血栓症の処置のための抗糖タンパク質ＶＩＳＣＦＶフラグメント
本発明は、配列番号１で示される、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドを介して結合された９Ｏ１２．２．２モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬドメインとそれに続く「ｃ−ｍｙｃ」フラッグからなる、ヒト糖タンパク質ＶＩに対する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２）に関する。本発明はまた、同一の重鎖および軽鎖相補性決定領域１、２および３を有する前記ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２フラグメントの機能的変異体、好ましくは、配列番号２８または配列番号４７で示されるヒト化ｓｃＦｖフラグメントなどのヒト化機能的変異体に関する。本発明はまた、このようなｓｃＦｖフラグメントをコードする核酸、このようなｓｃＦｖフラグメントを産生するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこのようなｓｃＦｖフラグメントの治療的使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、配列番号１で示される、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドを介して結合された９Ｏ１２．２モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬドメインとそれに続く「ｃ−ｍｙｃ」フラッグからなる、ヒト糖タンパク質ＶＩに対する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２）に関する。本発明はまた、同一の重鎖および軽鎖相補性決定領域１、２および３を有する前記ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２フラグメントの機能的変異体、好ましくは、配列番号２８または配列番号４７で示されるヒト化ｓｃＦｖフラグメントなどのヒト化機能的変異体に関する。本発明はまた、このようなｓｃＦｖフラグメントをコードする核酸、このようなｓｃＦｖフラグメントを産生するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこのようなｓｃＦｖフラグメントの治療的使用に関する。
【０００２】
背景技術
急性冠動脈および脳血管偶発症候は現在、世界の第一の死因である。さらに、急性冠動脈症候群後の処置の６か月後の再発および死亡の全体の罹患率は依然として８〜１５％である。ＳＴセグメントの上昇を伴う急性冠動脈症候群の場合、冠動脈血管形成術およびステントの導入による機械的処置は冠動脈流を緊急に回復させるのに極めて効果的であるが、その後６か月に患者の１５％で罹患／死亡を防ぐことができない。
【０００３】
長期の繊維素溶解薬、抗凝固薬および抗凝集薬の組合せに基づく血栓溶解処置は、有望な結果はほとんど得られない。実際、血栓症の医学的処置が改善されたものの、６か月時点での罹患率／死亡率は、セグメントＳＴ上昇を伴わない急性冠動脈症候群で見られるものと同様である。
【０００４】
脳血管虚血の偶発症候に関しては、一般にほとんどの患者の手当が遅れるため、また、現在利用可能な抗血栓処置の出血リスクのために、処置は依然として非常に限定されたものである。
【０００５】
従って、心血管疾患の処置の改善、特に、利用可能な分子に比べて特徴が改善された新規な分子、特に出血作用が軽減された分子の、本当に差し迫った臨床上の必要性がある。
【０００６】
血小板−コラーゲン相互作用は急性動脈血栓の発生および血栓後の血管再構築において重要である。糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、コラーゲンによる血小板に対する主要な受容体は、実験的血栓症、血管再構築、動脈血栓および急性心筋虚血に役割を果たすことが動物で実証されている。
【０００７】
現在血栓処置に用いられ、血小板の最終活性化段階を阻害するαＩＩｂβ３インテグリンアンタゴニストに対して、ＧＰＶＩは血小板の初期活性化段階に関連し、従って、ＧＰＶＩアンタゴニストは血小板凝集を妨げるだけでなく、二次的アゴニストの放出、さらには血管傷害の発生をもたらす増殖因子およびサイトカインの分泌も妨げるはずである。さらに、ＧＰＶＩの欠乏は高い出血リスクを伴わず、従って、患者の安全性に関して重要な特性ではない。最後に、ＧＰＶＩの発現は血小板に限定されているので、抗血栓処置の完全に特異的な標的となる。
【０００８】
よって、ＧＰＶＩアンタゴニストは一次的および二次的血栓を特異的かつ効率的に防ぐのに効果的であり、しかも低い出血リスクしか伴わないはずである。
【０００９】
様々な種の可能性のあるＧＰＶＩアンタゴニストが作出されている。あるアプローチでは、ＧＰＶＩ細胞外ドメインとヒトＩｇ Ｆｃドメインの融合タンパク質である可溶性ＧＰＶＩ組換えタンパク質が作出されている（例えば、ＷＯ０１／００８１０（１）およびＷＯ０３／００８４５４（２）参照）。よって、可溶性組換えＧＰＶＩタンパク質は、コラーゲンとの結合をめぐって血小板と競合する。血栓症ネズミモデルではこの可溶性ＧＰＶＩタンパク質で初めて有望な結果が得られた（３）が、これらの結果は確認されていない（４）。さらに、このアプローチは構造的、機能的および薬理学的欠点を含んでいる。第一に、この化合物は高分子量タンパク質（〜１６０ｋＤａ）であり、その半減期は短いと予測される。ＧＰＶＩは少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位を含んでいるので、この性組換えＧＰＶＩ−Ｆｃタンパク質の加水分解を考えなければならない。コラーゲンと結合すると、このタンパク質はそのＦｃドメインを血流に曝す。ヒト血小板（マウス血小板はそうではない）および白血球はそれらの表面で親和性の低いＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＡ）を発現する。固定されたＧＰＶＩ−Ｆｃによる血小板ＦｃγＲＩＩＡの架橋は血小板を活性化しやすいので、予測されるものとは反対の作用を持つ。また、このタンパク質を投与すべきタイミングと用量も問題となっている。血小板は、ひと度コラーゲンと結合すると、急速かつ不可逆的に活性化される。従って、ＧＰＶＩ−Ｆｃを効果的とするには、血小板の活性化前に投与すべきであり、これは血栓事象の前であり、現在の医学ではまれな状況である。さらに、投与すべきタンパク質の量は、予測不可能なパラメーターである血管傷害の大きさと性質の関数として様々である。
【００１０】
他の多くのものはヒトＧＰＶＩに対する中和モノクローナル抗体を開発しようとした。例えば、ＥＰ１２２４９４２（５）およびＥＰ１２２８７６８（６）は、血栓性疾患の処置のための、マウスＧＰＶＩと特異的に結合するモノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体ＪＡＱ１を開示している。ＪＡＱ１抗体はマウス血小板上でＧＰＶＩ受容体の不可逆的インターナリゼーションを誘発する。
【００１１】
ＥＰ１５３８１６５（７）は、別のモノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体ｈＧＰ ５Ｃ４を記載しており、このＦａｂフラグメントは、コラーゲン刺激によって誘発された血小板の主要な生理機能に著しい阻害作用を有することが見出されている。なお、コラーゲンにより媒介される生理学的活性化パラメーターＰＡＣ−ＩおよびＣＤ ６２Ｐ−セレクチンの刺激は、内因性の活性のないex vivoにおいて、ｈＧＰ ５Ｃ４ ＦａｂおよびｈＧＰ ５Ｃ４ Ｆａｂにより強力に阻害されたヒト血小板凝集によって完全に妨げられた。
【００１２】
ＷＯ２００５／１１１０８３（８）は、in vitroにおいてＧＰＶＩとコラーゲンの結合、コラーゲンにより誘発される分泌およびトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）の形成、ならびにカニクイザルに静脈内注射した後にex vivoにおいてコラーゲンにより誘発される血小板凝集を阻害することが見出された４つのモノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３およびＯＭ４を記載している。ＯＭ４はまた、ラット血栓モデルにおける血栓形成も阻害するものと思われる。
【００１３】
ＷＯ０１／００８１０（１）もまた、７Ｉ２０．２、８Ｍ１４．３、３Ｆ８．１、９Ｅ１８．３、３Ｊ２４．２、６Ｅ１２．３、ＩＰ１０．２、４Ｌ７．３、７Ｈ４．６、９Ｏ１２．２、７Ｈ１４．１および９Ｅ１８．２と呼ばれる種々のモノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体、ならびにＡ９、Ａ１０、Ｃ９、Ａ４、Ｃ１０、Ｂ４、Ｃ３およびＤ１１と呼ばれるいくつかのｓｃＦｖフラグメントを記載している。これらの抗体およびｓｃＦｖフラグメントのうち、抗体８Ｍ１４．３、３Ｆ８．１、９Ｅ１８．３、３Ｊ２４．２、６Ｅ１２．３、ＩＰ１０．２、４Ｌ７．３、７Ｈ４．６および９Ｏ１２．２、ならびにｓｃＦｖフラグメントＡ１０、Ａ４、Ｃ１０、Ｂ４、Ｃ３およびＤ１１を含む１いくつかのものは、ＧＰＶＩがコラーゲンと結合するのを阻害することが見出された。
【００１４】
さらに、９Ｏ１２．２ Ｆａｂフラグメントは、コラーゲンにより誘発される血小板凝集および分泌を完全に遮断すること、コラーゲンにより刺激される血小板の凝血促進活性および静置条件での血小板とコラーゲンの接着を阻害すること、血小板の接着を損なうこと、および動脈流条件下で血栓の形成を防ぐことが見出された（９）。
【００１５】
しかしながら、現在知られている抗ＧＰＶＩ抗体に、in vivoにおいて、動脈および静脈血栓、再狭窄、急性冠動脈症候群およびアテローム性動脈硬化症による脳血管偶発症候などの血小板凝集に関連する心血管疾患を予防および／または治療するのに本当に有効であることが証明されたものはない。最近までに、報告されている種々の抗ＧＰＶＩ抗体は、ヒトの医学的使用にための抗血栓薬の開発にはそぐわないことが分かった。阻害特性が報告されているものは数種に過ぎない。マウスＧＰＶＩに向けられ、ヒトＧＰＶＩとは交差反応しないＪＡＱｌの場合がこれである（１０）。ヒトＧＰＶＩに対するヒトｓｃＦｖは阻害性があると報告されているが（１１、１２）、それらの親和性は低いと思われる。ごく最近、ヒトＧＰＶＩと良好な親和性を有する新たな阻害抗体が同定され（１３）、治療手段としての開発が提案されている。
【００１６】
しかしながら、血小板表面での二価または多価リガンドによるＧＰＶＩの架橋は血小板の活性化をもたらす。ＧＰＶＩの二量体形成を介して、およびＧＰＶＩと低親和性Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＡ）の架橋を介して血小板を活性化する９Ｏ１２．２ ＩｇＧの場合がそれである（９）。Ｆａｂ’２もまた、ＧＰＶＩの二量体形成を介して血小板を活性化する（９）。これに対し、一価の９Ｏ１２．２ Ｆａｂフラグメントは阻害的である。しかし、これらのフラグメントは、それらの大きさと動物起源であることのために（ヒト患者において免疫原性となる）治療薬として使用することができない。
【００１７】
よって、高い効率、低い出血リスク、ならびに低い免疫原性作用で、血小板凝集の初期段階を阻害する有効な中和ＧＰＶＩアンタゴニストの必要性がなおある。
発明の開示
【００１８】
本発明者らは、９Ｏ１２．２モノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体ハイブリドーマから、免疫定常ドメイン（ＣＨ１およびＣＬ）を持たず、大きさが縮小されたフラグメント中に機能的阻害モチーフを含む利点を有する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）９Ｏ１２．２を作出した。このｓｃＦｖは、治療的使用に適した形式を得るために免疫寛容性と安定性が改良されたフラグメントを作製するための出発材料である。
【００１９】
このようなフラグメントをデザインするための技術的アプローチはこれまでに報告されているが、各ｓｃＦｖ構築物を特異的ケースとすることを乗り越えるには多くの困難がある。これらの困難としては、異常な転写物を迂回することによる抗体Ｖ遺伝子のクローニング（１４）、適切な折りたたみに十分適切なリンカーの同定、Ｖドメインの単量体ｓｃＦｖへの会合および最後にｓｃＦｖを機能的可溶型で発現可能な原核生物発現系の選択が含まれる。
【００２０】
よって、本発明は、
配列番号２、配列番号３および配列番号４からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＶＨドメイン、
ペプチドリンカー、および
配列番号５、配列番号６および配列番号７からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＶＬドメイン
を含んでなる、ヒト糖タンパク質ＶＩに対する単鎖可変フラグメントに関する。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明のｓｃＦｖフラグメントは、精製に有用なペプチドタグ、および所望により、核ｓｃＦｖフラグメント（ＶＨおよびＶＬドメインとペプチドリンカーを含む）とペプチドタグの間に短いペプチドスペーサーをさらに含んでなる。
【００２２】
抗体はおおまかには、「重鎖」および「軽鎖」と呼ばれる２つの異なるポリペプチド鎖からなるＹ型分子であり、抗体はジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖と２つの軽鎖からなっている。各重鎖は可変ドメイン（「ＶＨドメイン」）と３つの定常ドメイン（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」ドメイン）からなり、各軽鎖は可変ドメイン（「ＶＬドメイン」）と定常ドメイン（「ＣＬドメイン」）からなる。
【００２３】
「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖフラグメント」とは、リンカー分子によって連結された抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含んでなる単一の折りたたまれたポリペプチドを指す。このようなｓｃＦｖフラグメントでは、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨ−リンカー−ＶＬかＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれの順であってもよい。ｓｃＦｖフラグメントは、その産生を助ける他、スペーサーによってｓｃＦｖと連結されたタグ分子を含み得る。
【００２４】
さらに、各可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬドメイン）は、抗体間で示す変動が小さく、可変ドメインの構造フレームワークを形成するβシートの形成に関与する４つの「フレームワーク領域」（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と、各βシートの末端において折りたたまれた可変ドメインに並置された３ループに相当する、一般に「相補性決定領域」１、２および３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼ばれる３つの超可変領域からなる。これら３つのＣＤＲ領域は、主として抗原と接触する可変ドメインの部分、特に、重鎖および軽鎖の再配列領域に相当し、いっそう可変性が高く、より直接的に特異的抗原と接触する各鎖のＣＤＲ３領域であるので、抗体または抗体フラグメントの特異性の決定に重要である。
【００２５】
よって、本発明は、同一のＣＤＲ領域を維持する９Ｏ１２．２の総ての機能的変異体を包含する。ｓｃＦｖフラグメント９Ｏ１２．２ＣＤＲ領域データを下表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
「ペプチドリンカー」とは、ｓｃＦｖフラグメントの適当な折りたたみ、すなわち、ＶＨおよびＶＬドメインの適当な折りたたみとそれらが一緒になる能力を可能とする柔軟なペプチドを意味する。さらに、このようなペプチドリンカーは単量体機能的単位への折りたたみが可能であるべきである。ｓｃＦｖがＶＨからＶＬ配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）に組み立てられた場合、３〜１２残基のリンカーを有するｓｃＦｖは機能的Ｆｖドメインへと折りたたみ不能であり、その代わりに別の分子と会合して二価の二量体を形成する。３残基未満に減れば三量体となる。従ってこの場合には、好適なリンカーは少なくとも１２アミノ酸、好ましくは２５アミノ酸未満、好ましくは１４〜１８、１４〜１６の間、または１５アミノ酸を有するべきであり、好ましくは高いパーセンテージ、好ましくは少なくとも５０％のグリシン残基を含むべきである。好適なペプチドリンカーとしては、ペプチド（Ｇ４Ｓ）３（配列番号８）、Ｇ４ＩＡＰＳＭＶＧ４Ｓ（配列番号９）、Ｇ４ＫＶＥＧＡＧ５Ｓ（配列番号１０）、Ｇ４ＳＭＫＳＨＤＧ４Ｓ（配列番号１１）、Ｇ４ＮＬＩＴＩＶＧ４Ｓ（配列番号１２）、Ｇ４ＶＶＰＳＬＧ４Ｓ（配列番号１３）およびＧ２ＥＫＳＩＰＧ４Ｓ（配列番号１４）が挙げられる。ｓｃＦｖがＶＬからＶＨ配向（ＶＬ−リンカー−ＶＨ）に産生される場合、ＶＬのＣ末端とＶＨのＮ末端の間の距離は、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端の間の距離よりもわずかに大きい（３０〜３４Åに対して３９〜４３Å）。従って、１８アミノ酸残基のリンカーが、使用可能な最小配列サイズである。よって、好適なペプチドリンカーは１８〜２５ａａ、好ましくは１８〜２１の間であるべきである。好適なリンカーの例としては、配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１５）のリンカーである。
【００２８】
「ペプチドタグ」とは、特異的抗体が利用可能な５〜１５アミノ酸のペプチドを意味する。本発明のｓｃＦｖフラグメントには任意であるが、ｓｃＦｖフラグメントのＣ末端に挿入されたこのようなペプチドタグは、組換え産生後にｓｃＦｖフラグメントの精製を容易にすることができる。実際に、ペプチドタグは、他でもなく、そのタンパク質に特異的結合親和性を与え、クロマトグラフィーを用いてより容易な精製が可能となる。好適なペプチドタグの例としては、ニッケルイオンに対して親和性を有し、従って、ニッケルを含むクロマトグラフィーカラムを用いて精製され得るＨｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号１６）、またはそれらの特異的抗体の対して高い親和性を有し、従って、固定化されたペプチドに対する抗体を含むカラムを用いて精製され得るエピトープペプチド、例えば、ｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ、配列番号１７）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号１８）、フラッグタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１９）、タンパク質Ｃタグ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ、配列番号２０）、Ｔａｇ−１００タグ（ＥＥＴＡＲＦＱＰＧＹＲＳ、配列番号２１）、Ｖ５エピトープタグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号２２）、ＶＳＶ−Ｇタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号２３）またはＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号２４）が挙げられる。
【００２９】
「短いペプチドスペーサー」とは、１〜１５アミノ酸、好ましくは１〜１２または１〜１０アミノ酸、例えば８アミノ酸のペプチドを意味する。このようなペプチドスペーサーは、任意のペプチドタグの真のｓｃＦｖ部分（ペプチドリンカーによって分離されたＶＨおよびＶＬドメイン）を分離することを意図する。特にペプチドタグが存在しない場合も、ペプチドタグが含まれる場合にも、本発明のｓｃＦｖフラグメントの必要は必ずしもない。実際、ペプチドタグはＶＨまたはＶＬドメインに直接融合され得る。しかしながら、１〜１２アミノ酸の短いペプチドスペーサーは有用であり得る。例えば、９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメントでは、配列ＲＳＲＶＴＶＳＳ（配列番号２５）の８アミノ酸ペプチドスペーサーが用いられてきた。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるヒト糖タンパク質ＶＩに対する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に関し、ここで、前記２６６アミノ酸配列のうちアミノ酸２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０９、１５９〜１７４、１９０〜１９６および２２９〜２３７はそれぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる。このようなｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の機能的変異体は同一のＣＤＲ領域を保持するだけでなく、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のアミノ酸配列と高い同一性％を有する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号１を含んでなる、またはからなる単鎖可変フラグメントに関する。
【００３１】
しかしながら、フレームワーク領域は、ヒト糖タンパク質ＶＩに対するキメラ、特にヒト化ｓｃＦｖフラグメントを作出するように変異させることができる。ある種の参照抗体または抗体フラグメントに関して、対応する「キメラ」抗体または抗体フラグメントは、フレームワーク領域が別の種の対応するフレームワーク領域に置き換えられているものである。より詳しくは、「ヒト化」抗体または抗体フラグメントは、フレームワーク領域がヒトフレームワーク領域に置き換えられている、同一のＣＤＲ領域を有する抗体または抗体フラグメントである。
【００３２】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２フラグメントはネズミモノクローナル抗体９Ｏ１２．２から本発明者らによって誘導されたものであり、従って、マウスフレームワーク領域を有する。しかしながら、ヒト患者においてこのフラグメントの注射の免疫原性作用を軽減するためには、ネズミフレームワーク領域がヒトフレームワーク領域に置き換えられているヒト化ｓｃＦｖフラグメントが望ましい可能性がある。
【００３３】
抗体Ｖドメインをヒト化するいくつかの可能性のある方法が示唆されている。それらはＣＤＲグラフト、Ｖドメインの表面置換、または元の分子の抗原特異性と親和性を維持しつつ免疫原性を減じる目的で、あるＶ鎖に多様な置換を探索する予測的コンピューター分析を含む（１７〜１９）。これらの方法には単純なものはなく、総て特異性および／または親和性を損なう結果となることがも多い（２０〜２３）。
【００３４】
これらの困難にもかかわらず。本発明者らは、配列番号１のアミノ酸番号１〜１２０および１３６〜２６６に対応するネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインがそれぞれヒト化ＶＨおよびＶＬドメイン配列番号２６および配列番号２７に置換されており、配列番号２８のアミノ酸配列のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）、図１４参照）をもたらす、第一のヒト化ｓｃＦｖフラグメントを作出した。
【００３５】
よって第一の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域がヒト抗体のフレームワーク領域を有するＶＨおよびＶＬドメインに置き換えられている、請求項１〜３のいずれかに記載の単鎖可変フラグメントに関する。特に、前記ＶＨおよびＶＬドメインはそれぞれ配列番号２６および配列番号２７に置換されていてもよい。より厳密には、配列番号１を含んでなる、またはからなるｓｃＦｖフラグメントがヒト化されている場合、それは配列番号２８を含んでなる、またはからなる第一のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）、図１４参照）をもたらし得る。
【００３６】
