袋状微生物検出用容器
【課題】検査対象物の前処理を特に必要とせず、簡便な操作で正確に環境中の微生物検査を可能とし、かつ廃棄物量の少ない微生物検査用器具を提供する。
【解決手段】透明又は半透明の合成樹脂製袋中に、標的微生物が生育し得る培地成分、標的微生物が産生する酵素の基質、及び標的微生物用選択物質を含有する粒子状混合物又は顆粒を充填してなる袋状微生物検出用容器。
【解決手段】透明又は半透明の合成樹脂製袋中に、標的微生物が生育し得る培地成分、標的微生物が産生する酵素の基質、及び標的微生物用選択物質を含有する粒子状混合物又は顆粒を充填してなる袋状微生物検出用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便な操作で正確に標的微生物を検出可能な微生物検出用容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、医療機関、医薬品製造所や食品製造所の環境、これらで働く人たちの肌、手指、食品製造に使われる原料等の微生物検査として、拭き取り法（表面塗抹法、混釈培養法）やスタンプ法などがある。拭き取り法は、検査対象物の一定面積をガーゼ・綿棒等で拭き取り、これを滅菌水又は滅菌生理食塩水中で洗い、付着している菌体を滅菌水又は滅菌生理食塩水中に懸濁させ、得られた懸濁液を用いて、予め作製しておいた寒天培地に塗布することにより、微生物の培養を行う方法（表面塗抹法）や、予め粉末寒天培地を溶解、滅菌した後、約４５℃程度に保っておき、その寒天培地の一定量を、上記懸濁液の一定量を入れておいた滅菌ペトリ皿等に分注し、混釈後、寒天を固化し、一定温度で培養後、生じた微生物のコロニー数を計数する等の方法（混釈培養法）により行われてきた。このような拭き取り手段を容易にすべく、種々の拭き取り器具が開発されてきた（特許文献１〜３等）。
【０００３】
一方、スタンプ法は、シャーレに寒天培地を流し込み、表面張力を応用し凸状にしてある培地を直接検査対象箇所へ押し付け培養する方法である。しかし、スタンプ法（非特許文献１）では寒天表面全体が濡れてコロニー形成がうまくできないという問題があった。また、通常の方法では、培養後に多量の廃棄物が発生する等の問題が残されていた。
【０００４】
これらの手段に対し、多孔質シートに培地成分と水溶性高分子を含有する簡易微生物検出用培地が報告されている（特許文献４）。これを用いて微生物の環境検査を行う場合は、水分を含ませたガーゼなど検査対象表面を拭き取り、滅菌水又は滅菌生理食塩水中で洗い、その１ｍＬを滅菌ピペットで培地へ接種して、培養を行う必要がある。しかし、現場と検査室が離れているため、拭き取ったものは一度検査室へ持ち帰り、希釈や接種などの操作をする必要があり、このような時間と手間を短縮する技術開発が要望されていた。また、手指の微生物を検査するために特許文献５が開発され広く使われているが、使用後の廃棄量が多いため環境に対して負荷がかかるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−９０１３１号公報
【特許文献２】特開２００１−３３３７９６号公報
【特許文献３】特開２００８−３２５４１号公報
【特許文献４】特開平０８−２８６号公報
【特許文献５】特開２００６−２８０３２５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．６，２００４，Ｐａｇｅｓ ４４５−４５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように従来の環境中の微生物検査においては、培地に検体を接種する前段階である検査対象物の前処理の煩雑性や、多量の水を必要とし、使用後の廃棄物量が多い等の問題があった。
従って、本発明の課題は、検査対象物の前処理を特に必要とせず、簡便な操作で正確に環境中の微生物検査を可能とし、かつ廃棄物量の少ない微生物検査用器具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、培地成分、酵素基質及び選択物質を寒天培地とするのではなく、粒状物の状態で適用することを考え、さらに、検査対象物の前処理を簡便化することについて種々検討した結果、これらの成分を粒子状混合物又は顆粒にして透明又は半透明の袋に充填して袋状微生物用検出容器とすれば、例えば検査対象物の拭き取り物を袋中に直接投入でき、培養後は袋の外部から簡便に標的微生物が検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、透明又は半透明の合成樹脂製袋中に、標的微生物が生育し得る培地成分、標的微生物が産生する酵素の基質、及び標的微生物用選択物質を含有する粒子状混合物又は顆粒を充填してなる袋状微生物検出用容器を提供するものである。
また、本発明は、上記袋状微生物検出用容器を開封し、被検液又は被検液採取物を投入し、培養後当該容器を直接観察することを特徴とする標的微生物の検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の袋状微生物検出用容器を用いれば、検査対象物の拭き取り物をそのまま袋内に投入し、培養後、外部から直接標的微生物の有無又は定量をすることができる。従って、操作が簡便であり、かつ正確であるとともに、多量の水を必要とせず廃棄物も少ない。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の袋状微生物検出用容器には、透明又は半透明の合成樹脂製袋中に、標的微生物が生育し得る培地成分、標的微生物が産生する酵素の基質、及び標的微生物用選択物質を含有する粒子状混合物又は顆粒が充填されている。
【００１２】
本発明の容器は、袋状であり、透明又は半透明の合成樹脂製の袋である。透明又は半透明とすることにより、外部から微生物の検出が可能となる。ここで、透明又は半透明とは、外部から色やコロニーの数等が肉眼で判別できる程度であればよい。無色で、可視光の透過率が１０％以上のものが好ましい。
合成樹脂としては、水分非透過性でフレキシブルなものであれば特に限定されず、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニリデン等のポリオレフィン樹脂、ナイロン樹脂、三フッ化塩化エチレン樹脂、アクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリアクリル樹脂、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアクリルニトリル、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、セロファン等が挙げられる。このうち、透明性、水分非透過性、経済性等の点からポリオレフィン樹脂が好ましい。
【００１３】
袋中に充填される粒子状混合物又は顆粒に含まれる標的微生物が生育し得る培地成分としては、特に制限されず、微生物を培養するための栄養成分、例えばタンパク質、糖類、無機塩等が挙げられる。培地成分は、粒子状混合物又は顆粒中に１０〜９９質量％、さらに４０〜６０質量％含有するのが好ましい。
