被検物質の電気化学的検出方法
【課題】従来より高感度に被検物質を検出可能な電気化学的検出方法を提供する。
【解決手段】被検物質Ｓを作用電極本体１６１上に固定化された捕捉物質１０で捕捉する。溶解性担体２１上に被検物質Ｓに結合する結合物質２２と標識物質Ｓを含有する修飾標識物質２３とを有する標識結合物質２０と、被検物質Ｓとを含む複合体を作用電極１６１上に形成させる。そして、溶解性担体２１を溶解させ、作用電極１６１上に、修飾標識物質２３を誘引する。
【解決手段】被検物質Ｓを作用電極本体１６１上に固定化された捕捉物質１０で捕捉する。溶解性担体２１上に被検物質Ｓに結合する結合物質２２と標識物質Ｓを含有する修飾標識物質２３とを有する標識結合物質２０と、被検物質Ｓとを含む複合体を作用電極１６１上に形成させる。そして、溶解性担体２１を溶解させ、作用電極１６１上に、修飾標識物質２３を誘引する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の電気化学的検出方法に関する。より詳しくは、核酸、タンパク質等の被検物質の検出や定量等や、これらを利用する疾病の臨床検査、診断等に有用な、被検物質の電気化学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の臨床検査や診断は、生体試料中に含まれる前記疾病に関連する遺伝子やタンパク質等を、遺伝子検出法や免疫学的検出法等の検出法によって検出することにより行なわれている。かかる臨床検査や診断を行なうための方法として、被検物質の電気化学的検出方法が知られている。具体的には、光化学的に活性な標識物質を光励起させることにより生じる電流や、電気化学的に活性な標識物質の電圧印加により生じる光又は光励起による電流を、遺伝子やタンパク質等の被検物質の検出に利用する方法が提案されている。
【０００３】
ここで、検体中の被検物質を検出し臨床検査や診断を行なう場合、検体に含まれる微量な被検物質を高感度に検出することが求められる。そこで、例えば、特許文献１には、電気化学的に活性な多数のＥＣＬと被検物質に結合するプローブとを有する担体粒子を用いて、被検物質を検出する方法が提案されている。ここでは、ＥＣＬの電気化学発光の検出に際して、前記担体を溶解し、ＥＣＬを放出させることで分散させる。これにより、ＥＣＬと電解質との接触効率を向上させ、検出感度を高めている。このように、電気化学的検出方法を用いたより高感度な被検物質を検出可能な、電気化学的検出方法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５０４５２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前述の事情に鑑みてなされたものであり、従来より高感度に被検物質を検出可能な電気化学的検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、
（１）作用電極上に、被検物質に結合する結合物質と標識物質を含有する修飾標識物質とが結合した溶解性担体を有する標識結合物質と、被検物質とを含む複合体を形成すること、（２）この複合体中の標識結合物質に含まれる溶解性担体を溶解させること、及び
（３）作用電極上に修飾標識物質を誘引させること
により、上記課題を解決することができることを見出した。すなわち、本発明者らは、被検物質の電気化学的な検出に際して、前記（１）〜（３）の操作を行なうことにより、被検物質の大きさ等によらず、被検物質の量に応じた標識物質に基づくシグナルを効率よく得ることができ、高感度で被検物質を電気化学的に検出することができることを見出した。
本発明は、かかる本発明者らの知見に基づいてなされたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
被検物質を含む試料を、作用電極に接触させて、作用電極上に捕捉する捕捉工程、
前記被検物質が捕捉された作用電極に、被検物質に結合する結合物質と標識物質を含有する修飾標識物質とが結合した溶解性担体を有する標識結合物質を接触させて、前記作用電極上に、前記被検物質と前記標識結合物質とを含む複合体を形成させる形成工程、
前記作用電極上に形成された複合体に含まれる前記溶解性担体を溶解させ、前記修飾標識物質を遊離させる遊離工程、
前記修飾標識物質を作用電極上に誘引する誘引工程、及び
前記修飾標識物質中の標識物質を電気化学的に検出する検出工程
を含む被検物質の電気化学的検出方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の被検物質の検出方法によれば、従来より高感度に被検物質を検出可能な電気化学的検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法において、作用電極上に形成された捕捉物質と被検物質と標識結合物質とを含む複合体を示す概略説明図である。
【図２】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置を示す斜視図である。
【図３】図２に示される検出装置の構成を示すブロック図である。
【図４】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検査チップを示す斜視図である。
【図５】図４に示される検査チップのＡＡ線での断面図である。
【図６】（Ａ）は図４に示される検査チップの上基板を下面側から見た斜視図である。（Ｂ）は図４に示される検査チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【図７】（ａ）は光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。（ｂ）は光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。
【図８】（ａ）は光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。（ｂ）は光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。
【図９】（ａ）は酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。（ｂ）は酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。
【図１０】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板の変形例の平面説明図である。
【図１１】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板の変形例の平面説明図である。
【図１２】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板の変形例の平面説明図である。
【図１３】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法（光電気化学検出法）の処理手順を示す工程説明図である。
【図１４】本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法（酸化還元電流・電気化学発光検出法）の処理手順を示す工程説明図である。
【図１５】（Ａ）は試験例１における実験番号１の方法の操作手順を示す概略説明図である。（Ｂ）は試験例１における実験番号３の方法の操作手順を示す概略説明図である。
【図１６】試験例１において、実験番号１〜４の方法での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図１７】（Ａ）は試験例１における実験番号１の方法の光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。（Ｂ）は試験例１における実験番号３の方法の光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。
【図１８】試験例２における実験番号５の方法の操作手順を示す概略説明図である。
【図１９】試験例２において、実験番号５〜８の方法での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２０】（Ａ）は試験例２における実験番号５の方法の光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。（Ｂ）は試験例２における実験番号７の方法の光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。
【図２１】試験例３において、実験番号９〜１２の方法での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２２】試験例４において、実験番号１３及び１４の試料を用いたときの光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２３】（Ａ）は試験例５において、製造例６で得られた第１修飾結合物質を用いたときの光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。（Ｂ）は試験例５において、製造例７で得られた第１修飾結合物質を用いたときの光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。（Ｃ）は試験例５において、製造例８で得られた第１修飾結合物質を用いたときの光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。
【図２４】試験例５において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０／ビオチン（数量比）と、光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２５】試験例６において、被検物質量と、光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［用語の定義］
本発明の実施の形態を説明するにあたり、まず、本明細書で用いられる用語の定義を示す。
本明細書において、捕捉物質（図１中、「１０」）とは、被検物質Ｓを捕捉する物質であって、作用電極１６１上に固定化されている物質をいう。
標識結合物質（図１中、「２０」）とは、溶解性担体（図１中、「２１」）と、修飾標識物質（図１中、「２３」）と、結合物質（図１中、「２２」）とを含む物質をいう。図１に示される標識結合物質２０においては、溶解性担体２１上に修飾標識物質２３と、結合物質２２とが固定化されている。
結合物質２２は、被検物質Ｓを捕捉する物質であって、溶解性担体２１上に固定化されている物質である。
また、修飾標識物質（図１中、「２３」）とは、標識物質（図１中、「２４」）を含み、作用電極へ誘引可能な物質をいう。かかる「修飾標識物質」の用語の概念には、標識物質（図１中、「２４」）と誘引用修飾物質（図１中、「２５」）とからなる物質が包含される。また、標識物質（図１中、「２４」）が、そのままの状態で作用電極へ誘引可能である場合には、「修飾標識物質」の用語の概念には、当該標識物質単独のものが包含される。
【００１１】
［検出装置の構成］
つぎに、本発明の被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置の一例を添付図面により説明する。
図２は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置を示す斜視図である。この検出装置１０１は、光化学的に活性な物質を標識物質として用い、光電気化学的に被検物質を検出する電気化学的検出方法に用いる検出装置である。
【００１２】
検出装置１０１は、検査チップ１２０が挿入されるチップ受入部１１１と、検出結果を表示するディスプレイ１１２とを備えている。
【００１３】
図３は、図２に示される検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１０１は、光源１１３と、電流計１１４と、電源１１５と、Ａ／Ｄ変換部１１６と、制御部１１７と、ディスプレイ１１２とを備えている。
光源１１３は、検査チップ１２０の作用電極上に存在させた標識物質に光を照射して当該標識物質を励起させる。光源１１３は、励起光を発生する光源であればよい。かかる光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ、レーザーまたは太陽光が好ましい。前記光源のなかでは、レーザーがより好ましい。前記光源は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタにより、特定波長領域の光のみが放出されるものであってもよい。
電流計１１４は、励起された検出物質から放出される電子に起因して検査チップ１２０内を流れる電流を測定する。
電源１１５は、検査チップ１２０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。
Ａ／Ｄ変換部１１６は、電流計１１４によって測定された光電流値をデジタル変換する。
制御部１１７は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等から構成され、ディスプレイ１１２、光源１１３、電流計１１４及び電源１１５の動作を制御する。また、制御部１１７は、Ａ／Ｄ変換部１６でデジタル変換された光電流値から、予め作成された光電流値と標識物質の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出する。
ディスプレイ１１２は、制御部１１７で概算された検出物質の量等の情報を表示する。
【００１４】
なお、本発明において、前記標識物質を後述の酸化還元電流・電気化学発光検出法にしたがって検出する場合、検出装置は、光源１１３を備えていなくともよい（図示せず）。
前記標識物質を含む検出物質を電気化学発光により検出する場合、検出装置は、標識物質から生じる光等を検出するためのセンサをさらに備えていればよい。
【００１５】
［検査チップの構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検査チップ１２０の構成を説明する。図４は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検査チップを示す斜視図である。図５は、図４に示される検査チップのＡＡ線での断面図である。
【００１６】
検査チップ１２０は、上基板１３０と、上基板１３０の下方に設けられた下基板（電極基板）１４０と、上基板１３０と下基板１４０とに挟まれた間隔保持部材１５０とを備えている。検査チップ１２０では、上基板１３０と下基板１４０とは、一側部において重複して配置されている。そして、上基板１３０と下基板１４０とが重複する部分には、間隔保持部材５０が介在している。
【００１７】
上基板１３０は、図６（Ａ）に示されるように、基板本体１３０ａから構成されている。この基板本体１３０ａには、検出物質を含む試料等を内部に注入するための試料注入口１３０ｂが設けられている。この試料注入口１３０ｂは、基板本体１３０ａにおいて、間隔保持部材１５０が介装される部分よりも内側に設けられている。
【００１８】
基板本体１３０ａは、矩形状に形成されている。なお、かかる基板本体１３０ａの形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状等であってもよい。基板の作製及び取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは矩形状である。基板本体１３０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、光の透過性、十分な耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体１３０ａの厚さは、十分な耐久性を確保する観点から、好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．７ｍｍ、さらに好ましくは約０．５ｍｍである。また、基板本体１３０ａの大きさは、特に限定されないが、多種類の検出物質や被検物質の検出（多項目）を前提とした場合には項目数によるが、通常、２０ｍｍ×２０ｍｍ程度の大きさである。
【００１９】
下基板１４０は、図６（Ｂ）に示されるように、基板本体１４０ａと、作用電極１６１と、対極１６８と、参照電極１６９とを備えている。基板本体１４０ａは、上基板１３０の基板本体１３０ａと略同寸法の矩形状に形成されている。この基板本体１４０ａの表面には、作用電極１６１と、この作用電極１６１に接続されている電極リード１７１と、対極１６８と、この対極１６８に接続された電極リード１７２と、参照電極１６９、この参照電極１６９に接続された電極リード１７３とが形成されている。
【００２０】
基板本体１４０ａを構成する材料は、光の透過性を有する材料であればよい。かかる材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、十分な光の透過性、耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体１４０ａの厚さ及び大きさは、前記上基板１３０の基板本体１３０ａを構成する材料、基板本体１３０ａの厚さ及び大きさと同様である。
【００２１】
下基板１４０においては、作用電極１６１は、基板本体１４０ａの一側部〔図６（Ｂ）の右側〕に配置されている。電極リード１７１は、作用電極１６１から基板本体１４０ａの他側部〔図６（Ｂ）の左側〕に向けて延びている。また、対極１６８は、基板本体１４０ａ上において、作用電極１６１よりも外側〔図６（Ｂ）において、作用電極１６１の右側〕に配置されている。電極リード１７２は、対極１６８から、作用電極１６１を迂回して、基板本体１４０ａの他側部〔図６（Ｂ）の左側〕に向けて延びている。さらに、参照電極１６９は、作用電極１６１を挟んで、対極１６６と対向する位置に配置されている。電極リード１７３は、参照電極１６９から基板本体１４０ａの他側部〔図６（Ｂ）の左側〕に向けて延びている。そして、作用電極１６１の電極リード１７１と、対極１６６の電極リード１７２と参照電極１６９の電極リード１７３とは、基板本体１４０ａの他側部において互いに並列するように配置されている。また、電極リード１７１，１７２，１７３は、上基板１３０と下基板１４０とが重複する部分からはみ出して外部に露出している。
【００２２】
作用電極１６１は、ほぼ四角形状に形成されている。
図７（ａ）は、光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。
図７（ａ）に示される作用電極１６１は、基板本体１４０ａと、この基板本体１４０ａ上に形成された作用電極本体１６２とから構成されている。そして、この作用電極本体１６２の表面には、捕捉物質１０が固定化されている。
【００２３】
作用電極本体１６２は、導電層１６３と、この導電層１６３の表面に形成された電子受容層１６４とからなる〔図７（ａ）参照〕。
【００２４】
導電層１６３は、導電性材料からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属またはこれらの少なくとも１つを含む合金；酸化インジウム、スズをドーパントとして含む酸化インジウム等の酸化インジウム系材料；酸化スズ、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等の酸化スズ系材料；チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン系材料；グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等からなる炭素系材料等が挙げられる。
導電層１６３の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜２００ｎｍである。
なお、導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。導電材層を構成する材料としては、例えば、スズをドープした酸化インジウム（ＩＴＯ）、フッ素をドープした酸化スズ（ＦＴＯ）、アンチモンをドープした酸化スズ（ＡＴＯ）等が挙げられる。
導電層１６３は、例えば、当該導電層１６３を構成する材料の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。膜形成方法としては、蒸着法、スパッタリング法、インプリント法、スクリーン印刷法、めっき処理法、ゾルゲル法、スピンコート法、浸漬法、気相蒸着法等が挙げられる。
【００２５】
電子受容層１６４は、電子を受容可能な物質（電子受容物質）を含んでいる。前記電子受容物質は、光励起により検出物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位をとり得る物質であればよい。ここで、「光励起により検出物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位」とは、例えば、電子受容性物質として半導体を用いる場合には、伝導帯（コンダクションバンド）を意味する。すなわち、前記電子受容物質は、標識物質（後述）の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー順位を有すればよい。
前記電子受容物質としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体または有機物半導体等が挙げられる。なお、前記半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。
【００２６】
前記半導体のなかでは、酸化物半導体が好ましい。前記酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。また、前記酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズが好ましい。スズをドーパントとして含む酸化インジウム及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズは、電子受容物質及び導電性材料の両方の性質を兼ね備えている。そのため、これらの材料は、それぞれ単独で、作用電極本体を構成する材料として用いることができる。
電子受容層１６４の厚さは、通常、０．１〜１００ｎｍ、好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
かかる電子受容層１６４は、電子受容層１６４を構成する材料の種類に応じて、導電層１６３の形成に用いられる手法と同様の手法により形成させることができる。
導電層１６３が前記複合基材である場合、電子受容層１６４は、前記導電材層上に形成される。
【００２７】
作用電極本体１６２の表面（電子受容層１６４の表面）には、被検物質Ｓを捕捉する捕捉物質１０が固定化されている〔図７（ａ）参照〕。これにより、被検物質Ｓを作用電極本体１６２の近傍に存在させることができるようになっている。
