被検物質の検出方法、増感剤及びイムノクロマトグラフィー用キット
【課題】 試験溶液中の被検物質の高感度な検出を迅速かつ簡便に行う。
【解決手段】 被検物質の所定部位を認識する第１抗体１を固定化したテストストリップ４に対し、被検物質３と、当該被検物質３の所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体２を標識物質５に結合させた標識第２抗体６とを展開した後、所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤７を展開する。増感剤７を構成する抗体として第１抗体１を用いることが好ましい。増感物質としては例えば発色物質を用いる。
【解決手段】 被検物質の所定部位を認識する第１抗体１を固定化したテストストリップ４に対し、被検物質３と、当該被検物質３の所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体２を標識物質５に結合させた標識第２抗体６とを展開した後、所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤７を展開する。増感剤７を構成する抗体として第１抗体１を用いることが好ましい。増感物質としては例えば発色物質を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開する被検物質の検出方法に関し、さらには増感剤及びイムノクロマトグラフィー用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の微量の被検物質を検出する方法としては、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法やＭＥＩＡ（microparticle enzyme-based immunoassay）法等が普及しているが、これら検出法は、操作時間や反応時間に長時間を要し、また、測定操作が煩雑等の問題がある。
【０００３】
そこで近年、ＥＬＩＳＡ法等に代わる分析法として、イムノクロマトグラフィー法を利用した分析法が注目されている。イムノクロマトグラフィー法は、保存安定性、迅速測定、判定の容易さ、特別な付属装置が不要等の様々な点で優れているため、例えばインフルエンザ検査、ＨＣＶ検査、ＰＳＡ検査等を目的としたポイントオブケア検査の分野において汎用されている。
【０００４】
イムノクロマトグラフィー法を利用した被検物質の検出は、例えば以下のような工程を経る。先ず、被検物質の異なる部位を認識する２種類の抗体を用意し、一方の抗体（第１抗体）はテストストリップのテストラインと呼ばれる領域に塗布・固定しておき、他方の抗体（第２抗体）には金コロイド粒子を標識しておく。そして、試験溶液と金コロイド標識第２抗体と混合し、テストストリップの一端に吸収させ、展開する。試験溶液中に被検物質が存在する場合には、混合物中で形成された被検物質−金コロイド標識第２抗体複合体がテストライン上の固定化第１抗体に捕捉され、固定化第１抗体−被検物質−金コロイド標識第１抗体複合体が形成される。その結果、テストラインにおいて、金コロイドの赤色の呈色が観察される。一方、試験溶液中に被検物質が存在しない場合、テストラインにおける金コロイド標識第２抗体の集積が起こらないため、呈色しない。
【０００５】
しかしながら、イムノクロマトグラフィー法は感度の点で問題があり、測定対象物によっては充分な感度が得られない場合がある。例えば試験溶液中の被検物質濃度が極めて低濃度であると、テストラインにおける金コロイドの集積量が不十分となり、発色が極めて薄くなり、陰性と誤判定されるおそれがある。
【０００６】
そこで、イムノクロマトグラフィー法の検出感度向上を目的とした研究が各方面で進められている。例えば、磁性微粒子によって二次抗体を標識し、テストストリップ上の磁気の変化を指標として被検物質を検出する方法や、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素で二次抗体を標識し、発色剤を後から展開する方法が広く知られている。酵素標識二次抗体を用いる方法としては、ペルオキシダーゼを使用する酵素免疫測定において塩基の存在下に酵素免疫測定を行う方法（例えば、特許文献１等参照。）等が提案されている。
【特許文献１】特開２００１−７４７４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、磁性微粒子標識や酵素標識二次抗体の展開後に発色剤を展開する方法では、特別な検出装置が必要であり検出操作が煩雑となるばかりか、磁気変化の検出や酵素反応等に時間を要するという問題がある。
【０００８】
そこで本発明は前述の実情に鑑みて提案されたものであり、試験溶液中の被検物質の高感度な検出を迅速かつ簡便に行うことが可能な被検物質の検出方法を提供することを目的とする。また、本発明は、前記検出方法に用いる増感剤及びイムノクロマトグラフィー用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前述の課題を解決するために、本発明に係る被検物質の検出方法は、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開した後、所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤を展開することを特徴とする。また、本発明に係る増感剤は、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開するイムノクロマトグラフィー法に用いられ、所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させたことを特徴とする。
【００１０】
本発明に係るイムノクロマトグラフィー用キットは、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップと、前記被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体と、所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤とを備えることを特徴とする。また、本発明に係るイムノクロマトグラフィー用キットは、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップと、前記被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体と、所定のシグナルを発する増感物質で被検物質の前記所定部位を認識する抗体を標識した標識抗体と、被検物質とを備えることを特徴とする。
【００１１】
被検物質を検出するに際しては、先ず、被検物質を含む試験溶液と標識第２抗体とを混合し、展開する。試験溶液中に被検物質が存在する場合、混合物中で形成された被検物質−標識第２抗体複合体が、テストストリップに固定化された第１抗体に捕捉される。その結果、テストストリップ上に第１抗体−被検物質−標識第２抗体複合体が形成される。ここまでは従来のクロマトグラフィー法を利用した検出法と同様である。この時点においても判定部に集積した標識物質からのシグナル（発色又は発光）が観察されるが、試験溶液中の被検物質が低濃度の場合には標識物質の集積量が不十分となり、弱いシグナルしか得られないことがある。
【００１２】
そこで本発明では、所定のシグナルを発する増感物質に第１抗体と同一部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤を展開する。ストリップ上に形成された第１抗体−被検物質−標識第２抗体複合体に対し増感剤が結合する結果、判定部に標識物質と増感物質の両方が集積し、シグナルの増強が図られる。以上のように、増感剤を用いることで、試験溶液中の被検物質濃度が低い場合であっても判定部において強いシグナルが得られる。
【００１３】