標的微生物が産生する酵素の基質としては、例えばα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−キシロシダーゼ、β−キシロシダーゼ、α−ラムノシダーゼ、β−ラムノシダーゼ、α−フコシダーゼ等の酵素の基質が挙げられる。これらの基質としては、発色団又は蛍光発色団を含む基質が、標的微生物を正確に検出するうえで好ましい。酵素基質は粒子状混合物又は顆粒中に０．００１〜５質量％、さらに０．０５〜０．１質量％含有するのが好ましい。
標的微生物用選択物質としては、標的微生物以外の微生物の生育を抑制する抗生物質、合成抗菌剤、色素、界面活性剤、無機塩等が挙げられる。選択物質は粒子状混合物又は顆粒中に０．００１〜５質量％、さらに０．０５〜２質量％含有するのが好ましい。
【００１４】
また、粒子状混合物又は顆粒には、消毒剤中和剤を含有するのが、検査対象物中の消毒剤を中和し、正確な検出をする点で好ましい。消毒剤中和剤としては、チオ硫酸ナトリウム、レシチン、ポリソルベート、Ｌ−ヒスチジン、ルブロール等が挙げられる。消毒剤中和剤は粒子状混合物又は顆粒中に０．０１〜２５質量％、さらに０．５〜１０質量％含有するのが好ましい。
【００１５】
さらに、粒子状混合物又は顆粒には、生じたコロニーを見やすくするために、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド等のテトラゾリム塩や、ｐＨ指示薬等を加えてもよい。
【００１６】
粒子状混合物又は顆粒に含有させるこれらの成分の組み合わせは、標的微生物により異なる。具体的には、例えば次のとおりである。
【００１７】
一般生菌検査用としては酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等やこれらにリン酸二カリウム及び／又は塩化ナトリウムを加えたもの等が用いられる。大腸菌・大腸菌群検査用としてはデスオキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ニュートラルレッド混合物、コール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ニュートラルレッド混合物、酵母エキス・ペプトン・リン酸二カリウム・リン酸一カリウム・乳糖・デゾキシコール酸ナトリウム・塩化ナトリウム・ラウリル硫酸ナトリウム・亜硫酸ナトリウム・塩基性フクシン混合物、ペプトン・乳糖・胆汁酸塩・塩化ナトリウム・中性紅混合物、酵母エキス・ペプトン・胆汁酸・乳糖・塩化ナトリウム・中性紅・クリスタルバイオレット混合物、ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム・エオジンＹ・メチレンブルー混合物等が用いられる。ブドウ球菌用としてはペプトン・牛肉エキス・塩化ナトリウム・フェニルエアタノール混合物、ペプトン・牛肉エキス・塩化ナトリウム・マンニット・フェノールレッド混合物、ペプトン・酵母エキス・ゲラチン・乳糖・マンニット・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム混合物、酵母エキス・ペプトン・グリシン・マンニット・リン酸二カリウム・塩化リチウム混合物、ペプトン・牛肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸ナトリウム混合物等が用いられる。腸炎ビブリオ用としてはペプトン・塩化ナトリウム・胆汁酸塩・抗生物質・酵素基質混合物、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁・ブロムチモールブルー・チモールブルー混合物等が用いられる。
腸球菌用としてはペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・リン酸一カリウム・塩化ナトリウム・アジ化ナトリウム・ブロムクレゾールパープル混合物、牛肉エキス・ペプトン・エスクリン・胆汁酸・クエン酸鉄混合物、酵母エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・エスクリン・アクチジオン・アジドナトリウム・混合物、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム・ブロムチモールブルー・塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム混合物が用いられる。サルモネラ菌用としては、牛肉エキス・ペプトン・乳糖・胆汁酸塩・クエン酸ナトリウム・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸鉄・ブリリアントグリーン・ニュートラルレッド混合物等が用いられる。リステリア菌用としては、マンニット・ブドウ糖・エスクリン・クエン酸鉄アンモニウム・フェノールレッド・アクリフラビン塩酸塩・硫酸ポリミキシンＢ・ペプトン・牛心臓エキス・デンプン・塩化ナトリウム混合物等が用いられる。緑膿菌用としては、ペプトン・リン酸二カリウム・硫酸マグネシウム混合物、ペプトン・硫酸マグネシウム・硫酸カリウム混合物、ペプトン・塩化マグネシウム・硫酸カリウム・イルガサン混合物等が用いられる。乳酸菌用としては、ペプトン・牛肉エキス・酵母エキス・ブドウ糖・ソルビタンモノオレート・クエン酸アンモニウム・酢酸ナトリウム・硫酸マグネシウム・硫酸マンガン・リン酸二カリウム混合物等が用いられる。マイコプラズマ用として、牛心臓エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・酵母エキス・ペニシリン・酢酸タリウム混合物等が用いられる。真菌用としてはペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物等が用いられる。
【００１８】
粒子状混合物又は顆粒には、さらにゲル化剤を含有するのが、微生物の検出感度向上、被検体中の水分量が少ない場合でも微生物の検出精度を高める点で好ましい。例えば、拭き取った試料等の水分が少ない検体の場合には、ゲル化剤が少量の水により速やかにゲル化するため、拭き取った物質の繊維立体構造表面の拭き取り面から効率的に微生物をトラップする効果を奏するものと考えられる。また、水溶性試料の場合には、ゲル化剤が速やかにゲル化し、微生物の発育に必要な栄養素、選択物質、発色物質などの袋中の物質を効率よく微生物に接触させることにより、微生物の検出を効率よくするものと考えられる。
【００１９】
ゲル化剤としては、増粘性多糖類及び寒天から選ばれる１種又は２種以上を用いるのが好ましい。増粘性多糖類としては、カラギーナン、キサンタンガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ペクチン、ジェランガム、アラビアガム、タラガム等が挙げられる。これらのゲル化剤のうち、キサンタンガム及び寒天を用いるのが特に好ましい。
【００２０】
