、ＨＢＳ（HEPEs Buffered Saline）で２５ｎＭの濃度に希釈した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
２．制限酵素地図の作成
５’−アームあるいは３’−アームをクローニングしたプラスミドを任意の制限酵素にて３７℃、２時間処理後、アガロース電気泳動とエチジウムブロマイド染色にて消化バンドを確認し、ＤＮＡ塩基配列決定した配列の制限酵素認識部位を照合させ、制限酵素地図を作成した。
【００３６】
３．胎児線維芽細胞の採取
ランドレース♀×大ヨークシャー♂で交配後、妊娠６５もしくは７２日目の胎児を採取した。採取した胎児は、ハサミで筋肉組織を採取し、細切した。細切した胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌの０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液に懸濁し、一晩冷蔵した（４℃）。遠心処理（１５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により上清を除去した後、３７℃に保温したウォーターバスにて２０−３０分間処理した。保温処理後、胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加えてピペッティングし、セルストイレーナーにて濾過した。濾過液を遠心後、上清を除去し、沈殿物に１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを添加して再懸濁した。細胞数を計測し、適当量になるようＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて調整した後、７５ｃｍ２細胞培養用フラスコに播いた。その播いた細胞は、３７℃で５％ＣＯ２でコンフルエントになるまで培養し、以下のエレクトロポレーションによる遺伝子導入に用いた。
【００３７】
４．遺伝子導入とＧ４１８薬剤選択（ＦVIII遺伝子ＫＯ細胞の作出）
分離および増殖した胎児線維芽細胞は、０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液で剥離させ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて懸濁した。細胞懸濁液を遠心処理（１５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した後、上清を除去し、冷ＨＢＳに再懸濁した。再懸濁液は、再度遠心処理を行って上清を除去した。細胞数が２．５×１０７細胞／ｍｌになるようにＨＢＳにて調整した。キュベットに細胞溶液０．４ｍｌ（１．０×１０７細胞／ｍｌ）と１００μｌの調整済みＤＮＡ液（２５ｎＭの直線化したターゲッティングベクターを添加、図１．）を加えた後、良く混和した。遺伝子導入には、電気穿孔法装置を３００Ｖ、９５０μＦ、抵抗∞の条件のパルスにて行った。パルス付加後、１０分間室温にて静置した。静置した細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに懸濁後、３枚の１０ｃｍシャーレに分けて培養した。パルス後４８時間目に８００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）および２μＭガンシクロビア（Denosine；Mitsubishi Tanabe Pharma社製）を培養液に添加し、耐性細胞株を７−１２日間選択培養した。薬剤選択後、ＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Invitrogen社製）をしみ込ませたペーパーディスク（ADVANTEC社製）を細胞コロニーに乗せ、３７℃で３分インキュベーションした後、培地を入れておいた２４ウェル-プレート（Corning社製）へ１枚／ウェルとなるように継代した。培養５−６日目にフルコンフルエントになった各コロニーは１／６ずつ２４ウェル−プレートの３ウェルに継代し、１／２の細胞についてゲノムＤＮＡを抽出し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え体についてスクリーニングした。同様に継代した３ウェルについてもフルコンフルエントにした後に細胞継代とゲノムＤＮＡを抽出し、確認のＰＣＲスクリーニングをした。ＰＣＲスクリーニングで陽性の結果が出たコロニーは、そのまま培養を継続し、核移植に供した。
【００３８】
５．ＰＣＲ解析によるターゲッティングの検出
ＰＣＲスクリーニングはエキソン１４とエキソン１８に設置したプライマー（表２）を用いたＰＣＲによりＦVIII遺伝子組み換え体コロニーを特定し、Ｎｅｏに設置したプライマー（表２）とのＰＣＲにより確認した。また、Ｎｅｏ遺伝子の挿入を確かめるため、エキソン１４―１８のＰＣＲで得られたバンドをＮｅｏ遺伝子に存在するStuIの消化により確認した。ＦVIII遺伝子組換え体コロニーはＧ０期へ以降するまで増殖させ、核移植に使用した。核移植・胚移植由来の雄ブタ胎仔ゲノムについても同様のＰＣＲにより解析した。細胞は、２００ｇ／ｍｌのプロテナーゼＫが含む５０μｌの超純水に再懸濁し、５５℃で３時間保温した後、９５℃１０分間加熱してプロテナーゼを失活させた。ＰＣＲ分析は、Roche社製Expand Long Template PCR Systemを用いた。２５μｌ量の反応液中に消化した５０μｌのサンプルから鋳型として１μｌ（３０〜５００ｎｇ／μｌ）を用いた。ＰＣＲサイクルのパラメーターは、最初に９４℃を２分間、次に９４℃を１０秒、６８℃を６分の１サイクルを１０サイクル、９４℃を１５秒、６８℃を６分の１サイクルにおいて６８℃については、１サイクル毎に２０秒間増加させ２５サイクル後、６８℃を７分間処理した。プライマーはＦ８エキソン１４Ｆ（５’−ＣＡＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＴＡＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣ−３’）およびＦ８エキソン１８Ｒ（５’−ＧＣＣＡＧＧＧＡＧＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＡＧ−３’）を用いた。このプライマーは、８ｋｂの変異アレル特異的な産物を設定した。精製したＤＮＡに対するＰＣＲは、鋳型として１００ｎｇの精製ＤＮＡを使用した点を除いて同様に実施した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
６．ホルモン処理による採卵方法
ランドレース（Ｌ）およびランドレース、大ヨークシャー（Ｗ）、デュロック（Ｄ）の三元交雑種（ＬＷＤ）の生後１６０〜１９４日齢の春期発動前の雌ブタを用いた。供試ブタにｅＣＧ（ピーメックス、三共）を１５００ＩＵ投与し、その７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４８時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。また、性成熟に達した雌豚からの採卵は、予め発情時に雄希釈精液を用いて人工授精を行い、妊娠２１−５０日後に流産処置し行った。核移植予定５日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート：２ｍｌ量、武田製薬社製）を臀部筋肉内に投与した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共製薬社製）を臀部筋肉内に１５００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共製薬社製）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４６時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。
【００４１】
７．体内成熟卵子の準備
摘出した卵巣、卵管、子宮の結合組織を直ちに実験室に持ち帰り、灌流液（ＰＢＳ：Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含、（TAKARA社製）＋０．１％ウシ血清アルブミン：ＢＳＡ（Sigma社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−４５０３）＋１００ｍｌあたり１ｍｌ添加抗生物質：Antibiotic,Antimycotic（Sigma社製、Ａ−７２９２）で卵管を灌流し、卵子を採取した。得られた卵子は０．１％ヒアルロニダーゼを含む、灌流液を用いて卵丘細胞を裸化し、卵細胞質の均一な卵子を選抜した後、ヒアルロニダーゼを含まない灌流液中で洗浄した。その後、ＰＺＭ−３液（Biol Reprod. 66:112-119. 2002）を用いてインキュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２）内で供試するまで体外培養を行った。
【００４２】
８．屠場卵巣由来卵胞卵子の採卵方法
屠場にて食肉用として屠殺された春機発動前の未経産雌ブタより卵巣を採取し、ＰＢＳ（−）液にて３５℃保温下で研究室に持ち帰った。持ち帰った卵巣は直ちに、３７℃に保温したＰＢＳ（−）にて洗浄し、卵巣結合組織を除去した後、採卵作業を行った。直径３−６ｍｍの卵胞を選び、１６Ｇ注射針付き１０ｍｌシリンジで吸引した。吸引した卵胞液は、５０ｍｌディスポチューブに回収し、５分以上室温放置後、上清を除去した。卵子が含まれる沈殿物に対し、ＴＡＬＰ−Ｈｅｐｅｓ液を加えて懸濁後、沈殿物がチューブの底に溜まったのを確認し、沈殿物を吸引しないよう、パスツールピペットにて上清を除去した。この洗浄操作を２−３回繰り返した。卵丘細胞が３層以上密に付着した卵丘細胞卵子複合体（ＣＯＣ）とＣＯＣに壁側顆粒層細胞が付着した壁側顆粒層細胞−卵丘細胞卵子複合体（ＧＣＯＣ）を選別・採卵をした。
【００４３】
９．体外成熟培養
採取したＣＯＣおよびＧＣＯＣは、約１５〜２０個／穴で改変ＮＣＳＵ３７を１００μｌ分注し、１００μｌ流動パラフィンオイルカバーした６穴ディッシュを用いて成熟培養した。改変ＮＣＳＵ−３７は、１０％ブタ卵胞液、０．６ｍＭシステイン、５０μＭ βメルカプトエタノール、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍｌ ＰＭＳＧ（ピーメックス；１０００ＩＵ三共製薬社製）、１０ＩＵ／ｍｌ ｈＣＧ（プペローゲン；１５００ＩＵ、三共製薬社製）を添加して作製した。２０〜２２時間まで培養後、ホルモン及びジブチリルｃＡＭＰ無添加改変ＮＣＳＵ３７に移して供試時まで培養した。成熟培養は３９℃、気相条件は、ＣＯ２５％、Ｏ２５％、Ｎ２９０％の条件で実施した。成熟培養時間は、４２−４４時間で行い、成熟卵子（第一極体放出卵子）のみを試験に使用した。
