血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤、並びに医薬用組成物及び機能性飲食品
【課題】天然物から抽出可能な物質を有効成分とする血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤、並びにそのような血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤を含有する医薬用組成物及び機能性飲食品を提供する。
【解決手段】アセロラ等に含まれる両親媒性抗酸化物質である３−ハイドロキシ−２−ピロンが血小板凝集抑制効果と肝障害改善効果とを示すことを確認した。この３−ハイドロキシ−２−ピロンは、血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤に有効成分として含有させることができ、この血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤は、医薬用組成物や機能性飲食品に含有させることができる。
【解決手段】アセロラ等に含まれる両親媒性抗酸化物質である３−ハイドロキシ−２−ピロンが血小板凝集抑制効果と肝障害改善効果とを示すことを確認した。この３−ハイドロキシ−２−ピロンは、血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤に有効成分として含有させることができ、この血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤は、医薬用組成物や機能性飲食品に含有させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤、並びにそのような血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤を含有する医薬用組成物及び機能性飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本人の死亡原因の第１位はガンなどの悪性新生物、第２位は心疾患、第３位は脳血管疾患となっており、このうち心疾患、脳血管疾患は、共に血栓症が基盤となり引き起こされる。中でも狭心症や心筋梗塞、脳梗塞などは最も有名な疾患であり、近年、我が国においても特に問題視されている。
【０００３】
また、日本人の死亡原因として肝障害に起因するものは、悪性新生物、心疾患、脳血管疾患に次いで多くなっている。肝障害は、臨床的には急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変等に分類され、原因的にはウイルス性、アルコール性等に分類される。
【０００４】
【非特許文献１】Y. Morimitsu et al.,“Antiplatelet and anticancer isothiocyanates in Japanese domestic horseradish, Wasabi.”, Mechanisms of Ageing and Development, 116, p.125-134, 2000
【非特許文献２】T. Ariga et al.“Platelet aggregation inhibitor in garlic.”, Lancet, 1 (8212), p.150-151, 1981
【非特許文献３】B. H. Shah et al.,“Inhibitory Effect of Curcumin, a Food Spice from Turmeric, on Platelet-Activating Factor and Arachidonic Acid-Mediated Platelet Aggregation through Inhibition of Thromboxane Formation and Ca2+ Signaling.”, Biochemical Pharmacology, 58, p.1167-1172, 1999
【特許文献１】特開２００５−１９４２１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、天然物から抽出可能であり、且つ血栓症や肝障害を予防・改善する血小板凝集抑制効果、肝障害改善効果を示す物質としては、日本ワサビに含まれるイソチオシアネート、ニンニクに含まれるメチルアリルトリスルフィド、ウコンに含まれるクルクミン、ジャンボリーキに含まれるサポニン等、数多く知られている（非特許文献１〜３、特許文献１を参照）。
【０００６】
しかしながら、天然物の中には、現在報告されている物質以外にも、血小板凝集抑制効果、肝障害改善効果を示す物質が存在すると考えられることから、このような効果を示す新規な物質の探索が望まれていた。
【０００７】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、天然物から抽出可能な物質を有効成分とする血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤、並びにそのような血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤を含有する医薬用組成物及び機能性飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本件発明者等は、上述した目的を達成するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた。その結果、アセロラ等に含まれる両親媒性抗酸化物質である３−ハイドロキシ−２−ピロンが血小板凝集抑制効果と肝障害改善効果とを示すことを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明に係る血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤は、３−ハイドロキシ−２−ピロンを有効成分として含有するものである。
【００１０】
また、本発明に係る医薬用組成物及び機能性飲食品は、このような血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤を含有するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、３−ハイドロキシ−２−ピロンが血小板凝集抑制効果と肝障害改善効果とを示すため、この３−ハイドロキシ−２−ピロンを有効成分として含有させることで、血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤を提供することができる。また、この血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤を含有させることで、血栓症を予防し、又は肝障害を改善する医薬用組成物や機能性飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を適用した実施の形態について、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明する。
【００１３】
（１）３−ハイドロキシ−２−ピロンの合成
３−ハイドロキシ−２−ピロンは、以下の化学式（１）で表される両親媒性抗酸化物質である。
【００１４】
【化１】
【００１５】
この３−ハイドロキシ−２−ピロンは、アセロラ果実から抽出できるほか、アスコルビン酸を出発原料として合成することもできる。本実施の形態では、以下のように、アスコルビン酸を出発原料とし、デヒドロアスコルビン酸を経て３−ハイドロキシ−２−ピロンを合成した。
【００１６】
アスコルビン酸からデヒドロアスコルビン酸の合成
１００ｇのアスコルビン酸（和光純薬工業株式会社）に１５００ｍｌのアセトン（和光純薬工業株式会社）と２５０ｇの酸化銀（和光純薬工業株式会社）とを加え、ガラス棒でゆっくりと撹拌して酸化反応を開始させた。酸化銀を加えても泡が出ないことを確認後、グラスフィルター（３Ｇ４）にて吸引濾過した。そして、濾液に６０ｇの活性炭素を加え、ガラス棒で撹拌後、濾紙にて濾過した。その後、濾液を３０℃の水中でエバポレーターにて濃縮した。
