表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を使用した微生物鑑定またはその形態変化検出方法

【課題】微生物の種類と菌株の区別、抗生物質または抗菌剤の細菌細胞に対する影響の鑑定、結核病の感染の検出を可能にする、微生物鑑定またはその形態変化検出方法を提供する。
【解決手段】微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置し、固定液で微生物を固定して微生物のＳＥＲＳスペクトルを取得し、該ＳＥＲＳスペクトルを分析して曲線図を生成する。微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出するために、微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置し、固定液で微生物を固定し、微生物に対し有効量の抗菌剤または感染性病原体を加えて微生物のＳＥＲＳスペクトルを取得し、ＳＥＲＳスペクトルと対照群（抗菌剤または感染性病原体を加えていない）のＳＥＲＳスペクトルを比較し、少なくとも１つの新ピークを取得し、抗菌剤または感染性病原体の影響を鑑定する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し、微生物の鑑定及び抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化の検出を行う方法及び装置に関するものである。本発明はさらに臨床検査において結核菌を検出する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光法を用いた細菌及び真菌の迅速な鑑定には、多くの人々が興味を寄せており、すでに非常に潜在性のある全有機体フィンガープリント技術として認識されている。Jarvisらによる増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）の研究は、凝集した銀コロイド基板をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中の関係が近い細菌群の分析に採用している（Ｒ. Ｍ. Ｊａｒｖｉｓ，Ａ．ＢｒｏｏｋｅｒｂａｎｄＲ．Ｇｏｏｄａｃｒｅ，ＦａｒａｄａｙＤｉｓｃｕｓｓ．，２００６, １３２, ２８１-２９２.）。結果はＳＥＲＳ分光法には正確に菌株（ｓｔｒａｉｎ）レベルの鑑定ができるほど高い識別力があることを示している。
【０００３】
しかしながら、コロイド基板を使用するこの方法は、再現性と安定性において、ナノ粒子を埋設したまたはナノ粒子に被覆された固体薄膜を使用する方法ほど優れていない。
【０００４】
Ｐｒｅｍａｓｉｒｉらの研究において、新規金ナノ粒子（約８０ｎｍ）で被覆した二酸化ケイ素基板を使用した場合、一部の細菌の種類（ｓｐｅｃｉｅｓ）及び菌株（ｓｔｒａｉｎｓ）のＳＥＲＳは７８５ｎｍで励起されることが報告されている（Ｗ．Ｒ．Ｐｒｅｍａｓｉｒｉ，Ｄ．Ｔ．Ｍｏｉｒ，Ｍ．Ｓ．Ｋｌｅｍｐｎｅｒ，Ｎ．Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｇ．ＪｏｎｅｓＩＩ，ａｎｄＬ．Ｄ．Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００５, １０９, ３１２-３２０）。結果では、ＳＥＲＳの振動信号（ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）とＳＥＲＳ活性基板の形態および性質が強い関連性を持つことが示されている。これらの結果は、金粒子で被覆したガラス状基板上でのＳＥＲＳを用いた細菌性病原体の種類及び株特異性の検出及び鑑定における潜在性を証明している。
【０００５】
この領域を熟知した技術者であれば理解できるように、Ｐｒｅｍａｓｉｒｉらの方法に基づくと、ＳＥＲＳ信号を獲得する前に、まず固体基板上の細菌懸濁液を乾燥させる必要がある。さもなければ、細菌の移動が結果に影響を与えてしまう。
【０００６】
近年、新しい抗菌剤の数がすでに大幅に減少しており、それに伴って多剤耐性病原体が増加している。薬理材料の作用モードの特性を迅速かつ高い信頼性で特徴付けられる先進科学技術を運用し、新しい抗生物質を発見することは非常に重要な挑戦である。ＳＥＲＳを使用した抗生物質の細菌に対する影響をモニタリングすることは、新しい抗生物質の開発とスクリーニングの有効な方法である。この方法を達成するため、細菌を有水環境で培養し、抗生物質中に暴露する必要がある。
【０００７】
結核病（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＴＢ））は、結核菌（主にヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））により引き起こされる普遍的な致命的伝染病である。結核病は肺部に損傷を与えることが最も多いが、中枢神経系やリンパ系、循環器系、泌尿生殖器系、骨、関節、皮膚にも影響を与える。現在、結核病の診断にはツベルクリン皮膚検査、血清検査、微生物塗布標本と培養、胸部Ｘ線、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などが含まれる。
【０００８】
現在使用されている検査方法は、臨床診療において迅速に結核菌（ＴｕｂｅｒｃｌｅＢａｃｉｌｌｕｓ）を検出する、または迅速に治療成果を確認するというニーズを満たすことができない。上述から分かるように、より迅速かつ高感度の検査方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒ. Ｍ. Ｊａｒｖｉｓ，Ａ．ＢｒｏｏｋｅｒｂａｎｄＲ．Ｇｏｏｄａｃｒｅ，ＦａｒａｄａｙＤｉｓｃｕｓｓ．，２００６, １３２, ２８１-２９２.
