表層制御積層シリカナノ粒子及びその製造方法
【課題】表面に結合した生体分子の活性低下を抑制できる機能性分子含有シリカ粒子を製造する方法を提供する。
【解決手段】機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る第１工程、及び第１工程で得られた分散液に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基を有するオルガノアルコキシシランを添加してシリカのコア粒子にシェル層を形成させる第２工程を少なくとも含む、表面が前記官能基で修飾されたシリカナノ粒子の製造方法。
【解決手段】機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る第１工程、及び第１工程で得られた分散液に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基を有するオルガノアルコキシシランを添加してシリカのコア粒子にシェル層を形成させる第２工程を少なくとも含む、表面が前記官能基で修飾されたシリカナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は表面が修飾されたシリカナノ粒子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラエトキシシラン（以下ＴＥＯＳということもある。）に代表されるテトラアルコキシシランに、触媒であるアンモニアの存在下、水を加えて加水分解すると縮重合によるシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）を形成後、ナノ〜ミクロンサイズのシリカ粒子が形成される。（例えば、非特許文献１）。シリカ粒子は化学的に安定である上、表面修飾が容易であり、また、生体に対する安全性も高いことから、生体分子等を標識する物質として適した素材である。しかしながら、シリカ粒子はそのままでは吸光性、蛍光性、磁性といった特性がないために、標識物質として使用するためには、標識として機能しうる分子（吸光分子、蛍光分子、発色分子等）をシリカ粒子の構造中に取り込む必要がある。
【０００３】
特許文献１には、蛍光色素分子等の機能性分子が結合したオルガノアルコキシシラン化合物をＴＥＯＳと共にアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させて該機能性分子を含有するシリカ粒子を調製し、さらに前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランを追添して、加水分解と縮重合を行わせることにより、前記機能性分子含有シリカ粒子にさらに機能性分子を含有するシリカ層を積層する方法が開示されている。この方法によれば、その内部及び表層に機能性分子が結合したシリカ粒子を作製することができるので、機能性分子を多量に含有するシリカ粒子を作製できる。
このように作製した機能性分子含有シリカ粒子は、その表面に抗体や核酸などの生体分子を結合（吸着）させることができ、これにより該生体分子と結合する標的分子を高感度に検出するための診断試薬として利用すること等ができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２２１０５９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６，６２−６９（１９６８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、従来の方法で調製した機能性分子含有シリカ粒子に生体分子を吸着させると、時間経過に伴い該生体分子の活性が顕著に低下する現象を見出した。
本発明は、表面に結合した生体分子の活性低下を抑制できる機能性分子含有シリカ粒子の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、特定の方法で機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に特定の官能基を導入することで、溶液分散性の高い（凝集しにくい）シリカナノ粒子を作製できることを見出した。さらに、このシリカナノ粒子表面に生体分子を結合させると、該生体分子の活性が安定に維持されることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至ったものである。
【０００８】
本発明の課題は下記の手段により達成された。
［１］機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る第１工程、及び第１工程で得られた分散液に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基を有するオルガノアルコキシシランを添加してシリカのコア粒子にシェル層を形成させる第２工程を少なくとも含む、表面が前記官能基で修飾されたシリカナノ粒子の製造方法。
［２］第２工程でさらにテトラアルコキシシランを添加する、［１］に記載の製造方法。
［３］前記官能基がチオール基である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記チオール基を有するオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、［３］に記載の製造方法。
［５］第２工程で添加されるオルガノアルコキシシラン及び／又はテトラアルコキシシランの添加量を調節することによりシリカナノ粒子の純水中におけるゼータ電位の絶対値を２０〜７０ｍＶに調節する、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］機能性分子が蛍光分子である、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法により製造しうるシリカナノ粒子。
［８］表面に、ヒドロキシル基と、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基とを有し、純水中におけるゼータ電位の絶対値が２０〜７０ｍＶである、機能性分子を含有するシリカナノ粒子。
［９］前記官能基がチオール基である、［８］に記載のシリカナノ粒子。
［１０］表面に生体分子が結合している、［１］〜［９］のいずれかに記載のシリカナノ粒子。
［１１］生体分子がタンパク質である、［１０］に記載のシリカナノ粒子。
［１２］タンパク質が抗体又は抗原である、［１１］に記載のシリカナノ粒子。
［１３］［１０］〜［１２］に記載のシリカナノ粒子を含む診断キット。
［１４］診断キットがイムノクロマトグラフィー装置である、［１３］に記載の診断キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、表面に特定の官能基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法であって、ゼータ（ζ）電位の絶対値を所望の範囲に調節することができ、これにより粒子の溶液分散性を調節することができるシリカナノ粒子の簡便な製造方法が提供される。
また、本発明によれば、表面に特定の官能基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子であって、特定のゼータ電位を有し、溶液分散性の高いシリカナノ粒子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】シリカナノ粒子の調製の際に添加するＭＰＳの量とシリカナノ粒子のゼータ電位の関係を示すグラフである。
【図２】実施例において調製したテストストリップの構造を示す図である。図２ａはテストストリップを上から見た図であり、図２ｂはテストストリップを側面から見た図である。
【図３】表面にチオール基を有する本発明のシリカナノ粒子と、チオール基を有さないＴＥＯＳ粒子とについて、その表面に結合させた抗体活性の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明する。
【００１２】
［本発明の製造方法］
本発明の製造方法は、機能性分子を含むシリカのコア粒子を作製した後に、その表面にヒドロキシル基と所望の官能基とを有するシリカのシェル層を形成させる工程を含む、シリカナノ粒子の製造方法である。
【００１３】
（コア粒子の作製）
上記シリカのコア粒子は、機能性分子が結合したオルガノアルコキシシラン（機能性分子結合オルガノアルコキシシラン）と、テトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、加水分解反応と縮重反応とを行わせることで得ることができる。
【００１４】
上記機能性分子結合オルガノアルコキシシランの機能性分子としては、ＴＡＭＲＡ、ローダミン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＧＦＰ等の蛍光分子、ポルフィリン、フタロシアニン等の特定の波長に吸収をもつ色素分子、ルミノール等の発光分子、放射性分子、磁性分子、ｐＨ感受性色素分子、酵素等が挙げられる。機能性分子結合オルガノアルコキシシランは、機能性分子が有する官能基又は活性基とオルガノアルコキシシランが有する官能基又は活性基とを結合させることで調製することが好ましい。該官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等が挙げられ、該活性基としては、スクシンイミド基やマレイミド基が挙げられる。アミノ基とカルボキシル基とは、脱水縮合によってペプチド結合を形成することができる。また、スクシンイミド基及びマレイミド基は、それぞれアミノ基及びチオール基と容易に反応して結合することができる。機能性分子とオルガノアルコキシシランとの結合の具体例としては、例えば、機能性分子にスクシンイミド基を導入し、これを３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）や３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するオルガノアルコキシシランと反応させる方法や、機能性分子にマレイミド基を導入し、これを３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）等のチオール基（メルカプト基）を有するオルガノアルコキシシランと反応させる方法等が挙げられる。機能性分子へのマレイミド基やスクシンイミド基の導入は通常の方法で行うことができる。また、マレイミド基やスクシンイミド基が導入された市販の機能性分子を購入して使用することもできる。スクシンイミド基が導入された市販の機能性分子として、例えば、５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、いずれもインビトロジェン社製）が挙げられる。
機能性分子が結合するオルガノアルコキシシランとしては、上記ＡＰＳやＭＰＳの他、トリメトキシフェニルシラン、トリメトキシメチルシラン、３−イソシアネートプロピルエトキシシラン等が挙げられる。
【００１５】
上記テトラアルコキシシランとしては、テトラエトキシラン（ＴＥＯＳ）やテトラメトキシシラン等が挙げられるが、ＴＥＯＳを用いることが好ましい。
上記機能性分子結合オルガノアルコキシシランやテトラアルコキシシランのアルコキシ基は、上記アンモニア水含有溶媒中で加水分解されてヒドロキシル基となり、さらに該ヒドロキシル基が脱水縮合してシロキサン結合を形成する。その結果、オルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が形成される。
【００１６】
上記アンモニア水含有溶媒は好ましくはアンモニア水と親水性溶媒の混合液である。親水性溶媒に特に制限はないが、アルコールであることが好ましく、エタノール又はメタノールであることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。アンモニア水と親水性溶媒の混合割合に特に制限はないが、体積比で、アンモニア水１に対して親水性溶媒３〜２０の混合割合であることが好ましい。上記アンモニア水のアンモニア濃度に特に制限はないが、上記アンモニア水含有溶媒全量に対して１〜２８質量％であることが好ましく、２〜１４質量％であることがより好ましい。アンモニア水含有溶媒のアンモニア濃度が高くなるにしたがって、シリカ粒子の核形成頻度が高まり、また、シリカ粒子の成長速度が速まる。
【００１７】
上記アンモニア水含有溶媒に添加するテトラアルコキシシランの量に特に制限はないが、添加量多すぎると形成されたシリカ粒子の融合が生じやすく、また、添加量が少なすぎるとシリカ粒子の粒度分布が広がりやすい。したがって、上記アンモニア水含有溶媒に添加した際に、４．５〜９０．３ｍＭ（ミリモル／Ｌ）となることが好ましく、９．０〜４５．１ｍＭ（ミリモル／Ｌ）となることがより好ましい。