なお、増感剤を構成する被検物質は既に第１抗体と同一部位を認識する抗体に結合した状態とされているため、テストストリップに固定化された第１抗体に複合体が直接結合することはない。このため、判定部に標識第２抗体が存在しない場合（試験溶液中に被検物質が含まれない場合）、シグナルの増強は起こらず、正確な検出が実現される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の被検物質の検出方法によれば、試験溶液中の被検物質が低濃度の場合であっても、充分に強いシグナルを得ることができるため、検出感度の向上を図ることができる。また、本発明の被検物質の検出方法によれば、基本的には肉眼で検出可能であり、ほとんどの場合検出に際して特別な装置は不要であるため、試験溶液中の被検物質の高感度な検出を迅速かつ簡便に実施することができる。
【００１５】
本発明のイムノクロマトグラフィー用キットは、例えば患者の傍で行う臨床検査（いわゆるポイントオブケア検査）等の用途に非常に有用である。さらに、通常のイムノクロマトグラフィー法で用いられる材料で増感剤を調製できるため、材料の入手が容易で安価であるという利点も備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の被検物質の検出方法、増感剤及びイムノクロマトグラフィー用キットについて、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１７】
本発明の検出方法では、生体物質、合成物質等あらゆる物質を被検物質とすることができる。また、被検物質を含む試験溶液としては、例えば血液、血清、尿等の生体由来の試料溶液、自然環境から採取した水や土壌等を含む試料溶液、これらを調製して得た溶液等、任意のものを用いることができる。
【００１８】
本発明の検出方法においては、図１に示すように２種類の抗体、すなわち第１抗体１及び第２抗体２を用いる。これら抗体は、検出対象となる被検物質３上の異なる部位をそれぞれ認識して特異的に結合するものである。また、本発明の被検物質の検出方法は、判定部（テストラインＴ）に第１抗体１を固定化したテストストリップ４と、標識物質５で前記第２抗体２を標識した標識第２抗体６とを用意する。そして、テストストリップ４に被検物質３を含む試験溶液及び標識第２抗体６を展開した後、所定のシグナルを発する増感物質に前記第１抗体１の認識部位と同一部位を認識する抗体を介して被検物質３を結合させた増感剤７を展開する点に特徴の１つがある。以下、図１〜図３の説明では、増感剤７を構成する抗体として第１抗体１を用い、増感物質として標識物質５を用いた場合を例に挙げて説明する。
【００１９】
試験溶液中の被検物質３の検出に際しては、先ず、試験溶液と標識第２抗体６を混合した後、テストストリップ４を構成するメンブレン８の一端に吸収させ、展開する。試験溶液中に被検物質３が存在する場合には、図２に示すように、混合物中で形成された被検物質３と標識第２抗体６との複合体が矢印Ａで示す方向に移動し、メンブレン８に固定化された第１抗体１（テストラインＴ）に捕捉される。この結果、第１抗体１−被検物質３−標識第２抗体６からなる複合体が形成される。一方、試験溶液中に被検物質３が存在しない場合、標識第２抗体６は複合体を形成できないため、第１抗体１に捕捉されることなく、テストラインＴを通過する。ここまでは従来のイムノクロマトグラフィー法を利用した検出法と同様である。
【００２０】
本発明では、次に、図３に示すように、メンブレン８の一端に増感剤７を含む溶液を吸収させ、展開させる。テストラインＴに標識第２抗体６が捕捉されている場合、増感剤７を構成する第１抗体１が被検物質３をサンドイッチするような状態で標識第２抗体６と結合する結果、増感剤７は標識第２抗体６に捕捉される。この結果、第１抗体１−被検物質３−標識第２抗体６−増感剤７からなる複合体が形成される。増感剤７が捕捉される結果、テストラインＴにおける標識物質５の集積量が増加するため、増感される。したがって、本発明によりイムノクロマトグラフィー法の検出感度の向上を図ることができる。
【００２１】
増感剤７と標識第２抗体６とは下記のいずれかの状態で結合する。１つは、標識第２抗体６（第２抗体２）の抗原結合部位のうち被検物質３の結合していない部位と増感剤７を構成する被検物質３とが結合することによる。もう１つは、標識第２抗体６に結合している試験溶液由来の被検物質３と、増感剤７を構成する第１抗体１の抗原結合部位のうち被検物質３の結合していない部位とが結合することによる。
【００２２】
なお、増感剤７を構成する被検物質３は、当該増感剤７を構成する第１抗体１と既に結合しているため、メンブレン８に固定された第１抗体１には結合しない。このため、テストラインＴに標識第２抗体６が捕捉されていない場合、すなわち、試験溶液中に被検物質３が存在しなかった場合、テストラインＴにおいて増感剤７に起因するシグナルを発生することはない。したがって、本発明の検出方法は、試験溶液中に被検物質３が存在する場合のみテストラインＴにおけるシグナル強度を増強させるため、正確な検出が可能である。
【００２３】
以上のような検出方法で用いられる増感剤の調製法は任意である。例えば増感剤は、所定のシグナルを発する増感物質で第１抗体と被検物質の同一部位を認識する抗体を標識し、得られた標識抗体と被検物質とを混合し、これらを結合させることによって調製される。
【００２４】
増感剤を構成する抗体としては、被検物質に対する認識部位が第１抗体と同一である抗体をいずれも使用できるが、材料の入手が容易であることから、前記抗体として第１抗体を用いることが好ましい。例えば被検物質としてｈＣＧを検出する場合であって、テストストリップにＨαＳ抗体を固定している場合、増感剤を構成する抗体としてＨαＳ抗体を用いることが好ましい。
【００２５】
増感剤を構成する増感物質としては、所定のシグナルを発し、通常のイムノクロマトグラフィー法において標識物質として用いられるものをいずれも使用可能である。ただし、迅速且つ簡便な検出を可能とすることから、肉眼で検出可能なシグナルを発する発色物質又は発光物質を増感物質として用いることが好ましく、特に発色物質を用いることが好ましい。具体的な発色物質としては、金コロイド等の可視領域に特異的な吸収帯を有するコロイド金属、ラテックス微粒子、銀微粒子等の発色剤を包含したリポソーム等を使用することが可能である。また、より高感度の測定を実施する際には、増感物質として発光物質や蛍光物質等を用いることが好ましく、より具体的には蛍光微粒子等が挙げられる。ただし、増感物質として発光物質や蛍光物質等を用いる場合、測定機器が必要になることがある。
【００２６】
増感物質（増感剤）としては、標識第２抗体を構成する標識物質と同種材料を用いることができる。この場合、増感物質と標識物質とからそれぞれほぼ同一のシグナルが発せられるため、シグナル増強による検出感度の向上効果を確実に得ることができる。また、増感物質及び標識物質を同種材料とすることは、材料の入手が容易である点においても好ましい。増感物質と標識物質とで同種材料を用いる場合、それぞれの寸法（粒径）は同じでもよく、異なっていてもよい。増感物質と標識物質とで同種発色微粒子を用いる場合、互いに粒径を異ならせることで発色波長の変化（ピークシフト）あるいは発色波長強度の変化が観察される。
【００２７】
標識第２抗体を構成する標識物質と増感物質とを異種材料とすることもできる。増感物質と標識物質とを異種材料とする場合、増感物質と標識物質との組合せとしては、例えば金コロイド−蛍光微粒子、異種蛍光微粒子、金コロイド−銀微粒子包含リポソーム、タンパク質発色剤−銀微粒子包含リポソーム等が挙げられる。異種蛍光微粒子の組合せの場合、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー転移）の原理を利用して発せられる蛍光を検出することにより、さらなる検出感度の向上を図ることが可能である。
【００２８】
ＦＲＥＴの原理を利用する際には、標識物質及び増感物質として、蛍光物質で被覆したビーズや、ＱＤ（量子ドット）等を用いることができる。具体的には、波長５４６ｎｍの光で励起され５６１ｎｍ付近の蛍光を発する化学物質（例えばChromeon 546等）でビーズを被覆し、これと抗体とを結合させて標識第２抗体とする。一方、前記標識第２抗体から発せられる蛍光によって励起され６６０ｎｍ付近の蛍光を発する化学物質（例えばChromeon 642等）でビーズを被覆し、これと抗体とを結合させるとともに、被検物質を結合させて増感剤とする。この場合、標識第２抗体と増感剤とが結合する（近接する）ことによって、５６１ｎｍ付近の蛍光強度が弱くなるとともに６６０ｎｍ付近の蛍光強度が強くなるため、これを指標として被検物質を検出できる。
