製造方法
本発明は、所望のオープンリーディングフレームのコドンを改変することにより、タンパク質発現細胞株を作製するのに必要な力価測定可能な選択圧のレベル、増幅サイクル数、およびそれにかかる時間を減らす方法を提供する。この目的のためのコドン最適化の使用を通じて、本発明の方法は、細胞株開発研究で長期間を節約して、より早い時間枠で十分な収量を確実にもたらす。さらに、本発明の方法は、以前に達成可能なよりも低い濃度の選択・増幅薬剤で細胞株を作製する。したがって、最終的な細胞株でより低いレベルの選択・増幅マーカーが観察される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用タンパク質を分泌することが可能な細胞株の作製方法を提供する。該方法は、コドン最適化遺伝子配列の使用を含み、これはプロトコールタイムラインの減少と、例えば選択・増幅系を介した抗体産生細胞株の作製の際に必要とされる抗葉酸剤の濃度の低下の両方をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＮＳ０細胞およびＰｅｒＣ６細胞などの哺乳動物細胞は、生物製剤を製造するために生物製剤産業で通常用いられている。これらの細胞は、遺伝子操作され、続いて、得られた細胞株をバイオリアクターで培養したときに所望のタンパク質が高力価で発現されることを確実にするように選択される。
【０００３】
現在では、この目的で細胞を遺伝子操作し、続いて最良の細胞を選択するための多数の方法がある。これらの方法は多くの場合、組み込まれた発現ベクターのコピー数を増やして所望のタンパク質について得られる収量を改善するために、「増幅」ステップを含む。この「増幅」方法は、以前にＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌにより詳細に報告されている（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩＩ（ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，１９８７））。著者らは、多数の選択マーカー（多くの場合、宿主細胞の代謝に関与し、一定の培地条件においてその生存に必須の酵素をコードする核酸配列の形態で）を、所望のタンパク質を発現させるために設計された発現ベクターに機能的に連結して、それにより選択マーカーについての選択の際に、所望のタンパク質の発現についても選択することができる、と説明している。しかしながら、そのような選択後には、典型的には所望のタンパク質の力価は十分に高くないため、選択された細胞は「増幅」法にも供される。これらの方法は、通常、選択マーカーを阻害するある種の毒性薬物に細胞を供するステップを含む。そのような阻害を通して、このマーカーの発現レベルが増加している細胞集団が選択される可能性がある。このことは、多くの場合、同様に機能的に連結された発現カセットの発現レベルの増加につながる。そのような増加した発現または「増幅」は、通常、選択マーカーおよび機能的に連結された発現カセットのコピー数の増加をもたらすゲノム再構成により生じる。そのような「共増幅」を介して、力価は十分に改善され、得られる最良クローンを用いて好適な高いレベルの所望のタンパク質が産生される。増幅法に供された個々の細胞中のベクターコピー数をさらに調べて、タンパク質産生の「プラトー」に近づくまで、得られる産生レベルは典型的には遺伝子コピー数の増加に比例することが観察されている（ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、上掲）。
【０００４】
現在までに、増幅に適しており、したがって増幅可能選択マーカーと称される多くの異なる選択マーカーが明らかにされている。明らかになっているもののそれぞれはまた、選択・増幅法に際して細胞培養培地に添加される「選択・増幅」薬剤を伴っている。そのような選択マーカー／薬剤の組み合わせの例としては、以下のものが挙げられる：アデノシンデアミナーゼ／デオキシコホルマイシン、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ／Ｎ（ホスホアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸、ジヒドロ葉酸レダクターゼ／メトトレキサート、グルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシミン、メタロチオネイン−Ｉ／重金属、多剤耐性／アドリアマイシン（ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、上掲；Ｋｅｌｌｅｍｓ １９９１，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：ｐｐ７２３−７２９を参照されたい）。さらに、より最近になって、ネオマイシン／Ｇ４１８およびゼオシンに対する耐性を付与するものなどの抗生物質選択マーカーが、コピー数を増やすためにも用いることができる場合があり、適切な対応する選択・増幅（抗生物質系の）選択薬剤と組み合わせた場合、時には選択・増幅マーカーとしても用いられていたことが報告されている（例えば、Ｓａｕｔｔｌｅ ａｎｄ Ｅｎｅｎｋｅｌ：Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ２００４ ８９ ｐｐ５３０−５３８，Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００３；２１；ｐｐ５５３−５５８）。
【０００５】
この目的のために最良の遺伝子操作された細胞を選択する多数の方法がある中で、２種類の最もよく用いられている選択圧はグルタミン合成酵素（ＧＳ）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に基づく選択法である。
【０００６】
ＧＳ法は、グルタミン合成酵素発現カセットを１つまたは複数の治療用タンパク質発現カセットに機能的に連結するステップを含む。得られる機能的に連結されたベクターを細胞に送達して、ベクターの染色体組み込みについて、細胞を培養する培地からグルタミンを枯渇させるかまたは除去することにより選択する。メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）などのグルタミン合成酵素阻害剤の添加も、多くの場合培地に追加され、これにより内因性宿主細胞レベルが高いグルタミン合成酵素活性が選択されるのを確実にする。もう一方のＤＨＦＲ選択法は、ＤＨＦＲ選択圧を１つまたは複数の治療用タンパク質発現カセットに機能的に連結するステップを含む。機能的に連結されたベクターを細胞に送達して、ベクターの染色体組み込みについて、ヌクレオシド（例えば、ヒポキサンチンおよびチミジン）の除去または枯渇により選択する。ＤＨＦＲ法については典型的に、ＣＨＯ ＤＧ４４またはＣＨＯ ＤＵＸ−Ｂ１などのＤＨＦＲ陰性宿主細胞系統が通常用いられる。メトトレキサート（ＭＴＸ）などの選択・増幅薬剤を用いるのも通常行なわれることである。
【０００７】
漸増する量のＭＳＸまたはＭＴＸ選択・増幅薬剤の対応するＧＳおよびＤＨＦＲ選択系への添加または段階的力価測定が、多くの場合、遺伝子コピー数を増加させることにより発現を増大させるために行われる。このような方法は、細胞培養への選択・増幅薬剤の直接的な添加を含むことができる。あるいはまた、薬剤を、そのような細胞培養に用いる前に増殖培地に添加することもできる。細胞培養、または続いて細胞培養に用いられる培地へのそのような薬剤の直接的な添加または力価測定は、典型的には、「増幅」ステップと称される。例えば、ＧＳ系では、ＭＳＸレベルは５００μＭまで、およびこれを超えて添加するかまたは増加させることができるが、ＤＨＦＲ系では、ＭＴＸ抗葉酸剤レベルは１μＭ濃度レベルまで、およびこれを超えて添加するかまたは増加させることができる。そのような薬剤をこのように用いて、続いて新たな選択薬剤濃度（各濃度ステップは、増幅「ラウンド」と称される）で成育する細胞の選択を可能にする培養期間を設けることにより、選択圧を保持するゲノム領域がそれにより増幅され、選択マーカーのコピー数を増加させることもできることが明らかになっている。結果として、選択マーカーを治療用タンパク質発現カセットに機能的に連結している場合、これらのカセットもまた増幅される。ＧＳ選択系およびＤＨＦＲ選択系を用いる場合、適切な選択・増幅薬剤を用いることにより、所望のタンパク質の収量を、「産生プラトー」に達するまで著明に改善することができる（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ（上掲）を参照されたい）。その結果、そのような選択および増幅を経過して成育するクローンを、続いて力価／収量についてスクリーニングして、最良のクローンが選択され、次いでさらに評価される。そのような力価測定およびスクリーニングから、１種または複数種の所望のタンパク質の引き続く産生のために１クローンを同定し、続いてそれだけを用いるのが通常である。
【０００８】
典型的には、増幅「ラウンド」数および用いる選択・増幅薬剤濃度の両方が、選択・増幅プロトコールにおいて設定も固定もされていない。その代わり、通常は、選択・増幅法のために、産生閾値またはプラトーに達する点まで、徐々に厳しい条件にしていく。特に、抗体を発現させる場合、このプラトーに達しているクローンは、現行の改良された無血清バッチ培養モデルおよび産生バイオリアクターでは、０．３〜１．５ｇ／Ｌの最終力価を産生することが観察されている。このことは、典型的には、そのような無血清バッチ培養条件において、細胞生産性（Ｑｐ）が１０〜１００ｐｇ／細胞／日であることを意味する。しかしながら、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／日での）は重要ではあるが、最高のＱｐを有するクローンが常に最高の体積測定力価を示すわけではないので、これは生産性の独占的な決定要素ではない。近年の総説としては、Ｗｕｒｍ ２００４；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ２２；ｐｐ１３９３−１３９８を参照されたい。
【０００９】
治験で用いる所望のタンパク質を製造するための製造キャンペーンにおいて用いる細胞株を作製するために、選択・増幅法はうまく用いられている。しかしながら、選択・増幅法により得られる力価は十分ではあるが、そのような方法は、時間、コストおよび安全性をはじめとする多くの理由により依然として望ましくない。例えば、細胞株「増幅」プロトコールでの増幅・選択薬剤の力価測定はクローン選択およびコロニー増殖を遅らせ、増幅の各ラウンドは完了までに１ヵ月以上かかる。第２に、メトトレキサートおよびメチオニンスルホキシミンのような選択・増幅薬剤は毒性化合物であり、治療的に用いる予定であれば除去しなければならない。第３に、選択・増幅薬剤耐性は哺乳動物細胞でも起こり得るものであり、これは厳格でない選択圧をもたらし、またクローン性および生成物収量の不安定性につながる可能性がある。第４に、増幅は時にはエピソームで起こり得る。そのようなエピソームおよび任意の機能的に連結された機能的発現カセットは、細胞分裂の間に常に均等に受け継がれるものではなく、培養物中の多様性および不安定性を増加させる。第５に、増幅プロトコールの間に生じるゲノム再構成が、宿主細胞ゲノムに無視できない変化を引き起こす可能性があり、これは得られたクローンでの多様な表現型につながる。第６に、選択・増幅薬剤副生成物（例えば、ポリグルタミン酸メトトレキサート）が細胞の別の機能を阻害する場合がある（例えば、Ａｌｌｅｇｒａ ｅｔ ａｌ １９８５ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ ２６０；１７ ｐｐ９７２０−９７２６）。第７に、これらの選択・増幅薬剤の多くが、高レベルで曝露すれば細胞培養およびバイオリアクターの操作に従事している操作者にとっても潜在的に毒性である。第８に、哺乳動物宿主細胞中の組み込まれた発現ベクターのコピー数を増加させることにより、宿主細胞による反復配列誘発遺伝子サイレンシング（ＲＩＧＳ）活性がもたらされる場合があり、これにより、最終的に、組み込まれた各発現ベクターからの発現レベルの低下に至る可能性がある（例えば、ＭｃＢｕｒｎｅｙ ＭＷ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００２ ２７４：１−８）。
【００１０】
結果として、少ない増幅ラウンド数で、低いレベルの選択・増幅薬剤を用いて、なお治療用タンパク質の同じ最終収量を達成する選択・増幅法を用いることが非常に望ましいであろう。これにより、最終的な細胞株を作製するのにかかる時間は早くなり、かつ／または最終的な細胞株を作製するのに必要とされる望ましくない毒性薬剤のレベルを、細胞株作製、選択および培養において低下させるか、もしくは完全に除くことができる（Ｍ．Ｃｅｌｉｎａ ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６ ３４：１７９−１９０）。
【００１１】
６４種類の３塩基対コドン組み合わせが２０種類のアミノ酸しかコードしていないことから、遺伝的コードには重複があることが何十年間も知られている。しかしながら、発現を増加させるためのコドンバイアスの使用は１９８０年代まで分かっていなかった。例えば、１９８２年に、ＢｅｎｎｅｔｚｅｎおよびＨａｌｌ（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７ ｐｐ３０２６−３０３１）が、原核生物および真核生物の両方で強力に発現される遺伝子において生物種特異的なコドンバイアスを観察した。著者らは、このバイアスが生物分類学上多岐にわたっていることも記載した。その結果、組み換え発現系での発現を増大させるために、オープンリーディングフレームのコドン使用頻度を改変することができることがまもなく理解された。例えば、ＫｏｔｕｌａおよびＣｕｒｔｉｓ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ ＮＹ（１９９１）９：１３８６−９）は、高度に発現される内在性の酵母遺伝子により好まれるコドンにコドン使用頻度を偏重させるような、オープンリーディングフレームのコドン最適化により、酵母での哺乳動物抗体軽鎖の発現を顕著に改善させた。別の非常に注目すべき例は、哺乳動物細胞での発現を改善するための緑色蛍光タンパク質のコドン最適化である（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９６）７０：４６４６−５４；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９６ ２４：４５９２−３）。
【００１２】
最近のデータは、抗体重鎖および軽鎖をコードするオープンリーディングフレームのコドン最適化指数（ＣＡＩ）スコアを上昇させることにより、得られた最適化された発現カセットをグルタミン合成酵素選択マーカーと機能的に連結した場合で、細胞をＭＳＸ選択・増幅薬剤とインキュベートした場合に、哺乳動物宿主細胞での産生収量をかろうじて改善することができることを示唆している。このデータ（ＩＢＣ ２００５ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで発表された）は、平均発現レベルは有意には改善されていないが、群中の中央値陽性クローンは若干増加した（３７．８μｇ／ｍＬから５１．３μｇ／ｍＬ）ことを示唆したが、これは重鎖および軽鎖の両方のオープンリーディングフレームをコドン最適化した場合のみであった。より最近では、Ｍ．Ｃｅｌｉｎａ ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓら（上掲）も、選択・増幅法を用いて所望のタンパク質を発現する遺伝子操作された細胞株を作製する際に、選択・増幅薬剤のレベルを低下させる必要性を認識していた。著者らは、トランスフェクトされた細胞の播種密度を変化させることにより、用いるＭＳＸレベルを低下させ、同等かより高いレベルの所望のタンパク質を発現する遺伝子操作された細胞株を作製し維持するのに必要とされる期間（週数）を短縮することができることを実証した。
【００１３】
最近発表された研究は、グルタミン合成酵素選択マーカーの使用と組み合わせたコドン最適化のアプローチを研究している。例えば、Ｋａｗｌｅｙらにより発表された研究（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６ Ｖｏｌ ３４；ｐｐ１５１−１５６）は、結果として得られる発現レベルに対するコドン最適化の影響を評価しているが、報告されている結果は達成された発現レベルでのほんのわずかな改善しか示唆していない。
【００１４】
さらに最近、Ｃａｒｔｏｎら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ５５（２００７）ｐｐ２７９−２８６）も、コドン最適化の影響を研究した。この研究は、種々のアプローチによる、重鎖および軽鎖抗体オープンリーディングフレームの部分コドン最適化を含んでいた。これらの改変されたコード配列を、続いてｇｐｔ選択マーカーに機能的に連結した発現カセット中でミニジーン形式（すなわち、イントロンを含む）として骨髄腫細胞で発現させた。いかなる増幅アプローチについても議論されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ：ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩＩ，ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，１９８７
【非特許文献２】Ｋｅｌｌｅｍｓ １９９１：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：ｐｐ７２３−７２９
【非特許文献３】Ｓａｕｔｔｌｅ ａｎｄ Ｅｎｅｎｋｅｌ：Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ２００４ ８９ ｐｐ５３０−５３８
【非特許文献４】Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００３； ２１；ｐｐ５５３−５５８
【非特許文献５】Ｗｕｒｍ ２００４：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ２２；ｐｐ１３９３−１３９８
【非特許文献６】Ａｌｌｅｇｒａ ｅｔ ａｌ １９８５ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ ２６０；１７ ｐｐ９７２０−９７２６
【非特許文献７】ＭｃＢｕｒｎｅｙ ＭＷ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００２ ２７４：１−８