【００１７】
この濃縮液に対してアセトンをフラスコの１／３程加えて吸引濾過し、得られた沈殿物に純水を適量加え、撹拌後１０分間放置した。そして、この溶液を吸引濾過後、再びアセトンをフラスコの１／３程加えて吸引濾過した。さらに、得られた沈殿に１００ｍｌのジエチルエーテル（和光純薬工業株式会社）を加え、吸引濾過した。得られた沈殿をシャーレに回収して風乾させることにより、デヒドロアスコルビン酸の白色粉末１２．９ｇが得られた。
【００１８】
デヒドロアスコルビン酸から３−ハイドロキシ−２−ピロンの合成
３ｇのデヒドロアスコルビン酸に７０℃以上の純水 ７００ｍｌを加え、溶解した。この溶解液を１００℃で５時間、還流装置にて加熱した後、７００ｍｌのジエチルエーテルを加えて撹拌した。この混合液より分液漏斗を用いて上層を回収し、回収した上層に１００ｇの無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）を加え、脱水した。そして、濾紙にて濾過後、エバポレーターにて濃縮し、濃縮液に３００ｍｌの石油エーテル（和光純薬工業株式会社）を加えた後、エバポレーターにて乾固し、粗結晶を得た。この粗結晶を用いて、昇華装置により再結晶を行うことにより、３−ハイドロキシ−２−ピロンの白色針状結晶６０．２ｍｇが得られた。
【００１９】
なお、この結晶の構造は、ＧＣ−ＭＳ（gas chromatograph-mass spectrometer）、ＵＶ（ultra violet）、及びＮＭＲ（nuclear magnetic resonance）を用いて確認した。
【００２０】
（２）血小板凝集抑制効果の評価
３−ハイドロキシ−２−ピロンの血小板凝集抑制効果は、血小板凝集惹起物質を加えたときの多血小板血漿の透過率変化を、３−ハイドロキシ−２−ピロンの存在下、非存在下で比較することにより評価した。
【００２１】
多血小板血漿及び乏血小板血漿の調製
多血小板血漿及び乏血小板血漿を調製するため、２週間以上服薬していない健康な成人（２０〜２５歳）から、真空採血管（ベノジェクトII真空採血管、３．８％ クエン酸ナトリウム ０．５ｍｌ入り；テルモ株式会社）、採血針（ベノジェクトII採血針Ｓ、２２Ｇ×１ １／２；テルモ株式会社）を用いて、血液９容に対して３．８％ クエン酸ナトリウム１容となるように採血した。
【００２２】
そして、採血により得られたクエン酸化血液を室温、３００×ｇの条件で１０分間遠心分離し、上層を多血小板血漿（platelet rich plasma；ＰＲＰ）として用いた。さらに、多血小板血漿を調製した残りの下層を室温、１２００×ｇの条件で１５分間遠心分離し、上層を乏血小板血漿（platelet poor plasma；ＰＰＰ）として用いた。なお、血小板は採血後３時間程で機能低下が見られるため、採血後３時間以内に使用した。
【００２３】
血小板凝集惹起物質の調製
血小板凝集惹起物質としては、血小板が刺激を受けることによって膜リン脂質から放出されるアラキドン酸、アラキドン酸からシクロオキシゲナーゼの作用を受けて生成するトロンボキサンＡ２の安定類縁物質であるＵ−４６６１９、血小板の濃染顆粒中に存在し、血小板凝集に伴い放出されるＡＤＰ（adenosin diphosphate）、プロテインキナーゼＣの活性化物質であるＰＭＡ（phorbol-12-myristate-13-acetate）を使用し、それぞれ以下のように調製した。
【００２４】
アラキドン酸溶液：
１００ｍｇのアラキドン酸（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を２．７６ｍｌの０．５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、マイクロチューブに分注後、窒素充填して−８０℃で冷凍保存した。使用時には氷中で解凍し、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）バッファでＰＲＰ中の終濃度が１．５ｍＭとなるように希釈した。
Ｕ−４６６１９溶液：
１００μｌの酢酸メチルに溶解された１ｍｇのＵ−４６６１９（フナコシ株式会社）を１８５μｌのエタノールで希釈し、１０ｍＭ Ｕ−４６６１９溶液として−２０℃で冷凍保存した。使用時にはＰＢＳバッファでＰＲＰ中の終濃度が１μＭとなるように希釈した。
ＡＤＰ溶液：
ＡＤＰ（和光純薬工業株式会社）をＰＢＳバッファでＰＲＰ中の終濃度が１０μＭとなるように希釈した。
ＰＭＡ溶液；
ＰＭＡ（フナコシ株式会社）をエタノールで溶解し、４０ｍＭ ＰＭＡ溶液として−２０℃で冷凍保存した。使用時にはＰＢＳバッファを加えて９０μＭ ＰＭＡ溶液とし、４％エタノール含有ＰＢＳバッファでＰＲＰ中の終濃度が５μＭとなるように希釈した。
【００２５】
３−ハイドロキシ−２−ピロンの希釈液の調製
アスコルビン酸を出発原料として合成した３−ハイドロキシ−２−ピロンの終濃度が３．１６×１０−４Ｍ、１．０×１０−３Ｍ、１．０×１０−２Ｍとなるように、酸化防止剤としてＬ−アスコルビルパルミテート（和光純薬工業株式会社）を５０ｐｐｍ含有する無水エタノールで希釈し、希釈液を調製した。
【００２６】
血小板凝集抑制実験の手順及び結果
ＰＲＰに血小板凝集惹起物質を加えて撹拌すると、血小板は急速に凝集塊を作り、血小板凝集塊が生じるに従ってＰＲＰの透過率は高くなる。この現象を利用し、３−ハイドロキシ−２−ピロンの血小板凝集抑制作用を測定した。
【００２７】
血小板凝集抑制作用の測定には、血小板凝集能測定装置（NKK HEMATRACER 1 MODEL PAT-4；ＳＳＲエンジニアリング株式会社）を用い、透過率を記録計（CHROMATOPAC C-R4A、株式会社島津製作所）に記録した。この際、ガラス製キュベットを３７℃でインキュベートし、スターラーの回転速度が１０００ｒｐｍになるようにセットした。
【００２８】
具体的な測定方法は次の通りである。すなわち、キュベットにステアリングロッドを入れたものを２つ用意し、一方のキュベットにはＰＰＰを３００μｌ分注し、他方のキュベットにはＰＲＰを３００μｌ分注した。次に、記録計を始動させ、ＰＰＰ及びＰＲＰの両方にシイタケ精油希釈液を２μｌ添加し、ＰＰＰの入ったキュベットで記録計の透過率を４００００に調整し、ＰＲＰの入ったキュベットで記録計の透過率を０に調整した。このＳＰＡＮ調整は測定の度に行った。ＳＰＡＮ調整後、ＰＲＰの入ったキュベットをセットし、３−ハイドロキシ−２−ピロンの希釈液を添加してから３分間経過後に血小板凝集惹起物質（アラキドン酸、Ｕ−４６６１９、ＡＤＰ、ＰＭＡ）を１８μｌ添加し、凝集曲線の変化を１０分間記録した。このとき、コントロールとしては、３−ハイドロキシ−２−ピロンの希釈液の代わりに、５０ｐｐｍ Ｌ−アスコルビルパルミテート含有無水エタノールを添加した。
【００２９】
なお、測定に用いたキュベット及びステアリングロッドは、血小板異物接触刺激によって生じる接着、凝固を防止するため、予めシリコンコーティング処理を施した。具体的には、器具を洗浄し乾燥させた後、SIGMACOTE（シグマアルドリッチジャパン株式会社）に浸積させて乾燥させ、使用前に超純水で洗浄した。
【００３０】
このようにして記録計に記録された透過率から、次のようにして阻害率を算出した。すなわち、血小板凝集に伴うＰＲＰの透過率（Ｔ％）の変化を血小板の凝集率（Agg.％）の変化と見なし、その最大値を最大凝集率（Agg.max％）とした。そして、３−ハイドロキシ−２−ピロンの希釈液を添加したサンプルの最大凝集率Ｔと、コントロールのサンプルの最大凝集率Ｔ’とから、阻害率を（１−Ｔ'／Ｔ）×１００のように算出した。
【００３１】
各血小板凝集惹起物質を添加したときの阻害率の測定結果を表１、及び図１〜４に示す。なお、この表１、及び図１〜４は、阻害率を３回測定した平均値を示したものである。
【００３２】
【表１】
【００３３】