このようなヒト化ｓｃＦｖフラグメントを作出するためには、ＣＤＲグラフトと呼ばれる周知の技術を使用することができ、その技術はドナーｓｃＦｖフラグメントから相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択すること、およびそれを既知の三次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワークにグラフトすること（例えば、ＷＯ９８／４５３２２（２４）；ＷＯ８７／０２６７１（２５）；米国特許第５，８５９，２０５号（２６）；米国特許第５，５８５，０８９号（２７）；米国特許第４，８１６，５６７号（２８）；ＥＰ０１７３４９４（２９）；および参照文献２０〜２１および３０〜３１）、または可能性のある候補を特定するためにデータベースを検索することを含む。コンピューターモデリングおよびヒト生色細胞系配列との比較による典型的な方法では、ヒト化するモノクローナル抗体の抗原結合ループを最も適合するフレームワークに重ね合わせる。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をヒト化するアプローチはＣＤＲグラフト技術（３２）から採用したものである。ネズミ９Ｏ１２．２抗体のＣＤＲがヒト可変鎖フレームワークにグラフトされた。ヒト抗体の選択は次の基準を用いて行われた：結晶構造が解明されていること（ｐｄｂライブラリーでのＩＶＧＥ）；ヒト抗体ＩＶＧＥの可変ドメインは９Ｏ１２．２の可変ドメインと高い程度の配列相同性を示すこと（ＶＨ６０．６％；ＶＬ５５．４％）；候補ヒト抗体ＩＶＧＥの結晶学的データと９Ｏ１２．２の可変ドメインのモデルの構造比較を行い、ヒトアクセプタースキャフォールドＩＶＧＥの選択の確認が可能であったこと。この戦略により、ＣＤＲの適正な折りたたみに必要なスキャフォールドを保持し、抗原に対する高い親和性を保持しつつ、ＶＨドメインとＶＬドメインの間の相互作用の安定性を低下させるリスクが最小限となる。これらの分析に基づいて選択されたヒト抗体ＩＶＧＥはヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖの構築を可能とした。構造上の理由のために、ＣＤＲ Ｈ２の後の１０残基は変異していなかった。このヒト化ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をコードするヌクレオチド配列を至適化した。まず、最適な結合特性に関して可能な調整を行うため、これらのＣＤＲ領域間に制限部位を導入した。次に、原核生物発現系大腸菌(E. coli)においてヒト化ｓｃＦｖを発現させるために細菌のコドン利用を用いて至適化を行った。この方法により、それぞれ配列番号１のアミノ酸番号１〜１２０および１３６〜２６に相当するネズミ９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインが、それぞれ配列番号２６および配列番号２７に置き換えられているヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメント、すなわち、配列番号２８からなるヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメントが得られた。よって、本発明のヒト化ｓｃＦｖフラグメントの好ましい実施形態では、該ｓｃＦｖフラグメントは配列番号２８を含んでなる、またはからなる。
【００３７】
この第一のヒト化ｓｃＦｖフラグメントで得られた有望な結果にもかかわらず、このフラグメントは細菌での産生に適しておらず、さらに至適化した第二のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））はｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）に由来するものである。要するに、ＶＬ ＦＲ１およびＦＲ２領域では、ＩＶＧＥフレームワーク１および２との同一性は低く、よって、元の９Ｏ１２ ＶＬ ＦＲ１およびＦＲ２は第二のヒト化ｓｃＦｖ構築では保存した。モデルの綿密な検査に基づき、他の精密化も行った（詳細については実施例２を参照）。
【００３８】
従って、第二の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域が、ヒト抗体のフレームワーク領域を有するＶＨおよびＶＬドメインに置き換えられている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントに関する。特に、該ＶＨおよびＶＬドメインはそれぞれ配列番号２６および配列番号４６に置き換えられている場合がある。より厳密には、配列番号１を含んでなる、またはからなるｓｓｃＦｖフラグメントがヒト化される場合、それはまた好ましくは、配列番号４７を含んでなる、またはからなる第二のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２）、図１８参照）も生じ得る。
【００３９】
本発明はさらに、以上に記載したような本発明の単鎖可変フラグメントをコードする核酸配列に関する。特定の実施形態では、該ｓｃＦｖフラグメントは配列番号１を含んでなり、またはからなり、該核酸配列は配列番号２９、または例えば遺伝コードの縮重の結果として配列番号１をコードする誘導核酸配列を含んでなる、またはからなる場合がある。
【００４０】
該ｓｃＦｖフラグメントがヒト化され、それぞれ配列番号１のアミノ酸番号１〜１２０および１３６〜２６６に相当するネズミ９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインがそれぞれ配列番号２６および配列番号２７に置き換えられて、配列番号２８を含んでなる、またはからなる第一のヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））となる場合、該核酸は配列番号３０、または例えば遺伝コードの縮重の結果として配列番号２８をコードする任意の誘導核酸配列を含んでなる、またはからなる場合がある。
【００４１】
あるいは、該ｓｃＦｖフラグメントがヒト化され、それぞれアミノ酸番号１〜１２０および１３６〜２６６ ４７に相当するネズミ９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインが、配列番号４７を含んでなる、またはからなる第二のヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））となる場合、該核酸は配列番号５０（図１８Ｃ参照）、または例えば遺伝コードの縮重の結果として配列番号４７をコードする任意の誘導核酸配列を含んでなる、またはからなる場合がある。
【００４２】
本発明はまた、上記のような核酸配列を含んでなる発現ベクターに関する。このような発現ベクターはまた、特定の宿主細胞で、作動可能なように連結されたｓｃＦｖコード配列を発現させるのに必要な適当な核酸配列も含む。原核生物での発現に必要な核酸配列は、プロモーター、所望によりオペレーター配列、リボソーム結合部位およびおそらくは他の配列を含む。真核細胞は宿主細胞内でプロモーター、エンハンサーならびに終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００４３】
このような発現ベクターはまた、発現されたｓｃＦｖを特定の細胞コンパートメントへ向けるリーダー配列、例えば、ｓｃＦｖフラグメントの膜発現または分泌を命令するか、または細菌の周縁質での発現を命令する配列を含み得る。それはまた、同じプロモーターの制御下に、その発現が発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞を選択するために容易に検出できる選択遺伝子も含み得る。好適な選択遺伝子としては、特に抗生物質耐性遺伝子、蛍光遺伝子、または当業者に公知の、その発現が容易にモニタリングできる他のいずれかの遺伝子が挙げられる。
【００４４】
本発明はさらに、上記のような発現ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。このような組換え宿主細胞は、宿主細胞を本発明の発現ベクターを用いてトランスフェクトまたは形質転換することによって得ることができる。
【００４５】
このような宿主細胞は原核生物であっても真核生物であってもよい。好適な原核生物宿主細胞としては、グラム陽性菌およびグラム陰性菌が含まれる。グラム陰性菌では、好ましい宿主細胞は大腸菌である。細菌で用いるためには、発現ベクターは好ましくは、グラム陰性菌の原形質膜と外膜の間の空間、またはグラム陽性菌の原形質膜とペプチドグリカン層（細胞壁）の間の空間に相当する細菌周縁質にｓｃＦｖフラグメントの発現を向けるリーダー配列を含み得る。ポリペプチドの発現を細菌周縁質に向ける好適な配列としては、ｓｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ＬａｍＢ、β−ラクタマーゼ、Ｍ１３由来ｃｐ ＶＩＩＩ、ｐｅｌＢ、ｍａｌＥまたはｐｈｏＡシグナルペプチドまたはリーダー配列が挙げられる。特定の実施形態では、前記リーダー配列はｐｅｌＢである。
【００４６】
あるいは、真核細胞、特に哺乳類細胞を用いてもよい。実際、これはグリコシル化ｓｃＦｖフラグメントを直接的に生じさせることができる。発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞系統は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）およびいくつかの他の細胞系統を含む、特にAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞が挙げられる。真核細胞としては、酵母細胞も使用可能である。天然ヒトグリコシル化パターンに最も近いグリコシル化パターンを得るために、それを宿主細胞としてのヒト細胞系統に求めてもよい。あるいは、化学的に定義された増殖培地で高い細胞密度まで増殖可能な発酵法で一般に用いられる強い生物であるピキア・パストリス(Pichia pastoris)酵母細胞が、まず、内在する酵母グリコシル化経路を排除し、in vivoにおいて酵母に複合体ヒトＮ−グリカン、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生させることを可能とする合成in vivoグリコシル化経路をその生物に順次構築することにより改変されている（ＥＰ１２９７１７２（３３）、ＥＰ１５２２５９０（３４）および参照文献３５、３６参照）。ヒト化されたグリコシル化経路を有するこのような改変酵母細胞は、均一な複合体Ｎ−グリコシル化を伴うヒト糖タンパク質を分泌することができる。
【００４７】
本発明はまた、上記のような本発明の単鎖可変フラグメントを作製する方法であって、
ａ）上記のような本発明の宿主細胞を培養すること、および
ｂ）該単鎖可変フラグメントを精製すること
を含む方法に関する。
【００４８】
宿主細胞を培養するためのプロトコールおよび培地は常法であり、当業者ならば容易に使用可能である。得られたｓｃＦｖフラグメントの精製については、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ｌ−セファロースを使用）またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などを含む周知の技術を用いて行うことができる。より厳密には、ｓｃＦｖフラグメントは上記のようなＨｉｓ６タグまたはエピトープタグを含んでなる場合、ニッケルイオンカラムまたは固定化された特異的抗体を含有するカラムを用いたＨＰＬＣ。
【００４９】
本発明はさらに、薬剤としての上記のような本発明の単鎖可変フラグメントに関する。
【００５０】
本発明はまた、上記のような本発明の単鎖可変フラグメントと薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００５１】
より厳密には、本発明はまた、動脈および静脈血栓、再狭窄、急性冠動脈症候群ならびにアテローム性動脈硬化症による脳血管偶発症候から選択される心血管疾患の治療および／または予防を目的とした薬剤を製造するための、上記のような本発明の単鎖可変フラグメントの使用に関する。このような使用の好ましい実施形態では、該心血管疾患は血栓症である。
【００５２】
本発明の概略を記載したが、特定の具体的な実施例および図面を参照すれば本発明の特徴および利点のさらなる理解が得られる。これらの実施例および図面は単に例示のために本明細書に示されるものであり、特に断りのない限り限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２発現ベクターを構築するための用いた方法の概略図。工程１：Ｔ７およびＬｉｎｋ９Ｏ１２．２ＶＨＦｏｒプライマーを用いた９Ｏ１２．２．２モノクローナル抗体ＶＨセグメントと、Ｌｉｎｋ９Ｏ１２．２ＶＬＲｅｖおよび９Ｏ１２．２ｍｙｃＦｏｒプライマーを用いたＶＬセグメントのＰＣＲ増幅。工程２：ｐＳＷＲｅｖおよび９Ｏ１２．２ｍｙｃＦｏｒプライマーを用いたオーバーラップＰＣＲ増幅とその後のｐＳＷＲｅｖおよびｐＳＷＦｏｒプライマーを用いたＰＣＲ増幅による、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をコードする核酸の作製。工程３：ＰＣＲ産物のＤＮＡ精製。工程４：Ｐｓｔ１およびＸｈｏ１制限酵素を用いた精製ＤＮＡの消化。工程５：消化産物のｐＳＷ１発現ベクターへのクローニング。工程６：得られた構築物の配列決定。
【図２】プラスミドｐＳＷｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２ｍｙｃにクローニングされたｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。発現ベクターｐＳＷ１の制限部位Ｐｓｔ１とＸｈｏ１の間にクローニングされたｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーに相当するか、またはリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を斜体で示す。ＶＨおよびＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）の推定アミノ酸配列を下線で示す。ｃ−ｍｙｃフラッグの推定アミノ酸配列を示す。
【図３】ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２の三次元モデル。９Ｏ１２．２．２抗原−結合ドメインのモデル（側面図）。ＣＤＲを示す。
【図４】ヒト血小板に対するフローサイトメトリーによる細菌周縁質抽出物の分析。無関連のｓｃＦｖ−ｍｙｃをコードするプラスミドまたはプラスミドｐＳＷ ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２−ｍｙｃで形質転換された誘導型組換え細菌の細菌周縁質抽出物をヒト血小板とともにインキュベートした。ｓｃＦｖの結合をＦＩＴＣ結合抗ｃｍｙｃ抗体を用いて分析した。Ａ：無関連のｓｃＦｖ、Ｂ：ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２、左のパネル：前方分散と側方分散、右のパネル：蛍光ヒストグラム。
【図５】大腸菌Ｔｏｐｐ１における周縁質生産とｐＳＷ１−ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２ｍｙｃ培養物由来の組換えタンパク質の親和性アフィニティークロマトグラフィー精製。（Ａ）：クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）：抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧを用いたウエスタンブロット解析。レーン１：分子量標準、レーン２：ＧＰＶＩ−セファロースカラムにのせた誘導細菌の周縁質画分、レーン３：ＧＰＶＩ−セファロースカラム流出画分、レーン４：ＧＰＶＩ−セファロースカラム溶出画分。
【図６】天然ｓｃＦｖのサイズ排除クロマトグラフィー。アフィニティー精製されたｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のサイズ排除クロマトグラフィーは既知分子量の標準で較正したセファデックス７５ ＨＲ １０／３０カラムで行った。
【図７】固定化ＧＰＶＩ−Ｆｃに対する精製ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（黒の記号）または無関連のｓｃＦｖ（グレーの記号）をＧＰＶＩ−Ｆｃコーティングプレートでインキュベートし、ＨＲＰ結合抗ｃ−ｍｙｃを用いて検出した。（Ａ）：結合等温線。（Ｂ）：漸増量のＩｇＧ ９Ｏ１２．２との競合におけるｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（６０μｇ・ｍＬ−１）の結合。
【図８】固定化ＧＰＶＩ−Ｆｃに対するｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合の表面プラズモン共鳴分析。ＧＰＶＩ−Ｆに親和性のあるｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２は高く、２．５×１０ー９程度のＫＤを有する。ＩｇＧおよびＦａｂ ９Ｏ１２．２．２のＧＰＶＩ−Ｆｃに対するＫＤもナノモル程度である（それぞれ６．５×１０ー９Ｍおよび４．５×１０ー９Ｍ）。
【図９】固定化コラーゲンに対するＧＰＶＩの結合の阻害。ＧＰＶＩ−Ｆｃを漸増量の抗体：ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（三角）またはｐＦａｂ（四角）の存在下、固定化コラーゲン上でインキュベートした。（Ａ）：２μｇのＧＰ ＶＩ−Ｆｃ、（Ｂ）：４μｇのＧＰＶＩ−Ｆｃ。結合したＧＰＶＩ−ＦｃはＨＲＰ結合抗Ｆｃ ＩｇＧを用いて検出した。
【図１０】血小板に対する精製ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合：フローサイトメトリー分析。洗浄した血小板を無関連のｓｃＦｖ（上）または漸減量のｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１００、５０および２５ｍＭ）とともにインキュベートした。ｓｃＦｖの結合は、ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧを用いて分析した。
【図１１】コラーゲンにより誘発される血小板凝集に対するｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の効果。洗浄したヒト血小板（２．１０８ｍＬ）を無関連のｓｃＦｖ（下の曲線）、Ｆａｂ ９Ｏ１２．２（２５μｇ／ｍｌ）（上の曲線）、単離された単量体ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（黒）とともに３７℃で５分間インキュベートし、コラーゲンを加えた。３７℃、攪拌条件で凝集を分析し、光伝達の変化を記録した。
【図１２】動脈流条件下でコラーゲンにより誘発される血小板凝集に対するｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の効果。全血（５ｍＬ）を細胞透過性の蛍光色素ＤＩＯＣ−６で標識し、画像で白く見える血小板をＰＢＳ（Ａ）または５０μｇ・ｍＬー１の抗体フラグメント（Ｂ〜Ｄ）とともにインキュベートした後、１５００ｓ−１でフローチャンバー内のコラーゲンコーティングカバースリップへ流した。コラーゲンマトリックスと結合した血小板凝集塊の形成を蛍光顕微鏡で記録した。（Ｂ）無関連のｓｃＦｖ ９Ｃ２。（Ｃ）ｍｓｃＦｖ９Ｏ１２。（Ｄ）Ｆａｂ ９Ｏ１２。
【図１３】ＰＲＰにおけるコラーゲンにより誘発されるトロンビン生成に対するｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の効果。コラーゲンを加える前に、血小板豊富血漿（ＰＲＰ）をビヒクル（黒の曲線）または５０μｇ・ｍＬ−１のＦａｂ９Ｏ１２（濃いグレー）またはｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２（薄いグレー）とともに予備インキュベーションを行った。０．５ｐＭ組織因子および１６．６ｍＭ ＣａＣｌ２を加えることでトロンビンの生成を開始させた。蛍光基質を用いてトロンビン濃度を測定し、較正物質と比較して算出した。これらの追跡は１つの代表的な実験からのものである。棒グラフは誘導期の平均値±ＳＤとピーク値を示す（ｎ＝３）（バーは小さすぎて見えないＳＤに相当する）。
【図１４】ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインならびに第一のヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。Ａ．ヒト化９Ｏ１２．２ ＶＨ（１）ヌクレオチド（配列番号３１）およびアミノ酸（配列番号２６）を示す。Ｂ．ヒト化９Ｏ１２．２ ＶＬ（１）ヌクレオチド（配列番号３２）およびアミノ酸（配列番号２７）を示す。Ｃ．ヒト化ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（１）ヌクレオチド（配列番号３０）およびアミノ酸（配列番号２８）を示す。
【図１５】第一のヒト化ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））の特性決定。ＧＰＶＩセファロースへの親和性結合：組換え細菌の周縁質画分をＧＰＶＩセファロースカラムにのせた。保持されたタンパク質を、抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ、次いでＨＲＰに結合された抗マウス抗体とＥＣＬ曝露を用い、ウエスタンブロットによって分析した。ヒト化ｓｃＦｖに関して予測されたように、分子量２８．５ｋＤａの単一バンドが検出される。
【図１６】ＧＰＶＩ−Ｆｃに対するｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合。精製した第一のヒト化ｓｃＦｖ（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）、濃いグレー）およびｍｓｃＦｖ（薄いグレー）をＣＭ５センサーチップに固定されているＧＰＶＩ−Ｆｃに注入した。ブランクシグナルの検出の後のセンサーグラムを示す。
【図１７】ヒト血小板に対する第一のヒト化ｓｃＦｖ９Ｏ１２（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））の結合。ヒト血小板を細菌周縁質抽出物とともにインキュベートした。血小板に結合したｓｃＦｖは、ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて検出した。血小板との結合を、ＸＬ Ｅｐｉｃｓ Ｃｏｕｌｔｅｒフローサイトメーターで分析した。無関連のｓｃＦｖを陰性対照として用いた（上のパネル）。ヒストグラムの右側シフト（下のパネル）は、ヒト化ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２が血小板ＧＰＶＩと結合することを示す。
【図１８】ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインならびに第二の至適化ヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。Ａ．ヒト化９Ｏ１２．２ ＶＨ（２）ヌクレオチド（配列番号４８）およびアミノ酸（配列番号２６）を示す。Ｂ．ヒト化９Ｏ１２．２ ＶＬ（２）ヌクレオチド（配列番号４９）およびアミノ酸（配列番号４６）を示す。Ｃ．ヒト化ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２））ヌクレオチド（配列番号５０）およびアミノ酸（配列番号４７）を示す。酵素制限部位を太字で示す。ＶＨドメインとＶＬドメインの間のリンカーを下線で示す。ＣＤＲ領域をグレーで強調されている。
【図１９】９Ｏ１２抗体可変ドメインの至適化されたヒト化。抗体Ｖ−ドメインの配列分析：ネズミ９Ｏ１２（ｍ９Ｏ１２）、ＩＶＧＥ、ヒト化９Ｏ１２（ｈ９Ｏ１２）および１Ｘ９Ｑ。（．）はネズミ９Ｏ１２と同じ残基を示す。（−）はギャップを示す。ネズミ９Ｏ１２と類似性のないヒト化Ｖ−ドメインの残基を赤および青で示す（Ｋａｂｂａｔ命名法に従って残基ＡＨ７１、ＫＨ７３、ＲＨ７６、ＬＬＳ９、ＤＬ６Ｏ）。ＣＤＲはグレーで強調されている。
【図２０】第二のヒト化（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））の特性決定。Ａ−抗ｃＭｙｃ抗体を用いた組換えｓｃＦｖのウエスタンブロット検出。Ｂ−フローサイトメトリー分析。ヒト血小板を抗体フラグメントとともに３０分間プレインキュベーションした。ｓｃＦｖの結合は、ＦＩＴＣ結合抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いて検出した。
【実施例】
【００５４】
実施例１ ヒト糖タンパク質ＶＩに対するネズミ単鎖可変フラグメント ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２および第一のヒト化単鎖可変フラグメント ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の合成および活性
１．１ 試験手順
１．１．１ 材料
【００５５】
培地および溶液
ＬＢ（ルリア−ベルターニ）、DIFCO ４０２−１７；ＬＢ−寒天、DIFCO ４４５−１７；２ｘＴＹ（トリプトン−酵母）、DIFCO ２４４０２０；ＴＥＳ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、スクロース２０％、ｐＨ８．５；ＰＢＳ：ＮａＣｌ ０，１４Ｍ、ＫＣｌ １３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ ９ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ５０ｍＭ、ｐＨ７．４；ＢＢＳ：ホウ酸５０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨ７．６；アンピシリン、Euromedex ＥＵ−０４００Ｃ；イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、Euromedex ＥＵ０００８−Ｂ；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Sigma Ｂ４２８７；ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ、Sigma Ｆ−２０４７；デスオキシリボヌクレアーゼＡ、アプロチニン：Sigma Ａ−６２７９；ＨＲＰ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ、Invitrogen Ｒ９５１−２５；オルトフェニルジアミン（ＯＰＤ）：Sigma Ｐ８７８７、Ｔｒｉｚｏｌ：Invitrogen、コラーゲンホルムタイプＩ(Collagen Horm type I)：Nycomed、ｐＧＥＭＴクローニングベクター、Promega。ｓｃＦｖ発現にはｐＳＷｌプラスミドを用いた。６Ｈ８および９Ｃ２を無関連のｓｃＦｖとして用いた。
