血管生成の抑制剤、並びにその製造方法、修飾方法及び抗腫瘍薬の製造における用途
高性能血管生成抑制剤は血管生成抑制ポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-A la-Ala-Val-Proの一端又は両端にそれぞれArg-Gly-Asp配列を含むポリペプチドが接続される。当該高性能血管生成抑制は合成又は遺伝工学の方法で製造出来る。当該高性能血管生成抑制剤のポリエチレングリコール（PEG）修飾方法。上記高性能血管生成抑制剤及びその修飾物は固形腫瘍を治療する薬物の製造における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物工学の製薬技術分野又は蛋白質ポリペプチト類の薬物分野に属しており、具体的には血管生成抑制剤、並びにその製造方法、修飾方法及び血管新生抑制剤よりなる抗腫瘍薬の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍血管生成抑制剤は近年腫瘍治療において重要視されている薬物の一つであり、この面での研究がすでにある程度の進展をみせており、今後新しい腫瘍治療薬物の一つとして期待される。がん新生血管形成の概念は1947年にAlgurezaによって提出されたもので、成長中腫瘍の重要な特徴の一つとしては、宿主から新しい毛細管内皮細胞の形成を引き出すことができる、と同氏が指摘した。1971年にFolkmanは仮説を提起し、つまり、腫瘍の生成と転移が新しい血管の生成に依存しており、実体腫瘍の早期において腫瘍血管の分泌から因子を生成し、宿主毛細血管の増生を刺激する。新生血管は腫瘍に必要な栄養と酸素を提供して代謝物を排除するだけではなく、遠距離転移の経路にもなっている（Folkman,J.,J.Natl.Cancer Inst.1990;82:4-6)。従って、新生血管形成の可能性を遮断するのが腫瘍の生成と転移を阻止する手段となり、これを基に血管生成促進分子と血管生成抑制分子に対する盛んな研究を引き起こしている。これらの血管抑制剤の中では、特にアンジオスタチン（angiostatin）とエンドスタチン(endostatin)がもっとも注目され、両者ともアメリカでの臨床試験に入っている。これらの血管生成抑制剤が非常に魅力的な展望を呈しているが、その欠陥も明らかなものである。今までの血管生成薬物、例えばエンドスタチン、アンジオスタチンなどは作用する標的が不明確で、血管の専一性と選択性はあまり良くなく、その効果が限られている。そのため、実験での使用量はかなり高いものとなる。マウスによる動物模型実験の際、アンジオスタチンの用量は数百ｍｇ／ｋｇ体重にも達し、エンドスタチンは数十ｍｇ／ｋｇ体重になる。これらの血管生成抑制剤が人体に使用される時、使用量は少なくとも数クラム／人の用量となる。このような大きな薬物使用量は、この種の薬物の毒副作用発生の可能性を増加し、そこからこの種の薬物の品質へのコントロールが難しくなり、製造規模と製造コストが増大し、薬物の価格も高いものとなる。
【０００３】
従って、良い抗血管生成薬物としては新生血管の標的分子に対して選択性を持つべきで、これによって新生血管に対してその指向作用を持ち、総体的に血管生成に対する薬物の抑制作用を高める。これによって低用量の薬物を使用するだけで、高活性の血管生成抑制の効果をもたらしてくる。
【０００４】
インテグリンはαサブユニットとβサブユニットからなる膜貫通タンパク質ヘテロであり、研究結果によれば、腫瘍細胞表面のインテグリンは腫瘍転移発生の所在である。これらのインテグリンは細胞内の細胞骨格タンパク質と細胞外マトリックス分子とを接続する相互作用で細胞の遷移、分化及び増殖をコントロールする（Schoenwaelder SM, Curr Opin Cell Biol,1999;274-286）。20数種類のサブユニットの中の大多数はRGD(アルギニンーグリシンーアスパラギン酸)配列を含む細胞外マトリックスの配位子（Dennis MSなど, Proc Natl Acad Sci 1990; 87: 2471-2475）を識別でき、RGD配列を含むポリペプチトがインテグリン拮抗薬の作用を持つ。それが細胞接着分子の表面発現を減少し、細胞のシグナル伝達を調節することができ、腫瘍治療において幅広く応用できる。
【０００５】
物理的化学修飾はポリペプチド又はタンパク質が治療や生物技術方面での効力を高める重要なプロセスである。修飾物が適当な方式でタンパク質やポリペプチトに接続するか、若しくはタンパク質ポリペプチドに対して修飾する時、さまざまな特徴を変えることができるが、その主なバイオアクテイブ係数、例えば、酵素活性又は特定の結合部位が残存する。物理的化学修飾は下記いくつかの方法で薬物の性能を改善する。まず、修飾物がタンパク質やポリペプチドの表面への接続により、その分子の大きさを増やすだけでなく、水の分子を大量に運ぶことができるので、一種の修飾物―タンパク質は５〜10倍も増大する。それに、物理的化学修飾は以前溶けないタンパク質を簡単に溶かし、高度な移動性を持たせる。そのほか、タンパク質ポリペプチドへの修飾は腎臓の薬物への濾過作用を減少し、その内因性発熱物質の機能を下げ、またプロテアーゼの消化を減らすこともできる。人の免疫システムの攻撃から分子を保護することにより、その供給を改善する。同時に人の防御システムから逃げたため、作用部位に留まる時間がかなり長くなり、局部薬物の濃度を高めるのである。現在のところ、国際市場に出ているPEG‐ポリペプチド(又はPEG-タンパク質)製品はすでにいくつかの品種がある。世界でナンバーワンの生物技術会社Amgen社開発の新しい薬SD/01がPEG使用で修飾した顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）であり、Amgen社の早期製品G-CSFの持効性型である。G-CSF1999年の売り上げは12.2億ドルで、2000年は12.6億ドルである。そこから修飾タンパク質ポリペプチド製品の市場は非常に大きいことが分かる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在のところの発現によれば、あるコーデイングの血管生成抑制剤のオリゴペプチドは血管生成抑制と抗腫瘍の効果を有し、本研究は血管生成抑制のオリゴペプチドの両端にアルギニン‐グリシン‐アスパラキン酸を含む異なる配列を加え、インテグリンに対して結合作用と親和性を有する血管生成抑制剤を構築するのである。
【０００７】
本発明の目的は、インテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤を提供することで、本発明の高性能血管生成抑制剤が合成可能である。本発明の第二の目的は、上述した「インテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤」の製造方法を提供することである。上述したポリペプチドは合成又はPCRの増幅によって目標遺伝子を獲得でき、原核生物の発現ベクター又は真核生物の発現ベクターにクローニングして、遺伝子工程手段で生成物を獲得するのである。本発明の第三の目的は、上述した「インテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤」の物理的化学修飾方法を提供することである。つまりさまざまな修飾方法で血管生成抑制ポリペプチドを修飾し、ポリエチレングリコール修飾、ヘパリン修飾、デキストラン修飾、ポリビニルピロリトン修飾、ポリエチレングリコール‐ポリアミノ酸共重合体修飾、パルミチン酸修飾、ポリシアル酸修飾、リポソームとナノテクノロジー修飾を含めて、複数の修飾生成物を獲得した。本発明の第四の目的は、上述した「インテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤」及びその修飾生成物の応用を提供することである。すなわちインテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤とその修飾生成物が抗腫瘍薬の製造における応用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述一番目の発明課題を解決するための技術案としては、
血管生成抑制ポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(ES-2と称す)の両端に、少なくともその一端にインテグリンファミリーに親和性又は結合力を有するポリペプチドが接続してあり、前記した「インテグリンファミリーに親和性又は結合力を有するポリペプチド」とは、Arg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linkerを含む配列を指し、上述したリンカー（Linker）及び本出願すべてのリンカーは、一つか又は複数の異なるアミノ酸のことを指すのである。
【０００９】
前記したArg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linkerを含むポリぺプチド配列は下記配列より、選び出している。
【００１０】
Arg-Gly-Asp-linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(P1)、
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (P2)、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-linker-Arg-Gly-Asp(P3)、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp (P4)、 Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro- Arg-Gly-Asp(P5)、 Arg-Gly-Asp-Linker -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker -Arg-Gly-Asp(P6)、
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker- Arg-Gly-Asp(P7)、又は Arg-Gly-Asp-Linker -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp (P8)。
【００１１】
上述技術案のさらなる改善にあたり、前記したArg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linkerを含むポリぺプチド配列のかわりに、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg -Cly-Asp-Cys-Phs-Cys又は
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg -Cly-Asp-Cys-Phs-Cys-Linker含む配列を用いても良い。
【００１２】
前記したAla-Cys-Asp-Cys-Arg -Cly-Asp-Cys-Phs-Cys又は
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg -Cly-Asp-Cys-Phs-Cys-Linkerを含む配列は、下記ポリペプチド配列より選び出している。
【００１３】
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (P9)、
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (P10)、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P11 )、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P12 )、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys(P13)、 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro -Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P14 )、
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P15)、 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys ( P16 )。
【００１４】
このような形式の接続は血管生成抑制のポリペプチド
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの標的性を高めることができる(表１参照)。
【００１５】
本発明の上記二種類の形式とも別々さらなる改善が可能であり、下記最適化手法が得られる。
【００１６】
最適化手法１、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は化学合成の方法で形成可能である。
【００１７】
最適化手法２、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記方式の一つである遺伝子工学の方法を用いて形成できる。
【００１８】
２−１、Arg-Gly-Aspインテグリン結合配列ペプチドを含む血管生成抑制剤遺伝子配列を合成し、この配列をテンプレートにし、上流・下流プライマーを設計し、プライマー配列の５’末端と３’末端にクローニングに適切する制限酵素切断部位を付加し、PCR増幅し、RGD-ED遺伝子を獲得する。遺伝子をベクターにクローニングし、陽性クローンをスクリーニングし、ヌクレオチド配列の解析を行う。
【００１９】
２−２、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。RGD-ED遺伝子は原核生物発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、大腸菌に転化させ、 IPTGで発現RGD-EDを誘導し、発現生成物は封入体として存在する。
【００２０】
２−３、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００２１】
封入体のタンパク分離、溶解、活性再生を行い、更にイオン交換クロマトグラフィーでRGD-EDタンパク生成物を分離・純化し、フロースルーを収集し、凍結乾燥する。