【非特許文献２】Ｗ．Ｒ．Ｐｒｅｍａｓｉｒｉ，Ｄ．Ｔ．Ｍｏｉｒ，Ｍ．Ｓ．Ｋｌｅｍｐｎｅｒ，Ｎ．Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｇ．ＪｏｎｅｓＩＩ，ａｎｄＬ．Ｄ．Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００５, １０９, ３１２-３２０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、（１）微生物の種類と菌株を区別する、（２）抗生物質または抗菌剤の細菌細胞に対する影響を鑑定する、及び（３）結核病の感染を検出することを可能にする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を使用した微生物鑑定またはその形態変化検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し、微生物を鑑定する方法は、（ａ）微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置する、（ｂ）固定液で微生物を固定する、（ｃ）手順（ｂ）中の微生物のＳＥＲＳスペクトルを取得する、及び（ｄ）該ＳＥＲＳスペクトルを分析して微生物の曲線図を生成する、という手順を含む。
【００１２】
本発明の最良の実施例において、ＳＥＲＳ活性基板は、ナノ粒子を埋設した、またはナノ粒子に被覆された固体薄膜とする。該ナノ粒子は、金、銀、銅、白金、銀／金、白金／金、銅／金のコアシェル及び合金粒子から構成されるグループから選択する。より良い実施例においては、銀／陽極酸化アルミ（ＡＡＯ）基板を採用する（王玉麟教授より銀充填多孔陽極酸化アルミナノチャンネル（Ｓｉｌｖｅｒ‐ｆｉｌｌｅｄｐｏｒｏｕｓａｎｏｄｉｃａｌｕｍｉｎｕｍｏｘｉｄｅｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌｓ）の提供を受けた）。
【００１３】
本発明において言及する固定液は、微生物を移動できなくすると共に、その生命を有水環境中で維持させるものである。最良の実施例において、該固定液はアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ）とグリセロールから構成されるグループから選択する。一実施例において、固定液に採用する濃度は、０.０５％〜５％のアガロースゲルとする。良い実施例において、固定液に採用する濃度は、０.１％〜３％のアガロースゲルとする。より良い実施例において、固定液に採用する濃度は、０.２％〜１.５％のアガロースゲルとする。最良の実施例において、固定液に採用する濃度は、０.３％〜０.８％のアガロースゲルとする。
【００１４】
本発明において言及する曲線図（ｐｒｏｆｉｌｅ）は、パターン認識システム（ＰａｔｔｅｒｎＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）の補助により微生物の種類または菌株の鑑定に応用される。
【００１５】
本発明において言及する微生物は、細菌、真菌、細胞を含み、またこれらに限らない。
【００１６】
グラム菌特定フィンガープリントとすることができるラマンシフト（４００ｃｍ‐１〜１６００ｃｍ‐１）に基づき、本発明において言及する曲線図（ｐｒｏｆｉｌｅ）は、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の区別に応用することができる。最良の実施例において、区別ができる範囲は５００ｃｍ‐１〜９００ｃｍ‐１及び１１００ｃｍ‐１〜１５００ｃｍ‐１である。また、未知の細菌と既知の細菌を比較するＳＥＲＳスペクトルも区別の目的を達することができる。
【００１７】
また、本発明が提供する表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法は、（ａ）微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置する、（ｂ）固定液で微生物を固定する、（ｃ）微生物に対し有効量の抗菌剤または感染性病原体を加える、（ｄ）手順（ｃ）中の微生物のＳＥＲＳスペクトルを取得する、及び（ｅ）手順（ｄ）のＳＥＲＳスペクトルと対照群（抗菌剤または感染性病原体を加えていない）のＳＥＲＳスペクトルを比較し、少なくとも１つの新ピークを取得し、抗菌剤または感染性病原体の影響を鑑定する、という手順を含む。
【００１８】
最良の実施例において、ＳＥＲＳ活性基板はナノ粒子を埋設した、またはナノ粒子に被覆された固体薄膜とする。該ナノ粒子は、金、銀、銅、白金、銀／金、白金／金、銅／金のコアシェル及び合金粒子から構成されるグループから選択する。より良い実施例においては、銀／陽極酸化アルミ（ＡＡＯ）基板を採用する（王玉麟教授より銀充填多孔陽極酸化アルミナノチャンネル（Ｓｉｌｖｅｒ‐ｆｉｌｌｅｄｐｏｒｏｕｓａｎｏｄｉｃａｌｕｍｉｎｕｍｏｘｉｄｅｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌｓ）の提供を受けた）。
【００１９】
本発明中において言及する固定液は、微生物を移動できなくすると共に、その生命を有水環境中で維持させるものである。最良の実施例において、該固定液はアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ）とグリセロールから構成されるグループから選択する。一実施例において、固定液に採用する濃度は、０.０５％〜５％のアガロースゲルとする。良い実施例において、固定液に採用する濃度は、０.１％〜３％のアガロースゲルとする。より良い実施例において、固定液に採用する濃度は、０.２％〜１.５％のアガロースゲルとする。最良の実施例において、固定液に採用する濃度は、０.３％〜０.８％のアガロースゲルとする。
【００２０】