【００１８】
上記アンモニア水含有溶媒に添加する機能性分子結合オルガノアルコキシシランの量に特に制限はないが、アンモニア水含有溶媒中における上記テトラアルコキシシランとの混合比が、モル比で、テトラアルコキシシラン１に対して機能性分子結合オルガノアルコキシシランが０．０００５〜０．００６０であることが好ましく、０．００１０〜０．００５０であることがより好ましく、０．００１５〜０．００４０であることがさらに好ましい。
【００１９】
機能性分子結合オルガノアルコキシシランと、テトラアルコキシシランとの加水分解反応と縮重反応は、０〜７０℃で行うことが好ましく、３０〜６０℃で行うことがより好ましい。反応時間に特に制限はなく、所望の大きさのコア粒子を得るために適宜調節することができるが、通常には２〜４８時間反応させる。
【００２０】
上記シリカのコア粒子を形成させた上記アンモニア水含有溶媒に、さらにテトラアルコキシシラン及び／又は機能性分子結合オルガノアルコキシシランを添加することで、上記コア粒子をさらに所望の大きさに成長させることもできる。すなわち、本発明の製造方法において、「機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る第１工程」は、コア粒子をさらに所望の大きさに成長させる上記工程を含んでもよい。コア粒子の大きさは１０〜２５０ｎｍとすることが好ましい。
【００２１】
（シェル層の形成）
上記で作製したアンモニア水含有溶媒中のシリカのコア粒子の表面にヒドロキシル基と所望の官能基とを有するシリカのシェル層を形成させることで、表面に該ヒドロキシル基と該所望の官能基を有する本発明のシリカナノ粒子を作製することができる。具体的には、上記で調製した、コア粒子を含有するアンモニア水含有溶媒に、所望の官能基を有する少なくとも１種のオルガノアルコキシシランを添加し、加水分解反応と縮重反応とを行わせることで、表面にヒドロキシル基と上記官能基とを有するシリカのシェル層を形成させることができる。上記官能基が１種類である場合には、当該官能基を有する１種類のオルガノアルコキシシランを添加することで所望のシリカナノ粒子を得ることができる。また、上記官能基が２種以上である場合には各官能基に対応した２種以上のオルガノアルコキシシランを添加することで所望のシリカナノ粒子を得ることができる。上記官能基としては、チオール基、アミノ基、アリール基、アルキル基、イソシアネート基等が挙げられる。上記官能基がチオール基である場合には、ＭＰＳ等のチオール基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができ、上記官能基がアミノ基である場合には、ＡＰＳ等のアミノ基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができ、上記官能基がアリール基である場合には、トリメトキシフェニルシラン等のアリール基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができ、上記官能基がアルキル基である場合には、トリメトキシメチルシラン等のアルキル基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができ、上記官能基がイソシアネート基である場合には、３−イソシアネートプロピルエトキシシラン等のイソシアネート基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができる。
【００２２】
また、上記官能基を有するオルガノアルコキシシランの添加に加えて、さらにテトラアルコキシシランを添加してもよい。また、所望により機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランを添加することもできる。
上記官能基を有するオルガノアルコキシシランを、シリカのコア粒子を含むアンモニア水含有溶媒に添加する量に特に制限はないが、モル比で、コア粒子の形成からシェル層の形成を通して（シリカナノ粒子の全製造工程を通して）添加したテトラアルコキシシランと上記官能基を有するオルガノアルコキシシラン総モル数１に対して０．０１〜１．００であることが好ましく、０．０２〜０．８０であることがより好ましく、０．０３〜０．４０であることがさらに好ましい。
また、上記官能基を有するオルガノアルコキシシランの添加の際に添加しうるテトラアルコキシシランの量に特に制限はないが、モル比で、上記官能基を有するオルガノアルコキシシラン１に対して０〜２０であることが好ましく、０〜１０であることがより好ましく、０〜５であることがさらに好ましい。
シェル層を形成させたシリカナノ粒子の大きさは２０〜５００ｎｍとすることが好ましい。
【００２３】
シェル層を形成させる際のアンモニア水含有溶媒中のテトラアルコキシシランの量と上記官能基を有するオルガノアルコキシシランの量を調節することで、シリカナノ粒子表面の官能基の組成や量を調節することができる。シリカナノ粒子表面の官能基の組成や量を調節することで、本発明の製造方法で製造されるシリカナノ粒子の純水中におけるゼータ電位の絶対値は、１〜７０ｍＶに調節されることが好ましく、２０〜７０ｍＶに調節されることがより好ましく、３０〜６０ｍＶに調節されることがさらに好ましく、４５〜５５ｍＶに調節されることが特に好ましい。シリカナノ粒子のゼータ電位（界面動電電位）の絶対値は、シリカナノ粒子の帯電による静電的反発力の大きさと相関がある。ゼータ電位の絶対値が大きいとシリカナノ粒子の溶媒中での分散性が高くなり、分散安定性も高くなる（すなわちシリカナノ粒子の凝集が抑制される）ので、本発明の製造方法により、後述するような標識物質としての使用に適したシリカナノ粒子を提供することができる。しかしながら、ゼータ電位の絶対値が大きすぎると、静電的相互作用によりシリカナノ粒子への生体分子等の非特異的な結合が増大するおそれがあるため、ゼータ電位の絶対値を上記所定の範囲内に調節することが好ましい。ゼータ電位は、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）、ＥＬＳ−Ｚ１（商品名、大塚電子社製）、ＮＩＣＯＭＰ ３８０ＺＬＳ（商品名、ＩＢＣ社製）等を用いて測定することができる。
【００２４】
従来、機能性分子を含有するシリカナノ粒子の表面に官能基を導入するためには、テトラアルコキシシランと機能性分子含有オルガノアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合して形成させたシリカナノ粒子を一旦アンモニア水含有溶媒から、遠心分離、洗浄操作を経て分離し、該分離したシリカナノ粒子を、導入したい官能基を有するオルガノアルコキシシランを含有するアンモニア水含有溶媒中に再度分散するという煩雑な操作を要していた。また、シリカナノ粒子表面に導入した官能基の量が一定した粒子を高い再現性で得るためには粒子表面を該官能基で飽和させる必要がある。その結果、製造されたシリカナノ粒子はその表面の疎水性が高く（ゼータ電位の絶対値が低く）凝集しやすい性質を有するものであった。
これに対し、本発明の方法では、アンモニア水含有溶媒中で形成させたシリカのコア粒子を該アンモニア水含有溶媒から分離せずにその表面に官能基を導入することができるので、従来の方法に比べてより簡便な方法で官能基が導入されたシリカナノ粒子を作製することができる。しかも本発明の方法では、シリカナノ粒子表面の官能基の組成と量を簡単に制御することができるため、上記従来法で作製した官能基を有するシリカナノ粒子よりも粒子表面の親水性を高める（ゼータ電位の絶対値を高める）ことができる。これにより、粒子同士の凝集を抑えることができるため、後述するような用途に適したシリカナノ粒子を提供することができる。
【００２５】
［本発明のシリカナノ粒子］
本発明のシリカナノ粒子は機能性分子を含有し、その表面にヒドロキシル基とそれ以外の官能基とを有する。当該官能基に特に制限がないが、チオール基、アミノ基、アリール基、アルキル基又はイソシアネート基であることが好ましく、チオール基、アミノ基であることがより好ましく、チオール基であることが特に好ましい。本発明のシリカナノ粒子は、ヒドロキシル基以外の官能基を１種有していてもよいし、２種以上有していてもよい。本発明のシリカナノ粒子の純水中におけるゼータ電位の絶対値は１〜７０ｍＶであることが好ましく、２０〜７０ｍＶであることがより好ましく３０〜６０ｍＶであることがさらに好ましく、４５〜５５ｍＶであることが特に好ましい。
本発明のシリカナノ粒子は、上記本発明の製造方法により製造しうる。
【００２６】
本発明のシリカナノ粒子は標識物質として用いることができる。例えば、本発明のシリカナノ粒子表面に生体分子を結合させることで、本発明のシリカナノ粒子を、該生体分子に特異的に結合する分子（標的分子）を検出するための試薬とすることができる。該生体分子と該標的分子との組合せの例としては、抗体と抗原、抗原と抗体、核酸と該核酸に相補的な配列を有する核酸、受容体とリガンド、リガンドと受容体、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、レクチンと糖鎖、アプタマーと該アプタマーに特異的に結合する分子等が挙げられる。上記生体分子は本発明のシリカナノ粒子表面に直接結合していてもよいし、他の分子を介して間接的に結合していてもよい。
【００２７】
例えば、抗体を結合した本発明のシリカナノ粒子は、該抗体に結合する抗原を検出するための試薬として用いることができる。該抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいが、安定した品質の抗体を安定して供給するためには、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、本発明における抗体には、抗体をペプシンやパパインのようなタンパク質分解酵素で分解し、抗原に対する結合性を維持した、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメントや、２本のＨ鎖同士を結びつけているジスルフィド結合を還元して乖離させて、１本のＨ鎖と１本のＬ鎖からなるフラグメントとしたものも含まれる。また、本発明における抗体には、単鎖抗体やその２量体（ダイアボディー）もしくは３量体（トリアボディー）、又はミニボディーも含まれる。本発明に使用する抗体として、一般的に用いられているマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、トリ由来のもの等が使用できるがこれらに限定されず、抗原に特異的に結合する抗体であれば何れも使用できる。
該抗体の具体例としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ等の腫瘍マーカーに対する抗体、ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原、ｐ２４抗原等の感染症マーカーに対する抗体、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＰＩＣ、ＡＴIII、ＦＭ等の凝固線溶マーカー、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、トロポニン、ＣＲＰ、ＢＮＰ等の心不全マーカーに対する抗体、ＴＳＨ、ｈＣＧ等のホルモン類やインスリン等に対する抗体等が挙げられる。
【００２８】
また、抗原を結合した本発明のシリカナノ粒子は、該抗原に結合する抗体を検出するための試薬として用いることができる。該抗原として、例えば、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗体、ＨＣＶ抗体といった感染症マーカーとなりうる抗体に対する抗原等が挙げられる。
【００２９】
また、核酸を結合した本発明のシリカナノ粒子は、該核酸と相補的な配列を有する核酸を検出するための試薬として用いることができる。本発明のシリカナノ粒子に結合させる核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等が挙げられる。当該核酸が結合した本発明のシリカナノ粒子は、該核酸と相補的な配列を有する核酸を検出するための試薬として用いることができる。
【００３０】
本発明のシリカナノ粒子の表面にアビジンやストレプトアビジンを結合させることで、ビオチンを介して上記生体分子を間接的に結合させることもできる。すなわち、本発明のシリカナノ粒子の表面に結合させたい生体分子にビオチンを結合させ、これをアビジン又はストレプトアビジンが結合した本発明のシリカナノ粒子と接触させることで、アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの特異的結合を介して生体分子を本発明のシリカナノ粒子表面に結合させることができる。