【００２２】
２−４、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記方式の遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００２３】
本発明中のすべてのRGD−ED遺伝子に対し、真核生物の発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、真核細胞に転化させ、発現RGD-EDを誘導し、発現生成物を分離・純化する。
【００２４】
最適化手法３、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーディングする塩基配列に対して修飾することができ、生体内での半減期を高め、その標的性を高めるのである。
【００２５】
３、前記のインテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドは、ポリエチレングリコール又はヘパリン又はデキストラン又はポリビニルピロリトン又はポリエチレングリコール‐ポリアミノ酸共重合体又はパルミチン酸又はポリシアル酸又はリポソームとナノテクノロジーなどで修飾した後のポリペプチド生成物である。
【００２６】
本発明の二番目の任務を完成させた方案は、インテグリンに親和性と結合力を有する
高性能血管生成抑制剤の製造方法であり、そのステップは以下の通りである。
【００２７】
血管生成抑制ポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの両端に、少なくともその一端はインテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドが接続され、前記の「インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチド」は、Arg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linker又はAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys又は
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linkerを含む配列であり、その中の-Linkerは一つ又は複数の異なるアミノ酸である。
【００２８】
上述製造方法のさらなる限定については、下記具体的製造方法がある。
【００２９】
１.前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は固体と液体の化学合成方法を用いて形成する。
【００３０】
２.前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記方式の一つである遺伝子工学の方式を用いて形成する。
【００３１】
２−１、Arg-Gly-Aspインテグリン結合配列ペプチドを含む血管生成抑制剤遺伝子配列を合成し、この配列をテンプレートにし、上流・下流プライマーを設計し、プライマー配列の５’末端と３’末端にクローニングに適切する制限酵素切断部位を付加し、PCR増幅し、RGD-ED遺伝子を獲得する。遺伝子をベクターにクローニングし、陽性クローンをスクリーニングし、ヌクレオチド配列の解析を行う。
【００３２】
２−２、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００３３】
RGD-ED遺伝子は原核生物発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、大腸菌に転化させ、 IPTGで発現RGD-EDを誘導する。
【００３４】
２−３、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００３５】
封入体のタンパク分離、溶解、活性再生を行い、更にイオン交換クロマトグラフィーでRGD-EDタンパク生成物を分離・純化し、フロースルーを収集し、凍結乾燥する。
【００３６】
２−４、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００３７】
本発明中のすべてのRGD−ED遺伝子に対し、真核生物の発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、真核細胞に転化させ、発現RGD-EDを誘導し、発現生成物を分離・純化する。
【００３８】
本発明三番目の発明任務を完成させる方案は、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列に対して修飾する方法であり、以下のステップの一つを用いる。
【００３９】
１.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対し、ポリエチレングリコール（PEG）修飾
を行い、用いられたPEG分子量範囲が直鎖状（相対分子量が2000-30000Dα）又は分枝状（相対分子量が40000-60000Dα）であり、その中には、(1)PEG-ビニルスルホン酸（PEG-Vinylsulphone）と、(2)PEG-ヨードアセトアミド（PEG-Iodoacetamide）と、(3)PEG-マレアミド（PEG- Maleimide）と、(4)PEG-オルトピリジンジスルフィド
（PEG-Orthopyridyldisulfide）と、(5)SC-mPEG(メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート)と、又はSS-PEG（スクシンイミジルスクシネート）又はPEG-イソシアン酸エステル（PEG-lsocyanate）(7)(8)と、(6) メトキシ化PEGプロピオンアルデヒド（mPEG-ALD）が含まれる。
【００４０】
２.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してヘパリン修飾をする。
【００４１】
３.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してデキストラン修飾をする。
【００４２】
４.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してポリビニルピロリドン（PVP）修飾をする。
【００４３】
５.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してポリエチレングリコールーポリアミノ酸共重合体に対して修飾をする。
【００４４】
６.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してパルミチン酸（palmitic acid）修飾をする。
【００４５】
７.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してポリシアル酸（colominic acid）修飾をする。
【００４６】
８.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してリポソーム修飾をする。その内、リポソーム（REV）、乾燥したリポソーム（DRV）及び多重ラメラリポソーム（Mｖｌ）を含める。
【００４７】
９.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してナノテクノロジー修飾をする。
【００４８】
本発明四番目の任務を完成させた方案は、上述した「インテグリンに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤」が抗腫瘍薬物の製造における応用である。
【００４９】
前記の抗腫瘍薬物の製造における応用とは、本発明中のすべてのナノ配列に対する
ナノ薬物製造が含み、ポリ乳酸（PLA）ナノ粒子やナノ微粒子、又はポリ----ーシアノアクリレートブチル（PBCA）ナノ粒子やナノ微粒子、又はキトサンナノ粒子やナノ微粒子の製造が含まれる。
【００５０】
血管内皮細胞増殖実験、鶏胚絨毛尿膜（CAM）分析、マウス体内の抗腫瘍実験を通して腫瘍細胞との結合状況を分析する。本発明生成物が体内外実験において大幅に既成血管生成抑制剤の内皮細胞成長と抗腫瘍効果を改善し、向上させることができ、又、使用量が少ないため、コスト・ダウンが実現した。本発明の設計した効率な血管生成抑制剤が科学的で、合理的で、有効的なものであることが分かり、腫瘍治療の薬物とすることができる。
本発明の有益な効果は下記の通りである。
【００５１】
本発明で述べた高性能血管生成抑制のポリペプチド及びその物理的化学修飾の生成物が人類新生血管生成に関わる病気、即ち実体腫瘍の薬物として製造できるのである。
【００５２】
その生成物は同類の製品に比べ、効率的で、特異的に内皮細胞増殖抑制と抗腫瘍効果を有し、しかも使用量が少ないため、相対的に薬物治療の副作用を減少した。
【００５３】
本発明はポリペプチドに対してさまざまな修飾をした。これらの修飾は本発明中のポリペプチドの半減期（T1/2）を延長させ、安定性を強め、免役原性と抗原を下げ、分子構造を変えることから薬物動態と薬理学の性質を改善し、作用部位の薬剤血液濃度を高める。同時に、修飾をしていないポリペプチドよりもっと良い耐性を現し、将来の臨床応用範囲と治療効果を増やした。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１はHPLC純化 RGD-ED分析結果
【図２】図２は鶏胚絨毛尿膜（CAM）分析RGD-ED新生血管生成抑制：Ａ、空白対照、Ｂ、Ｃ、Ｄそれぞれ0.05μｇ、0.1μｇと0.2μｇの治療群
【図３】図３はRGD-ED体内腫瘍抑制効果
【図４】図４はポリエチレングリコール（PEG）とリポソームのポリペプチド修飾で体内腫瘍抑制の効果：1、2、3はそれぞれ修飾前のRGD-ED、リポソーム修飾後とポリエチレングリコール修飾後のRGD-ED体内肝臓がん抑制の作用効果
【発明を実施するための形態】
【００５５】
１．RGD-ED遺伝子のクローン及びその原核生物発現ベクターの構築
合成コーデイングされたRGD-EDポリペプチド配列の塩基をテンプレートにする。上流・下流プライマーを設計して、その中、上流プライマーにNdeI酵素切断部位を加え、下流プライマにはArg-Gly-Asp配列とXhoI部位を有する。PCR増幅し、増幅生成物がアガロースゲル電気泳動回収と純化を経て、NdeIとXhoI制限酵素切断を行い、原核生物の発現ベクターpwにクローニングし、PCR陽性クローンをスクリーニングする。ヌクレオチド配列の分析でその配列に設計上著しい変化が発生したのを確認した。
合成のプライマー1：5’GGAATTCCATATG ATCGTGCGCCGTGCCGACCGC3’
合成のプライマー2：5’CCGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCA3’
うち、プライマー1はNdeI部位とIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro
の一部の配列をコーデイングする。プライマー2はXhoI部位とArg-Gly-Asp配列を有する遺伝子をコーデイングした。
【００５６】
２．本発明の血管生成抑制剤RGD-EDの実際効果を比較するため、本実例においてわれわれは製造会社にArg-Gly-Asp配列を含まないポリペプチドの合成依頼を同時にした。
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro（ED）。
【００５７】
３.組み換え細胞の誘導発現
発現型プラスミドを大腸菌に転換させ、組み換え菌が1mMIPTG誘発3時間後細胞を採取し、超音波破砕し、上清と沈澱に遠心分離し、15％SDS-PAGEの電気泳動、クマシーブリリアンドブルー染色のSDS-PAGEスキャン（UVP White/Ultraviolet transilluminator）を行い、その発現結果を分析する。
【００５８】
４．封入体の分離、溶解と活性再生
超音波破砕と遠心分離をし、封入体沈澱を0.1Mtrisとデオキシコール酸ナトリウムにて洗滌して、沈澱をラウリルサルコシン酸ナトリウム（SLS）に溶解する。4℃、10000rpm にて5min遠心分離し、上清液4℃にて透析する。透析液はbufferA(10mM Tris-HCI、0.1mM酸化型グルタチオンと1mM還元型グルタチオン、pH7.4)である。6−8hで一回液体を取り替え、計三回取り替える。最後に一回透析をする。透析液はbuffer B（10mM Tris-HCI、pH7.4）である。サンプルに対して直接SP-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)-クロマトグラフィーを行う。カラムへの平衡洗滌はbuffer Bを使い、0.6M NaCI、 Tris-HCI、 pH7.4と1M NaCI、Tris-HCI、pH7.4 を使って順番で溶出する。溶出液を混合させ、buffer B透析後、冷凍乾燥して濃縮させる。クロマトグラフィーの結果は図１の示した通りである。
【００５９】
５．内皮細胞増殖分析
BCE細胞とNIH 3T3細胞を培養する。その方法：培養液DMEMに10％の不活化牛胎児血清(BCS)、1％の抗生物質及び３ng/ml bFGFが含まれる。細胞増殖分析方法は下記の通りである。PBSにて細胞を洗滌してトリプシンを消化する。浮遊細胞培養液を加え、遠心分離して細胞を採取する。細胞の濃度を25,000 cells/mlに調整する。細胞を６オリフィス（0.5ml/well）に移入して24ｈ培養し、培養液を１ml DMEMに交換する。5％BCS、1%抗生物質、１ng/ml bFGF、各ホールに異なる投与量を入れてさらに48ｈ培養する。トリプシンにて細胞を消化してPBSに再浮遊させる。70％の冷たいエタメールにて30min 固定させ、7-AAD染色する。細胞流量計測器で分析を行う。
【００６０】
その結果によれば、RGD-EDの組換えによって特異的に内皮細胞―BCE細胞の増殖を抑制することができるが、非内皮細胞―NIH 3T3に対しては抑制作用を持っていない。BCE増殖抑制のED50は約0.1μg/mlであるのに対し、RGD配列のないポリペプチドED50は、約0.8μg/mlであり、内皮抑素のED50は約0.5μg/mlである。上記実験で本発明の設計した高性能血管生成抑制剤は既成の血管生成の生物活性を著しく高めたことを明らかにした。