表１、及び図１〜４から分かるように、血小板凝集惹起物質としてアラキドン酸、ＡＤＰを添加した場合、３−ハイドロキシ−２−ピロンは濃度依存的に血小板凝集を抑制した。また、血小板凝集惹起物質としてＵ−４６６１９を添加した場合、３−ハイドロキシ−２−ピロンは低濃度（３．１６×１０−４Ｍ）では血小板凝集を抑制していたものの、濃度依存的に阻害率が低下した。また、血小板凝集惹起物質としてＰＭＡを添加した場合、３−ハイドロキシ−２−ピロンは血小板凝集を抑制しなかった。
【００３４】
これらの結果から、３−ハイドロキシ−２−ピロンによる血小板凝集抑制の作用機序は、ニンニクに含まれるメチルアリルトリスルフィドと同様に、シクロオキシゲナーゼ阻害によるものと分かった。
【００３５】
（３）肝障害改善効果の評価
３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果は、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮ）処理ラットの肝機能を、３−ハイドロキシ−２−ピロンの投与の有無で比較することにより評価した。
【００３６】
実験動物の準備
実験動物としては、Wistar系ＳＰＦ雄性ラット（５週齢、体重１５０ｇ前後；日本クレア株式会社）を１週間の予備飼育の後に使用した。飼育条件は、温度２２±１℃、湿度５５±５％、光のサイクルを１２時間毎の明暗、とした。食餌はマウス・ラット・ハムスター用飼育繁殖固形型飼料ＣＥ−２（日本クレア株式会社）を、飲料水は水道水をともに自由摂取させた。但し、採血前１８時間は絶食状態に保った。
【００３７】
Ｄ−ＧａｌＮ投与液の調製及び投与量の決定
Ｄ−ＧａｌＮ投与液は、Ｄ−ガラクトサミン（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用い、生理食塩水に溶解後、１Ｎ ＮａＯＨで中和し、滅菌フィルターで濾過することにより調製した。予備実験として、各群３匹のラットに４００ｍｇ／ｋｇ体重、７００ｍｇ／ｋｇ体重、１０００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量となるようにＤ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内に１ｍｌ投与し、２４時間後の血清中のＡＬＴ（alanine aminotransferase）活性及びＡＳＴ（asparate aminotransferase）活性を測定した。その結果、両活性が著しく上昇した７００ｍｇ／ｋｇ体重を以下の実験での投与量に決定した。
【００３８】
投与実験の手順及び結果（水溶性抗酸化物質との比較）
先ず、両親媒性抗酸化物質である３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果を水溶性抗酸化物質と比較した。水溶性抗酸化物質としては、Ｌ−アスコルビン酸及び２，４−ジヒドロキシ安息香酸を用いた。
【００３９】
この投与実験では、予備飼育したラットを、各群７匹、計５群に分けた。各群の詳細は以下の通りである。
【００４０】
ノーマル群：
純水を腹腔内投与した後、純水を経口胃内投与する。
コントロール群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、純水を経口胃内投与する。
ＨＰ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、アスコルビン酸を出発原料として合成した３−ハイドロキシ−２−ピロンを投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように純水１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
ＡｓＡ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、Ｌ−アスコルビン酸（和光純薬工業株式会社）を投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように純水１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
Ｂｅｎ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（和光純薬工業株式会社）を投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように純水１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
【００４１】
これらの実験群に対して、次のような投与実験を行った。すなわち、予備飼育後、ノーマル群以外の４群のラットに７００ｍｇ／ｋｇ体重のＤ−ＧａｌＮ投与液を投与し、投与後８、２４、３２時間の計３回、各サンプルを胃ゾンデを用いて経口胃内投与した。そして、Ｄ−ＧａｌＮ投与液の投与後４８時間にネンブタール麻酔下で頸静脈より採血した。その後、血液サンプルを１８℃、３０００ｒｐｍの条件で１５分間遠心分離することにより血清を分離し、血清中のＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、総ビリルビン量、γ−ＧＴＰ（γ-glutamyl transpeptidase）活性を測定した。測定には、スポットケムTM EZ SP-4430（アークレイ株式会社）を用いた。
【００４２】
各血清マーカーの測定結果を表２、及び図５〜８に示す。なお、図中異なる記号（ａ、ｂ、ｃ）が付されている測定値同士は有意差（ｐ＜０．０５）がある。
【００４３】
【表２】
【００４４】
表２、及び図５〜８から分かるように、Ｄ−ＧａｌＮ投与液を投与したコントロール群では、ノーマル群と比較してＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、総ビリルビン量、γ−ＧＴＰ活性が著しく上昇した。水溶性抗酸化物質であるＬ−アスコルビン酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸を投与したＡｓＡ群、Ｂｅｎ群では、ＡＬＴ活性、総ビリルビン量がコントロール群に対して有意に減少したものの、ＡＳＴ活性、γ−ＧＴＰ活性は有意に減少しなかった。一方、３−ハイドロキシ−２−ピロンを投与したＨＰ群では、コントロール群に対して全て有意に減少した。
【００４５】
これらの結果から、３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果は、水溶性抗酸化物質であるＬ−アスコルビン酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸よりも優れていることが確認できる。
【００４６】
投与実験の手順及び結果（脂溶性抗酸化物質との比較）
次に、両親媒性抗酸化物質である３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果を脂溶性抗酸化物質と比較した。脂溶性抗酸化物質としては、α−トコフェロール及びブチルヒドロキシトルエンを用いた。また、溶媒としてはピーナッツ油を用いた。
【００４７】
この投与実験では、予備飼育したラットを、各群７匹、計５群に分けた。各群の詳細は以下の通りである。
ノーマル群：
純水を腹腔内投与した後、ピーナッツ油を経口胃内投与する。
コントロール群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、ピーナッツ油を経口胃内投与する。
ＨＰ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、アスコルビン酸を出発原料として合成した３−ハイドロキシ−２−ピロンを投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるようにピーナッツ油１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