一実施例において、前記抗菌剤はアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、バシトラシン（ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、セファロスポリン（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）、サルファ剤（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、及びゼオシン（ｚｅｏｃｉｎｅ）（ブレオマイシン系糖タンパク抗生物質）から構成されるグループから選択する。
【００２１】
本発明で言及する感染性病原体は、ウイルスまたは伝染性細菌を含み、またこれに限らない。
【００２２】
前記方法は、新しい抗生物質の開発及びスクリーニングに応用することができる。
【００２３】
対照群のＳＥＲＳスペクトルと比較してスペクトル上で相対密度の変化が発生した位置を調べ、該方法を抗菌剤または感染性病原体の抗菌機制の予測に応用することができる。
【００２４】
本発明はさらに表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物曲線図を生成する装置を提供する。この装置は、（ａ）微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置する手段、（ｂ）微生物を固定する手段、（ｃ）手順（ｂ）中の微生物ＳＥＲＳスペクトルを取得する手段、及び（ｄ）該ＳＥＲＳスペクトルを分析して微生物曲線図を生成する手段を含む。
【００２５】
本発明はさらに表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生する形態変化を検出する装置を提供する。この装置は、（ａ）微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置する手段、（ｂ）微生物を固定する手段、（ｃ）微生物に対し有効量の抗菌剤または感染性病原体を加える手段、（ｄ）手順（ｃ）中の微生物のＳＥＲＳスペクトルを取得する手段、及び（ｅ）手順（ｄ）のＳＥＲＳスペクトルと対照群（抗菌剤または感染性病原体を加えていない）のＳＥＲＳスペクトルを比較し、少なくとも１つの新ピークを取得し、抗菌剤または感染性病原体の影響を鑑定する手段、を含む。
【００２６】
本発明は微生物が新しい銀／陽極酸化アルミ基板上に置かれたとき、良好な信号対ノイズ比（ｓｉｇｎａｌ-ｔｏ-ｎｏｉｓｅ）と再現可能なラマン分光を取得することができることをはっきりと証明する。ＳＥＲＳフィンガープリントで細菌の種類をはっきり特別する。このほか、ＳＥＲＳフィンガープリントは抗生物質の処理を経た細菌スペクトルも区別することができる。このため、ＳＥＲＳは新しい抗生物質の開発とスクリーニングの強力かつ有力な方法とすることができる。
【００２７】
本発明は結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）サンプルをＳＥＲＳ活性基板上に置く、（ｂ）固定液でサンプルを固定する、（ｃ）手順（ｂ）中のサンプルのＳＥＲＳスペクトルを取得する、（ｄ）該ＳＥＲＳスペクトルを分析してサンプルの曲線図を生成する、（ｅ）サンプルのＳＥＲＳスペクトルとグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のＳＥＲＳスペクトルを比較する、という手順を含む。
【００２８】
本発明で言及するサンプルは、血液、血漿、血清、痰、尿液、脳脊髄液、胸膜液（ｐｌｅｕｒａｆｌｕｉｄ）、組織液を含むが、これらに限らない。最良の実施例において、サンプルは血液、血漿、血清、痰、尿液とする。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】大腸菌ＪＭ１０９及びその突然変異体大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）のＳＥＲＳスペクトルの比較図である。
【図２】大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）及び腸球菌７-１８ｕＥのＳＥＲＳスペクトルの比較図である。
【図３Ａ】グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。（ａ）図はグラム陽性細菌（腸球菌１３６３１、黄色ブドウ球菌１３６４９、黄色ブドウ球菌１３６１５、無乳性レンサ球菌１３６４０、腸球菌７-１８ｕＥ、腸球菌１３６４１Ｃ２）のＳＥＲＳスペクトルを示す。（ｂ）図はグラム陰性細菌（大腸菌ＪＭ１０９（野生型）、大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）、クレブシエラ肺炎桿菌１３６４１Ｃ１、ミラビリス変形菌１３６２１Ｃ１、エンテロバクター・クロアカ１３４５７Ｃ２、大腸菌１３５９４Ｃ１、大腸菌１３６５０、及び大腸菌１３６３４）のＳＥＲＳスペクトルを示す。
【図３Ｂ】グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。（ａ）図はグラム陽性細菌（腸球菌１３６３１、黄色ブドウ球菌１３６４９、黄色ブドウ球菌１３６１５、無乳性レンサ球菌１３６４０、腸球菌７-１８ｕＥ、腸球菌１３６４１Ｃ２）のＳＥＲＳスペクトルを示す。（ｂ）図はグラム陰性細菌（大腸菌ＪＭ１０９（野生型）、大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）、クレブシエラ肺炎桿菌１３６４１Ｃ１、ミラビリス変形菌１３６２１Ｃ１、エンテロバクター・クロアカ１３４５７Ｃ２、大腸菌１３５９４Ｃ１、大腸菌１３６５０、及び大腸菌１３６３４）のＳＥＲＳスペクトルを示す。
