血液中の有核細胞成分濃縮方法
【課題】血液から比重差選別によらずに短時間に容易に幹細胞を含む白血球成分を濃縮する技術を開発する。
【解決手段】赤血球の変形能に着目して、赤血球や血漿などを通過させ、白血球を含む成分を非ろ過成分として回収する方法。
【解決手段】赤血球の変形能に着目して、赤血球や血漿などを通過させ、白血球を含む成分を非ろ過成分として回収する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液から有核細胞を含む成分を濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞やｉＰＳ細胞などの未分化な幹細胞は、再生医療に応用可能な細胞源として注目されている。例えば、臍帯血に含まれる造血幹細胞は、白血病の治療法である造血幹細胞移植に利用される頻度が高まっている。このような背景から、臍帯血などを保管する方法や施設を整備することも、細胞移植による治療成績を向上させるためには重要である。臍帯血の保管に関しては、公的、あるいは私的な臍帯血バンクに保存される仕組みがあるが、日本では提供者が少なく保存数が伸びないのが現状である。問題点としては、費用と技術的な側面が考えられる。
臍帯血は、採取できる量が少なく、一つの臍帯からは、３０〜１５０ｃｃ程度、平均で７０〜８０ｃｃが採取される。骨髄の場合は、一人あたり８００〜１０００ｃｃ程度採取可能である。移植に用いる臍帯血は、患者の体重１ｋｇあたり３〜５ｃｃ程度必要とされているため、現在日本では、移植対象が子供であることが多い。
臍帯血中の成分のうち、保存の対象となるのは、血漿や赤血球を除いた有核細胞成分であり、この中に造血幹細胞などの幹細胞成分が含まれる。有核細胞として白血球が主であるので、白血球を含む成分ともいわれる。この白血球成分を濃縮する技術として、臍帯血バンクで普及している技術は、比重選別である。二回の遠心処理を行い、白血球成分を多く含む層を回収する方法である。この方法では、視認できるほど明確な白血球層が生じないことが度々あり、また、採血された臍帯血の量によって途中で加える試薬の量も異なることから、その都度計算して、決定する必要がある。以上のことから、担当者の技量に左右されることが多く、処理には時間がかかり、白血球成分の品質が一定しないのが現状である。
【０００３】
臍帯血の処理工程は、（１）採血→（２）濃縮→（３）凍結保護液の添加→（４）凍結保存である。
濃縮工程は、採取した臍帯血から、赤血球と血漿を除去することによって有核細胞成分を濃縮する。赤血球の除去は、赤血球沈降剤を採血バッグ内の臍帯血に２０容量％添加し、その後軽遠心をして、赤血球を沈降させる。このとき、白血球層は赤血球層の最上部、つまり上清である血漿との界面にうっすらと形成される。遠心後、上清の血漿から赤血球層の上部までを採血バッグから分離バッグに移送することで、富白血球層を分離バッグに移す。次に、分離バッグの遠心を行って血球を沈降させ、上清の血漿を排出して、造血幹細胞を含む白血球含有成分を濃縮する。
この濃縮方法では、臍帯血の量は試料毎に異なるので赤血球沈降剤の添加量は毎回計算する必要がある。また、血漿層と赤血球層の界面にある白血球層は明瞭に形成されないこともあるので、不要成分の採取や回収率が変動することとなる。遠心沈降による層形成に必要な時間や熟練が必要などの問題があり、コストや品質に関する制約条件となっている。
【０００４】
特許文献１（特許第４０６１７１５号公報）には、軽遠心により分画された白血球層をさらに軽遠心して、血漿層と白血球濃厚液層に分画して、白血球濃縮液を回収し、凍結する方法が開示されている。
特許文献２（特許第３９３８９７３号公報）には、赤血球、血小板およびＣＤ３４陽性細胞を含む白血球から成る骨髄、末梢血、臍帯血あるいはこれらを粗分離した細胞集団から、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を回収することを特徴とする細胞分離方法が、開示されている。この方法では、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞は捕捉するのに対して、赤血球および血小板は実質的に通過させる特性を持つ不織布のフィルターを充填した容器に細胞集団を導入し、次に該フィルターにデキストランを含む生理的溶液を導入して、該フィルターに捕捉されている該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を選択的に回収することを特徴とする。この先行文献では、細胞分離フィルターとして、ポリエステル製不織布２５枚を積層して用いられている。不織布を積層したフィルターでは、繊維の絡みによってできる隙間のバラツキが大きく、白血球などが繊維の間に絡まってしまい、逆流させても回収した細胞の品質が安定しない可能性が高い。また、回収率を高めるためには、多くのフィルターと大量の回収液が必要になると考えられる。
特許文献３ （再公表２００７−０４６５０１号公報）には、不織布を幹細胞分離フィルターに使用する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０６１７１５号公報
【特許文献２】特許第３９３８９７３号公報
【特許文献３】再公表２００７−０４６５０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
濃縮技術として、遠心処理による濃縮では、調製後の成分が安定せず、調製に時間がかかり、操作に熟練を要するという欠点がある。また、不織布をフィルターに用いて、フィルターに絡め取られた白血球などを回収する方法では、まず、フィルターへの白血球の付着量を増やして白血球の回収率を高めるために、不織布を多数積層し、厚くする必要がある。その一方で、付着した白血球を回収する際には、不織布フィルターの内部にまで侵入して絡まった白血球を効率的に分離・回収する必要があることから、これら２つの要求を同時に満たすことは極めて困難である。さらに、繊維間に形成される隙間にはバラツキが生じることから再現性も得られにくい。
本発明は、血液から比重差選別によらずに短時間に容易に幹細胞を含む白血球成分を濃縮する技術を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者は、赤血球の変形能に着目して、赤血球や血漿などを通過させ、白血球を含む成分を非ろ過成分として回収する方法を提案する。
本発明の主な構成は次のとおりである。
１．血液から血球成分の細胞の大きさの違い、及び、細胞の変形能を利用して篩機能に基づいて分離して血液から有核細胞含有成分を濃縮する方法。
２．篩機能がフィルターであって、フィルターの孔径が２〜１２μｍであることを特徴とする１．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
３．フィルターの孔径が、３〜１０μｍであることを特徴とする２．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
４．フィルターの孔径が、５〜１０μｍであることを特徴とする３．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
５．フィルターの孔径が、５〜８μｍであることを特徴とする４．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