α−Ｔｏｃ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、α−トコフェロール（和光純薬工業株式会社）を投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるようにピーナッツ油１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
ＢＨＴ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、ブチルヒドロキシトルエン（LKT Laboratories, Inc.）を投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるようにピーナッツ油１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
【００４８】
これらの実験群に対して、次のような投与実験を行った。すなわち、予備飼育後、ノーマル群以外の４群のラットに７００ｍｇ／ｋｇ体重のＤ−ＧａｌＮ投与液を投与し、投与後８、２４、３２時間の計３回、各サンプルを胃ゾンデを用いて経口胃内投与した。そして、Ｄ−ＧａｌＮ投与液の投与後４８時間にネンブタール麻酔下で頸静脈より採血した。その後、血液サンプルを１８℃、３０００ｒｐｍの条件で１５分間遠心分離することにより血清を分離し、血清中のＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、総ビリルビン量、γ−ＧＴＰ活性を測定した。測定には、スポットケムTM EZ SP-4430（アークレイ株式会社）を用いた。
【００４９】
各血清マーカーの測定結果を表３、及び図９〜１２に示す。なお、図中異なる記号（ａ、ｂ、ｃ）が付されている測定値同士は有意差（ｐ＜０．０５）がある。
【００５０】
【表３】
【００５１】
表３、及び図９〜１２から分かるように、Ｄ−ＧａｌＮ投与液を投与したコントロール群では、ノーマル群と比較してＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、総ビリルビン量、γ−ＧＴＰ活性が著しく上昇した。脂溶性抗酸化物質であるα−トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエンを投与したα−Ｔｏｃ群、ＢＨＴ群では、コントロール群に対して全て有意に減少した。一方、３−ハイドロキシ−２−ピロンを投与したＨＰ群でも、コントロール群に対して全て有意に減少した。
【００５２】
これらの結果から、３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果は、脂溶性抗酸化物質であるα−トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエンと同程度であることが確認できる。
【００５３】
以上、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明したように、３−ハイドロキシ−２−ピロンは血小板凝集抑制効果と肝障害改善効果とを示すため、この３−ハイドロキシ−２−ピロンを血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤の有効成分として含有させることができる。
【００５４】
また、この血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤と、医薬用として通常用いられている他の任意成分とを組み合わせることで、血栓症を予防し、又は肝障害を改善する医薬用組成物を提供することができる。医薬用組成物の剤形は特に限定されるものではないが、一般に製剤上許容される１種又は２種以上の担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤沢剤、防腐剤、安定剤、香味剤等と共に混合して、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、水薬、ドリンク剤等の内服薬剤とすることが好ましい。この医薬用組成物の投与量は、患者の年齢、症状、体重等により異なるが、成人１日当たり、３−ハイドロキシ−２−ピロンを０．４〜０．６ｍｇ含む医薬用組成物を、１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００５５】
また、この血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤を飲食品に含有させることで、血栓症を予防し、又は肝障害を改善する機能性飲食品を提供することができる。飲食品としては、飲料、穀類加工品、水産・畜産加工品、乳製品、菓子類、調味料等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】血小板凝集惹起物質としてアラキドン酸を添加したときの３−ハイドロキシ−２−ピロンによる凝集阻害率を示す図である。
【図２】血小板凝集惹起物質としてＵ−４６６１９を添加したときの３−ハイドロキシ−２−ピロンによる凝集阻害率を示す図である。
【図３】血小板凝集惹起物質としてＡＤＰを添加したときの３−ハイドロキシ−２−ピロンによる凝集阻害率を示す図である。
【図４】血小板凝集惹起物質としてＰＭＡを添加したときの３−ハイドロキシ−２−ピロンによる凝集阻害率を示す図である。
【図５】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのＡＬＴ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を水溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図６】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのＡＳＴ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を水溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図７】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットの総ビリルビン量に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を水溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図８】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのγ−ＧＴＰ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を水溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図９】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのＡＬＴ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を脂溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図１０】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのＡＳＴ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を脂溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図１１】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットの総ビリルビン量に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を脂溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図１２】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのγ−ＧＴＰ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を脂溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤、並びにそのような血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤を含有する医薬用組成物及び機能性飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本人の死亡原因の第１位はガンなどの悪性新生物、第２位は心疾患、第３位は脳血管疾患となっており、このうち心疾患、脳血管疾患は、共に血栓症が基盤となり引き起こされる。中でも狭心症や心筋梗塞、脳梗塞などは最も有名な疾患であり、近年、我が国においても特に問題視されている。