【００５６】
オリゴデスオキシリボヌクレオチド配列
用いたオリゴデスオキシリボヌクレオチドを次の表２に挙げる：
【表２】
【００５７】
ヒト血小板の調製
ヒト血小板を上述のように調製した（９）
【００５８】
フローサイトメトリー
「簡単ＦＩＴＣ標識血小板プログラム(Simple FITC labelling of platelets program)」フローサイトメーター Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬを用いた
ＧＰＶＩ−セファロースの調製：
【００５９】
試薬：ＣｎＢｒ−セファロースはAmersham-Pharmacia社製とした。研究室で組換え可溶性ＧＰＶＩ（ＧＰＶＩ−Ｆｃ）を作製し、精製した（９）。
【００６０】
方法：ＣｎＢｒ−セファロース(Amersham-Pharmacia)を供給業者の指示どおりに調製した。それをＧＰＶＩ−Ｆｃ（ＮａＨＣＯ３ ０．１Ｍ；ＮａＣｌ ０．５Ｍ ｐＨ８．３のゲルの８ｍｇ／ｍＬ）とともに攪拌下で１８時間インキュベートした。このゲルを濾過し、濾液中の前記タンパク質濃度を測定して、結合収量を決定した。エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．８）を用いてゆっくりと攪拌しながら暗所にて室温で２時間の遮断工程後、このゲルを濾過し、結合バッファーおよび酢酸ナトリウム０．１Ｍ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ ｐＨ４で順次洗浄した。このゲルをアジ化ナトリウム（１％）含有ＰＢＳ中、４℃で保存した。
【００６１】
１．１．２ 手順
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の遺伝的構造：
ヒトＧＰＶＩに対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）９Ｏ１２．２．２を産生する、新たにサブクローニングしたハイブリドーマ９Ｏ１２．２．２細胞からｍＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲ後、前記抗体可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングによりｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２遺伝子を作出した。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２の製造にはｐＵＣ １９［ｐＳＷ Ｉベクター（３７）］から誘導した発現ベクターを用いた。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ誘導性ＬａｃＺプロモーター、ｐｅｌＢリーダー配列と、下流に、フラッグｃ−ｍｙｃと融合されたｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をコードする遺伝子および組換え細菌を選択するのに用いられるアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００６２】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２発現ベクターの構築に用いた方法を図１に要約する。
【００６３】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の製造
リーダー配列ｐｅｌＢは、組換えｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２を、発現ベクターｐＳＷ ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２ｍｙｃで形質転換した細菌の周縁質に向けることを可能にする。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２を作製するために、細菌Ｔｏｐｐｌ（登録商標）（非Ｋ１２、Ｒｉｆ、Ｆ’、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩｑＺΔＭ１５、Ｔｎ１０、ｔｅｔｒ）(Stratagene, La Jolla, USA)、コロニー５５Ｔｌを用いる。
【００６４】
＊Ｊ０：アンピシリンを補給したＬＢ寒天への５５Ｔｌコロニーのプレーティング（サブクローニング）。３７℃で一晩インキュベーション。
【００６５】
＊Ｊ１：４ ＰＭ：一クローンの選択およびアンピシリンを補給したＬＢ ５ｍＬ中での培養。攪拌（１２５ｒｐｍ）しながら３７℃で一晩インキュベーション。
【００６６】
＊Ｊ２：８ ＡＭ：６００ｎｍにおける吸光度の測定（予測値Ａ６００ｎｍ＝１．５±０．１）。５００ｍＬ ２ｘＴＹ＋アンピシリンへの４ｍＬの移入。Ａ６００ｎｍが１．５±０．１に達するまで（〜８時間）、攪拌（１２５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベーション。その後、０．８ｍＭ ＩＰＴＧでの細菌の誘導。攪拌（７５ｒｐｍ）しながら１６℃で１６時間インキュベーション。
【００６７】
＊Ｊ３：周縁質タンパク質抽出：遠心分離（３６００ｇ、４℃で２０分）により細菌細胞を集める。ペレットを１０ｍＬ ＴＥＳバッファー中にゆっくりと再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートする。次に、これらの細胞を、ＴＥＳバッファーを加えることによって弱い浸透圧ショックに付し、１：４希釈する。氷上で３０分間のインキュベーション後、４℃にて１５０００ｇで３０分間の遠心分離により不溶性物質を除去する。さらに、周縁質タンパク質抽出物に相当する上清にデオキシリボヌクレアーゼＡ（５０Ｕ）およびプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン ２μｇ／ｍＬ）を加える。その後、調製物を４℃でＰＢＳに対して大規模に透析する。同じ手順に従って、無関連のｓｃＦｖを発現する細菌の周縁質タンパク質抽出物を調製する。
【００６８】
＊Ｊ４：４℃にて１５０００ｇで３０分間の遠心分離。上清を集め、２８０ｎｍにおけるその吸光度を測定する（予測値：１．５〜３．０）。解析のために一サンプルをとり、調製物（〜３５ｍＬ±２．０）を−２０℃で保存する。
【００６９】
＊Ｊ５：フローサイトメトリーによる周縁質抽出物のスクリーニング：洗浄したヒト血小板（２ｘ１０７／ｍＬ）を１００μＬの周縁質タンパク質抽出物とともに室温で３０分間インキュベートする。ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧを加え、そのインキュベーションを暗所にて室温で３０分間続ける。陰性対照は、周縁質抽出物の不在下で抗ｃ−ｍｙｃ抗体とともに行う。サンプルをフローサイトメトリー（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬ）により解析する。
【００７０】
＊Ｊ６：ＧＰＶＩ結合セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによるｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の精製。周縁質抽出物（３５ｍＬ）を５００μＬ ＧＰＶＩ−セファロースとともに４℃で１２時間、さらに室温で４時間インキュベートする。この混合物をカラムにのせる。流出画分を集めた後、ＰＢＳでＡ２８０ｎｍ＝０．００１まで洗浄し；グリシン０．１Ｍ ｐＨ３．０を用いて溶出を行い、氷上で４００μＬの画分を５μＬ Ｔｒｉｓ ３Ｍの入ったチューブに集める。Ａ２８０ｎｍを測定し、Ａ２８０ｎｍが０．２より高い画分をプールし、ＰＢＳに対して大規模に透析する。
【００７１】
＊Ｊ７：このサンプルを１５０００ｇで３０分間遠心分離する。Ａ２８０ｎｍ測定後、タンパク質濃度を決定する。ＰｒｏｔＰａｒａｍソフトウエア(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)を用いて、ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２ｍｙｃの理論Ｍｒおよび２８０ｎｍにおけるその吸光係数を決定する。
【００７２】
タンパク質解析：
タンパク質解析を、LaemmliによるＳＤＳの存在下でのポリアクリルアミドスラブゲルでの電気泳動により；タンパク質のニトロセルロースへの転写、ＨＲＰ結合抗ｃ−ｍｙｃ抗体とのインキュベーションおよび４クロロナフトールを用いた検出後の免疫ブロット法により行った。
【００７３】
質量の実験的測定
精製ｓｃＦｖのＭｒをマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計(Voyager DE-PRO; PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA)で測定する。５０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡ中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸飽和溶液をマトリックスとして用い、外部標準ペプチド混合物を用いて分光計を較正する。
【００７４】
サイズ排除−拡散クロマトグラフィー：
精製ｓｃＦｖ調製物を、既知分子量の標準を用いて較正したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲカラムでのサイズ排除拡散クロマトグラフィーにより分離した。２００μＬのサンプルを０．５ｍＬ／分の速度で注入した。紫外線検出器を用いて２２６ｎｍで検出をモニタリングする。解析には画分をそのまま用いた。
【００７５】
可溶性組換えＧＰＶＩとの結合
マイクロタイタープレートをＧＰＶＩ−Ｆｃ（１０μｇ／ｍＬ、１ウェルにつき１００μＬ）にて４℃で一晩コーティングする。ウェルを１００μＬ ＢＳＡにて室温で２時間飽和させる。次に、これらのウェルに漸増濃度のｓｃＦｖ ９Ｏ１２を２時間加える。ＨＲＰ結合抗ｃ−ｍｙｃ−抗体（ＰＢＳ中１／７５０）とともに室温で２時間のインキュベーション後、結合したｓｃＦｖを検出する。その後、これらのウェルに基質溶液（ＯＰＤ）を５分間加え、４９２ｎｍで吸光度を読み取る。２つの対照：ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の代わりに無関連のｓｃＦｖを用いる第一の対照およびＧＰＶＩ−Ｆｃでのコーティングを省いた第二の対照を行う。中間工程ごとに０．０５％ Ｔｗｅｅｎおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有するＰＢＳで５回洗浄を行う。
【００７６】
第一ヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））の構築
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をヒト化するアプローチはＣＤＲグラフト技術９から適応させた。ネズミ９Ｏ１２．２抗体のＣＤＲをヒト可変鎖フレームワークにグラフトした。ヒト抗体の選択は次の判定基準を用いて行った：結晶構造が解明されており（ｐｄｂライブラリーのＩＶＧＥ）；ヒト抗体ＩＶＧＥの可変領域が９Ｏ１２．２の可変領域と高度の配列相同性（ＶＨ ６０．６％；ＶＬ ５５．４％）を示し；候補ヒト抗体ＩＶＧＥと９Ｏ１２．２の可変領域のモデルとの結晶学的データの構造比較が行われ、それにより本発明者らがヒトアクセプタースキャフォールドＩＶＧＥの選択の正当性を立証することが可能であった。この戦略はＶＨドメインとＶＬドメインの相互作用の安定性を低下させる危険性を最小限にしながら、ＣＤＲの適正な折りたたみに必要なスキャフォールドを保存し、抗原に対して高い親和性を保存する。これらの解析に基づいて選択されたヒト抗体ＩＶＧＥにより本発明者らはヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖを構築することができた。ヒト化ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をコードするヌクレオチド配列には至適化を行った。最初に、最適な結合特性を提供するために調整することができるように、ＣＤＲ領域間に制限部位を挿入した。さらに、原核生物発現系大腸菌においてヒト化ｓｃＦｖを発現させるために、細菌コドン使用頻度を用いて至適化を行った。
【００７７】
より厳密には、本発明者らは最初に、９Ｏ１２可変領域と最もよく似た配列を有する結晶構造を同定した後、ｍｓｃＦｖ９Ｏ１２の３Ｄ構造モデルをin silicoで構築した。これら総ての配列はネズミ由来のものであった。モデリングには上位４位のスコアのネズミ由来構造を用いた。ＶＨ遺伝子については、本発明者らは、９Ｏ１２と６６〜７８％の配列同一性（７９〜８５％類似性）を有する１ＰＬＧ、１ＭＮＵ、１Ａ５ＦおよびＨＧＩを用いた。ＶＬ遺伝子については、本発明者らは、８７〜９０％の配列同一性（９４〜９５％類似性）を有する１ＰＬＧ、ＨＧＩ、１ＭＮＵおよび１ＡＸＴを用いた。これら総ての配列の３Ｄ構造は２．８Åより高い分解能を用いて解明された。Ｍｏｄｅｌｅｒ ３．０ソフトウエアを用いて各ドメインにつき２０のモデルを作成し、ＲＭＳＤ値（ＶＨについては０．１３ÅおよびＶＬについては０．７０３Å）および詳細検査に基づいて最適なものを選択した。
【００７８】
次に、本発明者らは９Ｏ１２ Ｖ−ドメインのヒト化を進めた。これを行うために、ＦＡＳＴＡ検索を行って、ＰＤＢデータバンクに登録されたヒト抗体配列のレパートリーに対してＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を独立にアラインした。９Ｏ１２にマッチしたヒトＶ−ドメインのうち、本発明者らは最初に、自然抗体中で起こるドメイン間接触を保存するために、同じ抗体分子由来のＶＨおよびＶＬを選択した。ヒト抗体ＩＶＧＥは、Ｖ−ドメイン配列全体を見たときに９Ｏ１２と最高の同一性スコアを有し、ＶＨおよびＶＬについてそれぞれ６２％および５５％の同一性を示すことが分かったためそれを選択した。フレームワーク領域配列だけで計算すると、その同一性はさらに少し高まり、それぞれ６９．５％および６５．４％の同一性を示した。さらに、ＩＶＧＥの結晶構造は高分解能（２ÅおよびＲ値０．１８）で解明された。そのため、本発明者らは９Ｏ１２ ＣＤＲをＩＶＧＥ鋳型にin silicoでグラフトすることにした。この構築物をコードする遺伝子を化学合成し、ｍｓｃＦｖ９Ｏ１２について行ったとおりに正確にｐＳＷＩに挿入した。このベクターで形質転換したＴＯＰＰＩ細胞を、組換えタンパク質を発現するように誘導した。
【００７９】
この結果、第一のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）と呼称）が得られた
【００８０】
９Ｏ１２．２ ＩｇＧとの競合：
ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（１００μｇ／ｍｌ）を漸増濃度の９Ｏ１２．２ ＩｇＧと混合した後、ＧＶＩ−Ｆｃでコーティングしたマイクロタイトレーションウェルに加えた。結合したｓｃＦｖを上記のとおり検出した。
コラーゲンとのＧＰＶＩの結合に対する抗体の効果：
【００８１】
マイクロタイトレーションウェルを繊維状タイプＩコラーゲン(fibrilar type I collagen)（Collagen Horn，Nycomed, Munich ２μｇ／ウェル）でコーティングし、ＢＳＡで飽和させ、洗浄する。これらのウェルに、ＰＢＳ、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２またはＦａｂ ９Ｏ１２．２とともにプレインキュベートしたＧＰＶＩ−Ｆｃの漸増量を加える。室温で１時間、洗浄後、結合したＧＰＶＩ−Ｆｃをペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃおよびＯＰＤを用いて検出する。
【００８２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、BIAcore）：
抗ＧＰＶＩ ｓｃＦｖと組換えＧＰＶＩ−Ｆｃとの結合をＢＩＡｃｏｒｅ ２０００システム(Uppsala, Sweden)を用いた表面プラズモン共鳴により解析する。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２、タンパク質加水分解Ｆａｂおよび親ＩｇＧについて結合研究を行う。
【００８３】
組換えＧＰＶＩ−Ｆｃを、アミンカップリング法（ウィザード法）を用いてカルボキシ−メチルデキストランＣＭ５センサーチップ上に固定する（〜６００ＲＵ）。次に、固定した組換えＧＰＶＩ−Ｆｃ上に、抗体をＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ））中、２５℃で流速２０μｌ／分で流す。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．１ソフトウエアを用いて、データを結合モデルに当てはめることにより速度定数（ｋａ、ｋｄ）および親和性を決定する。ＨＢＳ−ＥＰはランニングバッファーである。２０μｌ／分で３０秒間注入した１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．５は再生バッファーである。用いた総ての試薬およびバッファーはBiacore社製である。
【００８４】
精製ｓｃＦｖとヒト血小板ＧＰＶＩとの結合
洗浄したヒト血小板（２．１０７／ｍＬ）を０〜１００μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖ ９Ｏ１２とともに室温で３０分間インキュベートし、その後、５μＬのＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ（希釈溶液１：６０）とともに暗所にて室温で３０分間再びインキュベートする。細胞蛍光をフローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ ＸＬ、Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて測定する。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の代わりに無関連のｓｃＦｖを用いることによりバックグラウンドを測定する。
【００８５】
血小板凝集
洗浄したヒト血小板（３ｘ１０８／ｍＬ）を、ＰＢＳ、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２またはＦａｂ ９Ｏ１２．２とともに攪拌せずに３７℃で５分間プレインキュベートする。タイプＩコラーゲンを加えることによって凝集を開始させ、光透過率の変化を連続記録する（Chronolog社製血小板凝集計）。
【００８６】
フロー条件下での血小板凝集
フロー条件下でのコラーゲンへの血小板粘着を、基本的には別記のとおり（９）測定した。ガラスカバースリップを繊維状タイプＩコラーゲン（５０μｇ・ｍＬ−１）でコーティングした。健康なボランティアの血液を４０μＭ ＰＰＡＣＫで採取し、ＤＩＯＣ−６（１μＭ）で標識した。血液アリコートを、バッファーまたは終濃度５０μｇ・ｍＬ−１の精製抗体フラグメント（Ｆａｂ ９Ｏ１２、ｍｓｃＦｖ９Ｏ１２、ｓｃＦｖ ９Ｃ２）とともに室温で１５分間インキュベートした。次に、この混合物を、フローチャンバー内に挿入した、コラーゲンでコーティングしたカバースリップに１５００秒−１で５分間散布した。透過率および蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて実時間で記録した。蛍光画像は、散布終了時に任意選択された少なくとも１０の異なるコラーゲン含有顕微鏡視野から得られた。蛍光画像の領域カバレージをＨｉｓｔｏｌａｂソフトウエア(Microvision, Evry, France)を用いてオフラインで解析した。
【００８７】
トロンビン生成
トロンボグラム法を用いて上述のとおりに（３８）多血小板血漿（ＰＲＰ）中でトロンビン生成を連続測定した。要するに、クエン酸ＰＲＰ（１．５ｘ１０８血小板 ｍＬ−１）を抗体フラグメントとともに３７℃で１０分間インキュベートした後、コラーゲンを加えた。１０分後、組織因子（０．５ｐＭ）の入ったマイクロタイトレーションプレートのウェルにサンプルを入れることによってトロンビン生成を開始させた。３７℃で５分後、ＣａＣｌ２含有バッファーおよび蛍光トロンビン基質Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ(Stago, Asnieres, France)）を加えることによって反応を開始させた。開裂された基質の蛍光蓄積を励起波長および発光波長それぞれ３９０ｎｍおよび４６０ｎｍにおいて連続測定した。蛍光蓄積の一次導関数曲線を、トロンビン較正装置を用いてトロンビン濃度曲線に変換した（３９）。ピーク高さはトロンビン形成最大速度の指標であり、血小板活性化に影響を受ける。
【００８８】
１．２ 結果
１．２．１ ネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖ（ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２）
抗体９Ｏ１２．２．２ ＶＨ ｃＤＮＡおよびＶＬ ｃＤＮＡのクローニング
９Ｏ１２．２はネズミＩｇＧ１（κ鎖）である。全ＲＮＡを、新たにサブクローニングしたハイブリドーマ細胞 約５．１０８からＴｒｉｚｏｌを用いて一段階法により抽出した。このＲＮＡ調製物を一本鎖ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。次に、ＩｇＧ ９Ｏ１２．２．２ ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードする二本鎖ｃＤＮＡを、プライマーセット（ＶＨＲｅｖ、ＶＨＦｏｒ）および（ＭＫＲｅｖＵ、ＭＫＣ５Ｆｏｒ）それぞれを用いたＰＣＲにより増幅した。ＶＨ ｃＤＮＡ配列はユニークであり、これはｐＧＥＭＴへのクローニング後のｃＤＮＡの配列決定により確認された。ＶＬドメインに対応するＰＣＲ産物の配列をスクランブルした。ｐＧＥＭＴへクローニングし、数クローンを配列決定した後、２つのＶＬ配列を同定した。ｆａｓｔａ解析を用いたデータ解析により、それらのＶＬ配列の１つが内因性の異常な非機能性Ｖｋ ｍＲＮＡ（Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ受託番号Ｍ３５６６９）を発現するＭＯＰＣ−２１クローンに由来することが分かった。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の一部として、もう一方のＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図２に示している。これらの配列をいくつかのデータバンク(UNIPROT UNIREF100 UNIREF90 UNIREF50 UNIPARC SWISSPROT IPI PRINTS SGT PDB IMGTHLAP, PATENT: epop jpop uspop)(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/)(DNA banks: EMBL, Human, MOUSE, SYNTHETIC, PATENT)に登録された免疫グロブリン可変領域配列と比較した。これにより、本発明者らはＶＨ領域およびＶＬ領域の相補性決定領域に相当する３つのループならびにカノニカル構造に関与するアミノ酸残基を同定することができた。
【００８９】
Kabat et al. (1991)およびChotia and Lesk (1987)から推定される次のルールに従ってＣＤＲを同定した：
・ＣＤＲ−Ｌ１：
開始−およそ残基２４
前の残基は常にＣｙｓである
後の残基は常にＴｒｐである。典型的にはＴＲＰ−ＴＹＲ−ＧＬＮ、同様に、ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＧＬＮ、ＴＲＰ−ＰＨＥ−ＧＬＮ、ＴＲＰ−ＴＹＲ−ＬＥＵ
長さ １０〜１７残基
・ＣＤＲ−Ｌ２：
開始−常にＬ１後１６残基
前の残基 一般的にはＩＬＥ−ＴＹＲ、同様に、ＶＡＬ−ＴＹＲ、ＩＬＥ−ＬＹＳ、ＩＬＥ−ＰＨＥ
長さ 常に７残基。
・ＣＤＲ−Ｌ３：
開始−常にＬ２後３３残基
前の残基は常にＣｙｓである
後の残基 常にＰＨＥ−ＧＬＹ−ＸＸＸ−ＧＬＹ
長さ ７〜１１残基
・ＣＤＲ−Ｈ１：
開始−およそ残基２６（常にＣＹＳ後４残基）［Chothia/AbM定義］ Kabat定義では５残基後に開始する
前の残基 常にＣＹＳ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ
後の残基 常にＴＲＰ。典型的にはＴＲＰ−ＶＡＬ、同様に、ＴＲＰ−ＩＬＥ、ＴＲＰ−ＡＬＡ
長さ １０〜１２残基（AbM定義） Chothia定義では最後の４残基を排除する
・ＣＤＲ−Ｈ２：
開始−常にＣＤＲ−Ｈ１の後１５残基Kabat/AbM定義）
前の残基 典型的にはＬＥＵ−ＧＬＵ−ＴＲＰ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、同様に多数の変化物
後の残基 ＬＹＳ／ＡＲＧ−ＬＥＵ／ＩＬＥ／ＶＡＬ／ＰＨＥ／ＴＨＲ／ＡＬＡ−ＴＨＲ／ＳＥＲ／ＩＬＥ／ＡＬＡ
長さ Kabat定義 １６〜１９残基（AbM定義では７残基前に終わる）
・ＣＤＲ−Ｈ３：
開始−常にＣＤＲ−Ｈ２後３３残基（常にＣＹＳ後２残基）
前の残基 常にＣＹＳ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（典型的にはＣＹＳ−ＡＬＡ−ＡＲＧ）