６．フィルターの孔径が、２μｍ〜赤血球よりも小さな径であることを特徴とする２．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
７．吸引を伴うことを特徴とする１．〜６．のいずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
８．フィルター素材は、ポリカーボネート製フィルムであることを特徴とする１．〜７．いずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
９．次の１〜３のステップによって、採取した血液から有核細胞含有成分を濃縮する方法。
第１ステップ：採取した血液を容器に入れ、フィルターを介して吸引用シリンジに連結 し、シリンジを引いて、シリンジ内のろ液が所定量になるまで吸引ろ過す る。
第２ステップ：吸引用シリンジを系から外し、洗浄液を収容した洗浄液供給用シリンジ と置換する。
第３ステップ：洗浄液供給用シリンジからフィルターへ向かって、洗浄液を送り、フィ ルターに補足されている富白血球分画を、濃縮血液回収容器に濃縮血液とし て回収する。
１０．第１ステップにおける、吸引ろ過スピードは、０.０４〜４．０ｍｌ／ｃｍ２・分の範囲であることを特徴とする９．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
１１．血液として人血を用いることを特徴とする１．〜１０．のいずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
１２．人血が臍帯血であることを特徴とする１１．に記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、上記特徴を具備することにより、主として次の効果を奏するものである。
（１）本発明は、微細孔を備えたフィルターを用いることにより、血液から比重差選別によらずに短時間に容易に幹細胞を含む有核細胞成分を濃縮する技術を提供することができる。特に、赤血球の変形能を利用して、赤血球よりも小さな孔径のフィルターを用いて、赤血球及び血漿成分等を通過させ、残った有核細胞分画を回収することができる。回収液を逆流させることにより容易に回収することができる。
（２）細孔フィルターを用いたろ過であるので、赤血球沈降剤の添加や不鮮明な層分画の選別を人的に行う必要が無いので、一定の条件に沿った、有核細胞成分を得ることができる。
（３）遠心操作や層分離の安定化などに要する時間が不要であるので、短時間に分離回収の調製を完了することができる。臍帯血などの血液採取から分離調製を短時間で行うことができるので、汚染など血液成分の劣化のリスクを抑制することができる。
（４）吸引や孔径の変更により、濃縮精度を容易にコントロールすることができる。
（５）熟練技術者でなくとも可能な方法である。
（６）品質の一定した有核細胞成分を濃縮した分画を短時間に得ることができるので、低コストで実用化することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】濃縮工程の概略を示す図
【図２】ラット血液試験における白血球回収率を示すグラフ。
【図３】ラット血液試験における赤血球回収率を示すグラフ。
【図４】ラット血液試験における白血球選択率を示すグラフ。
【図５】ラット血液試験における白血球濃縮率を示すグラフ。
【図６】ヒト血液試験における白血球回収率を示すグラフ。
【図７】ヒト血液試験における赤血球回収率を示すグラフ。
【図８】ヒト血液試験における白血球選択率を示すグラフ。
【図９】ヒト血液試験における白血球濃縮率を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、微細孔を備えたフィルターを用いることにより、血液から比重差選別によらずに短時間で容易に幹細胞を含む有核細胞成分を濃縮する発明である。特に、赤血球の変形能を利用して、赤血球よりも小さな孔径のフィルターを用いて、赤血球及び血漿成分等を通過させ、残った有核細胞分画を回収する発明である。遠心をかけて層を形成し、富白血球層を回収する方法や、不織布に白血球成分が吸着することを利用した白血球回収方法とは異なり、短時間に一定品質の有核細胞成分を濃縮した分画を回収することができる。非ろ過物である有核細胞成分を回収するに当たり、生理的食塩水などを用いて、逆流させて回収する。なお、本明細書にて、幹細胞を含む有核細胞成分を便宜上「白血球」と称することがある。
【００１１】
本方法は、膜を用いて赤血球と白血球をおおまかに分離することで、結果的に白血球を濃縮する点に特徴がある。
分離に用いる膜は、均一な孔径をもつ細孔が平行に多数開いている構造を持つフィルターを用いる。孔径は、白血球よりも小さい径であって、赤血球よりも小さな径が好ましい。ヒトの赤血球は７．８μｍとされるので、８．０μｍ以下が好ましい。
従来から白血球除去フィルターとして用いられている不織布を用いた「綿状」のフィルターとは、その構造が大きく異なっている。細孔が平行に開いている構造を持つフィルターは、医療分野ではこれまで「赤血球変形能測定用フィルター」として、限られた目的で用いられてきた。また、血液から血漿成分のみを取り出す「血漿分離フィルター」としても使用されてきた。しかし「赤血球と白血球を分離して、白血球を回収するためのフィルター」としての報告がない。「赤血球変形能測定用」として用いられてきたフィルターであるが、白血球を通過させず回収に用いることは、知られていない。本フィルターを「赤血球と白血球を分離するためのフィルター」として使用するためには、白血球と赤血球を分離して、白血球成分を選択的に回収できることを確認することが極めて重要である。また、「赤血球変形能測定」において用いられる血液量は１ｍｌ程度であり、本フィルターを臍帯血など数十ｍｌ以上の血液を処理できることが求められる。
【００１２】
白血球も変形能を有するが、赤血球は、短時間に変形することができるので、赤血球よりも小さな孔をすり抜けることができる。本発明は、この赤血球と白血球の変形能の違いに着目し、赤血球のみを通過させ、白血球を通過させずに回収する発明である。
【００１３】
処理対象血液は、骨髄液、末梢血、臍帯血があげられる。
微細孔を有するフィルターとしては、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、ポリビニリデンフロライド、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニール、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン等の合成高分子、セルロースアセテート、再生セルロース、セルロース混合エステル等のセルロース系材料、ステンレス、銀、チタン等の金属があげられる。微細孔フィルターは、ワットマン社 ニュークリポアフィルター、ミリポア社 アイソポアフィルターなどがある。
微細孔の加工は、レーザービームを用いた穿孔操作による均一な膜孔形成ができる。膜厚、フィルターの複層等設計も容易である。従来の不織布は、分厚くして、隙間に絡めるという方式であるので不織布繊維に付着してしまい回収残が多く回収率には限度がある。また、白血球は、体内にて異物に接触して活性化して生体を防御する機能を果たしているので、白血球が不織布繊維に接触する機会が多くなることは、活性化してしまう危険があって、回収された白血球は使用できない状態に劣化するリスクもある。
【００１４】
濃縮工程の概略を図１に示す。