粒子状混合物又は顆粒には、さらに水溶性ポリマーを含有するのが、少量の水であっても粒子状混合物又は顆粒を速やかに溶解するとともに、前記のゲル化剤とともに微生物の検出感度を向上させる点で好ましい。このような水溶性ポリマーとしては、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸等が挙げられるが、ポリビニルアルコールが水に対する溶解性が高く、特に好ましい。さらに、ケン化度が７５〜９５％、分子量が２５０００〜２５００００のポリビニルアルコールが特に好ましい。
【００２１】
粒子状混合物又は顆粒中の、培地成分、酵素基質及び選択物質の合計量は、３０〜１００質量％が好ましく、３０〜７０質量％がより好ましく、４０〜７０質量％がさらに好ましい。また、ゲル化剤の含有量は３０〜７０質量％が好ましく、３０〜６０質量％がより好ましい。水溶性ポリマーの含有量は０．１〜１０質量％が好ましく、３〜５質量％がより好ましい。
【００２２】
また、粒子状混合物又は顆粒のうち、顆粒であるのが少量の水でも速やかに溶解し、均一な検出が可能となる点で特に好ましい。さらに、前記成分を含有する顆粒の平均粒子径は、少量の水でも速やかに溶解し、均一な検出が可能になる点から１５０〜８５０μｍが好ましく、さらに２００〜８００μｍが好ましい。
【００２３】
このような顆粒は、例えば、培地成分、酵素基質、選択物質、必要により消毒剤中和剤及びゲル化剤の混合物を、水溶性ポリマーのエタノール水溶性を噴霧して造粒することにより製造するのが好ましい。用いるエタノール水溶液のエタノール濃度は、ダマの形成を防止し、造粒を効率良くする点から、２５〜５０質量％が好ましい。また、噴霧液中の水溶性ポリマーの濃度は、顆粒の粒子径を大きくする点から、４質量％以上、さらに４〜２０質量％が好ましい。
【００２４】
本発明の袋状微生物検出用容器は、前記合成樹脂製袋に、前記粒子状混合物又は顆粒を充填し、密封することにより製造することができる。
【００２５】
本発明の袋状微生物検出用容器を用いて微生物を検出するには、当該容器を開封し、被検液又は被検液採取物（例えば拭き取り物）を投入し、培養後当該容器を外部から直接観察すればよい。
【００２６】
拭き取り物の繊維としては、ナイロン繊維、ポリアクリロニトリル繊維、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）繊維、エチレン酢酸ビニル共重合体繊維、ポリエステル繊維（親水化処理したポリエステル繊維がより好ましい）、ポリオレフィン繊維合成繊維（親水化処理したポリオレフィン繊維がより好ましい）、ポリウレタン繊維等の合成繊維、レーヨン繊維等の半合成繊維、羊毛（獣毛）、絹、コットン繊維、セルロース繊維、パルプ繊維等の天然繊維、ガラス繊維等の無機繊維等が例示できる。上記繊維のうち、さらに好ましくは、ナイロン繊維、コットン繊維、セルロース繊維、及びレーヨン繊維である。拭き取り物の不織布としては、濾紙、レーヨン不織布、ポリエステル不織布、ポリプロピレン不織布に代表される合成繊維不織布、コットン不織布に代表される天然繊維不織布などが挙げられる。このうち、濾紙、レーヨン不織布及び長繊維セルロース不織布が好ましく、特に濾紙及びレーヨン不織布が好ましい。水の吸水性を考慮すれば５〜２００ｇ／ｍ2の密度を有し、０．０５〜０．５ｍｍの厚さを有する物、特に濾紙及びレーヨン不織布が好ましい。なお、これらの拭き取り物は、滅菌したものを使用する必要がある。
拭き取り物の大きさとしては、１ｍＬの水を拭き取る時、縦×横＝１０ｃｍ×４ｃｍが使いやすい大きさだが、これに限定されるものではない。
【００２７】
拭き取り物を用いた場合の操作法としては、例えば次の方法が挙げられる。
（使用法１）拭き取る物として滅菌済みの不織布を用い、これを滅菌水で湿らせた後、検査対象面を拭き取り、本発明袋状容器を開けて、拭き取り物を袋に入れ、密閉し、拭き取り物に含まれている水分をよく絞り出し、粒子状混合物又は顆粒とよくなじませ、適切な温度で培養を行う。
（使用法２）拭き取る物として滅菌済みの不織布を用い、これでそのまま検査対象面を良く拭き取り、本発明袋状容器を開け、拭き取り物を袋に入れ、密閉し、拭き取り物に含まれている水分をよく絞り出し、粒子状混合物又は顆粒とよくなじませ、適切な温度で培養を行う。
【００２８】
培養は、通常微生物が増殖する温度条件であればよい。また、微生物の検出は、用いた酵素基質が有する発色団、蛍光団等に応じて行うことができる。またコロニーを形成する場合には、そのコロニーの色等で標的微生物の有無又は定量することができる。
【実施例】
【００２９】
次に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
ペプトン、酵母エキス、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硝酸カリウム、ピルビン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、デゾキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム及びトリプトファンを合計で３１ｇ、酵素基質（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-β-D-グルクロン酸シクロヘキシルアンモニウム塩）０．３ｇ、（5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）０．３ｇ、及びキサンタンガム２０ｇの粒子状混合物を合成樹脂（ポリエチレン）袋へ入れ、電子線滅菌した。乾熱滅菌した不織布（４ｃｍ×１０ｃｍ）で１ｍＬずつ滅菌シャーレへ分注したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ １１７７５）菌液を拭き取り、合成樹脂袋へ入れ、よく水分を絞り出し粒子状混合物をその水分で溶かし、そのまま３５℃、２４時間培養した。その結果、菌数が多いところでは、不織布全体が青くなり、少ないところでは不織布上にコロニーの形成を認めた（表１）。しかし、大腸菌を含まない希釈液では、全く反応が認められず、不織布は白色のままであった。
さらに、青くなった不織布から１エーゼサンプリングし、ＥＭＢ培地へ画線塗抹し、大腸菌を確認することができた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
実施例２