【００２９】
増感剤における抗体と被検物質との存在比は任意であるが、あらゆる被検物質濃度の試験溶液の検出に際して確実なシグナル増強効果を確保する見地から、増感剤においては、被検物質が結合した抗原結合部位と被検物質が結合していない抗原結合部位との両方を存在させることが好ましい。被検物質の結合した抗原結合部位と被検物質の結合していない抗原結合部位との好ましい比率は、概ね１：１である。
【００３０】
例えば、増感剤において被検物質の結合していない抗原結合部位を相対的に多くし過ぎると、被検物質濃度の低い試験溶液を検査する場合にシグナルの増強が困難となるおそれがある。これは、標識第２抗体の表面に提示される被検物質の量が少なくなる結果、増感剤が標識第２抗体に結合し難くなるためである。逆に、被検物質の結合している抗原結合部位を相対的に多くし過ぎると、正確な検出が困難となるおそれがある。これは、増感剤を調製する際に発生した余剰の被検物質が、テストラインＴの上流に残存している標識第２抗体と結合した後、展開され、固定化第１抗体に捕捉される結果、試験溶液中に被検物質が存在しないにもかかわらずテストラインＴにおいてシグナルを発するからである。また、試験溶液中の被検物質が高濃度のときのシグナル増強が困難となるおそれがある
【００３１】
なお、「増感剤において、被検物質が結合した抗原結合部位と被検物質が結合していない抗原結合部位との両方を存在させる」とは、例えば個々の増感剤分子や個々の抗体において、被検物質の結合した抗原結合部位と被検物質の結合していない抗原結合部位との両方を存在させるという意味ではなく、実際の検査に用いる量の増感剤を全体で見たときに被検物質の結合した抗原結合部位と被検物質の結合していない抗原結合部位との両方が存在している状態を表す。
【００３２】
増感剤を保存する際には、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液に増感剤が溶解されている場合、４℃以下の環境で保存することが好ましい。
【００３３】
前記増感剤は、例えば１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液等に溶解した状態で、前記ストリップに対し展開させればよい。
【００３４】
標識第２抗体は、第２抗体を標識物質で標識することにより調製される。第２抗体は、第１抗体と異なる部位を認識して被検物質と特異的に結合する抗体であればよい。例えば被検物質としてｈＣＧを検出する場合であって、第１抗体としてＨαＳ抗体を用いる場合、第２抗体としてはｈＣＧのβ−サブユニットを認識する抗体（ｈＣＧ抗体）を用いることが好ましい。
【００３５】
標識第２抗体を構成する具体的な標識物質としては、所定のシグナルを発し、通常のイムノクロマトグラフィー法において標識物質として用いられるものをいずれも使用可能である。ただし、迅速且つ簡便な検出を可能とすることから、肉眼で検出可能なシグナルを発する発色物質又は発光物質を標識物質として用いることが好ましく、特に発色物質を用いることが好ましい。具体的な発色物質としては、金コロイド等のコロイド金属、ラテックス微粒子、銀微粒子等の発色剤を包含したリポソーム等を使用することが可能である。また、より高感度の測定を実施する際には、標識物質として発光物質や蛍光物質等を用いることが好ましく、より具体的には蛍光微粒子等が挙げられる。ただし、標識物質として発光物質や蛍光物質等を用いる場合、測定機器が必要になることがある。
【００３６】
なお、標識第２抗体は、テストストリップを滴下又は吸収させる前の試験溶液と混合してもよいし、テストストリップにおいてテストラインより上流側に展開可能な状態で保持されていてもよい。
【００３７】
テストストリップとしては、第１抗体が固定化された判定部（テストライン）を備える構成であれば、この種のイムノクロマトグラフィー法に用いられるテストストリップを制限無く用いることができる。テストストリップを構成するメンブレンも特に限定されるものではなく、例えばニトロセルロース等を用いることができる。メンブレンへの第１抗体の固定化は常法に従って行えばよく、例えば塗布すればよい。テストラインＴの形状は図１では展開方向に略直交する帯状であるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
テストストリップ４は、図４に示すように、テストラインＴに捕捉されなかった標識第２抗体６を捕捉するためのコントロールラインＣをテストラインＴより下流側に備えていることが好ましい。コントロールラインＣは、標識第２抗体６を認識する第３抗体９が塗布、固定化されて構成される。コントロールラインＣにおいて標識物質からのシグナル（発色又は発光）が観察されることにより、検査の終了が示される。
【００３９】
また、図４に示すように、テストストリップ４は、メンブレン８の下流側端部に吸収パット１０を備え、ここで余剰の展開液等を吸収させることが好ましい。
【００４０】
本発明のイムノクロマトグラフィー用キットは、前述したようなテストストリップと標識第２抗体と増感剤とを少なくとも備えるものである。本発明のキットを用いることにより、試験溶液中の被検物質の高感度検出を迅速かつ簡便に実施することができる。
【００４１】
また、本発明のイムノクロマトグラフィー用キットは、増感剤を原料の状態で備えてもよい。この場合、イムノクロマトグラフィー用キットは、少なくともテストストリップと、標識第２抗体と、第１抗体と被検物質の同一部位を認識する抗体を増感物質で標識した標識抗体と、被検物質とにより構成される。検査に際しては、標識抗体と被検物質とを混合することで増感剤を調製すればよい。例えば増感物質が金コロイド又は蛍光微粒子である場合、被検物質及び前記標識抗体を凍結乾燥しておくことによりキットの常温保存が可能となる。なお、被検物質及び標識抗体を凍結乾燥した場合であっても、長期保存の際には例えば４℃等の低温環境で保存することが好ましい。
【００４２】
なお、肉眼で検出困難な物質（例えば蛍光物質、発光物質等）を増感物質及び標識物質として用いる場合、イムノクロマトグラフィー用キットは、当該物質からのシグナルを検出し得る測定機をさらに備えることが好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例について、実験結果を参照しながら説明する。
本実施例では、被検物質として妊娠検査のマーカーであるＨＣＧ（ヒトゴナドトロピン）を用いてモデル実験を行った。第１抗体としてはＨＣＧのα−サブユニットを認識するモノクローナル抗体（抗ＨαＳ抗体）を用いた。第２抗体としては、ＨＣＧのβ−サブユニットを認識するモノクローナル抗体（抗ＨＣＧ抗体）を用いた。
【００４４】
（実験１）
実験１では、増感剤の効果について検討した。
先ず、メンブレンのテストラインに対応する領域に抗ＨαＳ抗体を塗布し、コントロールラインに対応する領域に抗マウスＩｇＧ抗体を塗布した。その後、ブロッキング、ウオッシングを行い、テストストリップを得た。
【００４５】
また、抗ＨＣＧ抗体と金コロイド溶液（田中貴金属製、粒径４０ｎｍ）とを混合し、標識第２抗体として金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体を作製した。金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体を含む溶液のＯ．Ｄ．値（５８０ｎｍ）は、６．０となるように調製した。
【００４６】
増感剤は以下のように作製した。先ず、抗ＨαＳ抗体に対して異なる粒径の金コロイド（４０ｎｍ，８０ｎｍ）をそれぞれ標識した。溶液のＯ．Ｄ値（５８０ｎｍ）は６．０となるように調製した。これにより得られた金コロイド標識抗ＨαＳ抗体含有溶液と濃度を１ｎｇ／ｍｌに調整したＨＣＧ溶液４０μｌとを混合し、増感剤を得た。
【００４７】
（比較例）