第１ステップは、採取した血液Ａを容器１に入れ、フィルター２を介して吸引用シリンジ３に連結する。シリンジを一定速度で引いて、シリンジ内のろ液Ｂが所定量になるまで吸引ろ過する。吸引用シリンジ３を使用する代わりに、採血した血液Ａをシリンジに入れてフィルター２に向かって押し出すことで、ろ過することもできる。
第２ステップは、吸引用シリンジ３を系から外し、洗浄液Ｃを収容した洗浄液供給用シリンジ６と置換する。
第３ステップは、この洗浄液供給用シリンジ６からフィルター２へ向かって、洗浄液Ｃを送り、フィルターに補足されている富白血球分画Ｄを、濃縮血液回収容器７に濃縮血液Ｅとして回収する。ここで、濃縮血液回収容器７は、第１ステップで使用した血液容器１を兼用するか、あるいは、新たな容器を用いることもできる。
更に、凍結保存する場合は、凍害保護剤をこの段階で、あるいは後の工程で添加することができる。
処理工程は、赤血球の沈降や相分離が不要であって、シンプルである。不織布の繊維間に絡まることもないので、回収が容易である。技能的要素が少ないので、標準技術化に適している。
【００１５】
吸引ろ過スピードは、０．５ｍｌ／ｍｉｎで試験を行った。試料血液５ｍｌは１０分でろ過することができる。試験に用いたフィルターは径１３ｍｍであるので、これを４７ｍｍ径とすると、ろ過面積は約１０倍となり、５０〜１００ｍｌ程度の臍帯血でも、フィルター径を５０ｍｍ程度あるいは、並列処理することにより、十分に１０分以内にろ過できる。
したがって、洗浄液による回収時間や凍害保護剤を添加する時間を含めても、血液の濃縮調整に要する時間は３０分程度で終了することができる。
【００１６】
ろ過スピードは、０.０４〜４．０ｍｌ／ｃｍ２・分が好ましい。ろ過スピードが大きすぎると目が詰まる。また、遅い場合は長時間を要することとなる。
本発明は、シンプルな装置構成を用いて、操作手順に従って、短時間で濃縮作業を行うことができ、熟練を必要としない。
短時間で濃縮作業を行うことができるので、臍帯などが新鮮な状態で処理することができ、処理工程における破損、細胞汚染などの事故を押さえることができ、濃縮血液の品質を高めることができる。
【００１７】
熟練を必要とせずシンプルな装置構成であるので、採取現場でも随時処理が可能であり、産院などの病院内でも実施することができる。病院内で処理することができれば、病院内の衛生環境及び医療廃棄物処理システムを活用することができる。これは、臍帯を臍帯血バンクなどの処理施設に搬送して濃縮処理することに比べて、搬送負荷も含めて、格段に改良されることとなる。臍帯血バンクでは、保存施設のみの機能に特化することができ、設備を軽減し、簡素化して、低コストのサービスが可能となる。
臍帯を預ける側にとっても、同じ産院などで処理することができれば、信頼関係もあり、また、自分の保存臍帯血をその場で確認することができるので、全体として預けたという確認行為と安心感を持つことができる。
【実施例】
【００１８】
血液はＳＤラット（オス）、またはヒトから採取した。採血時、あるいは血液処理時に、器具内部で血液が凝固しないように抗凝固剤としてヘパリンを用いた。
【００１９】
［ヒトの血球の大きさ］
赤血球 ： ７．８μｍ
白血球
・顆粒球 ： １２〜１５μｍ
・単球 ： １２ (１５)〜２０μｍ
・リンパ球 小型 ６〜８μｍ、
大型 ９〜１２μｍ
（「組織細胞生物学」内山安男監修、南江堂、p 147-154 参照）
【００２０】
［ラットの血球の大きさ］
赤血球 ： ５．９μｍ
白血球
・顆粒球 ： １１μｍ
・単球 ： 顆粒球よりも大きい。
・リンパ球 ６〜１５μｍ、
（The Laboratory Rat Volume 1: Biology and Diseases, (Eds) HJ Baker, JR Lindsey, SH Weisbroth, Academic Press 1979 等参照）
【００２１】
血液分離フィルターとして、孔径が均一な細孔が平行に開いている構造を持つポリカーボネートフィルム（アイソポアフィルター（登録商標）（ミリポア社）製）を用いた。
直径１３ｍｍで細孔径が３μｍ、５μｍ、８μｍ、更にヒトではこれらに加えて１０μｍの４種類のフィルターを用いた。一部の実験では、フィルターの細孔径が２μｍを使用した。
分離実験では、試験管に５ｍｌの血液を入れ、シリンジポンプを用いて血液（およそ０．５〜４ｍｌ）を吸引ろ過した（図１）。この時の血液ろ過速度は０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。
【００２２】
ろ過が終了したのち、ろ液が含まれたシリンジを脱着し、新たに洗浄液（生理的食塩水、２ｍｌ）を含んだシリンジをフィルターに装着した。この洗浄液をフィルターに通すことにより、チューブやフィルター内部に残存していた血液を、元の血液が入っていた試験管へと押し流した。この操作によって試験管に残った液（ろ過されなかった血液に洗浄液を加えたもの）を回収液とした。
元の血液、ろ液、および回収液の体積を計測するとともに、各溶液中の赤血球および白血球の濃度を自動血球計数器（日本光電工業、セルタックＭＥＫ−５２５８）で計測することにより、各溶液に含まれている赤血球数と白血球数を算出した。
【００２３】
白血球濃縮の指標として、以下のパラメーターを用いた。
（１）白血球回収率Ａ＝（回収液中の白血球数a1）／（採取血液（５ｍｌ）中の白血球数 a2）
（２）赤血球回収率Ｂ＝（回収液中の赤血球数b1）／（採取血液（５ｍｌ）中の赤血球数 b2）
（３）白血球選択率Ｃ＝白血球回収率Ａ−赤血球回収率Ｂ
（４）白血球濃縮率Ｄ＝（回収液中の白血球数a1）／（回収液中の赤血球数b1）
（採取血液中の白血球数a2）／（採取血液中の赤血球数b2）
【００２４】
［ラット血液の試験結果］
３種類のフィルター（孔径３、５、８μｍ）を用い、ろ液量を変化させて分離実験を行った結果を図２〜５に示す。
まず白血球回収率については（図２）、５μｍと８μｍのフィルターを用いた場合には、ろ液量が増加するに従って回収液中への白血球回収率は低下したことから、一定の割合で白血球はフィルターを通過していることがわかった。それに対して、３μｍのフィルターを用いた場合には、ろ液量にかかわらず白血球回収率はほぼ１００％であったことから、白血球は３μｍのフィルターをほとんど通過していないことが示された。
【００２５】
赤血球回収率については（図３）、いずれのフィルターを用いた場合にも、ろ液量の増加に伴って低下し、孔径の違いが回収率の違いにおよぼす影響も認められなかった。よって、赤血球はこれらのフィルターをほぼ一定の割合で通過することがわかった。
【００２６】
これらの回収率の差から白血球選択率を求めた結果を図４に示す。５μｍと８μｍのフィルターを用いた場合には、白血球と赤血球の回収率にあまり違いが無く、白血球選択率はほぼ０であった。一方、３μｍのフィルターを用いた場合には、ろ液量の増加に伴って選択率は増加したことから、白血球を有効に濃縮できていることが示された。
【００２７】
白血球濃縮の別の指標として、白血球濃縮率を求めた結果を図５に示す。白血球濃縮率の傾向は白血球選択率と同様であり、３μｍのフィルターを用いた場合のみ白血球は効率的に濃縮されていたことが示された。
【００２８】
なお、孔径が２μｍのフィルターを用いた場合には、血液をほとんどろ過できなかった。
以上の結果から、ラット血液中の白血球を濃縮するのに適した細孔径は２〜５μｍの範囲であり、今回実施した条件では３μｍが最適であった。
【００２９】
［ヒト血液の試験結果］
４種類のフィルター（孔径３、５、８、１０μｍ）を用い、分離実験を行った結果を図６〜９に示す。