ペプトン、酵母エキス、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、蟻酸ナトリウム、フマール酸ナトリウム、硝酸カリウム、ピルビン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム及びデスオキシコール酸ナトリウムを合計で２４ｇ、抗生物質（セフォペラゾン）０．０１５ｇ、酸化還元指示薬（トリフェニルテトラゾリウム クロライド）０．０２５ｇ、キサンタンガム３０ｇの混合物を合成樹脂（ポリエチレン）袋へ入れ、電子線滅菌した。乾熱滅菌した不織布（４ｃｍ×１０ｃｍ）で１ｍＬずつ滅菌シャーレへ分注したＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（Ａ３３０９）菌液を拭き取り、合成樹脂袋へ入れ、よく水分を絞り出し粒子状混合物をその水分で溶かし、好気条件及び微好気条件（６％酸素、１０％二酸化炭素、８４％窒素）で３５℃、４８時間培養した。その結果、菌数が多いところでは、不織布全体が赤くなり、少ないところでは不織布上にコロニーの形成を認めた（表２）。しかし、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉを含まない希釈液では、全く反応が認められず、不織布は白色のままであった。さらに、赤くなった不織布から１エーゼサンプリングし、Ｓｋｉｒｒｏｗ培地へ画線塗抹し、微好気培養した時Ｃ．ｊｅｊｕｎｉを確認することができた。
【００３３】
【表２】
【００３４】
実施例３
（１）下記表３の処方で顆粒を製造した。表３の上段の成分を流動層に添加し、下段の噴霧液を用いて、８０℃、９０分間流動後、１００℃、３０分間乾燥の流動条件で培地を造粒し、電磁式 実験用 篩振盪機（Ａ−３ ＦＲＩＴＳＨ ａｎａｌｙｓｅｔｔｅ：Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）に東京スクリーン株式会社の篩（２０メッシュ：目開き８５０μｍ・線径５２３μｍと１００メッシュ：目開き１５０μｍ・線径１０４μｍ）をセッティングし３０秒間振るい整粒した。１５０μｍ以上から８５０μｍ未満で効率よく生産できた。
【００３５】
【表３】
【００３６】
（２）得られた顆粒をポリエチレン袋に約０．０５ｇ充填し、本発明袋状微生物検出用容器を得た。本発明方法を直接塗抹法及び従来法と比較した。
本発明方法は拭き取った不織布を袋に入れ、開封部をシールし、不織布と顆粒を接触させて軽く揉み、３５℃、２４時間培養した。
直接塗抹法は、予め調製したデスオキシコレート寒天培地の表面に拭き取った不織布を塗り付け、３５℃、２４時間培養後、赤色コロニー数を測定した。
従来法は、拭き取った不織布をストマッカー袋に入れ、１０倍量の滅菌生理食塩水を入れ、ストマッカーで１分間ストマッキングしたものを原液とした。この原液を１０倍段階希釈して、デスオキシコレート寒天培地で混釈培養し、菌数測定を行った。
供試菌株はＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＡＴＣＣ ８０９０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ １１７７５、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １３０４８、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ＡＴＣＣ １３１８２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ６５３８、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６６３３、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ ２０９１を用いた。供試菌株をＴＳＢで、３５℃、２４時間培養後、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈して、１０-1から１０-9希釈液の１００μＬを滅菌ステンレス板（１０ｃｍ×１０ｃｍ）上に接種し、コンラージ棒で一面に塗付した。その後、生理食塩水に浸し高圧蒸気滅菌した不織布をピンセットでつまみ、余分な生理食塩水を瓶の壁を利用してよく絞り、その不織布を用いて菌液を塗抹してあるスレンレル板を丁寧に拭き取った。その結果、表４〜１１に示したように、いずれの菌株においても、本発明方法は他の２法に比べて、接種菌数が少ない場合でも陽性と判定することができ、グラム陽性菌および真菌では、反応は認められず発色はなかった。
【００３７】
【表４】
【００３８】
【表５】
【００３９】
【表６】
【００４０】
【表７】
【００４１】
【表８】
【００４２】
【表９】
【００４３】
【表１０】
【００４４】
【表１１】
【００４５】
実施例４
本発明袋状微生物検出用容器を用いたインドール産生能試験を実施した。実施例３（１）で得られた顆粒をポリエステル袋に約0.050ｇ充填し、袋状微生物検出用容器を得た。乾熱滅菌した不織布にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ １１７７５）菌液またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ １３８８３）菌液１ｍＬを染み込ませ、本発明袋状微生物検出用容器入れ、開封部をシールし、不織布と顆粒培地を接触させて軽く揉み、３５℃、７２時間培養した。その結果、両菌株とも不織布全体が青くなった。その後、培養後の袋状微生物検出用容器を開封し、コバック試薬を数滴添加し赤色に変色した場合には陽性、色の変化が見られなかった場合には陰性と判定した。Ｅ. ｃｏｌｉでは陽性となり、Ｋ. ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは全く反応が認められず陰性となった。
【００４６】
【表１２】
【００４７】
【表１３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便な操作で正確に標的微生物を検出可能な微生物検出用容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、医療機関、医薬品製造所や食品製造所の環境、これらで働く人たちの肌、手指、食品製造に使われる原料等の微生物検査として、拭き取り法（表面塗抹法、混釈培養法）やスタンプ法などがある。拭き取り法は、検査対象物の一定面積をガーゼ・綿棒等で拭き取り、これを滅菌水又は滅菌生理食塩水中で洗い、付着している菌体を滅菌水又は滅菌生理食塩水中に懸濁させ、得られた懸濁液を用いて、予め作製しておいた寒天培地に塗布することにより、微生物の培養を行う方法（表面塗抹法）や、予め粉末寒天培地を溶解、滅菌した後、約４５℃程度に保っておき、その寒天培地の一定量を、上記懸濁液の一定量を入れておいた滅菌ペトリ皿等に分注し、混釈後、寒天を固化し、一定温度で培養後、生じた微生物のコロニー数を計数する等の方法（混釈培養法）により行われてきた。このような拭き取り手段を容易にすべく、種々の拭き取り器具が開発されてきた（特許文献１〜３等）。
【０００３】
一方、スタンプ法は、シャーレに寒天培地を流し込み、表面張力を応用し凸状にしてある培地を直接検査対象箇所へ押し付け培養する方法である。しかし、スタンプ法（非特許文献１）では寒天表面全体が濡れてコロニー形成がうまくできないという問題があった。また、通常の方法では、培養後に多量の廃棄物が発生する等の問題が残されていた。
【０００４】