【０００３】
また、日本人の死亡原因として肝障害に起因するものは、悪性新生物、心疾患、脳血管疾患に次いで多くなっている。肝障害は、臨床的には急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変等に分類され、原因的にはウイルス性、アルコール性等に分類される。
【０００４】
【非特許文献１】Y. Morimitsu et al.,“Antiplatelet and anticancer isothiocyanates in Japanese domestic horseradish, Wasabi.”, Mechanisms of Ageing and Development, 116, p.125-134, 2000
【非特許文献２】T. Ariga et al.“Platelet aggregation inhibitor in garlic.”, Lancet, 1 (8212), p.150-151, 1981
【非特許文献３】B. H. Shah et al.,“Inhibitory Effect of Curcumin, a Food Spice from Turmeric, on Platelet-Activating Factor and Arachidonic Acid-Mediated Platelet Aggregation through Inhibition of Thromboxane Formation and Ca2+ Signaling.”, Biochemical Pharmacology, 58, p.1167-1172, 1999
【特許文献１】特開２００５−１９４２１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来、天然物から抽出可能であり、且つ血栓症や肝障害を予防・改善する血小板凝集抑制効果、肝障害改善効果を示す物質としては、日本ワサビに含まれるイソチオシアネート、ニンニクに含まれるメチルアリルトリスルフィド、ウコンに含まれるクルクミン、ジャンボリーキに含まれるサポニン等、数多く知られている（非特許文献１〜３、特許文献１を参照）。
【０００６】
しかしながら、天然物の中には、現在報告されている物質以外にも、血小板凝集抑制効果、肝障害改善効果を示す物質が存在すると考えられることから、このような効果を示す新規な物質の探索が望まれていた。
【０００７】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、天然物から抽出可能な物質を有効成分とする血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤、並びにそのような血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤を含有する医薬用組成物及び機能性飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本件発明者等は、上述した目的を達成するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた。その結果、アセロラ等に含まれる両親媒性抗酸化物質である３−ハイドロキシ−２−ピロンが血小板凝集抑制効果と肝障害改善効果とを示すことを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明に係る血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤は、３−ハイドロキシ−２−ピロンを有効成分として含有するものである。
【００１０】
また、本発明に係る医薬用組成物及び機能性飲食品は、このような血小板凝集抑制剤及び肝障害改善剤を含有するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、３−ハイドロキシ−２−ピロンが血小板凝集抑制効果と肝障害改善効果とを示すため、この３−ハイドロキシ−２−ピロンを有効成分として含有させることで、血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤を提供することができる。また、この血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤を含有させることで、血栓症を予防し、又は肝障害を改善する医薬用組成物や機能性飲食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を適用した実施の形態について、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明する。
【００１３】
（１）３−ハイドロキシ−２−ピロンの合成
３−ハイドロキシ−２−ピロンは、以下の化学式（１）で表される両親媒性抗酸化物質である。
【００１４】
【化１】
【００１５】
この３−ハイドロキシ−２−ピロンは、アセロラ果実から抽出できるほか、アスコルビン酸を出発原料として合成することもできる。本実施の形態では、以下のように、アスコルビン酸を出発原料とし、デヒドロアスコルビン酸を経て３−ハイドロキシ−２−ピロンを合成した。
【００１６】
アスコルビン酸からデヒドロアスコルビン酸の合成
１００ｇのアスコルビン酸（和光純薬工業株式会社）に１５００ｍｌのアセトン（和光純薬工業株式会社）と２５０ｇの酸化銀（和光純薬工業株式会社）とを加え、ガラス棒でゆっくりと撹拌して酸化反応を開始させた。酸化銀を加えても泡が出ないことを確認後、グラスフィルター（３Ｇ４）にて吸引濾過した。そして、濾液に６０ｇの活性炭素を加え、ガラス棒で撹拌後、濾紙にて濾過した。その後、濾液を３０℃の水中でエバポレーターにて濃縮した。
【００１７】
この濃縮液に対してアセトンをフラスコの１／３程加えて吸引濾過し、得られた沈殿物に純水を適量加え、撹拌後１０分間放置した。そして、この溶液を吸引濾過後、再びアセトンをフラスコの１／３程加えて吸引濾過した。さらに、得られた沈殿に１００ｍｌのジエチルエーテル（和光純薬工業株式会社）を加え、吸引濾過した。得られた沈殿をシャーレに回収して風乾させることにより、デヒドロアスコルビン酸の白色粉末１２．９ｇが得られた。
【００１８】
デヒドロアスコルビン酸から３−ハイドロキシ−２−ピロンの合成
３ｇのデヒドロアスコルビン酸に７０℃以上の純水 ７００ｍｌを加え、溶解した。この溶解液を１００℃で５時間、還流装置にて加熱した後、７００ｍｌのジエチルエーテルを加えて撹拌した。この混合液より分液漏斗を用いて上層を回収し、回収した上層に１００ｇの無水硫酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）を加え、脱水した。そして、濾紙にて濾過後、エバポレーターにて濃縮し、濃縮液に３００ｍｌの石油エーテル（和光純薬工業株式会社）を加えた後、エバポレーターにて乾固し、粗結晶を得た。この粗結晶を用いて、昇華装置により再結晶を行うことにより、３−ハイドロキシ−２−ピロンの白色針状結晶６０．２ｍｇが得られた。