かかる捕捉物質１０は、被検物質Ｓの種類に応じて、適宜選択することができる。前記捕捉物質１０としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を持つナノ構造体等が挙げられる。
作用電極本体１６２の表面上における捕捉物質１０の固定量は、特に限定されるものではない。作用電極本体１６２の表面上における捕捉物質１０の固定量は、例えば、用途及び目的に応じて設定してもよい。
作用電極本体１６２の表面への捕捉物質１０の固定は、作用電極本体１６２に化学吸着する結合基等を介して行うことができる。前記結合基としては、例えば、チオール基、ヒドロキシル基、リン酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基、アミノ基等が挙げられる。また、作用電極本体１６２の表面への捕捉物質１０の固定は、光硬化性樹脂や物理吸着により行なわれていてもよい。
【００２８】
また、作用電極本体１６２には、シランカップリング剤等を用いた表面処理が施されていてもよい。かかる表面処理により、作用電極本体１６２の表面を親水性または疎水性を有するように適宜調節することができる。前記シランカップリング剤としては、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）等のカチオン性シランカップリング剤等が挙げられる。
【００２９】
図７（ｂ）、図８（ａ）及び図８（ｂ）は、光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例の断面説明図である。
本発明においては、図７（ｂ）に示されるように、導電層１６３は、基板本体１４０ａの表面に形成された絶縁層１６５上に形成されていてもよい。この場合、基板本体１４０ａの表面に、順に、絶縁層１６５、導電層１６３、電子受容層１６４が形成されている。
かかる絶縁層１６５は、絶縁体材料から構成されている。前記絶縁体材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスチック類やフッ化物樹脂等の合成樹脂等が挙げられる。かかる絶縁層１６５は、絶縁体材料の種類に応じた手法により形成させることができる。前記手法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷、インプリント法、ディップコーティング法、スプレーコーティング法等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明においては、図８（ａ）及び（ｂ）に示されるように、電子受容層１６４を構成する電子受容物質が導電性材料としての性質を兼ね備えている場合、作用電極本体１６２は、電子受容層１６４のみで構成されていてもよい。
【００３１】
図９（ａ）は、酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の断面説明図である。また、図９（ｂ）は、酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例の断面説明図である。
検査チップを酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いる場合、作用電極１６１は、用いられる溶液等に対して安定であり、かつ導電性を有する材料からなる電極であればよい〔図９（ａ）及び（ｂ）参照〕。かかる電極としては、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等からなる炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム等からなる貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等からなる酸化物電極、電子受容物質としてのケイ素、ゲルマニウム、酸化亜鉛、硫化カドミウム、二酸化チタン、ヒ化ガリウム等からなる半導体電極、チタンからなるチタン電極等が挙げられる。
【００３２】
対極１６６は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属またはこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００３３】
参照電極１６９は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属またはこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。なお、本実施の形態では、参照電極１６９を設けているが、本発明においては、参照電極１６９を設けなくてもよい。対極１６６に用いる電極の種類、膜厚にもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極１６６が参照電極１６９を兼ねていてもよい。一方、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極１６１に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極１６９を設けることが好ましい。
【００３４】
間隔保持部材１５０は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。この間隔保持部材１５０は、作用電極１６１、対極１６６及び参照電極１６９を取り囲むように配置されている（図５及び図６参照）。上基板１３０と下基板１４０との間には間隔保持部材１５０の厚さに相当する間隔が形成されている。これにより、各電極１６１，１６６，１６９の間には試料や電解液を収容するための空間１２０ａが形成されている（図５参照）。間隔保持部材１５０の厚さは、通常、０．２〜３００μｍである。本発明においては、間隔保持部材１５０を構成する材料として、シリコーンゴムの代わりに、例えば、ポリエステルフィルム製両面テープ等を用いることもできる。
【００３５】
［検査チップの変形例］
本発明においては、作用電極１６１、対極１６６及び参照電極１６９は、各電極が他の電極と接触しないように間隔保持部材１５０の枠内に配置されていればよい。したがって、作用電極１６１、対極１６６及び参照電極１６９は、異なる基板本体上に形成されてもよい。すなわち、検査チップは、基板本体１３１ａに試料注入口１３１ｂ及び参照電極１６９が形成された上基板１３１〔図１０（Ａ）参照〕と、基板本体１４１ａに作用電極１６１及び対極１６６が形成された下基板１４１〔図１０（Ｂ）参照〕とを有するものであってもよい。また、検査チップは、基板本体１３２ａに試料注入口１３２ｂ、対極１６６及び参照電極１６９が形成された上基板１３２〔図１１（Ａ）参照〕と、基板本体１４２ａに作用電極１６１が形成された下基板１４２〔図１１（Ｂ）参照〕とを有するものであってもよい。
【００３６】
さらに、本発明においては、対極１６６及び参照電極１６９は、基板本体上に形成された薄膜状の電極でなくてもよい。すなわち、検査チップは、基板本体１３３ａに試料注入口１３３ｂが形成された上基板１３３〔図１２（Ａ）参照〕と、基板本体１４３ａに作用電極１６１が形成された下基板１４３〔図１２（Ｂ）参照〕と、部材本体１５１ａに対極１６６及び参照電極１６９が設けられた間隔保持部材１５１〔図１２（Ｃ）参照〕とを有するものであってもよい。この場合、対極１６６及び参照電極１６９の少なくともいずれかが間隔保持部材の部材本体に設けられていればよい。そして、上基板及び下基板のいずれかに、部材本体に設けた電極以外の電極が設けられていればよい。
【００３７】
［被検物質の電気化学的検出方法］
本発明の被検物質の電気化学的検出方法は、
（Ａ）被検物質を含む試料を、作用電極に接触させて、作用電極上に捕捉する捕捉工程、（Ｂ）前記被検物質が捕捉された作用電極に、被検物質に結合する結合物質と標識物質を含有する修飾標識物質とが結合した溶解性担体を有する標識結合物質を接触させて、前記作用電極上に、前記被検物質と前記標識結合物質とを含む複合体を形成させる形成工程、
（Ｃ）前記作用電極上に形成された複合体に含まれる前記溶解性担体を溶解させ、前記修飾標識物質を遊離させる遊離工程、
（Ｄ）前記修飾標識物質を作用電極上に誘引する誘引工程、
及び
（Ｅ）前記修飾標識物質中の標識物質を電気化学的に検出する検出工程
を含むことを特徴とする。
【００３８】
本発明の方法は、下記（１）〜（３）を行なう点に１つの特徴がある。
（１）作用電極上における被検物質と標識結合物質とを含む複合体の形成、
（２）この複合体中の標識結合物質に含まれる溶解性担体の溶解、及び
（３）作用電極上への修飾標識物質の誘引
【００３９】
前記複合体を形成することにより、被検物質に応じた量の修飾標識物質を得ることができる。また、前記溶解性担体を溶解させ、その後、作用電極上に、修飾標識物質を誘引することにより、標識物質と作用電極との間で、容易に、効率よく電子の授受を行なうことができるようになる。したがって、本発明の方法によれば、被検物質に応じた量の標識物質を、高感度で検出することができる。
【００４０】
本発明の方法では、前記標識物質として、電気化学的又は光化学的に活性な物質が用いられる。電気化学的に活性な物質は、当該物質に基づく酸化還元電流及び／又は電気化学発光を用いて検出される。一方、光化学的に活性な物質は、当該物質が光により励起されることにより放出される電子を用いて検出される。したがって、本発明の方法は、標識物質の検出技術の種類によって、光電気化学検出法（図１３参照）及び酸化還元電流・電気化学発光検出法（図１４）に大別することができる。
【００４１】
１．光電気化学検出法
まず、光電気化学検出方法について説明する。図１３は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法（光電気化学検出法）の処理手順を示す工程説明図である。光電気化学検出方法には、上述した図１に示される検出装置及び図４に示される検査チップを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以下、図４に示される検査チップを用いる場合を例としてあげて説明する。
【００４２】
光電気化学検出法では、まず、検査チップ１２０の試料注入口１３０ｂから当該検査チップ内に被検物質Ｓを含有する試料を注入する。そして、作用電極１６１上に被検物質Ｓを捕捉する〔前記工程（Ａ）、図１３（Ａ）を参照〕。工程（Ａ）では、被検物質Ｓは、作用電極本体１６２の表面に固定化された捕捉物質１０によって作用電極１６１上に捕捉される。このとき、前記試料中の被検物質Ｓ以外の物質（夾雑物質Ｆ）は、捕捉物質１０に捕捉されない。
【００４３】
なお、本発明においては、被検物質Ｓを特異的に作用電極１６１上に捕捉することができるのであれば、捕捉物質１０を用いなくてもよい。例えば、作用電極としてＩＴＯを用いた場合、ＩＴＯとチオール基とが結合可能であることを利用して、捕捉物質１０を用いなくともチオール基を有する被検物質Ｓを作用電極１６１上に捕捉することが可能である。
【００４４】
捕捉物質１０としては、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、捕捉物質１０は、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は前記核酸に対する抗体であればよい。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、捕捉物質１０は、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体、タンパク質に対するリガンド、ペプチドに対するレセプタータンパク質等であればよい。
【００４５】
捕捉物質１０による被検物質Ｓの捕捉は、例えば、捕捉物質１０と被検物質Ｓとが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質１０と被検物質Ｓとが結合する条件は、被検物質Ｓの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質Ｓが核酸であり、捕捉物質１０が前記核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質Ｓの捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。また。被検物質Ｓが核酸であり、捕捉物質１０が前記核酸に対する抗体である場合、被検物質１０の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうに適した溶液中で行なうことができる。
【００４６】
つぎに、試料注入口１３０ｂから当該検査チップ１２０内に標識結合物質２０ａを注入する。これにより、標識結合物質２０ａを作用電極１６１上に捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔前記工程（Ｂ）、図１３（Ｂ）を参照〕。工程（Ｂ）では、作用電極１６１上に、捕捉物質１０と被検物質Ｓと標識結合物質２０ａとを含む複合体が形成される。
【００４７】
標識結合物質２０ａは、溶解性担体２１と、標識物質２４ａ及び誘引用修飾物質２５とからなる修飾標識物質２３ａと、被検物質Ｓに結合する結合物質２２とから構成されている。標識結合物質２０ａでは、修飾標識物質２３ａ及び結合物質２２は、溶解性担体２１の表面に固定化されている。
【００４８】
標識物質２４ａは、光を照射することにより励起状態となり電子を放出する物質である。標識物質２４ａとして、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つを用いることができる。
前記標識物質の具体例としては、金属フタロシアン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ2Ｏ3：Ｒｅ、Ｌｎ2Ｏ2Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ4、ＭＯ・ｘＡｌ2Ｏ3：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（いずれも、モレキュラープローブ社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ―８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等が挙げられる。なお、前記ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。標識物質の他の例については、例えば、特許第４０８６０９０号公報、特開平７−８３９２７号公報、特願２００８−１５４１７９号公報等を参照することができる。
【００４９】
誘引用修飾物質２５としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸等が挙げられる。なお、本発明においては、標識物質２４ａが作用電極へ誘引可能な物質である場合、かかる誘引用修飾物質２５を用いなくてもよい。
ここで、誘引用修飾物質として、核酸を用いる場合、後述する修飾標識物質２３ａを作用電極１６１に誘引する観点および溶解性担体への結合効率の観点から、当該核酸の長さは１塩基以上１００００塩基以下、より具体的には１０塩基〜４０塩基が好ましい。
【００５０】
結合物質２２は、被検物質Ｓにおいて、捕捉物質１０とは異なる位置や場所に結合する物質であればよい。かかる結合物質２２は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、結合物質２２は、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は前記核酸に対する抗体であればよい。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、結合物質２２は、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体、タンパク質に対するリガンド、ペプチドに対するレセプタータンパク質等であればよい。
【００５１】
修飾標識物質２０ａは、後述の工程において、作用電極１６１への誘引が容易であることから、標識物質２４ａと核酸とからなることが好ましい。
【００５２】
工程（Ｂ）では、被検物質Ｓに結合していない残部の標識結合物質２０ａは、検査チップ１２０内において、遊離した状態で存在している。したがって、工程（Ｂ）の後、遊離の標識結合物質２０ａを除去する工程〔「洗浄工程」、図１３（Ｃ）参照〕をさらに行なう。これにより、検出結果の特性を向上させることができる。なお、かかる洗浄工程は、行なわなくてもよい。かかる洗浄工程では、例えば、エタノール、精製水等が用いられる。
【００５３】
光電気化学検出法では、つぎに、作用電極１６１上に形成された複合体に含まれる２１溶解性担体２１を溶解させ、修飾標識物質２３ａを遊離させる〔前記工程（Ｃ）、図１３（Ｄ）参照〕。
【００５４】
溶解性担体２１は、溶解して、その表面に固定化された修飾標識物質２３ａを遊離状態にさせることができる物質であればよい。前記溶解性担体２１としては、例えば、金、銀、パラジウム、プラチナ、イリジウム、ロジウム等の金属からなる金属微粒子；ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルニトリル、ナイロン、エチレン・アクリル酸共重合物、スチレン・アクリル酸エステル、架橋スチレン・アクリル、架橋ポリアクリル酸エステル、架橋ポリメタクリル酸ブチル、架橋ポリメタクリル酸メチル、シリコン樹脂、フェノール樹脂、メラミン・ホルマリン、ベンゾグアナミン・ホルマリン、ベンゾグアナミン・メラミン・ホルマリン、ポリ乳酸、ポリアミド樹脂等のポリマーからなるポリマー微粒子；パルミテート、オレエート等の脂肪酸のイオン、または、ポリアルキレンオキシド、ポリリンゴ酸、ポリアスパラギン酸、ポリエチレングリコール等の親水性高分子連鎖部とポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリメタクリル酸エステル等の疎水性高分子連鎖部とを有する高分子化合物等からなる高分子ミセル微粒子；リン脂質を水和した際に形成する微小な球体粒子であるリポソーム；アガロースゲル等の多糖類のゲルからなる多孔性微粒子等が挙げられる。
前記溶解性担体２１のなかでは、取り扱いが容易であることから、金ナノ粒子（金微粒子）が好ましい。
なお、溶解性担体２１は、修飾標識物質を固定する表面部分のみを溶解させることで、修飾標識物質を遊離させることができるのであれば、異なる材料からなる複数の層を有する担体であってもよい。例えば、酸化鉄(磁性)ナノ粒子周囲に金ナノ粒子を結合させた金−酸化鉄(磁性)ナノ粒子のうち金ナノ粒子のみが溶解される担体等が挙げられる。
【００５５】
溶解性担体２１の溶解は、検査チップ１２０を構成する基板本体の材料や電極（作用電極、対極及び参照電極）の材料を劣化させない条件下に、溶解性担体２１の種類に応じた手法により行なうことができる。例えば、溶解性担体２１を溶解する液体により、または溶解性担体２１が熱により溶融する担体である場合には、溶解性担体２１を加熱することにより、溶解性担体２１を溶解させることができる。
溶解性担体２１が前記金属微粒子である場合、検査チップ１２０を構成する基板本体の材料や電極（作用電極、対極及び参照電極）の材料を劣化させない条件下に、金属の酸化溶解を行なうことにより、溶解性担体２１を溶解させることができる。金属微粒子の溶解には、水酸化アルカリを含む液体、シアン化アルカリを含む液体、フェロシアン化塩を含む液体、ハロゲンとハロゲン化物との混合物を含む液体等を用いることができる。水酸化アルカリを含む液体としては、例えば、水酸化カリウム等の溶解液が挙げられる。また、シアン化アルカリを含む液体としては、例えば、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）と水酸化ナトリウムとを含む水溶液等が挙げられる。フェロシアン化塩を含む液体としては、例えば、フェロシアン化カリウムとシアン化カリウムとの混合物等が挙げられる。ハロゲン単体とハロゲン化塩との混合物としては、ヨウ素とヨウ化アルカリ（例えば、ヨウ化アンモニウム等）との混合物、臭素と臭化アルカリ（例えば、臭化アンモニウム）との混合物等が挙げられる。これらの溶解液に用いる溶媒としては、例えば、アセトニトリル等の有機溶媒、また、純水等が挙げられる。例えば、溶解性担体２１として、金微粒子を用いた場合、金の剥離液やエッチング液として知られる液体を用いることができる。
溶解性担体２１が前記ポリマー微粒子である場合、検査チップ１２０を構成する基板本体の材料や電極（作用電極、対極及び参照電極）の材料を劣化させない条件下に、有機溶媒を当該溶解性担体２１に接触させること；当該溶解性担体２１を構成するポリマーの融点よりも高い温度に前記溶解性担体２１を加熱すること等により、溶解性担体２１を溶解させることができる。前記有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、エーテル化合物、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、アセトン、塩化メチレン、シクロペンタノン等が挙げられる。
溶解性担体２１が前記高分子ミセルやリポソームである場合、ミセル構造を崩壊させる超音波処理や水による希釈等により、溶解性担体２１を溶解させることができる。
溶解性担体２１が前記多孔性微粒子である場合、当該溶解性担体２１を構成する多糖類のゲルの融点以上の温度に前記溶解性担体２１を加熱すること等により、溶解性担体２１を溶解させることができる。
溶解性担体２１が金ナノ粒子（金微粒子）である場合、ヨウ化物イオンとアセトニトリルとを含有する液体を用いることにより、当該溶解性担体２１を容易に溶解させることができる。
【００５６】
光電気化学検出法では、つぎに、修飾標識物質２３ａを作用電極１６１上に誘引する〔前記工程（Ｄ）、図１３（Ｅ）参照〕。これにより、前記工程（Ｃ）で、遊離した修飾標識物質２３ａが作用電極１６１の近傍に移送される。したがって、前記工程（Ｃ）で、修飾標識物質２３ａを遊離させただけの状態と比べて、標識物質２４ａと作用電極本体１６２との間の電子の授受が一層容易になる。
【００５７】
前記工程（Ｄ）では、修飾標識物質２３ａを作用電極１６１の近傍に誘引させる溶媒（「誘引液」ともいう）を用いることができる。作用電極１６１上への修飾標識物質の誘引は、修飾標識物質２３ａ、誘引液及び作用電極１６１との間の疎水性相互作用若しくは親水性相互作用、又は、作用電極１６１又は対極１６９に電圧を印加することによる電気泳動効果を利用すること等により行なうことができる。
【００５８】
本誘引工程は、例えば、
１） 誘引液の疎水性・親水性を変更することにより、修飾標識物質２３ａと作用電極１６１との間の疎水性相互作用若しくは親水性相互作用を大きくすること〔すなわち、修飾標識物質２３ａを、極性の違いによって、作用電極１６１に誘引すること〕（誘引方法１）、