【非特許文献８】Ｍ． Ｃｅｌｉｎａ ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６ ３４：１７９−１９０
【非特許文献９】Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７（１９８２）ｐｐ３０２６−３０３１
【非特許文献１０】Ｋｏｔｕｌａ ａｎｄ Ｃｕｒｔｉｓ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ ＮＹ （１９９１）９：１３８６−９
【非特許文献１１】Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ Ｊ Ｖｉｒｏｌ （１９９６）７０：４６４６−５４
【非特許文献１２】Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９６ ２４：４５９２−３
【非特許文献１３】Ｋａｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６ Ｖｏｌ ３４；ｐｐ１５１−１５６
【非特許文献１４】Ｃａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ５５（２００７）ｐｐ２７９−２８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
当該技術分野には、増幅可能選択マーカーと機能的に連結された発現系を用いる場合に必要とされる選択・増幅薬剤のレベルを低下させる必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、所望のオープンリーディングフレームのコドンを変更することにより、タンパク質発現細胞株を作製するために必要とされる力価測定可能選択圧、増幅サイクル数、およびそれにかかる時間を低減させる方法を提供する。この目的でコドン最適化を用いることにより、本発明の方法は、一貫して、より早い時間枠で十分な収量をもたらし、これにより細胞株開発研究で何週も節約することになる。さらに、本発明の方法では、以前に達成可能であった濃度よりも低いレベルの濃度の選択・増幅薬剤を用いて細胞株を作製する。したがって、最終的な細胞株でのより低い選択・増幅マーカーが観察される。
【００１８】
本発明は、治療用タンパク質を産生する細胞株を作製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
（ｂ）第１のポリヌクレオチド配列を改変して第２のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が第１のポリヌクレオチド配列のものよりも大きく、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとは同じ治療用タンパク質をコードしているステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の第２のポリヌクレオチド配列および細胞内で第２のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列で少なくとも１つの細胞を形質転換するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の第３のポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーの不十分なレベルを発現する細胞株で細胞の増殖を阻害する選択薬剤の濃度を含有する培地中でステップ（ｃ）の該少なくとも１つの細胞を増殖させ、複数の細胞を含む細胞株を作製し、それにより、第１のポリヌクレオチドで形質転換された細胞株で産生される該タンパク質の同等な産生プラトーに達するのに必要とされるであろうよりも、少ない増幅ラウンドで、かつ／または低い選択薬剤濃度で第２のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達するステップ
を含む。
【００１９】
本明細書中に記載されるすべての同様の方法において、別途記載されない限り、増幅プロトコールまたは選択薬剤の濃度などのすべての他のパラメータは一定に保たれる。
【００２０】
本発明の一実施形態では、第１の細胞株をバイオリアクター中で培養し、産生される治療用タンパク質を精製する。
【００２１】
本発明の一実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数は０．９よりも大きく、別の実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数は０．９１よりも大きく、また別の実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数は０．９２よりも大きく、また別の実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数は０．９５よりも大きい。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、計算上等価な治療用タンパク質産生収量に達するのに必要な選択薬剤のレベルは、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法について用いられる選択薬剤の量と比較して、５０％未満まで低下する。別の実施形態では、選択薬剤のレベルは、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法について用いられる選択薬剤の量と比較して、２５％未満まで低下し、また別の実施形態では、選択薬剤のレベルは、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法について用いられる選択薬剤の量と比較して、５％未満まで低下し、また別の実施形態では、選択薬剤のレベルは、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法について用いられる選択薬剤の量と比較して、３％未満まで低下する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、治療用タンパク質を産生する細胞株を作製する方法が提供され、該方法は、以下のステップ：
（ａ）治療用タンパク質をコードし、かつ０．９未満のコドン最適化指数を有する第１のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
（ｂ）治療用タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、該ポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が０．９よりも大きいステップ、
（ｃ）治療用タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列、および第２のポリヌクレオチドの増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列で細胞株を形質転換するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の第３のポリヌクレオチド配列によりコードされる選択マーカーの不十分なレベルを発現する細胞株で細胞の増殖を阻害する選択薬剤の濃度を含有する培地中でステップ（ｃ）の該少なくとも１つの細胞を増殖させて、複数の細胞を含む第１の細胞株を作製し、それにより、第１のポリヌクレオチドで形質転換した細胞株で産生される該タンパク質の同等な産生プラトーに達するのに必要とされるよりも少ない増幅ラウンドで、かつ／または低い選択薬剤濃度で第２のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達するステップ
を含む。
【００２４】
本発明の一実施形態では、形質転換される細胞株は内在性細胞性酵素の破壊または阻害により、代謝的に欠陥がある。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、形質転換される細胞株はヌクレオシド合成経路に欠陥がある。
【００２６】
本発明の一実施形態では、治療用タンパク質は抗体、その誘導体または抗原結合性断片である。
【００２７】
本発明の一実施形態では、治療用タンパク質はモノクローナル抗体である。
【００２８】
本発明の一実施形態では、選択マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするポリヌクレオチドであり、選択薬剤は抗葉酸剤である。別の実施形態では、抗葉酸剤はメトトレキサートである。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、選択マーカーはグルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドであり、選択薬剤はメチオニンスルホキシミンである。
【００３０】
本発明の一実施形態では、タンパク質産生のプラトーに達するのに１回の増幅ラウンドしか必要とされない。
【００３１】
本発明の一実施形態では、治療用タンパク質の最終的な収量は、無血清バッチで０．３ｇ／Ｌよりも多い。本発明の別の実施形態では、最終的な収量は、無血清バッチで０．５ｇ／Ｌよりも多い。本発明のまた別の実施形態では、最終的な収量は、無血清バッチで０．８ｇ／Ｌよりも多い。
【００３２】
本発明の一実施形態では、用いるＭＴＸの濃度は５０ｎＭ未満または２５ｎＭ未満または１０ｎＭ未満である。本発明の別の実施形態では、用いるＭＴＸの濃度は５ｎＭである。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、１回のみの増幅ステップが行なわれるので、培養培地中で選択される細胞でタンパク質産生のプラトーに達するのに細胞培養培地中で選択・増幅薬剤の１種類の濃度のみが必要とされる。
【００３４】
本発明の一実施形態では、本発明の方法により産生される抗体が提供される。別の実施形態では、この方法により産生される抗体が提供され、産生される該抗体は少なくとも１つの重鎖を含み、５％以下の非グリコシル化重鎖を有する。別の実施形態では、抗体の重鎖は９５％グリコシル化されているか、９６％グリコシル化されているか、９７％グリコシル化されているか、９８％グリコシル化されているか、または９９％グリコシル化されている。また別の実施形態では、抗体は１００％グリコシル化されている。本発明の一実施形態では、高度にグリコシル化された抗体はモノクローナル抗体である。本発明の一実施形態では、高度にグリコシル化された抗体は抗β−アミロイド抗体である。また別の実施形態では、抗体は配列番号１８の重鎖配列および配列番号１９の軽鎖配列を有する。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、本明細書中に記載される本発明の抗原結合性断片が提供され、該断片はＦａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、ミニボディ、単離された可変重鎖領域もしくは単離された可変軽鎖領域、血清由来タンパク質（例えば、増殖因子、サイトカイン、アルブミン等）またはそれらのコンビナトリアル融合体である。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、本明細書中に記載される抗体またはその抗原結合性断片の重鎖および／または軽鎖をコードする１以上の発現カセットを含むベクターを含む、安定的に形質転換された宿主細胞が提供される。例えば、そのような宿主細胞は軽鎖をコードする第１のベクターおよび重鎖をコードする第２のベクターを含むことができる。あるいはまた、そのような発現カセットは送達の前に組み合わせることができる。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、本発明による宿主細胞が提供され、該細胞は真核生物細胞であり、例えば該細胞は哺乳動物細胞である。そのような細胞株の例としては、以下のものが挙げられる：チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＮＳ０細胞またはＰｅｒＣ６細胞（最近の総説として、Ｗｕｒｍ ２００４：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２；１１ ｐｐ１３９３−１３９８を参照されたい）。そのような宿主細胞は、有利な遺伝型および／または表現型改変を含んでもよく、例えば、ＣＨＯ−ＤＧ４４宿主系統は不活性化されたｄｈｆｒ遺伝子のコピーを有し、他の宿主は不活性化されたグルタミン合成酵素遺伝子を有する場合がある。別の改変は、タンパク質グリコシル化に関与する酵素機構に対するものであり得る（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ２００４ ８７：ｐｐ ６１４−６２２；Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７ １３０：ｐｐ３００−３１０；Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７ ７：８４）。また別の宿主は、宿主アポトーシス、発現および生存経路に対する有利な遺伝型および／または表現型改変を有し得る（例えば、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２０００ ６８：３１−４３；Ｙａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ２００５ Ｃｈａｐｔｅｒ ３ ｐｐ７７９−８０７；Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００７ ９８：８２５−４１；Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００７ ９７：８７−９２）。宿主のこれらおよび他の改変は、単独でもしくは組み合わせて、非宿主遺伝子もしくは宿主遺伝子の過剰発現、遺伝子ノックアウトアプローチ、遺伝子サイレンシングアプローチ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、または所望の表現型を有する下位系統の進化および選択などの標準的な技術によりもたらすことができる。そのような技術は、当該技術分野で十分に確立されている。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、本明細書中に記載される本発明に係る治療用タンパク質の製造方法が提供され、該方法は、培養培地中で、例えば無血清培養培地中で、宿主細胞を培養するステップを含む。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、前記抗体含有無血清培養培地に対して、少なくとも９５％以上（例えば、９８％以上）まで、前記治療用タンパク質をさらに精製する、本明細書中に記載される本発明に係る方法が提供される。
【００４０】
本発明の一実施形態では、０．９より高いＣＡＩスコアを有し、抗体、抗体関連ポリペプチド、またはその誘導体もしくは融合体をコードするオープンリーディングフレームを含む哺乳動物発現ベクターが提供される。
【００４１】
別の実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列が同じ治療用タンパク質をコードし、第１のポリヌクレオチド配列よりも大きなコドン最適化指数を有する第２のポリヌクレオチド配列で形質転換されており、第１のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む第１の細胞株が提供され、該第１の細胞株は、選択培地中で増殖させた場合に、該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドで形質転換した第２の細胞株と比較して、該治療用タンパク質のより高い収量を産生する。
【００４２】
さらなる実施形態では、治療用タンパク質をコードし、０．９より大きなコドン最適化指数を有する第２のポリヌクレオチド配列で形質転換され、第２のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む第２の細胞株が提供され、該第２の細胞株は、選択培地中で増殖させた場合に、該治療用タンパク質をコードし、０．９未満のコドン最適化指数を有する第１のポリヌクレオチドで形質転換した第１の細胞株と比較して、該治療用タンパク質のより高い収量を産生する。
【００４３】
本発明の一実施形態では、０．９より高いＣＡＩスコアは、表６に記載されているＥＭＢＯＳＳ ＣＡＩスコア算出法を用いて算出される。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、本明細書中の上述の実施形態に係るベクターまたは発現カセットを含む細胞株が提供される。
【００４５】
また別の実施形態では、本発明の方法により取得可能な細胞株またはその子孫が提供される。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、抗体、抗体関連ポリペプチドまたはその誘導体をコードする、０．９より高いＣＡＩスコア（ＥＭＢＯＳＳコドン使用頻度表Ｅ．ｈｕｍａｎ．ｃｕｔを用いてもたらされる）を有するオープンリーディングフレームが組み込まれたゲノム、またはエピソームとして維持されるそのようなオープンリーディングフレームを有する哺乳動物細胞が提供される。
【００４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、用語「含んでいる」および「含む」は「からなっている」および「からなる」を取り込んでいる。すなわち、「含んでいる」および「含む」は、文脈が許容する場合、具体的には明記されていない他の要素または整数を包含する可能性を有する。
【００４８】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、用語「産生プラトー」は、追加の増幅ラウンドが典型的には増幅される親クローンに対して２倍未満の増加をもたらす、改良された無血清バッチ培養において達成される発現レベルを意味する。クローンが抗体を特異的に産生するように遺伝子操作されている場合、標準的な改良無血清産生培養において０．３ｇ〜１．５ｇ／Ｌを産生するクローンは、典型的には、現行の無血清改良培養法および培地組成を用いる場合、この産生プラトーに達しているものと考えることができる。
【００４９】
産生プラトーに達している最終的なクローンの単一細胞サブクローニングは、フローソーティング（例えば、９６ウェルプレート中で１ウェルあたり１細胞を投入する）、軟寒天コロニーピッキング、または限界希釈クローニングをはじめとする、多くの標準的な方法により行うことができる。受け入れウェルでの単一細胞増殖を確実にするために、投入された単一細胞の増殖を補助するために、馴化培地または一時的フィーダー培養を用いるべきである場合もある。生存フィーダー共培養物が必要な場合、それらは組み込まれた選択ベクターを含まない親宿主細胞を容易に含むことができ、それにより宿主細胞は投入された単一細胞クローンが健康に分裂し始めたときに、続いて選別することができる。