白血球回収率は（図６）、ラットの場合とほぼ同様の結果が得られた。つまり、孔径が３μｍのフィルターを用いた場合には回収率はほぼ１００％であったのに対して、５〜１０μｍのフィルターではろ液量の増加に伴って回収率が低下した。このとき、５〜１０μｍのフィルターでは、孔径の違いが回収率に及ぼす明確な効果は認められなかった。
【００３０】
赤血球回収率は（図７）、ろ液量の増加に伴い減少した。この減少の割合は、孔径によらずほぼ一定であった。
【００３１】
白血球選択率については（図８）、３μｍのフィルターを用いた場合が最も効率が高かった。しかし、本実験でのろ液量がほぼ限界であった。その他のフィルターでは、孔径による選択効率の違いはほとんど無かった。
【００３２】
白血球濃縮率については（図９）、選択率とほぼ同様の傾向が得られた。
【００３３】
以上の結果から、ヒト血液の場合には、孔径５〜１０μｍのフィルターが適していることがわかった。ろ液量と白血球回収率を考慮しながら細孔径を決定する必要がある。
【００３４】
［ 応用例 ］
・本実験では５ｍｌの血液を使用したので、ヘマトクリット（血液に占める血球の体積 の割合、以下 Ht）を４０％とすると、赤血球量は、
（５×０．４＝）２ｍｌ
である。白血球体積は微小なので一応無視すると、上記式（４）の採取血液中の赤血 球数b2 ＝２ｍｌとなる。
・上記式（４）の白血球濃縮率 D＝１．５で、白血球回収率A ＝１００％の場合、同式 の a1 = a2 より b1 ＝１．３３ｍｌとなる。つまり、ろ過操作によって
（２−１．３３＝)０．６７ｍｌ
の赤血球が、ろ液として除去されることになる。
・本実験で用いたフィルター（直径１３ｍｍ）を、大型化して直径４７ｍｍフィルターを 使用する場合を考える。膜面積あたり同じ量の赤血球を処理できるとして、直径４７ｍ ｍのフィルターでは、
０．６７×(４７／１３)2 ＝８．７６ｍｌ
の赤血球が除去できる。
・実用化されている凍結保存バッグの容積は２５ｍｌであり、１０％の凍害保護剤を添加 することを考えれば、血液体積を２２ｍｌ程度まで減らす必要がある。この血液中の赤 血球量は１６ｍｌとすれば、濃縮前の赤血球量は、４７ｍｍのフィルターが１〜３枚の 場合でそれぞれ
１枚： １６＋８．７６×１＝２４．７６ｍｌ
２枚： １６＋８．７６×２＝３３．５２ｍｌ
３枚： １６＋８．７６×３＝４２．２８ｍｌ
となる。
・したがって、Ht = ４０％とすると、処理できる元の血液量は、次のとおりとなる。
１枚： ２４．７６／０．４＝６１．９ｍｌ
２枚： ３３．５２／０．４＝８３．８ｍｌ
３枚： ４２．２８／０．４＝１０６ｍｌ
・一方、大型の膜（１枚または２枚）で１００ｍｌの血液を処理する場合のフィルター直 径について考える。フィルターで除去すべき赤血球量は、
１枚： (１００×０．４−１６)／１＝２４ｍｌ
２枚： (１００×０．４−１６)／２＝１２ｍｌ
である。D ＝１．５ とすると、必要な直径はそれぞれ次のとおりとなる。
１枚： １３×(２４／０．６７)0.5 ＝７８ｍｍ
２枚： １３×(１２／０．６７)0.5 ＝５５ｍｍ
【００３５】
以上のことから、本発明を適用することにより、処理できる血液量は十分に実用的である。
上記設定したとおり、現状の凍結システムを利用する場合、凍結バッグの容量は２５ｃｃであり、凍結保護剤が約１０％添加されるので、保存血液量は２２ｃｃ程度である。血液の流動性を考慮すると、保存血球量は１６ｃｃ程度にする必要がある。
本発明により処理できる血液量は、濃縮率が１．５、Ht が４０％、白血球回収率が１００％、保存血球量を１６ｍｌと仮定した場合に、直径４７ｍｍのフィルターを１枚用いた場合に約６２ｍｌ、２枚で約８４ｍｌ、３枚では約１０６ｍｌとなる。したがって、通常の量の臍帯血を処理する場合にはフィルターは２枚までで対応でき、臍帯血量が多い場合でも３枚で処理できる。
一方、１００ｍｌの臍帯血を大型のフィルターで処理するためには、１枚であれば直径７８ｍｍ、２枚であれば５５ｍｍのフィルターを用いれば良く、実用的な問題は無い（他の仮定は同上）。濃縮率を高めることができれば、規格品（直径４７ｍｍ）のフィルター２枚で十分に処理できることになる。
【符号の説明】
【００３６】
１ 容器
２ フィルター
３ 吸引用シリンジ
４ チューブ
５ チューブ
６ 洗浄液供給用シリンジ
７ 濃縮血液回収容器
Ａ 血液
Ｂ ろ液
Ｃ 洗浄液
Ｄ 富白血球分画
Ｅ 濃縮血液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液から有核細胞を含む成分を濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞やｉＰＳ細胞などの未分化な幹細胞は、再生医療に応用可能な細胞源として注目されている。例えば、臍帯血に含まれる造血幹細胞は、白血病の治療法である造血幹細胞移植に利用される頻度が高まっている。このような背景から、臍帯血などを保管する方法や施設を整備することも、細胞移植による治療成績を向上させるためには重要である。臍帯血の保管に関しては、公的、あるいは私的な臍帯血バンクに保存される仕組みがあるが、日本では提供者が少なく保存数が伸びないのが現状である。問題点としては、費用と技術的な側面が考えられる。
臍帯血は、採取できる量が少なく、一つの臍帯からは、３０〜１５０ｃｃ程度、平均で７０〜８０ｃｃが採取される。骨髄の場合は、一人あたり８００〜１０００ｃｃ程度採取可能である。移植に用いる臍帯血は、患者の体重１ｋｇあたり３〜５ｃｃ程度必要とされているため、現在日本では、移植対象が子供であることが多い。
臍帯血中の成分のうち、保存の対象となるのは、血漿や赤血球を除いた有核細胞成分であり、この中に造血幹細胞などの幹細胞成分が含まれる。有核細胞として白血球が主であるので、白血球を含む成分ともいわれる。この白血球成分を濃縮する技術として、臍帯血バンクで普及している技術は、比重選別である。二回の遠心処理を行い、白血球成分を多く含む層を回収する方法である。この方法では、視認できるほど明確な白血球層が生じないことが度々あり、また、採血された臍帯血の量によって途中で加える試薬の量も異なることから、その都度計算して、決定する必要がある。以上のことから、担当者の技量に左右されることが多く、処理には時間がかかり、白血球成分の品質が一定しないのが現状である。
【０００３】
臍帯血の処理工程は、（１）採血→（２）濃縮→（３）凍結保護液の添加→（４）凍結保存である。
濃縮工程は、採取した臍帯血から、赤血球と血漿を除去することによって有核細胞成分を濃縮する。赤血球の除去は、赤血球沈降剤を採血バッグ内の臍帯血に２０容量％添加し、その後軽遠心をして、赤血球を沈降させる。このとき、白血球層は赤血球層の最上部、つまり上清である血漿との界面にうっすらと形成される。遠心後、上清の血漿から赤血球層の上部までを採血バッグから分離バッグに移送することで、富白血球層を分離バッグに移す。次に、分離バッグの遠心を行って血球を沈降させ、上清の血漿を排出して、造血幹細胞を含む白血球含有成分を濃縮する。
この濃縮方法では、臍帯血の量は試料毎に異なるので赤血球沈降剤の添加量は毎回計算する必要がある。また、血漿層と赤血球層の界面にある白血球層は明瞭に形成されないこともあるので、不要成分の採取や回収率が変動することとなる。遠心沈降による層形成に必要な時間や熟練が必要などの問題があり、コストや品質に関する制約条件となっている。
【０００４】
特許文献１（特許第４０６１７１５号公報）には、軽遠心により分画された白血球層をさらに軽遠心して、血漿層と白血球濃厚液層に分画して、白血球濃縮液を回収し、凍結する方法が開示されている。