【００４４】
１０．卵子核の除去操作（除核操作）
除核操作前に、屠殺採卵した未受精卵子を、サイトカラシンＢ（Sigma社製：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ−６７６２）が５μｇ／ｍｌ濃度含むＰＺＭ３液に移し、１５分間以上処理した。除核操作も同濃度のサイトカラシンＢが含まれるＰＺＭ３液で作製したドロップ内（１０ｃｍプラスチックシャーレの中心付近に５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）で行った。卵子は、第一極体が、１２時から３時方向の位置になるようにホールディングピペットで保定した。ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ、先端を３０〜４５度の角度で研磨）により、第一極体ごと細胞質を１／４〜１／３量程吸引した。除核用ピペットの操作性が悪くなった場合は、２０％ＰＶＰ液（Sigma社製：Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＶＰ−３６０）ドロップにて、吸引・排出を繰り返し、洗浄を行った。除核操作終了後、直ちにサイトカラシンＢが含まれないＰＺＭ３液に移し、洗浄を行う。洗浄には、ＰＺＭ３液が３ｍｌ入った３５ｍｍディッシュ（Falcon社製、１００８）で２回以上、丁寧に洗浄し、サイトカラシンＢを除去した。その後、注入操作まで、ＰＺＭ３液ドロップ（３５ｍｍディッシュ：Falcon社製、３００１に１００μｌのドロップを作製し、４ｍｌミネラルオイルで被った）に移し、インキュベーター内で培養した。
【００４５】
１１．ドナー組換え体細胞の準備
ＰＣＲ解析によりＦVIII遺伝子がノックアウトされていると判定した雄胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。培養液にはＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳを用い、植え継ぎ回数は０〜５回の細胞を用いた。核移植予定日に合わせて、植え継ぎを行った後、コンフルエント状態から培養液の交換を行わず、３〜１４日間放置し、細胞周期をＧ１／Ｇ０期に同調した。核移植に用いる約１時間前にドナー体細胞の準備を行った。細胞処理は、培養容器の培養液を除去した後に、ＰＢＳ（−）にて３回以上洗浄を行い、０．２５％トリプシン＋０．０４％ＥＤＴＡ-２Ｎａ液にて細胞剥離処理を行った。剥離した細胞に１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを加えて懸濁した後、遠心処理（１，５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）を行った。遠心処理後、上清を除去し、ＰＺＭ３液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に、適当な細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに添加して使用した。
【００４６】
１２．体細胞核の注入操作
注入用チャンバー（１０ｃｍシャーレにＰＺＭ３液５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）のドロップに適量のドナー細胞を添加し、除核済み卵子５０〜１００個を入れて操作した。注入操作には、ピエゾマイクロマニュピレーターに体細胞核注入用ピペット（外径７−１０μｍ、鈍端）を用いた。注入用ピペットをピエゾマイクロマニュピレーターに取り付ける前に、ピペット後端より５ｍｍの位置にフロリナートを３−５ｍｍ幅になるように、充填して使用した。そのピペットをピエゾに取り付けて使用する時は、先端より培養液、フロリナート、空気、ミネラルオイルの順で満たされている状態にして操作した。注入操作を行う前に、必ず２０％ＰＶＰ液ドロップ内で注入用ピペットを洗浄（ピペッティングやＰＶＰドロップへのピペット先端の出し入れ）した。浮遊している体細胞を吸引し、数回ピペッティングを行い、細胞膜を壊し、ホールディングピペットにて保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した。体細胞核を注入した卵子は、活性化処理時間までインキュベーターで培養を行った（１〜３時間）。
【００４７】
１３．卵子の活性化処理
体細胞核を注入した卵子の活性化処理は直流パルス刺激（ＳＳＨ−２、島津製作所製）を、１．５ｋＶ／ｃｍ １００μｓｅｃ×１回の条件にて行った。チャンバーには２ｍｍ幅のステンレスワイヤー電極を用い、電気刺激用の電解質溶液には０．０５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４ならびに０．０２％ＢＳＡを含む０．２８Ｍマンニトール溶液を用いた。
【００４８】
１４．活性化卵子の第２極体放出抑制処理
活性化処理卵子は５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（Sigma社製：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ−６７６２）を含むＰＺＭ３液で２時間培養し、第２極体の放出を抑制させる処理を行った。
【００４９】
１５．活性化卵子の体外培養
活性化後２倍体処理をした卵子は、ＰＺＭ３液にて体外培養を行い、活性化処理後２日目に分割胚のみ胚移植に用いた。
【００５０】
１６．ホルモン処理による仮腹の同期化と胚移植方法
仮腹の同期化は妊娠豚を人工流産処置することで行った。また、仮腹の発情は、採卵豚のものより、１日遅れるように発情同期化処置を行った。供試予定の雌ブタは、発情時に、雄豚希釈精液を用いて人工授精を行い妊娠させた。妊娠後２１−５０日目の妊娠豚を用いた。核移植予定６日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート、武田製薬社製：２ｍｌ量）を臀部に注射した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共製薬社製）を１０００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共製薬社製）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与、約６８時間目に仮腹へケタラール投与後、ハロセン麻酔下で外科的に胚移植手術を行った。胚移植はＰＰカテーテル（フジヒラ社製）を卵管へ挿入して行った。
【００５１】
１７．組み換えクローン胎児の採取および細胞分離作業
同定したＰＣＲ陽性コロニーは、非相同組換え細胞が、様々な割合で含まれている可能性があり、体細胞核移植技術を用いた効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなりうることが予想された。そこで、単一な相同組換え細胞のみの集団を得るため、妊娠した雌ブタの３２日目もしくは３９日目に胎児を採取した。採取した胎児は、３．と同様に細胞を分離すると同時にゲノムＤＮＡを採取し、相同組み換え個体であるか５．と同様の条件でＰＣＲ解析した。ＰＣＲ解析にて陽性であった胎児細胞を用いて再核移植を実施し、胚移植によりＦVIIIノックアウトクローン個体の作出に供した。
【００５２】
１８．サザンブロット解析
核移植・胚移植により発生した雄ブタ胎仔線維芽細胞から抽出したゲノムＤＮＡを用いてＦVIII遺伝子の組換えをサザンブロットにて確認した。５ｍｇのゲノムＤＮＡを制限酵素SacI、StuI、EcoRI、SphI、あるいはXbaIで切断し、アガロース電気泳動後、アルカリトランスファー条件によるサザンブロッティングを実施した。バンドの検出はDIG PCR Labeling Kit（Roche社製）にてエキソン１４またはエキソン２２のＤＩＧラベルプローブを、エキソンプライマー（表３）を用いたＰＣＲにより作製し、DIG Easy Hyb（Roche社製）にてハイブリダイゼーション、DIG Detection Kit（Roche社製）により検出した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
１９．ブタ血漿の解析
血液と３．８％クエン酸ナトリウム溶液（Harasawa Pharmaceutical社製）を１／１０となるようにブタから採血し、３０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により血漿を分離した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）をCA500（Sysmex社製） にて測定し、ヒトＦVIIIに対する抗体Sheep anti-human FVIII Antibody（Affinity Biologicals Inc.社製）とRabbit Anti-human FVIII（研究室で作製したポリクローナル抗体）、Goat anti-Rabbit IgG-HRP（BioSourse社製）を用いたＥＬＩＳＡにより、ＦVIIIの検出を検討した。ヒト正常血漿（健常者ボランティアによる）においてＡＰＴＴのスタンダードを作製し、ヒト血漿ＦVIII活性を１００％としてブタ血漿ＦVIII活性を算出した。ＥＬＩＳＡでは、ブタ血漿とヒト血漿、それらの混和（ブタ／ヒト：１／１〜１／５０）をサンプルとし、Benchmark plus（Bio-Rad Laboratories社製）にて吸光度４１５ｎｍを測定し、ＡＢＴＳ（Kirkegaard＆Perry Laboratories社製）の発色によりＦVIIIを検出した。
【００５５】
２０．誕生したクローンブタのＰＣＲ判定
誕生したクローンブタから採取可能な組織（耳、臍帯組織）や血液等からＤＮＡを抽出し、前記５．「ＰＣＲ解析によるターゲッティングの検出」に準じてＰＣＲ解析を行った。
【００５６】
（ＦVIII遺伝子ターゲッティングベクター）
ブタの全ゲノムＤＮＡ配列が解読・公開されていないため、現時点で公開されているブタ肝臓からクローニングされたＦVIII ｃＤＮＡ配列をヒトＦVIII ｃＤＮＡ配列との相同性によりエキソン部位を予測、ＰＣＲにより増幅・クローニングすることで遺伝子発現を欠損させるためのターゲッティングベクターを構築し、配列を解読した。ｃＤＮＡ配列とクローニングしたゲノムＤＮＡ配列の照合によってエキソン部位が特定された。