【００５０】
本明細書を通して用いられるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）との用語は、１つまたは複数の所望のポリペプチド鎖をコードする核酸コード配列を意味する。そのようなＯＲＦコード配列内に含まれるコドンは、連続的であることができ、あるいはまた、それらがイントロンを含むこともできる。ＯＲＦに含まれる場合、イントロンまたは介在配列は、通常は宿主細胞中でのスプライシング反応により除去され、続いて成熟ｍＲＮＡでの最終的な連続的オープンリーディングフレームが形成される。
【００５１】
本明細書を通して用いられる「収量」は、溶液（例えば、培養ブロスまたは細胞溶解混合物もしくはバッファー）中の生成物（例えば、異種性に発現されたポリペプチド）の濃度を意味し、これは通常、ｍｇ／Ｌまたはｇ／Ｌで表現される。収量の増加は２種類の決められた条件で生成された生成物の濃度での絶対的なまたは相対的な増加を意味する場合がある。
【００５２】
機能的に連結されたとの用語は、所望のタンパク質産物を発現する発現カセットを有する宿主細胞を選択するために用いる選択・増幅マーカーの使用を意味する。これは、選択・増幅マーカーを、所望のタンパク質を発現する発現カセットを担持するのと同じプラスミドまたはベクターにクローニングすることにより達成することができ、あるいはまた、別個のプラスミドまたはベクター上で細胞に送達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実験計画２、３、４、５、６（ａ）、６（ｂ）および７（ａ）で用いたＲＳＶプロモーターに基づくベクターの模式図である。ＥＦ−１αプロモーターに基づく評価（実験計画６および７）については、ＲＳＶプロモーターをヒトＥＦ−１α由来プロモーターおよび第１イントロンで置き換えた（Ｋｉｍ，ＤＷ．，Ｇｅｎｅ，１９９０，９１：２１７−２３を参照されたい）。これはヒトゲノムＤＮＡからのＰＣＲにより得られた。このＥＦ−１αプロモーターを続いてＲＳＶに基づくプロモーターの代わりにベクター中にクローニングした。
【図２】ＣＡＩスコア：０．８０９を有する実験計画５の非最適化重鎖を示す。実験計画５（ａ）で用い、配列番号１０である。
【図３】ＣＡＩスコア：０．７６１を有する実験計画５の非最適化軽鎖を示す。実験計画５（ａ）で用い、配列番号１１である。
【図４】上昇したＣＡＩスコア（０．８４７）を有する実験計画５（ｂ）の重鎖ＯＲＦを示す。表５を参照されたい。配列番号１２を参照されたい。
【図５】上昇したＣＡＩスコア（０．８３３）を有する実験計画５（ｂ）の軽鎖ＯＲＦを示す。表５を参照されたい。配列番号１３を参照されたい。
【図６】上昇したＣＡＩスコア（０．８７２）を有する実験計画５の重鎖ＯＲＦを示す。この配列は抗体実験計画５（ｃ）で用いた。配列番号１４を参照されたい。
【図７】上昇したＣＡＩスコア（０．８９４）を有する実験計画５の軽鎖ＯＲＦを示す。この配列は抗体実験計画５（ｃ）で用いた。配列番号１５を参照されたい。
【図８】上昇したＣＡＩスコア（０．９８２）を有する実験計画５の重鎖ＯＲＦを示す。この配列は抗体実験計画５（ｄ）で用いた。配列番号１６を参照されたい。
【図９】上昇したＣＡＩスコア（０．９７６）を有する実験計画５の軽鎖ＯＲＦを示す。この配列は抗体実験計画５（ｄ）で用いた。配列番号１７を参照されたい。
【図１０】抗体実験計画５のための重鎖および軽鎖ＲＮＡならびにタンパク質レベルを示す。
【図１１】コドン最適化法の詳細を示す。
【図１２Ａ】実験計画５最終クローン選択で得られた実施例の生成物ＮＧＨＣのデータを示す。
【図１２Ｂ】実験計画５最終クローン選択で得られた実施例の生成物ＮＧＨＣのデータを示す。
【図１３】最終的な細胞株増幅および選択の後に約３ヵ月のさらなる開発を行なったＯ９７−７（実験計画５（ｄ）、５ｎＭ ＭＴＸ選択クローン、ＣＡＩ ＨＣ：０．９８２、ＬＣ：０．９７６）から生成された実施例の力価を示す。
【図１４】種々の実験計画で遺伝子操作された細胞にて観察されたＤＨＦＲ遺伝子コピーおよびタンパク質ならびにＮｅｏ遺伝子コピーの相対レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明により生成される治療用ポリペプチドをコードする遺伝子のコドン使用頻度を測定し、コドン最適化指数（ＣＡＩ）により定義する。
【００５５】
コドン最適化とは、得られるオープンリーディングフレームの発現を妨げる望ましくない二次的な配列機能を導入することを回避しながら、オープンリーディングフレームのコドンを、ヒト／哺乳動物遺伝子で好まれる同義のコドンに最適化することである。本発明者らは、好まれるヒトコドンは、非ヒト哺乳動物細胞（例えば、ハムスター由来細胞）での引き続く発現が計画される場合でさえも、非常に好適である。しかしながら、いずれかの所与のアミノ酸に対する最も好まれるコドンが、ある哺乳動物種で異なっていたとしても、これがヒトで優勢なものに代わり用いられることもある。各オープンリーディングフレームについて生成された「ＣＡＩスコア」は、オープンリーディングフレームがヒト／哺乳動物遺伝子により最も好まれる同義のコドンの使用に最適化されている程度を表す。本発明の文脈では、１のＣＡＩスコアは、各コドン位置において各アミノ酸について最も適したコドンが用いられていることを意味する。本発明の方法での最適な結果のためには、治療用タンパク質をコードする遺伝子は十分に１に近いＣＡＩを有し、それにより、顕著に少ない選択・増幅薬剤を用いて、かつ／または天然に存在する出発配列を発現させたときに観察されるのと比較してより速い時間で、治療用タンパク質の所望の発現レベルが達成され、例えば、ＣＡＩは少なくとも０．９、または少なくとも０．９５、または少なくとも０．９７５である。
【００５６】
しかしながら、すべてのコドンを最も好まれるコドンに置き換えるか、またはすべての最も好まれないコドンをより好まれるコドンで置き換える必要はない。唯一の条件は、得られる配列が天然には生じない高いＣＡＩスコアを有し、発現妨害エレメントを有しないことである。Ｌｅｔｏ１．０（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ドイツ）などの市販のソフトウェアは、好適な高いＣＡＩスコアの配列を設計することができる。本発明での使用のためのコドン最適化された配列の設計における案内をさらに補助するために、ＮＣＢＩゲノムビルド番号３６に由来する２４０４４ ＲｅｆＳＥＱデータベースヒト発現産物が解析されている（ＮＭ＿規定された登録番号）。ＣＡＩスコア範囲が算出され、０．５９３〜０．８９４（平均スコア０．７２０）であった。このデータベース中の既知の発現遺伝子（理論上のものではなく）についての最も高いスコア（０．８９４）は、ケラチン結合タンパク質５−８（ＫＲＴＡＰ５−８；ＮＭ＿０２１０４６）および後期角化エンベロープ１Ａ（late cornified envelope 1A；ＬＣＥ１Ａ；ＮＭ＿１７８３４８）によりもたらされた。さらに、２１１８２種のヒトＩｇＧ ｃＤＮＡのデータベースは、０．５７６〜０．８７８（平均０．７６６）のＩｇＧスコアを明らかにした。当業者の案内を補助するために、本発明での使用のために好適な配列は、後期角化エンベロープ１Ａ（ＬＣＥ１Ａ；ＮＭ＿１７８３４８）などの天然に存在する最も高いヒト遺伝子のもの以上かまたはそれを超えるＣＡＩスコアを有し得る。より好ましくは、０．９を超えるＣＡＩスコアを用いるべきである。
【００５７】
コドン最適化を比較的短い配列（例えば、可変領域のみ）にわたって実施した場合、高産生クローンの上昇したレベルが観察されるが、コドン最適化をオープンリーディングフレーム全体にわたって実施した場合、もたらされる高産生クローンの範囲（すなわち、数）はさらに増加することが観察された（表５を参照されたい）。
【００５８】
好まれるコドンの配列によっては、初期設定での通常の最適化アプローチが、正常には、高スコアＡＲＥ（ＡＵリッチエレメント（Ａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ １９９４；Ｖｏｌ．８３ ｐｐ３１８２−３１８７を参照されたい））ＲＮＡ不安定化配列の導入を回避するであろう。しかしながら、時には、コドン最適化後に、偶然導入された発現妨害配列エレメントを除去する必要がある場合がある。これらの発現妨害配列には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：
（ｉ）機能的スプライシング部位、
（ｉｉ）対相似領域（例えば、直接、逆、または回文配列）、これは特に発現レベルを低下させ、かつ／または配列間の組み換え率を上昇させる、
（ｉｉｉ）機能的不安定化配列。
【００５９】
稀に、最適化の際にそのような望ましくない妨害エレメントが作製された場合、あまり好まれないが最も好まれないものではないヒトコドン（選択は限れらるが）を用いて局所配列を破壊し、機能を不活性化することが推奨される。最高スコアからの小さなばらつきは、本発明における得られたオープンリーディングフレームの使用に著明な影響を与えない。
【００６０】
オープンリーディングフレームの狭い領域が最適化されずに残っても（例えば、有用な制限部位を残すため）、このことは全体的なＣＡＩスコアには著明に影響しないことも認識される。
【００６１】
オープンリーディングフレームが融合タンパク質、ハイブリッドタンパク質またはキメラタンパク質をコードする場合、ＣＡＩスコアを上記と同じ様式で上昇させることが推奨される。高度に発現される内在性遺伝子の発現について宿主細胞により好まれる同義のコドンへのこの最適化はまた、融合されたかもしくは遺伝子操作されたオープンリーディングフレームの遺伝子または同類のｃＤＮＡの各々すべての構成要素について行なわれるべきである。タンパク質中に存在する純粋に合成的なコード配列（すなわち、先行する配列が存在しない配列）については、正確に同じ様式で、天然には存在しない高いヒト遺伝子ＣＡＩスコアを導入すべきである。後期角化エンベロープ１Ａヒト遺伝子以上かそれを超えるＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを本発明で用いるべきである。
【００６２】
本明細書中に説明される本発明は、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームのコドン最適化により、所望のタンパク質レベルを発現する遺伝子操作された細胞株を作製するために必要とされる、選択・増幅薬剤のレベル、時間、および増幅サイクル数を減らす方法を最初に説明するものである。この目的でコドン最適化を使用することにより、より早い時間枠で十分な収量が観察され、したがって細胞株開発研究で長期間を節約する。さらに、本発明者らはまた、以前に達成していたものよりも低い濃度の選択・増幅薬剤を用いて同等かまたは改善された細胞株を作製している。実際、本明細書中に記載されるそのような改善を、Ｃｅｌｉｎａ ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓら（上掲）により記載されているものなどの標準的な細胞培養および播種プロトコールと組み合わせた場合に、遺伝子操作された細胞株からの同等かまたは改善された収量をもたらすのに必要な、選択・増幅薬剤レベルのさらなる低下、および時間のさらなる短縮が観察されるであろう。
【００６３】
本発明は、治療用タンパク質が糖タンパク質である場合の使用に好適である。以前の研究では、処理の持続時間、温度、ｐＨ、浸透圧ならびに培地成分および添加物等の改変によりタンパク質生成物のグリコシル化を制御することができることが開示されているが（例えば、ＷＯ２００２０７６５７８およびその引用文献を参照されたい）、本発明者らは、治療用ポリペプチド配列をコードするオープンリーディングフレームのコドン最適化（抗体治療用ポリペプチドの場合）が、ＣＨＯ細胞亜型、選択・増幅方法または培地培養条件に依存せず、不完全なグリコシル化のレベルおよびグリコシル化部位占有率減少のレベルを低下させることができることを見出した。
【００６４】
この驚くべき知見は、オープンリーディングフレームのコドン最適化によりタンパク質グリコシル化プロフィールに影響を与えることができることを最初に実証するものである。本明細書中に記載されるコドン最適化アプローチを用いることにより、宿主細胞を増殖させる条件ではなく、遺伝子配列に依存して、堅牢な製造プロセスを確実にすることができる。つまり、このことは、より多くの場合、生成物のグリコシル化プロフィールにもたらされる影響についての過剰な懸念なしに、標準的な培地および栄養供給開発の反復を通して培養条件および栄養供給を改善することを可能にする。
【００６５】
コドン最適化の程度は、ＳｈａｒｐおよびＬｉにより最初に記載された方法を用いて測定することができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９８７ １５：１２８１−９５）。ＳｈａｒｐおよびＬｉは、基本的にコドン優勢度統計に由来するが、異なる遺伝子間でのアミノ酸組成でのばらつきの影響を排除するために各アミノ酸について標準化されているコドン最適化指数（ＣＡＩ）スコアを提案した。このＣＡＩ計算法は、容易に利用可能である（例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅを介して（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ ２０００：Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６；ｐｐ２７６−２７７を参照されたい））。
【００６６】
本発明での使用が意図されるオープンリーディングフレームをスコア付けするために、まず、適切な参照データベースを用いなければならない。第１に、用いる宿主細胞について検討すべきであり、続いて該宿主細胞で発現される遺伝子についての対応する同義コドン使用頻度（ＲＳＣＵ）の参照表を特定するべきである。得られるオープンリーディングフレームをいずれかの哺乳動物細胞タイプで発現させる場合には、典型的には、ヒトＲＳＣＵデータベースが参照のために好適である。データベースの一例は、ＥＭＢＯＳＳにより提供されているものであり、これは参照としてＥｈｕｍ．ｃｕｔコドン使用頻度表を用いてヒト細胞でのコドン使用頻度優勢度を決定している。別の参照コドン使用頻度表は、Ｍａｓｓａｅｒら（上掲）により記載されているものであり、ここでは、比較的少ない高度発現ヒト遺伝子を用いてコドン優勢度を決定している。これら２つの参照表同士は、最も好まれるコドンについて大まかには一致しているものの、１種類のアミノ酸（アルギニン）については顕著な乖離がある。したがって、本発明での使用のためにオープンリーディングフレームを設計する場合には、同じコドン使用頻度表同士を相互参照して、（ｉ）オープンリーディングフレームに含めるための最も好まれるコドンを決定し、次に（ｉｉ）続いて得られたオープンリーディングフレームをＣＡＩスコア付けして、そのスコアが本発明での使用のために好適であるのに十分に高いことを確認することが合理的である。例えば、ヒトおよび哺乳動物細胞での発現のためのオープンリーディングフレームを設計するために日常的にＭａｓｓｅａｅｒらのデータベースを用いており、したがってＣＧＣコドンがアルギニンをコードするのに最も好まれると考えられる場合、得られるオープンリーディングフレームのＣＡＩスコアを決定するときにもこの優勢度参照データを用いるのが合理的である。
【００６７】
本明細書中に記載される方法は、抗体またはその誘導体を発現させる場合に特に好適であり、ＥＦ−１α遺伝子に由来するプロモーターおよび発現エレメントにより駆動される発現カセットと組み合わせる場合に特に有効である。他のプロモーターおよび発現エレメント（例えば、ＲＳＶ ＬＴＲに由来するもの）により駆動される発現カセットもまた好適である。発現カセットエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、マトリックス結合領域（ＭＡＲＳ）、インスレーター、非翻訳領域、イントロンなどの介在配列、およびポリアデニル化部位）は、多くの異なる組み合わせで組み合わせて、好適な発現カセットを作製し、所望のオープンリーディングフレームの発現を駆動し、かつ本発明で用いられる選択・増幅マーカーの発現を駆動することができることは当該技術分野で周知である。
【００６８】
いずれかの所与の細胞株開発プロトコールでのクローンが、無血清改良バッチ産生での産生プラトーに近づくと、さらなる研究は以下のような方法論に最も注目して行われる：（ｉ）最良クローンの単一細胞クローニング、（ｉｉ）血清添加バッチプロセス開発、（ｉｉｉ）灌流型プロセス開発、（ｉｖ）オーダーメード培地ならびに栄養供給配合および処方、ならびに（ｖ）さらなる培養最適化。例えば、１つの個別のクローンについて産生閾値に達したら、それに由来する単一細胞サブクローンは、さらに厳しいレベルの選択・増幅薬剤でのさらなる選択・増幅法により作製された増幅された娘クローンよりも、通常さらに安定であり高収量である。実際、すでに産生閾値に近づいている最終的なクローンのさらなる選択・増幅は、多くの場合、不安定化を招き、最初の改良の後では、しばしば、増幅された親クローンよりも、改良無血清産生モデルバッチ培養において同様か低い力価を最終的にもたらし得る。したがって、時には、稀で偶発的なさらなる増幅イベントが２倍を超えて力価を上昇させることがあり得るが、発現閾値に近づいたら、安定した力価をさらに増加させるために代わりに用いることができる、さらに信頼性のある技術が存在する。
【００６９】
本発明を以下の実施例により例証するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
これまで、１５を超える抗体実験計画にＤＨＦＲ選択法を用いてきた。この方法を用いたすべてのケースにおいて、好適な収量を有する細胞株を作製するために、少なくとも２ラウンドの増幅および選択・維持圧として最低でも５０ｎＭのＭＴＸが必要であった。この方法によりこの期間に得られた典型的な結果は、表１の抗体１、２、３および４に代表される。抗体実験計画１は、その時点で利用可能であった標準的な方法を用いて実施した。抗体実験計画２〜９は、以下の材料および方法に従い実施した。
【００７１】
オープンリーディングフレームのコドン最適化指数（ＣＡＩ）の改善の影響を調べた。
【００７２】
研究のために抗体５を最初に選択した。この研究は、野生型（すなわち、非コドン最適化）重鎖および軽鎖抗体オープンリーディングフレームに由来する抗体生成物（抗体５（ａ）として記録）、可変ドメインコード配列のみを広くコドン最適化した重鎖および軽鎖オープンリーディングフレーム（抗体５（ｂ）または５（ｃ）として記録）、または重鎖および軽鎖オープンリーディングフレームの全体のコドン最適化（抗体５（ｄ）として記録）を発現させることを含んでいた。この研究の結果は表１〜５に示されている。