後の残基 常にＴＲＰ−ＧＬＹ−ＸＸＸ−ＧＬＹ
長さ ３〜２５残基
【００９０】
ＶＨ ｃＤＮＡ配列は、別のネズミＶＨドメイン（ＭＭＭＤ５２Ｃ）をコードするｃＤＮＡと９２．９６％の同一性を示した。ＶＬについては、本発明者らは、ネズミ抗アセチル−ＬｙｓのＶＬドメイン（ＢＤ１７４８９１）をコードするｃＤＮＡ配列と９８．５１％の同一であることを見出した。推定アミノ酸配列解析でもネズミＩｇの配列と高い相同性を示した。９Ｏ１２．２ ＶＨは、抗ＣＤ２０ネズミＩｇＧの推定アミノ酸配列（ＢＤ６８８６５５）と８９．２５６％の同一性を示した。９Ｏ１２．２ ＶＬは、抗アセチル ＬｙｓネズミＩｇＧの推定アミノ酸配列（ＢＤ５８１２８８）と９６．４３％の同一性を示した。
【００９１】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の設計
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図２に示している。ｓｃＦｖは２６６アミノ酸長であり、［Ｇ４Ｓ］３リンカーによって互いに結合されたＶＨおよびＶＬ配列とそれに続く短いスペーサー（８残基）およびｃ−ｍｙｃフラッグ配列（１１残基）からなる。
【００９２】
ｓｃＦｖの理論構造特性
ｓｃＦｖの理論分子量は、ＰｒｏｔＰａｒａｍソフトウエアを用いて決定されるように２８３９３．５である。そのｐＩは６．９２であり、その吸光係数は２８０ｎｍにおいて４９６４０Ｍ−１ｃｍ−１である（表３）。
【００９３】
【表３】
【００９４】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の分子モデリング
鋳型として用いたネズミ可変領域のＰｄｂファイルは：
ＶＨドメインについては：１ＰＬＧ：Ｈ；１ＭＮＵ：Ｈ；１Ａ５Ｆ：Ｈ；１ＩＧＩ：Ｈ、
ＶＬドメインについては：１ＰＬＧ：Ｌ；１ＩＧＩ：Ｌ；１ＭＮＵ：Ｌ；１ＡＸＴ：Ｌである。
可変領域のモデリングにはＭｏｄｅｌｅｒ ３．０．ソフトウエアを用いた。各ドメインにつき２０のモデルを設計し、ＲＭＳＤ値：ＶＨ（ＲＭＳＤ：０．１３Å）；ＶＬ（ＲＭＳＤ：０．７０３Å）に基づいて最適なものを選択した。このモデルを図３に示している。
【００９５】
周縁質抽出物の解析
ｓｃＦｖが予測される抗ＧＰＶＩ活性を有するかどうかを評価するために、周縁質抽出物を、ヒト血小板およびＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧを用いて試験した。図４は、９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの存在下で血小板蛍光が右側へシフトし（４０％陽性血小板）、無関連のｓｃＦｖの存在下ではそれが起こらない（０．１７％陽性血小板）ことを示している。さらに、周縁質抽出物を、固定した組換え可溶性ＧＰＶＩとともにインキュベートしたときには、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合だけが検出された。これらの結果を合わせて、９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖは抗ＧＰＶＩ特性を保有することが示される。
【００９６】
９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの製造および精製
周縁質抽出物、流出画分およびＧＰＶＩ−セファロースカラムからの溶出画分中に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、そしてイムノブロットにより解析した（図５Ａおよび５Ｂ）。溶出画分は、理論質量に一致する〜２８ｋＤａの主要なバンドとして現われる。このバンドは、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたイムノブロットによっても検出される。これらの結果は、アフィニティークロマトグラフィーによってかなり純粋なｓｃＦｖ画分を得ることができることを示している。
【００９７】
サイズ排除クロマトグラフィー
ｓｃＦｖの精製調製物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０カラムに適用したときに、〜２５ｋＤの１つの主要なピーク（モノマーｓｃＦｖに相当する）が観察された（図６）。このピークは、４５ｋＤａおよび６８ｋＤａにおける２つのあまり重要でないピーク（二量体およびオリゴマーｓｃＦｖに相当する）より先に生じた。
【００９８】
単量体ｓｃＦｖは非常に安定しており、４℃で保存すると多量体形態は単量体に自発的に戻り、これによりＧＰＶＩとの一価結合および生物学的効果を保存することは絶対的となる。実際には、二価抗ＧＰＶＩ分子（ＩｇＧまたはＦ（ａｂ）’２）が血小板活性化をもたらし得る（４０，９３）ことは十分に確立されている。
【００９９】
９Ｏ１２．２ 精製ＧＰＶＩ−ＦｃとのｓｃＦｖの結合および９Ｏ１２．２ ＩｇＧとの競合
精製ｓｃＦｖはマイクロタイトレーションプレート上に固定されているＧＰＶＩ−Ｆｃと用量依存的に結合した（図７Ａ）。結合特異性は、無関連のｓｃＦｖが同じ条件でＧＰＶＩと結合しなかったという事実によって示される。
【０１００】
さらに、精製ＧＰＶＩとのｓｃＦｖとの結合は親ＩｇＧによって用量依存的に阻害された（図７Ｂ）。
【０１０１】
可溶性ＧＰＶＩに対する９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの親和性
表面プラズモン共鳴によって確認されたＧＰＶＩ−Ｆｃに対する９Ｏ１２．２ ＩｇＧの親和性およびパパイン消化後に調製されたそのＦａｂ（ｐＦａｂ）の親和性は高く、Ｋｄはそれぞれ６．５ １０−９Ｍおよび４．５ １０−９Ｍである。ｓｃＦｖのＫｄは２．５ １０−９Ｍである（図８）。
【０１０２】
第二次試験では、次の動力学的パラメーター値を決定した：ｋｏｎ＝６．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝１．７ｘ１０−４ｓ−１および９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤ＝２．６ｎＭ；さらに９Ｏ１２ タンパク質加水分解ＦａｂフラグメントのＫＤ＝２．３ｎＭおよび親ＩｇＧのＫＤ＝４．０ｎＭ。これらの値は第一次試験で得られた値と非常に類似しており、ナノモルＫＤ値が確認される。
【０１０３】
このように、ネズミｓｃＦｖ ９Ｏ１２は非常に高い機能的親和性をなお有し、ＫＤ値は１０−９Ｍの範囲内であり、このことがｓｃＦｖ−血小板ＧＰＶＩ複合体の安定性に寄与することは間違いなく、これによりフロー条件下での血小板凝集を阻害することは絶対的である。
【０１０４】
精製９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖはコラーゲンとのＧＰＶＩの結合を阻害する
９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖは、固定されている繊維状コラーゲンタイプＩとのＧＰＶＩ−Ｆｃの結合を用量依存的に阻害した（図９）。その阻害能力は９Ｏ１２．２ ｐＦａｂのものに近い。
【０１０５】
より厳密には、ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２はコラーゲンとのＧＰＶＩの結合を阻害し（ＩＣ５０はおよそ１．１７μｇ．ｍＬ−１（４２μＭ））、８０％阻害はｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の濃度５〜１０μｇ．ｍＬ−１において達した。この阻害能力は、親ＩｇＧのパパイン消化後に調製されたＦａｂ ９Ｏ１２（２．１μｇ．ｍＬ−１；１５ｎＭ）で観察されたものと同等であった。
【０１０６】
精製９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖはヒト血小板と結合し、コラーゲン誘導血小板凝集を阻害する。
【０１０７】
ヒト血小板との精製ｓｃＦｖの結合をフローサイトメトリーにより測定した。ピークの右側シフトによりｓｃＦｖがヒト血小板と用量依存的に結合することが示される（図１０）。無関連の精製ｓｃＦｖは血小板と結合しなかった。
【０１０８】
ＧＰＶＩ機能に対する９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの効果を、コラーゲン誘導血小板凝集を測定することによって試験した。このために、モノマー形態のｓｃＦｖをサイズ排除ゲルクロマトグラフィーによって精製した。９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖ（２５μｇ／ｍＬ）は、同じ濃度で用いた９Ｏ１２．２ ｐＦａｂと同じく、コラーゲン誘導血小板凝集を完全に抑制した（図１１）。
【０１０９】
フロー条件下での血小板凝集
さらに、コラーゲンへの血小板粘着および凝集に対するｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の効果を動脈流条件下で調査し、Ｆａｂ ９Ｏ１２および無関連のｓｃＦｖの結果と比較した（図１２参照）。この場合もコラーゲンによって誘導される血小板凝集が阻害された。ｓｃＦｖまたはＦａｂの存在下では、前の結果と一致してコラーゲン繊維と結合した分離血小板だけが観察され（９，４１）、対照条件とは対照的に、大きな血小板集塊は観察されなかった。
【０１１０】
トロンビン生成
Ｆａｂ ９Ｏ１２はコラーゲンによる刺激を受ける血小板の表面におけるトロンビン生成を阻害することが知られていることから、精製ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の効果を、トロンボグラム法を用いて試験した（図１３）。ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２およびＦａｂ ９Ｏ１２は、トロンビンピークを同様の程度まで下げ、トロンビン生成を遅らせた。このことから、ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２はコラーゲン誘導血小板凝血促進活性の阻害においてＦａｂ ９Ｏ１２と同程度有効であることが示される。
【０１１１】
１．２．２ 第一のヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖ（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））
次に、本発明者らは、第１．１．２段に記載のようにネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメントをヒト化した。ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインならびに第一ヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図１４に示している。次に、このｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）フラグメントを、ＧＰＶＩセファロースとの親和性結合を用いてさらに特性決定した：組換え細菌の周縁質画分をＧＰＶＩセファロースカラム上にのせた。保持されたタンパク質を抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ、続いてＨＲＰと結合した抗マウス抗体を用いたウエスタンブロットおよびＥＣＬによる検出によって解析した。ヒト化ｓｃＦｖについて予想されたとおりに、分子量２８．５ｋＤａの単一バンドが検出される（図１５）。
【０１１２】
さらに、ＧＰＶＩ−ＦｃとのｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）の結合を解析し、ネズミｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２）の結果と比較した。精製ヒト化ｓｃＦｖおよびｍｓｃＦｖを、ＣＭ５センサーチップ上に固定されているＧＰＶＩ−Ｆｃ上に注入した。結果を図１６に示しており、これらの結果からｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）がＧＰＶＩ−Ｆｃとも、ｍｓｃＦｖより高いように思われる親和性で結合するということが示される。
【０１１３】
最後に、ヒト血小板とのｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（ｌ）の結合を研究した。ヒト血小板を細菌周縁質抽出物とともにインキュベートした。血小板と結合したｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）を、ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて検出した。血小板との結合をＸＬ Ｅｐｉｃｓ Ｃｏｕｌｔｅｒフローサイトメーターで解析した。陰性対照として無関連のｓｃＦｖを用いた。結果を図１７に示しており、これらの結果からｈｓｃＦｖについてのヒストグラムの右側シフトが示され、これによりヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）が血小板ＧＰＶＩと結合することが分かる。
【０１１４】
１．３ 結論
上記の結果は、本発明者らによって９Ｏ１２．２モノクローナル抗体から作製されたネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖが、本質的な構造修飾にもかかわらず、ヒトＧＰＶＩと特異的に高親和性で結合することをはっきりと示している。さらに、そのネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖはコラーゲンとのＧＰＶＩの結合を阻害し、コラーゲン誘導血小板凝集を抑制するため、ＧＰＶＩ機能を阻害する。
【０１１５】
よって、このｓｃＦｖフラグメントはｓｃＦｖフラグメントの総ての利点を示しながら、対応するＦａｂフラグメントについての親和性および阻害能力を保有している。
さらに、本発明者らは、新たな本質的な構造修飾にもかかわらず、同様にヒトＧＰＶＩと高親和性で結合する第一ヒト化型９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメントも作製した（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））。
【０１１６】
この第一ヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２）は、免疫原性が潜在的に最小限に低下されているという利点をさらに有する。
【０１１７】
よって、本願は、血小板凝集を阻害する高い能力を有する低分子量、低免疫原性のＧＰＶＩリガンドについて初めて記載し、このＧＰＶＩリガンドによって結果的に動脈血栓症の処置に極めて有望な製品がもたらされる。
実施例２ ヒト糖タンパク質ＶＩに対する第二の至適化されたヒト化単鎖可変フラグメントｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２）の合成および活性
【０１１８】
第一の組換えヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（１）フラグメントの作製は困難であったことから、この構築物におけるいくつかの精密化が必要であった。このようにしてｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（１）から第二の至適化ヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（２）フラグメントを得た。
【０１１９】
２．１ 試験手順
第二のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））の構築
本発明者らは、元のネズミＣＤＲとヒトアクセプターフレームワークの間の予測されない構造的不和合性がＶ−ドメインの不適切な折りたたみならびに細菌の細胞質に隔離されて留まる不溶性の封入体の形成をもたらしたのではないかと仮定した。これらの困難を克服するため、いくつかの微細な精密化を行った。
【０１２０】
まず、本発明者らは、９Ｏ１２ ＣＤＲ Ｌ１ループがＩＶＧＥのものよりも５残基長いこと、および９Ｏ１２およびＩＶＧＥのフレームワーク１および２の同一性スコアが低いこと（それぞれ４８％および７３％）を見出した（図１９）。これにより、ＩＶＧＥ軽鎖ＦＲ１およびＦＲ２がＣＤＲ Ｌ１の適正な折りたたみに適さないことが示唆された。
【０１２１】
次に、９Ｏ１２ ＶＬ ＦＲ１およびＦＲ２を用いて、さらなるＦＡＳＴＡを行った。ＦＲ１およびＦＲ２ではヒト１Ｘ９Ｑと良好な一致が見られた（それぞれ同一性スコア９５．６および８６．６、両場合で類似性１００％）。さらに、選択抗体１Ｘ９ＱのループＬ１（ＣＤＲ１）は９Ｏ１２のものと長さが類似していた。
【０１２２】
従って、本発明者らは、それらのフレームワークの配列が別のヒト抗体フレームワーク（１Ｘ９Ｑ）とよく一致している（そのＣＤＲ Ｌ１は９Ｏ１２のものと正確に同じサイズであった）ことから新規なヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（２）の構築において元のネズミ９Ｏ１２ ＶＬ ＦＲ１およびＦＲ２を保存することにした（図１９参照）。
【０１２３】
モデルの綿密な検査に基づき、他の精密化も行った。実際に、本発明者らはまた、最終的なｈＳｃＦｖ ９Ｏ１２構築物において、ＣＤＲループの、それらのコンフォメーションを採用する能力に影響を及ぼし得る極めて限定された数の残基を保持した。２つの重要な領域を保存した。１つ目のものは、Ｌ ＣＤＲ２の残基に近接していることからおそらく重要であると思われるＶＬ．Ｌ５９（ヒト鋳型におけるＰ）の５９〜６０番のジペプチドＬＤであった。ＬとＰは双方とも疎水性であるが、Ｐは環状側鎖であり、タンパク質主鎖構造に特定の影響を誘導することが知られている(MacArthur and Thornton, 1999)。さらに、本発明者らは、この位置にＬはＰよりもはるかに存在が少ない（２％）ことに気づき、これは特定の役割の指標となり得る(Honegger & Pluckthun, 2001)。ヒト鋳型（ＩＶＧＥ）と類似性のない他の変異していないネズミ残基はＶＨ ＦＲ３（ＡＨ７１、ＫＨ７３、ＲＨ７６、Ｋａｂｂａｔナンバリング）に位置していた。最後に、ヒト化に関して選択されたヒトフレームワークでは、ＶＬでは５つ、ＶＨでは１０個のみのネズミ残基を維持した。
【０１２４】
最終的な構築物を図１９に示す。ＶＨおよびＶＬフレームワーク３（それぞれ９０．６２および９３．７５％）を除いたヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（２）フレームワークは総て、ヒトフレームワークと１００％の類似性を示す（下表１参照）。
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
全体として、最終的な構築物では、ネズミＶＨ ＦＲ３由来の１１個のＮ末端残基が保存されたが、これはそれらが、その抗原が予測され、従ってそれと相互作用し得るポケットの平坦部分に明らかに近接しているためである。しかしながらやはり、ＶＨ ＦＲ３はＩＶＧＥと２５／３２残基の同一性を示す。このフレームワークの３残基（ＡＨ７１、ＫＨ７３、ＲＨ７６、Ｋａｂｂａｔナンバリング）のみがＩＶＧＥと類似性を示さなかった。９Ｏ１２ ＶＬ ＦＲ３を、本質的にＬはこの位置に見られる頻度が少なく、Ｄは酸性残基であるので、この２残基（Ｌ５９ＰおよびＤ６０Ｓ）を除き、そのＩＶＧＥ相対物と置換した。
【０１２７】
他の試験手順
第二のｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（２）フラグメントを特性決定するための他の総ての試験手順は実施例１に記載の通りに行った。
【０１２８】
２．２ 結果
ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）の製造は、ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（１）のものより良好であった。
【０１２９】
さらに、精製ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）フラグメントは、固定化ＧＰＶＩに対するＳＰＲ分析（ｋｏｎ＝５．８×１０４Ｍー１ｓー１、ｋｏｆｆ＝１．８６×１０−４ｓー１および解離定数ＫＤ＝３．２ｎＭ）によって示されたように、その標的に対する高い親和性を保存していた。
【０１３０】
それはフローサイトメトリーにおいて新しく産生されたヒト血小板と結合することができ、蛍光ピークの右側シフトは、同様の実験条件下の、ネズミｍｓｃＦｖ９Ｏ１２で標識された細胞のものと常に類似していた（図２０Ｂ参照）。血小板を過剰量のＦａｂ ９Ｏ１２と予め混合した場合は、ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）結合のほぼ完全な阻害がみらレセプター他。これらの結果は、アフィニティー精製されたｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）分子がＧＰＶＩならびにヒト血小板の表面に曝されている天然ＧＰＶＩに対する親抗体の結合活性、親和性および特異性を保持していたことを示した。
【０１３１】
２．３ 結論
ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（１）に関して、ヒト化により通常を影響を受ける主要なパラメーターはｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）でよく保存されていた。アフィニティー精製されたｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）は十分機能的であり、生物学的適用の主要な点であるＧＰＶＩに対する高い親和性を有していた。ＦＡＣＳ分析はまた、ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）は、その結合が１モル過剰のＦａｂ ９Ｏ１２の存在下で特異的に遮断されたことから、ヒト血小板においてマウスＦａｂ ９Ｏ１２と同じエピトープを認識することを示した。
【参照文献】
【０１３２】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、配列番号１で示される、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドを介して結合された９Ｏ１２．２モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬドメインとそれに続く「ｃ−ｍｙｃ」フラッグからなる、ヒト糖タンパク質ＶＩに対する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２）に関する。本発明はまた、同一の重鎖および軽鎖相補性決定領域１、２および３を有する前記ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２フラグメントの機能的変異体、好ましくは、配列番号２８または配列番号４７で示されるヒト化ｓｃＦｖフラグメントなどのヒト化機能的変異体に関する。本発明はまた、このようなｓｃＦｖフラグメントをコードする核酸、このようなｓｃＦｖフラグメントを産生するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこのようなｓｃＦｖフラグメントの治療的使用に関する。
【０００２】
背景技術
急性冠動脈および脳血管偶発症候は現在、世界の第一の死因である。さらに、急性冠動脈症候群後の処置の６か月後の再発および死亡の全体の罹患率は依然として８〜１５％である。ＳＴセグメントの上昇を伴う急性冠動脈症候群の場合、冠動脈血管形成術およびステントの導入による機械的処置は冠動脈流を緊急に回復させるのに極めて効果的であるが、その後６か月に患者の１５％で罹患／死亡を防ぐことができない。
【０００３】
長期の繊維素溶解薬、抗凝固薬および抗凝集薬の組合せに基づく血栓溶解処置は、有望な結果はほとんど得られない。実際、血栓症の医学的処置が改善されたものの、６か月時点での罹患率／死亡率は、セグメントＳＴ上昇を伴わない急性冠動脈症候群で見られるものと同様である。
【０００４】
脳血管虚血の偶発症候に関しては、一般にほとんどの患者の手当が遅れるため、また、現在利用可能な抗血栓処置の出血リスクのために、処置は依然として非常に限定されたものである。
【０００５】
従って、心血管疾患の処置の改善、特に、利用可能な分子に比べて特徴が改善された新規な分子、特に出血作用が軽減された分子の、本当に差し迫った臨床上の必要性がある。
【０００６】
血小板−コラーゲン相互作用は急性動脈血栓の発生および血栓後の血管再構築において重要である。糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、コラーゲンによる血小板に対する主要な受容体は、実験的血栓症、血管再構築、動脈血栓および急性心筋虚血に役割を果たすことが動物で実証されている。
【０００７】
現在血栓処置に用いられ、血小板の最終活性化段階を阻害するαＩＩｂβ３インテグリンアンタゴニストに対して、ＧＰＶＩは血小板の初期活性化段階に関連し、従って、ＧＰＶＩアンタゴニストは血小板凝集を妨げるだけでなく、二次的アゴニストの放出、さらには血管傷害の発生をもたらす増殖因子およびサイトカインの分泌も妨げるはずである。さらに、ＧＰＶＩの欠乏は高い出血リスクを伴わず、従って、患者の安全性に関して重要な特性ではない。最後に、ＧＰＶＩの発現は血小板に限定されているので、抗血栓処置の完全に特異的な標的となる。
【０００８】
よって、ＧＰＶＩアンタゴニストは一次的および二次的血栓を特異的かつ効率的に防ぐのに効果的であり、しかも低い出血リスクしか伴わないはずである。
【０００９】