前記テストストリップ、金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体及び増感剤を用いて、ＨＣＧの検出を行った。先ず、４０μｌの抗原溶液（ＨＣＧ濃度：０．１ｎｇ／ｍｌ，０．０５ｎｇ／ｍｌ，０．０２５ｎｇ／ｍｌ）に対して前記金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体を４μｌ加え混合した。混合した溶液をテストストリップに吸収させ、テストラインにおける金コロイドの集積による呈色を観察した。結果を図５に示す。図５中、矢印で示すラインがテストラインに相当する。
【００４８】
（実施例）
実施例では、前記比較例の操作を行った後のテストストリップに増感剤を展開させた。具体的には、濃度を１ｎｇ／ｍｌに調整したＨＣＧ溶液４０μｌと前記金コロイド標識抗ＨαＳ抗体含有溶液４μｌとを混合して増感剤を調製し、比較例の操作後のテストストリップに対し増感剤を含む溶液を吸収させ、展開させた。その後、テストラインにおける金コロイドの集積による呈色を観察した。結果を図６に示す。
【００４９】
（結果）
図５から明らかなように、試験溶液と金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体との混合物を展開しただけの比較例においては、テストラインにおける赤色の呈色はほとんど確認できず、ＨＣＧの検出は困難であった。
【００５０】
これに対し、図６に示すように、粒径４０ｎｍの金コロイドを含む増感剤を展開することで、テストラインにおける発色が増強されており、濃度０．０５ｎｇ／ｍｌのＨＣＧの検出が実現された。また、粒径８０ｎｍの金コロイドを含む増感剤を展開した場合、さらに低濃度のＨＣＧ（０．０２５ｎｇ／ｍｌ）の検出も可能となっている。これらテストライン上の発色の増強は、テストラインに捕捉された金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体に対しさらに増感剤（金コロイド標識第１抗体）が結合し、テストライン上における金コロイドの集積量が増加したためと推測される。
【００５１】
以上の実験結果が示すように、増感剤を展開することで増感され、通常のイムノクロマトグラフィー法では検出不可能であった低濃度の抗原（ＨＣＧ）を検出することが可能となった。
【００５２】
（実験２）
実験２では、ＢＩＡＣＯＲＥ社製の分析装置を用いて増感剤と金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体との結合を分析した。
【００５３】
先ず、通常のイムノクロマトグラフィー法でメンブレンに固定化させる第１抗体と同濃度の抗体（抗ＨαＳ抗体）を、センサーチップのＡｕ基板に物理吸着させた。サンプルとして金コロイド（粒径４０ｎｍ）標識抗ＨＣＧ抗体と濃度０．０２ｎｍ／ｍｌのＨＣＧとを混合し、流動させた。その後、粒径４０ｎｍの金コロイドを用いた増感剤（金コロイド標識第１抗体）を流動させた。このときのセンサーチップ表面における２分子の結合及び解離に伴って生じる質量変化を、表面プラズモン共鳴を利用して測定した。結果を図７に示す。図７中、縦軸はセンサーチップ表面での質量変化、横軸は時間を表す。縦軸の単位はＲｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ（ＲＵ）で表され、１ＲＵは１ｐｇ／ｍｍ２に相当する。
【００５４】
図７に示すように、先ず、金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体と第１抗体（抗ＨαＳ抗体）との結合が観察された。次いで、金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体と第１抗体（抗ＨαＳ抗体）との複合体に対して、さらに増感剤（金コロイド標識第１抗体）が結合していることが確認された。なお、金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体の結合量は、図７中、２のラインと３のラインとの差で表される。増感剤の結合量は、図７中、１のラインと２のラインとの差で表される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の被検物質の検出方法の一例であり、試験溶液展開前のテストライン付近を示す要部拡大斜視図である。
【図２】本発明の被検物質の検出方法の一例であり、試験溶液と標識第２抗体とを展開した後のテストライン付近を示す要部拡大斜視図である。
【図３】本発明の被検物質の検出方法の一例であり、増感剤を展開した後のテストライン付近を示す要部拡大斜視図である。
【図４】本発明に用いられるテストストリップの一例を示す概略斜視図である。
【図５】比較例の検査結果を示す写真である。
【図６】実施例の検査結果を示す写真である。
【図７】増感剤等の結合を分析した結果を示す特性図である。
【符号の説明】
【００５６】
１ 第１抗体、２ 第２抗体、３ 被検物質、４ テストストリップ、５ 標識物質、６ 標識第２抗体、７ 増感剤、８ メンブレン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開する被検物質の検出方法に関し、さらには増感剤及びイムノクロマトグラフィー用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の微量の被検物質を検出する方法としては、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法やＭＥＩＡ（microparticle enzyme-based immunoassay）法等が普及しているが、これら検出法は、操作時間や反応時間に長時間を要し、また、測定操作が煩雑等の問題がある。
【０００３】
そこで近年、ＥＬＩＳＡ法等に代わる分析法として、イムノクロマトグラフィー法を利用した分析法が注目されている。イムノクロマトグラフィー法は、保存安定性、迅速測定、判定の容易さ、特別な付属装置が不要等の様々な点で優れているため、例えばインフルエンザ検査、ＨＣＶ検査、ＰＳＡ検査等を目的としたポイントオブケア検査の分野において汎用されている。
【０００４】
イムノクロマトグラフィー法を利用した被検物質の検出は、例えば以下のような工程を経る。先ず、被検物質の異なる部位を認識する２種類の抗体を用意し、一方の抗体（第１抗体）はテストストリップのテストラインと呼ばれる領域に塗布・固定しておき、他方の抗体（第２抗体）には金コロイド粒子を標識しておく。そして、試験溶液と金コロイド標識第２抗体と混合し、テストストリップの一端に吸収させ、展開する。試験溶液中に被検物質が存在する場合には、混合物中で形成された被検物質−金コロイド標識第２抗体複合体がテストライン上の固定化第１抗体に捕捉され、固定化第１抗体−被検物質−金コロイド標識第１抗体複合体が形成される。その結果、テストラインにおいて、金コロイドの赤色の呈色が観察される。一方、試験溶液中に被検物質が存在しない場合、テストラインにおける金コロイド標識第２抗体の集積が起こらないため、呈色しない。
【０００５】
しかしながら、イムノクロマトグラフィー法は感度の点で問題があり、測定対象物によっては充分な感度が得られない場合がある。例えば試験溶液中の被検物質濃度が極めて低濃度であると、テストラインにおける金コロイドの集積量が不十分となり、発色が極めて薄くなり、陰性と誤判定されるおそれがある。
【０００６】
そこで、イムノクロマトグラフィー法の検出感度向上を目的とした研究が各方面で進められている。例えば、磁性微粒子によって二次抗体を標識し、テストストリップ上の磁気の変化を指標として被検物質を検出する方法や、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素で二次抗体を標識し、発色剤を後から展開する方法が広く知られている。酵素標識二次抗体を用いる方法としては、ペルオキシダーゼを使用する酵素免疫測定において塩基の存在下に酵素免疫測定を行う方法（例えば、特許文献１等参照。）等が提案されている。