【００７３】
実施例１：材料および方法
１．１ ＤＮＡクローニングおよびベクター構築
すべてのＤＮＡクローニングは、確立された、制限酵素に基づくサブクローニングおよびＰＣＲアッセンブリ法を用いて行なった（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい）。発現および選択ベクターの代表的な模式図を示す（図１を参照されたい）。示したベクターはＲＳＶプロモーターを例示しているが、表１に従い異なるプロモーターを用いた。他の点では、ベクターに変更は加えなかった。
【００７４】
１．２ コドン最適化
ＣＡＩ最適化ＯＲＦ配列を研究した実験計画では、これらの配列は所望のオーバーラップしたオリゴヌクレオチドを組み合わせて用い、標準的な融合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とその後のクローニングおよび配列確認により作製した。すべて、標準的な方法により行った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）およびＳｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１６４（１）：４９−５３，１９９５を参照されたい）。実験計画５（ｂ）および５（ｃ）のＯＲＦの最適化された領域の配列は、ヒト／哺乳動物細胞についてのＭａｓｓａｅｒコドン使用頻度優勢度を用いて設計した（図１１を参照されたい）。
【００７５】
抗体実験計画５（ｄ）のために、コドン最適化ＯＲＦ配列は、契約供給業者１が設計し、生成した。得られたＯＲＦは、０．９より高いＣＡＩスコアを有していた。抗体実験計画６のための抗体可変ドメインをコードするコドン最適化配列は、契約供給業者２が設計し、生成した。続いて、これらの可変ドメインを、定常領域と可変領域との間に位置するユニークなクローニング部位を用いて（重鎖についてはＳｐｅＩを用い、軽鎖についてはＢｓｉＷＩを用いて）、標準的サブクローニングにより、実験計画５（ｄ）のコドン最適化した定常ドメインコード配列と組み合わせた（実験計画６（ｂ）および６（ｄ））。実験計画６（ｂ）および６（ｄ）のための全長抗体をコードする得られたＯＲＦは、各々、０．９を超えるＣＡＩスコアを有していた。抗体実験計画７のコドン最適化ＯＲＦの全体は、契約供給業者２が設計および作製し、得られたＯＲＦは０．９を超えるＣＡＩスコアを有していた。実験計画８および９のＯＲＦには、可変ドメイン配列を設計するために、Ｌｅｔｏソフトウェアアルゴリズムを用いた。続いて、これらの配列を適切な定常ドメインコード配列と組み合わせることにより、イン・フレームの全長オープンリーディングフレームを作製した（上記のように、再びＳｐｅＩ部位およびＢｓｉＷＩ部位を用いた）。抗体８のために、可変ドメインをコードする配列を、実験計画７からの対応する定常ドメインコード配列と融合させた。抗体９のために、作製した可変ドメインコード配列を、実験計画６（ｄ）からの対応する定常ドメインコード配列と融合させた。実験計画８および９のための重鎖および軽鎖全体をコードする得られたＯＲＦもまた、各々、０．９より高いＣＡＩスコアを有していた。
【００７６】
図１１（Ａ）では、抗体実験計画５のＣＤＲ１をコードする軽鎖配列を、代表的なサンプル配列として示している。このＣＤＲのアミノ酸配列を示している。例示的な、潜在的ａｕｕｕａ不安定化ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を、ボックスで囲み、太字で示している（Ａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ ８３：ｐｐ３１８２−３１８７も参照されたい）。アルギニンコドンも強調してある。第１に、改良したコドン最適化法はＯＲＦにわたって上昇したＣＡＩスコアをもたらした。この抗体は、実験計画５（ｂ）で用いた。示したように、この方法は最も好まれるコドンを含んでいるが（例えば、Ｔｙｒについて）、それはすべての場合についてではない（例えば、Ｌｅｕ）。第２に、最高のＣＡＩスコアは、Ｍａｓｓａｅｒらに従う最も好まれるコドンを用いていた。この配列は、抗体実験計画５（ｃ）で用いた。提供された最終的な配列は、コドン使用頻度データベースウェブサイトで利用可能なものなどのより大きなデータベースに従い最も好まれるコドンを用いていた。この抗体配列は、実験計画５（ｄ）で用いた。図１１（Ｂ）では、Ｍａｓｓａｅｒらから最適化した、ヒトで高度に発現される遺伝子のコドン優勢度表を示す。図１１（Ｃ）では、ヒトについてのコドン使用頻度データベース（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｇ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ）（８９５３３ＣＤ（３８６９１０９１コドン）を含む）から最適化した、ヒト遺伝子についてのコドン優勢度表を示す。
【００７７】
重鎖ＯＲＦと軽鎖ＯＲＦの両方について、オープンリーディングフレームを発現ベクターに挿入するために、ユニークなＨｉｎｄＩＩＩ部位（５’）およびＥｃｏＲＩ部位（３’）を通常用いた。すべての配列を、確認してからトランスフェクションに用いた。
【００７８】
例示的な配列については、図２、３、４、５、６、７、８、および９を参照されたい。これらの図面は、実験計画５の元のおよび最適化したオープンリーディングフレーム配列を示している。実験計画５のうちでは、５（ｄ）のみが、得られるＣＡＩスコアが０．９を超えるようにオープンリーディングフレームの領域で十分にコドン最適化されていたことに留意されたい。
【００７９】
本明細書中で報告するすべてのＣＡＩスコアについて、Ｅｈｕｍ．ｃｕｔコドン使用頻度表を参照のために用いた（ＥＭＢＯＳＳから入手可能）。
【００８０】
これらのスコアは、ＳｈａｒｐおよびＬｉ（上掲）により最初に報告された方法を用いるコドン最適化指数アプリケーションを用いて算出される。このアプリケーションは、ＥＭＢＯＳＳスイートの一部分である。配列のＣＡＩスコアを決定するために、バージョン２．８．０のＥｈｕｍ．ｃｕｔコドン使用頻度ファイルおよび初期値のパラメータ設定を用いた。
【００８１】
表６
ＥＭＢＯＳＳから誘導されたＥｈｕｍ．ｃｕｔコドン使用頻度表である。Ａ欄：コドン配列；Ｂ欄：コードされるアミノ酸；Ｃ欄：その重複セットのうちの所与のコドンの割合；Ｄ欄：１０００コドンあたりのコドン数；Ｅ欄：この表を誘導するために用いたデータセットでコドンが観察される回数。
【表１】
【００８２】
１．３ 細胞培養
懸濁に適応したＣＨＯ ＤＧ４４細胞は、通常、以前に適応させた動物由来成分不含培地中に播種した。この培地は、アミノ酸、微量元素、ビタミン、グルコース、および酵母加水分解物を含有する基本組成からなっていた。この培地には、組み換えインスリン、脂質およびヌクレオシドも添加した。炭酸水素ナトリウムをバッファーとして培地に添加した。当該技術分野では、多くの同等な動物由来成分不含培地処方が公知である。ベクターで形質転換した細胞の最初の選択は、ヌクレオシド除去（ＤＨＦＲ選択のため）およびＧ４１８添加（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択のため）により行なった。力価順位付けに関して、９６ウェルアッセイ力価は、細胞増殖、播種数、培地供給容量、およびプレートにわたる蒸発動態によりばらつきやすかった。結果として、振とうフラスコ産生モデルで生成された力価が、高収量増幅細胞株での細胞株順位についてより示唆的であった。そのようなモデルのために、すべての細胞を、同じ当初密度で播種した。そのようなモデルでは、生存率および増殖もモニタリングした。
【００８３】
１．４ トランスフェクション前のＤＮＡ調製
等量（１５μｇ）の重鎖および軽鎖発現ベクターを、２００μＬ容量エッペンドルフ反応中で完了まで直線化し（ＮｏｔＩを用いて）、続いて、エタノール／酢酸ナトリウム沈殿した。次いでペレットを７０％エタノール中で洗浄し、風乾し、５０μＬの分子生物学グレードの水に再懸濁した。
【００８４】
１．５ トランスフェクション前のＣＨＯ ＤＧ４４細胞の調製
健康な増殖中の細胞、１．２×１０７細胞（トランスフェクションあたり）を１５ｍＬまたは５０ｍＬ試験管中で遠心（１０００ｒｐｍ、２〜１０分）し、１５ｍＬの氷冷ＰＢＳ／スクロース中で洗浄し、再度遠心し、次いで８００μＬの氷冷ＰＢＳスクロース中に再懸濁した。続いて、この細胞懸濁液を、予め調製したＤＮＡに添加し、１５分間氷上に置き、その後、冷却したエレクトロポレーションキュベットに移した。
【００８５】
１．６ エレクトロポレーション
調製したＤＮＡおよび細胞を含むキュベットを、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（２５μＦ、０．３８ｋＶに設定）中でエレクトロポレーションし、続いて１０分間氷上に戻した。次いで細胞を取り出し、２４０ｍＬの非選択培地に添加し、４０×９６ウェルディッシュに非選択培地中で２〜５×１０３細胞／ウェルで播種した（すなわち、５０μＬ／ウェル）。続いてプレートをホイルでくるみ、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
【００８６】
１．７ 選択、増幅およびクローン同定
エレクトロポレーションの４８時間後、１５０μＬの選択培地を各ウェルに添加した。この選択培地は、Ｇ４１８を含有し、ヌクレオシドを含んでいない。それから１週間後、１４０μＬの培地を、定着した細胞層を崩さないように新鮮な選択培地と交換し、３〜４週間後、すべての増殖中のクローン（典型的にはウェルあたり０．１コロニーの増殖、すなわち、９６ウェルプレートあたり１０ウェルでの増殖）を、抗体産生について力価測定した。続いて、特定された最上位クローン（典型的には２０〜１００）を、同じ選択培地中で２４ウェルディッシュ〜６ウェルディッシュまでスケールアップした。次いでこれらのクローンを９６ウェルディッシュに１０００細胞／ウェルで播種し（クローンあたり９６ウェル）、次いで２００μＬ／ウェルの容量で５ｎＭのメトトレキサートも含有する選択培地にて選択した。さらなる２〜３週間のインキュベーション後、最良クローンを再度スケールアップし、次いで５０ｎＭ ＭＴＸ中に１０００細胞／ウェルで再び播種した。これらのクローンを、２〜３週間の増殖後に９６ウェルプレート中でスクリーニングし、最良クローンをスケールアップして、続いて１５０ｎＭ ＭＴＸを用いて９６ウェルディッシュに１０００細胞／ウェルで播種した。最終的なクローンを産生能について評価するために、続いて１５０ｎＭ ＭＴＸでの最良クローンをスケールアップし、振とうフラスコ産生モデルで、生成される生成物の力価および品質について評価した。実験計画５（ａ）についての最良クローンは、１７−９−６−１と名付けられたクローンであった。これは、無血清産生モデルで０．３ｇ／Ｌの最終力価を生成した。
留意事項：ステップ１．７で必要とされるメトトレキサートのレベルおよび増幅ラウンドの回数は、実験計画および配列がコドン最適化されているかどうかによって変化した。
【００８７】
１．８ 力価分析
９６ウェルプレートから得た培地サンプルについて、ＩＧＥＮ ＭシリーズＭ８／３８４アナライザー（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ，ＭａｒｙＬａｎｄ，米国）での自動化９６ウェルサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、製造業者の推奨および標準的な方法を用いて、抗体力価を測定した。当該サンドイッチは、ストレプトアビジンコーティング磁気コーティングビーズ、ビオチン化プロテインＡおよびルテニウム標識Ｆ（ａｂ）２断片からなっていた。次いで、被験サンプルについて生成されたシグナルを、抗体参照標準の希釈系列と比較した。非常に感度が高いアッセイではあるが、９６ウェル培養での細胞増殖のばらつきと併せたアッセイのばらつきにより、高収量、増幅細胞株についてのこのアッセイのアッセイ中間精度および再現性は比較的低い。振とうフラスコおよびバイオリアクター産生モデルで得られる培地サンプルについて、比濁法（このアッセイでは、反応溶液中の不溶性の免疫沈降素により光線シグナルが散乱する）により、ベックマン・コールター・イメージシステム（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）ならびに製造業者の推奨および標準的な方法を用いて、抗体力価を測定した。被験サンプルについて生成されたシグナルを、再度抗体参照標準の希釈系列と比較した。報告するすべての力価は概算である。
【００８８】
１．９ バイオリアクター振とうフラスコモデル（改良無血清バッチ産生モデル）
典型的には、動物由来成分不含培地を含む通気孔付きのフタをした標準的な２５０ｍＬ組織培養振とうフラスコ中、８００，０００細胞／ｍＬで、総容量１２０ｍＬまで、細胞を播種した。続いて、これらのフラスコを二酸化炭素を富化した空気中で振とうしながら、設定された温度でインキュベートし、細胞増殖を促進し、維持した。各クローンについて種々の条件を試験した（例えば、種々の温度条件）。本明細書中で報告する結果では、各クローンについての最も高い力価（標準的な条件にわたる）を例示している。典型的には、本明細書中で報告する産生モデル終点力価は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ）での標準的なＶｉ−Ｃｅｌｌ ＣＨＯパラメータ設定および製造業者の推奨プロトコールを用いたトリパンブルー排除に基づくアッセイにより決定して、細胞生存率が約５０％まで落ちた時点で記録した。典型的には、この終点力価は、１０〜２０日間のインキュベーションの後にもたらされた。
【００８９】
１．１０ バイオリアクター培養法
すべての場合で、標準的なバイオリアクター培養法および装置を用いた。一連のシードを作製するために、典型的には、細胞をより大きな容量までスケールアップし、反復する３日〜４日法で１週間に２回継代した。図１３に示す実験のために、シード細胞を用いて、以下のプロセス条件で駆動された３リットルＡｐｐｌｉｋｏｎ卓上バイオリアクター（実施容量：２Ｌ）に播種した：温度３４℃、ｐＨ設定値６．９５、ＤＯ設定値３０％。振とうフラスコモデルの場合と同様に、細胞生存率が約５０％に落ちるまで培養を続けた。これらのバイオリアクターは、振とうフラスコならびに治験材料等を供給するために用いるさらに大きなバイオリアクターの両方の終点力価を大まかに模倣する。
【００９０】
１．１１ ＲＴ−ＱＰＣＲ解析（結果については、図１０を参照されたい）
ＭａｇＮＡ ＰｕｒｅならびにＲＮＡ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＮＡ単離キットおよびプロトコール（Ｒｏｃｈｅ）を用いる自動化シリカベース抽出により、ＣＨＯ ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＱＰＣＲ反応を行なった。ランダムヘキサマーを用いる逆転写に続いて、ＡＢＩ−７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲ反応を行い、標準的な方法を用いてΔΔＣｔ相対定量アルゴリズムにより解析した。反応を多重にし（１８Ｓ＋標的遺伝子［重鎖／軽鎖］）、ここで最も存在量が多い標的である１８Ｓはプライマーを制限し、標的反応の阻害を妨げた。Ｑ−ＰＣＲに用いたプローブおよび隣接プライマー対を、配列番号１〜９に従って用いた。
【００９１】
上記の重鎖および軽鎖プローブ／プライマーは、実験計画５（ｄ）では上昇したＯＲＦコドン最適化のための使用に好適ではなく、図１０（Ａ）からは排除したことに留意されたい。
【００９２】
１．１２ ウエスタンブロット解析（結果については図１０を参照されたい）
標準的な方法を用い、これは別の文献に詳細に説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）を参照されたい）。簡潔には、ポリクローナルな等価な細胞抽出物を、全細胞溶解およびタンパク質抽出バッファーを用いて作製した。等量の各抽出物を、Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーとともに加熱インキュベートし、次いでＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルにロードし、Ｔｒｉｓ−グリシン泳動バッファーを用いて泳動し、タンパク質画分を分離した。分離したら、続いてタンパク質をニトロセルロースメンブレンに電気的トランスファーブロッティングし、全抗ヒトＩｇＧ（ＨＲＰコンジュゲート化）を用いてプローブ付けした。ＨＲＰ基質とのインキュベーションによりシグナルを生成させ、Ｘ線フィルムに記録した。実験計画５（ａ）のための抗体軽鎖生成物を検出するためには、追加のさらに長い露出が必要であった。
【００９３】
１．１３ 所望の組み換えタンパク質を産生するクローンでのＤＨＦＲレベルを決定するための蛍光メトトレキサート染色
各クローンをメトトレキサートなしで４〜５日間培養した後、１０μＭのＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８−メトトレキサート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ）を、１８〜２２時間、３７℃、５％ＣＯ２で、７００，０００個の生存細胞に添加した。続いて染色した細胞を回収し、培地で洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。回収した細胞を培地で再度洗浄し、培地中に再懸濁し、濾過し、生／死排除色素であるヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）を添加した後、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡで解析した。図１４（Ａ）に示したデータは、ゲートされた生細胞のみのものである。
【００９４】
１．１４ ＤＨＦＲおよびＮｅｏレベルについてのゲノムＤＮＡのｑＰＣＲ解析
Ｑｉａｇｅｎから入手した標準的なキットを用いて、ＣＨＯゲノムＤＮＡ抽出を行なった。分光光度計測定を用いてＤＮＡ定量化および標準化を行なった後、ＡＢＩ−７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲ反応を行い、標準的な方法を用いてΔＣｔ相対定量アルゴリズムにより解析した。Ｑ−ＰＣＲに用いたプローブおよび隣接プライマー対は、配列番号２０〜２５に従い使用した。結果を図１４（Ｂ）に示す。
【００９５】
実施例２．ＣＨＯ細胞でのモノクローナル抗体重鎖および軽鎖の発現