【００６１】
６．鶏胚絨毛尿膜（CAM）分析
体内の抗血管生成活性を測定するため、CAM分析をする。すべての実験がクリーンベンチに無菌操作で行われる。消毒した六日間の鶏胚を37℃、90％湿度の条件下で培養する。二日間後、各卵の上部に穴を開けて試薬を滅菌のWhatman濾紙に滴加し、CAMsの血管集中部位に入れる。48時間培養した後、鶏胚とCAMsを観察して写真を撮る。
図２の示したように、RGD-ED体内抗新生血管生成活性を評価するため、用量の異なるRGD-EDを使ってCAM実験を行った。うち、0.05μg、0.1μg と0.2μgのRGD-EDが明らかに新生血管と血管生成を抑制できるのである。0.5μgRGD-EDは完全に血管生成を抑制でき、鶏胚の死亡に至るのである。RGD-EDは血管生成抑制の潜在的作用を有する。
【００６２】
７.本発明のポリペプチドは固体又は液体の方法で人工合成可能である。
【００６３】
８.ポリペプチドのPEG修飾。
【００６４】
８.１ Ｎ末端アミノアシラーゼ修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約20−50％にして、約20−95重量％のポリエチレングリコールSC-mPEG (メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート、平均分子量5000)又はSS-PEG（スクシンイミジルスクシネート）又はPEG-イソシアン酸塩（PEG-lsocyanate）の溶液と混合する。約50−93重量％の上記修飾物を取って充分混合し、4℃−40℃の間、最適25℃−37℃のシェーカーで10分以上振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーでＮ末端修飾される生成物を分離する。
【００６５】
８.２ カルボキシ末端修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約20−50％にして、約20−95重量％のmPEG-NH2(平均分子量5000)、少量のDCCI（ジシクロヘキシルカルボジイミド）溶液と混合する。最適約50−93重量％の上記修飾物を充分混合し、4℃−40℃の間、最適23℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適90分、カルボキシがmPEG-NH2の中のアミノ酸と結合してアミドを形成する。RP-HPLC分離でＮ末端の修飾される生成物を得る。
【００６６】
８.３ スルビドリル末端修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約1−30％にして、約20−95重量％のmPEG-MAL(mPEG-マレイミド、平均分子量5000)溶液と混合する。最適約70−94％の上記修飾物を充分混合し、4℃−40℃の間、最適20℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適60分、イオン交換クロマトグラフィーでＮ末端の修飾される生成物を得る。
【００６７】
９.その他の修飾方法
その他の修飾方法はすべてPEG修飾を参照する。最良修飾効果はPEG修飾とリポソーム修飾である（図４参照）。
【００６８】
１０.動物体内抗腫瘍実験
培養したB16F10悪性黒色腫細胞を0.05％のトリプシンで消化し、1000rpm 5分遠心分離し、PBSに再浮遊させる。C57BL/6マウス(6-8週)の外側皮下に5ｘ10５細胞0.1mlを接種する。腫瘍の平均体積が200mm３-300mm３に達した際、マウスをランダムに組を分け、一組7匹にする。中の一組はRGD-ED治療を受け、もう一組はRGD-EDの含まない治療を受ける。上記二組の線量は皆5mg/kg/dであり、対照しながらPBSを注射する。治療は腫瘍接種の反対側に皮下注射方法を用いる。毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定して腫瘍の体積を計算する。使用公式は腫瘍体積＝長さ×幅２×0.52で、治療効果は限定時間内腫瘍の抑制率で表現、即ち、（1-T/C）×100%で、T=治療組の腫瘍体積、C＝対照組の腫瘍体積。
【００６９】
図３の示した通り、九日目に、RGD-EDの腫瘍抑制率は58％で、RGD配列のないポリペプチドＥＤの腫瘍抑制率は28％である。上記実験から本発明設計の高性能血管生成抑制剤は大幅にマウス体内の腫瘍成長を抑制できることが分かった。
【００７０】
培養した人肝細胞癌SGC7901を0.05％のトリプシンで消化し、 1000rpm 5分遠心分離し、再度PBSに浮遊させ、6-8週間の裸マウスの外側皮下に5×10５細胞0.1mlを接種する。腫瘍の平均体積が100mm３-200mm３に達した際、マウスをランダムに組を分け、一組7匹にする。中の一組はRGD-ED治療を受け、もう一組はリポソーム修飾のRGD-EDで治療し、あとの一組はポリエチレングリコール修飾のRGD-EDで治療する。上記三組の線量は皆3mg/kg/dであり、対照しながらPBSを注射する。治療は腫瘍接種の反対側に皮下注射方法を用いる。毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定して腫瘍の体積を計算する。使用公式は腫瘍体積＝長さ×幅２ｘ0.52で、治療効果は限定時間内腫瘍の抑制率で表現、即ち、（1-T/C）×100% で、T=治療組の腫瘍体積、C＝対照組の腫瘍体積。
【００７１】
図４に示すように、十日目に、RGD-EDの腫瘍抑制率は68％で、リポソーム修飾のRGD-EDの腫瘍抑制率は72％で、ポリエチレングリコール修飾のRGD-EDの腫瘍抑制率は78％である。上記実験から本発明設計の修飾方法で取得した修飾生成物は大幅にマウス体内の腫瘍成長を抑制できることが分かった。
【００７２】
実施例２は基本的に実施例1と同様であるが、下記変化がある。
プライマー２コーデイングするXhoI部位に有する遺伝子配列Arg-Gly-AspはArg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly配列に変わる。増幅して Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp
の遺伝子配列を得て、クローニングする。
【００７３】
実施例３は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-の遺伝子配列をクローニングする。
【００７４】
実施例４は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-の遺伝子配列をクローニングする。
【００７５】
実施例５は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列をクローニングする。
【００７６】
実施例６は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列をクローニングする。
【００７７】
実施例７は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列をクローニングする。
【００７８】
実施例８は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp遺伝子配列をクローニングする。
【００７９】
実施例９は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの遺伝子配列をクローニングする。
【００８０】
実施例１０は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの遺伝子配列をクローニングする。
【００８１】
実施例１１は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cysの遺伝子配列を得てクローニングする。
【００８２】
実施例１２は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro- Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cysの遺伝子配列をクローニングする。
【００８３】
実施例１３、ポリペプチドのPEG修飾
【００８４】
１３.１ Ｎ末端アミノアシル化修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約20−50％にして、約20−95重量％のポリエチレングリコールSC-mPEG (メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート、平均分子量5000)又はSS-PEG（スクシンイミジルスクシネート）又はPEG-イソシアン酸エステル（PEG-Isocyanate）の溶液と混合する。約50−93重量％の上記修飾物を取って充分混合し、4℃―40℃の間、最適25℃―37℃のシェーカーで10分以上振とう反応させ、イオン交換クロマトグラフィーでＮ末端修飾される生成物を分離する。
【００８５】
１３.２ カルボキシル基末端修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約20−50％にして、約20−95重量％のmPEG-NH2(平均分子量5000)、少量のDCCI（ジシクロヘキシルカルボジイミド）溶液と混合する。最適約50−93重量％の上記修飾物を充分混合し、4℃―40℃の間、最適22℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適90分。カルボキシル基はmPEG-NH2の中のアミノ基と結合してアミド結合を形成し、RP-HPLC分離でＮ末端の修飾される生成物が得られる。
【００８６】
１３.３ スルフヒドリル基末端修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約1−30重量％にして、約20−95重量％のmPEG-MAL(mPEG-マレアミド、平均分子量5000)の溶液と混合する。最適約70−94％の上記修飾物を充分混合し、4℃―40℃の間、最適20℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適60分。イオン交換分離でＮ末端の修飾される生成物を得る。
【００８７】
１３.４ 動物体内抗腫瘍実験
培養した人肝細胞癌SGC7901を0.05％のトリプシンで消化し、1000rpmで5分遠心分離してPBSに再浮遊させ、6-8週間の裸マウスの外側皮下に5×10５細胞0.1mlを接種する。腫瘍の平均体積が100mm３-200mm３に達した時、マウスをランダムに組を分け、一組7匹にする。うち、一組はRGD-ED治療を受け、もう一組はリポソーム修飾のRGD-EDで治療し、あとの一組はポリエチレングリコール修飾のRGD-EDで治療する。上記三組の線量は皆3mg/kg/dであり、対照しながらPBSを注射する。治療は腫瘍接種の反対側に皮下注射方法を用いる。毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定して腫瘍の体積を計算する。使用公式は腫瘍体積＝長さ×幅２×0.52で、治療効果は限定時間内腫瘍の抑制率で表現、即ち、（1-T/C）×100% で、T=治療組の腫瘍体積、C＝対照組の腫瘍体積。
【００８８】
図４の示した通り、結果として、十日目に、RGD-EDの腫瘍抑制率は68％で、リポソーム修飾のRGD-EDの腫瘍抑制率は72％で、ポリエチレングリコール修飾のRGD-EDの腫瘍抑制率は78％である。上記実験から本発明設計の修飾方法で取得した修飾生成物は大幅にマウス体内の腫瘍成長を抑制できることが分かった。
【００８９】
実施例１４、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。ヘパリン修飾を使用する。
約10−90重量％のポリペプチドを最適約25−50重量％にして、約10−90重量％の活性化低分子量ヘパリンと混合し、最適約43−75重量％。pH＝7-9の緩衝液に4℃、18時間以上軽く振とう反応させ、イオン交換クロマトグラフィーで遊離アノミ基の修飾される生成物を分離する。
【００９０】
実施例１５、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。ポリエチレングリコール-ポリ乳酸共重合体(PEG-PLA)修飾を使用する。
80mg−120mgのPEG-PLA と15mg-30mgのポリペプチドを取り、40mlのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解して混合物をMWCO 3500の透析袋に移す。3L−4Lの蒸留水に48時間透析し、遠心分離して沈澱を取り除く。上清を0.45μｍで膜濾過してポリマーのミセル溶液を得る。
【００９１】
実施例１６、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。デキストラン修飾を使用する。
1gのデキストラン（分子量35000）を取って活性化させ、10mg−60mgのポリペプチドを入れる。最適20mg−45mg。4℃のシエーカーで15時間以上ゆっくりと振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
【００９２】
実施例１７、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。パルミチン酸修飾を使用する。
約5−90重量％のポリペプチドを最適約25−60重量％にして、約10−95重量％の活性化パルミチン酸と混合する。最適約43−90重量％、4℃―40℃の間、最適25℃−37℃のシエーカーで30分以上振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
【００９３】
実施例１８、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。ポリシアル酸修飾を使用する。
約１−90重量％のポリペプチドを最適約７−50重量％にして、約10−95重量％の活性化ポリシアル酸と混合する。最適約50％−93重量％、4℃―40℃の間、最適25℃−37℃のシエーカーで15時間以上振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
【００９４】