様々な種の可能性のあるＧＰＶＩアンタゴニストが作出されている。あるアプローチでは、ＧＰＶＩ細胞外ドメインとヒトＩｇ Ｆｃドメインの融合タンパク質である可溶性ＧＰＶＩ組換えタンパク質が作出されている（例えば、ＷＯ０１／００８１０（１）およびＷＯ０３／００８４５４（２）参照）。よって、可溶性組換えＧＰＶＩタンパク質は、コラーゲンとの結合をめぐって血小板と競合する。血栓症ネズミモデルではこの可溶性ＧＰＶＩタンパク質で初めて有望な結果が得られた（３）が、これらの結果は確認されていない（４）。さらに、このアプローチは構造的、機能的および薬理学的欠点を含んでいる。第一に、この化合物は高分子量タンパク質（〜１６０ｋＤａ）であり、その半減期は短いと予測される。ＧＰＶＩは少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位を含んでいるので、この性組換えＧＰＶＩ−Ｆｃタンパク質の加水分解を考えなければならない。コラーゲンと結合すると、このタンパク質はそのＦｃドメインを血流に曝す。ヒト血小板（マウス血小板はそうではない）および白血球はそれらの表面で親和性の低いＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＡ）を発現する。固定されたＧＰＶＩ−Ｆｃによる血小板ＦｃγＲＩＩＡの架橋は血小板を活性化しやすいので、予測されるものとは反対の作用を持つ。また、このタンパク質を投与すべきタイミングと用量も問題となっている。血小板は、ひと度コラーゲンと結合すると、急速かつ不可逆的に活性化される。従って、ＧＰＶＩ−Ｆｃを効果的とするには、血小板の活性化前に投与すべきであり、これは血栓事象の前であり、現在の医学ではまれな状況である。さらに、投与すべきタンパク質の量は、予測不可能なパラメーターである血管傷害の大きさと性質の関数として様々である。
【００１０】
他の多くのものはヒトＧＰＶＩに対する中和モノクローナル抗体を開発しようとした。例えば、ＥＰ１２２４９４２（５）およびＥＰ１２２８７６８（６）は、血栓性疾患の処置のための、マウスＧＰＶＩと特異的に結合するモノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体ＪＡＱ１を開示している。ＪＡＱ１抗体はマウス血小板上でＧＰＶＩ受容体の不可逆的インターナリゼーションを誘発する。
【００１１】
ＥＰ１５３８１６５（７）は、別のモノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体ｈＧＰ ５Ｃ４を記載しており、このＦａｂフラグメントは、コラーゲン刺激によって誘発された血小板の主要な生理機能に著しい阻害作用を有することが見出されている。なお、コラーゲンにより媒介される生理学的活性化パラメーターＰＡＣ−ＩおよびＣＤ ６２Ｐ−セレクチンの刺激は、内因性の活性のないex vivoにおいて、ｈＧＰ ５Ｃ４ ＦａｂおよびｈＧＰ ５Ｃ４ Ｆａｂにより強力に阻害されたヒト血小板凝集によって完全に妨げられた。
【００１２】
ＷＯ２００５／１１１０８３（８）は、in vitroにおいてＧＰＶＩとコラーゲンの結合、コラーゲンにより誘発される分泌およびトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）の形成、ならびにカニクイザルに静脈内注射した後にex vivoにおいてコラーゲンにより誘発される血小板凝集を阻害することが見出された４つのモノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体、ＯＭ１、ＯＭ２、ＯＭ３およびＯＭ４を記載している。ＯＭ４はまた、ラット血栓モデルにおける血栓形成も阻害するものと思われる。
【００１３】
ＷＯ０１／００８１０（１）もまた、７Ｉ２０．２、８Ｍ１４．３、３Ｆ８．１、９Ｅ１８．３、３Ｊ２４．２、６Ｅ１２．３、ＩＰ１０．２、４Ｌ７．３、７Ｈ４．６、９Ｏ１２．２、７Ｈ１４．１および９Ｅ１８．２と呼ばれる種々のモノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体、ならびにＡ９、Ａ１０、Ｃ９、Ａ４、Ｃ１０、Ｂ４、Ｃ３およびＤ１１と呼ばれるいくつかのｓｃＦｖフラグメントを記載している。これらの抗体およびｓｃＦｖフラグメントのうち、抗体８Ｍ１４．３、３Ｆ８．１、９Ｅ１８．３、３Ｊ２４．２、６Ｅ１２．３、ＩＰ１０．２、４Ｌ７．３、７Ｈ４．６および９Ｏ１２．２、ならびにｓｃＦｖフラグメントＡ１０、Ａ４、Ｃ１０、Ｂ４、Ｃ３およびＤ１１を含む１いくつかのものは、ＧＰＶＩがコラーゲンと結合するのを阻害することが見出された。
【００１４】
さらに、９Ｏ１２．２ Ｆａｂフラグメントは、コラーゲンにより誘発される血小板凝集および分泌を完全に遮断すること、コラーゲンにより刺激される血小板の凝血促進活性および静置条件での血小板とコラーゲンの接着を阻害すること、血小板の接着を損なうこと、および動脈流条件下で血栓の形成を防ぐことが見出された（９）。
【００１５】
しかしながら、現在知られている抗ＧＰＶＩ抗体に、in vivoにおいて、動脈および静脈血栓、再狭窄、急性冠動脈症候群およびアテローム性動脈硬化症による脳血管偶発症候などの血小板凝集に関連する心血管疾患を予防および／または治療するのに本当に有効であることが証明されたものはない。最近までに、報告されている種々の抗ＧＰＶＩ抗体は、ヒトの医学的使用にための抗血栓薬の開発にはそぐわないことが分かった。阻害特性が報告されているものは数種に過ぎない。マウスＧＰＶＩに向けられ、ヒトＧＰＶＩとは交差反応しないＪＡＱｌの場合がこれである（１０）。ヒトＧＰＶＩに対するヒトｓｃＦｖは阻害性があると報告されているが（１１、１２）、それらの親和性は低いと思われる。ごく最近、ヒトＧＰＶＩと良好な親和性を有する新たな阻害抗体が同定され（１３）、治療手段としての開発が提案されている。
【００１６】
しかしながら、血小板表面での二価または多価リガンドによるＧＰＶＩの架橋は血小板の活性化をもたらす。ＧＰＶＩの二量体形成を介して、およびＧＰＶＩと低親和性Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＡ）の架橋を介して血小板を活性化する９Ｏ１２．２ ＩｇＧの場合がそれである（９）。Ｆａｂ’２もまた、ＧＰＶＩの二量体形成を介して血小板を活性化する（９）。これに対し、一価の９Ｏ１２．２ Ｆａｂフラグメントは阻害的である。しかし、これらのフラグメントは、それらの大きさと動物起源であることのために（ヒト患者において免疫原性となる）治療薬として使用することができない。
【００１７】
よって、高い効率、低い出血リスク、ならびに低い免疫原性作用で、血小板凝集の初期段階を阻害する有効な中和ＧＰＶＩアンタゴニストの必要性がなおある。
発明の開示
【００１８】
本発明者らは、９Ｏ１２．２モノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体ハイブリドーマから、免疫定常ドメイン（ＣＨ１およびＣＬ）を持たず、大きさが縮小されたフラグメント中に機能的阻害モチーフを含む利点を有する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）９Ｏ１２．２を作出した。このｓｃＦｖは、治療的使用に適した形式を得るために免疫寛容性と安定性が改良されたフラグメントを作製するための出発材料である。
【００１９】
このようなフラグメントをデザインするための技術的アプローチはこれまでに報告されているが、各ｓｃＦｖ構築物を特異的ケースとすることを乗り越えるには多くの困難がある。これらの困難としては、異常な転写物を迂回することによる抗体Ｖ遺伝子のクローニング（１４）、適切な折りたたみに十分適切なリンカーの同定、Ｖドメインの単量体ｓｃＦｖへの会合および最後にｓｃＦｖを機能的可溶型で発現可能な原核生物発現系の選択が含まれる。
【００２０】
よって、本発明は、
配列番号２、配列番号３および配列番号４からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＶＨドメイン、
ペプチドリンカー、および
配列番号５、配列番号６および配列番号７からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＶＬドメイン
を含んでなる、ヒト糖タンパク質ＶＩに対する単鎖可変フラグメントに関する。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明のｓｃＦｖフラグメントは、精製に有用なペプチドタグ、および所望により、核ｓｃＦｖフラグメント（ＶＨおよびＶＬドメインとペプチドリンカーを含む）とペプチドタグの間に短いペプチドスペーサーをさらに含んでなる。
【００２２】
抗体はおおまかには、「重鎖」および「軽鎖」と呼ばれる２つの異なるポリペプチド鎖からなるＹ型分子であり、抗体はジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖と２つの軽鎖からなっている。各重鎖は可変ドメイン（「ＶＨドメイン」）と３つの定常ドメイン（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」および「ＣＨ３」ドメイン）からなり、各軽鎖は可変ドメイン（「ＶＬドメイン」）と定常ドメイン（「ＣＬドメイン」）からなる。
【００２３】
「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖフラグメント」とは、リンカー分子によって連結された抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含んでなる単一の折りたたまれたポリペプチドを指す。このようなｓｃＦｖフラグメントでは、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＶＨ−リンカー−ＶＬかＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれの順であってもよい。ｓｃＦｖフラグメントは、その産生を助ける他、スペーサーによってｓｃＦｖと連結されたタグ分子を含み得る。
【００２４】
さらに、各可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬドメイン）は、抗体間で示す変動が小さく、可変ドメインの構造フレームワークを形成するβシートの形成に関与する４つの「フレームワーク領域」（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と、各βシートの末端において折りたたまれた可変ドメインに並置された３ループに相当する、一般に「相補性決定領域」１、２および３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼ばれる３つの超可変領域からなる。これら３つのＣＤＲ領域は、主として抗原と接触する可変ドメインの部分、特に、重鎖および軽鎖の再配列領域に相当し、いっそう可変性が高く、より直接的に特異的抗原と接触する各鎖のＣＤＲ３領域であるので、抗体または抗体フラグメントの特異性の決定に重要である。
【００２５】
よって、本発明は、同一のＣＤＲ領域を維持する９Ｏ１２．２の総ての機能的変異体を包含する。ｓｃＦｖフラグメント９Ｏ１２．２ＣＤＲ領域データを下表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
「ペプチドリンカー」とは、ｓｃＦｖフラグメントの適当な折りたたみ、すなわち、ＶＨおよびＶＬドメインの適当な折りたたみとそれらが一緒になる能力を可能とする柔軟なペプチドを意味する。さらに、このようなペプチドリンカーは単量体機能的単位への折りたたみが可能であるべきである。ｓｃＦｖがＶＨからＶＬ配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬ）に組み立てられた場合、３〜１２残基のリンカーを有するｓｃＦｖは機能的Ｆｖドメインへと折りたたみ不能であり、その代わりに別の分子と会合して二価の二量体を形成する。３残基未満に減れば三量体となる。従ってこの場合には、好適なリンカーは少なくとも１２アミノ酸、好ましくは２５アミノ酸未満、好ましくは１４〜１８、１４〜１６の間、または１５アミノ酸を有するべきであり、好ましくは高いパーセンテージ、好ましくは少なくとも５０％のグリシン残基を含むべきである。好適なペプチドリンカーとしては、ペプチド（Ｇ４Ｓ）３（配列番号８）、Ｇ４ＩＡＰＳＭＶＧ４Ｓ（配列番号９）、Ｇ４ＫＶＥＧＡＧ５Ｓ（配列番号１０）、Ｇ４ＳＭＫＳＨＤＧ４Ｓ（配列番号１１）、Ｇ４ＮＬＩＴＩＶＧ４Ｓ（配列番号１２）、Ｇ４ＶＶＰＳＬＧ４Ｓ（配列番号１３）およびＧ２ＥＫＳＩＰＧ４Ｓ（配列番号１４）が挙げられる。ｓｃＦｖがＶＬからＶＨ配向（ＶＬ−リンカー−ＶＨ）に産生される場合、ＶＬのＣ末端とＶＨのＮ末端の間の距離は、ＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端の間の距離よりもわずかに大きい（３０〜３４Åに対して３９〜４３Å）。従って、１８アミノ酸残基のリンカーが、使用可能な最小配列サイズである。よって、好適なペプチドリンカーは１８〜２５ａａ、好ましくは１８〜２１の間であるべきである。好適なリンカーの例としては、配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１５）のリンカーである。
【００２８】
「ペプチドタグ」とは、特異的抗体が利用可能な５〜１５アミノ酸のペプチドを意味する。本発明のｓｃＦｖフラグメントには任意であるが、ｓｃＦｖフラグメントのＣ末端に挿入されたこのようなペプチドタグは、組換え産生後にｓｃＦｖフラグメントの精製を容易にすることができる。実際に、ペプチドタグは、他でもなく、そのタンパク質に特異的結合親和性を与え、クロマトグラフィーを用いてより容易な精製が可能となる。好適なペプチドタグの例としては、ニッケルイオンに対して親和性を有し、従って、ニッケルを含むクロマトグラフィーカラムを用いて精製され得るＨｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号１６）、またはそれらの特異的抗体の対して高い親和性を有し、従って、固定化されたペプチドに対する抗体を含むカラムを用いて精製され得るエピトープペプチド、例えば、ｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ、配列番号１７）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号１８）、フラッグタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１９）、タンパク質Ｃタグ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ、配列番号２０）、Ｔａｇ−１００タグ（ＥＥＴＡＲＦＱＰＧＹＲＳ、配列番号２１）、Ｖ５エピトープタグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ、配列番号２２）、ＶＳＶ−Ｇタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ、配列番号２３）またはＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号２４）が挙げられる。
【００２９】
「短いペプチドスペーサー」とは、１〜１５アミノ酸、好ましくは１〜１２または１〜１０アミノ酸、例えば８アミノ酸のペプチドを意味する。このようなペプチドスペーサーは、任意のペプチドタグの真のｓｃＦｖ部分（ペプチドリンカーによって分離されたＶＨおよびＶＬドメイン）を分離することを意図する。特にペプチドタグが存在しない場合も、ペプチドタグが含まれる場合にも、本発明のｓｃＦｖフラグメントの必要は必ずしもない。実際、ペプチドタグはＶＨまたはＶＬドメインに直接融合され得る。しかしながら、１〜１２アミノ酸の短いペプチドスペーサーは有用であり得る。例えば、９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメントでは、配列ＲＳＲＶＴＶＳＳ（配列番号２５）の８アミノ酸ペプチドスペーサーが用いられてきた。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、またはからなるヒト糖タンパク質ＶＩに対する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に関し、ここで、前記２６６アミノ酸配列のうちアミノ酸２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０９、１５９〜１７４、１９０〜１９６および２２９〜２３７はそれぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる。このようなｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の機能的変異体は同一のＣＤＲ領域を保持するだけでなく、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のアミノ酸配列と高い同一性％を有する。特定の実施形態では、本発明は、配列番号１を含んでなる、またはからなる単鎖可変フラグメントに関する。
【００３１】
しかしながら、フレームワーク領域は、ヒト糖タンパク質ＶＩに対するキメラ、特にヒト化ｓｃＦｖフラグメントを作出するように変異させることができる。ある種の参照抗体または抗体フラグメントに関して、対応する「キメラ」抗体または抗体フラグメントは、フレームワーク領域が別の種の対応するフレームワーク領域に置き換えられているものである。より詳しくは、「ヒト化」抗体または抗体フラグメントは、フレームワーク領域がヒトフレームワーク領域に置き換えられている、同一のＣＤＲ領域を有する抗体または抗体フラグメントである。
【００３２】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２フラグメントはネズミモノクローナル抗体９Ｏ１２．２から本発明者らによって誘導されたものであり、従って、マウスフレームワーク領域を有する。しかしながら、ヒト患者においてこのフラグメントの注射の免疫原性作用を軽減するためには、ネズミフレームワーク領域がヒトフレームワーク領域に置き換えられているヒト化ｓｃＦｖフラグメントが望ましい可能性がある。
【００３３】
抗体Ｖドメインをヒト化するいくつかの可能性のある方法が示唆されている。それらはＣＤＲグラフト、Ｖドメインの表面置換、または元の分子の抗原特異性と親和性を維持しつつ免疫原性を減じる目的で、あるＶ鎖に多様な置換を探索する予測的コンピューター分析を含む（１７〜１９）。これらの方法には単純なものはなく、総て特異性および／または親和性を損なう結果となることがも多い（２０〜２３）。
【００３４】
これらの困難にもかかわらず。本発明者らは、配列番号１のアミノ酸番号１〜１２０および１３６〜２６６に対応するネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインがそれぞれヒト化ＶＨおよびＶＬドメイン配列番号２６および配列番号２７に置換されており、配列番号２８のアミノ酸配列のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）、図１４参照）をもたらす、第一のヒト化ｓｃＦｖフラグメントを作出した。
【００３５】
よって第一の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域がヒト抗体のフレームワーク領域を有するＶＨおよびＶＬドメインに置き換えられている、請求項１〜３のいずれかに記載の単鎖可変フラグメントに関する。特に、前記ＶＨおよびＶＬドメインはそれぞれ配列番号２６および配列番号２７に置換されていてもよい。より厳密には、配列番号１を含んでなる、またはからなるｓｃＦｖフラグメントがヒト化されている場合、それは配列番号２８を含んでなる、またはからなる第一のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）、図１４参照）をもたらし得る。
【００３６】
このようなヒト化ｓｃＦｖフラグメントを作出するためには、ＣＤＲグラフトと呼ばれる周知の技術を使用することができ、その技術はドナーｓｃＦｖフラグメントから相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択すること、およびそれを既知の三次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワークにグラフトすること（例えば、ＷＯ９８／４５３２２（２４）；ＷＯ８７／０２６７１（２５）；米国特許第５，８５９，２０５号（２６）；米国特許第５，５８５，０８９号（２７）；米国特許第４，８１６，５６７号（２８）；ＥＰ０１７３４９４（２９）；および参照文献２０〜２１および３０〜３１）、または可能性のある候補を特定するためにデータベースを検索することを含む。コンピューターモデリングおよびヒト生色細胞系配列との比較による典型的な方法では、ヒト化するモノクローナル抗体の抗原結合ループを最も適合するフレームワークに重ね合わせる。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をヒト化するアプローチはＣＤＲグラフト技術（３２）から採用したものである。ネズミ９Ｏ１２．２抗体のＣＤＲがヒト可変鎖フレームワークにグラフトされた。ヒト抗体の選択は次の基準を用いて行われた：結晶構造が解明されていること（ｐｄｂライブラリーでのＩＶＧＥ）；ヒト抗体ＩＶＧＥの可変ドメインは９Ｏ１２．２の可変ドメインと高い程度の配列相同性を示すこと（ＶＨ６０．６％；ＶＬ５５．４％）；候補ヒト抗体ＩＶＧＥの結晶学的データと９Ｏ１２．２の可変ドメインのモデルの構造比較を行い、ヒトアクセプタースキャフォールドＩＶＧＥの選択の確認が可能であったこと。この戦略により、ＣＤＲの適正な折りたたみに必要なスキャフォールドを保持し、抗原に対する高い親和性を保持しつつ、ＶＨドメインとＶＬドメインの間の相互作用の安定性を低下させるリスクが最小限となる。これらの分析に基づいて選択されたヒト抗体ＩＶＧＥはヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖの構築を可能とした。構造上の理由のために、ＣＤＲ Ｈ２の後の１０残基は変異していなかった。このヒト化ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をコードするヌクレオチド配列を至適化した。まず、最適な結合特性に関して可能な調整を行うため、これらのＣＤＲ領域間に制限部位を導入した。次に、原核生物発現系大腸菌(E. coli)においてヒト化ｓｃＦｖを発現させるために細菌のコドン利用を用いて至適化を行った。この方法により、それぞれ配列番号１のアミノ酸番号１〜１２０および１３６〜２６に相当するネズミ９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインが、それぞれ配列番号２６および配列番号２７に置き換えられているヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメント、すなわち、配列番号２８からなるヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメントが得られた。よって、本発明のヒト化ｓｃＦｖフラグメントの好ましい実施形態では、該ｓｃＦｖフラグメントは配列番号２８を含んでなる、またはからなる。
【００３７】
この第一のヒト化ｓｃＦｖフラグメントで得られた有望な結果にもかかわらず、このフラグメントは細菌での産生に適しておらず、さらに至適化した第二のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））はｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）に由来するものである。要するに、ＶＬ ＦＲ１およびＦＲ２領域では、ＩＶＧＥフレームワーク１および２との同一性は低く、よって、元の９Ｏ１２ ＶＬ ＦＲ１およびＦＲ２は第二のヒト化ｓｃＦｖ構築では保存した。モデルの綿密な検査に基づき、他の精密化も行った（詳細については実施例２を参照）。
【００３８】
従って、第二の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域が、ヒト抗体のフレームワーク領域を有するＶＨおよびＶＬドメインに置き換えられている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントに関する。特に、該ＶＨおよびＶＬドメインはそれぞれ配列番号２６および配列番号４６に置き換えられている場合がある。より厳密には、配列番号１を含んでなる、またはからなるｓｓｃＦｖフラグメントがヒト化される場合、それはまた好ましくは、配列番号４７を含んでなる、またはからなる第二のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２）、図１８参照）も生じ得る。
【００３９】
本発明はさらに、以上に記載したような本発明の単鎖可変フラグメントをコードする核酸配列に関する。特定の実施形態では、該ｓｃＦｖフラグメントは配列番号１を含んでなり、またはからなり、該核酸配列は配列番号２９、または例えば遺伝コードの縮重の結果として配列番号１をコードする誘導核酸配列を含んでなる、またはからなる場合がある。
【００４０】
該ｓｃＦｖフラグメントがヒト化され、それぞれ配列番号１のアミノ酸番号１〜１２０および１３６〜２６６に相当するネズミ９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインがそれぞれ配列番号２６および配列番号２７に置き換えられて、配列番号２８を含んでなる、またはからなる第一のヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））となる場合、該核酸は配列番号３０、または例えば遺伝コードの縮重の結果として配列番号２８をコードする任意の誘導核酸配列を含んでなる、またはからなる場合がある。