【図４Ａ】グラム陽性細菌（無乳性レンサ球菌１３６４０と黄色ブドウ球菌１３６１５）及びグラム陰性細菌（エンテロバクター・クロアカ１３４５７Ｃ２とミラビリス変形菌１３６２１Ｃ１）の連続ＳＥＲＳスペクトル検出を示す図である。（ａ）図はグラム陽性細菌（無乳性レンサ球菌１３６４０と黄色ブドウ球菌１３６１５）のスペクトルを示す。（ｂ）図はグラム陰性細菌（エンテロバクター・クロアカ１３４５７Ｃ２とミラビリス変形菌１３６２１Ｃ１）のスペクトルを示す。
【図４Ｂ】グラム陽性細菌（無乳性レンサ球菌１３６４０と黄色ブドウ球菌１３６１５）及びグラム陰性細菌（エンテロバクター・クロアカ１３４５７Ｃ２とミラビリス変形菌１３６２１Ｃ１）の連続ＳＥＲＳスペクトル検出を示す図である。（ａ）図はグラム陽性細菌（無乳性レンサ球菌１３６４０と黄色ブドウ球菌１３６１５）のスペクトルを示す。（ｂ）図はグラム陰性細菌（エンテロバクター・クロアカ１３４５７Ｃ２とミラビリス変形菌１３６２１Ｃ１）のスペクトルを示す。
【図５】抗生物質敏感株大腸菌ＪＭ１０９のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。処理を経ていないＪＭ１０９スペクトルと比較し、１０ μｇ／ｍｌアンピシリン処理３５分間を経たＪＭ１０９は、そのスペクトルが７００ｃｍ−１で新ピークがあり、アンピシリンによる新分子結合の振動を証明している。
【図６】抗生物質敏感株大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。処理を経ていないＪＭ１０９（突然変異体）スペクトルと比較し、２５ μｇ／ｍｌバシトラシン処理４８分間を経たＪＭ１０９（突然変異体）は、そのスペクトルが７００ｃｍ−１で新ピークがあり、バシトラシンによる新分子結合の振動を証明している。
【図７】抗生物質敏感株黄色ブドウ球菌１３６４９のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。２５ μｇ／ｍｌバンコマイシン処理５４分間を経た後、８００ cm-１〜１５００ｃｍ−１で出現した新ピークは、バンコマイシンによる新分子結合の振動を証明している。
【図８】抗生物質敏感株大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。処理を経ていないＪＭ１０９（突然変異体）スペクトルと比較し、５０ μｇ／ｍｌテトラサイクリン処理を経たＪＭ１０９（突然変異体）は、そのスペクトルが４４０ｃｍ−１及び１２４２ｃｍ−１で新ピークがあり、異なる時間点におけるテトラサイクリンによる新分子結合の振動を証明している。
【図９】抗生物質敏感株大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。処理を経ていないＪＭ１０９（突然変異体）スペクトルと比較し、５０ μｇ／ｍｌテトラサイクリン処理を経たＪＭ１０９（突然変異体）は、そのスペクトルが４１８ｃｍ−１、５６５ｃｍ−１、８３３ｃｍ−１、９０５ｃｍ−１、１２２５ｃｍ−１で新ピークがあり、異なる時間点におけるテトラサイクリンによるいくつかの新分子結合の振動を証明している。
【図１０】抗生物質敏感株大腸菌１３６５０のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。２５ μｇ／ｍｌのゲンタマイシン処理３７分間を経た後、４１８ｃｍ−１及び８００ｃｍ−１〜１５００ｃｍ−１で出現した新ピークは、ゲンタマイシンによる新分子結合の振動を証明している。
【図１１】薬剤耐性株腸球菌７-１８ｕＥのＳＥＲＳスペクトルを示す図である。アンピシリンまたはバシトラシン処理を経た後の７-１８ｕＥスペクトル上にはいかなる変化も観察されず、７-１８ｕＥの薬剤耐性を証明している。
【図１２】グラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び結核菌のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。
【図１３】対数期開始段階（ＯＤ６００＝０.４）、静止期接近（ＯＤ６００＝１.５）または静止期（ＯＤ６００＝２.０）にある大腸菌のＳＥＲＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は異なる形式で実施することが可能であり、以下の文中で言及する実施例のみに限られない。以下の実施例は本発明の異なる面及び特徴を示す代表的なものである。
【実施例１】
【００３１】
実施例１：材料と方法
細菌サンプルと抗生物質の準備
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９、大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）７-１８ｕＥ、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ）１３６３１、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）１３６４９、黄色ブドウ球菌１３６１５、無乳性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）１３６４０、腸球菌１３６４１Ｃ２、クレブシエラ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）１３６４１Ｃ１、ミラビリス変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）１３６２１Ｃ１、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）１３４５７Ｃ２、大腸菌１３５９４Ｃ１、大腸菌１３６５０、大腸菌１３６３４等の１４個の実験室株を分析した。細菌を５ｍｌのＬＢブロス中でＯＤ６００値がほぼ０.５に等しくなるまで培養した（約６時間）。PBSで５回洗浄した後、それを０.１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。約３〜５μlの細菌懸濁液を銀／陽極酸化アルミ基板上に置いた。０.５％のアガロースゲルを使用して細菌サンプルを固定し、細菌の移動を抑制した。実施例においてはアンピシリン、バシトラシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン等五種類の抗生物質を使用した。前の三種類は細菌の細胞壁の形成に干渉することができ、後の二種類はｔＲＮＡとリボソームの連結を中断することで細菌中の蛋白質の合成を抑制するものである。