【００１９】
なお、この結晶の構造は、ＧＣ−ＭＳ（gas chromatograph-mass spectrometer）、ＵＶ（ultra violet）、及びＮＭＲ（nuclear magnetic resonance）を用いて確認した。
【００２０】
（２）血小板凝集抑制効果の評価
３−ハイドロキシ−２−ピロンの血小板凝集抑制効果は、血小板凝集惹起物質を加えたときの多血小板血漿の透過率変化を、３−ハイドロキシ−２−ピロンの存在下、非存在下で比較することにより評価した。
【００２１】
多血小板血漿及び乏血小板血漿の調製
多血小板血漿及び乏血小板血漿を調製するため、２週間以上服薬していない健康な成人（２０〜２５歳）から、真空採血管（ベノジェクトII真空採血管、３．８％ クエン酸ナトリウム ０．５ｍｌ入り；テルモ株式会社）、採血針（ベノジェクトII採血針Ｓ、２２Ｇ×１ １／２；テルモ株式会社）を用いて、血液９容に対して３．８％ クエン酸ナトリウム１容となるように採血した。
【００２２】
そして、採血により得られたクエン酸化血液を室温、３００×ｇの条件で１０分間遠心分離し、上層を多血小板血漿（platelet rich plasma；ＰＲＰ）として用いた。さらに、多血小板血漿を調製した残りの下層を室温、１２００×ｇの条件で１５分間遠心分離し、上層を乏血小板血漿（platelet poor plasma；ＰＰＰ）として用いた。なお、血小板は採血後３時間程で機能低下が見られるため、採血後３時間以内に使用した。
【００２３】
血小板凝集惹起物質の調製
血小板凝集惹起物質としては、血小板が刺激を受けることによって膜リン脂質から放出されるアラキドン酸、アラキドン酸からシクロオキシゲナーゼの作用を受けて生成するトロンボキサンＡ２の安定類縁物質であるＵ−４６６１９、血小板の濃染顆粒中に存在し、血小板凝集に伴い放出されるＡＤＰ（adenosin diphosphate）、プロテインキナーゼＣの活性化物質であるＰＭＡ（phorbol-12-myristate-13-acetate）を使用し、それぞれ以下のように調製した。
【００２４】
アラキドン酸溶液：
１００ｍｇのアラキドン酸（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を２．７６ｍｌの０．５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、マイクロチューブに分注後、窒素充填して−８０℃で冷凍保存した。使用時には氷中で解凍し、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）バッファでＰＲＰ中の終濃度が１．５ｍＭとなるように希釈した。
Ｕ−４６６１９溶液：
１００μｌの酢酸メチルに溶解された１ｍｇのＵ−４６６１９（フナコシ株式会社）を１８５μｌのエタノールで希釈し、１０ｍＭ Ｕ−４６６１９溶液として−２０℃で冷凍保存した。使用時にはＰＢＳバッファでＰＲＰ中の終濃度が１μＭとなるように希釈した。
ＡＤＰ溶液：
ＡＤＰ（和光純薬工業株式会社）をＰＢＳバッファでＰＲＰ中の終濃度が１０μＭとなるように希釈した。
ＰＭＡ溶液；
ＰＭＡ（フナコシ株式会社）をエタノールで溶解し、４０ｍＭ ＰＭＡ溶液として−２０℃で冷凍保存した。使用時にはＰＢＳバッファを加えて９０μＭ ＰＭＡ溶液とし、４％エタノール含有ＰＢＳバッファでＰＲＰ中の終濃度が５μＭとなるように希釈した。
【００２５】
３−ハイドロキシ−２−ピロンの希釈液の調製
アスコルビン酸を出発原料として合成した３−ハイドロキシ−２−ピロンの終濃度が３．１６×１０−４Ｍ、１．０×１０−３Ｍ、１．０×１０−２Ｍとなるように、酸化防止剤としてＬ−アスコルビルパルミテート（和光純薬工業株式会社）を５０ｐｐｍ含有する無水エタノールで希釈し、希釈液を調製した。
【００２６】
血小板凝集抑制実験の手順及び結果
ＰＲＰに血小板凝集惹起物質を加えて撹拌すると、血小板は急速に凝集塊を作り、血小板凝集塊が生じるに従ってＰＲＰの透過率は高くなる。この現象を利用し、３−ハイドロキシ−２−ピロンの血小板凝集抑制作用を測定した。
【００２７】
血小板凝集抑制作用の測定には、血小板凝集能測定装置（NKK HEMATRACER 1 MODEL PAT-4；ＳＳＲエンジニアリング株式会社）を用い、透過率を記録計（CHROMATOPAC C-R4A、株式会社島津製作所）に記録した。この際、ガラス製キュベットを３７℃でインキュベートし、スターラーの回転速度が１０００ｒｐｍになるようにセットした。
【００２８】
具体的な測定方法は次の通りである。すなわち、キュベットにステアリングロッドを入れたものを２つ用意し、一方のキュベットにはＰＰＰを３００μｌ分注し、他方のキュベットにはＰＲＰを３００μｌ分注した。次に、記録計を始動させ、ＰＰＰ及びＰＲＰの両方にシイタケ精油希釈液を２μｌ添加し、ＰＰＰの入ったキュベットで記録計の透過率を４００００に調整し、ＰＲＰの入ったキュベットで記録計の透過率を０に調整した。このＳＰＡＮ調整は測定の度に行った。ＳＰＡＮ調整後、ＰＲＰの入ったキュベットをセットし、３−ハイドロキシ−２−ピロンの希釈液を添加してから３分間経過後に血小板凝集惹起物質（アラキドン酸、Ｕ−４６６１９、ＡＤＰ、ＰＭＡ）を１８μｌ添加し、凝集曲線の変化を１０分間記録した。このとき、コントロールとしては、３−ハイドロキシ−２−ピロンの希釈液の代わりに、５０ｐｐｍ Ｌ−アスコルビルパルミテート含有無水エタノールを添加した。
【００２９】
なお、測定に用いたキュベット及びステアリングロッドは、血小板異物接触刺激によって生じる接着、凝固を防止するため、予めシリコンコーティング処理を施した。具体的には、器具を洗浄し乾燥させた後、SIGMACOTE（シグマアルドリッチジャパン株式会社）に浸積させて乾燥させ、使用前に超純水で洗浄した。
【００３０】
このようにして記録計に記録された透過率から、次のようにして阻害率を算出した。すなわち、血小板凝集に伴うＰＲＰの透過率（Ｔ％）の変化を血小板の凝集率（Agg.％）の変化と見なし、その最大値を最大凝集率（Agg.max％）とした。そして、３−ハイドロキシ−２−ピロンの希釈液を添加したサンプルの最大凝集率Ｔと、コントロールのサンプルの最大凝集率Ｔ’とから、阻害率を（１−Ｔ'／Ｔ）×１００のように算出した。
【００３１】
各血小板凝集惹起物質を添加したときの阻害率の測定結果を表１、及び図１〜４に示す。なお、この表１、及び図１〜４は、阻害率を３回測定した平均値を示したものである。
【００３２】
【表１】
【００３３】
表１、及び図１〜４から分かるように、血小板凝集惹起物質としてアラキドン酸、ＡＤＰを添加した場合、３−ハイドロキシ−２−ピロンは濃度依存的に血小板凝集を抑制した。また、血小板凝集惹起物質としてＵ−４６６１９を添加した場合、３−ハイドロキシ−２−ピロンは低濃度（３．１６×１０−４Ｍ）では血小板凝集を抑制していたものの、濃度依存的に阻害率が低下した。また、血小板凝集惹起物質としてＰＭＡを添加した場合、３−ハイドロキシ−２−ピロンは血小板凝集を抑制しなかった。
【００３４】
これらの結果から、３−ハイドロキシ−２−ピロンによる血小板凝集抑制の作用機序は、ニンニクに含まれるメチルアリルトリスルフィドと同様に、シクロオキシゲナーゼ阻害によるものと分かった。
【００３５】
（３）肝障害改善効果の評価
３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果は、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮ）処理ラットの肝機能を、３−ハイドロキシ−２−ピロンの投与の有無で比較することにより評価した。
【００３６】
実験動物の準備