これらの手段に対し、多孔質シートに培地成分と水溶性高分子を含有する簡易微生物検出用培地が報告されている（特許文献４）。これを用いて微生物の環境検査を行う場合は、水分を含ませたガーゼなど検査対象表面を拭き取り、滅菌水又は滅菌生理食塩水中で洗い、その１ｍＬを滅菌ピペットで培地へ接種して、培養を行う必要がある。しかし、現場と検査室が離れているため、拭き取ったものは一度検査室へ持ち帰り、希釈や接種などの操作をする必要があり、このような時間と手間を短縮する技術開発が要望されていた。また、手指の微生物を検査するために特許文献５が開発され広く使われているが、使用後の廃棄量が多いため環境に対して負荷がかかるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−９０１３１号公報
【特許文献２】特開２００１−３３３７９６号公報
【特許文献３】特開２００８−３２５４１号公報
【特許文献４】特開平０８−２８６号公報
【特許文献５】特開２００６−２８０３２５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．６，２００４，Ｐａｇｅｓ ４４５−４５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように従来の環境中の微生物検査においては、培地に検体を接種する前段階である検査対象物の前処理の煩雑性や、多量の水を必要とし、使用後の廃棄物量が多い等の問題があった。
従って、本発明の課題は、検査対象物の前処理を特に必要とせず、簡便な操作で正確に環境中の微生物検査を可能とし、かつ廃棄物量の少ない微生物検査用器具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、培地成分、酵素基質及び選択物質を寒天培地とするのではなく、粒状物の状態で適用することを考え、さらに、検査対象物の前処理を簡便化することについて種々検討した結果、これらの成分を粒子状混合物又は顆粒にして透明又は半透明の袋に充填して袋状微生物用検出容器とすれば、例えば検査対象物の拭き取り物を袋中に直接投入でき、培養後は袋の外部から簡便に標的微生物が検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、透明又は半透明の合成樹脂製袋中に、標的微生物が生育し得る培地成分、標的微生物が産生する酵素の基質、及び標的微生物用選択物質を含有する粒子状混合物又は顆粒を充填してなる袋状微生物検出用容器を提供するものである。
また、本発明は、上記袋状微生物検出用容器を開封し、被検液又は被検液採取物を投入し、培養後当該容器を直接観察することを特徴とする標的微生物の検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の袋状微生物検出用容器を用いれば、検査対象物の拭き取り物をそのまま袋内に投入し、培養後、外部から直接標的微生物の有無又は定量をすることができる。従って、操作が簡便であり、かつ正確であるとともに、多量の水を必要とせず廃棄物も少ない。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の袋状微生物検出用容器には、透明又は半透明の合成樹脂製袋中に、標的微生物が生育し得る培地成分、標的微生物が産生する酵素の基質、及び標的微生物用選択物質を含有する粒子状混合物又は顆粒が充填されている。
【００１２】
本発明の容器は、袋状であり、透明又は半透明の合成樹脂製の袋である。透明又は半透明とすることにより、外部から微生物の検出が可能となる。ここで、透明又は半透明とは、外部から色やコロニーの数等が肉眼で判別できる程度であればよい。無色で、可視光の透過率が１０％以上のものが好ましい。
合成樹脂としては、水分非透過性でフレキシブルなものであれば特に限定されず、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニリデン等のポリオレフィン樹脂、ナイロン樹脂、三フッ化塩化エチレン樹脂、アクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリアクリル樹脂、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアクリルニトリル、エチレン−ビニルアルコール共重合体、エチレン−メタクリル酸共重合体、セロファン等が挙げられる。このうち、透明性、水分非透過性、経済性等の点からポリオレフィン樹脂が好ましい。
【００１３】
袋中に充填される粒子状混合物又は顆粒に含まれる標的微生物が生育し得る培地成分としては、特に制限されず、微生物を培養するための栄養成分、例えばタンパク質、糖類、無機塩等が挙げられる。培地成分は、粒子状混合物又は顆粒中に１０〜９９質量％、さらに４０〜６０質量％含有するのが好ましい。
標的微生物が産生する酵素の基質としては、例えばα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−マンノシダーゼ、β−マンノシダーゼ、α−キシロシダーゼ、β−キシロシダーゼ、α−ラムノシダーゼ、β−ラムノシダーゼ、α−フコシダーゼ等の酵素の基質が挙げられる。これらの基質としては、発色団又は蛍光発色団を含む基質が、標的微生物を正確に検出するうえで好ましい。酵素基質は粒子状混合物又は顆粒中に０．００１〜５質量％、さらに０．０５〜０．１質量％含有するのが好ましい。
標的微生物用選択物質としては、標的微生物以外の微生物の生育を抑制する抗生物質、合成抗菌剤、色素、界面活性剤、無機塩等が挙げられる。選択物質は粒子状混合物又は顆粒中に０．００１〜５質量％、さらに０．０５〜２質量％含有するのが好ましい。
【００１４】
また、粒子状混合物又は顆粒には、消毒剤中和剤を含有するのが、検査対象物中の消毒剤を中和し、正確な検出をする点で好ましい。消毒剤中和剤としては、チオ硫酸ナトリウム、レシチン、ポリソルベート、Ｌ−ヒスチジン、ルブロール等が挙げられる。消毒剤中和剤は粒子状混合物又は顆粒中に０．０１〜２５質量％、さらに０．５〜１０質量％含有するのが好ましい。
【００１５】
さらに、粒子状混合物又は顆粒には、生じたコロニーを見やすくするために、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド等のテトラゾリム塩や、ｐＨ指示薬等を加えてもよい。
【００１６】
粒子状混合物又は顆粒に含有させるこれらの成分の組み合わせは、標的微生物により異なる。具体的には、例えば次のとおりである。
【００１７】