また、種々の制限酵素処理によってクローニングしたゲノムＤＮＡ領域の制限酵素地図を作製した（図１参照）。
【００５７】
（ＦVIII遺伝子組換えブタ胎仔線維芽細胞の作出）
ＦVIII遺伝子ターゲティングベクターの導入と薬剤選択によって得られた９３６コロニーのうち増殖可能であった２００コロニーをＰＣＲスクリーニングした。遺伝子導入の回数と薬剤耐性コロニー数、増殖コロニー数、ＦVIII遺伝子組換え型コロニー数を表４に示す。エキソン１４−１８において、遺伝子組換え型ではエキソン１６へのＮｅｏの挿入により遺伝子増幅部位が長くなることを検証したところ、野生型と遺伝子組換え型の両方にバンドが出るコロニー＃１３４が１つ得られた（図２）。コロニー＃１３４におけるＮｅｏの挿入はＰＣＲ（エキソン１４−Ｎｅｏ、Ｎｅｏ-エキソン２２）とエキソン１４-１８のＰＣＲ後のＳｔｕＩの切断により陽性と確認された（図２）。さらに継代した３ウェルについても同様の結果が得られた（図２）。よって、得られたコロニー＃１３４は野生型細胞とエキソン１６にＮｅｏが挿入されたＦVIII遺伝子組換え細胞とを含む細胞集団であると考えられた。このコロニー＃１３４を核移植に用いた。
【００５８】
【表４】
【００５９】
（ＦVIII遺伝子組換え細胞をもちいた核移植由来胎仔の解析）
ＦVIII遺伝子組換え細胞コロニー＃１３４を用いた計５回の核移植・胚移植の結果、１匹のブタ胎仔が得られ、その線維芽細胞を分離・増殖・保存し、そのゲノムＤＮＡの解析を検討した。ＰＣＲによる解析はエキソン１４−１８において遺伝子組換え型のみを示す結果が得られ、エキソン１６へのＮｅｏの挿入も陽性であった（図３Ａ）。
また、サザンブロッティングによりＦVIII遺伝子の組換えの確認したところ、エキソン１４プローブまたはエキソン２２プローブを用いた場合において、任意のバンドシフトが認められ（図３Ｂ、３Ｃ）、目的であるＦVIII遺伝子のエキソン１６にＮｅｏが挿入されているという結果が得られた。よって、核移植に用いた細胞コロニーはＦVIII遺伝子組換え細胞と野生型細胞が混在する細胞集団であったが、核移植後に発生したクローンブタ胎仔はＦVIII遺伝子組換えブタ（ＦVIII−ＫＯブタ）であることが示された。
【００６０】
（ＦVIII遺伝子組換えブタ胎仔細胞の再核移植・胚移植）
作出した細胞由来のクローンブタ胎仔がＦVIII遺伝子組換え（ＦVIII−ＫＯ）ブタであることがゲノムＤＮＡの解析により確かめられたため、そのブタ胎仔線維芽細胞をもちいて計７回の核移植・胚移植を実施した。その結果、３頭の仮親が、妊娠し、分娩まで至った。４頭の生存クローンブタが誕生した。胚移植の実施日程と妊娠の有無、出産予定日、分娩頭数（死産）の結果を表５に示す。
【００６１】
【表５】
【００６２】
（ＦVIII−ＫＯブタ新生仔の観察）
ＦVIII−ＫＯ胎仔線維芽細胞の核移植・胚移植により、４頭のＦVIII−ＫＯクローンブタが誕生した。しかし、出産直後あるいは２日目までに３頭が死亡した。
死亡したＦVIII−ＫＯブタ新生仔の剖検から、体の複数箇所に内出血が認められた（図４Ａ）。母ブタとの接触による内出血と推察された。また、内出血部位を切開したところ、血腫が認められ（図４Ｃ）、ＦVIII−ＫＯブタ自身には死亡前に出血傾向があるものと考えられた。
一方、頭蓋内には出血は認められず、臓器所見も異常がなかった（図４Ｂ、４Ｄ）。ＦVIII−ＫＯブタ新生仔のＤＮＡをエキソン１４−１８ ＰＣＲにより解析したところ、２頭ともＦVIII−ＫＯのクローンであることが確認された。
【００６３】
（ブタ血漿の解析）
野生型ブタの血漿をヒトＦVIIIを検出するＥＬＩＳＡによって検出したところ、ブタＦVIIIは検出されず、ヒト血漿との混和によるＥＬＩＳＡにおいてもヒトＦVIIIの検出を阻害するような結果は得られなかった（図５Ａ）。また、野生型ブタ血漿のFVIII活性を測定したところ、ブタ血漿はヒト血漿の約３〜３．５倍のＦVIII活性を有することが示された（図５Ｂ）。
生後２日に出血死したFVIII-ＫＯクローンブタの血液の凝固因子活性（ヒト凝固因子活性換算）を測定したところ、第VIII因子活性は感度以下であり、正常対照となる野生型新生仔ブタの（生後1日）の凝固第VIII因子活性は２００％以上であった。FVIIIＫＯクローンブタの血漿中で低下がみられた第VII因子活性と第XI因子活性は野生型新生仔ブタでも低値であった。FVIII-ＫＯクローンブタでは第VIII因子活性のみが特異的に低下していたことは、得られたクローンブタがFVIII-ＫＯクローンブタであることを確実に示し、出血症状は第VIII因子活性の低下に基づくものであるといえる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子をノックアウトした血友病Ａモデルブタ、特に自発性の出血症状（自然出血症状）を呈する血友病Ａモデルブタに関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は血液凝固因子欠乏症の１つで、難治性の先天性出血性疾患である。Ｘ染色体に座する第VIII因子遺伝子異常による血友病Ａと第IX因子遺伝子異常による血友病Ｂに分けられる。１９世紀中頃まで重症血友病男児は成人する前に死亡していたが、診断の進歩や有効な治療法の進歩により患者の生活は向上した。特に血液製剤の開発は血友病治療の転換点であり現在の治療の基礎となった。血液製剤の出現はまさに画期的なことであったが、一方で、多くの血友病患者が血液製剤輸注により肝炎ウイルスやＨＩＶに感染し、患者は大きな犠牲を強いられることになった。その後、ウイルス不活化技術の向上と遺伝子組み換え凝固因子製剤の開発によりウイルス感染は激減し、既知のウイルスやプリオンへの暴露などの危険はほぼ無くなったと考えられる。現在は出血時に凝固因子製剤を投与するオンデマンド療法が中心であり、不測の致死的出血や傷害性出血を防ぐことは出来ない。また、補充する凝固因子の半減期が短いため（第VIII因子は８〜１２時間、第IX因子は１８〜２４時間）、重症患者では凝固因子製剤の輸注回数が多くなることで、補充した凝固因子に対する同種抗体（インヒビター）が発生することがあり、治療が極めて困難になる。この他、製剤療法には、凝固因子製剤のコストの問題、製剤への未知の病原物質の混入の問題なども残っている。こうした問題を解決し、患者のＱＯＬ（Quality of Life）を向上させ治癒へとつながる次世代の治療法として遺伝子治療が期待されている。
【０００３】
遺伝子治療の現在の技術レベルにおいて、治療レベルの遺伝子発現を得るためには、遺伝子導入にウイルスベクターを利用することが現実的である。ウイルスベクターの安全性については様々な改良がなされ、実用レベルに達している。しかし、各ベクターには搭載可能遺伝子サイズに制限があり、第VIII因子は遺伝子サイズが大きすぎる為、血友病Ａ遺伝子治療研究は遅れていた。生体内で活性化される際に分解除去される部分の遺伝子を除く等の改変第VIII因子が考案され、海外では臨床治験も行われるようになったが、いずれのトライアルも一年以上に及ぶ長期間の第VIII因子活性の上昇は見られず、造血障害や肝障害が出現した症例もあった。血友病Ａに対する遺伝子治療の臨床応用には、これらの課題をクリアすることが必須であり、更なる検討が必要であると考えられる。これまでの臨床治験は、第VIII因子遺伝子ノックアウトマウス（非特許文献１及び２参照）や自然発症の血友病イヌ（非特許文献３参照）を用いた実験結果を基に実施されている。
【０００４】
他方、本発明者らは体細胞核直接導入法によるクローンブタの作出について報告（非特許文献４参照）し、また、ＥｎｄｏＧａｌＣ遺伝子及びｈＤＡＦ遺伝子からなる導入遺伝子を共発現する、超急性拒絶反応及び急性拒絶反応が抑制されたブタ臓器を提供しうるダブルトランスジェニックブタ（特許文献１参照）を報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２２０２２２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nat Genet.10(1):119-21.1995
【非特許文献２】血栓止血誌８（６）：５１７〜５２０，１９９７
【非特許文献３】Mol Ther. 5: S289. 2000
【非特許文献４】Science,289,1118-1119,2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
凝固第VIII因子（ＦVIII）は種特異性が強いことから、よりヒトに近い実験動物を用いた前臨床試験で治療効果と安全性が評価された後にヒト臨床治験が行われるべきである。非ヒト霊長類であるサルには血友病が同定されておらず、導入したＢＤＤＦVIII抗原量の測定は可能になったが、ＦVIII活性の測定は不可能である。ヒト臨床試験開始前にはＢＤＤＦVIIIの止血能・治療効果の評価は必須であり、そのためにはヒトの類縁動物の欠損モデルが必要となる。しかし、霊長類で血友病モデルを作製するには、技術的にも倫理的にも大きな問題がある。
【０００８】
本発明の課題は、血友病Ａの病態や効果的な治療方法を開発する上で有用な、自然出血症状を呈する血友病Ａモデルブタを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、血友病Ａの根治に向けた治療研究を進め、臨床への展開を加速させるために、ヒトに近い病態モデルとして近年本発明者らのグループで開発されたクローンブタ作製技術を用い、ＦVIII遺伝子を破壊した血友病Ａブタの作製を検討した。種々の工夫をしてＦVIIIノックアウトブタを作出した。その結果、自発的な出血症状の発症頻度が低いＦVIII遺伝子欠損マウスに比べて、自発的な出血症状の発症頻度が極めて高いＦVIII遺伝子欠損ブタが得られることを見いだし、本発明を完成した。これら血友病モデルブタは、出産後１日以内にＦVIIIを投与し、その後２〜３日間隔でＦVIIIを投与する必要があり、その措置を行わなければ、自然出血が多く観察されるため、死亡したり重篤な症状が観察される。また、飼養管理する柵内の床に通常とは異なる柔らかい素材のゴムマットを敷くなどの措置も講じる必要があることがわかった。
【００１０】
すなわち、本発明は（１）Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われたことを特徴とする血友病Ａモデルブタや、（２）上記（１）記載の血友病Ａモデルブタに由来する臓器、組織又は細胞に関する。
【００１１】
また、本発明は、（３）以下の工程を備えた血友病Ａモデルブタの作出方法：
（ａ）第VIII因子遺伝子のエキソン１６を標的としたターゲティングベクターを作製する工程；