【００３１】
本発明のシリカナノ粒子表面への生体分子の結合は、共有結合であっても非共有結合であってもよい。生体分子をシリカナノ粒子表面に共有結合する方法としては架橋剤を利用する方法が挙げられる。このような架橋剤として、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
生体分子をシリカナノ粒子表面に非共有結合する方法としては生体分子をシリカナノ粒子表面に吸着させる方法が挙げられる。例えば、生体分子を含む溶液中に本発明のシリカナノ粒子を分散させることで、該生体分子を本発明のシリカナノ粒子の表面に物理的に吸着させることができる。
【００３２】
シリカナノ粒子表面に結合していない余分な生体分子は、遠心分離や限外ろ過等により除くことができる。
【００３３】
生体分子が結合したシリカナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のブロッキング剤で表面をブロッキングすることが好ましい。これにより、検体中に含まれるタンパク質等のシリカナノ粒子表面への非特異的な吸着が抑えられるため、標的分子をより高感度に検出することが可能になる。また、表面をブロッキングすることで、シリカナノ粒子の凝集をより抑制することにもつながる。
【００３４】
シリカナノ粒子の表面に生体分子が結合したことの確認は、生体分子を含む溶液中の該生体分子の量を、シリカナノ粒子を分散させる前と後で比較することでおこなうことができる。生体分子がタンパク質であれば、溶液中の該タンパク質の量を一般的なタンパク質の定量法（ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法等）で定量しておき、該溶液にシリカナノ粒子を分散させた後の溶液中のタンパク質の減少量を算出することで、シリカナノ粒子の表面に結合したタンパク質の量を算出することができる。また、生体分子が核酸である場合には、定量ＰＣＲ等により溶液中の核酸を定量することで同様にシリカナノ粒子の表面に結合した核酸の量を算出することができる。
【００３５】
本発明のシリカナノ粒子は、該シリカ粒子の表面に結合した生体分子の活性を維持した状態で長期間保存ができる優れた特性を有する。すなわち、本発明のシリカナノ粒子に生体分子を結合させた粒子を用いて標的分子を検出することで、ヒドロキシル基以外の官能基を有さないシリカナノ粒子に生体分子を結合させた粒子を用いて標的分子を検出する場合に比べて、標的分子をより高感度に検出することができる。親水性であるヒドロキシル基よりも疎水性の強いチオール基やアリール基、アルキル基等が粒子表面に導入されることにより、粒子表面の疎水性が強くなり、生体分子の配向性が安定化する。また、疎水性相互作用により粒子と生体分子の結合が強固になり、生体分子の運動が弱まり、生体分子がより安定した状態で粒子表面と結合する。このため、ヒドロキシル基以外の官能基を有さないシリカナノ粒子に比べ、シリカ粒子の表面に結合した生体分子の活性を維持した状態で長期間保存ができると考えられる。
【００３６】
［本発明の診断キット］
本発明の診断キットは、本発明のシリカナノ粒子表面に生体分子が結合した粒子を含むキットであり、標的分子を検出するために用いられる。以下本発明の診断キットの例について説明する。
（ａ）サンドイッチ免疫測定キット
本発明のシリカナノ粒子の表面に標的分子の第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗体を結合させたシリカナノ粒子と、標的分子の第１のエピトープとは異なるエピトープに特異的に結合する第２の抗体とを含むキットである。第１の抗体と第２の抗体は標的分子を挟んで結合することができる。このキットは抗原抗体反応に適した緩衝液等や、抗原抗体反応を行わせるための容器等を含んでいてもよい。第２の抗体は反応場に固定化されていてもよいし、免疫測定の際に反応場に添加しうる状態で含まれていてもよい。また、第２の抗体は磁性粒子等の担体に結合されていてもよい。第２の抗体が固定化される反応場としてはニトロセルロース等のシート、ガラスや樹脂製の反応容器内壁、ガラスや樹脂製のマイクロチップに形成されたマイクロ流路内壁等が挙げられる。ニトロセルロース等のシートが反応場である診断キットとして、イムノクロマトグラフィー装置（抗体が固定化されたシートを含むテストストリップがハウジングされたイムノクロマト試薬）の形態が例示される。
【００３７】
（ｂ）競合免疫測定キット
本発明のシリカナノ粒子の表面に標的分子が有するエピトープと同一のエピトープを有する標的分子のアナログを結合させたシリカナノ粒子と、該エピトープを特異的に認識する抗体を含むキットである。標的分子と標的分子のアナログは、該抗体に競合的に結合する。このキットは抗原抗体反応に適した緩衝液等や、抗原抗体反応を行わせるための容器等を含んでいてもよい。該抗体は反応場に固定化されていてもよいし、免疫測定の際に反応場に添加しうる状態で含まれていてもよい。また、該抗体は磁性粒子等の担体に結合していてもよい。該抗体が固定化される反応場としては、ニトロセルロース等のシート、ガラスや樹脂製の反応容器内壁、ガラスや樹脂製のマイクロチップに形成されたマイクロ流路内壁等が挙げられる。競合免疫測定キットはエピトープが１つしかないようなペプチドやホルモン等の低分子の標的分子の検出に好適に使用される。
【００３８】
（ｃ）核酸検出キット
本発明のシリカナノ粒子の表面に、標的核酸の連続した１つの領域における塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを結合させたシリカナノ粒子と、第１のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとは異なる部位で標的核酸にハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むキットである。第１のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは標的核酸を介して結合する。このキットはハイブリダイゼーション反応に適した緩衝液等や、ハイブリダイゼーション反応を行わせるための容器等を含んでいてもよい。第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは反応場に固定化されていてもよいし、反応場に添加しうる状態で含まれていてもよい。また、第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは磁性粒子等の担体に結合していてもよい。第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが固定化される反応場としてはニトロセルロース等のシート、ガラスや樹脂製の反応容器内壁、ガラスや樹脂製のマイクロチップに形成されたマイクロ流路内壁等が挙げられる。ニトロセルロース等のシートが反応場である診断キットとして、イムノクロマトグラフィー装置に準じた形態（イムノクロマトグラフィー装置においてニトロセルロース等のシートに固定化された抗体（抗原）が核酸に置き換わった形態である。便宜上、核酸クロマトグラフィー装置と呼ぶ。）が例示される。
【００３９】
また、目的に応じて、上記例示した診断キットにおける標的分子と該標的分子に特異的に結合する生体分子の組合せを、受容体とリガンド、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、糖鎖とレクチン、アプタマーに特異的に結合する分子と該アプタマー等に置き換えた診断キットも本発明の診断キットに包含される。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
調製例１ 本発明の製造方法による蛍光色素含有シリカナノ粒子の調製
１４質量％のアンモニア水をエタノールで５倍希釈して３．５ｍＬのアンモニア水含有溶媒を調製した。該アンモニア水含有溶媒にＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）３０μＬ（１３５マイクロモル）と、１０ｍＭの濃度になるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＦ）に溶解した５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ１６μＬ（１６０ナノモル）とを添加して、４０℃で３０分攪拌することで蛍光分子含有コア粒子が形成された溶液（以下、コア粒子含有溶液と呼ぶことがある。）を得た。本発明における機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物に該当する上記５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳは、５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステル（商品名、インビトロジェン社製）とＡＰＳ（信越シリコーン社製）とを反応させることで調製した。
【００４２】
上記コア粒子含有溶液に、ＴＥＯＳ３０μＬ（１３５マイクロモル）と、１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＦに溶解した５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ１１μＬ（１１０ナノモル）とを追添し、４０℃で３０分攪拌することでコア粒子にシェル層を形成させ、蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、第１シリカナノ粒子ということがある。）を含む溶液（以下、第１シリカナノ粒子含有溶液ということがある。）を得た。
【００４３】
上記第１シリカナノ粒子含有溶液にＴＥＯＳ１０μＬ（４５マイクロモル）と、１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＦに溶解した５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ５．３μＬ（５３ナノモル）とを追添し、４０℃で３０分攪拌して第１シリカナノ粒子にさらにシェル層を形成させ、蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、第２シリカナノ粒子ということがある。）を含む溶液（以下、第２シリカナノ粒子含有溶液ということがある。）を得た。
【００４４】
第２シリカナノ粒子の表面にメルカプトプロピル基を導入するために、上記第２シリカナノ粒子含有溶液に、表１の条件１の混合比で調製したＭＰＳ（和光純薬株式会社製）とＴＥＯＳの混合液（ＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液）２０μＬを追添した。室温で３０分攪拌することで、表層にヒドロキシル基とメルカプトプロピル基とを有する蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、本発明シリカナノ粒子１という。）を含む溶液（以下、本発明シリカナノ粒子１含有溶液という。）を得た。同様に、表１の条件２及び３の混合比で調製したＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液を添加した蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、それぞれ、本発明シリカナノ粒子２及び３という。）を含む溶液（以下、それぞれ本発明シリカナノ粒子２及び３含有溶液という。）も調製した。
表１中「ＴＥＯＳの総添加量（ＴＥＯＳ＋ＭＰＳ）に対するＭＰＳの添加量」とは、上記全工程を通してアンモニア水含有溶媒に添加したＴＥＯＳの総添加量に対するＭＰＳの添加量を示す。なお、ＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液は追添の直前に調製した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
上記本発明シリカナノ粒子含有溶液１を遠心して本発明シリカナノ粒子１を沈殿させた後、直ちに上清を除去した。続いて沈殿した本発明シリカナノ粒子１をエタノールに再分散し同様の操作をさらに２回繰り返すことで余分なＴＥＯＳ等を洗浄除去した。続いて、エタノールの代わりに蒸留水を用いて同様の洗浄操作を行い、余分な遊離色素を洗浄除去した。こうして洗浄された本発明シリカナノ粒子１を得た。また、本発明シリカナノ粒子含有溶液２及び３についても同様の洗浄操作を行うことで、洗浄された本発明シリカナノ粒子２及び３を得た。