一般生菌検査用としては酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等やこれらにリン酸二カリウム及び／又は塩化ナトリウムを加えたもの等が用いられる。大腸菌・大腸菌群検査用としてはデスオキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ニュートラルレッド混合物、コール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ニュートラルレッド混合物、酵母エキス・ペプトン・リン酸二カリウム・リン酸一カリウム・乳糖・デゾキシコール酸ナトリウム・塩化ナトリウム・ラウリル硫酸ナトリウム・亜硫酸ナトリウム・塩基性フクシン混合物、ペプトン・乳糖・胆汁酸塩・塩化ナトリウム・中性紅混合物、酵母エキス・ペプトン・胆汁酸・乳糖・塩化ナトリウム・中性紅・クリスタルバイオレット混合物、ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム・エオジンＹ・メチレンブルー混合物等が用いられる。ブドウ球菌用としてはペプトン・牛肉エキス・塩化ナトリウム・フェニルエアタノール混合物、ペプトン・牛肉エキス・塩化ナトリウム・マンニット・フェノールレッド混合物、ペプトン・酵母エキス・ゲラチン・乳糖・マンニット・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム混合物、酵母エキス・ペプトン・グリシン・マンニット・リン酸二カリウム・塩化リチウム混合物、ペプトン・牛肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸ナトリウム混合物等が用いられる。腸炎ビブリオ用としてはペプトン・塩化ナトリウム・胆汁酸塩・抗生物質・酵素基質混合物、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁・ブロムチモールブルー・チモールブルー混合物等が用いられる。
腸球菌用としてはペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・リン酸一カリウム・塩化ナトリウム・アジ化ナトリウム・ブロムクレゾールパープル混合物、牛肉エキス・ペプトン・エスクリン・胆汁酸・クエン酸鉄混合物、酵母エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・エスクリン・アクチジオン・アジドナトリウム・混合物、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム・ブロムチモールブルー・塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム混合物が用いられる。サルモネラ菌用としては、牛肉エキス・ペプトン・乳糖・胆汁酸塩・クエン酸ナトリウム・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸鉄・ブリリアントグリーン・ニュートラルレッド混合物等が用いられる。リステリア菌用としては、マンニット・ブドウ糖・エスクリン・クエン酸鉄アンモニウム・フェノールレッド・アクリフラビン塩酸塩・硫酸ポリミキシンＢ・ペプトン・牛心臓エキス・デンプン・塩化ナトリウム混合物等が用いられる。緑膿菌用としては、ペプトン・リン酸二カリウム・硫酸マグネシウム混合物、ペプトン・硫酸マグネシウム・硫酸カリウム混合物、ペプトン・塩化マグネシウム・硫酸カリウム・イルガサン混合物等が用いられる。乳酸菌用としては、ペプトン・牛肉エキス・酵母エキス・ブドウ糖・ソルビタンモノオレート・クエン酸アンモニウム・酢酸ナトリウム・硫酸マグネシウム・硫酸マンガン・リン酸二カリウム混合物等が用いられる。マイコプラズマ用として、牛心臓エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・酵母エキス・ペニシリン・酢酸タリウム混合物等が用いられる。真菌用としてはペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物等が用いられる。
【００１８】
粒子状混合物又は顆粒には、さらにゲル化剤を含有するのが、微生物の検出感度向上、被検体中の水分量が少ない場合でも微生物の検出精度を高める点で好ましい。例えば、拭き取った試料等の水分が少ない検体の場合には、ゲル化剤が少量の水により速やかにゲル化するため、拭き取った物質の繊維立体構造表面の拭き取り面から効率的に微生物をトラップする効果を奏するものと考えられる。また、水溶性試料の場合には、ゲル化剤が速やかにゲル化し、微生物の発育に必要な栄養素、選択物質、発色物質などの袋中の物質を効率よく微生物に接触させることにより、微生物の検出を効率よくするものと考えられる。
【００１９】
ゲル化剤としては、増粘性多糖類及び寒天から選ばれる１種又は２種以上を用いるのが好ましい。増粘性多糖類としては、カラギーナン、キサンタンガム、ローカストビーンガム、グァーガム、ペクチン、ジェランガム、アラビアガム、タラガム等が挙げられる。これらのゲル化剤のうち、キサンタンガム及び寒天を用いるのが特に好ましい。
【００２０】
粒子状混合物又は顆粒には、さらに水溶性ポリマーを含有するのが、少量の水であっても粒子状混合物又は顆粒を速やかに溶解するとともに、前記のゲル化剤とともに微生物の検出感度を向上させる点で好ましい。このような水溶性ポリマーとしては、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸等が挙げられるが、ポリビニルアルコールが水に対する溶解性が高く、特に好ましい。さらに、ケン化度が７５〜９５％、分子量が２５０００〜２５００００のポリビニルアルコールが特に好ましい。
【００２１】
粒子状混合物又は顆粒中の、培地成分、酵素基質及び選択物質の合計量は、３０〜１００質量％が好ましく、３０〜７０質量％がより好ましく、４０〜７０質量％がさらに好ましい。また、ゲル化剤の含有量は３０〜７０質量％が好ましく、３０〜６０質量％がより好ましい。水溶性ポリマーの含有量は０．１〜１０質量％が好ましく、３〜５質量％がより好ましい。
【００２２】
また、粒子状混合物又は顆粒のうち、顆粒であるのが少量の水でも速やかに溶解し、均一な検出が可能となる点で特に好ましい。さらに、前記成分を含有する顆粒の平均粒子径は、少量の水でも速やかに溶解し、均一な検出が可能になる点から１５０〜８５０μｍが好ましく、さらに２００〜８００μｍが好ましい。
【００２３】
このような顆粒は、例えば、培地成分、酵素基質、選択物質、必要により消毒剤中和剤及びゲル化剤の混合物を、水溶性ポリマーのエタノール水溶性を噴霧して造粒することにより製造するのが好ましい。用いるエタノール水溶液のエタノール濃度は、ダマの形成を防止し、造粒を効率良くする点から、２５〜５０質量％が好ましい。また、噴霧液中の水溶性ポリマーの濃度は、顆粒の粒子径を大きくする点から、４質量％以上、さらに４〜２０質量％が好ましい。
【００２４】
本発明の袋状微生物検出用容器は、前記合成樹脂製袋に、前記粒子状混合物又は顆粒を充填し、密封することにより製造することができる。
【００２５】
本発明の袋状微生物検出用容器を用いて微生物を検出するには、当該容器を開封し、被検液又は被検液採取物（例えば拭き取り物）を投入し、培養後当該容器を外部から直接観察すればよい。
【００２６】