（ｂ）胎児線維芽細胞に、工程（ａ）で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程；
（ｃ）採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で除核された卵子に、工程（ｃ）で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程；
や、（４）Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を評価することを特徴とする血友病の予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。
【００１２】
さらに、本発明は（５）ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体や、（６）ヒト第VIII因子により、Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタを免疫し、ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体を調製することを特徴とする抗第VIII因子抗体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
ヒトに近い病態モデルが作製されれば、遺伝子治療研究だけでなく、新規治療法や新規製剤開発、インヒビター治療研究に絶大な貢献をもたらし、血友病Ａ患者の望む治癒へ向けた治療研究が加速すると期待される。本発明によると、自然出血症状を呈する血友病Ａモデルブタを提供することができる。また、本発明の血友病Ａモデルブタに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を比較・評価することにより、血友病の予防・治療剤をスクリーニングすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ブタＦVIII遺伝子エキソン１４-エキソン２２制限酵素地図（Ｆ８）と遺伝子ターゲッティングベクター（Ｆ８−ＧＴＶ）を示す図である。ブタＦVIII遺伝子のエキソンは黒で示し、ＰＧＫ（phosphoglycerate kinase）プロモーターで発現させるネオマイシン耐性遺伝子ｃＤＮＡは斜線（右上から左下）で示している。ＨＳＶ−ＴＫ（Herpes simplex virus thymidine kinase）自殺遺伝子ｃＤＮＡは斜線（左上から右下）で示した。サザンブロットで用いたプローブの位置は二重下線で示した位置である。ＰＣＲスクリーニングで用いたプライマーの位置は鉤矢印で示した。また、制限酵素認識部位を矢印で示した。Ｆ８−ＧＴＶにおいてＮｅｏ下流のエキソン１６は１６塩基欠如させている。
【図２】薬剤耐性コロニーのＰＣＲスクリーニングの結果を示す図である。エキソン１４−１８で＃１３４は野生型と同様のバンドと共に長いバンドが確認された。Ｎｅｏ−エキソン２２により＃１３４はＮｅｏの挿入が示された。継代した３ウェルについてもエキソン１４−１８において２本のバンドが確認できる。Ｎｅｏの挿入がエキソン１４−Ｎｅｏ、Ｎｅｏ−エキソン２２、エキソン１４−１８のStuIの切断によっても示された。Ｃ；野生型ブタゲノムＤＮＡ
【図３】＃１３４細胞核移植由来クローンブタ胎仔ゲノムＤＮＡの解析結果を示す図である。Ａ）ＰＣＲによる解析：エキソン１４−１８のＰＣＲにおいてＮＴはＣに比べてＮｅｏの挿入とみられる長いバンドのみが認められた。Ｎｅｏ−エキソン２２、エキソン１４−ＮｅｏではＮＴにのみバンドが検出された。Ｂ）エキソン１４プローブを用いたサザンブロット：SacIはエキソン１４、イントロン１８に存在するため、Ｃ（野生型ブタゲノムＤＮＡ）において７．７ｋｂのバンドが検出され、ＮＴ（＃１３４細胞核移植由来ブタ胎仔ゲノムＤＮＡ）ではＮｅｏが挿入されたため、９．５ｋｂにバンドがシフトしている。StuIはＮｅｏにのみ存在するので、SacI＋StuIではＮＴは７ｋｂにバンドがシフトした。Ｃ）エキソン２２プローブを用いたサザンブロット：EcoRIはＮｅｏの３’に存在するため、ＮＴでは僅かにバンドのシフトが認められる。SphIは５’−アームとＮｅｏに、XbaIはＮｅｏにのみ存在するのでＮＴにおいて減少するバンドのシフトが認められる。
【図４】ＦVIII−ＫＯブタ新生仔の解剖像の写真である。Ａ）ＦVIII−ＫＯブタ＃１：全身に多くの内出血箇所が認められる。Ｂ）ＦVIII−ＫＯブタ＃１の臓器所見：臓器には異常は認められない。Ｃ）ＦVIII−ＫＯブタ＃１の内出血部位切開：内出血部位には血腫が認められた。Ｄ）ＦVIII−ＫＯブタ＃２の頭蓋内切開と臓器所見：頭蓋内には出血は認められず、皮下には出血が認められた。臓器に異常は認められない。
【図５】５ブタ血漿中ＦVIIIの解析結果を示す図である。Ａ）ブタ血漿におけるＦVIII抗原の検出：ブタ血漿ではＦVIIIの検出はされなかった。ヒト血漿との混和（ブタ血漿／ヒト血漿：５０／５０、３０／５０、２０／５０、１０／５０、５／５０、３／５０、２／５０、１／５０、０／５０）においてヒトＦVIIIの検出はほぼ変化なく検出可能であった。Ｂ）ブタ血漿におけるＡＰＰＴとＦVIII活性：ヒト血漿を１００％とした場合、ブタ血漿は約３〜３．５倍のＦVIII比活性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の血友病Ａモデルブタとしては、Ｘ染色体上のＦVIII遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＦVIIIを発現する機能が失われたブタであれば特に制限されず、より具体的には雄ヘミ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｙ）や雌ホモ接合体（ＦVIII：Ｘ−／Ｘ−）を例示することができるが、これらの中でも自発性の出血症状を呈する血友病モデルブタを好適に例示することができる。上記雌ホモ接合体は、雌ヘテロ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｘ＋）と雄ヘミ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｙ）を掛け合わせると、２５％の産生比率で出生する。
【００１６】
上記血友病モデルブタは、（ａ）ＦVIII遺伝子のエキソン１６を標的としたターゲティングベクターを作製する工程；（ｂ）胎児線維芽細胞に、工程（ａ）で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程；（ｃ）採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程；（ｄ）工程（ｃ）で除核された卵子に、工程（ｃ）で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程；（ｅ）工程（ｄ）で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程；の各工程を備えたＦVIIIノックアウトブタの作出方法により得ることができる。
【００１７】
上記工程（ａ）における血友病モデルブタの作出に用いられるターゲティングベクターとしては、相同組換えによりＦVIII遺伝子を破壊し、ＦVIII遺伝子機能を欠失させうるもので、ＦVIIIをコードする遺伝子中のエキソン１６を含む領域が改変されたポリヌクレオチドを含有し、かつ該ポリヌクレオチドが、ＦVIIIの生理活性を欠損した産物を生じるものを挙げることができ、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞をスクリーニングしやすくするために、エキソン１６の中にネオマイシン耐性遺伝子（ＰＧＫ−Ｎｅｏ）等の抗生物質耐性遺伝子やβガラクトシダーゼ遺伝子等の陽性選択マーカーを挿入させることができる他、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）遺伝子等の陰性選択マーカーを有するベクターが好ましい。
【００１８】
上記工程（ｂ）において、胎児線維芽細胞におけるターゲティングベクターによるＦVIIIをコードする遺伝子の相同組換えは、ターゲティングベクターをブタ胎児線維芽細胞に導入することにより達成される。ターゲティングベクターを胎児線維芽細胞に導入する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等を挙げることができる。ターゲティングベクター導入後の胎児線維芽細胞を、細胞内での相同組換えが起こっているかを確認するためのサザンブロッティング法やＰＣＲ法等の常法によりスクリーニングすることにより、ＦVIIIをコードする遺伝子が欠損した胎児線維芽細胞（遺伝子組換え細胞）が得られる。上記胎児線維芽細胞はトリプシン処理で細胞を分散させたものが好ましく、また、培養細胞が線維芽細胞であることを、サイトケラチンとＳＳＥＡ−１との陰性反応、ビメンチンでの陽性反応、線維芽細胞の特異的プライマーによるＰＣＲ分析等により確認することが好ましい。また、レシピエントや仮親と毛色の異なる品種のブタの線維芽細胞を核移植用ドナーとすると、毛色からノックアウトブタであるかどうかを簡便に判定することができる。
【００１９】
また、核移植に用いるドナー線維芽細胞の細胞周期は特に制限されるものではないが、細胞周期Ｇ0／Ｇ01期に同調させた細胞が好ましい。細胞周期Ｇ0／Ｇ01期に同調させた細胞は、例えばコンフルエントな状態で培養液の交換なしに、線維芽細胞を１６日間前後培養し続けることによって得ることができる。
【００２０】
上記工程（ｃ）におけるブタの卵子（レシピエント卵子）としては、ブタの成熟卵子であれば特に制限されるものではなく、ＰＧＦ２α、ＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール、ｅＣＧ等のホルモン投与による過排卵処理により得られる体内成熟卵子の他、屠場由来の卵巣から採取した卵子を体外成熟させたものも使用できるが、着床率の点からして体内成熟卵子、特に性成熟した雌ブタ、例えば生後１６０〜１９４日齢の春期発動前の雌ブタから採取した体内成熟卵子が好ましい。かかる体内成熟卵子は、過排卵処理により得られる雌ブタの子宮及び卵巣を、ＰＢＳ溶液等を用いて卵管灌流を行うことにより採取することができるが、卵丘細胞が付着している卵子はヒアルロニダーゼ処理を行って、卵丘細胞を除去することが好ましい。
【００２１】