【００３２】
ラマン顕微鏡学及び高度ラマン増強の基板
ジョバン・イボン・ラマン顕微鏡（ＪｏｂｉｎＹｖｏｎＲａｍａｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（型番ＬａｂＲＡＭＨＲ８００）を使用して６３２.８ｎｍヘリウム−ネオンレーザーで励起される散乱を観察した。スペクトルデータの採集時間は約１〜１０秒の範囲とし、１００倍の顕微鏡対物レンズでＳＥＲＳスペクトルを収集した。銀／陽極酸化アルミ基板は、一部に陽極酸化アルミナノチャンネルが埋設された、銀ナノ粒子アレイから成るＳＥＲＳ活性基板とした。該基板は極めて高いラマン信号増強因子を示した（（Ｈ．Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ｂ．Ｗｕ，Ｎ．Ｗ．Ｌｉｕ，Ｃ．Ｙ．Ｐｅｎｇ，Ｔ．Ｈ．Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｆ．Ｈｓｕ，Ｊ．Ｋ．Ｗａｎｇ，ａｎｄＹ．Ｌ．Ｗａｎｇ，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００６, １８, ４９１-４９５）。
【００３３】
信号分析
パターン認識システムを使用してＳＥＲＳで取得したすべての信号を分析した。パターン認識システム（ＰａｔｔｅｒｎＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）は学習機能を備え、先の知識またはパターンの統計資料を基礎として、データ（パターン）の分類の補助とすることができるものであり、分類または描写したい観察資料（例：ＳＥＲＳ）を収集するセンサ、観察資料の数字または符号情報を計算する特徴抽出メカニズム、実際に観察資料の分類または描写を行う分類・描写スキーム、及び分類効率の推定と検査の補助をするこのクラスタリング法の誤差推定メカニズムを含む。
【００３４】
本発明において採用する特徴抽出方法は、（ａ）２０９０個の原始データから得られたＳＥＲＳ平均値に基づき、各サンプルを標準化すると共にベクトル１.０としてまとめる、（ｂ）手順（ａ）で得られたデータの対数を取る、（ｃ）２０９０個のデータ中の最強信号部分の総和をベクトル１.０として標準化する、（ｄ）手順（ｃ）のデータから最も区別性のある部分を取り出す、という手順を含む。
【００３５】
本発明において採用した分類法はK平均アルゴリズム（Ｋ‐ｍｅａｎｓａｌｇｏｒｉｔｈｍ）及びサポートベクトルマシン（ＳｕｐｐｏｒｔＶｅｃｔｏｒＭａｃｈｉｎｅ）である。
【実施例２】
【００３６】
実施例２：ＳＥＲＳ曲線図の生成を利用した細菌の異なる菌株の鑑定。
図１に示すように、大腸菌ＪＭ１０９株及び大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）株のＳＥＲＳスペクトルを取得した。野生型株ＪＭ１０９と突然変異株ＪＭ１０９のスペクトルは明らかに互いに異なり、ＳＥＲＳが異なる菌株の細菌の検出と鑑定時に株特異性を備えていることを証明した。
【実施例３】
【００３７】
実施例３：ＳＥＲＳ曲線図の生成を利用した細菌の異なる種類の鑑定。
図２に示すように、大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）株及び腸球菌７-１８ｕＥ株のＳＥＲＳスペクトルを取得する。大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）と腸球菌７-１８ＵＥのスペクトルは明らかに互いに異なり、ＳＥＲＳが異なる種類の細菌の検出と鑑定時に種類特異性を備えていることを証明した。
【実施例４】
【００３８】
実施例４：曲線図の生成を利用したグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の鑑定。
図３に示すように、グラム陽性細菌（腸球菌１３６３１、黄色ブドウ球菌１３６４９、黄色ブドウ球菌１３６１５、無乳性レンサ球菌１３６４０、腸球菌７-１８ｕＥ、腸球菌１３６４１Ｃ２）及グラム陰性細菌（大腸菌ＪＭ１０９（野生型）、大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）、クレブシエラ肺炎桿菌１３６４１Ｃ１、ミラビリス変形菌１３６２１Ｃ１、エンテロバクター・クロアカ１３４５７Ｃ２、大腸菌１３５９４Ｃ１、大腸菌１３６５０、及び大腸菌１３６３４）のＳＥＲＳスペクトルを取得した。グラム陽性細菌とグラム陰性細菌のスペクトルは明らかに互いに異なり、ＳＥＲＳが異なる種類の細菌を区別するとき種類特異性を備えていることを証明した。
【実施例５】
【００３９】
実施例５：グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のＳＥＲＳスペクトルの連続検出。
ＳＥＲＳ曲線図の安定性が時間に伴って変化するか否かを検査するため、異なる時間点で連続検出し、グラム陽性細菌（無乳性レンサ球菌１３６４０及び黄色ブドウ球菌１３６１５）とグラム陰性細菌（エンテロバクター・クロアカ１３４５７Ｃ２及びミラビリス変形菌１３６２１Ｃ１）のＳＥＲＳスペクトルを取得する。結果を図４に示す。ＳＥＲＳ曲線図と相対密度の信号が少なくとも５９分間安定していることが証明された。
【実施例６】
【００４０】
実施例６：ＳＥＲＳを利用した抗生物質アンピシリン及びバシトラシンの細菌に対する影響のモニタリング。