拭き取り物の繊維としては、ナイロン繊維、ポリアクリロニトリル繊維、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）繊維、エチレン酢酸ビニル共重合体繊維、ポリエステル繊維（親水化処理したポリエステル繊維がより好ましい）、ポリオレフィン繊維合成繊維（親水化処理したポリオレフィン繊維がより好ましい）、ポリウレタン繊維等の合成繊維、レーヨン繊維等の半合成繊維、羊毛（獣毛）、絹、コットン繊維、セルロース繊維、パルプ繊維等の天然繊維、ガラス繊維等の無機繊維等が例示できる。上記繊維のうち、さらに好ましくは、ナイロン繊維、コットン繊維、セルロース繊維、及びレーヨン繊維である。拭き取り物の不織布としては、濾紙、レーヨン不織布、ポリエステル不織布、ポリプロピレン不織布に代表される合成繊維不織布、コットン不織布に代表される天然繊維不織布などが挙げられる。このうち、濾紙、レーヨン不織布及び長繊維セルロース不織布が好ましく、特に濾紙及びレーヨン不織布が好ましい。水の吸水性を考慮すれば５〜２００ｇ／ｍ2の密度を有し、０．０５〜０．５ｍｍの厚さを有する物、特に濾紙及びレーヨン不織布が好ましい。なお、これらの拭き取り物は、滅菌したものを使用する必要がある。
拭き取り物の大きさとしては、１ｍＬの水を拭き取る時、縦×横＝１０ｃｍ×４ｃｍが使いやすい大きさだが、これに限定されるものではない。
【００２７】
拭き取り物を用いた場合の操作法としては、例えば次の方法が挙げられる。
（使用法１）拭き取る物として滅菌済みの不織布を用い、これを滅菌水で湿らせた後、検査対象面を拭き取り、本発明袋状容器を開けて、拭き取り物を袋に入れ、密閉し、拭き取り物に含まれている水分をよく絞り出し、粒子状混合物又は顆粒とよくなじませ、適切な温度で培養を行う。
（使用法２）拭き取る物として滅菌済みの不織布を用い、これでそのまま検査対象面を良く拭き取り、本発明袋状容器を開け、拭き取り物を袋に入れ、密閉し、拭き取り物に含まれている水分をよく絞り出し、粒子状混合物又は顆粒とよくなじませ、適切な温度で培養を行う。
【００２８】
培養は、通常微生物が増殖する温度条件であればよい。また、微生物の検出は、用いた酵素基質が有する発色団、蛍光団等に応じて行うことができる。またコロニーを形成する場合には、そのコロニーの色等で標的微生物の有無又は定量することができる。
【実施例】
【００２９】
次に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１
ペプトン、酵母エキス、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、硝酸カリウム、ピルビン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、デゾキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム及びトリプトファンを合計で３１ｇ、酵素基質（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-β-D-グルクロン酸シクロヘキシルアンモニウム塩）０．３ｇ、（5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）０．３ｇ、及びキサンタンガム２０ｇの粒子状混合物を合成樹脂（ポリエチレン）袋へ入れ、電子線滅菌した。乾熱滅菌した不織布（４ｃｍ×１０ｃｍ）で１ｍＬずつ滅菌シャーレへ分注したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ １１７７５）菌液を拭き取り、合成樹脂袋へ入れ、よく水分を絞り出し粒子状混合物をその水分で溶かし、そのまま３５℃、２４時間培養した。その結果、菌数が多いところでは、不織布全体が青くなり、少ないところでは不織布上にコロニーの形成を認めた（表１）。しかし、大腸菌を含まない希釈液では、全く反応が認められず、不織布は白色のままであった。
さらに、青くなった不織布から１エーゼサンプリングし、ＥＭＢ培地へ画線塗抹し、大腸菌を確認することができた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
実施例２
ペプトン、酵母エキス、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、蟻酸ナトリウム、フマール酸ナトリウム、硝酸カリウム、ピルビン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム及びデスオキシコール酸ナトリウムを合計で２４ｇ、抗生物質（セフォペラゾン）０．０１５ｇ、酸化還元指示薬（トリフェニルテトラゾリウム クロライド）０．０２５ｇ、キサンタンガム３０ｇの混合物を合成樹脂（ポリエチレン）袋へ入れ、電子線滅菌した。乾熱滅菌した不織布（４ｃｍ×１０ｃｍ）で１ｍＬずつ滅菌シャーレへ分注したＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（Ａ３３０９）菌液を拭き取り、合成樹脂袋へ入れ、よく水分を絞り出し粒子状混合物をその水分で溶かし、好気条件及び微好気条件（６％酸素、１０％二酸化炭素、８４％窒素）で３５℃、４８時間培養した。その結果、菌数が多いところでは、不織布全体が赤くなり、少ないところでは不織布上にコロニーの形成を認めた（表２）。しかし、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉを含まない希釈液では、全く反応が認められず、不織布は白色のままであった。さらに、赤くなった不織布から１エーゼサンプリングし、Ｓｋｉｒｒｏｗ培地へ画線塗抹し、微好気培養した時Ｃ．ｊｅｊｕｎｉを確認することができた。
【００３３】
【表２】
【００３４】
実施例３
（１）下記表３の処方で顆粒を製造した。表３の上段の成分を流動層に添加し、下段の噴霧液を用いて、８０℃、９０分間流動後、１００℃、３０分間乾燥の流動条件で培地を造粒し、電磁式 実験用 篩振盪機（Ａ−３ ＦＲＩＴＳＨ ａｎａｌｙｓｅｔｔｅ：Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）に東京スクリーン株式会社の篩（２０メッシュ：目開き８５０μｍ・線径５２３μｍと１００メッシュ：目開き１５０μｍ・線径１０４μｍ）をセッティングし３０秒間振るい整粒した。１５０μｍ以上から８５０μｍ未満で効率よく生産できた。
【００３５】
【表３】
【００３６】
（２）得られた顆粒をポリエチレン袋に約０．０５ｇ充填し、本発明袋状微生物検出用容器を得た。本発明方法を直接塗抹法及び従来法と比較した。
本発明方法は拭き取った不織布を袋に入れ、開封部をシールし、不織布と顆粒を接触させて軽く揉み、３５℃、２４時間培養した。
直接塗抹法は、予め調製したデスオキシコレート寒天培地の表面に拭き取った不織布を塗り付け、３５℃、２４時間培養後、赤色コロニー数を測定した。
従来法は、拭き取った不織布をストマッカー袋に入れ、１０倍量の滅菌生理食塩水を入れ、ストマッカーで１分間ストマッキングしたものを原液とした。この原液を１０倍段階希釈して、デスオキシコレート寒天培地で混釈培養し、菌数測定を行った。