【特許文献１】特開２００１−７４７４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、磁性微粒子標識や酵素標識二次抗体の展開後に発色剤を展開する方法では、特別な検出装置が必要であり検出操作が煩雑となるばかりか、磁気変化の検出や酵素反応等に時間を要するという問題がある。
【０００８】
そこで本発明は前述の実情に鑑みて提案されたものであり、試験溶液中の被検物質の高感度な検出を迅速かつ簡便に行うことが可能な被検物質の検出方法を提供することを目的とする。また、本発明は、前記検出方法に用いる増感剤及びイムノクロマトグラフィー用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前述の課題を解決するために、本発明に係る被検物質の検出方法は、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開した後、所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤を展開することを特徴とする。また、本発明に係る増感剤は、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開するイムノクロマトグラフィー法に用いられ、所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させたことを特徴とする。
【００１０】
本発明に係るイムノクロマトグラフィー用キットは、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップと、前記被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体と、所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤とを備えることを特徴とする。また、本発明に係るイムノクロマトグラフィー用キットは、被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップと、前記被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体と、所定のシグナルを発する増感物質で被検物質の前記所定部位を認識する抗体を標識した標識抗体と、被検物質とを備えることを特徴とする。
【００１１】
被検物質を検出するに際しては、先ず、被検物質を含む試験溶液と標識第２抗体とを混合し、展開する。試験溶液中に被検物質が存在する場合、混合物中で形成された被検物質−標識第２抗体複合体が、テストストリップに固定化された第１抗体に捕捉される。その結果、テストストリップ上に第１抗体−被検物質−標識第２抗体複合体が形成される。ここまでは従来のクロマトグラフィー法を利用した検出法と同様である。この時点においても判定部に集積した標識物質からのシグナル（発色又は発光）が観察されるが、試験溶液中の被検物質が低濃度の場合には標識物質の集積量が不十分となり、弱いシグナルしか得られないことがある。
【００１２】
そこで本発明では、所定のシグナルを発する増感物質に第１抗体と同一部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤を展開する。ストリップ上に形成された第１抗体−被検物質−標識第２抗体複合体に対し増感剤が結合する結果、判定部に標識物質と増感物質の両方が集積し、シグナルの増強が図られる。以上のように、増感剤を用いることで、試験溶液中の被検物質濃度が低い場合であっても判定部において強いシグナルが得られる。
【００１３】
なお、増感剤を構成する被検物質は既に第１抗体と同一部位を認識する抗体に結合した状態とされているため、テストストリップに固定化された第１抗体に複合体が直接結合することはない。このため、判定部に標識第２抗体が存在しない場合（試験溶液中に被検物質が含まれない場合）、シグナルの増強は起こらず、正確な検出が実現される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の被検物質の検出方法によれば、試験溶液中の被検物質が低濃度の場合であっても、充分に強いシグナルを得ることができるため、検出感度の向上を図ることができる。また、本発明の被検物質の検出方法によれば、基本的には肉眼で検出可能であり、ほとんどの場合検出に際して特別な装置は不要であるため、試験溶液中の被検物質の高感度な検出を迅速かつ簡便に実施することができる。
【００１５】
本発明のイムノクロマトグラフィー用キットは、例えば患者の傍で行う臨床検査（いわゆるポイントオブケア検査）等の用途に非常に有用である。さらに、通常のイムノクロマトグラフィー法で用いられる材料で増感剤を調製できるため、材料の入手が容易で安価であるという利点も備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の被検物質の検出方法、増感剤及びイムノクロマトグラフィー用キットについて、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１７】
本発明の検出方法では、生体物質、合成物質等あらゆる物質を被検物質とすることができる。また、被検物質を含む試験溶液としては、例えば血液、血清、尿等の生体由来の試料溶液、自然環境から採取した水や土壌等を含む試料溶液、これらを調製して得た溶液等、任意のものを用いることができる。
【００１８】
本発明の検出方法においては、図１に示すように２種類の抗体、すなわち第１抗体１及び第２抗体２を用いる。これら抗体は、検出対象となる被検物質３上の異なる部位をそれぞれ認識して特異的に結合するものである。また、本発明の被検物質の検出方法は、判定部（テストラインＴ）に第１抗体１を固定化したテストストリップ４と、標識物質５で前記第２抗体２を標識した標識第２抗体６とを用意する。そして、テストストリップ４に被検物質３を含む試験溶液及び標識第２抗体６を展開した後、所定のシグナルを発する増感物質に前記第１抗体１の認識部位と同一部位を認識する抗体を介して被検物質３を結合させた増感剤７を展開する点に特徴の１つがある。以下、図１〜図３の説明では、増感剤７を構成する抗体として第１抗体１を用い、増感物質として標識物質５を用いた場合を例に挙げて説明する。
【００１９】
試験溶液中の被検物質３の検出に際しては、先ず、試験溶液と標識第２抗体６を混合した後、テストストリップ４を構成するメンブレン８の一端に吸収させ、展開する。試験溶液中に被検物質３が存在する場合には、図２に示すように、混合物中で形成された被検物質３と標識第２抗体６との複合体が矢印Ａで示す方向に移動し、メンブレン８に固定化された第１抗体１（テストラインＴ）に捕捉される。この結果、第１抗体１−被検物質３−標識第２抗体６からなる複合体が形成される。一方、試験溶液中に被検物質３が存在しない場合、標識第２抗体６は複合体を形成できないため、第１抗体１に捕捉されることなく、テストラインＴを通過する。ここまでは従来のイムノクロマトグラフィー法を利用した検出法と同様である。
【００２０】
本発明では、次に、図３に示すように、メンブレン８の一端に増感剤７を含む溶液を吸収させ、展開させる。テストラインＴに標識第２抗体６が捕捉されている場合、増感剤７を構成する第１抗体１が被検物質３をサンドイッチするような状態で標識第２抗体６と結合する結果、増感剤７は標識第２抗体６に捕捉される。この結果、第１抗体１−被検物質３−標識第２抗体６−増感剤７からなる複合体が形成される。増感剤７が捕捉される結果、テストラインＴにおける標識物質５の集積量が増加するため、増感される。したがって、本発明によりイムノクロマトグラフィー法の検出感度の向上を図ることができる。
【００２１】
増感剤７と標識第２抗体６とは下記のいずれかの状態で結合する。１つは、標識第２抗体６（第２抗体２）の抗原結合部位のうち被検物質３の結合していない部位と増感剤７を構成する被検物質３とが結合することによる。もう１つは、標識第２抗体６に結合している試験溶液由来の被検物質３と、増感剤７を構成する第１抗体１の抗原結合部位のうち被検物質３の結合していない部位とが結合することによる。
【００２２】