【００４７】
比較例１ ＴＥＯＳ粒子の調製
調製例１の中間生成物である第２シリカナノ粒子を、上記本発明シリカナノ粒子の洗浄操作と同様の洗浄操作に付すことで、表面にヒドロキシル基のみを有する蛍光分子含有シリカナノ粒子（ＴＥＯＳ粒子）を得た。
【００４８】
比較例２ ＭＰＳ粒子の調製
２８質量％のアンモニア水３．５ｍＬにＭＰＳ（和光純薬株式会社製）１５μＬ（８１マイクロモル）と、１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＦに溶解した５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ８μＬ（８０ナノモル）とを添加して、６０℃で１２０分攪拌することで約３５０ｎｍの蛍光分子含有シリカナノ粒子が形成された溶液を得た。このシリカナノ粒子を、上記本発明シリカナノ粒子の洗浄操作と同様の洗浄操作に付すことで、ＴＥＯＳを含まない蛍光分子含有シリカナノ粒子（ＭＰＳ粒子）を得た。比較例２で得られたシリカナノ粒子は構成成分としてＴＥＯＳを含まないため、その表面に存在するヒドロキシル基の数は、本発明シリカナノ粒子よりも格段に少ない。
【００４９】
比較例３ 従来法によりＭＰＳ修飾されたシリカナノ粒子の調製
調製例１の中間生成物である第２シリカナノ粒子含有溶液１ｍＬに、５．８ｍＭ ＭＰＳを０．１ｍＬ添加し、室温で一晩攪拌することで第２シリカナノ粒子表面をＭＰＳで修飾した。こうして得られた蛍光分子含有シリカナノ粒子を、上記本発明シリカナノ粒子の洗浄操作と同様の洗浄操作に付すことで、ＴＥＯＳ粒子の表面がＭＰＳで修飾された蛍光分子含有シリカナノ粒子を得た。
【００５０】
試験例１ ゼータ電位の測定
本発明シリカナノ粒子１〜３、比較例１のＴＥＯＳ粒子及び比較例２のＭＰＳ粒子についてゼータ電位の測定を行った。ゼータ電位の測定は、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）により実施した。結果を図１に示す。
図１より、表面にメルカプトプロピル基を有さないＴＥＯＳ粒子のゼータ電位の絶対値が最も高く（約−５８ｍＶ）、次いで本発明シリカナノ粒子１（約−５６ｍＶ）、本発明シリカナノ粒子２（約−５２ｍＶ）、本発明シリカナノ粒子３（約−４９ｍＶ）、ＭＰＳ粒子（約−１２ｍＶ）の順にゼータ電位の絶対値が小さいことがわかる。すなわち、シリカナノ粒子表面のメルカプトプロピル基の数が増加するにしたがってゼータ電位の絶対値が小さくなることがわかった。
また、比較例３のシリカナノ粒子のゼータ電位についても測定したところ、その値は−１５ｍＶであり、ＭＰＳ粒子と同様低いゼータ電位の絶対値を示した。
【００５１】
試験例２ 蛍光強度の測定
本発明シリカナノ粒子１〜３、比較例１のＴＥＯＳ粒子、比較例２のＭＰＳ粒子及び比較例３の蛍光分子含有シリカナノ粒子について蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の測定は、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）を用いて、５３０ｎｍの励起光を照射したときに発する５５５ｎｍの蛍光を測定することで行った。その結果、本発明シリカナノ粒子１〜３は、ＴＥＯＳ粒子と同程度の蛍光強度を示すことがわかった。一方、ＭＰＳ粒子及び比較例３のシリカナノ粒子は凝集しやすく、測定溶媒に分散させることができず、測定が不可能であった。ＭＰＳ粒子と比較例３のシリカナノ粒子は、粒子表面のゼータ電位の絶対値が１５程度と小さい。すなわち、表面の疎水性が高いために、粒子同士の疎水的相互作用によって凝集が起こりやすいと考えられる。
【００５２】
試験例３ 免疫測定試薬への応用
本発明シリカナノ粒子１〜３及び比較例１のＴＥＯＳ粒子について、その表面に抗体を結合させて、イムノクロマトグラフィー試薬としての性能を比較した。なお、比較例２のＭＰＳ粒子及び比較例３のシリカナノ粒子については、水溶液中で凝集してしまうため、本試験に用いることができなかった。
【００５３】
［抗体の吸着］
本発明シリカナノ粒子１を５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように蒸留水中に分散させた。この分散液１００μＬと、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）３９０μＬとをマイクロチューブに入れて軽く攪拌した。この混合液に５．８ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８，Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１０μＬを加え、室温で１０分間穏やかに混合することで、抗ｈＣＧ抗体を本発明シリカナノ粒子１に吸着させた。続いてこの混合液に１％のポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を２００μＬ加えて軽く攪拌し、さらに１０％ＢＳＡを２００μＬ加えて軽く混合した。混合液を遠心分離して粒子を沈殿させた後、上清を取り除いた。ここに、保存用バッファーとして、０．０５％ ＰＥＧ（分子量２００００）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ及び０．１％ ＮａＮ３を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を１ｍＬ加え、再度遠心分離して上清を取り除いた。ここに、蒸留水５００μＬと、塗布バッファーとして、０．０５％ ＰＥＧ（分子量２００００）、５％スクロースを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を５００μＬ加えて粒子を分散させ、表面に抗ｈＣＧ抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、抗体結合シリカナノ粒子と呼ぶ。）の分散溶液を得た。
【００５４】
［コンジュゲートパッドの作製］
Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１枚（８ｍｍ×１５０ｍｍ）に付き、上記抗体結合シリカナノ粒子の分散溶液０．８ｍＬを均一に塗布した。これをデキケーター内で、室温下で一晩減圧乾燥した。こうして抗体結合シリカナノ粒子を均一に含有するコンジュゲートパッドを作製した。
【００５５】
［抗体固定化メンブレンの作製］
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の中央付近（サンプルパッド側の端から約１２ｍｍ）に約１ｍｍ幅のテストラインを作製した。具体的には、抗ｈＣＧ抗体（ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＦＳＨ（ＬＨ），ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅ／６６０１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、５％スクロースを含む５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）溶液に溶解し、これを０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
続いて、メンブレンのサンプルパッド側の端から約１６ｍｍに約１ｍｍ幅のコントロールラインを作製した。具体的には、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０、シュガーフリー）溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
上記のようにテストラインとコントロールラインを形成させたメンブレンを５０℃で３０分乾燥させた。
【００５６】
続いて、上記乾燥後のメンブレンをブロッキングバッファー（組成：１００ｍＭホウ酸（ｐＨ８．５）、１重量％カゼイン）中に室温で３０分浸すことでメンブレンをブロッキングした。ブロッキング後のメンブレンをメンブレン洗浄／安定バッファー（組成：１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、１重量％スクロース、０．１％コール酸ナトリウム）に移し、室温で３０分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上において室温で一晩乾燥させることで、抗体固定化メンブレンを作製した。
【００５７】
［テストストリップの作製］
上記コンジュゲートパッドと、上記抗体固定化メンブレンと、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）と、吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）とを、バッキングシート（商品名：ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立て、幅５ｍｍ、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、図２ａ及び図２ｂに示す構成のテストストリップを得た。
【００５８】
［抗体結合シリカナノ粒子の抗体活性評価］
上記テストストリップのサンプルパッドに０．５ＩＵ／ＬのリコンビナントｈＣＧ（ロート製薬社製）を１００μＬ滴下して１分静置した後、テストストリップの蛍光をＣＣＤ検出器（Ｃ２７４１−３５Ａ（商品名、浜松ホトニクス社製）を用いて画像化した。蛍光の検出は、励起光源側のフィルタとしてＦＦ０１−４８２（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製）、検出器側のフィルタとしてＦＦ０１−５３６（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製）を用いて、テストストリップを水銀ランプ（１０３Ｗ）で照射することで行った。
作製直後並びに作成後１６日及び２５日経過後のテストストリップを用いてテストラインの蛍光強度を比較した結果を図３に示す。なお、図３中のプロットは抗体活性評価試験３回分の平均値を示し、図中のエラーバーは標準偏差を示す。
【符号の説明】
【００５９】
１ テストストリップ
２ サンプルパッド
３ コンジュゲートパッド
４ ニトロセルロースメンブレン
４１ テストライン
４２ コントロールライン
５ 吸収パッド
６ バッキングシート
【技術分野】
【０００１】
本発明は表面が修飾されたシリカナノ粒子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラエトキシシラン（以下ＴＥＯＳということもある。）に代表されるテトラアルコキシシランに、触媒であるアンモニアの存在下、水を加えて加水分解すると縮重合によるシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ結合）を形成後、ナノ〜ミクロンサイズのシリカ粒子が形成される。（例えば、非特許文献１）。シリカ粒子は化学的に安定である上、表面修飾が容易であり、また、生体に対する安全性も高いことから、生体分子等を標識する物質として適した素材である。しかしながら、シリカ粒子はそのままでは吸光性、蛍光性、磁性といった特性がないために、標識物質として使用するためには、標識として機能しうる分子（吸光分子、蛍光分子、発色分子等）をシリカ粒子の構造中に取り込む必要がある。
【０００３】
特許文献１には、蛍光色素分子等の機能性分子が結合したオルガノアルコキシシラン化合物をＴＥＯＳと共にアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させて該機能性分子を含有するシリカ粒子を調製し、さらに前記アンモニア水含有溶媒にテトラアルコキシシランを追添して、加水分解と縮重合を行わせることにより、前記機能性分子含有シリカ粒子にさらに機能性分子を含有するシリカ層を積層する方法が開示されている。この方法によれば、その内部及び表層に機能性分子が結合したシリカ粒子を作製することができるので、機能性分子を多量に含有するシリカ粒子を作製できる。
このように作製した機能性分子含有シリカ粒子は、その表面に抗体や核酸などの生体分子を結合（吸着）させることができ、これにより該生体分子と結合する標的分子を高感度に検出するための診断試薬として利用すること等ができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２２１０５９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６，６２−６９（１９６８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、従来の方法で調製した機能性分子含有シリカ粒子に生体分子を吸着させると、時間経過に伴い該生体分子の活性が顕著に低下する現象を見出した。