特許文献２（特許第３９３８９７３号公報）には、赤血球、血小板およびＣＤ３４陽性細胞を含む白血球から成る骨髄、末梢血、臍帯血あるいはこれらを粗分離した細胞集団から、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を回収することを特徴とする細胞分離方法が、開示されている。この方法では、該白血球またはＣＤ３４陽性細胞は捕捉するのに対して、赤血球および血小板は実質的に通過させる特性を持つ不織布のフィルターを充填した容器に細胞集団を導入し、次に該フィルターにデキストランを含む生理的溶液を導入して、該フィルターに捕捉されている該白血球またはＣＤ３４陽性細胞を選択的に回収することを特徴とする。この先行文献では、細胞分離フィルターとして、ポリエステル製不織布２５枚を積層して用いられている。不織布を積層したフィルターでは、繊維の絡みによってできる隙間のバラツキが大きく、白血球などが繊維の間に絡まってしまい、逆流させても回収した細胞の品質が安定しない可能性が高い。また、回収率を高めるためには、多くのフィルターと大量の回収液が必要になると考えられる。
特許文献３ （再公表２００７−０４６５０１号公報）には、不織布を幹細胞分離フィルターに使用する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４０６１７１５号公報
【特許文献２】特許第３９３８９７３号公報
【特許文献３】再公表２００７−０４６５０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
濃縮技術として、遠心処理による濃縮では、調製後の成分が安定せず、調製に時間がかかり、操作に熟練を要するという欠点がある。また、不織布をフィルターに用いて、フィルターに絡め取られた白血球などを回収する方法では、まず、フィルターへの白血球の付着量を増やして白血球の回収率を高めるために、不織布を多数積層し、厚くする必要がある。その一方で、付着した白血球を回収する際には、不織布フィルターの内部にまで侵入して絡まった白血球を効率的に分離・回収する必要があることから、これら２つの要求を同時に満たすことは極めて困難である。さらに、繊維間に形成される隙間にはバラツキが生じることから再現性も得られにくい。
本発明は、血液から比重差選別によらずに短時間に容易に幹細胞を含む白血球成分を濃縮する技術を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者は、赤血球の変形能に着目して、赤血球や血漿などを通過させ、白血球を含む成分を非ろ過成分として回収する方法を提案する。
本発明の主な構成は次のとおりである。
１．血液から血球成分の細胞の大きさの違い、及び、細胞の変形能を利用して篩機能に基づいて分離して血液から有核細胞含有成分を濃縮する方法。
２．篩機能がフィルターであって、フィルターの孔径が２〜１２μｍであることを特徴とする１．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
３．フィルターの孔径が、３〜１０μｍであることを特徴とする２．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
４．フィルターの孔径が、５〜１０μｍであることを特徴とする３．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
５．フィルターの孔径が、５〜８μｍであることを特徴とする４．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
６．フィルターの孔径が、２μｍ〜赤血球よりも小さな径であることを特徴とする２．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
７．吸引を伴うことを特徴とする１．〜６．のいずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
８．フィルター素材は、ポリカーボネート製フィルムであることを特徴とする１．〜７．いずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
９．次の１〜３のステップによって、採取した血液から有核細胞含有成分を濃縮する方法。
第１ステップ：採取した血液を容器に入れ、フィルターを介して吸引用シリンジに連結 し、シリンジを引いて、シリンジ内のろ液が所定量になるまで吸引ろ過す る。
第２ステップ：吸引用シリンジを系から外し、洗浄液を収容した洗浄液供給用シリンジ と置換する。
第３ステップ：洗浄液供給用シリンジからフィルターへ向かって、洗浄液を送り、フィ ルターに補足されている富白血球分画を、濃縮血液回収容器に濃縮血液とし て回収する。
１０．第１ステップにおける、吸引ろ過スピードは、０.０４〜４．０ｍｌ／ｃｍ２・分の範囲であることを特徴とする９．記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
１１．血液として人血を用いることを特徴とする１．〜１０．のいずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
１２．人血が臍帯血であることを特徴とする１１．に記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、上記特徴を具備することにより、主として次の効果を奏するものである。
（１）本発明は、微細孔を備えたフィルターを用いることにより、血液から比重差選別によらずに短時間に容易に幹細胞を含む有核細胞成分を濃縮する技術を提供することができる。特に、赤血球の変形能を利用して、赤血球よりも小さな孔径のフィルターを用いて、赤血球及び血漿成分等を通過させ、残った有核細胞分画を回収することができる。回収液を逆流させることにより容易に回収することができる。
（２）細孔フィルターを用いたろ過であるので、赤血球沈降剤の添加や不鮮明な層分画の選別を人的に行う必要が無いので、一定の条件に沿った、有核細胞成分を得ることができる。
（３）遠心操作や層分離の安定化などに要する時間が不要であるので、短時間に分離回収の調製を完了することができる。臍帯血などの血液採取から分離調製を短時間で行うことができるので、汚染など血液成分の劣化のリスクを抑制することができる。
（４）吸引や孔径の変更により、濃縮精度を容易にコントロールすることができる。
（５）熟練技術者でなくとも可能な方法である。
（６）品質の一定した有核細胞成分を濃縮した分画を短時間に得ることができるので、低コストで実用化することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】濃縮工程の概略を示す図
【図２】ラット血液試験における白血球回収率を示すグラフ。
【図３】ラット血液試験における赤血球回収率を示すグラフ。
【図４】ラット血液試験における白血球選択率を示すグラフ。
【図５】ラット血液試験における白血球濃縮率を示すグラフ。
【図６】ヒト血液試験における白血球回収率を示すグラフ。
【図７】ヒト血液試験における赤血球回収率を示すグラフ。
【図８】ヒト血液試験における白血球選択率を示すグラフ。