２） 修飾標識物質２３ａの電荷に応じて、正又は負の電圧を作用電極１６１に印加することにより、電気泳動効果を大きくすること〔すなわち、修飾標識物質２３ａを、電気泳動効果を利用することによって、作用電極１６１）に誘引すること〕（誘引方法２）等によって行なうことができる。前記の誘引方法１及び誘引方法２は、それぞれ単独で行なってもよく、両者を組み合わせて行なってもよい。
【００５９】
誘引方法１では、誘引用修飾物質２５として核酸を用いる場合、誘引液は、修飾標識物質２３ａと作用電極１６１との間の疎水性相互作用又は親水性相互作用を大きくして、作用電極１６１の近傍に検出物質を誘引しやすくする観点から、カオトロピックイオンを含有する液体であることが好ましい。
【００６０】
前記カオトロピックイオンとしては、例えば、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、グアニジンイオン、チオシアン酸イオン、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、塩化物イオン、酢酸イオン、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン等が挙げられる。
【００６１】
誘引液がカオトロピックイオンを含有する場合、誘引液中におけるカオトロピックイオンの濃度は、用いられるカオトロピックイオンの種類により異なる。前記濃度は、通常１．０〜８．０ｍｏｌ／Ｌである。カオトロピックイオンがグアニジンイオンである場合、誘引液中におけるカオトロピックイオンの濃度は、通常、４．０〜７．５ｍｏｌ／Ｌである。また、チオシアン酸イオンである場合、誘引液中におけるカオトロピックイオンの濃度は、通常、３．０〜５．５ｍｏｌ／Ｌである。
【００６２】
なお、標識物質２４ａ又は誘引用修飾物質２５として核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を用いる場合、慣用の核酸抽出・精製方法の原理を利用して、修飾標識物質２３ａを、作用電極１６１の近傍に誘引させることができる。
【００６３】
前記核酸抽出・精製方法としては、液相を用いる方法、核酸結合用担体を用いる方法等が挙げられる。液相を用いる方法としては、例えば、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ、１９６３年発行、第７２巻、ｐｐ．６１９−６２９）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７９年発行、第７巻、ｐｐ．１５１３−１５２３）、塩酸グアニジンを含有する緩衝液にエタノールを加え核酸を沈降させる方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６２、１９８７、４６３）等が挙げられる。核酸結合用担体を用いる方法としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液とを用いて核酸をガラス粒子に吸着させ、単離する方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６−２：６１５−６１９，１９７９）や、シリカ粒子とカオトロピックイオンを用いる方法〔例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年発行、第２８巻、ｐｐ．４９５−５０３、特許第２６８０４６２号公報等を参照〕等が挙げられる。シリカ粒子とカオトロピックイオンを用いる方法では、まず、核酸が結合するシリカ粒子と試料中の核酸を遊離する能力を有するカオトロピックイオンを含む溶液とを試料と混合して核酸をシリカ粒子に結合させる。つぎに、夾雑物質を洗浄により除去する。その後、シリカ粒子に結合した核酸を回収する。前記方法によれば、簡便、かつ迅速に核酸を抽出することができる。しかも、かかる方法は、ＤＮＡの抽出だけではなく、より不安定であるＲＮＡの抽出にも好適であり、純度の高い核酸が得られるという点で非常に優れている。
そこで、修飾標識物質２３ａが、標識物質２４ａ又は誘引用修飾物質２５として核酸を含む場合、前記核酸抽出・精製方法に用いられる溶媒を誘引液として用いることにより、修飾標識物質２３ａを作用電極１６１の近傍に誘引させることができる。この場合、カオトロピックイオンとして、グアニジンイオン、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、チオシアン酸イオン又はこれらの任意の組み合わせを用い、作用電極１６１として核酸を結合する電極（例えば、スズをドープした酸化インジウム等）を用いることが好ましい。
【００６４】
また、修飾標識物質２３ａが、標識物質２４ａ又は誘引用修飾物質２５として核酸を含む場合、誘引液は、必要に応じて、緩衝液を含有していてもよい。前記緩衝液は、核酸を安定に保持するために一般に用いられる緩衝液であればよい。前記緩衝液は、核酸を安定に保持する観点から、中性付近、すなわちｐＨ５．０〜９．０において緩衝能を有することが好ましい。前記緩衝液としては、例えば、トリス−塩酸塩、四ホウ酸ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度は、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００６５】
一方、誘引方法２では、修飾標識物質２３ａの電荷に応じて、正又は負の電圧を作用電極１６１に印加する。ここで、核酸は負に荷電している。したがって、修飾標識物質２３ａが、標識物質２４ａ又は誘引用修飾物質２５として核酸を含む場合、作用電極１６１に正の電圧を印加することにより、修飾標識物質２３ａを作用電極１６１の近傍に誘引させることができる。
【００６６】
光電気化学検出法では、つぎに、検査チップ１２０の作用電極１６１上に存在する修飾標識物質２３ａ中の標識物質２４ａに光を照射して標識物質２４ａを励起させ、光電流を測定することにより、検出物質を検出する〔前記工程（Ｅ）、図１３（Ｆ）参照〕。
【００６７】
工程（Ｅ）では、前記工程（Ｄ）において誘引液を用いた場合、必要に応じて、誘引液を、電気化学的な検出に適した電解液に置換することができる。この場合、電解液の存在下において、標識物質２４ａを電気化学的に検出する。
なお、誘引液が、酸化された状態の標識物質２４ａに電子を供給する性質を有し、標識物質２４ａの電気化学的な検出が可能である場合、工程（Ｅ）において、この誘引液をそのまま用いてもよい。
【００６８】
前記電解液として、酸化された状態の標識物質２４ａに電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性極性溶媒、プロトン性極性溶媒又は非プロトン性極性溶媒とプロトン性極性溶媒との混合物とを含む溶液を用いることができる。この電解液は、所望により、他の成分をさらに含んでいてもよい。
【００６９】
電解質としては、例えば、ヨウ化物、臭化物、金属錯体、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、これらの混合物等が挙げられる。前記電解質の具体例としては、ヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化セシウム、ヨウ化カルシウム等の金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイド等の４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化セシウム、臭化カルシウム等の金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイド等の４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオン等の金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム等のチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩；及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのなかでは、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド及びヨウ化カルシウムが好ましい。
【００７０】
電解液の電解質濃度は、好ましくは０．００１〜１５Ｍである。
【００７１】
プロトン性極性溶媒として、水、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒等を用いることができる。
非プロトン性極性溶媒としては、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）等のニトリル類；プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート等のカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノン、３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩等の複素環化合物；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が挙げられる。非プロトン性極性溶媒のなかでは、アセトニトリルが好ましい。プロトン性極性溶媒及び非プロトン性極性溶媒は、単独で、又は両者を混合して用いることができる。プロトン性極性溶媒と非プロトン性極性溶媒との混合物は、水とアセトニトリルとの混合物が好ましい。
【００７２】
標識物質２４ａへの光の照射には、標識物質２４ａを光励起することができる波長の光を照射できる光源を用いることができる。かかる光源は、標識物質２４ａの種類等に応じて、適宜選択することができる。前記光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ又は太陽光が好ましい。また、検出工程においては、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみを標識物質２４ａに照射してもよい。
【００７３】
標識物質２４ａに由来する光電流の測定には、例えば、電流計、ポテンショスタット、レコ−ダ及び計算機を備える測定装置等を用いることができる。
かかる工程（Ｅ）では、光電流を定量することにより、被検物質の量を調べることができる。
【００７４】
２．酸化還元電流・電気化学発光検出法
つぎに、酸化還元電流・電気化学発光検出法について説明する。図１４は、本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法（酸化還元電流・電気化学発光検出法）の処理手順を示す工程説明図である。
【００７５】
かかる酸化還元電流・電気化学発光検出法においても、前記光電気化学検出法の場合と同様に、まず、検査チップ１２０の試料注入口１３０ｂから当該検査チップ内に被検物質Ｓを含有する試料を注入する。そして、作用電極１６１上に被検物質Ｓを捕捉する〔前記工程（Ａ）、図１４（Ａ）を参照〕。つぎに、試料注入口１３０ｂから当該検査チップ１２０内に標識結合物質２０ｂを注入する。これにより、標識結合物質２０ｂを作用電極１６１上に捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔前記工程（Ｂ）、図１４（Ｂ）を参照〕。
【００７６】
標識結合物質２０ｂは、溶解性担体２１と、標識物質２４ｂ及び誘引用修飾物質２５とからなる修飾標識物質２３ｂと、被検物質Ｓに結合する結合物質２２とから構成されている。修飾標識物質２３ｂ及び結合物質２２は、溶解性担体２１の表面に固定化されている。
標識物質２４ｂは、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質又は電圧を印加することにより発光する標識物質である。
電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質としては、例えば、電気的に可逆的な酸化還元反応を起こす金属を中心金属として含む金属錯体等が挙げられる。このような金属錯体としては、例えば、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体等が挙げられる。
また、酸化還元電流・電気化学発光検出法においても、誘引用修飾物質としても利用可能な核酸を標識物質として用いてもよい。標識物質２３ｂとして核酸を用いた場合、核酸由来の酸化還元電流として、アデニン、チミン、グアニン、シトシン又はウラシルに由来する酸化還元電流を利用することができる。
電圧を印加することにより発光する標識物質としては、例えば、ルミノール、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセン、ルブレン等が挙げられる。
これらの標識物質の発光は、例えば、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノール、クロロフェノールのようなフェノ−ル類若しくはナフトール類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
なお、誘引用修飾物質２５及び結合物質２２は、光電気化学検出法における誘引用修飾物質２５及び結合物質２２と同様である。
【００７７】
酸化還元電流・電気化学発光検出法では、つぎに、遊離の標識結合物質２０ｂを除去する〔「洗浄工程」、図１４（Ｃ）参照〕。そして、作用電極１６１上に形成された複合体に含まれる溶解性担体２１を溶解させ、修飾標識物質２３ｂを遊離させる〔前記工程（Ｃ）、図１４（Ｄ）参照〕。その後、修飾標識物質２３ｂを作用電極１６１上に誘引する〔前記工程（Ｄ）、図１４（Ｅ）参照〕。これらの工程は、前述した光電気化学検出法の場合と同様の操作により行なうことができる。
【００７８】
酸化還元電流・電気化学発光検出法では、つぎに、検査チップ１２０の作用電極１６１上に存在する修飾標識物質２３ｂ中の標識物質２４ｂに電圧を印加する。そして、標識物質２４ｂに基づく酸化還元電流又は光を測定することにより、被検物質Ｓを検出する〔前記工程（Ｅ）、図１４（Ｆ）〕。なお、図１４（Ｆ）では、光を測定する場合を例として挙げて示している。
【００７９】
かかる工程（Ｅ）では、前記工程（Ｄ）において誘引液を用いた場合、光電気化学検出法の場合と同様に、必要に応じて、誘引液を、電気化学的な検出に適した電解液に置換することができる。この場合、電解液の存在下において、標識物質２４ｂを電気化学的に検出する。
【００８０】
本工程（Ｅ）において、酸化還元電流を測定する場合、酸化還元電流の測定には、例えば、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ、レコ−ダ及び計算機を備える測定装置等を用いることができる。
この場合、酸化還元電流を定量することにより、被検物質Ｓの量を調べることができる。
【００８１】
本工程（Ｅ）において、標識物質２４ｂに基づく光を測定する場合、当該光の測定には、フォトンカウンタ等を用いることができる。また、この場合、電極の代わりに、光ファイバーの先端に透明電極を形成することにより得られる光ファイバー電極を用いて間接的に検出することもできる（特許第２５７３４４３号公報を参照）。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８３】
（製造例１）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極本体を形成した。前記薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、前記作用電極本体に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【００８４】
得られた作用電極基板の作用電極本体の表面に対して、シランカップリング剤である３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）により表面処理を施した。つぎに、捕捉物質として、抗マウスＩｇＧ抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント〔ダコ社製〕をＴＣＥＰ〔トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン〕により還元処理し、前記作用電極本体の表面のＭＰＴＥＳと反応させてジスルフィド結合を形成させることにより、前記捕捉物質を前記作用電極本体の表面に固定化した。その後、ブロッキング剤であるチオール化ＰＥＧ〔シグマ−アルドリッチ社製〕を、前記作用電極本体の表面における残部のＭＰＴＥＳと反応させた。これにより、作用電極基板を得た。
【００８５】
（製造例２）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、厚さ２００ｎｍの白金薄膜（導電層）からなる対極を形成し、対極基板を得た。前記対極部には電流計と接続するための対極リードを接続した。これにより、対極基板を得た。
【００８６】
（製造例３）
修飾標識物質として、３’末端をチオール化した２４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔図１５（Ａ）（ｄ）中の「２５」；以下、「誘引用修飾物質２５」という。〕と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０（インビトロジェン社製）〔図１５（Ａ）（ｄ）中の「２４ａ」；以下、「標識物質２４ａ」という〕とからなる複合体〔図１５（Ａ）（ｄ）中、「２３ａ」〕を使用した。
【００８７】
つぎに、前記修飾標識物質２３ａと、３’末端をチオール化した２４ヌクレオチド長のビオチン標識ＤＮＡ〔図１５（Ａ）（ｄ）中、２２ｃ；以下、「第１結合物質２２ｃ」という〕とを１０：１（モル比）となるように混合した。なお、第１結合物質２２ｃは、２４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔誘引用修飾物質２５〕と、ビオチン〔図１５（Ａ）（ｄ）中、「２２ｃ１」〕とからなる。
【００８８】
得られた混合物５６０ピコモルと、溶解性担体である金ナノ粒子〔図１５（Ａ）（ｄ）中、「２１」〕５．６ピコモルとを混合して前記修飾標識物質２３ａ及び第１結合物質２２ｃそれぞれのチオール基を溶解性担体２１の表面に結合させた。得られた産物を限外濾過法により濃縮・精製し、第１修飾結合物質２０ｃ１を得た。得られた第１修飾結合物質２０ｃ１をその濃度が１ｎＭとなるように０．１体積％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）リン酸緩衝化生理食塩水に添加し、混合して溶液Ａを得た。
【００８９】
（製造例４）
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に、アスコルビン酸を電解質として、その濃度が０．６Ｍとなるように添加して、電解液を得た。
【００９０】
（製造例５）
アセトニトリルとエチレンカーボネートとを体積比で２：３となるように混合し、非プロトン性極性溶媒を得た。前記非プロトン性極性溶媒に、電解質塩として、テトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、溶解誘引電解液を得た。
【００９１】
なお、前記ヨウ素及びテトラプロピルアンモニウムヨーダイドは、金ナノ粒子を溶解させることができる。また、前記ヨウ素又はテトラプロピルアンモニウムヨーダイドより生成されるヨウ化物イオンは、第１標識結合物質に含まれる修飾標識物質を作用電極上に誘引させることができる。したがって、本製造例４で得られた溶解誘引電解液を用いることにより、標識結合物質に用いられた担体の溶解、作用電極上への修飾標識物質の誘引及び電気化学検出を、同一の液体中で行なうことができる。
【００９２】
（試験例１）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、マウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）を含有する試料〔組成：１μｇマウスＩｇＧ／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを供し、前記作用電極基板を２５℃で６０分間静置した。これにより、作用電極本体１６２上の捕捉物質１０に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１５（Ａ）（ａ）参照〕。
【００９３】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔図１５（Ａ）（ｂ）中、「２２ａ」；以下、「第２結合物質２２ａ」ともいう〕を含有する溶液Ｂ〔組成：４ｎｇビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）／μＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した〔図１５（Ａ）（ｂ）参照〕。これにより、作用電極本体１６２上の被検物質Ｓに、第２結合物質２２ａを付加した〔図１５（Ａ）（ｃ）参照〕。なお、第２結合物質２２ａは、マウスＩｇＧに結合する抗マウスＩｇＧ抗体２２ａ１と、ビオチン２２ａ２とからなる。
【００９４】
つぎに、前記空間に、ストレプトアビジン〔図１５（Ａ）（ｃ）中、「２２ｂ」、以下、「第３結合物質２２ｂ」ともいう〕を含有する溶液Ｃ〔４００ｎＭストレプトアビジン（ベクター社製）を含むトリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）〕３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。これにより、作用電極上に、捕捉物質１０と被検物質Ｓと標識結合物質２０ｃとを含む複合体を形成した〔図１５（Ａ）（ｄ）参照〕。その後、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した（実験番号１）。また、被検物質Ｓを含有する試料の代わりに、被検物質Ｓを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号２）。
【００９５】
なお、対照として、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体、ストレプトアビジン、製造例３で得られた溶液Ａの代わりに、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識抗マウスＩｇＧ抗体を含有する溶液Ｄ〔組成：４ｎｇ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）／μＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号３）〔図１５（Ｂ）（ａ）及び（ｂ）参照〕。また、被検物質Ｓを含有する試料の代わりに、被検物質Ｓを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号４）。