なお、増感剤７を構成する被検物質３は、当該増感剤７を構成する第１抗体１と既に結合しているため、メンブレン８に固定された第１抗体１には結合しない。このため、テストラインＴに標識第２抗体６が捕捉されていない場合、すなわち、試験溶液中に被検物質３が存在しなかった場合、テストラインＴにおいて増感剤７に起因するシグナルを発生することはない。したがって、本発明の検出方法は、試験溶液中に被検物質３が存在する場合のみテストラインＴにおけるシグナル強度を増強させるため、正確な検出が可能である。
【００２３】
以上のような検出方法で用いられる増感剤の調製法は任意である。例えば増感剤は、所定のシグナルを発する増感物質で第１抗体と被検物質の同一部位を認識する抗体を標識し、得られた標識抗体と被検物質とを混合し、これらを結合させることによって調製される。
【００２４】
増感剤を構成する抗体としては、被検物質に対する認識部位が第１抗体と同一である抗体をいずれも使用できるが、材料の入手が容易であることから、前記抗体として第１抗体を用いることが好ましい。例えば被検物質としてｈＣＧを検出する場合であって、テストストリップにＨαＳ抗体を固定している場合、増感剤を構成する抗体としてＨαＳ抗体を用いることが好ましい。
【００２５】
増感剤を構成する増感物質としては、所定のシグナルを発し、通常のイムノクロマトグラフィー法において標識物質として用いられるものをいずれも使用可能である。ただし、迅速且つ簡便な検出を可能とすることから、肉眼で検出可能なシグナルを発する発色物質又は発光物質を増感物質として用いることが好ましく、特に発色物質を用いることが好ましい。具体的な発色物質としては、金コロイド等の可視領域に特異的な吸収帯を有するコロイド金属、ラテックス微粒子、銀微粒子等の発色剤を包含したリポソーム等を使用することが可能である。また、より高感度の測定を実施する際には、増感物質として発光物質や蛍光物質等を用いることが好ましく、より具体的には蛍光微粒子等が挙げられる。ただし、増感物質として発光物質や蛍光物質等を用いる場合、測定機器が必要になることがある。
【００２６】
増感物質（増感剤）としては、標識第２抗体を構成する標識物質と同種材料を用いることができる。この場合、増感物質と標識物質とからそれぞれほぼ同一のシグナルが発せられるため、シグナル増強による検出感度の向上効果を確実に得ることができる。また、増感物質及び標識物質を同種材料とすることは、材料の入手が容易である点においても好ましい。増感物質と標識物質とで同種材料を用いる場合、それぞれの寸法（粒径）は同じでもよく、異なっていてもよい。増感物質と標識物質とで同種発色微粒子を用いる場合、互いに粒径を異ならせることで発色波長の変化（ピークシフト）あるいは発色波長強度の変化が観察される。
【００２７】
標識第２抗体を構成する標識物質と増感物質とを異種材料とすることもできる。増感物質と標識物質とを異種材料とする場合、増感物質と標識物質との組合せとしては、例えば金コロイド−蛍光微粒子、異種蛍光微粒子、金コロイド−銀微粒子包含リポソーム、タンパク質発色剤−銀微粒子包含リポソーム等が挙げられる。異種蛍光微粒子の組合せの場合、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー転移）の原理を利用して発せられる蛍光を検出することにより、さらなる検出感度の向上を図ることが可能である。
【００２８】
ＦＲＥＴの原理を利用する際には、標識物質及び増感物質として、蛍光物質で被覆したビーズや、ＱＤ（量子ドット）等を用いることができる。具体的には、波長５４６ｎｍの光で励起され５６１ｎｍ付近の蛍光を発する化学物質（例えばChromeon 546等）でビーズを被覆し、これと抗体とを結合させて標識第２抗体とする。一方、前記標識第２抗体から発せられる蛍光によって励起され６６０ｎｍ付近の蛍光を発する化学物質（例えばChromeon 642等）でビーズを被覆し、これと抗体とを結合させるとともに、被検物質を結合させて増感剤とする。この場合、標識第２抗体と増感剤とが結合する（近接する）ことによって、５６１ｎｍ付近の蛍光強度が弱くなるとともに６６０ｎｍ付近の蛍光強度が強くなるため、これを指標として被検物質を検出できる。
【００２９】
増感剤における抗体と被検物質との存在比は任意であるが、あらゆる被検物質濃度の試験溶液の検出に際して確実なシグナル増強効果を確保する見地から、増感剤においては、被検物質が結合した抗原結合部位と被検物質が結合していない抗原結合部位との両方を存在させることが好ましい。被検物質の結合した抗原結合部位と被検物質の結合していない抗原結合部位との好ましい比率は、概ね１：１である。
【００３０】
例えば、増感剤において被検物質の結合していない抗原結合部位を相対的に多くし過ぎると、被検物質濃度の低い試験溶液を検査する場合にシグナルの増強が困難となるおそれがある。これは、標識第２抗体の表面に提示される被検物質の量が少なくなる結果、増感剤が標識第２抗体に結合し難くなるためである。逆に、被検物質の結合している抗原結合部位を相対的に多くし過ぎると、正確な検出が困難となるおそれがある。これは、増感剤を調製する際に発生した余剰の被検物質が、テストラインＴの上流に残存している標識第２抗体と結合した後、展開され、固定化第１抗体に捕捉される結果、試験溶液中に被検物質が存在しないにもかかわらずテストラインＴにおいてシグナルを発するからである。また、試験溶液中の被検物質が高濃度のときのシグナル増強が困難となるおそれがある
【００３１】
なお、「増感剤において、被検物質が結合した抗原結合部位と被検物質が結合していない抗原結合部位との両方を存在させる」とは、例えば個々の増感剤分子や個々の抗体において、被検物質の結合した抗原結合部位と被検物質の結合していない抗原結合部位との両方を存在させるという意味ではなく、実際の検査に用いる量の増感剤を全体で見たときに被検物質の結合した抗原結合部位と被検物質の結合していない抗原結合部位との両方が存在している状態を表す。
【００３２】
増感剤を保存する際には、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液に増感剤が溶解されている場合、４℃以下の環境で保存することが好ましい。
【００３３】
前記増感剤は、例えば１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液等に溶解した状態で、前記ストリップに対し展開させればよい。
【００３４】
標識第２抗体は、第２抗体を標識物質で標識することにより調製される。第２抗体は、第１抗体と異なる部位を認識して被検物質と特異的に結合する抗体であればよい。例えば被検物質としてｈＣＧを検出する場合であって、第１抗体としてＨαＳ抗体を用いる場合、第２抗体としてはｈＣＧのβ−サブユニットを認識する抗体（ｈＣＧ抗体）を用いることが好ましい。
【００３５】
標識第２抗体を構成する具体的な標識物質としては、所定のシグナルを発し、通常のイムノクロマトグラフィー法において標識物質として用いられるものをいずれも使用可能である。ただし、迅速且つ簡便な検出を可能とすることから、肉眼で検出可能なシグナルを発する発色物質又は発光物質を標識物質として用いることが好ましく、特に発色物質を用いることが好ましい。具体的な発色物質としては、金コロイド等のコロイド金属、ラテックス微粒子、銀微粒子等の発色剤を包含したリポソーム等を使用することが可能である。また、より高感度の測定を実施する際には、標識物質として発光物質や蛍光物質等を用いることが好ましく、より具体的には蛍光微粒子等が挙げられる。ただし、標識物質として発光物質や蛍光物質等を用いる場合、測定機器が必要になることがある。
【００３６】
なお、標識第２抗体は、テストストリップを滴下又は吸収させる前の試験溶液と混合してもよいし、テストストリップにおいてテストラインより上流側に展開可能な状態で保持されていてもよい。
【００３７】
テストストリップとしては、第１抗体が固定化された判定部（テストライン）を備える構成であれば、この種のイムノクロマトグラフィー法に用いられるテストストリップを制限無く用いることができる。テストストリップを構成するメンブレンも特に限定されるものではなく、例えばニトロセルロース等を用いることができる。メンブレンへの第１抗体の固定化は常法に従って行えばよく、例えば塗布すればよい。テストラインＴの形状は図１では展開方向に略直交する帯状であるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