驚くべきことに、高いＣＡＩスコアのＯＲＦではあるが、しかし天然のスコア（すなわち、ＬＣＥ１Ａ；ＮＭ１７８３４８０の後期角化エンベロープなどの最も高い観察される天然のヒトＯＲＦのものよりも低くスコア付けされている）である実験計画５（ｃ）が、実験計画５（ｄ）の天然に存在しない高いＣＡＩスコアのオープンリーディングフレームよりも高い最高力価を生成し、５（ｄ）の高産生細胞の範囲（数）が改善された（表５を参照されたい）。続いて、５（ａ）、（ｃ）および（ｄ）のうち最良のクローンを増幅し、さらに評価した。このさらなる評価のために、５（ａ）のクローンを対照として進め、本明細書中に記載される結果以前に観察された典型的な実験計画力価を代表させた。この実験の結果、予想外に早く、少ない増幅レベルで、実験計画５（ｄ）から、高産生で安定なクローン（力価および増幅は４０回の継代にわたって観察された）がもたらされた。実際、５（ｄ）からの最終的な細胞株を作製するのに必要とされたメトトレキサートのレベルは、実験計画５（ａ）の非コドン最適化オープンリーディングフレームからの同じタンパク質生成物を同様かより低いレベルで発現する等価な細胞株を作製するのに必要とされるレベルと比較して、顕著に低かった（９７％少ないメトトレキサート）（表１を参照されたい）。さらに詳細な解析を実施した。表２〜４を参照されたい。
【００９６】
改変されたＣＡＩスコア付けされたＯＲＦにより生成される得られる組み換えタンパク質の結合特性が、コドン最適化によって変化しているか否かを調べるために、ＣＡＩスコア０．８０９（ＨＣ）／０．７６１（ＬＣ）のＯＲＦ、またはＣＡＩスコア０．９８２（ＨＣ）／０．９７６（ＬＣ）のＯＲＦによりコードされる実験計画５の抗体について、結合特性を比較し、解析した。両方の材料をバイオリアクターで生成し、同様の精製方法により精製した。この比較を通して、抗体の結合特性はこの抗体をコードしたＯＲＦに対するＣＡＩの変化により影響を受けていないことが示された。
【００９７】
実験計画５（ｄ）からの最上位産生クローンであるＯ９７−７（表１に示す）を、細胞株のクローン性を確かなものにするために単一細胞クローン化し、最良のサブクローンにより得られた力価は、非クローン化親細胞と比較して、無血清改良バッチ培養において２倍近い増加をもたらした。図１３に示されている力価は、１．１０に記載されているような、２つの別個の３リットルＡｐｐｌｉｋｏｎ卓上バイオリアクターでの無血清バッチ培養によりもたらされた。
【００９８】
表１
各実験計画について、引き続くさらなる開発およびバンク化のために選択した最終的なクローンを示す。細胞株開発の各段階での各最終クローンについて生成された９６ウェル力価（ｎｇ／ｍＬ）も強調してある。本明細書中に記載される結果以前に得られた典型的なデータは、抗体実験計画１、２、３および４として代表される。実験計画２と実験計画４とは、同じ生成物を発現することに留意されたい。実験計画２および４に関して、すべての実験は、同じベクター、宿主細胞およびプロトコールを用いて、しかし異なる実験者および装置を用いて、２つの独立した研究室で実施した。０、５、５０および１５０ｎＭ ＭＴＸでの、以下に示すすべての力価は、９６ウェル段階で得られたものである。より高い力価はバッチ産生モデルで顕著な改善を示さなかったので、より低いＭＴＸのクローンを進めた（表２を参照されたい）。ＦＩＯ＝情報としてのみ、必要ではない。実験計画６（ａ）は、実験計画６（ｂ）〜６（ｄ）からのよりよい力価によって、プラトーに達する前に中止された。
【表２】
【００９９】
表５
標準的トランスフェクションにより作製された非増幅細胞と、選択プロトコールにより作製され、続いてヌクレオシド除去およびＧ４１８添加により選択された非増幅細胞との比較である。すべての細胞株は、（実験計画５の）同じ抗体を発現する同じベクターであるが、抗体が、異なるＣＡＩスコアを有してこれをコードするオープンリーディングフレームから発現されるベクターを含んでいる。実験計画５（ａ）（非最適化）のために、３回のさらなるトランスフェクションを実施したが、結果が基本的にバックグラウンドであったため、示していない。図（Ａ）では、「５ｎｇを超える力価の％」とは、スクリーニング後に５ｎｇ／ｍＬを超える力価を示したウェルの割合（％）を意味し、「５０ｎｇ／ｍＬを超える力価の％」とは、スクリーニング後に５０ｎｇ／ｍＬを超える力価を示したウェルの割合（％）を意味する。「最上位力価」とは、スクリーニングしたすべてのうちで最高スコアの力価を意味する。「５０位値」とは、スクリーニングした５０番目に高い力価を意味する。「２０位値」とは、スクリーニングした２０番目に高い力価を意味する。（Ｂ）では、（Ａ）で報告した最上位、２０位および５０位の力価をヒストグラム形式で表している。
【表３】
【０１００】
表３
表１の実験計画の９６ウェルプレートでの詳細な力価分析である。Ｇ４１８添加およびヌクレオシド除去選択後であるが、メトトレキサート添加を用いていない、最良クローンおよび５０番目によいクローンの力価を示している。
【表４】
【０１０１】
表４
実験計画５および６で観察された上位２０〜１００位のクローンを、続いて６ウェルディッシュまでスケールアップし、その後、５ｎＭメトトレキサートを含有する培地中で９６ウェルプレートに再度播種した。９６ウェルディッシュで、５ｎＭ（Ａ１）および５０ｎＭ（Ａ２）濃度のメトトレキサート抗葉酸剤で選択した、実験５および６で観察された増殖中のクローンの平均力価および最高力価を示す。
【表５】
【０１０２】
表２
産生プラトーの実施例である。実施例（Ａ）：実験計画５（ｄ）のために最終的に選択したクローンを、５０ｎＭのＭＴＸ中でさらに増幅した。親クローン（網かけ）の無血清産生モデル力価および得られた「増幅」娘クローンの最高力価を示す。同様の実施例（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）も示す。各実施例について、さらなる増幅後の娘クローンの最高力価を記録している。
【０１０３】
これにより、より早くより高い力価に到達することが、さらなる増幅ラウンドを通じてより高い力価に到達させようと試みることよりも、有益であることが示されている。
【表６】
【０１０４】
実施例３．抗体６および７ならびにＥＦ−１ａプロモーター
抗体６のために重鎖および軽鎖の両方のオープンリーディングフレームのコドン最適化を実施し、ＯＲＦにわたって０．９を超える最終的なＣＡＩスコアを再びもたらした（表１を参照されたい）。野生型／出発オープンリーディングフレームおよびコドン最適化オープンリーディングフレームを、ＲＳＶに基づくプロモーター発現ベクターならびにヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１ａ）プロモーターに基づく発現ベクター（ｃｉｓ作用インスレーター、エンハンサーおよびプロモーター発現エレメントを代わりに非ウイルス性プロモーター供給源から供給している）で発現させた。この実験の結果はまた、所望のタンパク質のオープンリーディングフレームを最初にコドン最適化した場合、最終的な高産生細胞株を得るのに、顕著に少ないメトトレキサートが必要であったことを実証した。実際に、抗体６が非最適化ＯＲＦ（すなわち、０．９未満のＣＡＩスコア）によりコードされていたトランスフェクション６（ａ）は、産生プラトー付近の細胞の作製前に、５ｎＭ ＭＴＸの段階で中止された。０．９を超えるＯＲＦを用いた細胞株（すなわち、トランスフェクション６（ｂ）および６（ｄ））からすでに得られていた収量と比較して、同等なタンパク質収量を産生することが可能な細胞株を作製するのには、顕著により多くの資源および時間が必要であろうことが明らかであったので、トランスフェクション６（ａ）では増幅法をさらに行なわなかった。さらに、コドン最適化ありまたはなしの同一条件のベクターを比較した場合、コドン最適化は常に、必要とされる抗葉酸剤レベルを低減させたことが観察された。また、実験計画７のために、実験計画６と同様にしてコドン最適化を実施し（表１を参照されたい）、コドン最適化したＯＲＦ（０．９を超えるＣＡＩ）を、ＲＳＶならびにＥＦ−１ａプロモーターに基づく発現ベクターで発現させた。またしても、プロモーターに関係なく、ＣＡＩ最適化ＯＲＦからは、組み換え産物をコードするために非最適化ＯＲＦを用いたすべての以前の実験計画と比較して、同等の高収量細胞株が、より早い時間で、より少ないメトトレキサートを用いて作製された（表１にまとめてある）。
【０１０５】
実施例４．ｍＲＮＡレベル
この方法についてさらに研究するために、生成されるｍＲＮＡのレベルに対するコドン最適化の影響を、同じベクターから、しかし異なるＣＡＩスコアを示すオープンリーディングフレームからの同じ生成物（実験計画５の抗体）を発現する同一条件のポリクローナル細胞集団で調べた。
【０１０６】
ＣＨＯ細胞を、同じタンパク質生成物（実験計画５の抗体）をコードする、重鎖（ＨＣ）コード発現ベクターおよび軽鎖（ＬＣ）コード発現ベクターで共トランスフェクションした。各トランスフェクション集団は、ポリクローナルなプールとして維持した。各ベクター対は、同じ抗体重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）をコードするが、異なるＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームからのものである。
【０１０７】
この実験の結果は、図１０に示され、重鎖および軽鎖メッセンジャーの両方について、非最適化対照と比較してＣＡＩスコアが上昇している場合、ｍＲＮＡレベルの顕著な増加倍率が観察されることを明らかにしている。ＲＮＡレベルの同等な上昇（出発非最適化配列と比較して）が、解析したすべての最適化配列で生じた。同様に、またウエスタンブロットアッセイの範囲内で、すべての最適化配列について、細胞内タンパク質レベルの同等な上昇が見られた。しかしながら、細胞内タンパク質レベルではそのような同等性が見られたものの、分泌されるレベルには差異があった。天然に存在しない高いＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを含む細胞は、より高いポリクローナル力価をもたらした。このことはさらに、細胞株開発プロトコールで天然に存在しない高いＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを用いる場合、高産生クローンの範囲が改善されるとの知見を支持するものである。
【０１０８】
図１０
（Ａ）：ＲＴ−ＱＰＣＲにより測定したＨＣおよびＬＣメッセンジャーの細胞内ＲＮＡレベルである：リボソームＲＮＡに対して標準化したすべてのシグナルおよび増加倍率は、非コドン最適化オープンリーディングフレームによりコードされる出発ＨＣおよびＬＣについて生成されたシグナルに対するものである。Ｙ軸：ＲＮＡシグナルの０〜５０倍増加にわたる値である。Ｘ軸：ａ（ｈ）は、非トランスフェクション細胞から取得したＲＮＡ抽出物から生成された陰性対照ＨＣシグナル（二重）を表す；ｂ（ｈ）は、実験計画５（ａ）について用いたのと同様の非コドン最適化ＨＣおよびＬＣ発現ベクター（ＣＡＩスコアは、ＨＣについて０．８０９、ＬＣについて０．７６１）でトランスフェクションした細胞に由来するＲＮＡ抽出物から生成されたＨＣシグナルを表す；ｃ（ｈ）は、実験計画５（ｂ）で用いたのと同様のコドン最適化ＨＣおよびＬＣ発現ベクター（ＣＡＩスコアは、ＨＣについて０．８４７、ＬＣについて０．８３３）でトランスフェクションした細胞に由来するＲＮＡ抽出物から生成されたＨＣシグナルを表す；ｄ（ｈ）は、実験計画５（ｃ）で用いたのと同様のさらなるコドン最適化ＨＣおよびＬＣ発現ベクター（ＣＡＩスコアは、ＨＣについて０．８７２、ＬＣについて０．８９４）でトランスフェクションした細胞に由来するＲＮＡ抽出物から生成されたＨＣシグナルを表す。上記のものと同じＲＮＡ抽出物から生成された軽鎖シグナルは、ａ（ｌ）、ｂ（ｌ）、ｃ（ｌ）およびｄ（ｌ）にそれぞれ示されている。
【０１０９】
（Ｂ）：ウエスタンブロット分析：同等の細胞抽出物をＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離し、ブロッティングし、抗生成物抗体（ＨＲＰコンジュゲート化）で標識した。非トランスフェクション細胞の対照をレーン１に示す。生成物である重鎖および軽鎖オープンリーディングフレームを発現するポリクローナル細胞は以下のとおりである：レーン２および３：ＨＣ（ＣＡＩスコア０．８０９）およびＬＣ（ＣＡＩスコア０．７６１）（上記の実験ｂ（ｈ）およびｂ（ｌ）から発現されたタンパク質、実験計画５（ａ）で用いたのと等価なベクター）；レーン４および５：ＨＣ（ＣＡＩスコア０．８４７）およびＬＣ（ＣＡＩスコア０．８３３）（上記の実験ｃ（ｈ）およびｃ（ｌ）から発現されたタンパク質、実験計画５（ｂ）で用いたのと等価なベクター）；レーン６および７：ＨＣ（ＣＡＩスコア０．８７２）およびＬＣ（ＣＡＩスコア０．８９４）（上記の実験ｄ（ｈ）およびｄ（ｌ）から発現されたタンパク質、実験計画５（ｃ）で用いたのと等価なベクター）；レーン８および９：ＨＣ（ＣＡＩスコア０．９８２）およびＬＣ（ＣＡＩスコア０．９７６）（実験計画５（ｄ）で用いたものと等価なベクターにより発現されるタンパク質）。
【０１１０】
（Ｃ）：図１０（Ｂ）に記載されるポリクローナル細胞についての、ｎｇ／ｍＬで示される２４時間生成物力価を示す。
【０１１１】
実施例５．高ＣＡＩを達成するための種々の方法。実施例（ａ）実験計画８および実施例（ｂ）実験計画９
（ａ）実験計画８のために、Ｌｅｔｏソフトウェアを用いて可変ドメインを設計した。続いて、それらを、実験計画７のために予め作製した同一の定常ドメインと、標準的な制限酵素消化・ライゲーション法を用いて融合させた。得られた重鎖および軽鎖ＯＲＦのスコアは、それぞれ０．９５４および０．９１９であった。次に、これらを細胞株開発計画に用い、またしても、これまでにコドン最適化前に用いたどれよりも、より早い時間枠で、より少ないメトトレキサートで、高収量細胞株がもたらされた（表１を参照されたい）。
【０１１２】
（ｂ）実験計画９のために、Ｌｅｔｏソフトウェアを再び用いて、可変ドメインを設計した。続いて、これらを、実験計画６（ｄ）のために予め作製した同一の定常ドメインと、標準的な制限酵素消化・ライゲーション法を用いて融合させた。得られた重鎖および軽鎖ＯＲＦのスコアは、それぞれ０．９７５および０．９７３であった。次に、これらを細胞株開発計画に用い、またしても、これまでにコドン最適化前に用いたどれよりも、より早い時間枠で、より少ないメトトレキサートで、高収量細胞株がもたらされた（表１を参照されたい）。
【０１１３】
実施例６．グリコシル化に対する影響
両方の状況で、発現のために同じ宿主、培養培地およびＤＨＦＲ選択・増幅系を用いたにもかかわらず、非最適化オープンリーディングフレームから発現させた場合に生成されるレベルと比較して、コドン最適化オープンリーディングフレームから発現させた場合に、非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）のレベルが顕著に低いことが明らかになった。さらに興味深いことに、同様な高レベルのＮＧＨＣは、同じ非最適化オープンリーディングフレームを、異なる培養条件および異なるベクター、選択・増幅法（グルタミン合成酵素／ＭＳＸ）を用いて異なる宿主細胞で代わりに発現させた場合にも見られた（図１２を参照されたい）。オープンリーディングフレームのコドン最適化と非グリコシル化重鎖の低下したレベルとのこの相関は、オープンリーディングフレームのＣＡＩスコアを上昇させることによって、生成物の全体的な品質も向上させられることを明らかにする。
【０１１４】
６．１ Ｌｏｎｚａ ＣＨＯＫ１ＳＶおよびグルタミン合成酵素選択系を用いる細胞株開発（図１２）
ベクター構築および細胞株開発は、推奨されたＬｏｎｚａ（Ｓｌｏｕｇｈ）プロトコールに従い実施した。すべての場合で、用いた培地はＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。非最適化オープンリーディングフレームを有する抗体実験計画５（ａ）で用いたオープンリーディンフレームを、最初にＬｏｎｚａベクターｐＥＥ１４．４（軽鎖に対して）およびｐＥＥ６．４（重鎖に対して）にサブクローニングした。続いて、これらのベクターを推奨Ｌｏｚａプロトコールに従って組み合わせて、重鎖及び軽鎖を発現する単一の二遺伝子ベクターにした。次に、このベクターを、Ｌｏｎｚａ推奨使用説明書に従って、エレクトロポレーションを用いて、ＣＨＯＫ１ＳＶ宿主細胞と名付けられたＬｏｎｚａ懸濁液適合ＣＨＯＫ１株に送達し、これもまた推奨であるグルタミン除去およびＭＳＸの添加を用いて、選択および増幅した。得られたクローンを９６ウェルで力価測定し、最良クローンを振とうフラスコにスケールアップして、さらに評価した。最良クローンを選択し、大規模バイオリアクターで生成物を生成した。このアプローチに関するさらなる一般的な詳細については、ｄｅ Ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓら、２００６ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：１７９−１９０を参照されたい。
【０１１５】
６．２ 生成物ＮＧＨＣ分析
プロテインＡカラムを用いて、培養上清からタンパク質を精製した。次に、生成物をＳＤＳキャピラリー電気泳動バイオアナライザーラボチップ（Lab-on-a-chip）装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，英国）を用いて、還元条件下で、製造業者のプロトコールに従って分析した。非グリコシル化重鎖は、主要なグリコシル化重鎖分子種と比較してわずかに速く移動する分子種として観察される（図１２Ｂを参照されたい）。
【０１１６】
図１２：表（Ａ）は、すべての分析からの代表的なデータを示す。異なる宿主細胞、ベクター、培地および培養法を用いて異なる選択・増幅プロトコール（グルタミン合成酵素／メトトレキサート）で非最適化オープンリーディングフレームを発現させるために実施した追加の実験も含められている（上記の実施例６．１を参照されたい）。（Ｂ）出発非最適化ＯＲＦおよびコドン最適化ＯＲＦから観察された例示的なＮＧＨＣトレースを示す。この分析は、同等の規模（１０００リットル）のバイオリアクターから精製した生成物について実施した。これらの代表的なトレースの重ね合わせでは、非最適化ＯＲＦ（ＣＡＩ：ＨＣ ０．８０９、ＬＣ ０．７６１）からの生成物を発現するバイオリアクター細胞培養の回収物は、最適化したＯＲＦ（ＣＡＩ：ＨＣ ０．９８２、ＬＣ ０．９７６）から生成される生成物（わずか１．５％の非グリコシル化重鎖を含んでいた）と比較して、低下したグリコシル化部位占有率を有する重鎖をもたらした（１０％の非グリコシル化重鎖）。
【０１１７】
実施例７．最終的な細胞株での選択・増幅薬剤のレベルに対する影響
ＤＨＦＲ選択系での漸増量のＭＴＸ選択・増幅薬剤の追加のまたは段階的な力価測定を、遺伝子コピー数の増加により発現を増加させるために行なう。トランスフェクションされたプラスミドＤＮＡの遺伝子コピー数に対するコドン最適化の影響を調べるために、２種類の異なる半定量法を用いた（実験の説明については、１．１３節および１．１４節を参照されたい）。
【０１１８】