抗生物質敏感株大腸菌ＪＭ１０９を０.５％アガロースゲルで固定した後、１０ μｇ／ｍｌのアンピシリンで３５分間処理し、抗生物質の細菌に対する影響を鑑定した。アンピシリン処理を経たＪＭ１０９のスペクトルと処理を経ていないＪＭ１０９のスペクトルは明らかに異なった（図５）。アンピシリン処理を経たＪＭ１０９のスペクトル上の７００ｃｍ−１箇所の新ピークは、アンピシリンによる新しい分子結合の振動を証明している。
【００４１】
抗生物質の細菌に対する影響をさらに鑑定するため、別の抗生物質敏感株大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）を０.５％アガロースゲルで固定した後、２５ μｇ／ｍｌのバシトラシンで４８分間処理した。バシトラシン処理を経たＪＭ１０９（突然変異体）のスペクトルと処理を経ていないＪＭ１０９（突然変異体）のスペクトルは明らかに異なった（図６）。バシトラシン処理を経たＪＭ１０９（突然変異体）のスペクトル上の７００ｃｍ−１箇所の新ピークは、バシトラシンによる新しい分子結合の振動を証明している。
【００４２】
図３と図４において、いずれも７００ｃｍ−１箇所で発生した新ピークは、アンピシリン及びバシトラシンの２種類が細胞壁に作用する抗生物質であり、細菌の細胞壁の形成に干渉し、かつ細胞壁の形態変化を促したことを証明している。
【実施例７】
【００４３】
実施例７：ＳＥＲＳを利用した抗生物質バンコマイシンの細菌に対する影響のモニタリング
その他細胞壁に影響する抗生物質のその他細菌株に対する影響を鑑定するため、抗生物質敏感株黄色ブドウ球菌１３６４９を０.５％アガロースゲルで固定した後、２５μｇ／ｍｌのバンコマイシンで５４分間処理した。８００ｃｍ−１〜１５００ｃｍ−１で出現した新ピークは、バンコマイシンのような細胞壁に作用する抗生物質が、細菌の細胞壁の形成に干渉し、かつ細胞壁の形態変化を促すことを証明している（図７）。
【実施例８】
【００４４】
実施例８：ＳＥＲＳを利用した抗生物質テトラサイクリンの細菌に対する影響のモニタリング
抗生物質の細菌に対する影響を鑑定するため、抗生物質敏感株大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）を０.５％アガロースゲルで固定した後、５０ μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで処理した。異なる時間点でスペクトルの結果を取得した（図８及び図９）。異なる時間点で異なる新ピークが観察され、異なる時間点における異なる新しい分子結合の振動が証明された。この現象はテトラサイクリンが蛋白質合成を抑制した後の動態的新陳代謝を完全に反映している。
【実施例９】
【００４５】
実施例９：ＳＥＲＳを利用した抗生物質ゲンタマイシンの細菌に対する影響のモニタリング
その他蛋白質合成に干渉する抗生物質のその他細菌株に対する影響を鑑定するため、抗生物質敏感株大腸菌１３６５０を０.５％アガロースゲルで固定した後、２５ μｇ／ｍｌのゲンタマイシンで３７分間処理した。４１８ｃｍ−１及び８００ｃｍ−１〜１５００ｃｍ−１で出現した新ピークは、ゲンタマイシンにより促進された細菌の形態変化が蛋白質合成の抑制によるものであることを証明した（図１０）。
【実施例１０】
【００４６】
実施例１０：ＳＥＲＳを利用した抗生物質の薬剤耐性（Drug-Resistant）株に対する影響のモニタリング。
抗生物質の細菌に対する影響を証明するため、薬剤耐性株腸球菌７-１８ｕＥを０.５％アガロースゲルで固定した後、１０ μｇ／ｍｌのアンピシリンで３５分間、または２５ μｇ／ｍｌのバシトラシンで４８分間処理した。抗生物質敏感株大腸菌ＪＭ１０９及び大腸菌ＪＭ１０９（突然変異体）のスペクトルと比較すると、抗生物質の処理を経た後の薬剤耐性株腸球菌７-１８ｕＥのスペクトル上にはいかなる変化も観察されなかった（図１１）。
【実施例１１】
【００４７】
実施例１１：ＳＥＲＳスペクトルを利用した結核菌の検出
実施例１の手順は、結核菌の検査にも応用することができる。図１２にグラム陽性細菌、グラム陰性細菌及び結核菌のスペクトルを示す。結核菌のスペクトルはその他と明らかに異なる。
【実施例１２】
【００４８】
実施例１２：ＳＥＲＳスペクトルを利用したグラム陰性細菌の異なる生長状態の検出
対数期と静止期の開始段階および中間階段にある大腸菌（ＯＤ６００それぞれ０.４、１.５、２.０）を測定し、グラム陰性細菌の異なる生長状態を鑑定した。対数期の開始段階（ＯＤ６００＝０.４）、静止期近く（ＯＤ６００＝１.５）または静止期（ＯＤ６００＝２.０）にある細菌のＳＥＲＳスペクトルは、ＳＥＲＳ曲線図上で特徴的な変化があった（図１３）。細菌が対数期から静止期に成長したとき、６５５ｃｍ−１（＃１）、１１３０ｃｍ−１（＃４）、１２１９ｃｍ−１（＃５）、１２４５ｃｍ−１（＃６）でのピーク強度が徐々に増加し、７２５ｃｍ−１（＃２）及び１０９５ｃｍ−１（＃３）でのピーク強度が徐々に減少した。
【００４９】
この領域の技術を熟知した者であればすぐに分かるように、本発明は非常に容易に目標を達成することができ、かつ上述のような結果と利点、およびその中に本来存在しているものを得ることができる。本発明の細菌株、細胞株、抗生物質、固定溶液、反応剤、ＳＥＲＳ活性基板、設備、プロセス、製造方法は最良の実施例の代表であり、例示的なものであると同時に、本発明の領域を限定するものではない。この技術を熟知した者であれば変更やその他用途を思いつくことができる。これら変更はすべて本発明の要旨に含まれるものとし、かつ特許請求の範囲において定義される。
【００５０】
この領域の技術を熟知した者であれば、本発明の範囲と要旨から逸脱せずに、本文中に開示した発明の各種異なる代替や変化をすぐに行うことが可能である。明細書中で言及したあらゆる特許及び出版品は、本発明が関連する領域の一般技術を示すものである。ここにおけるあらゆる特許及び出版品は、個別の出版品が具体的かつ単独で参照により組み込まれることが示される状況と同程度に、参照により組み込まれる。