本発明は、表面に結合した生体分子の活性低下を抑制できる機能性分子含有シリカ粒子の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、特定の方法で機能性分子含有シリカナノ粒子の表面に特定の官能基を導入することで、溶液分散性の高い（凝集しにくい）シリカナノ粒子を作製できることを見出した。さらに、このシリカナノ粒子表面に生体分子を結合させると、該生体分子の活性が安定に維持されることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至ったものである。
【０００８】
本発明の課題は下記の手段により達成された。
［１］機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る第１工程、及び第１工程で得られた分散液に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基を有するオルガノアルコキシシランを添加してシリカのコア粒子にシェル層を形成させる第２工程を少なくとも含む、表面が前記官能基で修飾されたシリカナノ粒子の製造方法。
［２］第２工程でさらにテトラアルコキシシランを添加する、［１］に記載の製造方法。
［３］前記官能基がチオール基である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記チオール基を有するオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、［３］に記載の製造方法。
［５］第２工程で添加されるオルガノアルコキシシラン及び／又はテトラアルコキシシランの添加量を調節することによりシリカナノ粒子の純水中におけるゼータ電位の絶対値を２０〜７０ｍＶに調節する、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］機能性分子が蛍光分子である、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法により製造しうるシリカナノ粒子。
［８］表面に、ヒドロキシル基と、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基とを有し、純水中におけるゼータ電位の絶対値が２０〜７０ｍＶである、機能性分子を含有するシリカナノ粒子。
［９］前記官能基がチオール基である、［８］に記載のシリカナノ粒子。
［１０］表面に生体分子が結合している、［１］〜［９］のいずれかに記載のシリカナノ粒子。
［１１］生体分子がタンパク質である、［１０］に記載のシリカナノ粒子。
［１２］タンパク質が抗体又は抗原である、［１１］に記載のシリカナノ粒子。
［１３］［１０］〜［１２］に記載のシリカナノ粒子を含む診断キット。
［１４］診断キットがイムノクロマトグラフィー装置である、［１３］に記載の診断キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、表面に特定の官能基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子の製造方法であって、ゼータ（ζ）電位の絶対値を所望の範囲に調節することができ、これにより粒子の溶液分散性を調節することができるシリカナノ粒子の簡便な製造方法が提供される。
また、本発明によれば、表面に特定の官能基を有する機能性分子含有シリカナノ粒子であって、特定のゼータ電位を有し、溶液分散性の高いシリカナノ粒子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】シリカナノ粒子の調製の際に添加するＭＰＳの量とシリカナノ粒子のゼータ電位の関係を示すグラフである。
【図２】実施例において調製したテストストリップの構造を示す図である。図２ａはテストストリップを上から見た図であり、図２ｂはテストストリップを側面から見た図である。
【図３】表面にチオール基を有する本発明のシリカナノ粒子と、チオール基を有さないＴＥＯＳ粒子とについて、その表面に結合させた抗体活性の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明する。
【００１２】
［本発明の製造方法］
本発明の製造方法は、機能性分子を含むシリカのコア粒子を作製した後に、その表面にヒドロキシル基と所望の官能基とを有するシリカのシェル層を形成させる工程を含む、シリカナノ粒子の製造方法である。
【００１３】
（コア粒子の作製）
上記シリカのコア粒子は、機能性分子が結合したオルガノアルコキシシラン（機能性分子結合オルガノアルコキシシラン）と、テトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、加水分解反応と縮重反応とを行わせることで得ることができる。
【００１４】
上記機能性分子結合オルガノアルコキシシランの機能性分子としては、ＴＡＭＲＡ、ローダミン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＧＦＰ等の蛍光分子、ポルフィリン、フタロシアニン等の特定の波長に吸収をもつ色素分子、ルミノール等の発光分子、放射性分子、磁性分子、ｐＨ感受性色素分子、酵素等が挙げられる。機能性分子結合オルガノアルコキシシランは、機能性分子が有する官能基又は活性基とオルガノアルコキシシランが有する官能基又は活性基とを結合させることで調製することが好ましい。該官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等が挙げられ、該活性基としては、スクシンイミド基やマレイミド基が挙げられる。アミノ基とカルボキシル基とは、脱水縮合によってペプチド結合を形成することができる。また、スクシンイミド基及びマレイミド基は、それぞれアミノ基及びチオール基と容易に反応して結合することができる。機能性分子とオルガノアルコキシシランとの結合の具体例としては、例えば、機能性分子にスクシンイミド基を導入し、これを３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）や３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するオルガノアルコキシシランと反応させる方法や、機能性分子にマレイミド基を導入し、これを３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）等のチオール基（メルカプト基）を有するオルガノアルコキシシランと反応させる方法等が挙げられる。機能性分子へのマレイミド基やスクシンイミド基の導入は通常の方法で行うことができる。また、マレイミド基やスクシンイミド基が導入された市販の機能性分子を購入して使用することもできる。スクシンイミド基が導入された市販の機能性分子として、例えば、５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステル、５−カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステル（いずれも商品名、いずれもインビトロジェン社製）が挙げられる。
機能性分子が結合するオルガノアルコキシシランとしては、上記ＡＰＳやＭＰＳの他、トリメトキシフェニルシラン、トリメトキシメチルシラン、３−イソシアネートプロピルエトキシシラン等が挙げられる。
【００１５】
上記テトラアルコキシシランとしては、テトラエトキシラン（ＴＥＯＳ）やテトラメトキシシラン等が挙げられるが、ＴＥＯＳを用いることが好ましい。
上記機能性分子結合オルガノアルコキシシランやテトラアルコキシシランのアルコキシ基は、上記アンモニア水含有溶媒中で加水分解されてヒドロキシル基となり、さらに該ヒドロキシル基が脱水縮合してシロキサン結合を形成する。その結果、オルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が形成される。
【００１６】
上記アンモニア水含有溶媒は好ましくはアンモニア水と親水性溶媒の混合液である。親水性溶媒に特に制限はないが、アルコールであることが好ましく、エタノール又はメタノールであることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。アンモニア水と親水性溶媒の混合割合に特に制限はないが、体積比で、アンモニア水１に対して親水性溶媒３〜２０の混合割合であることが好ましい。上記アンモニア水のアンモニア濃度に特に制限はないが、上記アンモニア水含有溶媒全量に対して１〜２８質量％であることが好ましく、２〜１４質量％であることがより好ましい。アンモニア水含有溶媒のアンモニア濃度が高くなるにしたがって、シリカ粒子の核形成頻度が高まり、また、シリカ粒子の成長速度が速まる。
【００１７】
上記アンモニア水含有溶媒に添加するテトラアルコキシシランの量に特に制限はないが、添加量多すぎると形成されたシリカ粒子の融合が生じやすく、また、添加量が少なすぎるとシリカ粒子の粒度分布が広がりやすい。したがって、上記アンモニア水含有溶媒に添加した際に、４．５〜９０．３ｍＭ（ミリモル／Ｌ）となることが好ましく、９．０〜４５．１ｍＭ（ミリモル／Ｌ）となることがより好ましい。
【００１８】
上記アンモニア水含有溶媒に添加する機能性分子結合オルガノアルコキシシランの量に特に制限はないが、アンモニア水含有溶媒中における上記テトラアルコキシシランとの混合比が、モル比で、テトラアルコキシシラン１に対して機能性分子結合オルガノアルコキシシランが０．０００５〜０．００６０であることが好ましく、０．００１０〜０．００５０であることがより好ましく、０．００１５〜０．００４０であることがさらに好ましい。
【００１９】
機能性分子結合オルガノアルコキシシランと、テトラアルコキシシランとの加水分解反応と縮重反応は、０〜７０℃で行うことが好ましく、３０〜６０℃で行うことがより好ましい。反応時間に特に制限はなく、所望の大きさのコア粒子を得るために適宜調節することができるが、通常には２〜４８時間反応させる。
【００２０】
上記シリカのコア粒子を形成させた上記アンモニア水含有溶媒に、さらにテトラアルコキシシラン及び／又は機能性分子結合オルガノアルコキシシランを添加することで、上記コア粒子をさらに所望の大きさに成長させることもできる。すなわち、本発明の製造方法において、「機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る第１工程」は、コア粒子をさらに所望の大きさに成長させる上記工程を含んでもよい。コア粒子の大きさは１０〜２５０ｎｍとすることが好ましい。
【００２１】
（シェル層の形成）
上記で作製したアンモニア水含有溶媒中のシリカのコア粒子の表面にヒドロキシル基と所望の官能基とを有するシリカのシェル層を形成させることで、表面に該ヒドロキシル基と該所望の官能基を有する本発明のシリカナノ粒子を作製することができる。具体的には、上記で調製した、コア粒子を含有するアンモニア水含有溶媒に、所望の官能基を有する少なくとも１種のオルガノアルコキシシランを添加し、加水分解反応と縮重反応とを行わせることで、表面にヒドロキシル基と上記官能基とを有するシリカのシェル層を形成させることができる。上記官能基が１種類である場合には、当該官能基を有する１種類のオルガノアルコキシシランを添加することで所望のシリカナノ粒子を得ることができる。また、上記官能基が２種以上である場合には各官能基に対応した２種以上のオルガノアルコキシシランを添加することで所望のシリカナノ粒子を得ることができる。上記官能基としては、チオール基、アミノ基、アリール基、アルキル基、イソシアネート基等が挙げられる。上記官能基がチオール基である場合には、ＭＰＳ等のチオール基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができ、上記官能基がアミノ基である場合には、ＡＰＳ等のアミノ基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができ、上記官能基がアリール基である場合には、トリメトキシフェニルシラン等のアリール基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができ、上記官能基がアルキル基である場合には、トリメトキシメチルシラン等のアルキル基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができ、上記官能基がイソシアネート基である場合には、３−イソシアネートプロピルエトキシシラン等のイソシアネート基を有するオルガノアルコキシシランを添加することができる。