まず、ＦＡＣＳ解析を用いた。この目的のために、実験計画２、３、４、５（ｄ）、６（ｄ）および７（ｂ）について、最終的な細胞株またはその単一細胞クローンを蛍光メトトレキサートで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。結果（図１４Ａに示されている）から、平均蛍光強度により示されるメトトレキサートのレベル、およびしたがってＤＨＦＲのレベルが、細胞株の増幅レベルと相関することが実証され、すなわち、５ｎＭ ＭＴＸで選択された最終的な細胞株（実験計画５（ｄ）、６（ｄ）および７（ｄ））が最も低いＤＨＦＲレベルを有し、１５０ｎＭ ＭＴＸで選択された最終的な細胞株（実験計画３）が最も高いＤＨＦＲレベルを有する。さらに、ＤＨＦＲおよびＮｅｏについてのｑＰＣＲを、実験計画３、４、５（ａ）、５（ｄ）、７（ｂ）および９についての最終的な細胞株またはその単一細胞クローンから抽出されたゲノムＤＮＡに対して実施した。結果（図１４Ｂに示す）から、５ｎＭ ＭＴＸで選択された株（実験計画５（ｄ）、７（ｂ）および９）が、１５０ｎＭ ＭＴＸで選択された株（実験計画３、４および５（ａ））よりも、顕著に低いＤＨＦＲおよびＮｅｏのＤＮＡレベルを、したがってより少ないコピー数を有していることが実証される。
【０１１９】
上述の結果から、コドン最適化ＯＲＦ（この実施例については、実験計画５（ｄ）、６（ｄ）、７（ｂ）および９）から誘導された細胞株は、非最適化ＯＲＦから誘導された株（この実施例については、実験計画２、３、４、５（ａ））と比較して少ない遺伝子コピー数を有していることが実証される。したがって、コドン最適化ＯＲＦ（ＣＡＩ＞０．９）の使用は、（非最適化ＯＲＦから誘導された細胞株と比較した場合）同等またはより高い力価を有し、より低いレベルの増幅で、より少ないコピー数のトランスフェクションＤＮＡでの細胞株の作製をもたらす。より少ないコピー数、より少ない増幅された発現ベクターからの同等またはより高いレベルの抗体を生成するクローンの作製は、非常に望ましい。例えば、組み込まれた発現ベクターのコピー数が増加したときに、反復配列誘発遺伝子サイレンシング（ＲＩＧＳ）が誘導される場合があり、そのようなＲＩＧＳは翻って哺乳動物細胞でのそのようなベクターからの発現レベルの低下をもたらし得ることが示されている（例えば、ＭｃＢｕｒｎｅｙ ＭＷ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００２ ２７４：１−８を参照されたい）。
【０１２０】
図１４（Ａ）：実験計画２、３、４、５（ｄ）、６（ｄ）および７（ｂ）の各々に対する最終的な細胞株について観察された平均蛍光のプロットである。ＤＨＦＲに対する細胞染色は、材料および方法、実施例１に記載されているとおりに行なった。（Ｂ）：実験計画３、４、５（ａ）、５（ｄ）、７（ｂ）および９に対する最終的な細胞株からのゲノムＤＮＡに対するｑＰＣＲによる、ＤＨＦＲおよびＮｅｏ ＤＮＡのレベルを示す。ｑＰＣＲは、材料および方法、実施例１に記載されているとおりに行なった。観察された基準レベルに対して、ＤＨＦＲおよびＮｅｏについての最も低い値（実験計画７（ｂ）で見られた）を１に設定し、すべての他の値をそれ以上の相対的増加倍率としてプロットした。各値の下には、解析された細胞株により発現されるタンパク質が０．９を超えるＣＡＩを有するＯＲＦからのものであるか否か（Ｙ＝Ｙｅｓ、Ｎ＝Ｎｏ）、および該細胞株を作製するのに必要とされたＭＴＸレベル（ｎＭ ＭＴＸ）も示している。
【表７】
【０１２１】
配列番号１
【０１２２】
配列番号２
【０１２３】
配列番号３
【０１２４】
配列番号４
【０１２５】
配列番号５
【０１２６】
配列番号６
【０１２７】
配列番号７
【０１２８】
配列番号８
【０１２９】
配列番号９
【０１３０】
配列番号１０
【０１３１】
配列番号１１
【０１３２】
配列番号１２
【０１３３】
配列番号１３
【０１３４】
配列番号１４
【０１３５】
配列番号１５
【０１３６】
配列番号１６
【０１３７】
配列番号１７
【０１３８】
配列番号１８
【０１３９】
配列番号１９
【０１４０】
配列番号２０
【０１４１】
配列番号２１
【０１４２】
配列番号２２
【０１４３】
配列番号２３
【０１４４】
配列番号２４
【０１４５】
配列番号２５
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用タンパク質を分泌することが可能な細胞株の作製方法を提供する。該方法は、コドン最適化遺伝子配列の使用を含み、これはプロトコールタイムラインの減少と、例えば選択・増幅系を介した抗体産生細胞株の作製の際に必要とされる抗葉酸剤の濃度の低下の両方をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＮＳ０細胞およびＰｅｒＣ６細胞などの哺乳動物細胞は、生物製剤を製造するために生物製剤産業で通常用いられている。これらの細胞は、遺伝子操作され、続いて、得られた細胞株をバイオリアクターで培養したときに所望のタンパク質が高力価で発現されることを確実にするように選択される。
【０００３】
現在では、この目的で細胞を遺伝子操作し、続いて最良の細胞を選択するための多数の方法がある。これらの方法は多くの場合、組み込まれた発現ベクターのコピー数を増やして所望のタンパク質について得られる収量を改善するために、「増幅」ステップを含む。この「増幅」方法は、以前にＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌにより詳細に報告されている（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩＩ（ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，１９８７））。著者らは、多数の選択マーカー（多くの場合、宿主細胞の代謝に関与し、一定の培地条件においてその生存に必須の酵素をコードする核酸配列の形態で）を、所望のタンパク質を発現させるために設計された発現ベクターに機能的に連結して、それにより選択マーカーについての選択の際に、所望のタンパク質の発現についても選択することができる、と説明している。しかしながら、そのような選択後には、典型的には所望のタンパク質の力価は十分に高くないため、選択された細胞は「増幅」法にも供される。これらの方法は、通常、選択マーカーを阻害するある種の毒性薬物に細胞を供するステップを含む。そのような阻害を通して、このマーカーの発現レベルが増加している細胞集団が選択される可能性がある。このことは、多くの場合、同様に機能的に連結された発現カセットの発現レベルの増加につながる。そのような増加した発現または「増幅」は、通常、選択マーカーおよび機能的に連結された発現カセットのコピー数の増加をもたらすゲノム再構成により生じる。そのような「共増幅」を介して、力価は十分に改善され、得られる最良クローンを用いて好適な高いレベルの所望のタンパク質が産生される。増幅法に供された個々の細胞中のベクターコピー数をさらに調べて、タンパク質産生の「プラトー」に近づくまで、得られる産生レベルは典型的には遺伝子コピー数の増加に比例することが観察されている（ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、上掲）。
【０００４】
現在までに、増幅に適しており、したがって増幅可能選択マーカーと称される多くの異なる選択マーカーが明らかにされている。明らかになっているもののそれぞれはまた、選択・増幅法に際して細胞培養培地に添加される「選択・増幅」薬剤を伴っている。そのような選択マーカー／薬剤の組み合わせの例としては、以下のものが挙げられる：アデノシンデアミナーゼ／デオキシコホルマイシン、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ／Ｎ（ホスホアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸、ジヒドロ葉酸レダクターゼ／メトトレキサート、グルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシミン、メタロチオネイン−Ｉ／重金属、多剤耐性／アドリアマイシン（ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、上掲；Ｋｅｌｌｅｍｓ １９９１，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：ｐｐ７２３−７２９を参照されたい）。さらに、より最近になって、ネオマイシン／Ｇ４１８およびゼオシンに対する耐性を付与するものなどの抗生物質選択マーカーが、コピー数を増やすためにも用いることができる場合があり、適切な対応する選択・増幅（抗生物質系の）選択薬剤と組み合わせた場合、時には選択・増幅マーカーとしても用いられていたことが報告されている（例えば、Ｓａｕｔｔｌｅ ａｎｄ Ｅｎｅｎｋｅｌ：Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ２００４ ８９ ｐｐ５３０−５３８，Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００３；２１；ｐｐ５５３−５５８）。
【０００５】
この目的のために最良の遺伝子操作された細胞を選択する多数の方法がある中で、２種類の最もよく用いられている選択圧はグルタミン合成酵素（ＧＳ）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に基づく選択法である。
【０００６】
ＧＳ法は、グルタミン合成酵素発現カセットを１つまたは複数の治療用タンパク質発現カセットに機能的に連結するステップを含む。得られる機能的に連結されたベクターを細胞に送達して、ベクターの染色体組み込みについて、細胞を培養する培地からグルタミンを枯渇させるかまたは除去することにより選択する。メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）などのグルタミン合成酵素阻害剤の添加も、多くの場合培地に追加され、これにより内因性宿主細胞レベルが高いグルタミン合成酵素活性が選択されるのを確実にする。もう一方のＤＨＦＲ選択法は、ＤＨＦＲ選択圧を１つまたは複数の治療用タンパク質発現カセットに機能的に連結するステップを含む。機能的に連結されたベクターを細胞に送達して、ベクターの染色体組み込みについて、ヌクレオシド（例えば、ヒポキサンチンおよびチミジン）の除去または枯渇により選択する。ＤＨＦＲ法については典型的に、ＣＨＯ ＤＧ４４またはＣＨＯ ＤＵＸ−Ｂ１などのＤＨＦＲ陰性宿主細胞系統が通常用いられる。メトトレキサート（ＭＴＸ）などの選択・増幅薬剤を用いるのも通常行なわれることである。
【０００７】
漸増する量のＭＳＸまたはＭＴＸ選択・増幅薬剤の対応するＧＳおよびＤＨＦＲ選択系への添加または段階的力価測定が、多くの場合、遺伝子コピー数を増加させることにより発現を増大させるために行われる。このような方法は、細胞培養への選択・増幅薬剤の直接的な添加を含むことができる。あるいはまた、薬剤を、そのような細胞培養に用いる前に増殖培地に添加することもできる。細胞培養、または続いて細胞培養に用いられる培地へのそのような薬剤の直接的な添加または力価測定は、典型的には、「増幅」ステップと称される。例えば、ＧＳ系では、ＭＳＸレベルは５００μＭまで、およびこれを超えて添加するかまたは増加させることができるが、ＤＨＦＲ系では、ＭＴＸ抗葉酸剤レベルは１μＭ濃度レベルまで、およびこれを超えて添加するかまたは増加させることができる。そのような薬剤をこのように用いて、続いて新たな選択薬剤濃度（各濃度ステップは、増幅「ラウンド」と称される）で成育する細胞の選択を可能にする培養期間を設けることにより、選択圧を保持するゲノム領域がそれにより増幅され、選択マーカーのコピー数を増加させることもできることが明らかになっている。結果として、選択マーカーを治療用タンパク質発現カセットに機能的に連結している場合、これらのカセットもまた増幅される。ＧＳ選択系およびＤＨＦＲ選択系を用いる場合、適切な選択・増幅薬剤を用いることにより、所望のタンパク質の収量を、「産生プラトー」に達するまで著明に改善することができる（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ（上掲）を参照されたい）。その結果、そのような選択および増幅を経過して成育するクローンを、続いて力価／収量についてスクリーニングして、最良のクローンが選択され、次いでさらに評価される。そのような力価測定およびスクリーニングから、１種または複数種の所望のタンパク質の引き続く産生のために１クローンを同定し、続いてそれだけを用いるのが通常である。
【０００８】
典型的には、増幅「ラウンド」数および用いる選択・増幅薬剤濃度の両方が、選択・増幅プロトコールにおいて設定も固定もされていない。その代わり、通常は、選択・増幅法のために、産生閾値またはプラトーに達する点まで、徐々に厳しい条件にしていく。特に、抗体を発現させる場合、このプラトーに達しているクローンは、現行の改良された無血清バッチ培養モデルおよび産生バイオリアクターでは、０．３〜１．５ｇ／Ｌの最終力価を産生することが観察されている。このことは、典型的には、そのような無血清バッチ培養条件において、細胞生産性（Ｑｐ）が１０〜１００ｐｇ／細胞／日であることを意味する。しかしながら、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／日での）は重要ではあるが、最高のＱｐを有するクローンが常に最高の体積測定力価を示すわけではないので、これは生産性の独占的な決定要素ではない。近年の総説としては、Ｗｕｒｍ ２００４；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ２２；ｐｐ１３９３−１３９８を参照されたい。
【０００９】
治験で用いる所望のタンパク質を製造するための製造キャンペーンにおいて用いる細胞株を作製するために、選択・増幅法はうまく用いられている。しかしながら、選択・増幅法により得られる力価は十分ではあるが、そのような方法は、時間、コストおよび安全性をはじめとする多くの理由により依然として望ましくない。例えば、細胞株「増幅」プロトコールでの増幅・選択薬剤の力価測定はクローン選択およびコロニー増殖を遅らせ、増幅の各ラウンドは完了までに１ヵ月以上かかる。第２に、メトトレキサートおよびメチオニンスルホキシミンのような選択・増幅薬剤は毒性化合物であり、治療的に用いる予定であれば除去しなければならない。第３に、選択・増幅薬剤耐性は哺乳動物細胞でも起こり得るものであり、これは厳格でない選択圧をもたらし、またクローン性および生成物収量の不安定性につながる可能性がある。第４に、増幅は時にはエピソームで起こり得る。そのようなエピソームおよび任意の機能的に連結された機能的発現カセットは、細胞分裂の間に常に均等に受け継がれるものではなく、培養物中の多様性および不安定性を増加させる。第５に、増幅プロトコールの間に生じるゲノム再構成が、宿主細胞ゲノムに無視できない変化を引き起こす可能性があり、これは得られたクローンでの多様な表現型につながる。第６に、選択・増幅薬剤副生成物（例えば、ポリグルタミン酸メトトレキサート）が細胞の別の機能を阻害する場合がある（例えば、Ａｌｌｅｇｒａ ｅｔ ａｌ １９８５ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ ２６０；１７ ｐｐ９７２０−９７２６）。第７に、これらの選択・増幅薬剤の多くが、高レベルで曝露すれば細胞培養およびバイオリアクターの操作に従事している操作者にとっても潜在的に毒性である。第８に、哺乳動物宿主細胞中の組み込まれた発現ベクターのコピー数を増加させることにより、宿主細胞による反復配列誘発遺伝子サイレンシング（ＲＩＧＳ）活性がもたらされる場合があり、これにより、最終的に、組み込まれた各発現ベクターからの発現レベルの低下に至る可能性がある（例えば、ＭｃＢｕｒｎｅｙ ＭＷ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００２ ２７４：１−８）。
【００１０】
結果として、少ない増幅ラウンド数で、低いレベルの選択・増幅薬剤を用いて、なお治療用タンパク質の同じ最終収量を達成する選択・増幅法を用いることが非常に望ましいであろう。これにより、最終的な細胞株を作製するのにかかる時間は早くなり、かつ／または最終的な細胞株を作製するのに必要とされる望ましくない毒性薬剤のレベルを、細胞株作製、選択および培養において低下させるか、もしくは完全に除くことができる（Ｍ．Ｃｅｌｉｎａ ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６ ３４：１７９−１９０）。
【００１１】
６４種類の３塩基対コドン組み合わせが２０種類のアミノ酸しかコードしていないことから、遺伝的コードには重複があることが何十年間も知られている。しかしながら、発現を増加させるためのコドンバイアスの使用は１９８０年代まで分かっていなかった。例えば、１９８２年に、ＢｅｎｎｅｔｚｅｎおよびＨａｌｌ（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７ ｐｐ３０２６−３０３１）が、原核生物および真核生物の両方で強力に発現される遺伝子において生物種特異的なコドンバイアスを観察した。著者らは、このバイアスが生物分類学上多岐にわたっていることも記載した。その結果、組み換え発現系での発現を増大させるために、オープンリーディングフレームのコドン使用頻度を改変することができることがまもなく理解された。例えば、ＫｏｔｕｌａおよびＣｕｒｔｉｓ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ ＮＹ（１９９１）９：１３８６−９）は、高度に発現される内在性の酵母遺伝子により好まれるコドンにコドン使用頻度を偏重させるような、オープンリーディングフレームのコドン最適化により、酵母での哺乳動物抗体軽鎖の発現を顕著に改善させた。別の非常に注目すべき例は、哺乳動物細胞での発現を改善するための緑色蛍光タンパク質のコドン最適化である（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ Ｊ Ｖｉｒｏｌ（１９９６）７０：４６４６−５４；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９６ ２４：４５９２−３）。
【００１２】