テストストリップ４は、図４に示すように、テストラインＴに捕捉されなかった標識第２抗体６を捕捉するためのコントロールラインＣをテストラインＴより下流側に備えていることが好ましい。コントロールラインＣは、標識第２抗体６を認識する第３抗体９が塗布、固定化されて構成される。コントロールラインＣにおいて標識物質からのシグナル（発色又は発光）が観察されることにより、検査の終了が示される。
【００３９】
また、図４に示すように、テストストリップ４は、メンブレン８の下流側端部に吸収パット１０を備え、ここで余剰の展開液等を吸収させることが好ましい。
【００４０】
本発明のイムノクロマトグラフィー用キットは、前述したようなテストストリップと標識第２抗体と増感剤とを少なくとも備えるものである。本発明のキットを用いることにより、試験溶液中の被検物質の高感度検出を迅速かつ簡便に実施することができる。
【００４１】
また、本発明のイムノクロマトグラフィー用キットは、増感剤を原料の状態で備えてもよい。この場合、イムノクロマトグラフィー用キットは、少なくともテストストリップと、標識第２抗体と、第１抗体と被検物質の同一部位を認識する抗体を増感物質で標識した標識抗体と、被検物質とにより構成される。検査に際しては、標識抗体と被検物質とを混合することで増感剤を調製すればよい。例えば増感物質が金コロイド又は蛍光微粒子である場合、被検物質及び前記標識抗体を凍結乾燥しておくことによりキットの常温保存が可能となる。なお、被検物質及び標識抗体を凍結乾燥した場合であっても、長期保存の際には例えば４℃等の低温環境で保存することが好ましい。
【００４２】
なお、肉眼で検出困難な物質（例えば蛍光物質、発光物質等）を増感物質及び標識物質として用いる場合、イムノクロマトグラフィー用キットは、当該物質からのシグナルを検出し得る測定機をさらに備えることが好ましい。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例について、実験結果を参照しながら説明する。
本実施例では、被検物質として妊娠検査のマーカーであるＨＣＧ（ヒトゴナドトロピン）を用いてモデル実験を行った。第１抗体としてはＨＣＧのα−サブユニットを認識するモノクローナル抗体（抗ＨαＳ抗体）を用いた。第２抗体としては、ＨＣＧのβ−サブユニットを認識するモノクローナル抗体（抗ＨＣＧ抗体）を用いた。
【００４４】
（実験１）
実験１では、増感剤の効果について検討した。
先ず、メンブレンのテストラインに対応する領域に抗ＨαＳ抗体を塗布し、コントロールラインに対応する領域に抗マウスＩｇＧ抗体を塗布した。その後、ブロッキング、ウオッシングを行い、テストストリップを得た。
【００４５】
また、抗ＨＣＧ抗体と金コロイド溶液（田中貴金属製、粒径４０ｎｍ）とを混合し、標識第２抗体として金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体を作製した。金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体を含む溶液のＯ．Ｄ．値（５８０ｎｍ）は、６．０となるように調製した。
【００４６】
増感剤は以下のように作製した。先ず、抗ＨαＳ抗体に対して異なる粒径の金コロイド（４０ｎｍ，８０ｎｍ）をそれぞれ標識した。溶液のＯ．Ｄ値（５８０ｎｍ）は６．０となるように調製した。これにより得られた金コロイド標識抗ＨαＳ抗体含有溶液と濃度を１ｎｇ／ｍｌに調整したＨＣＧ溶液４０μｌとを混合し、増感剤を得た。
【００４７】
（比較例）
前記テストストリップ、金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体及び増感剤を用いて、ＨＣＧの検出を行った。先ず、４０μｌの抗原溶液（ＨＣＧ濃度：０．１ｎｇ／ｍｌ，０．０５ｎｇ／ｍｌ，０．０２５ｎｇ／ｍｌ）に対して前記金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体を４μｌ加え混合した。混合した溶液をテストストリップに吸収させ、テストラインにおける金コロイドの集積による呈色を観察した。結果を図５に示す。図５中、矢印で示すラインがテストラインに相当する。
【００４８】
（実施例）
実施例では、前記比較例の操作を行った後のテストストリップに増感剤を展開させた。具体的には、濃度を１ｎｇ／ｍｌに調整したＨＣＧ溶液４０μｌと前記金コロイド標識抗ＨαＳ抗体含有溶液４μｌとを混合して増感剤を調製し、比較例の操作後のテストストリップに対し増感剤を含む溶液を吸収させ、展開させた。その後、テストラインにおける金コロイドの集積による呈色を観察した。結果を図６に示す。
【００４９】
（結果）
図５から明らかなように、試験溶液と金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体との混合物を展開しただけの比較例においては、テストラインにおける赤色の呈色はほとんど確認できず、ＨＣＧの検出は困難であった。
【００５０】
これに対し、図６に示すように、粒径４０ｎｍの金コロイドを含む増感剤を展開することで、テストラインにおける発色が増強されており、濃度０．０５ｎｇ／ｍｌのＨＣＧの検出が実現された。また、粒径８０ｎｍの金コロイドを含む増感剤を展開した場合、さらに低濃度のＨＣＧ（０．０２５ｎｇ／ｍｌ）の検出も可能となっている。これらテストライン上の発色の増強は、テストラインに捕捉された金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体に対しさらに増感剤（金コロイド標識第１抗体）が結合し、テストライン上における金コロイドの集積量が増加したためと推測される。
【００５１】
以上の実験結果が示すように、増感剤を展開することで増感され、通常のイムノクロマトグラフィー法では検出不可能であった低濃度の抗原（ＨＣＧ）を検出することが可能となった。
【００５２】
（実験２）
実験２では、ＢＩＡＣＯＲＥ社製の分析装置を用いて増感剤と金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体との結合を分析した。
【００５３】
先ず、通常のイムノクロマトグラフィー法でメンブレンに固定化させる第１抗体と同濃度の抗体（抗ＨαＳ抗体）を、センサーチップのＡｕ基板に物理吸着させた。サンプルとして金コロイド（粒径４０ｎｍ）標識抗ＨＣＧ抗体と濃度０．０２ｎｍ／ｍｌのＨＣＧとを混合し、流動させた。その後、粒径４０ｎｍの金コロイドを用いた増感剤（金コロイド標識第１抗体）を流動させた。このときのセンサーチップ表面における２分子の結合及び解離に伴って生じる質量変化を、表面プラズモン共鳴を利用して測定した。結果を図７に示す。図７中、縦軸はセンサーチップ表面での質量変化、横軸は時間を表す。縦軸の単位はＲｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ（ＲＵ）で表され、１ＲＵは１ｐｇ／ｍｍ２に相当する。
【００５４】
図７に示すように、先ず、金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体と第１抗体（抗ＨαＳ抗体）との結合が観察された。次いで、金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体と第１抗体（抗ＨαＳ抗体）との複合体に対して、さらに増感剤（金コロイド標識第１抗体）が結合していることが確認された。なお、金コロイド標識抗ＨＣＧ抗体の結合量は、図７中、２のラインと３のラインとの差で表される。増感剤の結合量は、図７中、１のラインと２のラインとの差で表される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の被検物質の検出方法の一例であり、試験溶液展開前のテストライン付近を示す要部拡大斜視図である。
【図２】本発明の被検物質の検出方法の一例であり、試験溶液と標識第２抗体とを展開した後のテストライン付近を示す要部拡大斜視図である。