上記ブタのレシピエント卵子からの除核は、細胞骨格形成阻害剤であるサイトカラシンＢ処理を施したブタの卵子から除核することが好ましく、より具体的にはサイトカラシンＢを含有するＰＺＭ３液、ＮＣＳＵ２３等の培地で体外成熟卵子等のレシピエント卵子を処理した後、除核操作用シャーレのサイトカラシン入りドロップに移してホールディングピペットで保定し、透明帯を迅速・的確に貫通することができる除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ）を用いて、Ｍ（metaphase）II期の染色体を含む第一極体の付近を極体ごと吸引することにより行われる。なお、吸引した極体を調べることにより除核できていることを確認することが好ましく、また除核卵子からはサイトカラシンＢを除去することが好ましい。
【００２２】
上記工程（ｄ）において、除核された卵子にブタ胎児遺伝子組換え線維芽細胞核を注入する方法としては、ブタ胎児遺伝子組換え線維芽細胞の核を除核されたレシピエント卵母細胞に直接注入（インジェクション）する方法を特に好適に例示することができる。かかる核の直接注入には、例えば、プライムテック株式会社製のＰＭＭ三次元マイクロマニピュレーションシステムを用いることができる。特に、インジェクションピペットとしては、透明帯の貫通が迅速・精確かつ簡単にでき、細胞質膜へのダメージを最小にすることができるものが好ましく、かかるインジェクションピペットとしてはピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた体細胞注入用ピペット（外径２５〜３０μｍ、先端を３０〜４５度の角度で研磨）を具体的に例示することができる。
【００２３】
かかる工程（ｄ）において体細胞核が注入された卵子には、上記工程（ｅ）において活性化処理を施すことが好ましい。かかる活性化処理としては、従来公知の核移植胚の活性化処理方法であれば特に制限されるものではないが、電気パルス活性化処理を好適に例示することができる。電気パルス活性化処理としては、電荷の大きい１回の電気パルス、例えば１．５ｋＶ／ｃｍ、１００μｓｅｃ、１回を印加する方がそれより小さい電荷の電気パルスを２回印加するよりも胚活性の点で好ましく、また、電気パルス活性化処理における培地としてはＮＣＳＵ２３（J.Reprod.Fertil.Suppl.,48,61,1993）を用いることが高い胚盤胞形成率の点で好ましい。また、電気パルスによる活性化処理の場合、体内成熟卵子の方が体外成熟卵子に比べて胚盤胞の発生能の点で好ましい。さらに、レシピエント細胞として体内成熟卵子を用いる場合には、過排卵処理のために使用した最初のｈＣＧ投与後、５０〜６０時間後、好ましくは５４〜５５時間後に活性化処理をすることが望ましい。
【００２４】
また、卵細胞からの除核時及び該除核細胞への体細胞核の直接注入時の２回にわたって損傷を受けた核移植胚の胚盤胞への発生率を高め、クローンブタを効率よく作出するために、活性化処理後の核移植胚は、卵管又は子宮への移植前に、包埋剤により包埋処理を施すこともできる。かかる包埋剤による包埋処理は、複数回の包埋処理を行い、複数被膜で包埋した核移植胚とすることが好ましく、特に３重包埋処理を行い、３重被膜核移植胚とすることが好ましい。また、かかる複数回の包埋処理を行うに際しては、包埋剤の濃度を順次高めていく包埋処理、すなわち外層膜ほど高濃度の包埋剤を用いて包埋し、その物理的強度を内層から外層へと順次高めていくことが好ましい。
【００２５】
包埋処理に用いられる包埋剤としては、核移植胚を包埋することにより、２回にわたって損傷を受けた核移植胚の桑実胚や胚盤胞への発生率を高め、クローンブタを効率よく作出することができるものであれば特に制限されるものではないが、損傷を受けた透明帯の修復・保護機能を有するものや、包埋処理後の核移植胚を卵管及び子宮に移植した後、生体内での分解機能を有するものや、卵管及び子宮の膜運動による損耗からの保護機能を有するものや、白血球の攻撃からの防御機能を有するものや、包埋皮膜を通しての栄養分の透過・排泄物の排出機能を有するものの他、包埋処理時に核移植胚に影響を与えることなく包埋処理することができるものや、顕微鏡下で包埋皮膜が確認しやすいものや、顕微鏡下で包埋胚の操作がし易くなるものなどが好ましい。かかる包埋剤としては、アルギン酸、寒天等の天然多糖類の他、ムコタンパク質、ポリアミノ酸などの蛋白質、生分解性有機高分子等を例示することができるが、上記包埋剤としての好ましい機能を備えたアルギン酸が特に好ましい。その他、包埋剤の使用濃度についても特に制限されるものではないが、上記包埋剤としての好ましい機能を十分発揮しうる濃度が好ましい。なお、複数回の包埋処理を行う場合、例えばアルギン酸と寒天等、包埋剤の種類を変えて包埋処理をすることもできる。
【００２６】
例えば、アルギン酸を包埋剤として３重包埋処理する方法としては、アルギン酸ナトリウムを所定濃度（例えば０．５％、１．５％、２．０％）となるようにリンゲル液等に溶解し、あらかじめ滅菌しておき、この滅菌済みのアルギン酸ナトリウム溶液（例えば０．５％）に核移植胚を浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル包埋胚とした後、この包埋胚を前記アルギン酸ナトリウム溶液よりも高濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば１．５％）に浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル２重包埋胚とし、次いでこの２重包埋胚を上記アルギン酸ナトリウム溶液よりも高濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば２．０％）に浸漬して十分馴染ませた後、塩化カルシウム液等のカルシウムイオン含有液と接触させ、アルギン酸ゲル３重包埋核移植胚とする方法を具体的に示すことができる。
【００２７】
活性化処理後に、必要に応じて包埋剤による包埋処理をした核移植胚を、卵管又は子宮に移植する雌ブタとしては特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠２１〜４０日目にプロスタグランジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った雌ブタを用いることが好ましい。また、核移植胚を雌ブタの卵管又は子宮に移植するに際し、複数個の受精卵を核移植胚に混合して雌ブタの卵管又は子宮に移植する追い移植法を用いることが好ましい。
【００２８】
また産仔したブタが、ＦVIIIノックアウトブタであることの確認は、産仔の毛色の他、ＦVIIIノックアウトクローンブタ、ＦVIIIノックアウトクローンブタの仮親の耳から採取したＤＮＡ並びにＦVIIIノックアウトクローンブタを作出するために用いた線維芽細胞のＤＮＡを採取し、ＰＣＲを行い、ＦVIIIノックアウトクローンブタが線維芽細胞と同一の遺伝子をもち、ＦVIII遺伝子が破壊され、自然出血症状を呈するかどうかを確認することにより同定することができる。
【００２９】
核移植用ドナーとして雄の胎児線維芽細胞を用いたときには雄ヘミ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｙ）からなる血友病モデルブタを作出することができるが、雌の胎児線維芽細胞を用いたときには血友病症状を呈さない雌ヘテロ接合体ブタ（ＦVIII：Ｘ−／Ｘ＋）が得られる。この場合、雄ヘミ接合体ブタと雌ヘテロ接合体ブタを掛け合わせると、血友病症状を呈する２５％の雌ホモ接合体、２５％の雌ヘテロ接合体、血友病症状を呈する２５％の雄ヘミ接合体ブタ、２５％の雄の正常ブタの出生割合で産仔が得られる。前記非特許文献２によると、雄ヘミ接合体マウスで約１１％、雌ホモ接合体マウスで約７％が自発性の出血症状を呈するに過ぎず、８〜１０週を経過したＦVIIIＫＯマウスでは、尾を切断したり、尾を火傷させた場合でも全マウスが生存すると報告されているが、本発明によると、雄ヘミ接合体ブタで１００％自発性の出血症状を呈し、５週を経過した後でも自然出血症状を維持していた。
【００３０】
本発明はまた、本発明の血友病モデルブタに由来する臓器、組織又は細胞に関し、かかる臓器、組織又は細胞は、血友病モデルブタと同様に、血友病の予防・治療剤のスクリーニングに有利に用いることができる。また、臓器、組織または生殖細胞を含む細胞を用いることで、後代を含む個体作出に利用できる。
【００３１】
本発明の血友病の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、上記本発明の血友病モデルブタ（ＦVIIIノックアウトブタ）をに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を、被検物質を投与しない場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、上記血液凝固機能の程度とは、自然出血や怪我等の外因性要因による出血の症状の止血の程度や止血の持続期間の程度をいい、血液凝固機能の程度を既存の血友病の予防・治療剤と比較・評価することができる。上記被検物質としては、ＦVIII遺伝子やその一部、又はＦVIII遺伝子改変体が組み込まれたＤＮＡベクター、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus：ＡＡＶ）ベクター、組換えレンチウイルス（lentivirus）ベクター、組換えアデノウイルス（adeno virus）ベクター、ネイキッドＤＮＡベクター等を好適に例示することができる。本発明は、上記本発明のスクリーニング方法により得られた血友病Ａの予防・治療剤をも包含する。
【００３２】
本発明の抗ＦVIII抗体としては、ヒトＦVIIIとブタＦVIIIとに交差反応性を有する抗体であれば特に制限されず、抗ＦVIIIモノクローナル抗体が好ましい。本発明の抗ＦVIII抗体は、ヒトＦVIIIでＦVIIIノックアウトブタを免疫することにより調製することができる。かかる本発明のヒトＦVIIIとブタＦVIIIとに交差反応性を有する抗体は、ＦVIIIインヒビターである抗ＦVIII抗体を無力化あるいは回避する血友病の予防・治療剤のスクリーニングに使用することができる。
【実施例１】
【００３３】
［ＦVIII遺伝子ＫＯクローンブタの作出］
１．ＦVIII遺伝子ターゲティングベクターの作製（ベクター名：Ｆ８−ＧＴＶ）