【００２２】
また、上記官能基を有するオルガノアルコキシシランの添加に加えて、さらにテトラアルコキシシランを添加してもよい。また、所望により機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランを添加することもできる。
上記官能基を有するオルガノアルコキシシランを、シリカのコア粒子を含むアンモニア水含有溶媒に添加する量に特に制限はないが、モル比で、コア粒子の形成からシェル層の形成を通して（シリカナノ粒子の全製造工程を通して）添加したテトラアルコキシシランと上記官能基を有するオルガノアルコキシシラン総モル数１に対して０．０１〜１．００であることが好ましく、０．０２〜０．８０であることがより好ましく、０．０３〜０．４０であることがさらに好ましい。
また、上記官能基を有するオルガノアルコキシシランの添加の際に添加しうるテトラアルコキシシランの量に特に制限はないが、モル比で、上記官能基を有するオルガノアルコキシシラン１に対して０〜２０であることが好ましく、０〜１０であることがより好ましく、０〜５であることがさらに好ましい。
シェル層を形成させたシリカナノ粒子の大きさは２０〜５００ｎｍとすることが好ましい。
【００２３】
シェル層を形成させる際のアンモニア水含有溶媒中のテトラアルコキシシランの量と上記官能基を有するオルガノアルコキシシランの量を調節することで、シリカナノ粒子表面の官能基の組成や量を調節することができる。シリカナノ粒子表面の官能基の組成や量を調節することで、本発明の製造方法で製造されるシリカナノ粒子の純水中におけるゼータ電位の絶対値は、１〜７０ｍＶに調節されることが好ましく、２０〜７０ｍＶに調節されることがより好ましく、３０〜６０ｍＶに調節されることがさらに好ましく、４５〜５５ｍＶに調節されることが特に好ましい。シリカナノ粒子のゼータ電位（界面動電電位）の絶対値は、シリカナノ粒子の帯電による静電的反発力の大きさと相関がある。ゼータ電位の絶対値が大きいとシリカナノ粒子の溶媒中での分散性が高くなり、分散安定性も高くなる（すなわちシリカナノ粒子の凝集が抑制される）ので、本発明の製造方法により、後述するような標識物質としての使用に適したシリカナノ粒子を提供することができる。しかしながら、ゼータ電位の絶対値が大きすぎると、静電的相互作用によりシリカナノ粒子への生体分子等の非特異的な結合が増大するおそれがあるため、ゼータ電位の絶対値を上記所定の範囲内に調節することが好ましい。ゼータ電位は、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）、ＥＬＳ−Ｚ１（商品名、大塚電子社製）、ＮＩＣＯＭＰ ３８０ＺＬＳ（商品名、ＩＢＣ社製）等を用いて測定することができる。
【００２４】
従来、機能性分子を含有するシリカナノ粒子の表面に官能基を導入するためには、テトラアルコキシシランと機能性分子含有オルガノアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合して形成させたシリカナノ粒子を一旦アンモニア水含有溶媒から、遠心分離、洗浄操作を経て分離し、該分離したシリカナノ粒子を、導入したい官能基を有するオルガノアルコキシシランを含有するアンモニア水含有溶媒中に再度分散するという煩雑な操作を要していた。また、シリカナノ粒子表面に導入した官能基の量が一定した粒子を高い再現性で得るためには粒子表面を該官能基で飽和させる必要がある。その結果、製造されたシリカナノ粒子はその表面の疎水性が高く（ゼータ電位の絶対値が低く）凝集しやすい性質を有するものであった。
これに対し、本発明の方法では、アンモニア水含有溶媒中で形成させたシリカのコア粒子を該アンモニア水含有溶媒から分離せずにその表面に官能基を導入することができるので、従来の方法に比べてより簡便な方法で官能基が導入されたシリカナノ粒子を作製することができる。しかも本発明の方法では、シリカナノ粒子表面の官能基の組成と量を簡単に制御することができるため、上記従来法で作製した官能基を有するシリカナノ粒子よりも粒子表面の親水性を高める（ゼータ電位の絶対値を高める）ことができる。これにより、粒子同士の凝集を抑えることができるため、後述するような用途に適したシリカナノ粒子を提供することができる。
【００２５】
［本発明のシリカナノ粒子］
本発明のシリカナノ粒子は機能性分子を含有し、その表面にヒドロキシル基とそれ以外の官能基とを有する。当該官能基に特に制限がないが、チオール基、アミノ基、アリール基、アルキル基又はイソシアネート基であることが好ましく、チオール基、アミノ基であることがより好ましく、チオール基であることが特に好ましい。本発明のシリカナノ粒子は、ヒドロキシル基以外の官能基を１種有していてもよいし、２種以上有していてもよい。本発明のシリカナノ粒子の純水中におけるゼータ電位の絶対値は１〜７０ｍＶであることが好ましく、２０〜７０ｍＶであることがより好ましく３０〜６０ｍＶであることがさらに好ましく、４５〜５５ｍＶであることが特に好ましい。
本発明のシリカナノ粒子は、上記本発明の製造方法により製造しうる。
【００２６】
本発明のシリカナノ粒子は標識物質として用いることができる。例えば、本発明のシリカナノ粒子表面に生体分子を結合させることで、本発明のシリカナノ粒子を、該生体分子に特異的に結合する分子（標的分子）を検出するための試薬とすることができる。該生体分子と該標的分子との組合せの例としては、抗体と抗原、抗原と抗体、核酸と該核酸に相補的な配列を有する核酸、受容体とリガンド、リガンドと受容体、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン、レクチンと糖鎖、アプタマーと該アプタマーに特異的に結合する分子等が挙げられる。上記生体分子は本発明のシリカナノ粒子表面に直接結合していてもよいし、他の分子を介して間接的に結合していてもよい。
【００２７】
例えば、抗体を結合した本発明のシリカナノ粒子は、該抗体に結合する抗原を検出するための試薬として用いることができる。該抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいが、安定した品質の抗体を安定して供給するためには、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、本発明における抗体には、抗体をペプシンやパパインのようなタンパク質分解酵素で分解し、抗原に対する結合性を維持した、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメントや、２本のＨ鎖同士を結びつけているジスルフィド結合を還元して乖離させて、１本のＨ鎖と１本のＬ鎖からなるフラグメントとしたものも含まれる。また、本発明における抗体には、単鎖抗体やその２量体（ダイアボディー）もしくは３量体（トリアボディー）、又はミニボディーも含まれる。本発明に使用する抗体として、一般的に用いられているマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、トリ由来のもの等が使用できるがこれらに限定されず、抗原に特異的に結合する抗体であれば何れも使用できる。
該抗体の具体例としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ等の腫瘍マーカーに対する抗体、ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原、ｐ２４抗原等の感染症マーカーに対する抗体、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＰＩＣ、ＡＴIII、ＦＭ等の凝固線溶マーカー、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、トロポニン、ＣＲＰ、ＢＮＰ等の心不全マーカーに対する抗体、ＴＳＨ、ｈＣＧ等のホルモン類やインスリン等に対する抗体等が挙げられる。
【００２８】
また、抗原を結合した本発明のシリカナノ粒子は、該抗原に結合する抗体を検出するための試薬として用いることができる。該抗原として、例えば、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗体、ＨＣＶ抗体といった感染症マーカーとなりうる抗体に対する抗原等が挙げられる。
【００２９】
また、核酸を結合した本発明のシリカナノ粒子は、該核酸と相補的な配列を有する核酸を検出するための試薬として用いることができる。本発明のシリカナノ粒子に結合させる核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等が挙げられる。当該核酸が結合した本発明のシリカナノ粒子は、該核酸と相補的な配列を有する核酸を検出するための試薬として用いることができる。
【００３０】
本発明のシリカナノ粒子の表面にアビジンやストレプトアビジンを結合させることで、ビオチンを介して上記生体分子を間接的に結合させることもできる。すなわち、本発明のシリカナノ粒子の表面に結合させたい生体分子にビオチンを結合させ、これをアビジン又はストレプトアビジンが結合した本発明のシリカナノ粒子と接触させることで、アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの特異的結合を介して生体分子を本発明のシリカナノ粒子表面に結合させることができる。
【００３１】
本発明のシリカナノ粒子表面への生体分子の結合は、共有結合であっても非共有結合であってもよい。生体分子をシリカナノ粒子表面に共有結合する方法としては架橋剤を利用する方法が挙げられる。このような架橋剤として、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。
生体分子をシリカナノ粒子表面に非共有結合する方法としては生体分子をシリカナノ粒子表面に吸着させる方法が挙げられる。例えば、生体分子を含む溶液中に本発明のシリカナノ粒子を分散させることで、該生体分子を本発明のシリカナノ粒子の表面に物理的に吸着させることができる。
【００３２】
シリカナノ粒子表面に結合していない余分な生体分子は、遠心分離や限外ろ過等により除くことができる。
【００３３】
生体分子が結合したシリカナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のブロッキング剤で表面をブロッキングすることが好ましい。これにより、検体中に含まれるタンパク質等のシリカナノ粒子表面への非特異的な吸着が抑えられるため、標的分子をより高感度に検出することが可能になる。また、表面をブロッキングすることで、シリカナノ粒子の凝集をより抑制することにもつながる。
【００３４】
シリカナノ粒子の表面に生体分子が結合したことの確認は、生体分子を含む溶液中の該生体分子の量を、シリカナノ粒子を分散させる前と後で比較することでおこなうことができる。生体分子がタンパク質であれば、溶液中の該タンパク質の量を一般的なタンパク質の定量法（ＵＶ法、Ｌｏｗｒｙ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法等）で定量しておき、該溶液にシリカナノ粒子を分散させた後の溶液中のタンパク質の減少量を算出することで、シリカナノ粒子の表面に結合したタンパク質の量を算出することができる。また、生体分子が核酸である場合には、定量ＰＣＲ等により溶液中の核酸を定量することで同様にシリカナノ粒子の表面に結合した核酸の量を算出することができる。
【００３５】
本発明のシリカナノ粒子は、該シリカ粒子の表面に結合した生体分子の活性を維持した状態で長期間保存ができる優れた特性を有する。すなわち、本発明のシリカナノ粒子に生体分子を結合させた粒子を用いて標的分子を検出することで、ヒドロキシル基以外の官能基を有さないシリカナノ粒子に生体分子を結合させた粒子を用いて標的分子を検出する場合に比べて、標的分子をより高感度に検出することができる。親水性であるヒドロキシル基よりも疎水性の強いチオール基やアリール基、アルキル基等が粒子表面に導入されることにより、粒子表面の疎水性が強くなり、生体分子の配向性が安定化する。また、疎水性相互作用により粒子と生体分子の結合が強固になり、生体分子の運動が弱まり、生体分子がより安定した状態で粒子表面と結合する。このため、ヒドロキシル基以外の官能基を有さないシリカナノ粒子に比べ、シリカ粒子の表面に結合した生体分子の活性を維持した状態で長期間保存ができると考えられる。
【００３６】
［本発明の診断キット］
本発明の診断キットは、本発明のシリカナノ粒子表面に生体分子が結合した粒子を含むキットであり、標的分子を検出するために用いられる。以下本発明の診断キットの例について説明する。
（ａ）サンドイッチ免疫測定キット