実施例１９、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。リポソーム修飾を使用する。中にはリポソーム（REV）、乾燥したリポソーム（DRV）及び多重ラメラリポソーム（Mvl）が含まれる。
【００９５】
一定比例の大豆リン脂質とコレステロールを取ってクロロホルムに溶かし、35℃ー45℃で減圧蒸発によって薄膜にする。更にこれを無水エーテルに溶かしておく。6mg−10mgのポリペプチドを測りとって6mlpH6-8のリン酸緩衝液に溶かす。この緩衝液をリン脂質液と混合して４min-9min超音波振動し、20℃―30℃で減圧蒸発によって有機溶剤を取り除く。60℃で真空乾燥した後、リン酸緩衝液を入れて４h浸漬してリポソーム懸濁液を得る。この懸濁液を高圧均質機で数回循環させ、リポソームを得る。
【００９６】
実施例２０、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。ナノ薬物の製造を用いて、中にはポリ乳酸（PLA）ナノ、ポリブチルシアノアクリレート（PBCA）ナノ微粒子とキトサンナノ微粒子の製造が含まれる。
10mg-50mgのキトサンを取って20ml-40mlの水と混合し、20-40分超音波して微粒子分散液を獲得する。3.5mg-6mgのポリペプチドを入れて2ml-5mlの無水メタナールに溶解し、超音波の過程においてゆっくりと微粒子分散液に滴加してポリペプチドを封じておく。遠心分離でナノ微粒子を得る。
【００９７】
実施例２１、細胞流量計測器でポリペプチドとインテグリンとの結合状況を分析し、Bel-7402腫瘍細胞を用い、この細胞はインテグリンを発現する。24穴プレートにて細胞培養し、細胞収集する。冷たいPBSで2回洗滌する。標記される前、細胞をPBS+1%BSAに再浮遊させて30分キープする。1μl FITC標記のポリペプチド(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P16、RGD and ES-2)25分反応させる。標記後、細胞収集する。PBSにて2回細胞を洗滌して400μl lPBSに再浮遊させる。細胞流量計測器で分析し（Becton Dickinson、USA）、FITC蛍光はFL1 channelにて測定される。FITC特徴を有する細胞に対しより詳細な分析を行う。その結果から変換後RGD配列を含むポリペプチドは特異的に発現インテグリンの腫瘍細胞を結合することができるのが分かる（表１）。
【００９８】
【表１】
【００９９】
実施例22、37℃プラズマの中に於ける修飾後ポリペプチド半減期を考査、薬剤血液サンプル製造:体積(V)の原薬(800ug/m1)+1Vのプラズマ+2Vの水で希釈し、均一に混ぜ、37℃でそれぞれ0、5、30分孵化後、 即-80℃の中30分加熱する。陰性対照は１Vのプラズマ+3Vの水で希釈し、均一に混ぜてから80℃の中 30分加熱する。陽性対照は１Vの原薬(800ug/m1)+3Vの水で希釈し、均一に混ぜてから80℃の中 30分加熱する。各サンプルは修飾後の生成物で、加熱後、14000rpm、10分で、上清を採取、HPLCを行い、サンプル体積は皆20μ1である。結果では、修飾後ポリペプチドの半減期が著しく増大された（表2)。
【０１００】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物工学の製薬技術分野又は蛋白質ポリペプチト類の薬物分野に属しており、具体的には血管生成抑制剤、並びにその製造方法、修飾方法及び血管新生抑制剤よりなる抗腫瘍薬の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍血管生成抑制剤は近年腫瘍治療において重要視されている薬物の一つであり、この面での研究がすでにある程度の進展をみせており、今後新しい腫瘍治療薬物の一つとして期待される。がん新生血管形成の概念は1947年にAlgurezaによって提出されたもので、成長中腫瘍の重要な特徴の一つとしては、宿主から新しい毛細管内皮細胞の形成を引き出すことができる、と同氏が指摘した。1971年にFolkmanは仮説を提起し、つまり、腫瘍の生成と転移が新しい血管の生成に依存しており、実体腫瘍の早期において腫瘍血管の分泌から因子を生成し、宿主毛細血管の増生を刺激する。新生血管は腫瘍に必要な栄養と酸素を提供して代謝物を排除するだけではなく、遠距離転移の経路にもなっている（Folkman,J.,J.Natl.Cancer Inst.1990;82:4-6)。従って、新生血管形成の可能性を遮断するのが腫瘍の生成と転移を阻止する手段となり、これを基に血管生成促進分子と血管生成抑制分子に対する盛んな研究を引き起こしている。これらの血管抑制剤の中では、特にアンジオスタチン（angiostatin）とエンドスタチン(endostatin)がもっとも注目され、両者ともアメリカでの臨床試験に入っている。これらの血管生成抑制剤が非常に魅力的な展望を呈しているが、その欠陥も明らかなものである。今までの血管生成薬物、例えばエンドスタチン、アンジオスタチンなどは作用する標的が不明確で、血管の専一性と選択性はあまり良くなく、その効果が限られている。そのため、実験での使用量はかなり高いものとなる。マウスによる動物模型実験の際、アンジオスタチンの用量は数百ｍｇ／ｋｇ体重にも達し、エンドスタチンは数十ｍｇ／ｋｇ体重になる。これらの血管生成抑制剤が人体に使用される時、使用量は少なくとも数クラム／人の用量となる。このような大きな薬物使用量は、この種の薬物の毒副作用発生の可能性を増加し、そこからこの種の薬物の品質へのコントロールが難しくなり、製造規模と製造コストが増大し、薬物の価格も高いものとなる。
【０００３】
従って、良い抗血管生成薬物としては新生血管の標的分子に対して選択性を持つべきで、これによって新生血管に対してその指向作用を持ち、総体的に血管生成に対する薬物の抑制作用を高める。これによって低用量の薬物を使用するだけで、高活性の血管生成抑制の効果をもたらしてくる。
【０００４】
インテグリンはαサブユニットとβサブユニットからなる膜貫通タンパク質ヘテロであり、研究結果によれば、腫瘍細胞表面のインテグリンは腫瘍転移発生の所在である。これらのインテグリンは細胞内の細胞骨格タンパク質と細胞外マトリックス分子とを接続する相互作用で細胞の遷移、分化及び増殖をコントロールする（Schoenwaelder SM, Curr Opin Cell Biol,1999;274-286）。20数種類のサブユニットの中の大多数はRGD(アルギニンーグリシンーアスパラギン酸)配列を含む細胞外マトリックスの配位子（Dennis MSなど, Proc Natl Acad Sci 1990; 87: 2471-2475）を識別でき、RGD配列を含むポリペプチトがインテグリン拮抗薬の作用を持つ。それが細胞接着分子の表面発現を減少し、細胞のシグナル伝達を調節することができ、腫瘍治療において幅広く応用できる。
【０００５】
物理的化学修飾はポリペプチド又はタンパク質が治療や生物技術方面での効力を高める重要なプロセスである。修飾物が適当な方式でタンパク質やポリペプチトに接続するか、若しくはタンパク質ポリペプチドに対して修飾する時、さまざまな特徴を変えることができるが、その主なバイオアクテイブ係数、例えば、酵素活性又は特定の結合部位が残存する。物理的化学修飾は下記いくつかの方法で薬物の性能を改善する。まず、修飾物がタンパク質やポリペプチドの表面への接続により、その分子の大きさを増やすだけでなく、水の分子を大量に運ぶことができるので、一種の修飾物―タンパク質は５〜10倍も増大する。それに、物理的化学修飾は以前溶けないタンパク質を簡単に溶かし、高度な移動性を持たせる。そのほか、タンパク質ポリペプチドへの修飾は腎臓の薬物への濾過作用を減少し、その内因性発熱物質の機能を下げ、またプロテアーゼの消化を減らすこともできる。人の免疫システムの攻撃から分子を保護することにより、その供給を改善する。同時に人の防御システムから逃げたため、作用部位に留まる時間がかなり長くなり、局部薬物の濃度を高めるのである。現在のところ、国際市場に出ているPEG‐ポリペプチド(又はPEG-タンパク質)製品はすでにいくつかの品種がある。世界でナンバーワンの生物技術会社Amgen社開発の新しい薬SD/01がPEG使用で修飾した顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）であり、Amgen社の早期製品G-CSFの持効性型である。G-CSF1999年の売り上げは12.2億ドルで、2000年は12.6億ドルである。そこから修飾タンパク質ポリペプチド製品の市場は非常に大きいことが分かる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在のところの発現によれば、あるコーデイングの血管生成抑制剤のオリゴペプチドは血管生成抑制と抗腫瘍の効果を有し、本研究は血管生成抑制のオリゴペプチドの両端にアルギニン‐グリシン‐アスパラキン酸を含む異なる配列を加え、インテグリンに対して結合作用と親和性を有する血管生成抑制剤を構築するのである。
【０００７】
本発明の目的は、インテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤を提供することで、本発明の高性能血管生成抑制剤が合成可能である。本発明の第二の目的は、上述した「インテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤」の製造方法を提供することである。上述したポリペプチドは合成又はPCRの増幅によって目標遺伝子を獲得でき、原核生物の発現ベクター又は真核生物の発現ベクターにクローニングして、遺伝子工程手段で生成物を獲得するのである。本発明の第三の目的は、上述した「インテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤」の物理的化学修飾方法を提供することである。つまりさまざまな修飾方法で血管生成抑制ポリペプチドを修飾し、ポリエチレングリコール修飾、ヘパリン修飾、デキストラン修飾、ポリビニルピロリトン修飾、ポリエチレングリコール‐ポリアミノ酸共重合体修飾、パルミチン酸修飾、ポリシアル酸修飾、リポソームとナノテクノロジー修飾を含めて、複数の修飾生成物を獲得した。本発明の第四の目的は、上述した「インテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤」及びその修飾生成物の応用を提供することである。すなわちインテグリンに親和性又は結合力を有する高性能血管生成抑制剤とその修飾生成物が抗腫瘍薬の製造における応用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述一番目の発明課題を解決するための技術案としては、
血管生成抑制ポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(ES-2と称す)の両端に、少なくともその一端にインテグリンファミリーに親和性又は結合力を有するポリペプチドが接続してあり、前記した「インテグリンファミリーに親和性又は結合力を有するポリペプチド」とは、Arg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linkerを含む配列を指し、上述したリンカー（Linker）及び本出願すべてのリンカーは、一つか又は複数の異なるアミノ酸のことを指すのである。
【０００９】
前記したArg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linkerを含むポリぺプチド配列は下記配列より、選び出している。
【００１０】
Arg-Gly-Asp-linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(P1)、
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (P2)、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-linker-Arg-Gly-Asp(P3)、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp (P4)、 Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro- Arg-Gly-Asp(P5)、 Arg-Gly-Asp-Linker -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker -Arg-Gly-Asp(P6)、
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker- Arg-Gly-Asp(P7)、又は Arg-Gly-Asp-Linker -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp (P8)。
【００１１】
上述技術案のさらなる改善にあたり、前記したArg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linkerを含むポリぺプチド配列のかわりに、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg -Cly-Asp-Cys-Phs-Cys又は
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg -Cly-Asp-Cys-Phs-Cys-Linker含む配列を用いても良い。
【００１２】
前記したAla-Cys-Asp-Cys-Arg -Cly-Asp-Cys-Phs-Cys又は
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg -Cly-Asp-Cys-Phs-Cys-Linkerを含む配列は、下記ポリペプチド配列より選び出している。
【００１３】
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (P9)、
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (P10)、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P11 )、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P12 )、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys(P13)、 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro -Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P14 )、