実験動物としては、Wistar系ＳＰＦ雄性ラット（５週齢、体重１５０ｇ前後；日本クレア株式会社）を１週間の予備飼育の後に使用した。飼育条件は、温度２２±１℃、湿度５５±５％、光のサイクルを１２時間毎の明暗、とした。食餌はマウス・ラット・ハムスター用飼育繁殖固形型飼料ＣＥ−２（日本クレア株式会社）を、飲料水は水道水をともに自由摂取させた。但し、採血前１８時間は絶食状態に保った。
【００３７】
Ｄ−ＧａｌＮ投与液の調製及び投与量の決定
Ｄ−ＧａｌＮ投与液は、Ｄ−ガラクトサミン（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用い、生理食塩水に溶解後、１Ｎ ＮａＯＨで中和し、滅菌フィルターで濾過することにより調製した。予備実験として、各群３匹のラットに４００ｍｇ／ｋｇ体重、７００ｍｇ／ｋｇ体重、１０００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量となるようにＤ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内に１ｍｌ投与し、２４時間後の血清中のＡＬＴ（alanine aminotransferase）活性及びＡＳＴ（asparate aminotransferase）活性を測定した。その結果、両活性が著しく上昇した７００ｍｇ／ｋｇ体重を以下の実験での投与量に決定した。
【００３８】
投与実験の手順及び結果（水溶性抗酸化物質との比較）
先ず、両親媒性抗酸化物質である３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果を水溶性抗酸化物質と比較した。水溶性抗酸化物質としては、Ｌ−アスコルビン酸及び２，４−ジヒドロキシ安息香酸を用いた。
【００３９】
この投与実験では、予備飼育したラットを、各群７匹、計５群に分けた。各群の詳細は以下の通りである。
【００４０】
ノーマル群：
純水を腹腔内投与した後、純水を経口胃内投与する。
コントロール群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、純水を経口胃内投与する。
ＨＰ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、アスコルビン酸を出発原料として合成した３−ハイドロキシ−２−ピロンを投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように純水１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
ＡｓＡ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、Ｌ−アスコルビン酸（和光純薬工業株式会社）を投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように純水１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
Ｂｅｎ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（和光純薬工業株式会社）を投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように純水１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
【００４１】
これらの実験群に対して、次のような投与実験を行った。すなわち、予備飼育後、ノーマル群以外の４群のラットに７００ｍｇ／ｋｇ体重のＤ−ＧａｌＮ投与液を投与し、投与後８、２４、３２時間の計３回、各サンプルを胃ゾンデを用いて経口胃内投与した。そして、Ｄ−ＧａｌＮ投与液の投与後４８時間にネンブタール麻酔下で頸静脈より採血した。その後、血液サンプルを１８℃、３０００ｒｐｍの条件で１５分間遠心分離することにより血清を分離し、血清中のＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、総ビリルビン量、γ−ＧＴＰ（γ-glutamyl transpeptidase）活性を測定した。測定には、スポットケムTM EZ SP-4430（アークレイ株式会社）を用いた。
【００４２】
各血清マーカーの測定結果を表２、及び図５〜８に示す。なお、図中異なる記号（ａ、ｂ、ｃ）が付されている測定値同士は有意差（ｐ＜０．０５）がある。
【００４３】
【表２】
【００４４】
表２、及び図５〜８から分かるように、Ｄ−ＧａｌＮ投与液を投与したコントロール群では、ノーマル群と比較してＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、総ビリルビン量、γ−ＧＴＰ活性が著しく上昇した。水溶性抗酸化物質であるＬ−アスコルビン酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸を投与したＡｓＡ群、Ｂｅｎ群では、ＡＬＴ活性、総ビリルビン量がコントロール群に対して有意に減少したものの、ＡＳＴ活性、γ−ＧＴＰ活性は有意に減少しなかった。一方、３−ハイドロキシ−２−ピロンを投与したＨＰ群では、コントロール群に対して全て有意に減少した。
【００４５】
これらの結果から、３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果は、水溶性抗酸化物質であるＬ−アスコルビン酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸よりも優れていることが確認できる。
【００４６】
投与実験の手順及び結果（脂溶性抗酸化物質との比較）
次に、両親媒性抗酸化物質である３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果を脂溶性抗酸化物質と比較した。脂溶性抗酸化物質としては、α−トコフェロール及びブチルヒドロキシトルエンを用いた。また、溶媒としてはピーナッツ油を用いた。
【００４７】
この投与実験では、予備飼育したラットを、各群７匹、計５群に分けた。各群の詳細は以下の通りである。
ノーマル群：
純水を腹腔内投与した後、ピーナッツ油を経口胃内投与する。
コントロール群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、ピーナッツ油を経口胃内投与する。
ＨＰ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、アスコルビン酸を出発原料として合成した３−ハイドロキシ−２−ピロンを投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるようにピーナッツ油１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
α−Ｔｏｃ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、α−トコフェロール（和光純薬工業株式会社）を投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるようにピーナッツ油１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
ＢＨＴ群：
Ｄ−ＧａｌＮ投与液を腹腔内投与した後、ブチルヒドロキシトルエン（LKT Laboratories, Inc.）を投与量が１０ｍｇ／ｋｇ体重となるようにピーナッツ油１ｍｌに溶解し、経口胃内投与する。
【００４８】
これらの実験群に対して、次のような投与実験を行った。すなわち、予備飼育後、ノーマル群以外の４群のラットに７００ｍｇ／ｋｇ体重のＤ−ＧａｌＮ投与液を投与し、投与後８、２４、３２時間の計３回、各サンプルを胃ゾンデを用いて経口胃内投与した。そして、Ｄ−ＧａｌＮ投与液の投与後４８時間にネンブタール麻酔下で頸静脈より採血した。その後、血液サンプルを１８℃、３０００ｒｐｍの条件で１５分間遠心分離することにより血清を分離し、血清中のＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、総ビリルビン量、γ−ＧＴＰ活性を測定した。測定には、スポットケムTM EZ SP-4430（アークレイ株式会社）を用いた。