本発明のシリカナノ粒子の表面に標的分子の第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗体を結合させたシリカナノ粒子と、標的分子の第１のエピトープとは異なるエピトープに特異的に結合する第２の抗体とを含むキットである。第１の抗体と第２の抗体は標的分子を挟んで結合することができる。このキットは抗原抗体反応に適した緩衝液等や、抗原抗体反応を行わせるための容器等を含んでいてもよい。第２の抗体は反応場に固定化されていてもよいし、免疫測定の際に反応場に添加しうる状態で含まれていてもよい。また、第２の抗体は磁性粒子等の担体に結合されていてもよい。第２の抗体が固定化される反応場としてはニトロセルロース等のシート、ガラスや樹脂製の反応容器内壁、ガラスや樹脂製のマイクロチップに形成されたマイクロ流路内壁等が挙げられる。ニトロセルロース等のシートが反応場である診断キットとして、イムノクロマトグラフィー装置（抗体が固定化されたシートを含むテストストリップがハウジングされたイムノクロマト試薬）の形態が例示される。
【００３７】
（ｂ）競合免疫測定キット
本発明のシリカナノ粒子の表面に標的分子が有するエピトープと同一のエピトープを有する標的分子のアナログを結合させたシリカナノ粒子と、該エピトープを特異的に認識する抗体を含むキットである。標的分子と標的分子のアナログは、該抗体に競合的に結合する。このキットは抗原抗体反応に適した緩衝液等や、抗原抗体反応を行わせるための容器等を含んでいてもよい。該抗体は反応場に固定化されていてもよいし、免疫測定の際に反応場に添加しうる状態で含まれていてもよい。また、該抗体は磁性粒子等の担体に結合していてもよい。該抗体が固定化される反応場としては、ニトロセルロース等のシート、ガラスや樹脂製の反応容器内壁、ガラスや樹脂製のマイクロチップに形成されたマイクロ流路内壁等が挙げられる。競合免疫測定キットはエピトープが１つしかないようなペプチドやホルモン等の低分子の標的分子の検出に好適に使用される。
【００３８】
（ｃ）核酸検出キット
本発明のシリカナノ粒子の表面に、標的核酸の連続した１つの領域における塩基配列と相補的な塩基配列を有する第１のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを結合させたシリカナノ粒子と、第１のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとは異なる部位で標的核酸にハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むキットである。第１のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは標的核酸を介して結合する。このキットはハイブリダイゼーション反応に適した緩衝液等や、ハイブリダイゼーション反応を行わせるための容器等を含んでいてもよい。第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは反応場に固定化されていてもよいし、反応場に添加しうる状態で含まれていてもよい。また、第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは磁性粒子等の担体に結合していてもよい。第２のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが固定化される反応場としてはニトロセルロース等のシート、ガラスや樹脂製の反応容器内壁、ガラスや樹脂製のマイクロチップに形成されたマイクロ流路内壁等が挙げられる。ニトロセルロース等のシートが反応場である診断キットとして、イムノクロマトグラフィー装置に準じた形態（イムノクロマトグラフィー装置においてニトロセルロース等のシートに固定化された抗体（抗原）が核酸に置き換わった形態である。便宜上、核酸クロマトグラフィー装置と呼ぶ。）が例示される。
【００３９】
また、目的に応じて、上記例示した診断キットにおける標的分子と該標的分子に特異的に結合する生体分子の組合せを、受容体とリガンド、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、糖鎖とレクチン、アプタマーに特異的に結合する分子と該アプタマー等に置き換えた診断キットも本発明の診断キットに包含される。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
調製例１ 本発明の製造方法による蛍光色素含有シリカナノ粒子の調製
１４質量％のアンモニア水をエタノールで５倍希釈して３．５ｍＬのアンモニア水含有溶媒を調製した。該アンモニア水含有溶媒にＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）３０μＬ（１３５マイクロモル）と、１０ｍＭの濃度になるようにジメチルスルフォキシド（ＤＭＦ）に溶解した５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ１６μＬ（１６０ナノモル）とを添加して、４０℃で３０分攪拌することで蛍光分子含有コア粒子が形成された溶液（以下、コア粒子含有溶液と呼ぶことがある。）を得た。本発明における機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物に該当する上記５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳは、５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステル（商品名、インビトロジェン社製）とＡＰＳ（信越シリコーン社製）とを反応させることで調製した。
【００４２】
上記コア粒子含有溶液に、ＴＥＯＳ３０μＬ（１３５マイクロモル）と、１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＦに溶解した５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ１１μＬ（１１０ナノモル）とを追添し、４０℃で３０分攪拌することでコア粒子にシェル層を形成させ、蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、第１シリカナノ粒子ということがある。）を含む溶液（以下、第１シリカナノ粒子含有溶液ということがある。）を得た。
【００４３】
上記第１シリカナノ粒子含有溶液にＴＥＯＳ１０μＬ（４５マイクロモル）と、１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＦに溶解した５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ５．３μＬ（５３ナノモル）とを追添し、４０℃で３０分攪拌して第１シリカナノ粒子にさらにシェル層を形成させ、蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、第２シリカナノ粒子ということがある。）を含む溶液（以下、第２シリカナノ粒子含有溶液ということがある。）を得た。
【００４４】
第２シリカナノ粒子の表面にメルカプトプロピル基を導入するために、上記第２シリカナノ粒子含有溶液に、表１の条件１の混合比で調製したＭＰＳ（和光純薬株式会社製）とＴＥＯＳの混合液（ＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液）２０μＬを追添した。室温で３０分攪拌することで、表層にヒドロキシル基とメルカプトプロピル基とを有する蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、本発明シリカナノ粒子１という。）を含む溶液（以下、本発明シリカナノ粒子１含有溶液という。）を得た。同様に、表１の条件２及び３の混合比で調製したＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液を添加した蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、それぞれ、本発明シリカナノ粒子２及び３という。）を含む溶液（以下、それぞれ本発明シリカナノ粒子２及び３含有溶液という。）も調製した。
表１中「ＴＥＯＳの総添加量（ＴＥＯＳ＋ＭＰＳ）に対するＭＰＳの添加量」とは、上記全工程を通してアンモニア水含有溶媒に添加したＴＥＯＳの総添加量に対するＭＰＳの添加量を示す。なお、ＭＰＳ／ＴＥＯＳ混合液は追添の直前に調製した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
上記本発明シリカナノ粒子含有溶液１を遠心して本発明シリカナノ粒子１を沈殿させた後、直ちに上清を除去した。続いて沈殿した本発明シリカナノ粒子１をエタノールに再分散し同様の操作をさらに２回繰り返すことで余分なＴＥＯＳ等を洗浄除去した。続いて、エタノールの代わりに蒸留水を用いて同様の洗浄操作を行い、余分な遊離色素を洗浄除去した。こうして洗浄された本発明シリカナノ粒子１を得た。また、本発明シリカナノ粒子含有溶液２及び３についても同様の洗浄操作を行うことで、洗浄された本発明シリカナノ粒子２及び３を得た。
【００４７】
比較例１ ＴＥＯＳ粒子の調製
調製例１の中間生成物である第２シリカナノ粒子を、上記本発明シリカナノ粒子の洗浄操作と同様の洗浄操作に付すことで、表面にヒドロキシル基のみを有する蛍光分子含有シリカナノ粒子（ＴＥＯＳ粒子）を得た。
【００４８】
比較例２ ＭＰＳ粒子の調製
２８質量％のアンモニア水３．５ｍＬにＭＰＳ（和光純薬株式会社製）１５μＬ（８１マイクロモル）と、１０ｍＭの濃度になるようにＤＭＦに溶解した５−カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ８μＬ（８０ナノモル）とを添加して、６０℃で１２０分攪拌することで約３５０ｎｍの蛍光分子含有シリカナノ粒子が形成された溶液を得た。このシリカナノ粒子を、上記本発明シリカナノ粒子の洗浄操作と同様の洗浄操作に付すことで、ＴＥＯＳを含まない蛍光分子含有シリカナノ粒子（ＭＰＳ粒子）を得た。比較例２で得られたシリカナノ粒子は構成成分としてＴＥＯＳを含まないため、その表面に存在するヒドロキシル基の数は、本発明シリカナノ粒子よりも格段に少ない。
【００４９】
比較例３ 従来法によりＭＰＳ修飾されたシリカナノ粒子の調製
調製例１の中間生成物である第２シリカナノ粒子含有溶液１ｍＬに、５．８ｍＭ ＭＰＳを０．１ｍＬ添加し、室温で一晩攪拌することで第２シリカナノ粒子表面をＭＰＳで修飾した。こうして得られた蛍光分子含有シリカナノ粒子を、上記本発明シリカナノ粒子の洗浄操作と同様の洗浄操作に付すことで、ＴＥＯＳ粒子の表面がＭＰＳで修飾された蛍光分子含有シリカナノ粒子を得た。
【００５０】
試験例１ ゼータ電位の測定
本発明シリカナノ粒子１〜３、比較例１のＴＥＯＳ粒子及び比較例２のＭＰＳ粒子についてゼータ電位の測定を行った。ゼータ電位の測定は、ゼータサイザーナノ（商品名、マルバーン社製）により実施した。結果を図１に示す。
図１より、表面にメルカプトプロピル基を有さないＴＥＯＳ粒子のゼータ電位の絶対値が最も高く（約−５８ｍＶ）、次いで本発明シリカナノ粒子１（約−５６ｍＶ）、本発明シリカナノ粒子２（約−５２ｍＶ）、本発明シリカナノ粒子３（約−４９ｍＶ）、ＭＰＳ粒子（約−１２ｍＶ）の順にゼータ電位の絶対値が小さいことがわかる。すなわち、シリカナノ粒子表面のメルカプトプロピル基の数が増加するにしたがってゼータ電位の絶対値が小さくなることがわかった。
また、比較例３のシリカナノ粒子のゼータ電位についても測定したところ、その値は−１５ｍＶであり、ＭＰＳ粒子と同様低いゼータ電位の絶対値を示した。
【００５１】
試験例２ 蛍光強度の測定
本発明シリカナノ粒子１〜３、比較例１のＴＥＯＳ粒子、比較例２のＭＰＳ粒子及び比較例３の蛍光分子含有シリカナノ粒子について蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の測定は、蛍光分光光度計ＦＰ−６５００（商品名、日本分光社製）を用いて、５３０ｎｍの励起光を照射したときに発する５５５ｎｍの蛍光を測定することで行った。その結果、本発明シリカナノ粒子１〜３は、ＴＥＯＳ粒子と同程度の蛍光強度を示すことがわかった。一方、ＭＰＳ粒子及び比較例３のシリカナノ粒子は凝集しやすく、測定溶媒に分散させることができず、測定が不可能であった。ＭＰＳ粒子と比較例３のシリカナノ粒子は、粒子表面のゼータ電位の絶対値が１５程度と小さい。すなわち、表面の疎水性が高いために、粒子同士の疎水的相互作用によって凝集が起こりやすいと考えられる。
【００５２】
試験例３ 免疫測定試薬への応用
本発明シリカナノ粒子１〜３及び比較例１のＴＥＯＳ粒子について、その表面に抗体を結合させて、イムノクロマトグラフィー試薬としての性能を比較した。なお、比較例２のＭＰＳ粒子及び比較例３のシリカナノ粒子については、水溶液中で凝集してしまうため、本試験に用いることができなかった。