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P15)、 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys ( P16 )。
【００１４】
このような形式の接続は血管生成抑制のポリペプチド
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの標的性を高めることができる(表１参照)。
【００１５】
本発明の上記二種類の形式とも別々さらなる改善が可能であり、下記最適化手法が得られる。
【００１６】
最適化手法１、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は化学合成の方法で形成可能である。
【００１７】
最適化手法２、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記方式の一つである遺伝子工学の方法を用いて形成できる。
【００１８】
２−１、Arg-Gly-Aspインテグリン結合配列ペプチドを含む血管生成抑制剤遺伝子配列を合成し、この配列をテンプレートにし、上流・下流プライマーを設計し、プライマー配列の５’末端と３’末端にクローニングに適切する制限酵素切断部位を付加し、PCR増幅し、RGD-ED遺伝子を獲得する。遺伝子をベクターにクローニングし、陽性クローンをスクリーニングし、ヌクレオチド配列の解析を行う。
【００１９】
２−２、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。RGD-ED遺伝子は原核生物発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、大腸菌に転化させ、 IPTGで発現RGD-EDを誘導し、発現生成物は封入体として存在する。
【００２０】
２−３、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００２１】
封入体のタンパク分離、溶解、活性再生を行い、更にイオン交換クロマトグラフィーでRGD-EDタンパク生成物を分離・純化し、フロースルーを収集し、凍結乾燥する。
【００２２】
２−４、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記方式の遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００２３】
本発明中のすべてのRGD−ED遺伝子に対し、真核生物の発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、真核細胞に転化させ、発現RGD-EDを誘導し、発現生成物を分離・純化する。
【００２４】
最適化手法３、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーディングする塩基配列に対して修飾することができ、生体内での半減期を高め、その標的性を高めるのである。
【００２５】
３、前記のインテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドは、ポリエチレングリコール又はヘパリン又はデキストラン又はポリビニルピロリトン又はポリエチレングリコール‐ポリアミノ酸共重合体又はパルミチン酸又はポリシアル酸又はリポソームとナノテクノロジーなどで修飾した後のポリペプチド生成物である。
【００２６】
本発明の二番目の任務を完成させた方案は、インテグリンに親和性と結合力を有する
高性能血管生成抑制剤の製造方法であり、そのステップは以下の通りである。
【００２７】
血管生成抑制ポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの両端に、少なくともその一端はインテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドが接続され、前記の「インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチド」は、Arg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linker又はAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys又は
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linkerを含む配列であり、その中の-Linkerは一つ又は複数の異なるアミノ酸である。
【００２８】
上述製造方法のさらなる限定については、下記具体的製造方法がある。
【００２９】
１.前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は固体と液体の化学合成方法を用いて形成する。
【００３０】
２.前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記方式の一つである遺伝子工学の方式を用いて形成する。
【００３１】
２−１、Arg-Gly-Aspインテグリン結合配列ペプチドを含む血管生成抑制剤遺伝子配列を合成し、この配列をテンプレートにし、上流・下流プライマーを設計し、プライマー配列の５’末端と３’末端にクローニングに適切する制限酵素切断部位を付加し、PCR増幅し、RGD-ED遺伝子を獲得する。遺伝子をベクターにクローニングし、陽性クローンをスクリーニングし、ヌクレオチド配列の解析を行う。
【００３２】
２−２、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００３３】
RGD-ED遺伝子は原核生物発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、大腸菌に転化させ、 IPTGで発現RGD-EDを誘導する。
【００３４】
２−３、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００３５】
封入体のタンパク分離、溶解、活性再生を行い、更にイオン交換クロマトグラフィーでRGD-EDタンパク生成物を分離・純化し、フロースルーを収集し、凍結乾燥する。
【００３６】
２−４、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列は下記遺伝子工学の方法を用いて形成している。
【００３７】
本発明中のすべてのRGD−ED遺伝子に対し、真核生物の発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、真核細胞に転化させ、発現RGD-EDを誘導し、発現生成物を分離・純化する。
【００３８】
本発明三番目の発明任務を完成させる方案は、前記のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーデイングする塩基配列に対して修飾する方法であり、以下のステップの一つを用いる。
【００３９】
１.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対し、ポリエチレングリコール（PEG）修飾
を行い、用いられたPEG分子量範囲が直鎖状（相対分子量が2000-30000Dα）又は分枝状（相対分子量が40000-60000Dα）であり、その中には、(1)PEG-ビニルスルホン酸（PEG-Vinylsulphone）と、(2)PEG-ヨードアセトアミド（PEG-Iodoacetamide）と、(3)PEG-マレアミド（PEG- Maleimide）と、(4)PEG-オルトピリジンジスルフィド
（PEG-Orthopyridyldisulfide）と、(5)SC-mPEG(メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート)と、又はSS-PEG（スクシンイミジルスクシネート）又はPEG-イソシアン酸エステル（PEG-lsocyanate）(7)(8)と、(6) メトキシ化PEGプロピオンアルデヒド（mPEG-ALD）が含まれる。
【００４０】
２.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してヘパリン修飾をする。
【００４１】
３.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してデキストラン修飾をする。
【００４２】
４.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してポリビニルピロリドン（PVP）修飾をする。
【００４３】
５.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してポリエチレングリコールーポリアミノ酸共重合体に対して修飾をする。
【００４４】
６.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してパルミチン酸（palmitic acid）修飾をする。
【００４５】
７.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してポリシアル酸（colominic acid）修飾をする。
【００４６】
８.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してリポソーム修飾をする。その内、リポソーム（REV）、乾燥したリポソーム（DRV）及び多重ラメラリポソーム（Mｖｌ）を含める。
【００４７】
９.本発明中のすべてのポリペプチド配列に対してナノテクノロジー修飾をする。
【００４８】
本発明四番目の任務を完成させた方案は、上述した「インテグリンに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤」が抗腫瘍薬物の製造における応用である。
【００４９】
前記の抗腫瘍薬物の製造における応用とは、本発明中のすべてのナノ配列に対する
ナノ薬物製造が含み、ポリ乳酸（PLA）ナノ粒子やナノ微粒子、又はポリ----ーシアノアクリレートブチル（PBCA）ナノ粒子やナノ微粒子、又はキトサンナノ粒子やナノ微粒子の製造が含まれる。
【００５０】
血管内皮細胞増殖実験、鶏胚絨毛尿膜（CAM）分析、マウス体内の抗腫瘍実験を通して腫瘍細胞との結合状況を分析する。本発明生成物が体内外実験において大幅に既成血管生成抑制剤の内皮細胞成長と抗腫瘍効果を改善し、向上させることができ、又、使用量が少ないため、コスト・ダウンが実現した。本発明の設計した効率な血管生成抑制剤が科学的で、合理的で、有効的なものであることが分かり、腫瘍治療の薬物とすることができる。
本発明の有益な効果は下記の通りである。
【００５１】
本発明で述べた高性能血管生成抑制のポリペプチド及びその物理的化学修飾の生成物が人類新生血管生成に関わる病気、即ち実体腫瘍の薬物として製造できるのである。
【００５２】
その生成物は同類の製品に比べ、効率的で、特異的に内皮細胞増殖抑制と抗腫瘍効果を有し、しかも使用量が少ないため、相対的に薬物治療の副作用を減少した。
【００５３】
本発明はポリペプチドに対してさまざまな修飾をした。これらの修飾は本発明中のポリペプチドの半減期（T1/2）を延長させ、安定性を強め、免役原性と抗原を下げ、分子構造を変えることから薬物動態と薬理学の性質を改善し、作用部位の薬剤血液濃度を高める。同時に、修飾をしていないポリペプチドよりもっと良い耐性を現し、将来の臨床応用範囲と治療効果を増やした。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１はHPLC純化 RGD-ED分析結果
【図２】図２は鶏胚絨毛尿膜（CAM）分析RGD-ED新生血管生成抑制：Ａ、空白対照、Ｂ、Ｃ、Ｄそれぞれ0.05μｇ、0.1μｇと0.2μｇの治療群
【図３】図３はRGD-ED体内腫瘍抑制効果
【図４】図４はポリエチレングリコール（PEG）とリポソームのポリペプチド修飾で体内腫瘍抑制の効果：1、2、3はそれぞれ修飾前のRGD-ED、リポソーム修飾後とポリエチレングリコール修飾後のRGD-ED体内肝臓がん抑制の作用効果
【発明を実施するための形態】
【００５５】
１．RGD-ED遺伝子のクローン及びその原核生物発現ベクターの構築
合成コーデイングされたRGD-EDポリペプチド配列の塩基をテンプレートにする。上流・下流プライマーを設計して、その中、上流プライマーにNdeI酵素切断部位を加え、下流プライマにはArg-Gly-Asp配列とXhoI部位を有する。PCR増幅し、増幅生成物がアガロースゲル電気泳動回収と純化を経て、NdeIとXhoI制限酵素切断を行い、原核生物の発現ベクターpwにクローニングし、PCR陽性クローンをスクリーニングする。ヌクレオチド配列の分析でその配列に設計上著しい変化が発生したのを確認した。
合成のプライマー1：5’GGAATTCCATATG ATCGTGCGCCGTGCCGACCGC3’
合成のプライマー2：5’CCGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCA3’
うち、プライマー1はNdeI部位とIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro
の一部の配列をコーデイングする。プライマー2はXhoI部位とArg-Gly-Asp配列を有する遺伝子をコーデイングした。
【００５６】
２．本発明の血管生成抑制剤RGD-EDの実際効果を比較するため、本実例においてわれわれは製造会社にArg-Gly-Asp配列を含まないポリペプチドの合成依頼を同時にした。
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro（ED）。
【００５７】
３.組み換え細胞の誘導発現
発現型プラスミドを大腸菌に転換させ、組み換え菌が1mMIPTG誘発3時間後細胞を採取し、超音波破砕し、上清と沈澱に遠心分離し、15％SDS-PAGEの電気泳動、クマシーブリリアンドブルー染色のSDS-PAGEスキャン（UVP White/Ultraviolet transilluminator）を行い、その発現結果を分析する。