【００５１】
ここで適切に例を挙げて説明した発明は、いずれかの要件またはいくつかの要件を欠いた状況、或いは本文中で特に開示していない制限状況下で実施することが可能である場合がある。使用した名詞及び表現は、明細書の描写のためのものであり、制限のためのものではない。同時に、ここに示したおよび描写した特徴またはその一部のあらゆる同等物を排除する名詞及び表現を使用することを意図していないが、本発明の特許請求の範囲内において、各種異なる変更が可能であることを認識しておく必要がある。このため、最良の実施例及び任意の特徴に基づいて本発明を具体的に開示してきたが、この技術を熟知した者であれば開示された内容に変更や変化を行うことが可能であり、そのような変更や変化は本発明の特許請求の範囲内に含まれることを理解する必要がある。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法であって、
（ａ）微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置する、
（ｂ）固定液で微生物を固定する、
（ｃ）手順（ｂ）中の微生物のＳＥＲＳスペクトルを取得する、
（ｄ）該ＳＥＲＳスペクトルを分析して微生物の曲線図を生成する、
という手順を含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、前記ＳＥＲＳ活性基板がナノ粒子を埋設した、またはナノ粒子に被覆された固体薄膜であることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、前記ナノ粒子が、金、銀、銅、白金、銀／金、白金／金、銅／金のコアシェル及び合金粒子から構成されるグループから選択されることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項４】
請求項１に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、前記固定液が、微生物を移動できなくすると共に、その生命を有水環境中で維持させることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項５】
請求項１に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、前記固定液が、アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ）及びグリセロールから構成されるグループから選択されることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項６】
請求項１に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、前記曲線図が、微生物の種類または菌株の鑑定に応用されることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項７】
請求項１に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、前記曲線図が、パターン認識システム（ＰａｔｔｅｒｎＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）から生成されることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項８】
請求項１に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、前記微生物が、細菌、真菌、または細胞であることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項９】
請求項１に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、前記ＳＥＲＳスペクトルが、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の区別に用いられることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、前記区別がラマンシフトに基づいて行われ、識別力のある範囲が５００ｃｍ−１〜９００ｃｍ−１及び１１００ｃｍ−１〜１５００ｃｍ−１であることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法において、さらに未知の細菌と既知の細菌のＳＥＲＳスペクトルを比較する方法を含むことを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して曲線図を生成し微生物を鑑定する方法。
【請求項１２】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法であって、
（ａ）微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置する、
（ｂ）固定液で微生物を固定する、
（ｃ）微生物に対し有効量の抗菌剤または感染性病原体を加える、
（ｄ）手順（ｃ）中の微生物のＳＥＲＳスペクトルを取得する、