【００９６】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例４で得られた電解液１１．５μＬを充填した。そして、前記電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極と対極とを電解液に接触させた。つぎに、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【００９７】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、前記電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。試験例１において、実験番号１〜４の方法での光電流の測定結果を図１６に示す。
【００９８】
図１６に示された結果から、製造例４で得られた電解液を用いた場合、実験番号１及び実験番号３では、被検物質Ｓの存在に基づく光電流を検出することができることがわかる。しかしながら、被検物質Ｓが存在しない場合の光電流との差が小さい〔図１６中、実験番号２及び実験番号４参照〕。これは、図１７に示されるように、実験番号１の方法〔図１７（Ａ）参照〕及び実験番号３の方法〔図１７（Ｂ）参照〕では、作用電極本体１６２と標識物質２４ａ，２０３との間の距離が長く、標識物質２４ａ，２０３から生じた電子が作用電極本体１６２に輸送されにくいためであると考えられる。
【００９９】
（試験例２）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、マウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）を含有する試料〔組成：１μｇマウスＩｇＧ／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを供し、前記作用電極基板を２５℃で６０分間静置した。これにより、作用電極本体１６２上の捕捉物質１０に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１８（Ａ）参照〕。
【０１００】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（第２結合物質２２ａ）を含有する溶液Ｂ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。つぎに、前記空間に、ストレプトアビジン（第３結合物質２２ｂ）を含有する溶液Ｃ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。これにより、作用電極上に、捕捉物質１０と被検物質Ｓと標識結合物質２０ｃとを含む複合体を形成した〔図１８（Ｂ）参照〕。その後、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した（実験番号５）。また、被検物質Ｓを含有する試料の代わりに、被検物質Ｓを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号６）。
【０１０１】
なお、対照として、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体、ストレプトアビジン、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬの代わりに、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識抗マウスＩｇＧ抗体を含有する溶液Ｄ３０μＬを用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号７）。また、被検物質Ｓを含有する試料の代わりに、被検物質Ｓを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号８）。
【０１０２】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。さらに、前記溶解誘引電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。そして、前記作用電極基板及び対極基板を５分間静置した。これにより、作用電極と対極とを溶解誘引電解液に接触させた。つぎに、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。なお、製造例５で得られた溶解誘引電解液によって溶解性担体２１は溶解され、修飾標識物質２３ａは遊離した状態となる。また、遊離した状態の修飾標識物質２３ａは、製造例５で得られた溶解誘引電解液によって作用電極本体１６２上に誘引される。
【０１０３】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例２において、実験番号５〜８の方法での光電流の測定結果を図１９に示す。
【０１０４】
図１９に示された結果から、製造例５で得られた電解液を用いた場合、実験番号５の検出方法により検出された光電流は、実験番号７の検出方法により検出された光電流と比べて、大きいことがわかる。これは、図２０に示されるように、実験番号７の方法〔図２０（Ｂ）参照〕では、捕捉物質と被検物質と標識物質２０３とからなる複合体が物理的に嵩高い構造をとるため、作用電極本体１６２と標識物質２０３との間の距離が長く、標識物質２０３から生じた電子が作用電極本体１６２に輸送されにくいのに対し、実験番号５の方法〔図２０（Ａ）参照〕では、製造例５で得られた溶解誘引電解液による溶解性担体２１の溶解と、遊離した修飾標識物質２３ａの作用電極本体１６２上への誘引とによって、電子の輸送が容易になることによると考えられる。
【０１０５】
（試験例３）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、マウスＩｇＧを含有する試料〔組成：１μｇマウスＩｇＧ／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを供し、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。
【０１０６】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（第２結合物質２２ａ）を含有する溶液Ｂ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。つぎに、前記空間に、ストレプトアビジン（第３結合物質２２ｂ）を含有する溶液Ｃ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。つぎに、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した（実験番号９）。また、マウスＩｇＧを含有する試料の代わりに、マウスＩｇＧを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号１０）。
【０１０７】
なお、対照として、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体、ストレプトアビジン、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬの代わりに、前記溶液Ｄ３０μＬを用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号１１）。また、マウスＩｇＧを含有する試料の代わりに、マウスＩｇＧを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号１１）。
【０１０８】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。そして、前記作用電極基板を５分間静置した。その後、電極基板をエタノールで洗浄、乾燥後、前記溶解誘引電解液を製造例４で得られた電解液に置換した。前記電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極と対極とを電解液に接触させた。つぎに、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１０９】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例３において、実験番号９〜１２の方法での光電流の測定結果を図２１に示す。
【０１１０】
図２１に示された結果から、実験番号９の方法により検出された光電流は、実験番号１１の方法により検出された光電流と比べて、大きいことがわかる。かかる結果から、製造例５で得られた溶解誘引電解液を用いて、溶解性担体を溶解し、修飾標識物質を作用電極本体に誘引させることにより、光電流の検出の際に、製造例５で得られた溶解誘引電解液を製造例４で得られた電解液に置換しても、高感度で修飾標識物質を検出することができることがわかる。また、かかる結果から、製造例４で得られた電解液は、被検物質の検出に際して、電解液として十分な性質を有していることがわかる。
【０１１１】
（試験例４）
製造例５で得られた溶解誘引電解液（実験番号１３）又は製造例４で得られた電解液（実験番号１４）に、２４ヌクレオチド長のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡをその濃度が１ｎＭとなるように溶解し、実験番号１３の試料又は実験番号１４の試料を得た。ここで、製造例５で得られた溶解誘引電解液は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを作用電極に誘引する作用（誘引作用）を有する。一方、製造例４で得られた電解液は、誘引作用を有していない。
【０１１２】
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極上に、実験番号１３の試料１１．５μＬ又は実験番号１４の試料１１．５μＬを滴下し、５分間放置した。その後、作用電極をエタノールで洗浄した。
【０１１３】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。さらに、前記溶解誘引電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。その後、作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例４において、実験番号１３及び１４の試料を用いたときの光電流の測定結果を図２２に示す。
【０１１４】
図２２に示された結果から、誘引作用を有する溶解誘引電解液を含む実験番号１３の試料を用いた場合の光電流誘引作用を有しない電解液を含む実験番号１４の試料を用いた場合の光電流と比べて、高くなっていることがわかる。したがって、修飾標識物質を作用電極に誘引する工程は、シグナルを向上させるのに有効であることがわかる。
【０１１５】
（製造例６〜８）
金ナノ粒子（溶解性担体２１）に、第１結合物質２２ｃと、修飾標識物質２３ａと、誘引用修飾物質２５（３’末端をチオール化した２４ヌクレオチド長のＤＮＡ）とを、第１結合物質２２ｃ：修飾標識物質２３ａ：誘引用修飾物質２５（モル比）が１：１：８（製造例６）、１：３：６（製造例７）、１：９：０（製造例８）となるように混合し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０／ビオチン（数量比）が１／１の第１修飾結合物質〔図２３（Ａ）中、「２０ｃ２」参照；製造例６〕、３／１の第１修飾結合物質〔図２３（Ｂ）中、「２０ｃ３」参照；製造例７〕又は９／１の第１修飾結合物質〔図２３（Ｃ）中、「２０ｃ４」参照；製造例８〕を得た。得られた第１修飾結合物質２０ｃ２、第１修飾結合物質２０ｃ３又は第１修飾結合物質２０ｃ４を濃度が１ｎＭとなるように０．１体積％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）に添加し、混合して溶液Ａ２（製造例６）、溶液Ａ３（製造例７）又は溶液Ａ４（製造例８）を得た。
【０１１６】
（試験例５）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、試料１〔組成：１μｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬ又は試料２〔組成：０μｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕を供し、前記作用電極基板を２５℃で６０分間静置した。
【０１１７】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（第２結合物質２２ａ）を含有する溶液Ｂ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。さらに、前記空間に、ストレプトアビジン（第３結合物質２２ｂ）を含有する溶液Ｃ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例６で得られた溶液Ａ２ ３０μＬ、製造例７で得られた溶液Ａ３ ３０μＬ又は製造例８で得られた溶液Ａ４ ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した。
【０１１８】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。さらに、前記溶解誘引電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。そして、前記作用電極基板及び対極基板を５分間静置した。
【０１１９】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例５において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０／ビオチン（数量比）と、光電流との関係を調べた結果を図２４に示す。図中、黒四角は、試料１を用いた場合の光電流、黒丸は、試料２を用いた場合の光電流を示す。
【０１２０】
図２４に示された結果から、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の数が増加するほど、検出される光電流も増加することがわかる。かかる結果から、本方法により、標識物質量に応じた大きさの光電流を検出することができることがわかる。
【０１２１】
（試験例６）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、試料３〔組成：３ｎｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬ、試料４〔組成：３０ｎｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕又は試料５〔３００ｎｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬリン酸緩衝液〕を供し、前記作用電極基板を２５℃で６０分間静置した。
【０１２２】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（第２結合物質２２ａ）を含有する溶液Ｂ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。さらに、前記空間に、ストレプトアビジン（第３結合物質２２ｂ）を含有する溶液Ｃ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例５で得られた溶液Ａ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した。
【０１２３】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。さらに、前記溶解誘引電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。そして、前記作用電極基板及び対極基板を５分間静置した。
【０１２４】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例６において、被検物質量と、光電流との関係を調べた結果を図２５に示す。
【０１２５】
図２５に示された結果から、被検物質量が増加するほど、検出される光電流も増加することがわかる。かかる結果から、本方法により、被検物質を定量することができることがわかる。
【符号の説明】
【０１２６】
１０ 捕捉物質
２０ 標識結合物質
２１ 溶解性担体
２２ 結合物質
２３ 修飾標識物質
２４ 標識物質
２５ 誘引用修飾物質
１０１ 検出装置
１１１ チップ受入部
１１２ ディスプレイ
１１３ 光源
１１４ 電流計
１１５ 電源
１１６ Ａ／Ｄ変換部
１１７ 制御部
１２０ 検査チップ
１２０ａ 空間
１３０ 上基板
１３０ａ 基板本体
１３０ｂ 試料注入口
１３１ 上基板
１３１ａ 基板本体
１３１ｂ 試料注入口
１３２ 上基板
１３２ａ 基板本体
１３２ｂ 試料注入口
１３３ 上基板
１３３ａ 基板本体
１３３ｂ 試料注入口
１４０ 作用電極基板（下基板）
１４１ 作用電極基板（下基板）
１４２ 作用電極基板（下基板）
１４３ 作用電極基板（下基板）
１４０ａ 基板本体
１４１ａ 基板本体
１４２ａ 基板本体
１４３ａ 基板本体
１５０ 間隔保持部材
１５１ 間隔保持部材
１５１ａ 部材本体
１６１ 作用電極
１６２ 作用電極本体
１６３ 導電層
１６４ 電子受容層
１６５ 絶縁層
１６６ 対極
１６９ 参照電極
１７１ 電極リード
１７２ 電極リード
１７３ 電極リード
Ｓ 被検物質
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の電気化学的検出方法に関する。より詳しくは、核酸、タンパク質等の被検物質の検出や定量等や、これらを利用する疾病の臨床検査、診断等に有用な、被検物質の電気化学的検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の臨床検査や診断は、生体試料中に含まれる前記疾病に関連する遺伝子やタンパク質等を、遺伝子検出法や免疫学的検出法等の検出法によって検出することにより行なわれている。かかる臨床検査や診断を行なうための方法として、被検物質の電気化学的検出方法が知られている。具体的には、光化学的に活性な標識物質を光励起させることにより生じる電流や、電気化学的に活性な標識物質の電圧印加により生じる光又は光励起による電流を、遺伝子やタンパク質等の被検物質の検出に利用する方法が提案されている。
【０００３】
ここで、検体中の被検物質を検出し臨床検査や診断を行なう場合、検体に含まれる微量な被検物質を高感度に検出することが求められる。そこで、例えば、特許文献１には、電気化学的に活性な多数のＥＣＬと被検物質に結合するプローブとを有する担体粒子を用いて、被検物質を検出する方法が提案されている。ここでは、ＥＣＬの電気化学発光の検出に際して、前記担体を溶解し、ＥＣＬを放出させることで分散させる。これにより、ＥＣＬと電解質との接触効率を向上させ、検出感度を高めている。このように、電気化学的検出方法を用いたより高感度な被検物質を検出可能な、電気化学的検出方法の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５０４５２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前述の事情に鑑みてなされたものであり、従来より高感度に被検物質を検出可能な電気化学的検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、
（１）作用電極上に、被検物質に結合する結合物質と標識物質を含有する修飾標識物質とが結合した溶解性担体を有する標識結合物質と、被検物質とを含む複合体を形成すること、（２）この複合体中の標識結合物質に含まれる溶解性担体を溶解させること、及び
（３）作用電極上に修飾標識物質を誘引させること
により、上記課題を解決することができることを見出した。すなわち、本発明者らは、被検物質の電気化学的な検出に際して、前記（１）〜（３）の操作を行なうことにより、被検物質の大きさ等によらず、被検物質の量に応じた標識物質に基づくシグナルを効率よく得ることができ、高感度で被検物質を電気化学的に検出することができることを見出した。
本発明は、かかる本発明者らの知見に基づいてなされたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
被検物質を含む試料を、作用電極に接触させて、作用電極上に捕捉する捕捉工程、
前記被検物質が捕捉された作用電極に、被検物質に結合する結合物質と標識物質を含有する修飾標識物質とが結合した溶解性担体を有する標識結合物質を接触させて、前記作用電極上に、前記被検物質と前記標識結合物質とを含む複合体を形成させる形成工程、
前記作用電極上に形成された複合体に含まれる前記溶解性担体を溶解させ、前記修飾標識物質を遊離させる遊離工程、
前記修飾標識物質を作用電極上に誘引する誘引工程、及び
前記修飾標識物質中の標識物質を電気化学的に検出する検出工程
を含む被検物質の電気化学的検出方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の被検物質の検出方法によれば、従来より高感度に被検物質を検出可能な電気化学的検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法において、作用電極上に形成された捕捉物質と被検物質と標識結合物質とを含む複合体を示す概略説明図である。
【図２】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置を示す斜視図である。
【図３】図２に示される検出装置の構成を示すブロック図である。
【図４】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検査チップを示す斜視図である。
【図５】図４に示される検査チップのＡＡ線での断面図である。
【図６】（Ａ）は図４に示される検査チップの上基板を下面側から見た斜視図である。（Ｂ）は図４に示される検査チップの下基板を上面側から見た斜視図である。
【図７】（ａ）は光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。（ｂ）は光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。
【図８】（ａ）は光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。（ｂ）は光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。