【図９】ヒト血液試験における白血球濃縮率を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、微細孔を備えたフィルターを用いることにより、血液から比重差選別によらずに短時間で容易に幹細胞を含む有核細胞成分を濃縮する発明である。特に、赤血球の変形能を利用して、赤血球よりも小さな孔径のフィルターを用いて、赤血球及び血漿成分等を通過させ、残った有核細胞分画を回収する発明である。遠心をかけて層を形成し、富白血球層を回収する方法や、不織布に白血球成分が吸着することを利用した白血球回収方法とは異なり、短時間に一定品質の有核細胞成分を濃縮した分画を回収することができる。非ろ過物である有核細胞成分を回収するに当たり、生理的食塩水などを用いて、逆流させて回収する。なお、本明細書にて、幹細胞を含む有核細胞成分を便宜上「白血球」と称することがある。
【００１１】
本方法は、膜を用いて赤血球と白血球をおおまかに分離することで、結果的に白血球を濃縮する点に特徴がある。
分離に用いる膜は、均一な孔径をもつ細孔が平行に多数開いている構造を持つフィルターを用いる。孔径は、白血球よりも小さい径であって、赤血球よりも小さな径が好ましい。ヒトの赤血球は７．８μｍとされるので、８．０μｍ以下が好ましい。
従来から白血球除去フィルターとして用いられている不織布を用いた「綿状」のフィルターとは、その構造が大きく異なっている。細孔が平行に開いている構造を持つフィルターは、医療分野ではこれまで「赤血球変形能測定用フィルター」として、限られた目的で用いられてきた。また、血液から血漿成分のみを取り出す「血漿分離フィルター」としても使用されてきた。しかし「赤血球と白血球を分離して、白血球を回収するためのフィルター」としての報告がない。「赤血球変形能測定用」として用いられてきたフィルターであるが、白血球を通過させず回収に用いることは、知られていない。本フィルターを「赤血球と白血球を分離するためのフィルター」として使用するためには、白血球と赤血球を分離して、白血球成分を選択的に回収できることを確認することが極めて重要である。また、「赤血球変形能測定」において用いられる血液量は１ｍｌ程度であり、本フィルターを臍帯血など数十ｍｌ以上の血液を処理できることが求められる。
【００１２】
白血球も変形能を有するが、赤血球は、短時間に変形することができるので、赤血球よりも小さな孔をすり抜けることができる。本発明は、この赤血球と白血球の変形能の違いに着目し、赤血球のみを通過させ、白血球を通過させずに回収する発明である。
【００１３】
処理対象血液は、骨髄液、末梢血、臍帯血があげられる。
微細孔を有するフィルターとしては、成型性、滅菌性や細胞毒性が低いという点で好ましいものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、ポリビニリデンフロライド、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニール、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン等の合成高分子、セルロースアセテート、再生セルロース、セルロース混合エステル等のセルロース系材料、ステンレス、銀、チタン等の金属があげられる。微細孔フィルターは、ワットマン社 ニュークリポアフィルター、ミリポア社 アイソポアフィルターなどがある。
微細孔の加工は、レーザービームを用いた穿孔操作による均一な膜孔形成ができる。膜厚、フィルターの複層等設計も容易である。従来の不織布は、分厚くして、隙間に絡めるという方式であるので不織布繊維に付着してしまい回収残が多く回収率には限度がある。また、白血球は、体内にて異物に接触して活性化して生体を防御する機能を果たしているので、白血球が不織布繊維に接触する機会が多くなることは、活性化してしまう危険があって、回収された白血球は使用できない状態に劣化するリスクもある。
【００１４】
濃縮工程の概略を図１に示す。
第１ステップは、採取した血液Ａを容器１に入れ、フィルター２を介して吸引用シリンジ３に連結する。シリンジを一定速度で引いて、シリンジ内のろ液Ｂが所定量になるまで吸引ろ過する。吸引用シリンジ３を使用する代わりに、採血した血液Ａをシリンジに入れてフィルター２に向かって押し出すことで、ろ過することもできる。
第２ステップは、吸引用シリンジ３を系から外し、洗浄液Ｃを収容した洗浄液供給用シリンジ６と置換する。
第３ステップは、この洗浄液供給用シリンジ６からフィルター２へ向かって、洗浄液Ｃを送り、フィルターに補足されている富白血球分画Ｄを、濃縮血液回収容器７に濃縮血液Ｅとして回収する。ここで、濃縮血液回収容器７は、第１ステップで使用した血液容器１を兼用するか、あるいは、新たな容器を用いることもできる。
更に、凍結保存する場合は、凍害保護剤をこの段階で、あるいは後の工程で添加することができる。
処理工程は、赤血球の沈降や相分離が不要であって、シンプルである。不織布の繊維間に絡まることもないので、回収が容易である。技能的要素が少ないので、標準技術化に適している。
【００１５】
吸引ろ過スピードは、０．５ｍｌ／ｍｉｎで試験を行った。試料血液５ｍｌは１０分でろ過することができる。試験に用いたフィルターは径１３ｍｍであるので、これを４７ｍｍ径とすると、ろ過面積は約１０倍となり、５０〜１００ｍｌ程度の臍帯血でも、フィルター径を５０ｍｍ程度あるいは、並列処理することにより、十分に１０分以内にろ過できる。
したがって、洗浄液による回収時間や凍害保護剤を添加する時間を含めても、血液の濃縮調整に要する時間は３０分程度で終了することができる。
【００１６】
ろ過スピードは、０.０４〜４．０ｍｌ／ｃｍ２・分が好ましい。ろ過スピードが大きすぎると目が詰まる。また、遅い場合は長時間を要することとなる。
本発明は、シンプルな装置構成を用いて、操作手順に従って、短時間で濃縮作業を行うことができ、熟練を必要としない。
短時間で濃縮作業を行うことができるので、臍帯などが新鮮な状態で処理することができ、処理工程における破損、細胞汚染などの事故を押さえることができ、濃縮血液の品質を高めることができる。
【００１７】
熟練を必要とせずシンプルな装置構成であるので、採取現場でも随時処理が可能であり、産院などの病院内でも実施することができる。病院内で処理することができれば、病院内の衛生環境及び医療廃棄物処理システムを活用することができる。これは、臍帯を臍帯血バンクなどの処理施設に搬送して濃縮処理することに比べて、搬送負荷も含めて、格段に改良されることとなる。臍帯血バンクでは、保存施設のみの機能に特化することができ、設備を軽減し、簡素化して、低コストのサービスが可能となる。
臍帯を預ける側にとっても、同じ産院などで処理することができれば、信頼関係もあり、また、自分の保存臍帯血をその場で確認することができるので、全体として預けたという確認行為と安心感を持つことができる。
【実施例】
【００１８】
血液はＳＤラット（オス）、またはヒトから採取した。採血時、あるいは血液処理時に、器具内部で血液が凝固しないように抗凝固剤としてヘパリンを用いた。
【００１９】
［ヒトの血球の大きさ］
赤血球 ： ７．８μｍ
白血球
・顆粒球 ： １２〜１５μｍ
・単球 ： １２ (１５)〜２０μｍ
・リンパ球 小型 ６〜８μｍ、
大型 ９〜１２μｍ
（「組織細胞生物学」内山安男監修、南江堂、p 147-154 参照）
【００２０】
［ラットの血球の大きさ］
赤血球 ： ５．９μｍ
白血球
・顆粒球 ： １１μｍ
・単球 ： 顆粒球よりも大きい。
・リンパ球 ６〜１５μｍ、
（The Laboratory Rat Volume 1: Biology and Diseases, (Eds) HJ Baker, JR Lindsey, SH Weisbroth, Academic Press 1979 等参照）