（ｅ）手順（ｄ）のＳＥＲＳスペクトルと対照群（抗菌剤または感染性病原体を加えていない）のＳＥＲＳスペクトルを比較し、少なくとも１つの新ピークを取得し、抗菌剤または感染性病原体の影響を鑑定する、という手順を含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法において、前記ＳＥＲＳ活性基板が、ナノ粒子を埋設した、またはナノ粒子に被覆された固体薄膜であることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法において、前記固定液が、微生物を移動できなくすると共に、その生命を有水環境中で維持させることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法において、前記固定液が、アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ）及びグリセロールから構成されるグループから選択されることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法において、前記微生物が細菌、真菌、または細胞であることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法において、前記抗菌剤が、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、バシトラシン（ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、セファロスポリン（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）、サルファ剤（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、及ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎｅ）（ブレオマイシン系糖タンパク抗生物質）から構成されるグループから選択されることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法。
【請求項１８】
請求項１２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法において、前記感染性病原体がウイルスまたは伝染性細菌であることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法において、前記方法が、新しい抗生物質の開発とスクリーニングに応用されることを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法。
【請求項２０】
対照群のＳＥＲＳスペクトルと比較してスペクトル上で相対密度の変化が発生した位置を調べ、抗菌剤または感染性病原体の抗菌機制の予測に応用することを特徴とする、請求項１２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物の抗菌剤または感染性病原体により発生した形態変化を検出する方法。
【請求項２１】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物曲線図を生成する装置であって、
（ａ）微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置する手段、
（ｂ）微生物を固定する手段、
（ｃ）手順（ｂ）中の微生物のＳＥＲＳスペクトルを取得する手段、
（ｄ）前記ＳＥＲＳスペクトルを分析して微生物曲線図を生成する手段、
を含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して微生物曲線図を生成する装置。
【請求項２２】
表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して抗菌剤または感染性病原体により発生した微生物の形態変化を検出する装置であって、
（ａ）微生物をＳＥＲＳ活性基板上に配置する手段、
（ｂ）微生物を固定する手段、
（ｃ）微生物に対し有効量の抗菌剤または感染性病原体を加える手段、
（ｄ）手順（ｃ）中の微生物のＳＥＲＳスペクトル取得する手段、
（ｅ）手順（ｄ）のＳＥＲＳスペクトルと対照群（抗菌剤または感染性病原体を加えていない）のＳＥＲＳスペクトルを比較し、少なくとも１つの新ピークを取得して抗菌剤または感染性病原体の影響を鑑定する手段を含む、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して抗菌剤または感染性病原体により発生した微生物の形態変化を検出する装置。
【請求項２３】
請求項２２に記載の表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して抗菌剤または感染性病原体により発生した微生物の形態変化を検出する装置において、前記手段（ｅ）が、パターン認識システム（ＰａｔｔｅｒｎＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）を含むことを特徴とする、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を利用して抗菌剤または感染性病原体により発生した微生物の形態変化を検出する装置。
【請求項２４】
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出する方法であって、
（ａ）サンプルをＳＥＲＳ活性基板上に置く、
（ｂ）固定液でサンプルを固定する、
（ｃ）手順（ｂ）中のサンプルのＳＥＲＳスペクトルを取得する、
（ｄ）前記ＳＥＲＳスペクトルを分析してサンプルの曲線図を生成する、
（ｅ）サンプルのＳＥＲＳスペクトルとグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌のＳＥＲＳスペクトルを比較する、
という手順を含む、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出する方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出する方法において、前記サンプルが、血液、血漿、血清、痰、尿液、腦脊髄液、胸膜液（ｐｌｅｕｒａｆｌｕｉｄ）、組織液のいずれかであることを特徴とする、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出する方法。

【図１】