胎齢６５日目の雄ブタ胎仔線維芽細胞からDNAzol（Invitrogen社製）を用いてブタゲノムＤＮＡを分離し、このゲノムＤＮＡからＦVIII遺伝子のエキソン１６を標的とするベクターを構築した。Sus scrofa coagulation factor VIII cDNA sequence（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ；ＮＭ＿２１４１６７）をもとにプライマーを作製し（表１）、エキソン１４からエキソン２１までと、エキソン１６からエキソン２２までをExpand Long Template PCR System（Roche Diagnostics社製）を用いたＰＣＲにて増幅させ、pCR2.1-TOPO Cloning Kit（Invitrogen社製）またはpCRBluntII-TOPO Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いてクローニング後、ABI PRISM Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）によるＤＮＡ塩基配列決定と、エキソン部位とｃＤＮＡ配列とを照合した。さらにイントロン１４部位におけるXhoI認識配列を付加したプライマー（表１）とエキソン２１プライマーのＰＣＲによりクローニングしたイントロン１４−エキソン２１をエキソン１６内にあるXhoIで処理したイントロン１４−エキソン１６の５’−アームを、エキソン１６プライマーとイントロン２１部位におけるXbaI認識配列を付加したプライマー（表１）によりエキソン１６−イントロン２１の３’−アームをクローニングし、pBS-HSVTK-PGKNeo（京都大学ウイルス研究所 生田宏一教授からの供与）のXhoIとXbaI部位へ組み込み、エキソン１６の中にＰＧＫ−Ｎｅｏを挿入させ、５’−アーム上流に自殺遺伝子であるＨＳＶ−ＴＫを配したＦVIII遺伝子ターゲティングベクターを作製した。エレクトロポレーションに用いるため、NotI（TOYOBO社製）の消化により線状化し、フェノール／クロロフォルムによる精製後、ＨＢＳ（HEPEs Buffered Saline）で２５ｎＭの濃度に希釈した。
【００３４】
【表１】
【００３５】
２．制限酵素地図の作成
５’−アームあるいは３’−アームをクローニングしたプラスミドを任意の制限酵素にて３７℃、２時間処理後、アガロース電気泳動とエチジウムブロマイド染色にて消化バンドを確認し、ＤＮＡ塩基配列決定した配列の制限酵素認識部位を照合させ、制限酵素地図を作成した。
【００３６】
３．胎児線維芽細胞の採取
ランドレース♀×大ヨークシャー♂で交配後、妊娠６５もしくは７２日目の胎児を採取した。採取した胎児は、ハサミで筋肉組織を採取し、細切した。細切した胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌの０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液に懸濁し、一晩冷蔵した（４℃）。遠心処理（１５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により上清を除去した後、３７℃に保温したウォーターバスにて２０−３０分間処理した。保温処理後、胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加えてピペッティングし、セルストイレーナーにて濾過した。濾過液を遠心後、上清を除去し、沈殿物に１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを添加して再懸濁した。細胞数を計測し、適当量になるようＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて調整した後、７５ｃｍ２細胞培養用フラスコに播いた。その播いた細胞は、３７℃で５％ＣＯ２でコンフルエントになるまで培養し、以下のエレクトロポレーションによる遺伝子導入に用いた。
【００３７】
４．遺伝子導入とＧ４１８薬剤選択（ＦVIII遺伝子ＫＯ細胞の作出）
分離および増殖した胎児線維芽細胞は、０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液で剥離させ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて懸濁した。細胞懸濁液を遠心処理（１５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した後、上清を除去し、冷ＨＢＳに再懸濁した。再懸濁液は、再度遠心処理を行って上清を除去した。細胞数が２．５×１０７細胞／ｍｌになるようにＨＢＳにて調整した。キュベットに細胞溶液０．４ｍｌ（１．０×１０７細胞／ｍｌ）と１００μｌの調整済みＤＮＡ液（２５ｎＭの直線化したターゲッティングベクターを添加、図１．）を加えた後、良く混和した。遺伝子導入には、電気穿孔法装置を３００Ｖ、９５０μＦ、抵抗∞の条件のパルスにて行った。パルス付加後、１０分間室温にて静置した。静置した細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに懸濁後、３枚の１０ｃｍシャーレに分けて培養した。パルス後４８時間目に８００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）および２μＭガンシクロビア（Denosine；Mitsubishi Tanabe Pharma社製）を培養液に添加し、耐性細胞株を７−１２日間選択培養した。薬剤選択後、ＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Invitrogen社製）をしみ込ませたペーパーディスク（ADVANTEC社製）を細胞コロニーに乗せ、３７℃で３分インキュベーションした後、培地を入れておいた２４ウェル-プレート（Corning社製）へ１枚／ウェルとなるように継代した。培養５−６日目にフルコンフルエントになった各コロニーは１／６ずつ２４ウェル−プレートの３ウェルに継代し、１／２の細胞についてゲノムＤＮＡを抽出し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え体についてスクリーニングした。同様に継代した３ウェルについてもフルコンフルエントにした後に細胞継代とゲノムＤＮＡを抽出し、確認のＰＣＲスクリーニングをした。ＰＣＲスクリーニングで陽性の結果が出たコロニーは、そのまま培養を継続し、核移植に供した。
【００３８】
５．ＰＣＲ解析によるターゲッティングの検出
ＰＣＲスクリーニングはエキソン１４とエキソン１８に設置したプライマー（表２）を用いたＰＣＲによりＦVIII遺伝子組み換え体コロニーを特定し、Ｎｅｏに設置したプライマー（表２）とのＰＣＲにより確認した。また、Ｎｅｏ遺伝子の挿入を確かめるため、エキソン１４―１８のＰＣＲで得られたバンドをＮｅｏ遺伝子に存在するStuIの消化により確認した。ＦVIII遺伝子組換え体コロニーはＧ０期へ以降するまで増殖させ、核移植に使用した。核移植・胚移植由来の雄ブタ胎仔ゲノムについても同様のＰＣＲにより解析した。細胞は、２００ｇ／ｍｌのプロテナーゼＫが含む５０μｌの超純水に再懸濁し、５５℃で３時間保温した後、９５℃１０分間加熱してプロテナーゼを失活させた。ＰＣＲ分析は、Roche社製Expand Long Template PCR Systemを用いた。２５μｌ量の反応液中に消化した５０μｌのサンプルから鋳型として１μｌ（３０〜５００ｎｇ／μｌ）を用いた。ＰＣＲサイクルのパラメーターは、最初に９４℃を２分間、次に９４℃を１０秒、６８℃を６分の１サイクルを１０サイクル、９４℃を１５秒、６８℃を６分の１サイクルにおいて６８℃については、１サイクル毎に２０秒間増加させ２５サイクル後、６８℃を７分間処理した。プライマーはＦ８エキソン１４Ｆ（５’−ＣＡＴＣＡＧＡＧＧＧＡＣＡＴＡＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣ−３’）およびＦ８エキソン１８Ｒ（５’−ＧＣＣＡＧＧＧＡＧＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＡＧ−３’）を用いた。このプライマーは、８ｋｂの変異アレル特異的な産物を設定した。精製したＤＮＡに対するＰＣＲは、鋳型として１００ｎｇの精製ＤＮＡを使用した点を除いて同様に実施した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
６．ホルモン処理による採卵方法
ランドレース（Ｌ）およびランドレース、大ヨークシャー（Ｗ）、デュロック（Ｄ）の三元交雑種（ＬＷＤ）の生後１６０〜１９４日齢の春期発動前の雌ブタを用いた。供試ブタにｅＣＧ（ピーメックス、三共）を１５００ＩＵ投与し、その７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４８時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。また、性成熟に達した雌豚からの採卵は、予め発情時に雄希釈精液を用いて人工授精を行い、妊娠２１−５０日後に流産処置し行った。核移植予定５日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート：２ｍｌ量、武田製薬社製）を臀部筋肉内に投与した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共製薬社製）を臀部筋肉内に１５００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共製薬社製）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４６時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。
【００４１】
７．体内成熟卵子の準備
摘出した卵巣、卵管、子宮の結合組織を直ちに実験室に持ち帰り、灌流液（ＰＢＳ：Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含、（TAKARA社製）＋０．１％ウシ血清アルブミン：ＢＳＡ（Sigma社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−４５０３）＋１００ｍｌあたり１ｍｌ添加抗生物質：Antibiotic,Antimycotic（Sigma社製、Ａ−７２９２）で卵管を灌流し、卵子を採取した。得られた卵子は０．１％ヒアルロニダーゼを含む、灌流液を用いて卵丘細胞を裸化し、卵細胞質の均一な卵子を選抜した後、ヒアルロニダーゼを含まない灌流液中で洗浄した。その後、ＰＺＭ−３液（Biol Reprod. 66:112-119. 2002）を用いてインキュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２）内で供試するまで体外培養を行った。