【００５８】
４．封入体の分離、溶解と活性再生
超音波破砕と遠心分離をし、封入体沈澱を0.1Mtrisとデオキシコール酸ナトリウムにて洗滌して、沈澱をラウリルサルコシン酸ナトリウム（SLS）に溶解する。4℃、10000rpm にて5min遠心分離し、上清液4℃にて透析する。透析液はbufferA(10mM Tris-HCI、0.1mM酸化型グルタチオンと1mM還元型グルタチオン、pH7.4)である。6−8hで一回液体を取り替え、計三回取り替える。最後に一回透析をする。透析液はbuffer B（10mM Tris-HCI、pH7.4）である。サンプルに対して直接SP-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)-クロマトグラフィーを行う。カラムへの平衡洗滌はbuffer Bを使い、0.6M NaCI、 Tris-HCI、 pH7.4と1M NaCI、Tris-HCI、pH7.4 を使って順番で溶出する。溶出液を混合させ、buffer B透析後、冷凍乾燥して濃縮させる。クロマトグラフィーの結果は図１の示した通りである。
【００５９】
５．内皮細胞増殖分析
BCE細胞とNIH 3T3細胞を培養する。その方法：培養液DMEMに10％の不活化牛胎児血清(BCS)、1％の抗生物質及び３ng/ml bFGFが含まれる。細胞増殖分析方法は下記の通りである。PBSにて細胞を洗滌してトリプシンを消化する。浮遊細胞培養液を加え、遠心分離して細胞を採取する。細胞の濃度を25,000 cells/mlに調整する。細胞を６オリフィス（0.5ml/well）に移入して24ｈ培養し、培養液を１ml DMEMに交換する。5％BCS、1%抗生物質、１ng/ml bFGF、各ホールに異なる投与量を入れてさらに48ｈ培養する。トリプシンにて細胞を消化してPBSに再浮遊させる。70％の冷たいエタメールにて30min 固定させ、7-AAD染色する。細胞流量計測器で分析を行う。
【００６０】
その結果によれば、RGD-EDの組換えによって特異的に内皮細胞―BCE細胞の増殖を抑制することができるが、非内皮細胞―NIH 3T3に対しては抑制作用を持っていない。BCE増殖抑制のED50は約0.1μg/mlであるのに対し、RGD配列のないポリペプチドED50は、約0.8μg/mlであり、内皮抑素のED50は約0.5μg/mlである。上記実験で本発明の設計した高性能血管生成抑制剤は既成の血管生成の生物活性を著しく高めたことを明らかにした。
【００６１】
６．鶏胚絨毛尿膜（CAM）分析
体内の抗血管生成活性を測定するため、CAM分析をする。すべての実験がクリーンベンチに無菌操作で行われる。消毒した六日間の鶏胚を37℃、90％湿度の条件下で培養する。二日間後、各卵の上部に穴を開けて試薬を滅菌のWhatman濾紙に滴加し、CAMsの血管集中部位に入れる。48時間培養した後、鶏胚とCAMsを観察して写真を撮る。
図２の示したように、RGD-ED体内抗新生血管生成活性を評価するため、用量の異なるRGD-EDを使ってCAM実験を行った。うち、0.05μg、0.1μg と0.2μgのRGD-EDが明らかに新生血管と血管生成を抑制できるのである。0.5μgRGD-EDは完全に血管生成を抑制でき、鶏胚の死亡に至るのである。RGD-EDは血管生成抑制の潜在的作用を有する。
【００６２】
７.本発明のポリペプチドは固体又は液体の方法で人工合成可能である。
【００６３】
８.ポリペプチドのPEG修飾。
【００６４】
８.１ Ｎ末端アミノアシラーゼ修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約20−50％にして、約20−95重量％のポリエチレングリコールSC-mPEG (メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート、平均分子量5000)又はSS-PEG（スクシンイミジルスクシネート）又はPEG-イソシアン酸塩（PEG-lsocyanate）の溶液と混合する。約50−93重量％の上記修飾物を取って充分混合し、4℃−40℃の間、最適25℃−37℃のシェーカーで10分以上振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーでＮ末端修飾される生成物を分離する。
【００６５】
８.２ カルボキシ末端修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約20−50％にして、約20−95重量％のmPEG-NH2(平均分子量5000)、少量のDCCI（ジシクロヘキシルカルボジイミド）溶液と混合する。最適約50−93重量％の上記修飾物を充分混合し、4℃−40℃の間、最適23℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適90分、カルボキシがmPEG-NH2の中のアミノ酸と結合してアミドを形成する。RP-HPLC分離でＮ末端の修飾される生成物を得る。
【００６６】
８.３ スルビドリル末端修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約1−30％にして、約20−95重量％のmPEG-MAL(mPEG-マレイミド、平均分子量5000)溶液と混合する。最適約70−94％の上記修飾物を充分混合し、4℃−40℃の間、最適20℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適60分、イオン交換クロマトグラフィーでＮ末端の修飾される生成物を得る。
【００６７】
９.その他の修飾方法
その他の修飾方法はすべてPEG修飾を参照する。最良修飾効果はPEG修飾とリポソーム修飾である（図４参照）。
【００６８】
１０.動物体内抗腫瘍実験
培養したB16F10悪性黒色腫細胞を0.05％のトリプシンで消化し、1000rpm 5分遠心分離し、PBSに再浮遊させる。C57BL/6マウス(6-8週)の外側皮下に5ｘ10５細胞0.1mlを接種する。腫瘍の平均体積が200mm３-300mm３に達した際、マウスをランダムに組を分け、一組7匹にする。中の一組はRGD-ED治療を受け、もう一組はRGD-EDの含まない治療を受ける。上記二組の線量は皆5mg/kg/dであり、対照しながらPBSを注射する。治療は腫瘍接種の反対側に皮下注射方法を用いる。毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定して腫瘍の体積を計算する。使用公式は腫瘍体積＝長さ×幅２×0.52で、治療効果は限定時間内腫瘍の抑制率で表現、即ち、（1-T/C）×100%で、T=治療組の腫瘍体積、C＝対照組の腫瘍体積。
【００６９】
図３の示した通り、九日目に、RGD-EDの腫瘍抑制率は58％で、RGD配列のないポリペプチドＥＤの腫瘍抑制率は28％である。上記実験から本発明設計の高性能血管生成抑制剤は大幅にマウス体内の腫瘍成長を抑制できることが分かった。
【００７０】
培養した人肝細胞癌SGC7901を0.05％のトリプシンで消化し、 1000rpm 5分遠心分離し、再度PBSに浮遊させ、6-8週間の裸マウスの外側皮下に5×10５細胞0.1mlを接種する。腫瘍の平均体積が100mm３-200mm３に達した際、マウスをランダムに組を分け、一組7匹にする。中の一組はRGD-ED治療を受け、もう一組はリポソーム修飾のRGD-EDで治療し、あとの一組はポリエチレングリコール修飾のRGD-EDで治療する。上記三組の線量は皆3mg/kg/dであり、対照しながらPBSを注射する。治療は腫瘍接種の反対側に皮下注射方法を用いる。毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定して腫瘍の体積を計算する。使用公式は腫瘍体積＝長さ×幅２ｘ0.52で、治療効果は限定時間内腫瘍の抑制率で表現、即ち、（1-T/C）×100% で、T=治療組の腫瘍体積、C＝対照組の腫瘍体積。
【００７１】
図４に示すように、十日目に、RGD-EDの腫瘍抑制率は68％で、リポソーム修飾のRGD-EDの腫瘍抑制率は72％で、ポリエチレングリコール修飾のRGD-EDの腫瘍抑制率は78％である。上記実験から本発明設計の修飾方法で取得した修飾生成物は大幅にマウス体内の腫瘍成長を抑制できることが分かった。
【００７２】
実施例２は基本的に実施例1と同様であるが、下記変化がある。
プライマー２コーデイングするXhoI部位に有する遺伝子配列Arg-Gly-AspはArg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly配列に変わる。増幅して Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp
の遺伝子配列を得て、クローニングする。
【００７３】
実施例３は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-の遺伝子配列をクローニングする。
【００７４】
実施例４は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-の遺伝子配列をクローニングする。
【００７５】
実施例５は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列をクローニングする。
【００７６】
実施例６は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列をクローニングする。
【００７７】
実施例７は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列をクローニングする。
【００７８】
実施例８は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp遺伝子配列をクローニングする。
【００７９】
実施例９は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの遺伝子配列をクローニングする。
【００８０】
実施例１０は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの遺伝子配列をクローニングする。
【００８１】
実施例１１は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cysの遺伝子配列を得てクローニングする。
【００８２】
実施例１２は基本的に実施例１と同様であるが、下記変化がある。
全体の遺伝子合成である
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro- Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cysの遺伝子配列をクローニングする。
【００８３】
実施例１３、ポリペプチドのPEG修飾
【００８４】
１３.１ Ｎ末端アミノアシル化修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約20−50％にして、約20−95重量％のポリエチレングリコールSC-mPEG (メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート、平均分子量5000)又はSS-PEG（スクシンイミジルスクシネート）又はPEG-イソシアン酸エステル（PEG-Isocyanate）の溶液と混合する。約50−93重量％の上記修飾物を取って充分混合し、4℃―40℃の間、最適25℃―37℃のシェーカーで10分以上振とう反応させ、イオン交換クロマトグラフィーでＮ末端修飾される生成物を分離する。
【００８５】
１３.２ カルボキシル基末端修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約20−50％にして、約20−95重量％のmPEG-NH2(平均分子量5000)、少量のDCCI（ジシクロヘキシルカルボジイミド）溶液と混合する。最適約50−93重量％の上記修飾物を充分混合し、4℃―40℃の間、最適22℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適90分。カルボキシル基はmPEG-NH2の中のアミノ基と結合してアミド結合を形成し、RP-HPLC分離でＮ末端の修飾される生成物が得られる。
【００８６】
１３.３ スルフヒドリル基末端修飾
約1−70重量％のポリペプチドを最適約1−30重量％にして、約20−95重量％のmPEG-MAL(mPEG-マレアミド、平均分子量5000)の溶液と混合する。最適約70−94％の上記修飾物を充分混合し、4℃―40℃の間、最適20℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適60分。イオン交換分離でＮ末端の修飾される生成物を得る。
【００８７】
１３.４ 動物体内抗腫瘍実験
培養した人肝細胞癌SGC7901を0.05％のトリプシンで消化し、1000rpmで5分遠心分離してPBSに再浮遊させ、6-8週間の裸マウスの外側皮下に5×10５細胞0.1mlを接種する。腫瘍の平均体積が100mm３-200mm３に達した時、マウスをランダムに組を分け、一組7匹にする。うち、一組はRGD-ED治療を受け、もう一組はリポソーム修飾のRGD-EDで治療し、あとの一組はポリエチレングリコール修飾のRGD-EDで治療する。上記三組の線量は皆3mg/kg/dであり、対照しながらPBSを注射する。治療は腫瘍接種の反対側に皮下注射方法を用いる。毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定して腫瘍の体積を計算する。使用公式は腫瘍体積＝長さ×幅２×0.52で、治療効果は限定時間内腫瘍の抑制率で表現、即ち、（1-T/C）×100% で、T=治療組の腫瘍体積、C＝対照組の腫瘍体積。
【００８８】
図４の示した通り、結果として、十日目に、RGD-EDの腫瘍抑制率は68％で、リポソーム修飾のRGD-EDの腫瘍抑制率は72％で、ポリエチレングリコール修飾のRGD-EDの腫瘍抑制率は78％である。上記実験から本発明設計の修飾方法で取得した修飾生成物は大幅にマウス体内の腫瘍成長を抑制できることが分かった。
【００８９】
実施例１４、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。ヘパリン修飾を使用する。