【図９】（ａ）は酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。（ｂ）は酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例を模式的に表した断面説明図である。
【図１０】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板の変形例の平面説明図である。
【図１１】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板の変形例の平面説明図である。
【図１２】（Ａ）は上基板の変形例の平面説明図である。（Ｂ）は下基板の変形例の平面説明図である。
【図１３】本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法（光電気化学検出法）の処理手順を示す工程説明図である。
【図１４】本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法（酸化還元電流・電気化学発光検出法）の処理手順を示す工程説明図である。
【図１５】（Ａ）は試験例１における実験番号１の方法の操作手順を示す概略説明図である。（Ｂ）は試験例１における実験番号３の方法の操作手順を示す概略説明図である。
【図１６】試験例１において、実験番号１〜４の方法での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図１７】（Ａ）は試験例１における実験番号１の方法の光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。（Ｂ）は試験例１における実験番号３の方法の光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。
【図１８】試験例２における実験番号５の方法の操作手順を示す概略説明図である。
【図１９】試験例２において、実験番号５〜８の方法での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２０】（Ａ）は試験例２における実験番号５の方法の光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。（Ｂ）は試験例２における実験番号７の方法の光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。
【図２１】試験例３において、実験番号９〜１２の方法での光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２２】試験例４において、実験番号１３及び１４の試料を用いたときの光電流の測定結果を示すグラフである。
【図２３】（Ａ）は試験例５において、製造例６で得られた第１修飾結合物質を用いたときの光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。（Ｂ）は試験例５において、製造例７で得られた第１修飾結合物質を用いたときの光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。（Ｃ）は試験例５において、製造例８で得られた第１修飾結合物質を用いたときの光電流測定（検出工程）の際の標識物質の状態を示す概略説明図である。
【図２４】試験例５において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０／ビオチン（数量比）と、光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２５】試験例６において、被検物質量と、光電流との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［用語の定義］
本発明の実施の形態を説明するにあたり、まず、本明細書で用いられる用語の定義を示す。
本明細書において、捕捉物質（図１中、「１０」）とは、被検物質Ｓを捕捉する物質であって、作用電極１６１上に固定化されている物質をいう。
標識結合物質（図１中、「２０」）とは、溶解性担体（図１中、「２１」）と、修飾標識物質（図１中、「２３」）と、結合物質（図１中、「２２」）とを含む物質をいう。図１に示される標識結合物質２０においては、溶解性担体２１上に修飾標識物質２３と、結合物質２２とが固定化されている。
結合物質２２は、被検物質Ｓを捕捉する物質であって、溶解性担体２１上に固定化されている物質である。
また、修飾標識物質（図１中、「２３」）とは、標識物質（図１中、「２４」）を含み、作用電極へ誘引可能な物質をいう。かかる「修飾標識物質」の用語の概念には、標識物質（図１中、「２４」）と誘引用修飾物質（図１中、「２５」）とからなる物質が包含される。また、標識物質（図１中、「２４」）が、そのままの状態で作用電極へ誘引可能である場合には、「修飾標識物質」の用語の概念には、当該標識物質単独のものが包含される。
【００１１】
［検出装置の構成］
つぎに、本発明の被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置の一例を添付図面により説明する。
図２は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検出装置を示す斜視図である。この検出装置１０１は、光化学的に活性な物質を標識物質として用い、光電気化学的に被検物質を検出する電気化学的検出方法に用いる検出装置である。
【００１２】
検出装置１０１は、検査チップ１２０が挿入されるチップ受入部１１１と、検出結果を表示するディスプレイ１１２とを備えている。
【００１３】
図３は、図２に示される検出装置の構成を示すブロック図である。検出装置１０１は、光源１１３と、電流計１１４と、電源１１５と、Ａ／Ｄ変換部１１６と、制御部１１７と、ディスプレイ１１２とを備えている。
光源１１３は、検査チップ１２０の作用電極上に存在させた標識物質に光を照射して当該標識物質を励起させる。光源１１３は、励起光を発生する光源であればよい。かかる光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ、レーザーまたは太陽光が好ましい。前記光源のなかでは、レーザーがより好ましい。前記光源は、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタにより、特定波長領域の光のみが放出されるものであってもよい。
電流計１１４は、励起された検出物質から放出される電子に起因して検査チップ１２０内を流れる電流を測定する。
電源１１５は、検査チップ１２０に設けられた電極に対して所定の電位を印加する。
Ａ／Ｄ変換部１１６は、電流計１１４によって測定された光電流値をデジタル変換する。
制御部１１７は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等から構成され、ディスプレイ１１２、光源１１３、電流計１１４及び電源１１５の動作を制御する。また、制御部１１７は、Ａ／Ｄ変換部１６でデジタル変換された光電流値から、予め作成された光電流値と標識物質の量との関係を示す検量線に基づき、標識物質の量を概算し、被検物質の量を算出する。
ディスプレイ１１２は、制御部１１７で概算された検出物質の量等の情報を表示する。
【００１４】
なお、本発明において、前記標識物質を後述の酸化還元電流・電気化学発光検出法にしたがって検出する場合、検出装置は、光源１１３を備えていなくともよい（図示せず）。
前記標識物質を含む検出物質を電気化学発光により検出する場合、検出装置は、標識物質から生じる光等を検出するためのセンサをさらに備えていればよい。
【００１５】
［検査チップの構成］
つぎに、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検査チップ１２０の構成を説明する。図４は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法に用いられる検査チップを示す斜視図である。図５は、図４に示される検査チップのＡＡ線での断面図である。
【００１６】
検査チップ１２０は、上基板１３０と、上基板１３０の下方に設けられた下基板（電極基板）１４０と、上基板１３０と下基板１４０とに挟まれた間隔保持部材１５０とを備えている。検査チップ１２０では、上基板１３０と下基板１４０とは、一側部において重複して配置されている。そして、上基板１３０と下基板１４０とが重複する部分には、間隔保持部材５０が介在している。
【００１７】
上基板１３０は、図６（Ａ）に示されるように、基板本体１３０ａから構成されている。この基板本体１３０ａには、検出物質を含む試料等を内部に注入するための試料注入口１３０ｂが設けられている。この試料注入口１３０ｂは、基板本体１３０ａにおいて、間隔保持部材１５０が介装される部分よりも内側に設けられている。
【００１８】
基板本体１３０ａは、矩形状に形成されている。なお、かかる基板本体１３０ａの形状は、特に限定されるものではなく、多角形形状、円盤状等であってもよい。基板の作製及び取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは矩形状である。基板本体１３０ａを構成する材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、光の透過性、十分な耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体１３０ａの厚さは、十分な耐久性を確保する観点から、好ましくは０．０１〜１ｍｍ、より好ましくは０．１〜０．７ｍｍ、さらに好ましくは約０．５ｍｍである。また、基板本体１３０ａの大きさは、特に限定されないが、多種類の検出物質や被検物質の検出（多項目）を前提とした場合には項目数によるが、通常、２０ｍｍ×２０ｍｍ程度の大きさである。
【００１９】
下基板１４０は、図６（Ｂ）に示されるように、基板本体１４０ａと、作用電極１６１と、対極１６８と、参照電極１６９とを備えている。基板本体１４０ａは、上基板１３０の基板本体１３０ａと略同寸法の矩形状に形成されている。この基板本体１４０ａの表面には、作用電極１６１と、この作用電極１６１に接続されている電極リード１７１と、対極１６８と、この対極１６８に接続された電極リード１７２と、参照電極１６９、この参照電極１６９に接続された電極リード１７３とが形成されている。
【００２０】
基板本体１４０ａを構成する材料は、光の透過性を有する材料であればよい。かかる材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド樹脂等のプラスチック類、金属等の無機材料等が挙げられる。これらのなかでは、十分な光の透過性、耐熱性、耐久性、平滑性等を確保し、かつ材料に要するコストを低減させる観点から、好ましくはガラスである。基板本体１４０ａの厚さ及び大きさは、前記上基板１３０の基板本体１３０ａを構成する材料、基板本体１３０ａの厚さ及び大きさと同様である。
【００２１】
下基板１４０においては、作用電極１６１は、基板本体１４０ａの一側部〔図６（Ｂ）の右側〕に配置されている。電極リード１７１は、作用電極１６１から基板本体１４０ａの他側部〔図６（Ｂ）の左側〕に向けて延びている。また、対極１６８は、基板本体１４０ａ上において、作用電極１６１よりも外側〔図６（Ｂ）において、作用電極１６１の右側〕に配置されている。電極リード１７２は、対極１６８から、作用電極１６１を迂回して、基板本体１４０ａの他側部〔図６（Ｂ）の左側〕に向けて延びている。さらに、参照電極１６９は、作用電極１６１を挟んで、対極１６６と対向する位置に配置されている。電極リード１７３は、参照電極１６９から基板本体１４０ａの他側部〔図６（Ｂ）の左側〕に向けて延びている。そして、作用電極１６１の電極リード１７１と、対極１６６の電極リード１７２と参照電極１６９の電極リード１７３とは、基板本体１４０ａの他側部において互いに並列するように配置されている。また、電極リード１７１，１７２，１７３は、上基板１３０と下基板１４０とが重複する部分からはみ出して外部に露出している。
【００２２】
作用電極１６１は、ほぼ四角形状に形成されている。
図７（ａ）は、光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の一例を模式的に表した断面説明図である。
図７（ａ）に示される作用電極１６１は、基板本体１４０ａと、この基板本体１４０ａ上に形成された作用電極本体１６２とから構成されている。そして、この作用電極本体１６２の表面には、捕捉物質１０が固定化されている。
【００２３】
作用電極本体１６２は、導電層１６３と、この導電層１６３の表面に形成された電子受容層１６４とからなる〔図７（ａ）参照〕。
【００２４】
導電層１６３は、導電性材料からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属またはこれらの少なくとも１つを含む合金；酸化インジウム、スズをドーパントとして含む酸化インジウム等の酸化インジウム系材料；酸化スズ、アンチモンをドーパントとして含む酸化スズ（ＡＴＯ）、フッ素をドーパントとして含む酸化スズ（ＦＴＯ）等の酸化スズ系材料；チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン系材料；グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等からなる炭素系材料等が挙げられる。
導電層１６３の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜２００ｎｍである。
なお、導電性材料は、ガラス、プラスチック等の非導電性物質からなる非導電性基材の表面に導電性を有する材料からなる導電材層が設けられた複合基材であってもよい。かかる導電材層の形状は、薄膜状及びスポット状のいずれであってもよい。導電材層を構成する材料としては、例えば、スズをドープした酸化インジウム（ＩＴＯ）、フッ素をドープした酸化スズ（ＦＴＯ）、アンチモンをドープした酸化スズ（ＡＴＯ）等が挙げられる。
導電層１６３は、例えば、当該導電層１６３を構成する材料の種類に応じた膜形成方法により形成させることができる。膜形成方法としては、蒸着法、スパッタリング法、インプリント法、スクリーン印刷法、めっき処理法、ゾルゲル法、スピンコート法、浸漬法、気相蒸着法等が挙げられる。
【００２５】
電子受容層１６４は、電子を受容可能な物質（電子受容物質）を含んでいる。前記電子受容物質は、光励起により検出物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位をとり得る物質であればよい。ここで、「光励起により検出物質から生じた電子の注入が可能なエネルギー準位」とは、例えば、電子受容性物質として半導体を用いる場合には、伝導帯（コンダクションバンド）を意味する。すなわち、前記電子受容物質は、標識物質（後述）の最低非占有分子軌道（ＬＵＭＯ）のエネルギー準位よりも低いエネルギー順位を有すればよい。
前記電子受容物質としては、特に限定されないが、例えば、シリコン、ゲルマニウム等の単体半導体；チタン、スズ、亜鉛、鉄、タングステン、ジルコニウム、ハフニウム、ストロンチウム、インジウム、セリウム、イットリウム、ランタン、バナジウム、ニオブ、タンタル等の酸化物を含む酸化物半導体；チタン酸ストロンチウム、チタン酸カルシウム、チタン酸ナトリウム、チタン酸バナジウム、ニオブ酸カリウム等のペロブスカイト型半導体；カドニウム、亜鉛、鉛、銀、アンチモン、ビスマス等の硫化物を含む硫化物半導体；ガリウム、チタン等の窒化物を含む半導体；カドミウム、鉛のセレン化物からなる半導体（例えば、カドミウムセレナイド等）；カドミウムのテルル化物を含む半導体；亜鉛、ガリウム、インジウム、カドミウム等のリン化合物からなる半導体；ガリウム砒素、銅−インジウム−セレン化物、銅−インジウム−硫化物等の化合物を含む半導体；カーボン等の化合物半導体または有機物半導体等が挙げられる。なお、前記半導体は、真性半導体及び不純物半導体のいずれであってもよい。
【００２６】
前記半導体のなかでは、酸化物半導体が好ましい。前記酸化物半導体のうち、真性半導体のなかでは、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、酸化インジウム、酸化タングステン、酸化タンタル及びチタン酸ストロンチウムが好ましい。また、前記酸化物半導体のうち、不純物半導体のなかでは、スズをドーパントとして含む酸化インジウム及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズが好ましい。スズをドーパントとして含む酸化インジウム及びフッ素をドーパントとして含む酸化スズは、電子受容物質及び導電性材料の両方の性質を兼ね備えている。そのため、これらの材料は、それぞれ単独で、作用電極本体を構成する材料として用いることができる。
電子受容層１６４の厚さは、通常、０．１〜１００ｎｍ、好ましくは０．１〜１０ｎｍである。
かかる電子受容層１６４は、電子受容層１６４を構成する材料の種類に応じて、導電層１６３の形成に用いられる手法と同様の手法により形成させることができる。
導電層１６３が前記複合基材である場合、電子受容層１６４は、前記導電材層上に形成される。
【００２７】
作用電極本体１６２の表面（電子受容層１６４の表面）には、被検物質Ｓを捕捉する捕捉物質１０が固定化されている〔図７（ａ）参照〕。これにより、被検物質Ｓを作用電極本体１６２の近傍に存在させることができるようになっている。
かかる捕捉物質１０は、被検物質Ｓの種類に応じて、適宜選択することができる。前記捕捉物質１０としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、抗体、特異的な認識能を持つナノ構造体等が挙げられる。
作用電極本体１６２の表面上における捕捉物質１０の固定量は、特に限定されるものではない。作用電極本体１６２の表面上における捕捉物質１０の固定量は、例えば、用途及び目的に応じて設定してもよい。
作用電極本体１６２の表面への捕捉物質１０の固定は、作用電極本体１６２に化学吸着する結合基等を介して行うことができる。前記結合基としては、例えば、チオール基、ヒドロキシル基、リン酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基、アミノ基等が挙げられる。また、作用電極本体１６２の表面への捕捉物質１０の固定は、光硬化性樹脂や物理吸着により行なわれていてもよい。
【００２８】
また、作用電極本体１６２には、シランカップリング剤等を用いた表面処理が施されていてもよい。かかる表面処理により、作用電極本体１６２の表面を親水性または疎水性を有するように適宜調節することができる。前記シランカップリング剤としては、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）等のカチオン性シランカップリング剤等が挙げられる。
【００２９】
図７（ｂ）、図８（ａ）及び図８（ｂ）は、光電気化学検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例の断面説明図である。
本発明においては、図７（ｂ）に示されるように、導電層１６３は、基板本体１４０ａの表面に形成された絶縁層１６５上に形成されていてもよい。この場合、基板本体１４０ａの表面に、順に、絶縁層１６５、導電層１６３、電子受容層１６４が形成されている。
かかる絶縁層１６５は、絶縁体材料から構成されている。前記絶縁体材料としては、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスチック類やフッ化物樹脂等の合成樹脂等が挙げられる。かかる絶縁層１６５は、絶縁体材料の種類に応じた手法により形成させることができる。前記手法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷、インプリント法、ディップコーティング法、スプレーコーティング法等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明においては、図８（ａ）及び（ｂ）に示されるように、電子受容層１６４を構成する電子受容物質が導電性材料としての性質を兼ね備えている場合、作用電極本体１６２は、電子受容層１６４のみで構成されていてもよい。
【００３１】
図９（ａ）は、酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の断面説明図である。また、図９（ｂ）は、酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いられる下基板の作用電極を含む部分の変形例の断面説明図である。
検査チップを酸化還元電流・電気化学発光検出法に用いる場合、作用電極１６１は、用いられる溶液等に対して安定であり、かつ導電性を有する材料からなる電極であればよい〔図９（ａ）及び（ｂ）参照〕。かかる電極としては、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバー等からなる炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム等からなる貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等からなる酸化物電極、電子受容物質としてのケイ素、ゲルマニウム、酸化亜鉛、硫化カドミウム、二酸化チタン、ヒ化ガリウム等からなる半導体電極、チタンからなるチタン電極等が挙げられる。
【００３２】
対極１６６は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属またはこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。
【００３３】
参照電極１６９は、導電性材料からなる薄膜からなる。前記導電性材料としては、例えば、金、銀、銅、カーボン、白金、パラジウム、クロム、アルミニウム、ニッケル等の金属またはこれらの少なくとも１つを含む合金、ＩＴＯ、酸化インジウム等の導電性セラミックス、ＡＴＯ、ＦＴＯ等の金属酸化物、チタン、酸化チタン、窒化チタン等のチタン化合物等が挙げられる。前記薄膜の厚さは、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１０〜２００ｎｍである。なお、本実施の形態では、参照電極１６９を設けているが、本発明においては、参照電極１６９を設けなくてもよい。対極１６６に用いる電極の種類、膜厚にもよるが、電圧降下の影響が僅かな小さな電流（例えば、１μＡ以下）を測定する場合は、対極１６６が参照電極１６９を兼ねていてもよい。一方、大きな電流を測定する場合、電圧降下の影響を抑制し、作用電極１６１に印加する電圧を安定化させる観点から、参照電極１６９を設けることが好ましい。
【００３４】