最近のデータは、抗体重鎖および軽鎖をコードするオープンリーディングフレームのコドン最適化指数（ＣＡＩ）スコアを上昇させることにより、得られた最適化された発現カセットをグルタミン合成酵素選択マーカーと機能的に連結した場合で、細胞をＭＳＸ選択・増幅薬剤とインキュベートした場合に、哺乳動物宿主細胞での産生収量をかろうじて改善することができることを示唆している。このデータ（ＩＢＣ ２００５ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅで発表された）は、平均発現レベルは有意には改善されていないが、群中の中央値陽性クローンは若干増加した（３７．８μｇ／ｍＬから５１．３μｇ／ｍＬ）ことを示唆したが、これは重鎖および軽鎖の両方のオープンリーディングフレームをコドン最適化した場合のみであった。より最近では、Ｍ．Ｃｅｌｉｎａ ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓら（上掲）も、選択・増幅法を用いて所望のタンパク質を発現する遺伝子操作された細胞株を作製する際に、選択・増幅薬剤のレベルを低下させる必要性を認識していた。著者らは、トランスフェクトされた細胞の播種密度を変化させることにより、用いるＭＳＸレベルを低下させ、同等かより高いレベルの所望のタンパク質を発現する遺伝子操作された細胞株を作製し維持するのに必要とされる期間（週数）を短縮することができることを実証した。
【００１３】
最近発表された研究は、グルタミン合成酵素選択マーカーの使用と組み合わせたコドン最適化のアプローチを研究している。例えば、Ｋａｗｌｅｙらにより発表された研究（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６ Ｖｏｌ ３４；ｐｐ１５１−１５６）は、結果として得られる発現レベルに対するコドン最適化の影響を評価しているが、報告されている結果は達成された発現レベルでのほんのわずかな改善しか示唆していない。
【００１４】
さらに最近、Ｃａｒｔｏｎら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ５５（２００７）ｐｐ２７９−２８６）も、コドン最適化の影響を研究した。この研究は、種々のアプローチによる、重鎖および軽鎖抗体オープンリーディングフレームの部分コドン最適化を含んでいた。これらの改変されたコード配列を、続いてｇｐｔ選択マーカーに機能的に連結した発現カセット中でミニジーン形式（すなわち、イントロンを含む）として骨髄腫細胞で発現させた。いかなる増幅アプローチについても議論されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ：ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩＩ，ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，１９８７
【非特許文献２】Ｋｅｌｌｅｍｓ １９９１：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：ｐｐ７２３−７２９
【非特許文献３】Ｓａｕｔｔｌｅ ａｎｄ Ｅｎｅｎｋｅｌ：Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ２００４ ８９ ｐｐ５３０−５３８
【非特許文献４】Ｋｗａｋｓ ｅｔ ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００３； ２１；ｐｐ５５３−５５８
【非特許文献５】Ｗｕｒｍ ２００４：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ２２；ｐｐ１３９３−１３９８
【非特許文献６】Ａｌｌｅｇｒａ ｅｔ ａｌ １９８５ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ ２６０；１７ ｐｐ９７２０−９７２６
【非特許文献７】ＭｃＢｕｒｎｅｙ ＭＷ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００２ ２７４：１−８
【非特許文献８】Ｍ． Ｃｅｌｉｎａ ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６ ３４：１７９−１９０
【非特許文献９】Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７（１９８２）ｐｐ３０２６−３０３１
【非特許文献１０】Ｋｏｔｕｌａ ａｎｄ Ｃｕｒｔｉｓ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ ＮＹ （１９９１）９：１３８６−９
【非特許文献１１】Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓ Ｊ Ｖｉｒｏｌ （１９９６）７０：４６４６−５４
【非特許文献１２】Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９６ ２４：４５９２−３
【非特許文献１３】Ｋａｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６ Ｖｏｌ ３４；ｐｐ１５１−１５６
【非特許文献１４】Ｃａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ５５（２００７）ｐｐ２７９−２８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
当該技術分野には、増幅可能選択マーカーと機能的に連結された発現系を用いる場合に必要とされる選択・増幅薬剤のレベルを低下させる必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、所望のオープンリーディングフレームのコドンを変更することにより、タンパク質発現細胞株を作製するために必要とされる力価測定可能選択圧、増幅サイクル数、およびそれにかかる時間を低減させる方法を提供する。この目的でコドン最適化を用いることにより、本発明の方法は、一貫して、より早い時間枠で十分な収量をもたらし、これにより細胞株開発研究で何週も節約することになる。さらに、本発明の方法では、以前に達成可能であった濃度よりも低いレベルの濃度の選択・増幅薬剤を用いて細胞株を作製する。したがって、最終的な細胞株でのより低い選択・増幅マーカーが観察される。
【００１８】
本発明は、治療用タンパク質を産生する細胞株を作製するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
（ｂ）第１のポリヌクレオチド配列を改変して第２のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が第１のポリヌクレオチド配列のものよりも大きく、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとは同じ治療用タンパク質をコードしているステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の第２のポリヌクレオチド配列および細胞内で第２のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列で少なくとも１つの細胞を形質転換するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の第３のポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーの不十分なレベルを発現する細胞株で細胞の増殖を阻害する選択薬剤の濃度を含有する培地中でステップ（ｃ）の該少なくとも１つの細胞を増殖させ、複数の細胞を含む細胞株を作製し、それにより、第１のポリヌクレオチドで形質転換された細胞株で産生される該タンパク質の同等な産生プラトーに達するのに必要とされるであろうよりも、少ない増幅ラウンドで、かつ／または低い選択薬剤濃度で第２のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達するステップ
を含む。
【００１９】
本明細書中に記載されるすべての同様の方法において、別途記載されない限り、増幅プロトコールまたは選択薬剤の濃度などのすべての他のパラメータは一定に保たれる。
【００２０】
本発明の一実施形態では、第１の細胞株をバイオリアクター中で培養し、産生される治療用タンパク質を精製する。
【００２１】
本発明の一実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数は０．９よりも大きく、別の実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数は０．９１よりも大きく、また別の実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数は０．９２よりも大きく、また別の実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数は０．９５よりも大きい。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、計算上等価な治療用タンパク質産生収量に達するのに必要な選択薬剤のレベルは、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法について用いられる選択薬剤の量と比較して、５０％未満まで低下する。別の実施形態では、選択薬剤のレベルは、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法について用いられる選択薬剤の量と比較して、２５％未満まで低下し、また別の実施形態では、選択薬剤のレベルは、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法について用いられる選択薬剤の量と比較して、５％未満まで低下し、また別の実施形態では、選択薬剤のレベルは、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法について用いられる選択薬剤の量と比較して、３％未満まで低下する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、治療用タンパク質を産生する細胞株を作製する方法が提供され、該方法は、以下のステップ：
（ａ）治療用タンパク質をコードし、かつ０．９未満のコドン最適化指数を有する第１のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
（ｂ）治療用タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、該ポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が０．９よりも大きいステップ、
（ｃ）治療用タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列、および第２のポリヌクレオチドの増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列で細胞株を形質転換するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の第３のポリヌクレオチド配列によりコードされる選択マーカーの不十分なレベルを発現する細胞株で細胞の増殖を阻害する選択薬剤の濃度を含有する培地中でステップ（ｃ）の該少なくとも１つの細胞を増殖させて、複数の細胞を含む第１の細胞株を作製し、それにより、第１のポリヌクレオチドで形質転換した細胞株で産生される該タンパク質の同等な産生プラトーに達するのに必要とされるよりも少ない増幅ラウンドで、かつ／または低い選択薬剤濃度で第２のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達するステップ
を含む。
【００２４】
本発明の一実施形態では、形質転換される細胞株は内在性細胞性酵素の破壊または阻害により、代謝的に欠陥がある。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、形質転換される細胞株はヌクレオシド合成経路に欠陥がある。
【００２６】
本発明の一実施形態では、治療用タンパク質は抗体、その誘導体または抗原結合性断片である。
【００２７】
本発明の一実施形態では、治療用タンパク質はモノクローナル抗体である。
【００２８】
本発明の一実施形態では、選択マーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするポリヌクレオチドであり、選択薬剤は抗葉酸剤である。別の実施形態では、抗葉酸剤はメトトレキサートである。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、選択マーカーはグルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドであり、選択薬剤はメチオニンスルホキシミンである。
【００３０】
本発明の一実施形態では、タンパク質産生のプラトーに達するのに１回の増幅ラウンドしか必要とされない。
【００３１】
本発明の一実施形態では、治療用タンパク質の最終的な収量は、無血清バッチで０．３ｇ／Ｌよりも多い。本発明の別の実施形態では、最終的な収量は、無血清バッチで０．５ｇ／Ｌよりも多い。本発明のまた別の実施形態では、最終的な収量は、無血清バッチで０．８ｇ／Ｌよりも多い。
【００３２】
本発明の一実施形態では、用いるＭＴＸの濃度は５０ｎＭ未満または２５ｎＭ未満または１０ｎＭ未満である。本発明の別の実施形態では、用いるＭＴＸの濃度は５ｎＭである。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、１回のみの増幅ステップが行なわれるので、培養培地中で選択される細胞でタンパク質産生のプラトーに達するのに細胞培養培地中で選択・増幅薬剤の１種類の濃度のみが必要とされる。
【００３４】
本発明の一実施形態では、本発明の方法により産生される抗体が提供される。別の実施形態では、この方法により産生される抗体が提供され、産生される該抗体は少なくとも１つの重鎖を含み、５％以下の非グリコシル化重鎖を有する。別の実施形態では、抗体の重鎖は９５％グリコシル化されているか、９６％グリコシル化されているか、９７％グリコシル化されているか、９８％グリコシル化されているか、または９９％グリコシル化されている。また別の実施形態では、抗体は１００％グリコシル化されている。本発明の一実施形態では、高度にグリコシル化された抗体はモノクローナル抗体である。本発明の一実施形態では、高度にグリコシル化された抗体は抗β−アミロイド抗体である。また別の実施形態では、抗体は配列番号１８の重鎖配列および配列番号１９の軽鎖配列を有する。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、本明細書中に記載される本発明の抗原結合性断片が提供され、該断片はＦａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、ミニボディ、単離された可変重鎖領域もしくは単離された可変軽鎖領域、血清由来タンパク質（例えば、増殖因子、サイトカイン、アルブミン等）またはそれらのコンビナトリアル融合体である。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、本明細書中に記載される抗体またはその抗原結合性断片の重鎖および／または軽鎖をコードする１以上の発現カセットを含むベクターを含む、安定的に形質転換された宿主細胞が提供される。例えば、そのような宿主細胞は軽鎖をコードする第１のベクターおよび重鎖をコードする第２のベクターを含むことができる。あるいはまた、そのような発現カセットは送達の前に組み合わせることができる。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、本発明による宿主細胞が提供され、該細胞は真核生物細胞であり、例えば該細胞は哺乳動物細胞である。そのような細胞株の例としては、以下のものが挙げられる：チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＮＳ０細胞またはＰｅｒＣ６細胞（最近の総説として、Ｗｕｒｍ ２００４：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２；１１ ｐｐ１３９３−１３９８を参照されたい）。そのような宿主細胞は、有利な遺伝型および／または表現型改変を含んでもよく、例えば、ＣＨＯ−ＤＧ４４宿主系統は不活性化されたｄｈｆｒ遺伝子のコピーを有し、他の宿主は不活性化されたグルタミン合成酵素遺伝子を有する場合がある。別の改変は、タンパク質グリコシル化に関与する酵素機構に対するものであり得る（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｅｎｇ ２００４ ８７：ｐｐ ６１４−６２２；Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７ １３０：ｐｐ３００−３１０；Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７ ７：８４）。また別の宿主は、宿主アポトーシス、発現および生存経路に対する有利な遺伝型および／または表現型改変を有し得る（例えば、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２０００ ６８：３１−４３；Ｙａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ２００５ Ｃｈａｐｔｅｒ ３ ｐｐ７７９−８０７；Ｎｉｖｉｔｃｈａｎｙａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００７ ９８：８２５−４１；Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００７ ９７：８７−９２）。宿主のこれらおよび他の改変は、単独でもしくは組み合わせて、非宿主遺伝子もしくは宿主遺伝子の過剰発現、遺伝子ノックアウトアプローチ、遺伝子サイレンシングアプローチ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、または所望の表現型を有する下位系統の進化および選択などの標準的な技術によりもたらすことができる。そのような技術は、当該技術分野で十分に確立されている。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、本明細書中に記載される本発明に係る治療用タンパク質の製造方法が提供され、該方法は、培養培地中で、例えば無血清培養培地中で、宿主細胞を培養するステップを含む。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、前記抗体含有無血清培養培地に対して、少なくとも９５％以上（例えば、９８％以上）まで、前記治療用タンパク質をさらに精製する、本明細書中に記載される本発明に係る方法が提供される。
【００４０】
本発明の一実施形態では、０．９より高いＣＡＩスコアを有し、抗体、抗体関連ポリペプチド、またはその誘導体もしくは融合体をコードするオープンリーディングフレームを含む哺乳動物発現ベクターが提供される。