【００５３】
［抗体の吸着］
本発明シリカナノ粒子１を５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように蒸留水中に分散させた。この分散液１００μＬと、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）３９０μＬとをマイクロチューブに入れて軽く攪拌した。この混合液に５．８ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８，Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１０μＬを加え、室温で１０分間穏やかに混合することで、抗ｈＣＧ抗体を本発明シリカナノ粒子１に吸着させた。続いてこの混合液に１％のポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を２００μＬ加えて軽く攪拌し、さらに１０％ＢＳＡを２００μＬ加えて軽く混合した。混合液を遠心分離して粒子を沈殿させた後、上清を取り除いた。ここに、保存用バッファーとして、０．０５％ ＰＥＧ（分子量２００００）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ及び０．１％ ＮａＮ３を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を１ｍＬ加え、再度遠心分離して上清を取り除いた。ここに、蒸留水５００μＬと、塗布バッファーとして、０．０５％ ＰＥＧ（分子量２００００）、５％スクロースを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を５００μＬ加えて粒子を分散させ、表面に抗ｈＣＧ抗体が結合した蛍光分子含有シリカナノ粒子（以下、抗体結合シリカナノ粒子と呼ぶ。）の分散溶液を得た。
【００５４】
［コンジュゲートパッドの作製］
Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）１枚（８ｍｍ×１５０ｍｍ）に付き、上記抗体結合シリカナノ粒子の分散溶液０．８ｍＬを均一に塗布した。これをデキケーター内で、室温下で一晩減圧乾燥した。こうして抗体結合シリカナノ粒子を均一に含有するコンジュゲートパッドを作製した。
【００５５】
［抗体固定化メンブレンの作製］
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の中央付近（サンプルパッド側の端から約１２ｍｍ）に約１ｍｍ幅のテストラインを作製した。具体的には、抗ｈＣＧ抗体（ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＦＳＨ（ＬＨ），ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅ／６６０１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、５％スクロースを含む５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）溶液に溶解し、これを０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
続いて、メンブレンのサンプルパッド側の端から約１６ｍｍに約１ｍｍ幅のコントロールラインを作製した。具体的には、抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０、シュガーフリー）溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
上記のようにテストラインとコントロールラインを形成させたメンブレンを５０℃で３０分乾燥させた。
【００５６】
続いて、上記乾燥後のメンブレンをブロッキングバッファー（組成：１００ｍＭホウ酸（ｐＨ８．５）、１重量％カゼイン）中に室温で３０分浸すことでメンブレンをブロッキングした。ブロッキング後のメンブレンをメンブレン洗浄／安定バッファー（組成：１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）、１重量％スクロース、０．１％コール酸ナトリウム）に移し、室温で３０分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上において室温で一晩乾燥させることで、抗体固定化メンブレンを作製した。
【００５７】
［テストストリップの作製］
上記コンジュゲートパッドと、上記抗体固定化メンブレンと、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）と、吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）とを、バッキングシート（商品名：ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立て、幅５ｍｍ、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、図２ａ及び図２ｂに示す構成のテストストリップを得た。
【００５８】
［抗体結合シリカナノ粒子の抗体活性評価］
上記テストストリップのサンプルパッドに０．５ＩＵ／ＬのリコンビナントｈＣＧ（ロート製薬社製）を１００μＬ滴下して１分静置した後、テストストリップの蛍光をＣＣＤ検出器（Ｃ２７４１−３５Ａ（商品名、浜松ホトニクス社製）を用いて画像化した。蛍光の検出は、励起光源側のフィルタとしてＦＦ０１−４８２（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製）、検出器側のフィルタとしてＦＦ０１−５３６（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製）を用いて、テストストリップを水銀ランプ（１０３Ｗ）で照射することで行った。
作製直後並びに作成後１６日及び２５日経過後のテストストリップを用いてテストラインの蛍光強度を比較した結果を図３に示す。なお、図３中のプロットは抗体活性評価試験３回分の平均値を示し、図中のエラーバーは標準偏差を示す。
【符号の説明】
【００５９】
１ テストストリップ
２ サンプルパッド
３ コンジュゲートパッド
４ ニトロセルロースメンブレン
４１ テストライン
４２ コントロールライン
５ 吸収パッド
６ バッキングシート
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る第１工程、及び
第１工程で得られた分散液に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基を有するオルガノアルコキシシランを添加してシリカのコア粒子にシェル層を形成させる第２工程、
を少なくとも含む、表面が前記官能基で修飾されたシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
第２工程でさらにテトラアルコキシシランを添加する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記官能基がチオール基である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記チオール基を有するオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
第２工程で添加されるオルガノアルコキシシラン及び／又はテトラアルコキシシランの添加量を調節することによりシリカナノ粒子の純水中におけるゼータ電位の絶対値を２０〜７０ｍＶに調節する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
機能性分子が蛍光分子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法により製造しうるシリカナノ粒子。
【請求項８】
表面に、ヒドロキシル基と、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基とを有し、純水中におけるゼータ電位の絶対値が２０〜７０ｍＶである、機能性分子を含有するシリカナノ粒子。
【請求項９】
前記官能基がチオール基である、請求項８に記載のシリカナノ粒子。
【請求項１０】
表面に生体分子が結合している、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシリカナノ粒子。
【請求項１１】
生体分子がタンパク質である、請求項１０に記載のシリカナノ粒子。
【請求項１２】
タンパク質が抗体又は抗原である、請求項１１に記載のシリカナノ粒子。
【請求項１３】
請求項１０〜１２に記載のシリカナノ粒子を含む診断キット。
【請求項１４】
診断キットがイムノクロマトグラフィー装置である、請求項１３に記載の診断キット。
【請求項１】
機能性分子が結合したオルガノアルコキシシランとテトラアルコキシシランとをアンモニア水含有溶媒中で混合し、該溶媒中に該機能性分子を含有するシリカのコア粒子を形成させて該コア粒子の分散液を得る第１工程、及び
第１工程で得られた分散液に、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基を有するオルガノアルコキシシランを添加してシリカのコア粒子にシェル層を形成させる第２工程、
を少なくとも含む、表面が前記官能基で修飾されたシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
第２工程でさらにテトラアルコキシシランを添加する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記官能基がチオール基である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記チオール基を有するオルガノアルコキシシランが、メルカプトプロピル基を有するオルガノアルコキシシランである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
第２工程で添加されるオルガノアルコキシシラン及び／又はテトラアルコキシシランの添加量を調節することによりシリカナノ粒子の純水中におけるゼータ電位の絶対値を２０〜７０ｍＶに調節する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
機能性分子が蛍光分子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法により製造しうるシリカナノ粒子。
【請求項８】
表面に、ヒドロキシル基と、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、アルキル基、アリール基、エポキシ基、ビニル基、メタクリル基、シアノ基、ハロゲン基、ウレイド基、アクリロキシ基、及びポリスルフィド基からなる群から選択される官能基とを有し、純水中におけるゼータ電位の絶対値が２０〜７０ｍＶである、機能性分子を含有するシリカナノ粒子。
【請求項９】
前記官能基がチオール基である、請求項８に記載のシリカナノ粒子。
【請求項１０】
表面に生体分子が結合している、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシリカナノ粒子。
【請求項１１】
生体分子がタンパク質である、請求項１０に記載のシリカナノ粒子。
【請求項１２】
タンパク質が抗体又は抗原である、請求項１１に記載のシリカナノ粒子。
【請求項１３】
請求項１０〜１２に記載のシリカナノ粒子を含む診断キット。
【請求項１４】
診断キットがイムノクロマトグラフィー装置である、請求項１３に記載の診断キット。
【図１】
【図３】
【図２】
【図３】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２２５３８１（Ｐ２０１１−２２５３８１Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９４０７１（Ｐ２０１０−９４０７１）
【出願日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（０００００５２９０）古河電気工業株式会社 (4,457)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（０００００５２９０）古河電気工業株式会社 (4,457)
【Ｆターム（参考）】
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