間隔保持部材１５０は、矩形の環状体形状に形成され、絶縁体であるシリコーンゴムからなっている。この間隔保持部材１５０は、作用電極１６１、対極１６６及び参照電極１６９を取り囲むように配置されている（図５及び図６参照）。上基板１３０と下基板１４０との間には間隔保持部材１５０の厚さに相当する間隔が形成されている。これにより、各電極１６１，１６６，１６９の間には試料や電解液を収容するための空間１２０ａが形成されている（図５参照）。間隔保持部材１５０の厚さは、通常、０．２〜３００μｍである。本発明においては、間隔保持部材１５０を構成する材料として、シリコーンゴムの代わりに、例えば、ポリエステルフィルム製両面テープ等を用いることもできる。
【００３５】
［検査チップの変形例］
本発明においては、作用電極１６１、対極１６６及び参照電極１６９は、各電極が他の電極と接触しないように間隔保持部材１５０の枠内に配置されていればよい。したがって、作用電極１６１、対極１６６及び参照電極１６９は、異なる基板本体上に形成されてもよい。すなわち、検査チップは、基板本体１３１ａに試料注入口１３１ｂ及び参照電極１６９が形成された上基板１３１〔図１０（Ａ）参照〕と、基板本体１４１ａに作用電極１６１及び対極１６６が形成された下基板１４１〔図１０（Ｂ）参照〕とを有するものであってもよい。また、検査チップは、基板本体１３２ａに試料注入口１３２ｂ、対極１６６及び参照電極１６９が形成された上基板１３２〔図１１（Ａ）参照〕と、基板本体１４２ａに作用電極１６１が形成された下基板１４２〔図１１（Ｂ）参照〕とを有するものであってもよい。
【００３６】
さらに、本発明においては、対極１６６及び参照電極１６９は、基板本体上に形成された薄膜状の電極でなくてもよい。すなわち、検査チップは、基板本体１３３ａに試料注入口１３３ｂが形成された上基板１３３〔図１２（Ａ）参照〕と、基板本体１４３ａに作用電極１６１が形成された下基板１４３〔図１２（Ｂ）参照〕と、部材本体１５１ａに対極１６６及び参照電極１６９が設けられた間隔保持部材１５１〔図１２（Ｃ）参照〕とを有するものであってもよい。この場合、対極１６６及び参照電極１６９の少なくともいずれかが間隔保持部材の部材本体に設けられていればよい。そして、上基板及び下基板のいずれかに、部材本体に設けた電極以外の電極が設けられていればよい。
【００３７】
［被検物質の電気化学的検出方法］
本発明の被検物質の電気化学的検出方法は、
（Ａ）被検物質を含む試料を、作用電極に接触させて、作用電極上に捕捉する捕捉工程、（Ｂ）前記被検物質が捕捉された作用電極に、被検物質に結合する結合物質と標識物質を含有する修飾標識物質とが結合した溶解性担体を有する標識結合物質を接触させて、前記作用電極上に、前記被検物質と前記標識結合物質とを含む複合体を形成させる形成工程、
（Ｃ）前記作用電極上に形成された複合体に含まれる前記溶解性担体を溶解させ、前記修飾標識物質を遊離させる遊離工程、
（Ｄ）前記修飾標識物質を作用電極上に誘引する誘引工程、
及び
（Ｅ）前記修飾標識物質中の標識物質を電気化学的に検出する検出工程
を含むことを特徴とする。
【００３８】
本発明の方法は、下記（１）〜（３）を行なう点に１つの特徴がある。
（１）作用電極上における被検物質と標識結合物質とを含む複合体の形成、
（２）この複合体中の標識結合物質に含まれる溶解性担体の溶解、及び
（３）作用電極上への修飾標識物質の誘引
【００３９】
前記複合体を形成することにより、被検物質に応じた量の修飾標識物質を得ることができる。また、前記溶解性担体を溶解させ、その後、作用電極上に、修飾標識物質を誘引することにより、標識物質と作用電極との間で、容易に、効率よく電子の授受を行なうことができるようになる。したがって、本発明の方法によれば、被検物質に応じた量の標識物質を、高感度で検出することができる。
【００４０】
本発明の方法では、前記標識物質として、電気化学的又は光化学的に活性な物質が用いられる。電気化学的に活性な物質は、当該物質に基づく酸化還元電流及び／又は電気化学発光を用いて検出される。一方、光化学的に活性な物質は、当該物質が光により励起されることにより放出される電子を用いて検出される。したがって、本発明の方法は、標識物質の検出技術の種類によって、光電気化学検出法（図１３参照）及び酸化還元電流・電気化学発光検出法（図１４）に大別することができる。
【００４１】
１．光電気化学検出法
まず、光電気化学検出方法について説明する。図１３は、本発明の一実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法（光電気化学検出法）の処理手順を示す工程説明図である。光電気化学検出方法には、上述した図１に示される検出装置及び図４に示される検査チップを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以下、図４に示される検査チップを用いる場合を例としてあげて説明する。
【００４２】
光電気化学検出法では、まず、検査チップ１２０の試料注入口１３０ｂから当該検査チップ内に被検物質Ｓを含有する試料を注入する。そして、作用電極１６１上に被検物質Ｓを捕捉する〔前記工程（Ａ）、図１３（Ａ）を参照〕。工程（Ａ）では、被検物質Ｓは、作用電極本体１６２の表面に固定化された捕捉物質１０によって作用電極１６１上に捕捉される。このとき、前記試料中の被検物質Ｓ以外の物質（夾雑物質Ｆ）は、捕捉物質１０に捕捉されない。
【００４３】
なお、本発明においては、被検物質Ｓを特異的に作用電極１６１上に捕捉することができるのであれば、捕捉物質１０を用いなくてもよい。例えば、作用電極としてＩＴＯを用いた場合、ＩＴＯとチオール基とが結合可能であることを利用して、捕捉物質１０を用いなくともチオール基を有する被検物質Ｓを作用電極１６１上に捕捉することが可能である。
【００４４】
捕捉物質１０としては、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、捕捉物質１０は、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は前記核酸に対する抗体であればよい。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、捕捉物質１０は、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体、タンパク質に対するリガンド、ペプチドに対するレセプタータンパク質等であればよい。
【００４５】
捕捉物質１０による被検物質Ｓの捕捉は、例えば、捕捉物質１０と被検物質Ｓとが結合する条件下で行なうことができる。捕捉物質１０と被検物質Ｓとが結合する条件は、被検物質Ｓの種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、被検物質Ｓが核酸であり、捕捉物質１０が前記核酸にハイブリダイズする核酸プローブである場合、被検物質Ｓの捕捉は、ハイブリダイゼーション用緩衝液存在下に行なうことができる。また。被検物質Ｓが核酸であり、捕捉物質１０が前記核酸に対する抗体である場合、被検物質１０の捕捉は、リン酸緩衝生理的食塩水、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の抗原抗体反応を行なうに適した溶液中で行なうことができる。
【００４６】
つぎに、試料注入口１３０ｂから当該検査チップ１２０内に標識結合物質２０ａを注入する。これにより、標識結合物質２０ａを作用電極１６１上に捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔前記工程（Ｂ）、図１３（Ｂ）を参照〕。工程（Ｂ）では、作用電極１６１上に、捕捉物質１０と被検物質Ｓと標識結合物質２０ａとを含む複合体が形成される。
【００４７】
標識結合物質２０ａは、溶解性担体２１と、標識物質２４ａ及び誘引用修飾物質２５とからなる修飾標識物質２３ａと、被検物質Ｓに結合する結合物質２２とから構成されている。標識結合物質２０ａでは、修飾標識物質２３ａ及び結合物質２２は、溶解性担体２１の表面に固定化されている。
【００４８】
標識物質２４ａは、光を照射することにより励起状態となり電子を放出する物質である。標識物質２４ａとして、金属錯体、有機蛍光体、量子ドット及び無機蛍光体からなる群より選択された少なくとも１つを用いることができる。
前記標識物質の具体例としては、金属フタロシアン、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、鉄錯体、亜鉛錯体、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、ポルフィリン系色素、フタロシアニン系色素、ローダミン系色素、キサンテン系色素、クロロフィル系色素、エオシン系色素、マーキュロクロム系色素、インジゴ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、ＣＡＬＦｌｕｏｒ系色素、オレゴングリーン系色素、ロードル（Ｒｈｏｄｏｌ）グリーン、テキサスレッド、カスケードブルー、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、セレン化カドミウム、テルル化カドミウム、Ｌｎ2Ｏ3：Ｒｅ、Ｌｎ2Ｏ2Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、ＣａＷＯ4、ＭＯ・ｘＡｌ2Ｏ3：Ｅｕ、Ｚｎ2ＳｉＯ4：Ｍｎ、ＬａＰＯ4：Ｃｅ、Ｔｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５及びＣｙ９（いずれも、アマシャムバイオサイエンス社製）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（いずれも、モレキュラープローブ社製）；ＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹ―８００、ＤＹＱ−６６０及びＤＹＱ−６６１（いずれも、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）；Ａｔｔｏ４２５、Ａｔｔｏ４６５、Ａｔｔｏ４８８、Ａｔｔｏ４９５、Ａｔｔｏ５２０、Ａｔｔｏ５３２、Ａｔｔｏ５５０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５９０、Ａｔｔｏ５９４、Ａｔｔｏ６１０、Ａｔｔｏ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ６２０、Ａｔｔｏ６３３、Ａｔｔｏ６３５、Ａｔｔｏ６３７、Ａｔｔｏ６４７、Ａｔｔｏ６５５、Ａｔｔｏ６８０、Ａｔｔｏ７００、Ａｔｔｏ７２５及びＡｔｔｏ７４０（いずれも、Ａｔｔｏ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）；ＶｉｖｏＴａｇＳ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ６８０及びＶｉｖｏＴａｇＳ７５０（いずれも、ＶｉｓＥｎＭｅｄｉｃａｌ社製）等が挙げられる。なお、前記ＬｎはＬａ、Ｇｄ、Ｌｕ又はＹを示し、Ｒｅはランタニド族元素を示し、Ｍはアルカリ土類金属元素を示し、ｘは０．５〜１．５の数を示す。標識物質の他の例については、例えば、特許第４０８６０９０号公報、特開平７−８３９２７号公報、特願２００８−１５４１７９号公報等を参照することができる。
【００４９】
誘引用修飾物質２５としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸等が挙げられる。なお、本発明においては、標識物質２４ａが作用電極へ誘引可能な物質である場合、かかる誘引用修飾物質２５を用いなくてもよい。
ここで、誘引用修飾物質として、核酸を用いる場合、後述する修飾標識物質２３ａを作用電極１６１に誘引する観点および溶解性担体への結合効率の観点から、当該核酸の長さは１塩基以上１００００塩基以下、より具体的には１０塩基〜４０塩基が好ましい。
【００５０】
結合物質２２は、被検物質Ｓにおいて、捕捉物質１０とは異なる位置や場所に結合する物質であればよい。かかる結合物質２２は、被検物質Ｓの種類に応じて適宜選択される。例えば、被検物質Ｓが核酸である場合、結合物質２２は、かかる核酸にハイブリダイズする核酸プローブ又は前記核酸に対する抗体であればよい。また、被検物質Ｓがタンパク質又はペプチドである場合、結合物質２２は、かかるタンパク質又はペプチドに対する抗体、タンパク質に対するリガンド、ペプチドに対するレセプタータンパク質等であればよい。
【００５１】
修飾標識物質２０ａは、後述の工程において、作用電極１６１への誘引が容易であることから、標識物質２４ａと核酸とからなることが好ましい。
【００５２】
工程（Ｂ）では、被検物質Ｓに結合していない残部の標識結合物質２０ａは、検査チップ１２０内において、遊離した状態で存在している。したがって、工程（Ｂ）の後、遊離の標識結合物質２０ａを除去する工程〔「洗浄工程」、図１３（Ｃ）参照〕をさらに行なう。これにより、検出結果の特性を向上させることができる。なお、かかる洗浄工程は、行なわなくてもよい。かかる洗浄工程では、例えば、エタノール、精製水等が用いられる。
【００５３】
光電気化学検出法では、つぎに、作用電極１６１上に形成された複合体に含まれる２１溶解性担体２１を溶解させ、修飾標識物質２３ａを遊離させる〔前記工程（Ｃ）、図１３（Ｄ）参照〕。
【００５４】
溶解性担体２１は、溶解して、その表面に固定化された修飾標識物質２３ａを遊離状態にさせることができる物質であればよい。前記溶解性担体２１としては、例えば、金、銀、パラジウム、プラチナ、イリジウム、ロジウム等の金属からなる金属微粒子；ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルニトリル、ナイロン、エチレン・アクリル酸共重合物、スチレン・アクリル酸エステル、架橋スチレン・アクリル、架橋ポリアクリル酸エステル、架橋ポリメタクリル酸ブチル、架橋ポリメタクリル酸メチル、シリコン樹脂、フェノール樹脂、メラミン・ホルマリン、ベンゾグアナミン・ホルマリン、ベンゾグアナミン・メラミン・ホルマリン、ポリ乳酸、ポリアミド樹脂等のポリマーからなるポリマー微粒子；パルミテート、オレエート等の脂肪酸のイオン、または、ポリアルキレンオキシド、ポリリンゴ酸、ポリアスパラギン酸、ポリエチレングリコール等の親水性高分子連鎖部とポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリメタクリル酸エステル等の疎水性高分子連鎖部とを有する高分子化合物等からなる高分子ミセル微粒子；リン脂質を水和した際に形成する微小な球体粒子であるリポソーム；アガロースゲル等の多糖類のゲルからなる多孔性微粒子等が挙げられる。
前記溶解性担体２１のなかでは、取り扱いが容易であることから、金ナノ粒子（金微粒子）が好ましい。
なお、溶解性担体２１は、修飾標識物質を固定する表面部分のみを溶解させることで、修飾標識物質を遊離させることができるのであれば、異なる材料からなる複数の層を有する担体であってもよい。例えば、酸化鉄(磁性)ナノ粒子周囲に金ナノ粒子を結合させた金−酸化鉄(磁性)ナノ粒子のうち金ナノ粒子のみが溶解される担体等が挙げられる。
【００５５】
溶解性担体２１の溶解は、検査チップ１２０を構成する基板本体の材料や電極（作用電極、対極及び参照電極）の材料を劣化させない条件下に、溶解性担体２１の種類に応じた手法により行なうことができる。例えば、溶解性担体２１を溶解する液体により、または溶解性担体２１が熱により溶融する担体である場合には、溶解性担体２１を加熱することにより、溶解性担体２１を溶解させることができる。
溶解性担体２１が前記金属微粒子である場合、検査チップ１２０を構成する基板本体の材料や電極（作用電極、対極及び参照電極）の材料を劣化させない条件下に、金属の酸化溶解を行なうことにより、溶解性担体２１を溶解させることができる。金属微粒子の溶解には、水酸化アルカリを含む液体、シアン化アルカリを含む液体、フェロシアン化塩を含む液体、ハロゲンとハロゲン化物との混合物を含む液体等を用いることができる。水酸化アルカリを含む液体としては、例えば、水酸化カリウム等の溶解液が挙げられる。また、シアン化アルカリを含む液体としては、例えば、シアン化ナトリウム（ＮａＣＮ）と水酸化ナトリウムとを含む水溶液等が挙げられる。フェロシアン化塩を含む液体としては、例えば、フェロシアン化カリウムとシアン化カリウムとの混合物等が挙げられる。ハロゲン単体とハロゲン化塩との混合物としては、ヨウ素とヨウ化アルカリ（例えば、ヨウ化アンモニウム等）との混合物、臭素と臭化アルカリ（例えば、臭化アンモニウム）との混合物等が挙げられる。これらの溶解液に用いる溶媒としては、例えば、アセトニトリル等の有機溶媒、また、純水等が挙げられる。例えば、溶解性担体２１として、金微粒子を用いた場合、金の剥離液やエッチング液として知られる液体を用いることができる。
溶解性担体２１が前記ポリマー微粒子である場合、検査チップ１２０を構成する基板本体の材料や電極（作用電極、対極及び参照電極）の材料を劣化させない条件下に、有機溶媒を当該溶解性担体２１に接触させること；当該溶解性担体２１を構成するポリマーの融点よりも高い温度に前記溶解性担体２１を加熱すること等により、溶解性担体２１を溶解させることができる。前記有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、エーテル化合物、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、アセトン、塩化メチレン、シクロペンタノン等が挙げられる。
溶解性担体２１が前記高分子ミセルやリポソームである場合、ミセル構造を崩壊させる超音波処理や水による希釈等により、溶解性担体２１を溶解させることができる。
溶解性担体２１が前記多孔性微粒子である場合、当該溶解性担体２１を構成する多糖類のゲルの融点以上の温度に前記溶解性担体２１を加熱すること等により、溶解性担体２１を溶解させることができる。
溶解性担体２１が金ナノ粒子（金微粒子）である場合、ヨウ化物イオンとアセトニトリルとを含有する液体を用いることにより、当該溶解性担体２１を容易に溶解させることができる。
【００５６】
光電気化学検出法では、つぎに、修飾標識物質２３ａを作用電極１６１上に誘引する〔前記工程（Ｄ）、図１３（Ｅ）参照〕。これにより、前記工程（Ｃ）で、遊離した修飾標識物質２３ａが作用電極１６１の近傍に移送される。したがって、前記工程（Ｃ）で、修飾標識物質２３ａを遊離させただけの状態と比べて、標識物質２４ａと作用電極本体１６２との間の電子の授受が一層容易になる。
【００５７】
前記工程（Ｄ）では、修飾標識物質２３ａを作用電極１６１の近傍に誘引させる溶媒（「誘引液」ともいう）を用いることができる。作用電極１６１上への修飾標識物質の誘引は、修飾標識物質２３ａ、誘引液及び作用電極１６１との間の疎水性相互作用若しくは親水性相互作用、又は、作用電極１６１又は対極１６９に電圧を印加することによる電気泳動効果を利用すること等により行なうことができる。
【００５８】
本誘引工程は、例えば、
１） 誘引液の疎水性・親水性を変更することにより、修飾標識物質２３ａと作用電極１６１との間の疎水性相互作用若しくは親水性相互作用を大きくすること〔すなわち、修飾標識物質２３ａを、極性の違いによって、作用電極１６１に誘引すること〕（誘引方法１）、
２） 修飾標識物質２３ａの電荷に応じて、正又は負の電圧を作用電極１６１に印加することにより、電気泳動効果を大きくすること〔すなわち、修飾標識物質２３ａを、電気泳動効果を利用することによって、作用電極１６１）に誘引すること〕（誘引方法２）等によって行なうことができる。前記の誘引方法１及び誘引方法２は、それぞれ単独で行なってもよく、両者を組み合わせて行なってもよい。
【００５９】
誘引方法１では、誘引用修飾物質２５として核酸を用いる場合、誘引液は、修飾標識物質２３ａと作用電極１６１との間の疎水性相互作用又は親水性相互作用を大きくして、作用電極１６１の近傍に検出物質を誘引しやすくする観点から、カオトロピックイオンを含有する液体であることが好ましい。
【００６０】
前記カオトロピックイオンとしては、例えば、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、グアニジンイオン、チオシアン酸イオン、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、塩化物イオン、酢酸イオン、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン等が挙げられる。
【００６１】
誘引液がカオトロピックイオンを含有する場合、誘引液中におけるカオトロピックイオンの濃度は、用いられるカオトロピックイオンの種類により異なる。前記濃度は、通常１．０〜８．０ｍｏｌ／Ｌである。カオトロピックイオンがグアニジンイオンである場合、誘引液中におけるカオトロピックイオンの濃度は、通常、４．０〜７．５ｍｏｌ／Ｌである。また、チオシアン酸イオンである場合、誘引液中におけるカオトロピックイオンの濃度は、通常、３．０〜５．５ｍｏｌ／Ｌである。
【００６２】
なお、標識物質２４ａ又は誘引用修飾物質２５として核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を用いる場合、慣用の核酸抽出・精製方法の原理を利用して、修飾標識物質２３ａを、作用電極１６１の近傍に誘引させることができる。
【００６３】
前記核酸抽出・精製方法としては、液相を用いる方法、核酸結合用担体を用いる方法等が挙げられる。液相を用いる方法としては、例えば、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ、１９６３年発行、第７２巻、ｐｐ．６１９−６２９）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７９年発行、第７巻、ｐｐ．１５１３−１５２３）、塩酸グアニジンを含有する緩衝液にエタノールを加え核酸を沈降させる方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６２、１９８７、４６３）等が挙げられる。核酸結合用担体を用いる方法としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液とを用いて核酸をガラス粒子に吸着させ、単離する方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６−２：６１５−６１９，１９７９）や、シリカ粒子とカオトロピックイオンを用いる方法〔例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年発行、第２８巻、ｐｐ．４９５−５０３、特許第２６８０４６２号公報等を参照〕等が挙げられる。シリカ粒子とカオトロピックイオンを用いる方法では、まず、核酸が結合するシリカ粒子と試料中の核酸を遊離する能力を有するカオトロピックイオンを含む溶液とを試料と混合して核酸をシリカ粒子に結合させる。つぎに、夾雑物質を洗浄により除去する。その後、シリカ粒子に結合した核酸を回収する。前記方法によれば、簡便、かつ迅速に核酸を抽出することができる。しかも、かかる方法は、ＤＮＡの抽出だけではなく、より不安定であるＲＮＡの抽出にも好適であり、純度の高い核酸が得られるという点で非常に優れている。