【００４２】
８．屠場卵巣由来卵胞卵子の採卵方法
屠場にて食肉用として屠殺された春機発動前の未経産雌ブタより卵巣を採取し、ＰＢＳ（−）液にて３５℃保温下で研究室に持ち帰った。持ち帰った卵巣は直ちに、３７℃に保温したＰＢＳ（−）にて洗浄し、卵巣結合組織を除去した後、採卵作業を行った。直径３−６ｍｍの卵胞を選び、１６Ｇ注射針付き１０ｍｌシリンジで吸引した。吸引した卵胞液は、５０ｍｌディスポチューブに回収し、５分以上室温放置後、上清を除去した。卵子が含まれる沈殿物に対し、ＴＡＬＰ−Ｈｅｐｅｓ液を加えて懸濁後、沈殿物がチューブの底に溜まったのを確認し、沈殿物を吸引しないよう、パスツールピペットにて上清を除去した。この洗浄操作を２−３回繰り返した。卵丘細胞が３層以上密に付着した卵丘細胞卵子複合体（ＣＯＣ）とＣＯＣに壁側顆粒層細胞が付着した壁側顆粒層細胞−卵丘細胞卵子複合体（ＧＣＯＣ）を選別・採卵をした。
【００４３】
９．体外成熟培養
採取したＣＯＣおよびＧＣＯＣは、約１５〜２０個／穴で改変ＮＣＳＵ３７を１００μｌ分注し、１００μｌ流動パラフィンオイルカバーした６穴ディッシュを用いて成熟培養した。改変ＮＣＳＵ−３７は、１０％ブタ卵胞液、０．６ｍＭシステイン、５０μＭ βメルカプトエタノール、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍｌ ＰＭＳＧ（ピーメックス；１０００ＩＵ三共製薬社製）、１０ＩＵ／ｍｌ ｈＣＧ（プペローゲン；１５００ＩＵ、三共製薬社製）を添加して作製した。２０〜２２時間まで培養後、ホルモン及びジブチリルｃＡＭＰ無添加改変ＮＣＳＵ３７に移して供試時まで培養した。成熟培養は３９℃、気相条件は、ＣＯ２５％、Ｏ２５％、Ｎ２９０％の条件で実施した。成熟培養時間は、４２−４４時間で行い、成熟卵子（第一極体放出卵子）のみを試験に使用した。
【００４４】
１０．卵子核の除去操作（除核操作）
除核操作前に、屠殺採卵した未受精卵子を、サイトカラシンＢ（Sigma社製：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ−６７６２）が５μｇ／ｍｌ濃度含むＰＺＭ３液に移し、１５分間以上処理した。除核操作も同濃度のサイトカラシンＢが含まれるＰＺＭ３液で作製したドロップ内（１０ｃｍプラスチックシャーレの中心付近に５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）で行った。卵子は、第一極体が、１２時から３時方向の位置になるようにホールディングピペットで保定した。ピエゾマイクロマニピュレーター（プライムテック株式会社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５〜３０μｍ、先端を３０〜４５度の角度で研磨）により、第一極体ごと細胞質を１／４〜１／３量程吸引した。除核用ピペットの操作性が悪くなった場合は、２０％ＰＶＰ液（Sigma社製：Ｃａｔ．Ｎｏ．ＰＶＰ−３６０）ドロップにて、吸引・排出を繰り返し、洗浄を行った。除核操作終了後、直ちにサイトカラシンＢが含まれないＰＺＭ３液に移し、洗浄を行う。洗浄には、ＰＺＭ３液が３ｍｌ入った３５ｍｍディッシュ（Falcon社製、１００８）で２回以上、丁寧に洗浄し、サイトカラシンＢを除去した。その後、注入操作まで、ＰＺＭ３液ドロップ（３５ｍｍディッシュ：Falcon社製、３００１に１００μｌのドロップを作製し、４ｍｌミネラルオイルで被った）に移し、インキュベーター内で培養した。
【００４５】
１１．ドナー組換え体細胞の準備
ＰＣＲ解析によりＦVIII遺伝子がノックアウトされていると判定した雄胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。培養液にはＤＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳを用い、植え継ぎ回数は０〜５回の細胞を用いた。核移植予定日に合わせて、植え継ぎを行った後、コンフルエント状態から培養液の交換を行わず、３〜１４日間放置し、細胞周期をＧ１／Ｇ０期に同調した。核移植に用いる約１時間前にドナー体細胞の準備を行った。細胞処理は、培養容器の培養液を除去した後に、ＰＢＳ（−）にて３回以上洗浄を行い、０．２５％トリプシン＋０．０４％ＥＤＴＡ-２Ｎａ液にて細胞剥離処理を行った。剥離した細胞に１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを加えて懸濁した後、遠心処理（１，５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、室温）を行った。遠心処理後、上清を除去し、ＰＺＭ３液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に、適当な細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに添加して使用した。
【００４６】
１２．体細胞核の注入操作
注入用チャンバー（１０ｃｍシャーレにＰＺＭ３液５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）のドロップに適量のドナー細胞を添加し、除核済み卵子５０〜１００個を入れて操作した。注入操作には、ピエゾマイクロマニュピレーターに体細胞核注入用ピペット（外径７−１０μｍ、鈍端）を用いた。注入用ピペットをピエゾマイクロマニュピレーターに取り付ける前に、ピペット後端より５ｍｍの位置にフロリナートを３−５ｍｍ幅になるように、充填して使用した。そのピペットをピエゾに取り付けて使用する時は、先端より培養液、フロリナート、空気、ミネラルオイルの順で満たされている状態にして操作した。注入操作を行う前に、必ず２０％ＰＶＰ液ドロップ内で注入用ピペットを洗浄（ピペッティングやＰＶＰドロップへのピペット先端の出し入れ）した。浮遊している体細胞を吸引し、数回ピペッティングを行い、細胞膜を壊し、ホールディングピペットにて保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した。体細胞核を注入した卵子は、活性化処理時間までインキュベーターで培養を行った（１〜３時間）。
【００４７】
１３．卵子の活性化処理
体細胞核を注入した卵子の活性化処理は直流パルス刺激（ＳＳＨ−２、島津製作所製）を、１．５ｋＶ／ｃｍ １００μｓｅｃ×１回の条件にて行った。チャンバーには２ｍｍ幅のステンレスワイヤー電極を用い、電気刺激用の電解質溶液には０．０５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４ならびに０．０２％ＢＳＡを含む０．２８Ｍマンニトール溶液を用いた。
【００４８】
１４．活性化卵子の第２極体放出抑制処理
活性化処理卵子は５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（Sigma社製：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ−６７６２）を含むＰＺＭ３液で２時間培養し、第２極体の放出を抑制させる処理を行った。
【００４９】
１５．活性化卵子の体外培養
活性化後２倍体処理をした卵子は、ＰＺＭ３液にて体外培養を行い、活性化処理後２日目に分割胚のみ胚移植に用いた。
【００５０】
１６．ホルモン処理による仮腹の同期化と胚移植方法
仮腹の同期化は妊娠豚を人工流産処置することで行った。また、仮腹の発情は、採卵豚のものより、１日遅れるように発情同期化処置を行った。供試予定の雌ブタは、発情時に、雄豚希釈精液を用いて人工授精を行い妊娠させた。妊娠後２１−５０日目の妊娠豚を用いた。核移植予定６日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート、武田製薬社製：２ｍｌ量）を臀部に注射した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共製薬社製）を１０００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共製薬社製）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与、約６８時間目に仮腹へケタラール投与後、ハロセン麻酔下で外科的に胚移植手術を行った。胚移植はＰＰカテーテル（フジヒラ社製）を卵管へ挿入して行った。
【００５１】
１７．組み換えクローン胎児の採取および細胞分離作業
同定したＰＣＲ陽性コロニーは、非相同組換え細胞が、様々な割合で含まれている可能性があり、体細胞核移植技術を用いた効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなりうることが予想された。そこで、単一な相同組換え細胞のみの集団を得るため、妊娠した雌ブタの３２日目もしくは３９日目に胎児を採取した。採取した胎児は、３．と同様に細胞を分離すると同時にゲノムＤＮＡを採取し、相同組み換え個体であるか５．と同様の条件でＰＣＲ解析した。ＰＣＲ解析にて陽性であった胎児細胞を用いて再核移植を実施し、胚移植によりＦVIIIノックアウトクローン個体の作出に供した。
【００５２】
１８．サザンブロット解析
核移植・胚移植により発生した雄ブタ胎仔線維芽細胞から抽出したゲノムＤＮＡを用いてＦVIII遺伝子の組換えをサザンブロットにて確認した。５ｍｇのゲノムＤＮＡを制限酵素SacI、StuI、EcoRI、SphI、あるいはXbaIで切断し、アガロース電気泳動後、アルカリトランスファー条件によるサザンブロッティングを実施した。バンドの検出はDIG PCR Labeling Kit（Roche社製）にてエキソン１４またはエキソン２２のＤＩＧラベルプローブを、エキソンプライマー（表３）を用いたＰＣＲにより作製し、DIG Easy Hyb（Roche社製）にてハイブリダイゼーション、DIG Detection Kit（Roche社製）により検出した。
【００５３】
【表３】
【００５４】
１９．ブタ血漿の解析