【００４１】
あるいは、該ｓｃＦｖフラグメントがヒト化され、それぞれアミノ酸番号１〜１２０および１３６〜２６６ ４７に相当するネズミ９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインが、配列番号４７を含んでなる、またはからなる第二のヒト化９Ｏ１２．２ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））となる場合、該核酸は配列番号５０（図１８Ｃ参照）、または例えば遺伝コードの縮重の結果として配列番号４７をコードする任意の誘導核酸配列を含んでなる、またはからなる場合がある。
【００４２】
本発明はまた、上記のような核酸配列を含んでなる発現ベクターに関する。このような発現ベクターはまた、特定の宿主細胞で、作動可能なように連結されたｓｃＦｖコード配列を発現させるのに必要な適当な核酸配列も含む。原核生物での発現に必要な核酸配列は、プロモーター、所望によりオペレーター配列、リボソーム結合部位およびおそらくは他の配列を含む。真核細胞は宿主細胞内でプロモーター、エンハンサーならびに終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００４３】
このような発現ベクターはまた、発現されたｓｃＦｖを特定の細胞コンパートメントへ向けるリーダー配列、例えば、ｓｃＦｖフラグメントの膜発現または分泌を命令するか、または細菌の周縁質での発現を命令する配列を含み得る。それはまた、同じプロモーターの制御下に、その発現が発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞を選択するために容易に検出できる選択遺伝子も含み得る。好適な選択遺伝子としては、特に抗生物質耐性遺伝子、蛍光遺伝子、または当業者に公知の、その発現が容易にモニタリングできる他のいずれかの遺伝子が挙げられる。
【００４４】
本発明はさらに、上記のような発現ベクターを含んでなる宿主細胞に関する。このような組換え宿主細胞は、宿主細胞を本発明の発現ベクターを用いてトランスフェクトまたは形質転換することによって得ることができる。
【００４５】
このような宿主細胞は原核生物であっても真核生物であってもよい。好適な原核生物宿主細胞としては、グラム陽性菌およびグラム陰性菌が含まれる。グラム陰性菌では、好ましい宿主細胞は大腸菌である。細菌で用いるためには、発現ベクターは好ましくは、グラム陰性菌の原形質膜と外膜の間の空間、またはグラム陽性菌の原形質膜とペプチドグリカン層（細胞壁）の間の空間に相当する細菌周縁質にｓｃＦｖフラグメントの発現を向けるリーダー配列を含み得る。ポリペプチドの発現を細菌周縁質に向ける好適な配列としては、ｓｏｍｐＡ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ＬａｍＢ、β−ラクタマーゼ、Ｍ１３由来ｃｐ ＶＩＩＩ、ｐｅｌＢ、ｍａｌＥまたはｐｈｏＡシグナルペプチドまたはリーダー配列が挙げられる。特定の実施形態では、前記リーダー配列はｐｅｌＢである。
【００４６】
あるいは、真核細胞、特に哺乳類細胞を用いてもよい。実際、これはグリコシル化ｓｃＦｖフラグメントを直接的に生じさせることができる。発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞系統は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）およびいくつかの他の細胞系統を含む、特にAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞が挙げられる。真核細胞としては、酵母細胞も使用可能である。天然ヒトグリコシル化パターンに最も近いグリコシル化パターンを得るために、それを宿主細胞としてのヒト細胞系統に求めてもよい。あるいは、化学的に定義された増殖培地で高い細胞密度まで増殖可能な発酵法で一般に用いられる強い生物であるピキア・パストリス(Pichia pastoris)酵母細胞が、まず、内在する酵母グリコシル化経路を排除し、in vivoにおいて酵母に複合体ヒトＮ−グリカン、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を産生させることを可能とする合成in vivoグリコシル化経路をその生物に順次構築することにより改変されている（ＥＰ１２９７１７２（３３）、ＥＰ１５２２５９０（３４）および参照文献３５、３６参照）。ヒト化されたグリコシル化経路を有するこのような改変酵母細胞は、均一な複合体Ｎ−グリコシル化を伴うヒト糖タンパク質を分泌することができる。
【００４７】
本発明はまた、上記のような本発明の単鎖可変フラグメントを作製する方法であって、
ａ）上記のような本発明の宿主細胞を培養すること、および
ｂ）該単鎖可変フラグメントを精製すること
を含む方法に関する。
【００４８】
宿主細胞を培養するためのプロトコールおよび培地は常法であり、当業者ならば容易に使用可能である。得られたｓｃＦｖフラグメントの精製については、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ｌ−セファロースを使用）またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などを含む周知の技術を用いて行うことができる。より厳密には、ｓｃＦｖフラグメントは上記のようなＨｉｓ６タグまたはエピトープタグを含んでなる場合、ニッケルイオンカラムまたは固定化された特異的抗体を含有するカラムを用いたＨＰＬＣ。
【００４９】
本発明はさらに、薬剤としての上記のような本発明の単鎖可変フラグメントに関する。
【００５０】
本発明はまた、上記のような本発明の単鎖可変フラグメントと薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００５１】
より厳密には、本発明はまた、動脈および静脈血栓、再狭窄、急性冠動脈症候群ならびにアテローム性動脈硬化症による脳血管偶発症候から選択される心血管疾患の治療および／または予防を目的とした薬剤を製造するための、上記のような本発明の単鎖可変フラグメントの使用に関する。このような使用の好ましい実施形態では、該心血管疾患は血栓症である。
【００５２】
本発明の概略を記載したが、特定の具体的な実施例および図面を参照すれば本発明の特徴および利点のさらなる理解が得られる。これらの実施例および図面は単に例示のために本明細書に示されるものであり、特に断りのない限り限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２発現ベクターを構築するための用いた方法の概略図。工程１：Ｔ７およびＬｉｎｋ９Ｏ１２．２ＶＨＦｏｒプライマーを用いた９Ｏ１２．２．２モノクローナル抗体ＶＨセグメントと、Ｌｉｎｋ９Ｏ１２．２ＶＬＲｅｖおよび９Ｏ１２．２ｍｙｃＦｏｒプライマーを用いたＶＬセグメントのＰＣＲ増幅。工程２：ｐＳＷＲｅｖおよび９Ｏ１２．２ｍｙｃＦｏｒプライマーを用いたオーバーラップＰＣＲ増幅とその後のｐＳＷＲｅｖおよびｐＳＷＦｏｒプライマーを用いたＰＣＲ増幅による、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をコードする核酸の作製。工程３：ＰＣＲ産物のＤＮＡ精製。工程４：Ｐｓｔ１およびＸｈｏ１制限酵素を用いた精製ＤＮＡの消化。工程５：消化産物のｐＳＷ１発現ベクターへのクローニング。工程６：得られた構築物の配列決定。
【図２】プラスミドｐＳＷｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２ｍｙｃにクローニングされたｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。発現ベクターｐＳＷ１の制限部位Ｐｓｔ１とＸｈｏ１の間にクローニングされたｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーに相当するか、またはリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を斜体で示す。ＶＨおよびＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）の推定アミノ酸配列を下線で示す。ｃ−ｍｙｃフラッグの推定アミノ酸配列を示す。
【図３】ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２の三次元モデル。９Ｏ１２．２．２抗原−結合ドメインのモデル（側面図）。ＣＤＲを示す。
【図４】ヒト血小板に対するフローサイトメトリーによる細菌周縁質抽出物の分析。無関連のｓｃＦｖ−ｍｙｃをコードするプラスミドまたはプラスミドｐＳＷ ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２−ｍｙｃで形質転換された誘導型組換え細菌の細菌周縁質抽出物をヒト血小板とともにインキュベートした。ｓｃＦｖの結合をＦＩＴＣ結合抗ｃｍｙｃ抗体を用いて分析した。Ａ：無関連のｓｃＦｖ、Ｂ：ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２、左のパネル：前方分散と側方分散、右のパネル：蛍光ヒストグラム。
【図５】大腸菌Ｔｏｐｐ１における周縁質生産とｐＳＷ１−ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２ｍｙｃ培養物由来の組換えタンパク質の親和性アフィニティークロマトグラフィー精製。（Ａ）：クーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）：抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧを用いたウエスタンブロット解析。レーン１：分子量標準、レーン２：ＧＰＶＩ−セファロースカラムにのせた誘導細菌の周縁質画分、レーン３：ＧＰＶＩ−セファロースカラム流出画分、レーン４：ＧＰＶＩ−セファロースカラム溶出画分。
【図６】天然ｓｃＦｖのサイズ排除クロマトグラフィー。アフィニティー精製されたｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のサイズ排除クロマトグラフィーは既知分子量の標準で較正したセファデックス７５ ＨＲ １０／３０カラムで行った。
【図７】固定化ＧＰＶＩ−Ｆｃに対する精製ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（黒の記号）または無関連のｓｃＦｖ（グレーの記号）をＧＰＶＩ−Ｆｃコーティングプレートでインキュベートし、ＨＲＰ結合抗ｃ−ｍｙｃを用いて検出した。（Ａ）：結合等温線。（Ｂ）：漸増量のＩｇＧ ９Ｏ１２．２との競合におけるｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（６０μｇ・ｍＬ−１）の結合。
【図８】固定化ＧＰＶＩ−Ｆｃに対するｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合の表面プラズモン共鳴分析。ＧＰＶＩ−Ｆに親和性のあるｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２は高く、２．５×１０ー９程度のＫＤを有する。ＩｇＧおよびＦａｂ ９Ｏ１２．２．２のＧＰＶＩ−Ｆｃに対するＫＤもナノモル程度である（それぞれ６．５×１０ー９Ｍおよび４．５×１０ー９Ｍ）。
【図９】固定化コラーゲンに対するＧＰＶＩの結合の阻害。ＧＰＶＩ−Ｆｃを漸増量の抗体：ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（三角）またはｐＦａｂ（四角）の存在下、固定化コラーゲン上でインキュベートした。（Ａ）：２μｇのＧＰ ＶＩ−Ｆｃ、（Ｂ）：４μｇのＧＰＶＩ−Ｆｃ。結合したＧＰＶＩ−ＦｃはＨＲＰ結合抗Ｆｃ ＩｇＧを用いて検出した。
【図１０】血小板に対する精製ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合：フローサイトメトリー分析。洗浄した血小板を無関連のｓｃＦｖ（上）または漸減量のｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１００、５０および２５ｍＭ）とともにインキュベートした。ｓｃＦｖの結合は、ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧを用いて分析した。
【図１１】コラーゲンにより誘発される血小板凝集に対するｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の効果。洗浄したヒト血小板（２．１０８ｍＬ）を無関連のｓｃＦｖ（下の曲線）、Ｆａｂ ９Ｏ１２．２（２５μｇ／ｍｌ）（上の曲線）、単離された単量体ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（黒）とともに３７℃で５分間インキュベートし、コラーゲンを加えた。３７℃、攪拌条件で凝集を分析し、光伝達の変化を記録した。
【図１２】動脈流条件下でコラーゲンにより誘発される血小板凝集に対するｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の効果。全血（５ｍＬ）を細胞透過性の蛍光色素ＤＩＯＣ−６で標識し、画像で白く見える血小板をＰＢＳ（Ａ）または５０μｇ・ｍＬー１の抗体フラグメント（Ｂ〜Ｄ）とともにインキュベートした後、１５００ｓ−１でフローチャンバー内のコラーゲンコーティングカバースリップへ流した。コラーゲンマトリックスと結合した血小板凝集塊の形成を蛍光顕微鏡で記録した。（Ｂ）無関連のｓｃＦｖ ９Ｃ２。（Ｃ）ｍｓｃＦｖ９Ｏ１２。（Ｄ）Ｆａｂ ９Ｏ１２。
【図１３】ＰＲＰにおけるコラーゲンにより誘発されるトロンビン生成に対するｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の効果。コラーゲンを加える前に、血小板豊富血漿（ＰＲＰ）をビヒクル（黒の曲線）または５０μｇ・ｍＬ−１のＦａｂ９Ｏ１２（濃いグレー）またはｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２（薄いグレー）とともに予備インキュベーションを行った。０．５ｐＭ組織因子および１６．６ｍＭ ＣａＣｌ２を加えることでトロンビンの生成を開始させた。蛍光基質を用いてトロンビン濃度を測定し、較正物質と比較して算出した。これらの追跡は１つの代表的な実験からのものである。棒グラフは誘導期の平均値±ＳＤとピーク値を示す（ｎ＝３）（バーは小さすぎて見えないＳＤに相当する）。
【図１４】ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインならびに第一のヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。Ａ．ヒト化９Ｏ１２．２ ＶＨ（１）ヌクレオチド（配列番号３１）およびアミノ酸（配列番号２６）を示す。Ｂ．ヒト化９Ｏ１２．２ ＶＬ（１）ヌクレオチド（配列番号３２）およびアミノ酸（配列番号２７）を示す。Ｃ．ヒト化ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（１）ヌクレオチド（配列番号３０）およびアミノ酸（配列番号２８）を示す。
【図１５】第一のヒト化ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））の特性決定。ＧＰＶＩセファロースへの親和性結合：組換え細菌の周縁質画分をＧＰＶＩセファロースカラムにのせた。保持されたタンパク質を、抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ、次いでＨＲＰに結合された抗マウス抗体とＥＣＬ曝露を用い、ウエスタンブロットによって分析した。ヒト化ｓｃＦｖに関して予測されたように、分子量２８．５ｋＤａの単一バンドが検出される。
【図１６】ＧＰＶＩ−Ｆｃに対するｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合。精製した第一のヒト化ｓｃＦｖ（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）、濃いグレー）およびｍｓｃＦｖ（薄いグレー）をＣＭ５センサーチップに固定されているＧＰＶＩ−Ｆｃに注入した。ブランクシグナルの検出の後のセンサーグラムを示す。
【図１７】ヒト血小板に対する第一のヒト化ｓｃＦｖ９Ｏ１２（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））の結合。ヒト血小板を細菌周縁質抽出物とともにインキュベートした。血小板に結合したｓｃＦｖは、ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて検出した。血小板との結合を、ＸＬ Ｅｐｉｃｓ Ｃｏｕｌｔｅｒフローサイトメーターで分析した。無関連のｓｃＦｖを陰性対照として用いた（上のパネル）。ヒストグラムの右側シフト（下のパネル）は、ヒト化ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２が血小板ＧＰＶＩと結合することを示す。
【図１８】ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインならびに第二の至適化ヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。Ａ．ヒト化９Ｏ１２．２ ＶＨ（２）ヌクレオチド（配列番号４８）およびアミノ酸（配列番号２６）を示す。Ｂ．ヒト化９Ｏ１２．２ ＶＬ（２）ヌクレオチド（配列番号４９）およびアミノ酸（配列番号４６）を示す。Ｃ．ヒト化ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２））ヌクレオチド（配列番号５０）およびアミノ酸（配列番号４７）を示す。酵素制限部位を太字で示す。ＶＨドメインとＶＬドメインの間のリンカーを下線で示す。ＣＤＲ領域をグレーで強調されている。
【図１９】９Ｏ１２抗体可変ドメインの至適化されたヒト化。抗体Ｖ−ドメインの配列分析：ネズミ９Ｏ１２（ｍ９Ｏ１２）、ＩＶＧＥ、ヒト化９Ｏ１２（ｈ９Ｏ１２）および１Ｘ９Ｑ。（．）はネズミ９Ｏ１２と同じ残基を示す。（−）はギャップを示す。ネズミ９Ｏ１２と類似性のないヒト化Ｖ−ドメインの残基を赤および青で示す（Ｋａｂｂａｔ命名法に従って残基ＡＨ７１、ＫＨ７３、ＲＨ７６、ＬＬＳ９、ＤＬ６Ｏ）。ＣＤＲはグレーで強調されている。
【図２０】第二のヒト化（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））の特性決定。Ａ−抗ｃＭｙｃ抗体を用いた組換えｓｃＦｖのウエスタンブロット検出。Ｂ−フローサイトメトリー分析。ヒト血小板を抗体フラグメントとともに３０分間プレインキュベーションした。ｓｃＦｖの結合は、ＦＩＴＣ結合抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いて検出した。
【実施例】
【００５４】
実施例１ ヒト糖タンパク質ＶＩに対するネズミ単鎖可変フラグメント ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２および第一のヒト化単鎖可変フラグメント ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の合成および活性
１．１ 試験手順
１．１．１ 材料
【００５５】
培地および溶液
ＬＢ（ルリア−ベルターニ）、DIFCO ４０２−１７；ＬＢ−寒天、DIFCO ４４５−１７；２ｘＴＹ（トリプトン−酵母）、DIFCO ２４４０２０；ＴＥＳ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、スクロース２０％、ｐＨ８．５；ＰＢＳ：ＮａＣｌ ０，１４Ｍ、ＫＣｌ １３ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ ９ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ５０ｍＭ、ｐＨ７．４；ＢＢＳ：ホウ酸５０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨ７．６；アンピシリン、Euromedex ＥＵ−０４００Ｃ；イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、Euromedex ＥＵ０００８−Ｂ；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Sigma Ｂ４２８７；ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ、Sigma Ｆ−２０４７；デスオキシリボヌクレアーゼＡ、アプロチニン：Sigma Ａ−６２７９；ＨＲＰ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ、Invitrogen Ｒ９５１−２５；オルトフェニルジアミン（ＯＰＤ）：Sigma Ｐ８７８７、Ｔｒｉｚｏｌ：Invitrogen、コラーゲンホルムタイプＩ(Collagen Horm type I)：Nycomed、ｐＧＥＭＴクローニングベクター、Promega。ｓｃＦｖ発現にはｐＳＷｌプラスミドを用いた。６Ｈ８および９Ｃ２を無関連のｓｃＦｖとして用いた。
【００５６】
オリゴデスオキシリボヌクレオチド配列
用いたオリゴデスオキシリボヌクレオチドを次の表２に挙げる：
【表２】
【００５７】
ヒト血小板の調製
ヒト血小板を上述のように調製した（９）
【００５８】
フローサイトメトリー
「簡単ＦＩＴＣ標識血小板プログラム(Simple FITC labelling of platelets program)」フローサイトメーター Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬを用いた
ＧＰＶＩ−セファロースの調製：
【００５９】
試薬：ＣｎＢｒ−セファロースはAmersham-Pharmacia社製とした。研究室で組換え可溶性ＧＰＶＩ（ＧＰＶＩ−Ｆｃ）を作製し、精製した（９）。
【００６０】
方法：ＣｎＢｒ−セファロース(Amersham-Pharmacia)を供給業者の指示どおりに調製した。それをＧＰＶＩ−Ｆｃ（ＮａＨＣＯ３ ０．１Ｍ；ＮａＣｌ ０．５Ｍ ｐＨ８．３のゲルの８ｍｇ／ｍＬ）とともに攪拌下で１８時間インキュベートした。このゲルを濾過し、濾液中の前記タンパク質濃度を測定して、結合収量を決定した。エタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．８）を用いてゆっくりと攪拌しながら暗所にて室温で２時間の遮断工程後、このゲルを濾過し、結合バッファーおよび酢酸ナトリウム０．１Ｍ、ＮａＣｌ ０．５Ｍ ｐＨ４で順次洗浄した。このゲルをアジ化ナトリウム（１％）含有ＰＢＳ中、４℃で保存した。
【００６１】
１．１．２ 手順
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の遺伝的構造：
ヒトＧＰＶＩに対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）９Ｏ１２．２．２を産生する、新たにサブクローニングしたハイブリドーマ９Ｏ１２．２．２細胞からｍＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲ後、前記抗体可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングによりｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２遺伝子を作出した。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２の製造にはｐＵＣ １９［ｐＳＷ Ｉベクター（３７）］から誘導した発現ベクターを用いた。この発現ベクターは、ＩＰＴＧ誘導性ＬａｃＺプロモーター、ｐｅｌＢリーダー配列と、下流に、フラッグｃ−ｍｙｃと融合されたｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をコードする遺伝子および組換え細菌を選択するのに用いられるアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００６２】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２発現ベクターの構築に用いた方法を図１に要約する。
【００６３】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の製造
リーダー配列ｐｅｌＢは、組換えｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２を、発現ベクターｐＳＷ ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２ｍｙｃで形質転換した細菌の周縁質に向けることを可能にする。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２を作製するために、細菌Ｔｏｐｐｌ（登録商標）（非Ｋ１２、Ｒｉｆ、Ｆ’、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩｑＺΔＭ１５、Ｔｎ１０、ｔｅｔｒ）(Stratagene, La Jolla, USA)、コロニー５５Ｔｌを用いる。
【００６４】
＊Ｊ０：アンピシリンを補給したＬＢ寒天への５５Ｔｌコロニーのプレーティング（サブクローニング）。３７℃で一晩インキュベーション。
【００６５】
＊Ｊ１：４ ＰＭ：一クローンの選択およびアンピシリンを補給したＬＢ ５ｍＬ中での培養。攪拌（１２５ｒｐｍ）しながら３７℃で一晩インキュベーション。
【００６６】