そこで、修飾標識物質２３ａが、標識物質２４ａ又は誘引用修飾物質２５として核酸を含む場合、前記核酸抽出・精製方法に用いられる溶媒を誘引液として用いることにより、修飾標識物質２３ａを作用電極１６１の近傍に誘引させることができる。この場合、カオトロピックイオンとして、グアニジンイオン、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、チオシアン酸イオン又はこれらの任意の組み合わせを用い、作用電極１６１として核酸を結合する電極（例えば、スズをドープした酸化インジウム等）を用いることが好ましい。
【００６４】
また、修飾標識物質２３ａが、標識物質２４ａ又は誘引用修飾物質２５として核酸を含む場合、誘引液は、必要に応じて、緩衝液を含有していてもよい。前記緩衝液は、核酸を安定に保持するために一般に用いられる緩衝液であればよい。前記緩衝液は、核酸を安定に保持する観点から、中性付近、すなわちｐＨ５．０〜９．０において緩衝能を有することが好ましい。前記緩衝液としては、例えば、トリス−塩酸塩、四ホウ酸ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度は、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００６５】
一方、誘引方法２では、修飾標識物質２３ａの電荷に応じて、正又は負の電圧を作用電極１６１に印加する。ここで、核酸は負に荷電している。したがって、修飾標識物質２３ａが、標識物質２４ａ又は誘引用修飾物質２５として核酸を含む場合、作用電極１６１に正の電圧を印加することにより、修飾標識物質２３ａを作用電極１６１の近傍に誘引させることができる。
【００６６】
光電気化学検出法では、つぎに、検査チップ１２０の作用電極１６１上に存在する修飾標識物質２３ａ中の標識物質２４ａに光を照射して標識物質２４ａを励起させ、光電流を測定することにより、検出物質を検出する〔前記工程（Ｅ）、図１３（Ｆ）参照〕。
【００６７】
工程（Ｅ）では、前記工程（Ｄ）において誘引液を用いた場合、必要に応じて、誘引液を、電気化学的な検出に適した電解液に置換することができる。この場合、電解液の存在下において、標識物質２４ａを電気化学的に検出する。
なお、誘引液が、酸化された状態の標識物質２４ａに電子を供給する性質を有し、標識物質２４ａの電気化学的な検出が可能である場合、工程（Ｅ）において、この誘引液をそのまま用いてもよい。
【００６８】
前記電解液として、酸化された状態の標識物質２４ａに電子を供給しうる塩からなる電解質と、非プロトン性極性溶媒、プロトン性極性溶媒又は非プロトン性極性溶媒とプロトン性極性溶媒との混合物とを含む溶液を用いることができる。この電解液は、所望により、他の成分をさらに含んでいてもよい。
【００６９】
電解質としては、例えば、ヨウ化物、臭化物、金属錯体、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、これらの混合物等が挙げられる。前記電解質の具体例としては、ヨウ化リチウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化セシウム、ヨウ化カルシウム等の金属ヨウ化物；テトラアルキルアンモニウムヨーダイド、ピリジニウムヨーダイド、イミダゾリウムヨーダイド等の４級アンモニウム化合物のヨウ素塩；臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化セシウム、臭化カルシウム等の金属臭化物；テトラアルキルアンモニウムブロマイド、ピリジニウムブロマイド等の４級アンモニウム化合物の臭素塩；フェロシアン酸塩、フェリシニウムイオン等の金属錯体；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸アンモニウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム等のチオ硫酸塩；亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸鉄、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩；及びこれらの混合物等が挙げられる。これらのなかでは、テトラプロピルアンモニウムヨーダイド及びヨウ化カルシウムが好ましい。
【００７０】
電解液の電解質濃度は、好ましくは０．００１〜１５Ｍである。
【００７１】
プロトン性極性溶媒として、水、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒等を用いることができる。
非プロトン性極性溶媒としては、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）等のニトリル類；プロピレンカーボネート、エチレンカーボネート等のカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノン、３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩等の複素環化合物；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホラン等が挙げられる。非プロトン性極性溶媒のなかでは、アセトニトリルが好ましい。プロトン性極性溶媒及び非プロトン性極性溶媒は、単独で、又は両者を混合して用いることができる。プロトン性極性溶媒と非プロトン性極性溶媒との混合物は、水とアセトニトリルとの混合物が好ましい。
【００７２】
標識物質２４ａへの光の照射には、標識物質２４ａを光励起することができる波長の光を照射できる光源を用いることができる。かかる光源は、標識物質２４ａの種類等に応じて、適宜選択することができる。前記光源としては、例えば、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色ＬＥＤ、青色ＬＥＤ、緑色ＬＥＤ、赤色ＬＥＤ等）、レーザー（炭酸ガスレーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光等が挙げられる。前記光源のなかでは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ又は太陽光が好ましい。また、検出工程においては、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみを標識物質２４ａに照射してもよい。
【００７３】
標識物質２４ａに由来する光電流の測定には、例えば、電流計、ポテンショスタット、レコ−ダ及び計算機を備える測定装置等を用いることができる。
かかる工程（Ｅ）では、光電流を定量することにより、被検物質の量を調べることができる。
【００７４】
２．酸化還元電流・電気化学発光検出法
つぎに、酸化還元電流・電気化学発光検出法について説明する。図１４は、本発明の他の実施の形態に係る被検物質の電気化学的検出方法（酸化還元電流・電気化学発光検出法）の処理手順を示す工程説明図である。
【００７５】
かかる酸化還元電流・電気化学発光検出法においても、前記光電気化学検出法の場合と同様に、まず、検査チップ１２０の試料注入口１３０ｂから当該検査チップ内に被検物質Ｓを含有する試料を注入する。そして、作用電極１６１上に被検物質Ｓを捕捉する〔前記工程（Ａ）、図１４（Ａ）を参照〕。つぎに、試料注入口１３０ｂから当該検査チップ１２０内に標識結合物質２０ｂを注入する。これにより、標識結合物質２０ｂを作用電極１６１上に捕捉された被検物質Ｓに結合させる〔前記工程（Ｂ）、図１４（Ｂ）を参照〕。
【００７６】
標識結合物質２０ｂは、溶解性担体２１と、標識物質２４ｂ及び誘引用修飾物質２５とからなる修飾標識物質２３ｂと、被検物質Ｓに結合する結合物質２２とから構成されている。修飾標識物質２３ｂ及び結合物質２２は、溶解性担体２１の表面に固定化されている。
標識物質２４ｂは、電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質又は電圧を印加することにより発光する標識物質である。
電圧を印加することにより酸化還元電流を生じる標識物質としては、例えば、電気的に可逆的な酸化還元反応を起こす金属を中心金属として含む金属錯体等が挙げられる。このような金属錯体としては、例えば、トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体等が挙げられる。
また、酸化還元電流・電気化学発光検出法においても、誘引用修飾物質としても利用可能な核酸を標識物質として用いてもよい。標識物質２３ｂとして核酸を用いた場合、核酸由来の酸化還元電流として、アデニン、チミン、グアニン、シトシン又はウラシルに由来する酸化還元電流を利用することができる。
電圧を印加することにより発光する標識物質としては、例えば、ルミノール、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセン、ルブレン等が挙げられる。
これらの標識物質の発光は、例えば、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノール、クロロフェノールのようなフェノ−ル類若しくはナフトール類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
なお、誘引用修飾物質２５及び結合物質２２は、光電気化学検出法における誘引用修飾物質２５及び結合物質２２と同様である。
【００７７】
酸化還元電流・電気化学発光検出法では、つぎに、遊離の標識結合物質２０ｂを除去する〔「洗浄工程」、図１４（Ｃ）参照〕。そして、作用電極１６１上に形成された複合体に含まれる溶解性担体２１を溶解させ、修飾標識物質２３ｂを遊離させる〔前記工程（Ｃ）、図１４（Ｄ）参照〕。その後、修飾標識物質２３ｂを作用電極１６１上に誘引する〔前記工程（Ｄ）、図１４（Ｅ）参照〕。これらの工程は、前述した光電気化学検出法の場合と同様の操作により行なうことができる。
【００７８】
酸化還元電流・電気化学発光検出法では、つぎに、検査チップ１２０の作用電極１６１上に存在する修飾標識物質２３ｂ中の標識物質２４ｂに電圧を印加する。そして、標識物質２４ｂに基づく酸化還元電流又は光を測定することにより、被検物質Ｓを検出する〔前記工程（Ｅ）、図１４（Ｆ）〕。なお、図１４（Ｆ）では、光を測定する場合を例として挙げて示している。
【００７９】
かかる工程（Ｅ）では、前記工程（Ｄ）において誘引液を用いた場合、光電気化学検出法の場合と同様に、必要に応じて、誘引液を、電気化学的な検出に適した電解液に置換することができる。この場合、電解液の存在下において、標識物質２４ｂを電気化学的に検出する。
【００８０】
本工程（Ｅ）において、酸化還元電流を測定する場合、酸化還元電流の測定には、例えば、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ、レコ−ダ及び計算機を備える測定装置等を用いることができる。
この場合、酸化還元電流を定量することにより、被検物質Ｓの量を調べることができる。
【００８１】
本工程（Ｅ）において、標識物質２４ｂに基づく光を測定する場合、当該光の測定には、フォトンカウンタ等を用いることができる。また、この場合、電極の代わりに、光ファイバーの先端に透明電極を形成することにより得られる光ファイバー電極を用いて間接的に検出することもできる（特許第２５７３４４３号公報を参照）。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例等により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８３】
（製造例１）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、スズをドープした酸化インジウムの薄膜（厚さ２００ｎｍ）からなる作用電極本体を形成した。前記薄膜は、導電層と電子受容層とを兼ねている。つぎに、前記作用電極本体に、電流計と接続するための作用電極リードを接続した。
【００８４】
得られた作用電極基板の作用電極本体の表面に対して、シランカップリング剤である３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）により表面処理を施した。つぎに、捕捉物質として、抗マウスＩｇＧ抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント〔ダコ社製〕をＴＣＥＰ〔トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン〕により還元処理し、前記作用電極本体の表面のＭＰＴＥＳと反応させてジスルフィド結合を形成させることにより、前記捕捉物質を前記作用電極本体の表面に固定化した。その後、ブロッキング剤であるチオール化ＰＥＧ〔シグマ−アルドリッチ社製〕を、前記作用電極本体の表面における残部のＭＰＴＥＳと反応させた。これにより、作用電極基板を得た。
【００８５】
（製造例２）
スパッタリング法により、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）からなる基板本体上に、厚さ２００ｎｍの白金薄膜（導電層）からなる対極を形成し、対極基板を得た。前記対極部には電流計と接続するための対極リードを接続した。これにより、対極基板を得た。
【００８６】
（製造例３）
修飾標識物質として、３’末端をチオール化した２４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔図１５（Ａ）（ｄ）中の「２５」；以下、「誘引用修飾物質２５」という。〕と、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０（インビトロジェン社製）〔図１５（Ａ）（ｄ）中の「２４ａ」；以下、「標識物質２４ａ」という〕とからなる複合体〔図１５（Ａ）（ｄ）中、「２３ａ」〕を使用した。
【００８７】
つぎに、前記修飾標識物質２３ａと、３’末端をチオール化した２４ヌクレオチド長のビオチン標識ＤＮＡ〔図１５（Ａ）（ｄ）中、２２ｃ；以下、「第１結合物質２２ｃ」という〕とを１０：１（モル比）となるように混合した。なお、第１結合物質２２ｃは、２４ヌクレオチド長のＤＮＡ〔誘引用修飾物質２５〕と、ビオチン〔図１５（Ａ）（ｄ）中、「２２ｃ１」〕とからなる。
【００８８】
得られた混合物５６０ピコモルと、溶解性担体である金ナノ粒子〔図１５（Ａ）（ｄ）中、「２１」〕５．６ピコモルとを混合して前記修飾標識物質２３ａ及び第１結合物質２２ｃそれぞれのチオール基を溶解性担体２１の表面に結合させた。得られた産物を限外濾過法により濃縮・精製し、第１修飾結合物質２０ｃ１を得た。得られた第１修飾結合物質２０ｃ１をその濃度が１ｎＭとなるように０．１体積％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）リン酸緩衝化生理食塩水に添加し、混合して溶液Ａを得た。
【００８９】
（製造例４）
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に、アスコルビン酸を電解質として、その濃度が０．６Ｍとなるように添加して、電解液を得た。
【００９０】
（製造例５）
アセトニトリルとエチレンカーボネートとを体積比で２：３となるように混合し、非プロトン性極性溶媒を得た。前記非プロトン性極性溶媒に、電解質塩として、テトラプロピルアンモニウムヨーダイドをその濃度が０．６Ｍとなるように溶解させた。得られた溶液に、さらに電解質として、ヨウ素をその濃度が０．０６Ｍとなるように溶解させ、溶解誘引電解液を得た。
【００９１】
なお、前記ヨウ素及びテトラプロピルアンモニウムヨーダイドは、金ナノ粒子を溶解させることができる。また、前記ヨウ素又はテトラプロピルアンモニウムヨーダイドより生成されるヨウ化物イオンは、第１標識結合物質に含まれる修飾標識物質を作用電極上に誘引させることができる。したがって、本製造例４で得られた溶解誘引電解液を用いることにより、標識結合物質に用いられた担体の溶解、作用電極上への修飾標識物質の誘引及び電気化学検出を、同一の液体中で行なうことができる。
【００９２】
（試験例１）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、マウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）を含有する試料〔組成：１μｇマウスＩｇＧ／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを供し、前記作用電極基板を２５℃で６０分間静置した。これにより、作用電極本体１６２上の捕捉物質１０に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１５（Ａ）（ａ）参照〕。
【００９３】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体〔図１５（Ａ）（ｂ）中、「２２ａ」；以下、「第２結合物質２２ａ」ともいう〕を含有する溶液Ｂ〔組成：４ｎｇビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）／μＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した〔図１５（Ａ）（ｂ）参照〕。これにより、作用電極本体１６２上の被検物質Ｓに、第２結合物質２２ａを付加した〔図１５（Ａ）（ｃ）参照〕。なお、第２結合物質２２ａは、マウスＩｇＧに結合する抗マウスＩｇＧ抗体２２ａ１と、ビオチン２２ａ２とからなる。
【００９４】
つぎに、前記空間に、ストレプトアビジン〔図１５（Ａ）（ｃ）中、「２２ｂ」、以下、「第３結合物質２２ｂ」ともいう〕を含有する溶液Ｃ〔４００ｎＭストレプトアビジン（ベクター社製）を含むトリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）〕３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。これにより、作用電極上に、捕捉物質１０と被検物質Ｓと標識結合物質２０ｃとを含む複合体を形成した〔図１５（Ａ）（ｄ）参照〕。その後、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した（実験番号１）。また、被検物質Ｓを含有する試料の代わりに、被検物質Ｓを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号２）。
【００９５】
なお、対照として、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体、ストレプトアビジン、製造例３で得られた溶液Ａの代わりに、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識抗マウスＩｇＧ抗体を含有する溶液Ｄ〔組成：４ｎｇ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識抗マウスＩｇＧ抗体（インビトロジェン社製）／μＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号３）〔図１５（Ｂ）（ａ）及び（ｂ）参照〕。また、被検物質Ｓを含有する試料の代わりに、被検物質Ｓを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号４）。
【００９６】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例４で得られた電解液１１．５μＬを充填した。そして、前記電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極と対極とを電解液に接触させた。つぎに、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【００９７】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射した。光照射により、標識物質が励起され、電子を生じる。そして、前記電子が作用電極に輸送されることにより、作用電極と対極との間に電流が流れる。そこで、この電流を測定した。試験例１において、実験番号１〜４の方法での光電流の測定結果を図１６に示す。
【００９８】
図１６に示された結果から、製造例４で得られた電解液を用いた場合、実験番号１及び実験番号３では、被検物質Ｓの存在に基づく光電流を検出することができることがわかる。しかしながら、被検物質Ｓが存在しない場合の光電流との差が小さい〔図１６中、実験番号２及び実験番号４参照〕。これは、図１７に示されるように、実験番号１の方法〔図１７（Ａ）参照〕及び実験番号３の方法〔図１７（Ｂ）参照〕では、作用電極本体１６２と標識物質２４ａ，２０３との間の距離が長く、標識物質２４ａ，２０３から生じた電子が作用電極本体１６２に輸送されにくいためであると考えられる。
【００９９】
（試験例２）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、マウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）を含有する試料〔組成：１μｇマウスＩｇＧ／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを供し、前記作用電極基板を２５℃で６０分間静置した。これにより、作用電極本体１６２上の捕捉物質１０に、被検物質Ｓを捕捉させた〔図１８（Ａ）参照〕。
【０１００】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（第２結合物質２２ａ）を含有する溶液Ｂ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。つぎに、前記空間に、ストレプトアビジン（第３結合物質２２ｂ）を含有する溶液Ｃ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。これにより、作用電極上に、捕捉物質１０と被検物質Ｓと標識結合物質２０ｃとを含む複合体を形成した〔図１８（Ｂ）参照〕。その後、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した（実験番号５）。また、被検物質Ｓを含有する試料の代わりに、被検物質Ｓを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号６）。
【０１０１】