供試菌株はＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＡＴＣＣ ８０９０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ １１７７５、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １３０４８、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ＡＴＣＣ １３１８２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ６５３８、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６６３３、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ ２０９１を用いた。供試菌株をＴＳＢで、３５℃、２４時間培養後、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈して、１０-1から１０-9希釈液の１００μＬを滅菌ステンレス板（１０ｃｍ×１０ｃｍ）上に接種し、コンラージ棒で一面に塗付した。その後、生理食塩水に浸し高圧蒸気滅菌した不織布をピンセットでつまみ、余分な生理食塩水を瓶の壁を利用してよく絞り、その不織布を用いて菌液を塗抹してあるスレンレル板を丁寧に拭き取った。その結果、表４〜１１に示したように、いずれの菌株においても、本発明方法は他の２法に比べて、接種菌数が少ない場合でも陽性と判定することができ、グラム陽性菌および真菌では、反応は認められず発色はなかった。
【００３７】
【表４】
【００３８】
【表５】
【００３９】
【表６】
【００４０】
【表７】
【００４１】
【表８】
【００４２】
【表９】
【００４３】
【表１０】
【００４４】
【表１１】
【００４５】
実施例４
本発明袋状微生物検出用容器を用いたインドール産生能試験を実施した。実施例３（１）で得られた顆粒をポリエステル袋に約0.050ｇ充填し、袋状微生物検出用容器を得た。乾熱滅菌した不織布にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ １１７７５）菌液またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ １３８８３）菌液１ｍＬを染み込ませ、本発明袋状微生物検出用容器入れ、開封部をシールし、不織布と顆粒培地を接触させて軽く揉み、３５℃、７２時間培養した。その結果、両菌株とも不織布全体が青くなった。その後、培養後の袋状微生物検出用容器を開封し、コバック試薬を数滴添加し赤色に変色した場合には陽性、色の変化が見られなかった場合には陰性と判定した。Ｅ. ｃｏｌｉでは陽性となり、Ｋ. ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは全く反応が認められず陰性となった。
【００４６】
【表１２】
【００４７】
【表１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明又は半透明の合成樹脂製袋中に、標的微生物が生育し得る培地成分、標的微生物が産生する酵素の基質、及び標的微生物用選択物質を含有する粒子状混合物又は顆粒を充填してなる袋状微生物検出用容器。
【請求項２】
前記粒子状混合物又は顆粒中に、さらにゲル化剤を含有する請求項１記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項３】
ゲル化剤が、増粘性多糖類及び寒天から選ばれる１種又は２種以上である請求項２記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項４】
前記粒子状混合物又は顆粒中に、さらに水溶性ポリマーを含有する請求項１〜３のいずれか１項記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項５】
前記粒子状混合物又は顆粒中に、さらに消毒剤中和成分を含有する請求項１〜４のいずれか１項記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項６】
袋状微生物検出用容器を開封し、被検液又は被検液採取物を投入し、培養後当該容器を直接観察して標的微生物を検出するものである請求項１〜５のいずれか１項記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の袋状微生物検出用容器を開封し、被検液又は被検液採取物を投入し、培養後当該容器を直接観察することを特徴とする標的微生物の検出方法。
【請求項１】
透明又は半透明の合成樹脂製袋中に、標的微生物が生育し得る培地成分、標的微生物が産生する酵素の基質、及び標的微生物用選択物質を含有する粒子状混合物又は顆粒を充填してなる袋状微生物検出用容器。
【請求項２】
前記粒子状混合物又は顆粒中に、さらにゲル化剤を含有する請求項１記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項３】
ゲル化剤が、増粘性多糖類及び寒天から選ばれる１種又は２種以上である請求項２記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項４】
前記粒子状混合物又は顆粒中に、さらに水溶性ポリマーを含有する請求項１〜３のいずれか１項記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項５】
前記粒子状混合物又は顆粒中に、さらに消毒剤中和成分を含有する請求項１〜４のいずれか１項記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項６】
袋状微生物検出用容器を開封し、被検液又は被検液採取物を投入し、培養後当該容器を直接観察して標的微生物を検出するものである請求項１〜５のいずれか１項記載の袋状微生物検出用容器。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の袋状微生物検出用容器を開封し、被検液又は被検液採取物を投入し、培養後当該容器を直接観察することを特徴とする標的微生物の検出方法。
【公開番号】特開２０１２−２１７４４０（Ｐ２０１２−２１７４４０Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８９７２３（Ｐ２０１１−８９７２３）
【出願日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（０００２２６８６２）日水製薬株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１４日（２０１１．４．１４）
【出願人】（０００２２６８６２）日水製薬株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
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