＊Ｊ２：８ ＡＭ：６００ｎｍにおける吸光度の測定（予測値Ａ６００ｎｍ＝１．５±０．１）。５００ｍＬ ２ｘＴＹ＋アンピシリンへの４ｍＬの移入。Ａ６００ｎｍが１．５±０．１に達するまで（〜８時間）、攪拌（１２５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベーション。その後、０．８ｍＭ ＩＰＴＧでの細菌の誘導。攪拌（７５ｒｐｍ）しながら１６℃で１６時間インキュベーション。
【００６７】
＊Ｊ３：周縁質タンパク質抽出：遠心分離（３６００ｇ、４℃で２０分）により細菌細胞を集める。ペレットを１０ｍＬ ＴＥＳバッファー中にゆっくりと再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートする。次に、これらの細胞を、ＴＥＳバッファーを加えることによって弱い浸透圧ショックに付し、１：４希釈する。氷上で３０分間のインキュベーション後、４℃にて１５０００ｇで３０分間の遠心分離により不溶性物質を除去する。さらに、周縁質タンパク質抽出物に相当する上清にデオキシリボヌクレアーゼＡ（５０Ｕ）およびプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン ２μｇ／ｍＬ）を加える。その後、調製物を４℃でＰＢＳに対して大規模に透析する。同じ手順に従って、無関連のｓｃＦｖを発現する細菌の周縁質タンパク質抽出物を調製する。
【００６８】
＊Ｊ４：４℃にて１５０００ｇで３０分間の遠心分離。上清を集め、２８０ｎｍにおけるその吸光度を測定する（予測値：１．５〜３．０）。解析のために一サンプルをとり、調製物（〜３５ｍＬ±２．０）を−２０℃で保存する。
【００６９】
＊Ｊ５：フローサイトメトリーによる周縁質抽出物のスクリーニング：洗浄したヒト血小板（２ｘ１０７／ｍＬ）を１００μＬの周縁質タンパク質抽出物とともに室温で３０分間インキュベートする。ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧを加え、そのインキュベーションを暗所にて室温で３０分間続ける。陰性対照は、周縁質抽出物の不在下で抗ｃ−ｍｙｃ抗体とともに行う。サンプルをフローサイトメトリー（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬ）により解析する。
【００７０】
＊Ｊ６：ＧＰＶＩ結合セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによるｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の精製。周縁質抽出物（３５ｍＬ）を５００μＬ ＧＰＶＩ−セファロースとともに４℃で１２時間、さらに室温で４時間インキュベートする。この混合物をカラムにのせる。流出画分を集めた後、ＰＢＳでＡ２８０ｎｍ＝０．００１まで洗浄し；グリシン０．１Ｍ ｐＨ３．０を用いて溶出を行い、氷上で４００μＬの画分を５μＬ Ｔｒｉｓ ３Ｍの入ったチューブに集める。Ａ２８０ｎｍを測定し、Ａ２８０ｎｍが０．２より高い画分をプールし、ＰＢＳに対して大規模に透析する。
【００７１】
＊Ｊ７：このサンプルを１５０００ｇで３０分間遠心分離する。Ａ２８０ｎｍ測定後、タンパク質濃度を決定する。ＰｒｏｔＰａｒａｍソフトウエア(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)を用いて、ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２ｍｙｃの理論Ｍｒおよび２８０ｎｍにおけるその吸光係数を決定する。
【００７２】
タンパク質解析：
タンパク質解析を、LaemmliによるＳＤＳの存在下でのポリアクリルアミドスラブゲルでの電気泳動により；タンパク質のニトロセルロースへの転写、ＨＲＰ結合抗ｃ−ｍｙｃ抗体とのインキュベーションおよび４クロロナフトールを用いた検出後の免疫ブロット法により行った。
【００７３】
質量の実験的測定
精製ｓｃＦｖのＭｒをマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計(Voyager DE-PRO; PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA)で測定する。５０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡ中のα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸飽和溶液をマトリックスとして用い、外部標準ペプチド混合物を用いて分光計を較正する。
【００７４】
サイズ排除−拡散クロマトグラフィー：
精製ｓｃＦｖ調製物を、既知分子量の標準を用いて較正したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲカラムでのサイズ排除拡散クロマトグラフィーにより分離した。２００μＬのサンプルを０．５ｍＬ／分の速度で注入した。紫外線検出器を用いて２２６ｎｍで検出をモニタリングする。解析には画分をそのまま用いた。
【００７５】
可溶性組換えＧＰＶＩとの結合
マイクロタイタープレートをＧＰＶＩ−Ｆｃ（１０μｇ／ｍＬ、１ウェルにつき１００μＬ）にて４℃で一晩コーティングする。ウェルを１００μＬ ＢＳＡにて室温で２時間飽和させる。次に、これらのウェルに漸増濃度のｓｃＦｖ ９Ｏ１２を２時間加える。ＨＲＰ結合抗ｃ−ｍｙｃ−抗体（ＰＢＳ中１／７５０）とともに室温で２時間のインキュベーション後、結合したｓｃＦｖを検出する。その後、これらのウェルに基質溶液（ＯＰＤ）を５分間加え、４９２ｎｍで吸光度を読み取る。２つの対照：ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の代わりに無関連のｓｃＦｖを用いる第一の対照およびＧＰＶＩ−Ｆｃでのコーティングを省いた第二の対照を行う。中間工程ごとに０．０５％ Ｔｗｅｅｎおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有するＰＢＳで５回洗浄を行う。
【００７６】
第一ヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））の構築
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をヒト化するアプローチはＣＤＲグラフト技術９から適応させた。ネズミ９Ｏ１２．２抗体のＣＤＲをヒト可変鎖フレームワークにグラフトした。ヒト抗体の選択は次の判定基準を用いて行った：結晶構造が解明されており（ｐｄｂライブラリーのＩＶＧＥ）；ヒト抗体ＩＶＧＥの可変領域が９Ｏ１２．２の可変領域と高度の配列相同性（ＶＨ ６０．６％；ＶＬ ５５．４％）を示し；候補ヒト抗体ＩＶＧＥと９Ｏ１２．２の可変領域のモデルとの結晶学的データの構造比較が行われ、それにより本発明者らがヒトアクセプタースキャフォールドＩＶＧＥの選択の正当性を立証することが可能であった。この戦略はＶＨドメインとＶＬドメインの相互作用の安定性を低下させる危険性を最小限にしながら、ＣＤＲの適正な折りたたみに必要なスキャフォールドを保存し、抗原に対して高い親和性を保存する。これらの解析に基づいて選択されたヒト抗体ＩＶＧＥにより本発明者らはヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖを構築することができた。ヒト化ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２をコードするヌクレオチド配列には至適化を行った。最初に、最適な結合特性を提供するために調整することができるように、ＣＤＲ領域間に制限部位を挿入した。さらに、原核生物発現系大腸菌においてヒト化ｓｃＦｖを発現させるために、細菌コドン使用頻度を用いて至適化を行った。
【００７７】
より厳密には、本発明者らは最初に、９Ｏ１２可変領域と最もよく似た配列を有する結晶構造を同定した後、ｍｓｃＦｖ９Ｏ１２の３Ｄ構造モデルをin silicoで構築した。これら総ての配列はネズミ由来のものであった。モデリングには上位４位のスコアのネズミ由来構造を用いた。ＶＨ遺伝子については、本発明者らは、９Ｏ１２と６６〜７８％の配列同一性（７９〜８５％類似性）を有する１ＰＬＧ、１ＭＮＵ、１Ａ５ＦおよびＨＧＩを用いた。ＶＬ遺伝子については、本発明者らは、８７〜９０％の配列同一性（９４〜９５％類似性）を有する１ＰＬＧ、ＨＧＩ、１ＭＮＵおよび１ＡＸＴを用いた。これら総ての配列の３Ｄ構造は２．８Åより高い分解能を用いて解明された。Ｍｏｄｅｌｅｒ ３．０ソフトウエアを用いて各ドメインにつき２０のモデルを作成し、ＲＭＳＤ値（ＶＨについては０．１３ÅおよびＶＬについては０．７０３Å）および詳細検査に基づいて最適なものを選択した。
【００７８】
次に、本発明者らは９Ｏ１２ Ｖ−ドメインのヒト化を進めた。これを行うために、ＦＡＳＴＡ検索を行って、ＰＤＢデータバンクに登録されたヒト抗体配列のレパートリーに対してＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を独立にアラインした。９Ｏ１２にマッチしたヒトＶ−ドメインのうち、本発明者らは最初に、自然抗体中で起こるドメイン間接触を保存するために、同じ抗体分子由来のＶＨおよびＶＬを選択した。ヒト抗体ＩＶＧＥは、Ｖ−ドメイン配列全体を見たときに９Ｏ１２と最高の同一性スコアを有し、ＶＨおよびＶＬについてそれぞれ６２％および５５％の同一性を示すことが分かったためそれを選択した。フレームワーク領域配列だけで計算すると、その同一性はさらに少し高まり、それぞれ６９．５％および６５．４％の同一性を示した。さらに、ＩＶＧＥの結晶構造は高分解能（２ÅおよびＲ値０．１８）で解明された。そのため、本発明者らは９Ｏ１２ ＣＤＲをＩＶＧＥ鋳型にin silicoでグラフトすることにした。この構築物をコードする遺伝子を化学合成し、ｍｓｃＦｖ９Ｏ１２について行ったとおりに正確にｐＳＷＩに挿入した。このベクターで形質転換したＴＯＰＰＩ細胞を、組換えタンパク質を発現するように誘導した。
【００７９】
この結果、第一のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）と呼称）が得られた
【００８０】
９Ｏ１２．２ ＩｇＧとの競合：
ｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（１００μｇ／ｍｌ）を漸増濃度の９Ｏ１２．２ ＩｇＧと混合した後、ＧＶＩ−Ｆｃでコーティングしたマイクロタイトレーションウェルに加えた。結合したｓｃＦｖを上記のとおり検出した。
コラーゲンとのＧＰＶＩの結合に対する抗体の効果：
【００８１】
マイクロタイトレーションウェルを繊維状タイプＩコラーゲン(fibrilar type I collagen)（Collagen Horn，Nycomed, Munich ２μｇ／ウェル）でコーティングし、ＢＳＡで飽和させ、洗浄する。これらのウェルに、ＰＢＳ、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２またはＦａｂ ９Ｏ１２．２とともにプレインキュベートしたＧＰＶＩ−Ｆｃの漸増量を加える。室温で１時間、洗浄後、結合したＧＰＶＩ−Ｆｃをペルオキシダーゼ結合抗ヒトＦｃおよびＯＰＤを用いて検出する。
【００８２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、BIAcore）：
抗ＧＰＶＩ ｓｃＦｖと組換えＧＰＶＩ−Ｆｃとの結合をＢＩＡｃｏｒｅ ２０００システム(Uppsala, Sweden)を用いた表面プラズモン共鳴により解析する。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２、タンパク質加水分解Ｆａｂおよび親ＩｇＧについて結合研究を行う。
【００８３】
組換えＧＰＶＩ−Ｆｃを、アミンカップリング法（ウィザード法）を用いてカルボキシ−メチルデキストランＣＭ５センサーチップ上に固定する（〜６００ＲＵ）。次に、固定した組換えＧＰＶＩ−Ｆｃ上に、抗体をＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ））中、２５℃で流速２０μｌ／分で流す。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．１ソフトウエアを用いて、データを結合モデルに当てはめることにより速度定数（ｋａ、ｋｄ）および親和性を決定する。ＨＢＳ−ＥＰはランニングバッファーである。２０μｌ／分で３０秒間注入した１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．５は再生バッファーである。用いた総ての試薬およびバッファーはBiacore社製である。
【００８４】
精製ｓｃＦｖとヒト血小板ＧＰＶＩとの結合
洗浄したヒト血小板（２．１０７／ｍＬ）を０〜１００μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖ ９Ｏ１２とともに室温で３０分間インキュベートし、その後、５μＬのＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ（希釈溶液１：６０）とともに暗所にて室温で３０分間再びインキュベートする。細胞蛍光をフローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ ＸＬ、Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて測定する。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の代わりに無関連のｓｃＦｖを用いることによりバックグラウンドを測定する。
【００８５】
血小板凝集
洗浄したヒト血小板（３ｘ１０８／ｍＬ）を、ＰＢＳ、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２またはＦａｂ ９Ｏ１２．２とともに攪拌せずに３７℃で５分間プレインキュベートする。タイプＩコラーゲンを加えることによって凝集を開始させ、光透過率の変化を連続記録する（Chronolog社製血小板凝集計）。
【００８６】
フロー条件下での血小板凝集
フロー条件下でのコラーゲンへの血小板粘着を、基本的には別記のとおり（９）測定した。ガラスカバースリップを繊維状タイプＩコラーゲン（５０μｇ・ｍＬ−１）でコーティングした。健康なボランティアの血液を４０μＭ ＰＰＡＣＫで採取し、ＤＩＯＣ−６（１μＭ）で標識した。血液アリコートを、バッファーまたは終濃度５０μｇ・ｍＬ−１の精製抗体フラグメント（Ｆａｂ ９Ｏ１２、ｍｓｃＦｖ９Ｏ１２、ｓｃＦｖ ９Ｃ２）とともに室温で１５分間インキュベートした。次に、この混合物を、フローチャンバー内に挿入した、コラーゲンでコーティングしたカバースリップに１５００秒−１で５分間散布した。透過率および蛍光画像を蛍光顕微鏡を用いて実時間で記録した。蛍光画像は、散布終了時に任意選択された少なくとも１０の異なるコラーゲン含有顕微鏡視野から得られた。蛍光画像の領域カバレージをＨｉｓｔｏｌａｂソフトウエア(Microvision, Evry, France)を用いてオフラインで解析した。
【００８７】
トロンビン生成
トロンボグラム法を用いて上述のとおりに（３８）多血小板血漿（ＰＲＰ）中でトロンビン生成を連続測定した。要するに、クエン酸ＰＲＰ（１．５ｘ１０８血小板 ｍＬ−１）を抗体フラグメントとともに３７℃で１０分間インキュベートした後、コラーゲンを加えた。１０分後、組織因子（０．５ｐＭ）の入ったマイクロタイトレーションプレートのウェルにサンプルを入れることによってトロンビン生成を開始させた。３７℃で５分後、ＣａＣｌ２含有バッファーおよび蛍光トロンビン基質Ｚ−ＧＧＲ−ＡＭＣ(Stago, Asnieres, France)）を加えることによって反応を開始させた。開裂された基質の蛍光蓄積を励起波長および発光波長それぞれ３９０ｎｍおよび４６０ｎｍにおいて連続測定した。蛍光蓄積の一次導関数曲線を、トロンビン較正装置を用いてトロンビン濃度曲線に変換した（３９）。ピーク高さはトロンビン形成最大速度の指標であり、血小板活性化に影響を受ける。
【００８８】
１．２ 結果
１．２．１ ネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖ（ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２）
抗体９Ｏ１２．２．２ ＶＨ ｃＤＮＡおよびＶＬ ｃＤＮＡのクローニング
９Ｏ１２．２はネズミＩｇＧ１（κ鎖）である。全ＲＮＡを、新たにサブクローニングしたハイブリドーマ細胞 約５．１０８からＴｒｉｚｏｌを用いて一段階法により抽出した。このＲＮＡ調製物を一本鎖ｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。次に、ＩｇＧ ９Ｏ１２．２．２ ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードする二本鎖ｃＤＮＡを、プライマーセット（ＶＨＲｅｖ、ＶＨＦｏｒ）および（ＭＫＲｅｖＵ、ＭＫＣ５Ｆｏｒ）それぞれを用いたＰＣＲにより増幅した。ＶＨ ｃＤＮＡ配列はユニークであり、これはｐＧＥＭＴへのクローニング後のｃＤＮＡの配列決定により確認された。ＶＬドメインに対応するＰＣＲ産物の配列をスクランブルした。ｐＧＥＭＴへクローニングし、数クローンを配列決定した後、２つのＶＬ配列を同定した。ｆａｓｔａ解析を用いたデータ解析により、それらのＶＬ配列の１つが内因性の異常な非機能性Ｖｋ ｍＲＮＡ（Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ受託番号Ｍ３５６６９）を発現するＭＯＰＣ−２１クローンに由来することが分かった。ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の一部として、もう一方のＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図２に示している。これらの配列をいくつかのデータバンク(UNIPROT UNIREF100 UNIREF90 UNIREF50 UNIPARC SWISSPROT IPI PRINTS SGT PDB IMGTHLAP, PATENT: epop jpop uspop)(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/)(DNA banks: EMBL, Human, MOUSE, SYNTHETIC, PATENT)に登録された免疫グロブリン可変領域配列と比較した。これにより、本発明者らはＶＨ領域およびＶＬ領域の相補性決定領域に相当する３つのループならびにカノニカル構造に関与するアミノ酸残基を同定することができた。
【００８９】
Kabat et al. (1991)およびChotia and Lesk (1987)から推定される次のルールに従ってＣＤＲを同定した：
・ＣＤＲ−Ｌ１：
開始−およそ残基２４
前の残基は常にＣｙｓである
後の残基は常にＴｒｐである。典型的にはＴＲＰ−ＴＹＲ−ＧＬＮ、同様に、ＴＲＰ−ＬＥＵ−ＧＬＮ、ＴＲＰ−ＰＨＥ−ＧＬＮ、ＴＲＰ−ＴＹＲ−ＬＥＵ
長さ １０〜１７残基
・ＣＤＲ−Ｌ２：
開始−常にＬ１後１６残基
前の残基 一般的にはＩＬＥ−ＴＹＲ、同様に、ＶＡＬ−ＴＹＲ、ＩＬＥ−ＬＹＳ、ＩＬＥ−ＰＨＥ
長さ 常に７残基。
・ＣＤＲ−Ｌ３：
開始−常にＬ２後３３残基
前の残基は常にＣｙｓである
後の残基 常にＰＨＥ−ＧＬＹ−ＸＸＸ−ＧＬＹ
長さ ７〜１１残基
・ＣＤＲ−Ｈ１：
開始−およそ残基２６（常にＣＹＳ後４残基）［Chothia/AbM定義］ Kabat定義では５残基後に開始する
前の残基 常にＣＹＳ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ
後の残基 常にＴＲＰ。典型的にはＴＲＰ−ＶＡＬ、同様に、ＴＲＰ−ＩＬＥ、ＴＲＰ−ＡＬＡ
長さ １０〜１２残基（AbM定義） Chothia定義では最後の４残基を排除する
・ＣＤＲ−Ｈ２：
開始−常にＣＤＲ−Ｈ１の後１５残基Kabat/AbM定義）
前の残基 典型的にはＬＥＵ−ＧＬＵ−ＴＲＰ−ＩＬＥ−ＧＬＹ、同様に多数の変化物
後の残基 ＬＹＳ／ＡＲＧ−ＬＥＵ／ＩＬＥ／ＶＡＬ／ＰＨＥ／ＴＨＲ／ＡＬＡ−ＴＨＲ／ＳＥＲ／ＩＬＥ／ＡＬＡ
長さ Kabat定義 １６〜１９残基（AbM定義では７残基前に終わる）
・ＣＤＲ−Ｈ３：
開始−常にＣＤＲ−Ｈ２後３３残基（常にＣＹＳ後２残基）
前の残基 常にＣＹＳ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（典型的にはＣＹＳ−ＡＬＡ−ＡＲＧ）
後の残基 常にＴＲＰ−ＧＬＹ−ＸＸＸ−ＧＬＹ
長さ ３〜２５残基
【００９０】
ＶＨ ｃＤＮＡ配列は、別のネズミＶＨドメイン（ＭＭＭＤ５２Ｃ）をコードするｃＤＮＡと９２．９６％の同一性を示した。ＶＬについては、本発明者らは、ネズミ抗アセチル−ＬｙｓのＶＬドメイン（ＢＤ１７４８９１）をコードするｃＤＮＡ配列と９８．５１％の同一であることを見出した。推定アミノ酸配列解析でもネズミＩｇの配列と高い相同性を示した。９Ｏ１２．２ ＶＨは、抗ＣＤ２０ネズミＩｇＧの推定アミノ酸配列（ＢＤ６８８６５５）と８９．２５６％の同一性を示した。９Ｏ１２．２ ＶＬは、抗アセチル ＬｙｓネズミＩｇＧの推定アミノ酸配列（ＢＤ５８１２８８）と９６．４３％の同一性を示した。
【００９１】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の設計
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図２に示している。ｓｃＦｖは２６６アミノ酸長であり、［Ｇ４Ｓ］３リンカーによって互いに結合されたＶＨおよびＶＬ配列とそれに続く短いスペーサー（８残基）およびｃ−ｍｙｃフラッグ配列（１１残基）からなる。
【００９２】
ｓｃＦｖの理論構造特性
ｓｃＦｖの理論分子量は、ＰｒｏｔＰａｒａｍソフトウエアを用いて決定されるように２８３９３．５である。そのｐＩは６．９２であり、その吸光係数は２８０ｎｍにおいて４９６４０Ｍ−１ｃｍ−１である（表３）。
【００９３】
【表３】
【００９４】
ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の分子モデリング
鋳型として用いたネズミ可変領域のＰｄｂファイルは：
ＶＨドメインについては：１ＰＬＧ：Ｈ；１ＭＮＵ：Ｈ；１Ａ５Ｆ：Ｈ；１ＩＧＩ：Ｈ、
ＶＬドメインについては：１ＰＬＧ：Ｌ；１ＩＧＩ：Ｌ；１ＭＮＵ：Ｌ；１ＡＸＴ：Ｌである。
可変領域のモデリングにはＭｏｄｅｌｅｒ ３．０．ソフトウエアを用いた。各ドメインにつき２０のモデルを設計し、ＲＭＳＤ値：ＶＨ（ＲＭＳＤ：０．１３Å）；ＶＬ（ＲＭＳＤ：０．７０３Å）に基づいて最適なものを選択した。このモデルを図３に示している。
【００９５】
周縁質抽出物の解析
ｓｃＦｖが予測される抗ＧＰＶＩ活性を有するかどうかを評価するために、周縁質抽出物を、ヒト血小板およびＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧを用いて試験した。図４は、９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの存在下で血小板蛍光が右側へシフトし（４０％陽性血小板）、無関連のｓｃＦｖの存在下ではそれが起こらない（０．１７％陽性血小板）ことを示している。さらに、周縁質抽出物を、固定した組換え可溶性ＧＰＶＩとともにインキュベートしたときには、ｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２の結合だけが検出された。これらの結果を合わせて、９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖは抗ＧＰＶＩ特性を保有することが示される。
【００９６】
９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの製造および精製
周縁質抽出物、流出画分およびＧＰＶＩ−セファロースカラムからの溶出画分中に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、そしてイムノブロットにより解析した（図５Ａおよび５Ｂ）。溶出画分は、理論質量に一致する〜２８ｋＤａの主要なバンドとして現われる。このバンドは、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたイムノブロットによっても検出される。これらの結果は、アフィニティークロマトグラフィーによってかなり純粋なｓｃＦｖ画分を得ることができることを示している。
【００９７】
サイズ排除クロマトグラフィー
ｓｃＦｖの精製調製物をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０カラムに適用したときに、〜２５ｋＤの１つの主要なピーク（モノマーｓｃＦｖに相当する）が観察された（図６）。このピークは、４５ｋＤａおよび６８ｋＤａにおける２つのあまり重要でないピーク（二量体およびオリゴマーｓｃＦｖに相当する）より先に生じた。
【００９８】
単量体ｓｃＦｖは非常に安定しており、４℃で保存すると多量体形態は単量体に自発的に戻り、これによりＧＰＶＩとの一価結合および生物学的効果を保存することは絶対的となる。実際には、二価抗ＧＰＶＩ分子（ＩｇＧまたはＦ（ａｂ）’２）が血小板活性化をもたらし得る（４０，９３）ことは十分に確立されている。
【００９９】
９Ｏ１２．２ 精製ＧＰＶＩ−ＦｃとのｓｃＦｖの結合および９Ｏ１２．２ ＩｇＧとの競合
精製ｓｃＦｖはマイクロタイトレーションプレート上に固定されているＧＰＶＩ−Ｆｃと用量依存的に結合した（図７Ａ）。結合特異性は、無関連のｓｃＦｖが同じ条件でＧＰＶＩと結合しなかったという事実によって示される。
【０１００】
さらに、精製ＧＰＶＩとのｓｃＦｖとの結合は親ＩｇＧによって用量依存的に阻害された（図７Ｂ）。
【０１０１】
可溶性ＧＰＶＩに対する９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの親和性