なお、対照として、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体、ストレプトアビジン、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬの代わりに、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識抗マウスＩｇＧ抗体を含有する溶液Ｄ３０μＬを用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号７）。また、被検物質Ｓを含有する試料の代わりに、被検物質Ｓを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号８）。
【０１０２】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。さらに、前記溶解誘引電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。そして、前記作用電極基板及び対極基板を５分間静置した。これにより、作用電極と対極とを溶解誘引電解液に接触させた。つぎに、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。なお、製造例５で得られた溶解誘引電解液によって溶解性担体２１は溶解され、修飾標識物質２３ａは遊離した状態となる。また、遊離した状態の修飾標識物質２３ａは、製造例５で得られた溶解誘引電解液によって作用電極本体１６２上に誘引される。
【０１０３】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例２において、実験番号５〜８の方法での光電流の測定結果を図１９に示す。
【０１０４】
図１９に示された結果から、製造例５で得られた電解液を用いた場合、実験番号５の検出方法により検出された光電流は、実験番号７の検出方法により検出された光電流と比べて、大きいことがわかる。これは、図２０に示されるように、実験番号７の方法〔図２０（Ｂ）参照〕では、捕捉物質と被検物質と標識物質２０３とからなる複合体が物理的に嵩高い構造をとるため、作用電極本体１６２と標識物質２０３との間の距離が長く、標識物質２０３から生じた電子が作用電極本体１６２に輸送されにくいのに対し、実験番号５の方法〔図２０（Ａ）参照〕では、製造例５で得られた溶解誘引電解液による溶解性担体２１の溶解と、遊離した修飾標識物質２３ａの作用電極本体１６２上への誘引とによって、電子の輸送が容易になることによると考えられる。
【０１０５】
（試験例３）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、マウスＩｇＧを含有する試料〔組成：１μｇマウスＩｇＧ／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬを供し、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。
【０１０６】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（第２結合物質２２ａ）を含有する溶液Ｂ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。つぎに、前記空間に、ストレプトアビジン（第３結合物質２２ｂ）を含有する溶液Ｃ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。つぎに、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した（実験番号９）。また、マウスＩｇＧを含有する試料の代わりに、マウスＩｇＧを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号１０）。
【０１０７】
なお、対照として、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体、ストレプトアビジン、製造例３で得られた溶液Ａ３０μＬの代わりに、前記溶液Ｄ３０μＬを用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号１１）。また、マウスＩｇＧを含有する試料の代わりに、マウスＩｇＧを含有しない試料を用いたことを除き、前記と同様に操作を行なった（実験番号１１）。
【０１０８】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。そして、前記作用電極基板を５分間静置した。その後、電極基板をエタノールで洗浄、乾燥後、前記溶解誘引電解液を製造例４で得られた電解液に置換した。前記電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。これにより、作用電極と対極とを電解液に接触させた。つぎに、作用電極リード及び対極リードを電流計に接続した。
【０１０９】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例３において、実験番号９〜１２の方法での光電流の測定結果を図２１に示す。
【０１１０】
図２１に示された結果から、実験番号９の方法により検出された光電流は、実験番号１１の方法により検出された光電流と比べて、大きいことがわかる。かかる結果から、製造例５で得られた溶解誘引電解液を用いて、溶解性担体を溶解し、修飾標識物質を作用電極本体に誘引させることにより、光電流の検出の際に、製造例５で得られた溶解誘引電解液を製造例４で得られた電解液に置換しても、高感度で修飾標識物質を検出することができることがわかる。また、かかる結果から、製造例４で得られた電解液は、被検物質の検出に際して、電解液として十分な性質を有していることがわかる。
【０１１１】
（試験例４）
製造例５で得られた溶解誘引電解液（実験番号１３）又は製造例４で得られた電解液（実験番号１４）に、２４ヌクレオチド長のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡをその濃度が１ｎＭとなるように溶解し、実験番号１３の試料又は実験番号１４の試料を得た。ここで、製造例５で得られた溶解誘引電解液は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ＤＮＡを作用電極に誘引する作用（誘引作用）を有する。一方、製造例４で得られた電解液は、誘引作用を有していない。
【０１１２】
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極上に、実験番号１３の試料１１．５μＬ又は実験番号１４の試料１１．５μＬを滴下し、５分間放置した。その後、作用電極をエタノールで洗浄した。
【０１１３】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。さらに、前記溶解誘引電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。その後、作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例４において、実験番号１３及び１４の試料を用いたときの光電流の測定結果を図２２に示す。
【０１１４】
図２２に示された結果から、誘引作用を有する溶解誘引電解液を含む実験番号１３の試料を用いた場合の光電流誘引作用を有しない電解液を含む実験番号１４の試料を用いた場合の光電流と比べて、高くなっていることがわかる。したがって、修飾標識物質を作用電極に誘引する工程は、シグナルを向上させるのに有効であることがわかる。
【０１１５】
（製造例６〜８）
金ナノ粒子（溶解性担体２１）に、第１結合物質２２ｃと、修飾標識物質２３ａと、誘引用修飾物質２５（３’末端をチオール化した２４ヌクレオチド長のＤＮＡ）とを、第１結合物質２２ｃ：修飾標識物質２３ａ：誘引用修飾物質２５（モル比）が１：１：８（製造例６）、１：３：６（製造例７）、１：９：０（製造例８）となるように混合し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０／ビオチン（数量比）が１／１の第１修飾結合物質〔図２３（Ａ）中、「２０ｃ２」参照；製造例６〕、３／１の第１修飾結合物質〔図２３（Ｂ）中、「２０ｃ３」参照；製造例７〕又は９／１の第１修飾結合物質〔図２３（Ｃ）中、「２０ｃ４」参照；製造例８〕を得た。得られた第１修飾結合物質２０ｃ２、第１修飾結合物質２０ｃ３又は第１修飾結合物質２０ｃ４を濃度が１ｎＭとなるように０．１体積％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ−２０）含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）に添加し、混合して溶液Ａ２（製造例６）、溶液Ａ３（製造例７）又は溶液Ａ４（製造例８）を得た。
【０１１６】
（試験例５）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、試料１〔組成：１μｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬ又は試料２〔組成：０μｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕を供し、前記作用電極基板を２５℃で６０分間静置した。
【０１１７】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（第２結合物質２２ａ）を含有する溶液Ｂ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。さらに、前記空間に、ストレプトアビジン（第３結合物質２２ｂ）を含有する溶液Ｃ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例６で得られた溶液Ａ２ ３０μＬ、製造例７で得られた溶液Ａ３ ３０μＬ又は製造例８で得られた溶液Ａ４ ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した。
【０１１８】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。さらに、前記溶解誘引電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。そして、前記作用電極基板及び対極基板を５分間静置した。
【０１１９】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例５において、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０／ビオチン（数量比）と、光電流との関係を調べた結果を図２４に示す。図中、黒四角は、試料１を用いた場合の光電流、黒丸は、試料２を用いた場合の光電流を示す。
【０１２０】
図２４に示された結果から、標識物質であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０の数が増加するほど、検出される光電流も増加することがわかる。かかる結果から、本方法により、標識物質量に応じた大きさの光電流を検出することができることがわかる。
【０１２１】
（試験例６）
製造例１で得られた作用電極基板の作用電極本体の周囲に、隔壁となるようにシリコーンゴム（厚さ０．１ｍｍ）を配置した。その後、この作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、試料３〔組成：３ｎｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕３０μＬ、試料４〔組成：３０ｎｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬ（１質量％ウシ血清アルブミン含有トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ））〕又は試料５〔３００ｎｇマウスＩｇＧ（被検物質Ｓ）／ｍＬリン酸緩衝液〕を供し、前記作用電極基板を２５℃で６０分間静置した。
【０１２２】
つぎに、前記作用電極基板の前記空間に、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（第２結合物質２２ａ）を含有する溶液Ｂ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。さらに、前記空間に、ストレプトアビジン（第３結合物質２２ｂ）を含有する溶液Ｃ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、前記空間に、製造例５で得られた溶液Ａ３０μＬを入れ、前記作用電極基板を２５℃で３０分間静置した。その後、作用電極基板を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ-Ｔ）と純水とを用いて洗浄した。
【０１２３】
つぎに、前記作用電極基板の周囲に、厚さ０．２ｍｍの側壁となるようにシリコーンゴムを配置した。そして、前記作用電極基板とシリコーンゴムとに囲まれた空間に、製造例５で得られた溶解誘引電解液１１．５μＬを充填した。さらに、前記溶解誘引電解液が充填された空間を、作用電極基板の上方から、製造例２で得られた対極基板で密封した。そして、前記作用電極基板及び対極基板を５分間静置した。
【０１２４】
作用電極基板側から対極基板に向けて、光源（波長７８１ｎｍ、出力１３ｍＷのレーザー光源）から光を照射し、光電流を測定した。試験例６において、被検物質量と、光電流との関係を調べた結果を図２５に示す。
【０１２５】
図２５に示された結果から、被検物質量が増加するほど、検出される光電流も増加することがわかる。かかる結果から、本方法により、被検物質を定量することができることがわかる。
【符号の説明】
【０１２６】
１０ 捕捉物質
２０ 標識結合物質
２１ 溶解性担体
２２ 結合物質
２３ 修飾標識物質
２４ 標識物質
２５ 誘引用修飾物質
１０１ 検出装置
１１１ チップ受入部
１１２ ディスプレイ
１１３ 光源
１１４ 電流計
１１５ 電源
１１６ Ａ／Ｄ変換部
１１７ 制御部
１２０ 検査チップ
１２０ａ 空間
１３０ 上基板
１３０ａ 基板本体
１３０ｂ 試料注入口
１３１ 上基板
１３１ａ 基板本体
１３１ｂ 試料注入口
１３２ 上基板
１３２ａ 基板本体
１３２ｂ 試料注入口
１３３ 上基板
１３３ａ 基板本体
１３３ｂ 試料注入口
１４０ 作用電極基板（下基板）
１４１ 作用電極基板（下基板）
１４２ 作用電極基板（下基板）
１４３ 作用電極基板（下基板）
１４０ａ 基板本体
１４１ａ 基板本体
１４２ａ 基板本体
１４３ａ 基板本体
１５０ 間隔保持部材
１５１ 間隔保持部材
１５１ａ 部材本体
１６１ 作用電極
１６２ 作用電極本体
１６３ 導電層
１６４ 電子受容層
１６５ 絶縁層
１６６ 対極
１６９ 参照電極
１７１ 電極リード
１７２ 電極リード
１７３ 電極リード
Ｓ 被検物質
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
被検物質を含む試料を、作用電極に接触させて、作用電極上に捕捉する捕捉工程、
前記被検物質が捕捉された作用電極に、被検物質に結合する結合物質と標識物質を含有する修飾標識物質とが結合した溶解性担体を有する標識結合物質を接触させて、前記作用電極上に、前記被検物質と前記標識結合物質とを含む複合体を形成させる形成工程、
前記作用電極上に形成された複合体に含まれる前記溶解性担体を溶解させ、前記修飾標識物質を遊離させる遊離工程、
前記修飾標識物質を作用電極上に誘引する誘引工程、
及び
前記修飾標識物質中の標識物質を電気化学的に検出する検出工程
を含む被検物質の電気化学的検出方法。
【請求項２】
修飾標識物質が、さらに誘引用修飾物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
誘引用修飾物質が、核酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
誘引工程が、前記修飾標識物質を、極性の違いによって作用電極上に誘引する工程である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
カオトロピックイオンを含有する液体によって、前記極性の違いを生じさせる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
カオトロピックイオンが、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、グアニジンイオン、チオシアン酸イオン、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、塩化物イオン、酢酸イオン、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン及びマグネシウムイオンからなる群より選択された少なくとも１つである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遊離工程が、溶解性担体を溶解する溶解液によって前記溶解性担体を溶解させる工程である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
溶解性担体が、溶解液に溶解する金属またはその合金からなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
溶解性担体が、金ナノ粒子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
溶解液が、ヨウ素またはヨウ化物を含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
溶解性担体が、熱により溶融する担体であり、
遊離工程が、当該溶解性担体を加熱することによって前記溶解性担体を溶解させる工程である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
検出工程が、電解液の存在下において、修飾標識物質中の標識物質を電気化学的に検出する工程である、請求項１〜１２いずれかに記載の方法。
【請求項１４】
遊離工程、誘引工程および検出工程が、ヨウ化物イオンとアセトニトリルとを含有する液体中で行なわれる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
形成工程の後に、遊離の標識結合物質を除去する洗浄工程をさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記作用電極が、作用電極本体と、この作用電極本体上に固定化され、前記被検物質を捕捉する捕捉物質とからなる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
被検物質を電気化学的に検出する方法であって、
被検物質を含む試料を、作用電極に接触させて、作用電極上に捕捉する捕捉工程、
前記被検物質が捕捉された作用電極に、被検物質に結合する結合物質と標識物質を含有する修飾標識物質とが結合した溶解性担体を有する標識結合物質を接触させて、前記作用電極上に、前記被検物質と前記標識結合物質とを含む複合体を形成させる形成工程、
前記作用電極上に形成された複合体に含まれる前記溶解性担体を溶解させ、前記修飾標識物質を遊離させる遊離工程、
前記修飾標識物質を作用電極上に誘引する誘引工程、
及び
前記修飾標識物質中の標識物質を電気化学的に検出する検出工程
を含む被検物質の電気化学的検出方法。
【請求項２】
修飾標識物質が、さらに誘引用修飾物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
誘引用修飾物質が、核酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
誘引工程が、前記修飾標識物質を、極性の違いによって作用電極上に誘引する工程である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
カオトロピックイオンを含有する液体によって、前記極性の違いを生じさせる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
カオトロピックイオンが、ヨウ化物イオン、臭化物イオン、グアニジンイオン、チオシアン酸イオン、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、塩化物イオン、酢酸イオン、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン及びマグネシウムイオンからなる群より選択された少なくとも１つである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遊離工程が、溶解性担体を溶解する溶解液によって前記溶解性担体を溶解させる工程である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
溶解性担体が、溶解液に溶解する金属またはその合金からなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
溶解性担体が、金ナノ粒子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
溶解液が、ヨウ素またはヨウ化物を含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
溶解性担体が、熱により溶融する担体であり、
遊離工程が、当該溶解性担体を加熱することによって前記溶解性担体を溶解させる工程である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
検出工程が、電解液の存在下において、修飾標識物質中の標識物質を電気化学的に検出する工程である、請求項１〜１２いずれかに記載の方法。
【請求項１４】
遊離工程、誘引工程および検出工程が、ヨウ化物イオンとアセトニトリルとを含有する液体中で行なわれる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
形成工程の後に、遊離の標識結合物質を除去する洗浄工程をさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記作用電極が、作用電極本体と、この作用電極本体上に固定化され、前記被検物質を捕捉する捕捉物質とからなる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公開番号】特開２０１２−１１７８８８（Ｐ２０１２−１１７８８８Ａ）
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６６８１９（Ｐ２０１０−２６６８１９）
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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