約10−90重量％のポリペプチドを最適約25−50重量％にして、約10−90重量％の活性化低分子量ヘパリンと混合し、最適約43−75重量％。pH＝7-9の緩衝液に4℃、18時間以上軽く振とう反応させ、イオン交換クロマトグラフィーで遊離アノミ基の修飾される生成物を分離する。
【００９０】
実施例１５、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。ポリエチレングリコール-ポリ乳酸共重合体(PEG-PLA)修飾を使用する。
80mg−120mgのPEG-PLA と15mg-30mgのポリペプチドを取り、40mlのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解して混合物をMWCO 3500の透析袋に移す。3L−4Lの蒸留水に48時間透析し、遠心分離して沈澱を取り除く。上清を0.45μｍで膜濾過してポリマーのミセル溶液を得る。
【００９１】
実施例１６、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。デキストラン修飾を使用する。
1gのデキストラン（分子量35000）を取って活性化させ、10mg−60mgのポリペプチドを入れる。最適20mg−45mg。4℃のシエーカーで15時間以上ゆっくりと振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
【００９２】
実施例１７、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。パルミチン酸修飾を使用する。
約5−90重量％のポリペプチドを最適約25−60重量％にして、約10−95重量％の活性化パルミチン酸と混合する。最適約43−90重量％、4℃―40℃の間、最適25℃−37℃のシエーカーで30分以上振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
【００９３】
実施例１８、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。ポリシアル酸修飾を使用する。
約１−90重量％のポリペプチドを最適約７−50重量％にして、約10−95重量％の活性化ポリシアル酸と混合する。最適約50％−93重量％、4℃―40℃の間、最適25℃−37℃のシエーカーで15時間以上振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
【００９４】
実施例１９、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。リポソーム修飾を使用する。中にはリポソーム（REV）、乾燥したリポソーム（DRV）及び多重ラメラリポソーム（Mvl）が含まれる。
【００９５】
一定比例の大豆リン脂質とコレステロールを取ってクロロホルムに溶かし、35℃ー45℃で減圧蒸発によって薄膜にする。更にこれを無水エーテルに溶かしておく。6mg−10mgのポリペプチドを測りとって6mlpH6-8のリン酸緩衝液に溶かす。この緩衝液をリン脂質液と混合して４min-9min超音波振動し、20℃―30℃で減圧蒸発によって有機溶剤を取り除く。60℃で真空乾燥した後、リン酸緩衝液を入れて４h浸漬してリポソーム懸濁液を得る。この懸濁液を高圧均質機で数回循環させ、リポソームを得る。
【００９６】
実施例２０、基本的に実施例１３と同様であるが、下記変化がある。ナノ薬物の製造を用いて、中にはポリ乳酸（PLA）ナノ、ポリブチルシアノアクリレート（PBCA）ナノ微粒子とキトサンナノ微粒子の製造が含まれる。
10mg-50mgのキトサンを取って20ml-40mlの水と混合し、20-40分超音波して微粒子分散液を獲得する。3.5mg-6mgのポリペプチドを入れて2ml-5mlの無水メタナールに溶解し、超音波の過程においてゆっくりと微粒子分散液に滴加してポリペプチドを封じておく。遠心分離でナノ微粒子を得る。
【００９７】
実施例２１、細胞流量計測器でポリペプチドとインテグリンとの結合状況を分析し、Bel-7402腫瘍細胞を用い、この細胞はインテグリンを発現する。24穴プレートにて細胞培養し、細胞収集する。冷たいPBSで2回洗滌する。標記される前、細胞をPBS+1%BSAに再浮遊させて30分キープする。1μl FITC標記のポリペプチド(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P16、RGD and ES-2)25分反応させる。標記後、細胞収集する。PBSにて2回細胞を洗滌して400μl lPBSに再浮遊させる。細胞流量計測器で分析し（Becton Dickinson、USA）、FITC蛍光はFL1 channelにて測定される。FITC特徴を有する細胞に対しより詳細な分析を行う。その結果から変換後RGD配列を含むポリペプチドは特異的に発現インテグリンの腫瘍細胞を結合することができるのが分かる（表１）。
【００９８】
【表１】
【００９９】
実施例22、37℃プラズマの中に於ける修飾後ポリペプチド半減期を考査、薬剤血液サンプル製造:体積(V)の原薬(800ug/m1)+1Vのプラズマ+2Vの水で希釈し、均一に混ぜ、37℃でそれぞれ0、5、30分孵化後、 即-80℃の中30分加熱する。陰性対照は１Vのプラズマ+3Vの水で希釈し、均一に混ぜてから80℃の中 30分加熱する。陽性対照は１Vの原薬(800ug/m1)+3Vの水で希釈し、均一に混ぜてから80℃の中 30分加熱する。各サンプルは修飾後の生成物で、加熱後、14000rpm、10分で、上清を採取、HPLCを行い、サンプル体積は皆20μ1である。結果では、修飾後ポリペプチドの半減期が著しく増大された（表2)。
【０１００】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高性能血管生成抑制剤であって、血管生成を抑制するポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro の両端に、少なくとも一端はインテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドが接続され、前記「インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチ」はArg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-linkerの配列を含み、その中の-Linkerは一つ又は複数の異なるアミノ酸である、
ことを特徴とする高性能血管生成抑制剤。
【請求項２】
前記Arg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linkerを含むポリペプチド配列が以下の配列より選ばれたこと、即ち、
Arg-Gly-Asp-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、 Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Arg-Gly-Asp、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp、 Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp、
Arg-Gly-Asp-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Arg-Gly
-Asp、
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Arg-Gly-Asp、又は
Arg-Gly-Asp-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Aspである、
ことを特徴とする請求項１に記載の高性能血管生成抑制剤。
【請求項３】
前記Arg-Gly-Aspを含む配列がAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys又は Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linkerを含む配列である、
ことを特徴とする請求項１に記載の高性能血管生成抑制剤。
【請求項４】
前記Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys又は Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linkerを含む配列が以下のポリペプチド配列より選ばれたこと、即ち、
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-
Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-
Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-
Cys、 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys
-lle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-
Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro
-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、又は
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-
Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro- Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cysである、
ことを特徴とする請求項３に記載の高性能血管生成抑制剤。
【請求項５】
前記インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドがPEG又はへパリン又はデキストラン又はポリビニルピロリドン又はPEG・ポリアミド酸共重合体又はパルミチン酸又はポリシアル酸又はリポソーム又はナノテクノロジーで修飾後のポリペプチド生成物であることを特徴とする請求項２又は３に記載の高性能血管生成抑制剤。
【請求項６】
請求項１に記載のインテグリンファミリーに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤の製造方法であって、以下のステップが含まれる、即ち、
血管生成を抑制するポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro の両端に、少なくとも一端はインテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドが接続され、前記「インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチド」はArg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linker又はAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys又はAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linkerを含む配列であり、その中の-Linkerは一つ又は複数の異なるアミノ酸である、
ことを特徴とするインテグリンファミリーに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤の製造方法。
【請求項７】
前記ポリペプチド配列及びこのポリペプチドをコーディングする塩基配列が化学合成法を用い、形成されることを請求項６に記載のインテグリンファミリーに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤の製造方法。
【請求項８】
前記ポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーディングする塩基配列が以下の方式である遺伝工学法を用い、形成されること、即ち、
Arg-Gly-Aspインテグリン結合配列ペプチドを含む血管生成抑制剤遺伝子配列を合成し、この配列をテンプレートにし、上流・下流プライマーを設計し、プライマー配列の５’末端と３’末端にクローニングに適切する制限酵素切断部位を付加し、PCR増幅し、RGD-ED遺伝子を獲得し、遺伝子をベクターにクローニングし、陽性クローンをスクリーニングし、ヌクレオチド配列の解析と鑑定を行い、
RGD-ED遺伝子は原核生物発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、大腸菌に転化させ、IPTGで発現RGD-EDを誘導し、発現生成物は封入体として存在し、
封入体のタンパク分離、溶解、活性再生を行い、更にイオン交換クロマトグラフィーでRGD-EDタンパク生成物を分離・純化し、フロースルーを収集し、凍結乾燥し、
すべてのRGD−ED遺伝子に対し、真核生物の発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、真核細胞に転化させ、発現RGD-EDを誘導し、発現生成物を分離・純化する、
こと請求項６に記載のインテグリンファミリーに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーディングする塩基配列に対する修飾方法であって、以下のステップの一つを用いること、即ち、
前記ポリペプチド配列にPEGで修飾する；
又は前記ポリペプチド配列に対し、へパリン修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、デキストラン修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、ポリビニルピロリドン修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、PEG−ポリアミド酸共重合体修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、パルミチン酸修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、ポリシアル酸修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、リポソーム修飾をし、前記リポソームはリポソームREV、乾燥したリポソームDRV、多重ラメラリポソームMvlから選択される；