【図３】本発明の被検物質の検出方法の一例であり、増感剤を展開した後のテストライン付近を示す要部拡大斜視図である。
【図４】本発明に用いられるテストストリップの一例を示す概略斜視図である。
【図５】比較例の検査結果を示す写真である。
【図６】実施例の検査結果を示す写真である。
【図７】増感剤等の結合を分析した結果を示す特性図である。
【符号の説明】
【００５６】
１ 第１抗体、２ 第２抗体、３ 被検物質、４ テストストリップ、５ 標識物質、６ 標識第２抗体、７ 増感剤、８ メンブレン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開した後、
所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤を展開することを特徴とする被検物質の検出方法。
【請求項２】
前記増感剤を構成する抗体として、前記第１抗体を用いることを特徴とする請求項１記載の被検物質の検出方法。
【請求項３】
前記増感物質として発色物質、発光物質から選ばれる少なくとも１種を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の被検物質の検出方法。
【請求項４】
前記増感物質と前記標識物質とが同種材料からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の被検物質の検出方法。
【請求項５】
前記増感物質と前記標識物質とが異種材料からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の被検物質の検出方法。
【請求項６】
前記増感物質と前記標識物質との組合せが、金コロイド−銀微粒子包含リポソームであることを特徴とする請求項５記載の被検物質の検出方法。
【請求項７】
前記増感物質と前記標識物質とで異種蛍光微粒子を用いるとともに、蛍光共鳴エネルギー転移の原理を利用して発せられる蛍光を検出することを特徴とする請求項５記載の被検物質の検出方法。
【請求項８】
前記増感剤において、被検物質が結合した抗原結合部位と被検物質が結合していない抗原結合部位との両方を存在させることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の被検物質の検出方法。
【請求項９】
前記増感剤における被検物質が結合した抗原結合部位と被検物質が結合していない抗原結合部位との比率が概ね１：１であることを特徴とする請求項８記載の被検物質の検出方法。
【請求項１０】
被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開するイムノクロマトグラフィー法に用いられ、
所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させたことを特徴とする増感剤。
【請求項１１】
被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップと、
前記被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体と、
所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤とを備えることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用キット。
【請求項１２】
被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップと、
前記被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体と、
所定のシグナルを発する増感物質で被検物質の前記所定部位を認識する抗体を標識した標識抗体と、
被検物質とを備えることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用キット。
【請求項１】
被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開した後、
所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤を展開することを特徴とする被検物質の検出方法。
【請求項２】
前記増感剤を構成する抗体として、前記第１抗体を用いることを特徴とする請求項１記載の被検物質の検出方法。
【請求項３】
前記増感物質として発色物質、発光物質から選ばれる少なくとも１種を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の被検物質の検出方法。
【請求項４】
前記増感物質と前記標識物質とが同種材料からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の被検物質の検出方法。
【請求項５】
前記増感物質と前記標識物質とが異種材料からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の被検物質の検出方法。
【請求項６】
前記増感物質と前記標識物質との組合せが、金コロイド−銀微粒子包含リポソームであることを特徴とする請求項５記載の被検物質の検出方法。
【請求項７】
前記増感物質と前記標識物質とで異種蛍光微粒子を用いるとともに、蛍光共鳴エネルギー転移の原理を利用して発せられる蛍光を検出することを特徴とする請求項５記載の被検物質の検出方法。
【請求項８】
前記増感剤において、被検物質が結合した抗原結合部位と被検物質が結合していない抗原結合部位との両方を存在させることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の被検物質の検出方法。
【請求項９】
前記増感剤における被検物質が結合した抗原結合部位と被検物質が結合していない抗原結合部位との比率が概ね１：１であることを特徴とする請求項８記載の被検物質の検出方法。
【請求項１０】
被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップに対し、被検物質と、当該被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体とを展開するイムノクロマトグラフィー法に用いられ、
所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させたことを特徴とする増感剤。
【請求項１１】
被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップと、
前記被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体と、
所定のシグナルを発する増感物質に被検物質の前記所定部位を認識する抗体を介して被検物質を結合させた増感剤とを備えることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用キット。
【請求項１２】
被検物質の所定部位を認識する第１抗体を固定化したテストストリップと、
前記被検物質の前記所定部位とは異なる部位を認識する第２抗体を標識物質に結合させた標識第２抗体と、
所定のシグナルを発する増感物質で被検物質の前記所定部位を認識する抗体を標識した標識抗体と、
被検物質とを備えることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−６４７６６（Ｐ２００７−６４７６６Ａ）
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２５０２１６（Ｐ２００５−２５０２１６）
【出願日】平成１７年８月３０日（２００５．８．３０）
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月３０日（２００５．８．３０）
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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