【００２１】
血液分離フィルターとして、孔径が均一な細孔が平行に開いている構造を持つポリカーボネートフィルム（アイソポアフィルター（登録商標）（ミリポア社）製）を用いた。
直径１３ｍｍで細孔径が３μｍ、５μｍ、８μｍ、更にヒトではこれらに加えて１０μｍの４種類のフィルターを用いた。一部の実験では、フィルターの細孔径が２μｍを使用した。
分離実験では、試験管に５ｍｌの血液を入れ、シリンジポンプを用いて血液（およそ０．５〜４ｍｌ）を吸引ろ過した（図１）。この時の血液ろ過速度は０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。
【００２２】
ろ過が終了したのち、ろ液が含まれたシリンジを脱着し、新たに洗浄液（生理的食塩水、２ｍｌ）を含んだシリンジをフィルターに装着した。この洗浄液をフィルターに通すことにより、チューブやフィルター内部に残存していた血液を、元の血液が入っていた試験管へと押し流した。この操作によって試験管に残った液（ろ過されなかった血液に洗浄液を加えたもの）を回収液とした。
元の血液、ろ液、および回収液の体積を計測するとともに、各溶液中の赤血球および白血球の濃度を自動血球計数器（日本光電工業、セルタックＭＥＫ−５２５８）で計測することにより、各溶液に含まれている赤血球数と白血球数を算出した。
【００２３】
白血球濃縮の指標として、以下のパラメーターを用いた。
（１）白血球回収率Ａ＝（回収液中の白血球数a1）／（採取血液（５ｍｌ）中の白血球数 a2）
（２）赤血球回収率Ｂ＝（回収液中の赤血球数b1）／（採取血液（５ｍｌ）中の赤血球数 b2）
（３）白血球選択率Ｃ＝白血球回収率Ａ−赤血球回収率Ｂ
（４）白血球濃縮率Ｄ＝（回収液中の白血球数a1）／（回収液中の赤血球数b1）
（採取血液中の白血球数a2）／（採取血液中の赤血球数b2）
【００２４】
［ラット血液の試験結果］
３種類のフィルター（孔径３、５、８μｍ）を用い、ろ液量を変化させて分離実験を行った結果を図２〜５に示す。
まず白血球回収率については（図２）、５μｍと８μｍのフィルターを用いた場合には、ろ液量が増加するに従って回収液中への白血球回収率は低下したことから、一定の割合で白血球はフィルターを通過していることがわかった。それに対して、３μｍのフィルターを用いた場合には、ろ液量にかかわらず白血球回収率はほぼ１００％であったことから、白血球は３μｍのフィルターをほとんど通過していないことが示された。
【００２５】
赤血球回収率については（図３）、いずれのフィルターを用いた場合にも、ろ液量の増加に伴って低下し、孔径の違いが回収率の違いにおよぼす影響も認められなかった。よって、赤血球はこれらのフィルターをほぼ一定の割合で通過することがわかった。
【００２６】
これらの回収率の差から白血球選択率を求めた結果を図４に示す。５μｍと８μｍのフィルターを用いた場合には、白血球と赤血球の回収率にあまり違いが無く、白血球選択率はほぼ０であった。一方、３μｍのフィルターを用いた場合には、ろ液量の増加に伴って選択率は増加したことから、白血球を有効に濃縮できていることが示された。
【００２７】
白血球濃縮の別の指標として、白血球濃縮率を求めた結果を図５に示す。白血球濃縮率の傾向は白血球選択率と同様であり、３μｍのフィルターを用いた場合のみ白血球は効率的に濃縮されていたことが示された。
【００２８】
なお、孔径が２μｍのフィルターを用いた場合には、血液をほとんどろ過できなかった。
以上の結果から、ラット血液中の白血球を濃縮するのに適した細孔径は２〜５μｍの範囲であり、今回実施した条件では３μｍが最適であった。
【００２９】
［ヒト血液の試験結果］
４種類のフィルター（孔径３、５、８、１０μｍ）を用い、分離実験を行った結果を図６〜９に示す。
白血球回収率は（図６）、ラットの場合とほぼ同様の結果が得られた。つまり、孔径が３μｍのフィルターを用いた場合には回収率はほぼ１００％であったのに対して、５〜１０μｍのフィルターではろ液量の増加に伴って回収率が低下した。このとき、５〜１０μｍのフィルターでは、孔径の違いが回収率に及ぼす明確な効果は認められなかった。
【００３０】
赤血球回収率は（図７）、ろ液量の増加に伴い減少した。この減少の割合は、孔径によらずほぼ一定であった。
【００３１】
白血球選択率については（図８）、３μｍのフィルターを用いた場合が最も効率が高かった。しかし、本実験でのろ液量がほぼ限界であった。その他のフィルターでは、孔径による選択効率の違いはほとんど無かった。
【００３２】
白血球濃縮率については（図９）、選択率とほぼ同様の傾向が得られた。
【００３３】
以上の結果から、ヒト血液の場合には、孔径５〜１０μｍのフィルターが適していることがわかった。ろ液量と白血球回収率を考慮しながら細孔径を決定する必要がある。
【００３４】
［ 応用例 ］
・本実験では５ｍｌの血液を使用したので、ヘマトクリット（血液に占める血球の体積 の割合、以下 Ht）を４０％とすると、赤血球量は、
（５×０．４＝）２ｍｌ
である。白血球体積は微小なので一応無視すると、上記式（４）の採取血液中の赤血 球数b2 ＝２ｍｌとなる。
・上記式（４）の白血球濃縮率 D＝１．５で、白血球回収率A ＝１００％の場合、同式 の a1 = a2 より b1 ＝１．３３ｍｌとなる。つまり、ろ過操作によって
（２−１．３３＝)０．６７ｍｌ
の赤血球が、ろ液として除去されることになる。
・本実験で用いたフィルター（直径１３ｍｍ）を、大型化して直径４７ｍｍフィルターを 使用する場合を考える。膜面積あたり同じ量の赤血球を処理できるとして、直径４７ｍ ｍのフィルターでは、
０．６７×(４７／１３)2 ＝８．７６ｍｌ
の赤血球が除去できる。
・実用化されている凍結保存バッグの容積は２５ｍｌであり、１０％の凍害保護剤を添加 することを考えれば、血液体積を２２ｍｌ程度まで減らす必要がある。この血液中の赤 血球量は１６ｍｌとすれば、濃縮前の赤血球量は、４７ｍｍのフィルターが１〜３枚の 場合でそれぞれ
１枚： １６＋８．７６×１＝２４．７６ｍｌ
２枚： １６＋８．７６×２＝３３．５２ｍｌ
３枚： １６＋８．７６×３＝４２．２８ｍｌ
となる。
・したがって、Ht = ４０％とすると、処理できる元の血液量は、次のとおりとなる。
１枚： ２４．７６／０．４＝６１．９ｍｌ
２枚： ３３．５２／０．４＝８３．８ｍｌ
３枚： ４２．２８／０．４＝１０６ｍｌ
・一方、大型の膜（１枚または２枚）で１００ｍｌの血液を処理する場合のフィルター直 径について考える。フィルターで除去すべき赤血球量は、
１枚： (１００×０．４−１６)／１＝２４ｍｌ
２枚： (１００×０．４−１６)／２＝１２ｍｌ
である。D ＝１．５ とすると、必要な直径はそれぞれ次のとおりとなる。
１枚： １３×(２４／０．６７)0.5 ＝７８ｍｍ
２枚： １３×(１２／０．６７)0.5 ＝５５ｍｍ
【００３５】
以上のことから、本発明を適用することにより、処理できる血液量は十分に実用的である。
上記設定したとおり、現状の凍結システムを利用する場合、凍結バッグの容量は２５ｃｃであり、凍結保護剤が約１０％添加されるので、保存血液量は２２ｃｃ程度である。血液の流動性を考慮すると、保存血球量は１６ｃｃ程度にする必要がある。
本発明により処理できる血液量は、濃縮率が１．５、Ht が４０％、白血球回収率が１００％、保存血球量を１６ｍｌと仮定した場合に、直径４７ｍｍのフィルターを１枚用いた場合に約６２ｍｌ、２枚で約８４ｍｌ、３枚では約１０６ｍｌとなる。したがって、通常の量の臍帯血を処理する場合にはフィルターは２枚までで対応でき、臍帯血量が多い場合でも３枚で処理できる。