又は前記ポリペプチド配列に対し、ナノテクノロジー修飾をする、
ことを特徴とするポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーディングする塩基配列に対する修飾方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの修飾ステップは以下の通りであること、即ち、
(1) 1〜70重量%のポリペプチドを用いて、20〜95重量%のPEG又はへパリン又はデキストラン又はポリビニルピロリドン又はPEG−ポリアミド酸共重合体又はパルミチン酸又はポリシアル酸又はリポソーム又はナノ粒子溶液と混合する；
(2）4℃〜40℃の間、好ましくは25℃〜37℃であり、シェーカーで10分以上振とう反応させる；
(3）修飾された生成物を分離する、
ことを特徴とする高性能血管生成抑制剤の修飾方法。
【請求項１１】
前記ステップ(1)中のポリエチレングリコール（PEG）は用いられたPEG分子量範囲が直鎖状であり、相対分子量が2000-30000Dαであり、又は分枝状であり、相対分子量が40000-60000Dαであり、その中には(1)PEG-ビニルスルホン酸と、(2)PEG-ヨードアセトアミドと、(3)PEG ‐マレアミドと、(4)PEG-オルトピリジンジスルフィドと、(5)SC-mPEG（メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート）又はSS-PEG (スクシンイミジルスクシネート)又はPEG-イソシアン酸エステルと、(6)メトキシ化PEGプロピオンアルデヒドとが含まれる、
ことを特徴とする請求項１０に記載の高性能血管生成抑制剤の修飾方法。
【請求項１２】
請求項１〜５の何れか一項に記載の高性能血管生成抑制剤であって、当該高性能血管生成抑制剤及び修飾生成物を、抗腫瘍薬物を製造するために用いることを特徴とする高性能血管生成抑制剤の用途。
【請求項１】
高性能血管生成抑制剤であって、血管生成を抑制するポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro の両端に、少なくとも一端はインテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドが接続され、前記「インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチ」はArg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-linkerの配列を含み、その中の-Linkerは一つ又は複数の異なるアミノ酸である、
ことを特徴とする高性能血管生成抑制剤。
【請求項２】
前記Arg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linkerを含むポリペプチド配列が以下の配列より選ばれたこと、即ち、
Arg-Gly-Asp-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、 Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Arg-Gly-Asp、 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp、 Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp、
Arg-Gly-Asp-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Arg-Gly
-Asp、
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Arg-Gly-Asp、又は
Arg-Gly-Asp-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Aspである、
ことを特徴とする請求項１に記載の高性能血管生成抑制剤。
【請求項３】
前記Arg-Gly-Aspを含む配列がAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys又は Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linkerを含む配列である、
ことを特徴とする請求項１に記載の高性能血管生成抑制剤。
【請求項４】
前記Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys又は Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linkerを含む配列が以下のポリペプチド配列より選ばれたこと、即ち、
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-
Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro、
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-
Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-
Cys、 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys
-lle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-
Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro
-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys、又は
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-
Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro- Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cysである、
ことを特徴とする請求項３に記載の高性能血管生成抑制剤。
【請求項５】
前記インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドがPEG又はへパリン又はデキストラン又はポリビニルピロリドン又はPEG・ポリアミド酸共重合体又はパルミチン酸又はポリシアル酸又はリポソーム又はナノテクノロジーで修飾後のポリペプチド生成物であることを特徴とする請求項２又は３に記載の高性能血管生成抑制剤。
【請求項６】
請求項１に記載のインテグリンファミリーに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤の製造方法であって、以下のステップが含まれる、即ち、
血管生成を抑制するポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro の両端に、少なくとも一端はインテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドが接続され、前記「インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチド」はArg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linker又はAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys又はAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linkerを含む配列であり、その中の-Linkerは一つ又は複数の異なるアミノ酸である、
ことを特徴とするインテグリンファミリーに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤の製造方法。
【請求項７】
前記ポリペプチド配列及びこのポリペプチドをコーディングする塩基配列が化学合成法を用い、形成されることを請求項６に記載のインテグリンファミリーに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤の製造方法。
【請求項８】
前記ポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーディングする塩基配列が以下の方式である遺伝工学法を用い、形成されること、即ち、
Arg-Gly-Aspインテグリン結合配列ペプチドを含む血管生成抑制剤遺伝子配列を合成し、この配列をテンプレートにし、上流・下流プライマーを設計し、プライマー配列の５’末端と３’末端にクローニングに適切する制限酵素切断部位を付加し、PCR増幅し、RGD-ED遺伝子を獲得し、遺伝子をベクターにクローニングし、陽性クローンをスクリーニングし、ヌクレオチド配列の解析と鑑定を行い、
RGD-ED遺伝子は原核生物発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、大腸菌に転化させ、IPTGで発現RGD-EDを誘導し、発現生成物は封入体として存在し、
封入体のタンパク分離、溶解、活性再生を行い、更にイオン交換クロマトグラフィーでRGD-EDタンパク生成物を分離・純化し、フロースルーを収集し、凍結乾燥し、
すべてのRGD−ED遺伝子に対し、真核生物の発現ベクターと組換え、発現型プラスミドを形成し、真核細胞に転化させ、発現RGD-EDを誘導し、発現生成物を分離・純化する、
こと請求項６に記載のインテグリンファミリーに親和性と結合力を有する高性能血管生成抑制剤の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーディングする塩基配列に対する修飾方法であって、以下のステップの一つを用いること、即ち、
前記ポリペプチド配列にPEGで修飾する；
又は前記ポリペプチド配列に対し、へパリン修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、デキストラン修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、ポリビニルピロリドン修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、PEG−ポリアミド酸共重合体修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、パルミチン酸修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、ポリシアル酸修飾をする；
又は前記ポリペプチド配列に対し、リポソーム修飾をし、前記リポソームはリポソームREV、乾燥したリポソームDRV、多重ラメラリポソームMvlから選択される；
又は前記ポリペプチド配列に対し、ナノテクノロジー修飾をする、
ことを特徴とするポリペプチド配列及びこのポリペプチド配列をコーディングする塩基配列に対する修飾方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの修飾ステップは以下の通りであること、即ち、
(1) 1〜70重量%のポリペプチドを用いて、20〜95重量%のPEG又はへパリン又はデキストラン又はポリビニルピロリドン又はPEG−ポリアミド酸共重合体又はパルミチン酸又はポリシアル酸又はリポソーム又はナノ粒子溶液と混合する；
(2）4℃〜40℃の間、好ましくは25℃〜37℃であり、シェーカーで10分以上振とう反応させる；
(3）修飾された生成物を分離する、
ことを特徴とする高性能血管生成抑制剤の修飾方法。
【請求項１１】
前記ステップ(1)中のポリエチレングリコール（PEG）は用いられたPEG分子量範囲が直鎖状であり、相対分子量が2000-30000Dαであり、又は分枝状であり、相対分子量が40000-60000Dαであり、その中には(1)PEG-ビニルスルホン酸と、(2)PEG-ヨードアセトアミドと、(3)PEG ‐マレアミドと、(4)PEG-オルトピリジンジスルフィドと、(5)SC-mPEG（メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート）又はSS-PEG (スクシンイミジルスクシネート)又はPEG-イソシアン酸エステルと、(6)メトキシ化PEGプロピオンアルデヒドとが含まれる、
ことを特徴とする請求項１０に記載の高性能血管生成抑制剤の修飾方法。
【請求項１２】
請求項１〜５の何れか一項に記載の高性能血管生成抑制剤であって、当該高性能血管生成抑制剤及び修飾生成物を、抗腫瘍薬物を製造するために用いることを特徴とする高性能血管生成抑制剤の用途。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５３０８５６（Ｐ２０１０−５３０８５６Ａ）
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１２４８９（Ｐ２０１０−５１２４８９）
【出願日】平成２０年２月１３日（２００８．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０００３４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０００１３７
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０９３５２６０２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１３日（２００８．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／０００３４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０００１３７
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０９３５２６０２）
【Ｆターム（参考）】
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