表面プラズモン共鳴によって確認されたＧＰＶＩ−Ｆｃに対する９Ｏ１２．２ ＩｇＧの親和性およびパパイン消化後に調製されたそのＦａｂ（ｐＦａｂ）の親和性は高く、Ｋｄはそれぞれ６．５ １０−９Ｍおよび４．５ １０−９Ｍである。ｓｃＦｖのＫｄは２．５ １０−９Ｍである（図８）。
【０１０２】
第二次試験では、次の動力学的パラメーター値を決定した：ｋｏｎ＝６．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝１．７ｘ１０−４ｓ−１および９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの解離定数ＫＤ＝２．６ｎＭ；さらに９Ｏ１２ タンパク質加水分解ＦａｂフラグメントのＫＤ＝２．３ｎＭおよび親ＩｇＧのＫＤ＝４．０ｎＭ。これらの値は第一次試験で得られた値と非常に類似しており、ナノモルＫＤ値が確認される。
【０１０３】
このように、ネズミｓｃＦｖ ９Ｏ１２は非常に高い機能的親和性をなお有し、ＫＤ値は１０−９Ｍの範囲内であり、このことがｓｃＦｖ−血小板ＧＰＶＩ複合体の安定性に寄与することは間違いなく、これによりフロー条件下での血小板凝集を阻害することは絶対的である。
【０１０４】
精製９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖはコラーゲンとのＧＰＶＩの結合を阻害する
９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖは、固定されている繊維状コラーゲンタイプＩとのＧＰＶＩ−Ｆｃの結合を用量依存的に阻害した（図９）。その阻害能力は９Ｏ１２．２ ｐＦａｂのものに近い。
【０１０５】
より厳密には、ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２はコラーゲンとのＧＰＶＩの結合を阻害し（ＩＣ５０はおよそ１．１７μｇ．ｍＬ−１（４２μＭ））、８０％阻害はｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の濃度５〜１０μｇ．ｍＬ−１において達した。この阻害能力は、親ＩｇＧのパパイン消化後に調製されたＦａｂ ９Ｏ１２（２．１μｇ．ｍＬ−１；１５ｎＭ）で観察されたものと同等であった。
【０１０６】
精製９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖはヒト血小板と結合し、コラーゲン誘導血小板凝集を阻害する。
【０１０７】
ヒト血小板との精製ｓｃＦｖの結合をフローサイトメトリーにより測定した。ピークの右側シフトによりｓｃＦｖがヒト血小板と用量依存的に結合することが示される（図１０）。無関連の精製ｓｃＦｖは血小板と結合しなかった。
【０１０８】
ＧＰＶＩ機能に対する９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖの効果を、コラーゲン誘導血小板凝集を測定することによって試験した。このために、モノマー形態のｓｃＦｖをサイズ排除ゲルクロマトグラフィーによって精製した。９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖ（２５μｇ／ｍＬ）は、同じ濃度で用いた９Ｏ１２．２ ｐＦａｂと同じく、コラーゲン誘導血小板凝集を完全に抑制した（図１１）。
【０１０９】
フロー条件下での血小板凝集
さらに、コラーゲンへの血小板粘着および凝集に対するｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の効果を動脈流条件下で調査し、Ｆａｂ ９Ｏ１２および無関連のｓｃＦｖの結果と比較した（図１２参照）。この場合もコラーゲンによって誘導される血小板凝集が阻害された。ｓｃＦｖまたはＦａｂの存在下では、前の結果と一致してコラーゲン繊維と結合した分離血小板だけが観察され（９，４１）、対照条件とは対照的に、大きな血小板集塊は観察されなかった。
【０１１０】
トロンビン生成
Ｆａｂ ９Ｏ１２はコラーゲンによる刺激を受ける血小板の表面におけるトロンビン生成を阻害することが知られていることから、精製ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２の効果を、トロンボグラム法を用いて試験した（図１３）。ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２およびＦａｂ ９Ｏ１２は、トロンビンピークを同様の程度まで下げ、トロンビン生成を遅らせた。このことから、ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２はコラーゲン誘導血小板凝血促進活性の阻害においてＦａｂ ９Ｏ１２と同程度有効であることが示される。
【０１１１】
１．２．２ 第一のヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖ（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））
次に、本発明者らは、第１．１．２段に記載のようにネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメントをヒト化した。ヒト化ＶＨおよびＶＬドメインならびに第一ヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を図１４に示している。次に、このｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）フラグメントを、ＧＰＶＩセファロースとの親和性結合を用いてさらに特性決定した：組換え細菌の周縁質画分をＧＰＶＩセファロースカラム上にのせた。保持されたタンパク質を抗ｃ−ｍｙｃ ＩｇＧ、続いてＨＲＰと結合した抗マウス抗体を用いたウエスタンブロットおよびＥＣＬによる検出によって解析した。ヒト化ｓｃＦｖについて予想されたとおりに、分子量２８．５ｋＤａの単一バンドが検出される（図１５）。
【０１１２】
さらに、ＧＰＶＩ−ＦｃとのｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）の結合を解析し、ネズミｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（ｍｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２）の結果と比較した。精製ヒト化ｓｃＦｖおよびｍｓｃＦｖを、ＣＭ５センサーチップ上に固定されているＧＰＶＩ−Ｆｃ上に注入した。結果を図１６に示しており、これらの結果からｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）がＧＰＶＩ−Ｆｃとも、ｍｓｃＦｖより高いように思われる親和性で結合するということが示される。
【０１１３】
最後に、ヒト血小板とのｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（ｌ）の結合を研究した。ヒト血小板を細菌周縁質抽出物とともにインキュベートした。血小板と結合したｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）を、ＦＩＴＣ結合抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて検出した。血小板との結合をＸＬ Ｅｐｉｃｓ Ｃｏｕｌｔｅｒフローサイトメーターで解析した。陰性対照として無関連のｓｃＦｖを用いた。結果を図１７に示しており、これらの結果からｈｓｃＦｖについてのヒストグラムの右側シフトが示され、これによりヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１）が血小板ＧＰＶＩと結合することが分かる。
【０１１４】
１．３ 結論
上記の結果は、本発明者らによって９Ｏ１２．２モノクローナル抗体から作製されたネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖが、本質的な構造修飾にもかかわらず、ヒトＧＰＶＩと特異的に高親和性で結合することをはっきりと示している。さらに、そのネズミ９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖはコラーゲンとのＧＰＶＩの結合を阻害し、コラーゲン誘導血小板凝集を抑制するため、ＧＰＶＩ機能を阻害する。
【０１１５】
よって、このｓｃＦｖフラグメントはｓｃＦｖフラグメントの総ての利点を示しながら、対応するＦａｂフラグメントについての親和性および阻害能力を保有している。
さらに、本発明者らは、新たな本質的な構造修飾にもかかわらず、同様にヒトＧＰＶＩと高親和性で結合する第一ヒト化型９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメントも作製した（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（１））。
【０１１６】
この第一ヒト化９Ｏ１２．２ ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２）は、免疫原性が潜在的に最小限に低下されているという利点をさらに有する。
【０１１７】
よって、本願は、血小板凝集を阻害する高い能力を有する低分子量、低免疫原性のＧＰＶＩリガンドについて初めて記載し、このＧＰＶＩリガンドによって結果的に動脈血栓症の処置に極めて有望な製品がもたらされる。
実施例２ ヒト糖タンパク質ＶＩに対する第二の至適化されたヒト化単鎖可変フラグメントｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２）の合成および活性
【０１１８】
第一の組換えヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（１）フラグメントの作製は困難であったことから、この構築物におけるいくつかの精密化が必要であった。このようにしてｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（１）から第二の至適化ヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（２）フラグメントを得た。
【０１１９】
２．１ 試験手順
第二のヒト化ｓｃＦｖフラグメント（ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．２（２））の構築
本発明者らは、元のネズミＣＤＲとヒトアクセプターフレームワークの間の予測されない構造的不和合性がＶ−ドメインの不適切な折りたたみならびに細菌の細胞質に隔離されて留まる不溶性の封入体の形成をもたらしたのではないかと仮定した。これらの困難を克服するため、いくつかの微細な精密化を行った。
【０１２０】
まず、本発明者らは、９Ｏ１２ ＣＤＲ Ｌ１ループがＩＶＧＥのものよりも５残基長いこと、および９Ｏ１２およびＩＶＧＥのフレームワーク１および２の同一性スコアが低いこと（それぞれ４８％および７３％）を見出した（図１９）。これにより、ＩＶＧＥ軽鎖ＦＲ１およびＦＲ２がＣＤＲ Ｌ１の適正な折りたたみに適さないことが示唆された。
【０１２１】
次に、９Ｏ１２ ＶＬ ＦＲ１およびＦＲ２を用いて、さらなるＦＡＳＴＡを行った。ＦＲ１およびＦＲ２ではヒト１Ｘ９Ｑと良好な一致が見られた（それぞれ同一性スコア９５．６および８６．６、両場合で類似性１００％）。さらに、選択抗体１Ｘ９ＱのループＬ１（ＣＤＲ１）は９Ｏ１２のものと長さが類似していた。
【０１２２】
従って、本発明者らは、それらのフレームワークの配列が別のヒト抗体フレームワーク（１Ｘ９Ｑ）とよく一致している（そのＣＤＲ Ｌ１は９Ｏ１２のものと正確に同じサイズであった）ことから新規なヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（２）の構築において元のネズミ９Ｏ１２ ＶＬ ＦＲ１およびＦＲ２を保存することにした（図１９参照）。
【０１２３】
モデルの綿密な検査に基づき、他の精密化も行った。実際に、本発明者らはまた、最終的なｈＳｃＦｖ ９Ｏ１２構築物において、ＣＤＲループの、それらのコンフォメーションを採用する能力に影響を及ぼし得る極めて限定された数の残基を保持した。２つの重要な領域を保存した。１つ目のものは、Ｌ ＣＤＲ２の残基に近接していることからおそらく重要であると思われるＶＬ．Ｌ５９（ヒト鋳型におけるＰ）の５９〜６０番のジペプチドＬＤであった。ＬとＰは双方とも疎水性であるが、Ｐは環状側鎖であり、タンパク質主鎖構造に特定の影響を誘導することが知られている(MacArthur and Thornton, 1999)。さらに、本発明者らは、この位置にＬはＰよりもはるかに存在が少ない（２％）ことに気づき、これは特定の役割の指標となり得る(Honegger & Pluckthun, 2001)。ヒト鋳型（ＩＶＧＥ）と類似性のない他の変異していないネズミ残基はＶＨ ＦＲ３（ＡＨ７１、ＫＨ７３、ＲＨ７６、Ｋａｂｂａｔナンバリング）に位置していた。最後に、ヒト化に関して選択されたヒトフレームワークでは、ＶＬでは５つ、ＶＨでは１０個のみのネズミ残基を維持した。
【０１２４】
最終的な構築物を図１９に示す。ＶＨおよびＶＬフレームワーク３（それぞれ９０．６２および９３．７５％）を除いたヒト化ｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（２）フレームワークは総て、ヒトフレームワークと１００％の類似性を示す（下表１参照）。
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
全体として、最終的な構築物では、ネズミＶＨ ＦＲ３由来の１１個のＮ末端残基が保存されたが、これはそれらが、その抗原が予測され、従ってそれと相互作用し得るポケットの平坦部分に明らかに近接しているためである。しかしながらやはり、ＶＨ ＦＲ３はＩＶＧＥと２５／３２残基の同一性を示す。このフレームワークの３残基（ＡＨ７１、ＫＨ７３、ＲＨ７６、Ｋａｂｂａｔナンバリング）のみがＩＶＧＥと類似性を示さなかった。９Ｏ１２ ＶＬ ＦＲ３を、本質的にＬはこの位置に見られる頻度が少なく、Ｄは酸性残基であるので、この２残基（Ｌ５９ＰおよびＤ６０Ｓ）を除き、そのＩＶＧＥ相対物と置換した。
【０１２７】
他の試験手順
第二のｈｓｃＦｖ ９Ｏ１２．（２）フラグメントを特性決定するための他の総ての試験手順は実施例１に記載の通りに行った。
【０１２８】
２．２ 結果
ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）の製造は、ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（１）のものより良好であった。
【０１２９】
さらに、精製ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）フラグメントは、固定化ＧＰＶＩに対するＳＰＲ分析（ｋｏｎ＝５．８×１０４Ｍー１ｓー１、ｋｏｆｆ＝１．８６×１０−４ｓー１および解離定数ＫＤ＝３．２ｎＭ）によって示されたように、その標的に対する高い親和性を保存していた。
【０１３０】
それはフローサイトメトリーにおいて新しく産生されたヒト血小板と結合することができ、蛍光ピークの右側シフトは、同様の実験条件下の、ネズミｍｓｃＦｖ９Ｏ１２で標識された細胞のものと常に類似していた（図２０Ｂ参照）。血小板を過剰量のＦａｂ ９Ｏ１２と予め混合した場合は、ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）結合のほぼ完全な阻害がみらレセプター他。これらの結果は、アフィニティー精製されたｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）分子がＧＰＶＩならびにヒト血小板の表面に曝されている天然ＧＰＶＩに対する親抗体の結合活性、親和性および特異性を保持していたことを示した。
【０１３１】
２．３ 結論
ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（１）に関して、ヒト化により通常を影響を受ける主要なパラメーターはｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）でよく保存されていた。アフィニティー精製されたｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）は十分機能的であり、生物学的適用の主要な点であるＧＰＶＩに対する高い親和性を有していた。ＦＡＣＳ分析はまた、ｈｓｃＦｖ９Ｏ１２．２（２）は、その結合が１モル過剰のＦａｂ ９Ｏ１２の存在下で特異的に遮断されたことから、ヒト血小板においてマウスＦａｂ ９Ｏ１２と同じエピトープを認識することを示した。
【参照文献】
【０１３２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号３および配列番号４からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＶＨドメイン、
ペプチドリンカー、および
配列番号５、配列番号６および配列番号７からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＶＬドメイン
を含んでなる、ヒト糖タンパク質ＶＩに対する単鎖可変フラグメント。
【請求項２】
ペプチドタグおよび所望により短いペプチドスペーサーをさらに含んでなる、請求項１に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項３】
配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する２６６アミノ酸の配列を含んでなる、またはからなり、その２６６アミノ酸の配列のアミノ酸２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０９、１５９〜１７４、１９０〜１９６および２２９〜２３７がそれぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる、請求項２に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項４】
配列番号１を含んでなる、またはからなる、請求項３に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項５】
ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域がヒト抗体のフレームワーク領域を有するＶＨおよびＶＬドメインに置き換えられている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項６】
配列番号２８または配列番号４７を含んでなる、あるいはからなる、請求項５に記載のヒト化単鎖可変フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントをコードする核酸配列。
【請求項８】
配列番号２９を含んでなる、またはからなる、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項９】
配列番号３０または配列番号４９を含んでなる、あるいはからなる、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の核酸配列を含んでなる、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントを作製する方法であって、
ａ）請求項１１に記載の宿主細胞を培養すること、および
ｂ）前記単鎖可変フラグメントを精製すること
を含む、方法。
【請求項１３】
薬剤としての、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントと薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１５】
動脈および静脈血栓、再狭窄、急性冠動脈症候群ならびにアテローム性動脈硬化症による脳血管偶発症候から選択される心血管疾患の治療および／または予防を目的とした薬剤を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントの使用。
【請求項１６】
前記心血管疾患が血栓症である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１】
配列番号２、配列番号３および配列番号４からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＶＨドメイン、
ペプチドリンカー、および
配列番号５、配列番号６および配列番号７からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＶＬドメイン
を含んでなる、ヒト糖タンパク質ＶＩに対する単鎖可変フラグメント。
【請求項２】
ペプチドタグおよび所望により短いペプチドスペーサーをさらに含んでなる、請求項１に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項３】
配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する２６６アミノ酸の配列を含んでなる、またはからなり、その２６６アミノ酸の配列のアミノ酸２６〜３５、５０〜６６、９９〜１０９、１５９〜１７４、１９０〜１９６および２２９〜２３７がそれぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる、請求項２に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項４】
配列番号１を含んでなる、またはからなる、請求項３に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項５】
ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域がヒト抗体のフレームワーク領域を有するＶＨおよびＶＬドメインに置き換えられている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項６】
配列番号２８または配列番号４７を含んでなる、あるいはからなる、請求項５に記載のヒト化単鎖可変フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントをコードする核酸配列。
【請求項８】
配列番号２９を含んでなる、またはからなる、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項９】
配列番号３０または配列番号４９を含んでなる、あるいはからなる、請求項７に記載の核酸配列。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の核酸配列を含んでなる、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントを作製する方法であって、
ａ）請求項１１に記載の宿主細胞を培養すること、および
ｂ）前記単鎖可変フラグメントを精製すること
を含む、方法。
【請求項１３】
薬剤としての、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメント。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントと薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１５】
動脈および静脈血栓、再狭窄、急性冠動脈症候群ならびにアテローム性動脈硬化症による脳血管偶発症候から選択される心血管疾患の治療および／または予防を目的とした薬剤を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単鎖可変フラグメントの使用。
【請求項１６】
前記心血管疾患が血栓症である、請求項１５に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９】
【図２０】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９】
【図２０】
【図１３】
【公表番号】特表２０１０−５０７３８３（Ｐ２０１０−５０７３８３Ａ）
【公表日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３３８７１（Ｐ２００９−５３３８７１）
【出願日】平成１９年１０月２６日（２００７．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６１５６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４９９２８
【国際公開日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【出願人】（５０００２５４７７）アンスティテュ、ナショナル、ド、ラ、サント、エ、ド、ラ、ルシェルシュ、メディカル（アンセルム） (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬ （ＩＮＳＥＲＭ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２６日（２００７．１０．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６１５６９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４９９２８
【国際公開日】平成２０年５月２日（２００８．５．２）
【出願人】（５０００２５４７７）アンスティテュ、ナショナル、ド、ラ、サント、エ、ド、ラ、ルシェルシュ、メディカル（アンセルム） (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬ （ＩＮＳＥＲＭ）
【Ｆターム（参考）】
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