【００４９】
各血清マーカーの測定結果を表３、及び図９〜１２に示す。なお、図中異なる記号（ａ、ｂ、ｃ）が付されている測定値同士は有意差（ｐ＜０．０５）がある。
【００５０】
【表３】
【００５１】
表３、及び図９〜１２から分かるように、Ｄ−ＧａｌＮ投与液を投与したコントロール群では、ノーマル群と比較してＡＬＴ活性、ＡＳＴ活性、総ビリルビン量、γ−ＧＴＰ活性が著しく上昇した。脂溶性抗酸化物質であるα−トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエンを投与したα−Ｔｏｃ群、ＢＨＴ群では、コントロール群に対して全て有意に減少した。一方、３−ハイドロキシ−２−ピロンを投与したＨＰ群でも、コントロール群に対して全て有意に減少した。
【００５２】
これらの結果から、３−ハイドロキシ−２−ピロンの肝障害改善効果は、脂溶性抗酸化物質であるα−トコフェロール、ブチルヒドロキシトルエンと同程度であることが確認できる。
【００５３】
以上、具体的な実験結果を参照しながら詳細に説明したように、３−ハイドロキシ−２−ピロンは血小板凝集抑制効果と肝障害改善効果とを示すため、この３−ハイドロキシ−２−ピロンを血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤の有効成分として含有させることができる。
【００５４】
また、この血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤と、医薬用として通常用いられている他の任意成分とを組み合わせることで、血栓症を予防し、又は肝障害を改善する医薬用組成物を提供することができる。医薬用組成物の剤形は特に限定されるものではないが、一般に製剤上許容される１種又は２種以上の担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤沢剤、防腐剤、安定剤、香味剤等と共に混合して、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、水薬、ドリンク剤等の内服薬剤とすることが好ましい。この医薬用組成物の投与量は、患者の年齢、症状、体重等により異なるが、成人１日当たり、３−ハイドロキシ−２−ピロンを０．４〜０．６ｍｇ含む医薬用組成物を、１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００５５】
また、この血小板凝集抑制剤又は肝障害改善剤を飲食品に含有させることで、血栓症を予防し、又は肝障害を改善する機能性飲食品を提供することができる。飲食品としては、飲料、穀類加工品、水産・畜産加工品、乳製品、菓子類、調味料等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】血小板凝集惹起物質としてアラキドン酸を添加したときの３−ハイドロキシ−２−ピロンによる凝集阻害率を示す図である。
【図２】血小板凝集惹起物質としてＵ−４６６１９を添加したときの３−ハイドロキシ−２−ピロンによる凝集阻害率を示す図である。
【図３】血小板凝集惹起物質としてＡＤＰを添加したときの３−ハイドロキシ−２−ピロンによる凝集阻害率を示す図である。
【図４】血小板凝集惹起物質としてＰＭＡを添加したときの３−ハイドロキシ−２−ピロンによる凝集阻害率を示す図である。
【図５】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのＡＬＴ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を水溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図６】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのＡＳＴ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を水溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図７】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットの総ビリルビン量に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を水溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図８】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのγ−ＧＴＰ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を水溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図９】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのＡＬＴ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を脂溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図１０】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのＡＳＴ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を脂溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図１１】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットの総ビリルビン量に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を脂溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【図１２】Ｄ−ＧａｌＮ処理ラットのγ−ＧＴＰ活性に対する３−ハイドロキシ−２−ピロン（ＨＰ）の効果を脂溶性抗酸化物質と比較して示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ハイドロキシ−２−ピロンを有効成分として含有する血小板凝集抑制剤。
【請求項２】
３−ハイドロキシ−２−ピロンを有効成分として含有する肝障害改善剤。
【請求項３】
請求項１記載の血小板凝集抑制剤を含有する医薬用組成物。
【請求項４】
請求項２記載の肝障害改善剤を含有する医薬用組成物。
【請求項５】
請求項１記載の血小板凝集抑制剤を含有する機能性飲食品。
【請求項６】
請求項２記載の肝障害改善剤を含有する機能性飲食品。
【請求項１】
３−ハイドロキシ−２−ピロンを有効成分として含有する血小板凝集抑制剤。
【請求項２】
３−ハイドロキシ−２−ピロンを有効成分として含有する肝障害改善剤。
【請求項３】
請求項１記載の血小板凝集抑制剤を含有する医薬用組成物。
【請求項４】
請求項２記載の肝障害改善剤を含有する医薬用組成物。
【請求項５】
請求項１記載の血小板凝集抑制剤を含有する機能性飲食品。
【請求項６】
請求項２記載の肝障害改善剤を含有する機能性飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−２４６４７５（Ｐ２００７−２４６４７５Ａ）
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−７４９０６（Ｐ２００６−７４９０６）
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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