血液と３．８％クエン酸ナトリウム溶液（Harasawa Pharmaceutical社製）を１／１０となるようにブタから採血し、３０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により血漿を分離した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）をCA500（Sysmex社製） にて測定し、ヒトＦVIIIに対する抗体Sheep anti-human FVIII Antibody（Affinity Biologicals Inc.社製）とRabbit Anti-human FVIII（研究室で作製したポリクローナル抗体）、Goat anti-Rabbit IgG-HRP（BioSourse社製）を用いたＥＬＩＳＡにより、ＦVIIIの検出を検討した。ヒト正常血漿（健常者ボランティアによる）においてＡＰＴＴのスタンダードを作製し、ヒト血漿ＦVIII活性を１００％としてブタ血漿ＦVIII活性を算出した。ＥＬＩＳＡでは、ブタ血漿とヒト血漿、それらの混和（ブタ／ヒト：１／１〜１／５０）をサンプルとし、Benchmark plus（Bio-Rad Laboratories社製）にて吸光度４１５ｎｍを測定し、ＡＢＴＳ（Kirkegaard＆Perry Laboratories社製）の発色によりＦVIIIを検出した。
【００５５】
２０．誕生したクローンブタのＰＣＲ判定
誕生したクローンブタから採取可能な組織（耳、臍帯組織）や血液等からＤＮＡを抽出し、前記５．「ＰＣＲ解析によるターゲッティングの検出」に準じてＰＣＲ解析を行った。
【００５６】
（ＦVIII遺伝子ターゲッティングベクター）
ブタの全ゲノムＤＮＡ配列が解読・公開されていないため、現時点で公開されているブタ肝臓からクローニングされたＦVIII ｃＤＮＡ配列をヒトＦVIII ｃＤＮＡ配列との相同性によりエキソン部位を予測、ＰＣＲにより増幅・クローニングすることで遺伝子発現を欠損させるためのターゲッティングベクターを構築し、配列を解読した。ｃＤＮＡ配列とクローニングしたゲノムＤＮＡ配列の照合によってエキソン部位が特定された。
また、種々の制限酵素処理によってクローニングしたゲノムＤＮＡ領域の制限酵素地図を作製した（図１参照）。
【００５７】
（ＦVIII遺伝子組換えブタ胎仔線維芽細胞の作出）
ＦVIII遺伝子ターゲティングベクターの導入と薬剤選択によって得られた９３６コロニーのうち増殖可能であった２００コロニーをＰＣＲスクリーニングした。遺伝子導入の回数と薬剤耐性コロニー数、増殖コロニー数、ＦVIII遺伝子組換え型コロニー数を表４に示す。エキソン１４−１８において、遺伝子組換え型ではエキソン１６へのＮｅｏの挿入により遺伝子増幅部位が長くなることを検証したところ、野生型と遺伝子組換え型の両方にバンドが出るコロニー＃１３４が１つ得られた（図２）。コロニー＃１３４におけるＮｅｏの挿入はＰＣＲ（エキソン１４−Ｎｅｏ、Ｎｅｏ-エキソン２２）とエキソン１４-１８のＰＣＲ後のＳｔｕＩの切断により陽性と確認された（図２）。さらに継代した３ウェルについても同様の結果が得られた（図２）。よって、得られたコロニー＃１３４は野生型細胞とエキソン１６にＮｅｏが挿入されたＦVIII遺伝子組換え細胞とを含む細胞集団であると考えられた。このコロニー＃１３４を核移植に用いた。
【００５８】
【表４】
【００５９】
（ＦVIII遺伝子組換え細胞をもちいた核移植由来胎仔の解析）
ＦVIII遺伝子組換え細胞コロニー＃１３４を用いた計５回の核移植・胚移植の結果、１匹のブタ胎仔が得られ、その線維芽細胞を分離・増殖・保存し、そのゲノムＤＮＡの解析を検討した。ＰＣＲによる解析はエキソン１４−１８において遺伝子組換え型のみを示す結果が得られ、エキソン１６へのＮｅｏの挿入も陽性であった（図３Ａ）。
また、サザンブロッティングによりＦVIII遺伝子の組換えの確認したところ、エキソン１４プローブまたはエキソン２２プローブを用いた場合において、任意のバンドシフトが認められ（図３Ｂ、３Ｃ）、目的であるＦVIII遺伝子のエキソン１６にＮｅｏが挿入されているという結果が得られた。よって、核移植に用いた細胞コロニーはＦVIII遺伝子組換え細胞と野生型細胞が混在する細胞集団であったが、核移植後に発生したクローンブタ胎仔はＦVIII遺伝子組換えブタ（ＦVIII−ＫＯブタ）であることが示された。
【００６０】
（ＦVIII遺伝子組換えブタ胎仔細胞の再核移植・胚移植）
作出した細胞由来のクローンブタ胎仔がＦVIII遺伝子組換え（ＦVIII−ＫＯ）ブタであることがゲノムＤＮＡの解析により確かめられたため、そのブタ胎仔線維芽細胞をもちいて計７回の核移植・胚移植を実施した。その結果、３頭の仮親が、妊娠し、分娩まで至った。４頭の生存クローンブタが誕生した。胚移植の実施日程と妊娠の有無、出産予定日、分娩頭数（死産）の結果を表５に示す。
【００６１】
【表５】
【００６２】
（ＦVIII−ＫＯブタ新生仔の観察）
ＦVIII−ＫＯ胎仔線維芽細胞の核移植・胚移植により、４頭のＦVIII−ＫＯクローンブタが誕生した。しかし、出産直後あるいは２日目までに３頭が死亡した。
死亡したＦVIII−ＫＯブタ新生仔の剖検から、体の複数箇所に内出血が認められた（図４Ａ）。母ブタとの接触による内出血と推察された。また、内出血部位を切開したところ、血腫が認められ（図４Ｃ）、ＦVIII−ＫＯブタ自身には死亡前に出血傾向があるものと考えられた。
一方、頭蓋内には出血は認められず、臓器所見も異常がなかった（図４Ｂ、４Ｄ）。ＦVIII−ＫＯブタ新生仔のＤＮＡをエキソン１４−１８ ＰＣＲにより解析したところ、２頭ともＦVIII−ＫＯのクローンであることが確認された。
【００６３】
（ブタ血漿の解析）
野生型ブタの血漿をヒトＦVIIIを検出するＥＬＩＳＡによって検出したところ、ブタＦVIIIは検出されず、ヒト血漿との混和によるＥＬＩＳＡにおいてもヒトＦVIIIの検出を阻害するような結果は得られなかった（図５Ａ）。また、野生型ブタ血漿のFVIII活性を測定したところ、ブタ血漿はヒト血漿の約３〜３．５倍のＦVIII活性を有することが示された（図５Ｂ）。
生後２日に出血死したFVIII-ＫＯクローンブタの血液の凝固因子活性（ヒト凝固因子活性換算）を測定したところ、第VIII因子活性は感度以下であり、正常対照となる野生型新生仔ブタの（生後1日）の凝固第VIII因子活性は２００％以上であった。FVIIIＫＯクローンブタの血漿中で低下がみられた第VII因子活性と第XI因子活性は野生型新生仔ブタでも低値であった。FVIII-ＫＯクローンブタでは第VIII因子活性のみが特異的に低下していたことは、得られたクローンブタがFVIII-ＫＯクローンブタであることを確実に示し、出血症状は第VIII因子活性の低下に基づくものであるといえる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われたことを特徴とする血友病Ａモデルブタ。
【請求項２】
請求項１記載の血友病Ａモデルブタに由来する臓器、組織又は細胞。
【請求項３】
以下の工程を備えた血友病Ａモデルブタの作出方法。
（ａ）第VIII因子遺伝子のエキソン１６を標的としたターゲティングベクターを作製する工程；
（ｂ）胎児線維芽細胞に、工程（ａ）で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程；
（ｃ）採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で除核された卵子に、工程（ｃ）で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程；
【請求項４】
Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を評価することを特徴とする血友病の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体。
【請求項６】
ヒト第VIII因子により、Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタを免疫し、ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体を調製することを特徴とする抗第VIII因子抗体の製造方法。
【請求項１】
Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われたことを特徴とする血友病Ａモデルブタ。
【請求項２】
請求項１記載の血友病Ａモデルブタに由来する臓器、組織又は細胞。
【請求項３】
以下の工程を備えた血友病Ａモデルブタの作出方法。
（ａ）第VIII因子遺伝子のエキソン１６を標的としたターゲティングベクターを作製する工程；
（ｂ）胎児線維芽細胞に、工程（ａ）で作製したターゲティングベクターを導入し、相同組換えにより生じた遺伝子組換え細胞を選抜する工程；
（ｃ）採取した豚の体内成熟卵子から除核する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で除核された卵子に、工程（ｃ）で選抜された遺伝子組換え細胞の細胞核を注入する工程；
（ｅ）工程（ｄ）で細胞核が注入された卵子に活性化処理を施し、活性化処理後の核移植胚を雌豚の卵管又は子宮に移植する工程；
【請求項４】
Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタに被検物質を投与し、該モデルブタにおける血液凝固機能の程度を評価することを特徴とする血友病の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体。
【請求項６】
ヒト第VIII因子により、Ｘ染色体上の第VIII因子遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現される第VIII因子を発現する機能が失われた第VIII因子ノックアウトブタを免疫し、ヒト第VIII因子とブタ第VIII因子とに交差反応性を有する抗第VIII因子抗体を調製することを特徴とする抗第VIII因子抗体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２２９４５６（Ｐ２０１１−２２９４５６Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０２５６９（Ｐ２０１０−１０２５６９）
【出願日】平成２２年４月２７日（２０１０．４．２７）
【出願人】（５００３６２４４２）プライムテック株式会社 (5)
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【出願人】（５０５２４６７８９）学校法人自治医科大学 (49)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２７日（２０１０．４．２７）
【出願人】（５００３６２４４２）プライムテック株式会社 (5)
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【出願人】（５０５２４６７８９）学校法人自治医科大学 (49)
【Ｆターム（参考）】
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