一方、１００ｍｌの臍帯血を大型のフィルターで処理するためには、１枚であれば直径７８ｍｍ、２枚であれば５５ｍｍのフィルターを用いれば良く、実用的な問題は無い（他の仮定は同上）。濃縮率を高めることができれば、規格品（直径４７ｍｍ）のフィルター２枚で十分に処理できることになる。
【符号の説明】
【００３６】
１ 容器
２ フィルター
３ 吸引用シリンジ
４ チューブ
５ チューブ
６ 洗浄液供給用シリンジ
７ 濃縮血液回収容器
Ａ 血液
Ｂ ろ液
Ｃ 洗浄液
Ｄ 富白血球分画
Ｅ 濃縮血液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液から血球成分の細胞の大きさの違い、及び、細胞の変形能を利用して篩機能に基づいて分離して血液から有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項２】
篩機能がフィルターであって、フィルターの孔径が２〜１２μｍであることを特徴とする請求項１記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項３】
フィルターの孔径が、３〜１０μｍであることを特徴とする請求項２記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項４】
フィルターの孔径が、５〜１０μｍであることを特徴とする請求項３記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項５】
フィルターの孔径が、５〜８μｍであることを特徴とする請求項４記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項６】
フィルターの孔径が、２μｍ〜赤血球よりも小さな径であることを特徴とする請求項２記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項７】
吸引を伴うことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項８】
フィルター素材は、ポリカーボネート製フィルムであることを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項９】
次の１〜３のステップによって、採取した血液から有核細胞含有成分を濃縮する方法。
第１ステップ：採取した血液を容器に入れ、フィルターを介して吸引用シリンジに連 結し、シリンジを引いて、シリンジ内のろ液が所定量になるまで吸引ろ過 する。
第２ステップ：吸引用シリンジを系から外し、洗浄液を収容した洗浄液供給用シリン ジと置換する。
第３ステップ：洗浄液供給用シリンジからフィルターへ向かって、洗浄液を送り、 フィルターに補足されている富白血球分画を、濃縮血液回収容器に濃縮血 液として回収する。
【請求項１０】
第１ステップにおける、吸引ろ過スピードは、０.０４〜４．０ｍｌ／ｃｍ２・分の範囲であることを特徴とする請求項９記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項１１】
血液として人血を用いることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項１２】
人血が臍帯血であることを特徴とする請求項１１に記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項１】
血液から血球成分の細胞の大きさの違い、及び、細胞の変形能を利用して篩機能に基づいて分離して血液から有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項２】
篩機能がフィルターであって、フィルターの孔径が２〜１２μｍであることを特徴とする請求項１記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項３】
フィルターの孔径が、３〜１０μｍであることを特徴とする請求項２記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項４】
フィルターの孔径が、５〜１０μｍであることを特徴とする請求項３記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項５】
フィルターの孔径が、５〜８μｍであることを特徴とする請求項４記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項６】
フィルターの孔径が、２μｍ〜赤血球よりも小さな径であることを特徴とする請求項２記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項７】
吸引を伴うことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項８】
フィルター素材は、ポリカーボネート製フィルムであることを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項９】
次の１〜３のステップによって、採取した血液から有核細胞含有成分を濃縮する方法。
第１ステップ：採取した血液を容器に入れ、フィルターを介して吸引用シリンジに連 結し、シリンジを引いて、シリンジ内のろ液が所定量になるまで吸引ろ過 する。
第２ステップ：吸引用シリンジを系から外し、洗浄液を収容した洗浄液供給用シリン ジと置換する。
第３ステップ：洗浄液供給用シリンジからフィルターへ向かって、洗浄液を送り、 フィルターに補足されている富白血球分画を、濃縮血液回収容器に濃縮血 液として回収する。
【請求項１０】
第１ステップにおける、吸引ろ過スピードは、０.０４〜４．０ｍｌ／ｃｍ２・分の範囲であることを特徴とする請求項９記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項１１】
血液として人血を用いることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【請求項１２】
人血が臍帯血であることを特徴とする請求項１１に記載の有核細胞含有成分を濃縮する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−８０８２１（Ｐ２０１２−８０８２１Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２９６２６（Ｐ２０１０−２２９６２６）
【出願日】平成２２年１０月１２日（２０１０．１０．１２）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（５１０２７１１９６）ファミリーセルバンク合同会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１２日（２０１０．１０．１２）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（５１０２７１１９６）ファミリーセルバンク合同会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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