【００４１】
別の実施形態では、第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列が同じ治療用タンパク質をコードし、第１のポリヌクレオチド配列よりも大きなコドン最適化指数を有する第２のポリヌクレオチド配列で形質転換されており、第１のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む第１の細胞株が提供され、該第１の細胞株は、選択培地中で増殖させた場合に、該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドで形質転換した第２の細胞株と比較して、該治療用タンパク質のより高い収量を産生する。
【００４２】
さらなる実施形態では、治療用タンパク質をコードし、０．９より大きなコドン最適化指数を有する第２のポリヌクレオチド配列で形質転換され、第２のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む第２の細胞株が提供され、該第２の細胞株は、選択培地中で増殖させた場合に、該治療用タンパク質をコードし、０．９未満のコドン最適化指数を有する第１のポリヌクレオチドで形質転換した第１の細胞株と比較して、該治療用タンパク質のより高い収量を産生する。
【００４３】
本発明の一実施形態では、０．９より高いＣＡＩスコアは、表６に記載されているＥＭＢＯＳＳ ＣＡＩスコア算出法を用いて算出される。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、本明細書中の上述の実施形態に係るベクターまたは発現カセットを含む細胞株が提供される。
【００４５】
また別の実施形態では、本発明の方法により取得可能な細胞株またはその子孫が提供される。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、抗体、抗体関連ポリペプチドまたはその誘導体をコードする、０．９より高いＣＡＩスコア（ＥＭＢＯＳＳコドン使用頻度表Ｅ．ｈｕｍａｎ．ｃｕｔを用いてもたらされる）を有するオープンリーディングフレームが組み込まれたゲノム、またはエピソームとして維持されるそのようなオープンリーディングフレームを有する哺乳動物細胞が提供される。
【００４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、用語「含んでいる」および「含む」は「からなっている」および「からなる」を取り込んでいる。すなわち、「含んでいる」および「含む」は、文脈が許容する場合、具体的には明記されていない他の要素または整数を包含する可能性を有する。
【００４８】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、用語「産生プラトー」は、追加の増幅ラウンドが典型的には増幅される親クローンに対して２倍未満の増加をもたらす、改良された無血清バッチ培養において達成される発現レベルを意味する。クローンが抗体を特異的に産生するように遺伝子操作されている場合、標準的な改良無血清産生培養において０．３ｇ〜１．５ｇ／Ｌを産生するクローンは、典型的には、現行の無血清改良培養法および培地組成を用いる場合、この産生プラトーに達しているものと考えることができる。
【００４９】
産生プラトーに達している最終的なクローンの単一細胞サブクローニングは、フローソーティング（例えば、９６ウェルプレート中で１ウェルあたり１細胞を投入する）、軟寒天コロニーピッキング、または限界希釈クローニングをはじめとする、多くの標準的な方法により行うことができる。受け入れウェルでの単一細胞増殖を確実にするために、投入された単一細胞の増殖を補助するために、馴化培地または一時的フィーダー培養を用いるべきである場合もある。生存フィーダー共培養物が必要な場合、それらは組み込まれた選択ベクターを含まない親宿主細胞を容易に含むことができ、それにより宿主細胞は投入された単一細胞クローンが健康に分裂し始めたときに、続いて選別することができる。
【００５０】
本明細書を通して用いられるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）との用語は、１つまたは複数の所望のポリペプチド鎖をコードする核酸コード配列を意味する。そのようなＯＲＦコード配列内に含まれるコドンは、連続的であることができ、あるいはまた、それらがイントロンを含むこともできる。ＯＲＦに含まれる場合、イントロンまたは介在配列は、通常は宿主細胞中でのスプライシング反応により除去され、続いて成熟ｍＲＮＡでの最終的な連続的オープンリーディングフレームが形成される。
【００５１】
本明細書を通して用いられる「収量」は、溶液（例えば、培養ブロスまたは細胞溶解混合物もしくはバッファー）中の生成物（例えば、異種性に発現されたポリペプチド）の濃度を意味し、これは通常、ｍｇ／Ｌまたはｇ／Ｌで表現される。収量の増加は２種類の決められた条件で生成された生成物の濃度での絶対的なまたは相対的な増加を意味する場合がある。
【００５２】
機能的に連結されたとの用語は、所望のタンパク質産物を発現する発現カセットを有する宿主細胞を選択するために用いる選択・増幅マーカーの使用を意味する。これは、選択・増幅マーカーを、所望のタンパク質を発現する発現カセットを担持するのと同じプラスミドまたはベクターにクローニングすることにより達成することができ、あるいはまた、別個のプラスミドまたはベクター上で細胞に送達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】実験計画２、３、４、５、６（ａ）、６（ｂ）および７（ａ）で用いたＲＳＶプロモーターに基づくベクターの模式図である。ＥＦ−１αプロモーターに基づく評価（実験計画６および７）については、ＲＳＶプロモーターをヒトＥＦ−１α由来プロモーターおよび第１イントロンで置き換えた（Ｋｉｍ，ＤＷ．，Ｇｅｎｅ，１９９０，９１：２１７−２３を参照されたい）。これはヒトゲノムＤＮＡからのＰＣＲにより得られた。このＥＦ−１αプロモーターを続いてＲＳＶに基づくプロモーターの代わりにベクター中にクローニングした。
【図２】ＣＡＩスコア：０．８０９を有する実験計画５の非最適化重鎖を示す。実験計画５（ａ）で用い、配列番号１０である。
【図３】ＣＡＩスコア：０．７６１を有する実験計画５の非最適化軽鎖を示す。実験計画５（ａ）で用い、配列番号１１である。
【図４】上昇したＣＡＩスコア（０．８４７）を有する実験計画５（ｂ）の重鎖ＯＲＦを示す。表５を参照されたい。配列番号１２を参照されたい。
【図５】上昇したＣＡＩスコア（０．８３３）を有する実験計画５（ｂ）の軽鎖ＯＲＦを示す。表５を参照されたい。配列番号１３を参照されたい。
【図６】上昇したＣＡＩスコア（０．８７２）を有する実験計画５の重鎖ＯＲＦを示す。この配列は抗体実験計画５（ｃ）で用いた。配列番号１４を参照されたい。
【図７】上昇したＣＡＩスコア（０．８９４）を有する実験計画５の軽鎖ＯＲＦを示す。この配列は抗体実験計画５（ｃ）で用いた。配列番号１５を参照されたい。
【図８】上昇したＣＡＩスコア（０．９８２）を有する実験計画５の重鎖ＯＲＦを示す。この配列は抗体実験計画５（ｄ）で用いた。配列番号１６を参照されたい。
【図９】上昇したＣＡＩスコア（０．９７６）を有する実験計画５の軽鎖ＯＲＦを示す。この配列は抗体実験計画５（ｄ）で用いた。配列番号１７を参照されたい。
【図１０】抗体実験計画５のための重鎖および軽鎖ＲＮＡならびにタンパク質レベルを示す。
【図１１】コドン最適化法の詳細を示す。
【図１２Ａ】実験計画５最終クローン選択で得られた実施例の生成物ＮＧＨＣのデータを示す。
【図１２Ｂ】実験計画５最終クローン選択で得られた実施例の生成物ＮＧＨＣのデータを示す。
【図１３】最終的な細胞株増幅および選択の後に約３ヵ月のさらなる開発を行なったＯ９７−７（実験計画５（ｄ）、５ｎＭ ＭＴＸ選択クローン、ＣＡＩ ＨＣ：０．９８２、ＬＣ：０．９７６）から生成された実施例の力価を示す。
【図１４】種々の実験計画で遺伝子操作された細胞にて観察されたＤＨＦＲ遺伝子コピーおよびタンパク質ならびにＮｅｏ遺伝子コピーの相対レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明により生成される治療用ポリペプチドをコードする遺伝子のコドン使用頻度を測定し、コドン最適化指数（ＣＡＩ）により定義する。
【００５５】
コドン最適化とは、得られるオープンリーディングフレームの発現を妨げる望ましくない二次的な配列機能を導入することを回避しながら、オープンリーディングフレームのコドンを、ヒト／哺乳動物遺伝子で好まれる同義のコドンに最適化することである。本発明者らは、好まれるヒトコドンは、非ヒト哺乳動物細胞（例えば、ハムスター由来細胞）での引き続く発現が計画される場合でさえも、非常に好適である。しかしながら、いずれかの所与のアミノ酸に対する最も好まれるコドンが、ある哺乳動物種で異なっていたとしても、これがヒトで優勢なものに代わり用いられることもある。各オープンリーディングフレームについて生成された「ＣＡＩスコア」は、オープンリーディングフレームがヒト／哺乳動物遺伝子により最も好まれる同義のコドンの使用に最適化されている程度を表す。本発明の文脈では、１のＣＡＩスコアは、各コドン位置において各アミノ酸について最も適したコドンが用いられていることを意味する。本発明の方法での最適な結果のためには、治療用タンパク質をコードする遺伝子は十分に１に近いＣＡＩを有し、それにより、顕著に少ない選択・増幅薬剤を用いて、かつ／または天然に存在する出発配列を発現させたときに観察されるのと比較してより速い時間で、治療用タンパク質の所望の発現レベルが達成され、例えば、ＣＡＩは少なくとも０．９、または少なくとも０．９５、または少なくとも０．９７５である。
【００５６】
しかしながら、すべてのコドンを最も好まれるコドンに置き換えるか、またはすべての最も好まれないコドンをより好まれるコドンで置き換える必要はない。唯一の条件は、得られる配列が天然には生じない高いＣＡＩスコアを有し、発現妨害エレメントを有しないことである。Ｌｅｔｏ１．０（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ドイツ）などの市販のソフトウェアは、好適な高いＣＡＩスコアの配列を設計することができる。本発明での使用のためのコドン最適化された配列の設計における案内をさらに補助するために、ＮＣＢＩゲノムビルド番号３６に由来する２４０４４ ＲｅｆＳＥＱデータベースヒト発現産物が解析されている（ＮＭ＿規定された登録番号）。ＣＡＩスコア範囲が算出され、０．５９３〜０．８９４（平均スコア０．７２０）であった。このデータベース中の既知の発現遺伝子（理論上のものではなく）についての最も高いスコア（０．８９４）は、ケラチン結合タンパク質５−８（ＫＲＴＡＰ５−８；ＮＭ＿０２１０４６）および後期角化エンベロープ１Ａ（late cornified envelope 1A；ＬＣＥ１Ａ；ＮＭ＿１７８３４８）によりもたらされた。さらに、２１１８２種のヒトＩｇＧ ｃＤＮＡのデータベースは、０．５７６〜０．８７８（平均０．７６６）のＩｇＧスコアを明らかにした。当業者の案内を補助するために、本発明での使用のために好適な配列は、後期角化エンベロープ１Ａ（ＬＣＥ１Ａ；ＮＭ＿１７８３４８）などの天然に存在する最も高いヒト遺伝子のもの以上かまたはそれを超えるＣＡＩスコアを有し得る。より好ましくは、０．９を超えるＣＡＩスコアを用いるべきである。
【００５７】
コドン最適化を比較的短い配列（例えば、可変領域のみ）にわたって実施した場合、高産生クローンの上昇したレベルが観察されるが、コドン最適化をオープンリーディングフレーム全体にわたって実施した場合、もたらされる高産生クローンの範囲（すなわち、数）はさらに増加することが観察された（表５を参照されたい）。
【００５８】
好まれるコドンの配列によっては、初期設定での通常の最適化アプローチが、正常には、高スコアＡＲＥ（ＡＵリッチエレメント（Ａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ １９９４；Ｖｏｌ．８３ ｐｐ３１８２−３１８７を参照されたい））ＲＮＡ不安定化配列の導入を回避するであろう。しかしながら、時には、コドン最適化後に、偶然導入された発現妨害配列エレメントを除去する必要がある場合がある。これらの発現妨害配列には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：
（ｉ）機能的スプライシング部位、
（ｉｉ）対相似領域（例えば、直接、逆、または回文配列）、これは特に発現レベルを低下させ、かつ／または配列間の組み換え率を上昇させる、
（ｉｉｉ）機能的不安定化配列。
【００５９】
稀に、最適化の際にそのような望ましくない妨害エレメントが作製された場合、あまり好まれないが最も好まれないものではないヒトコドン（選択は限れらるが）を用いて局所配列を破壊し、機能を不活性化することが推奨される。最高スコアからの小さなばらつきは、本発明における得られたオープンリーディングフレームの使用に著明な影響を与えない。
【００６０】
オープンリーディングフレームの狭い領域が最適化されずに残っても（例えば、有用な制限部位を残すため）、このことは全体的なＣＡＩスコアには著明に影響しないことも認識される。
【００６１】
オープンリーディングフレームが融合タンパク質、ハイブリッドタンパク質またはキメラタンパク質をコードする場合、ＣＡＩスコアを上記と同じ様式で上昇させることが推奨される。高度に発現される内在性遺伝子の発現について宿主細胞により好まれる同義のコドンへのこの最適化はまた、融合されたかもしくは遺伝子操作されたオープンリーディングフレームの遺伝子または同類のｃＤＮＡの各々すべての構成要素について行なわれるべきである。タンパク質中に存在する純粋に合成的なコード配列（すなわち、先行する配列が存在しない配列）については、正確に同じ様式で、天然には存在しない高いヒト遺伝子ＣＡＩスコアを導入すべきである。後期角化エンベロープ１Ａヒト遺伝子以上かそれを超えるＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを本発明で用いるべきである。
【００６２】
本明細書中に説明される本発明は、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームのコドン最適化により、所望のタンパク質レベルを発現する遺伝子操作された細胞株を作製するために必要とされる、選択・増幅薬剤のレベル、時間、および増幅サイクル数を減らす方法を最初に説明するものである。この目的でコドン最適化を使用することにより、より早い時間枠で十分な収量が観察され、したがって細胞株開発研究で長期間を節約する。さらに、本発明者らはまた、以前に達成していたものよりも低い濃度の選択・増幅薬剤を用いて同等かまたは改善された細胞株を作製している。実際、本明細書中に記載されるそのような改善を、Ｃｅｌｉｎａ ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓら（上掲）により記載されているものなどの標準的な細胞培養および播種プロトコールと組み合わせた場合に、遺伝子操作された細胞株からの同等かまたは改善された収量をもたらすのに必要な、選択・増幅薬剤レベルのさらなる低下、および時間のさらなる短縮が観察されるであろう。
【００６３】
本発明は、治療用タンパク質が糖タンパク質である場合の使用に好適である。以前の研究では、処理の持続時間、温度、ｐＨ、浸透圧ならびに培地成分および添加物等の改変によりタンパク質生成物のグリコシル化を制御することができることが開示されているが（例えば、ＷＯ２００２０７６５７８およびその引用文献を参照されたい）、本発明者らは、治療用ポリペプチド配列をコードするオープンリーディングフレームのコドン最適化（抗体治療用ポリペプチドの場合）が、ＣＨＯ細胞亜型、選択・増幅方法または培地培養条件に依存せず、不完全なグリコシル化のレベルおよびグリコシル化部位占有率減少のレベルを低下させることができることを見出した。
【００６４】
この驚くべき知見は、オープンリーディングフレームのコドン最適化によりタンパク質グリコシル化プロフィールに影響を与えることができることを最初に実証するものである。本明細書中に記載されるコドン最適化アプローチを用いることにより、宿主細胞を増殖させる条件ではなく、遺伝子配列に依存して、堅牢な製造プロセスを確実にすることができる。つまり、このことは、より多くの場合、生成物のグリコシル化プロフィールにもたらされる影響についての過剰な懸念なしに、標準的な培地および栄養供給開発の反復を通して培養条件および栄養供給を改善することを可能にする。
【００６５】
コドン最適化の程度は、ＳｈａｒｐおよびＬｉにより最初に記載された方法を用いて測定することができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９８７ １５：１２８１−９５）。ＳｈａｒｐおよびＬｉは、基本的にコドン優勢度統計に由来するが、異なる遺伝子間でのアミノ酸組成でのばらつきの影響を排除するために各アミノ酸について標準化されているコドン最適化指数（ＣＡＩ）スコアを提案した。このＣＡＩ計算法は、容易に利用可能である（例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅを介して（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ ２０００：Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６；ｐｐ２７６−２７７を参照されたい））。
【００６６】
本発明での使用が意図されるオープンリーディングフレームをスコア付けするために、まず、適切な参照データベースを用いなければならない。第１に、用いる宿主細胞について検討すべきであり、続いて該宿主細胞で発現される遺伝子についての対応する同義コドン使用頻度（ＲＳＣＵ）の参照表を特定するべきである。得られるオープンリーディングフレームをいずれかの哺乳動物細胞タイプで発現させる場合には、典型的には、ヒトＲＳＣＵデータベースが参照のために好適である。データベースの一例は、ＥＭＢＯＳＳにより提供されているものであり、これは参照としてＥｈｕｍ．ｃｕｔコドン使用頻度表を用いてヒト細胞でのコドン使用頻度優勢度を決定している。別の参照コドン使用頻度表は、Ｍａｓｓａｅｒら（上掲）により記載されているものであり、ここでは、比較的少ない高度発現ヒト遺伝子を用いてコドン優勢度を決定している。これら２つの参照表同士は、最も好まれるコドンについて大まかには一致しているものの、１種類のアミノ酸（アルギニン）については顕著な乖離がある。したがって、本発明での使用のためにオープンリーディングフレームを設計する場合には、同じコドン使用頻度表同士を相互参照して、（ｉ）オープンリーディングフレームに含めるための最も好まれるコドンを決定し、次に（ｉｉ）続いて得られたオープンリーディングフレームをＣＡＩスコア付けして、そのスコアが本発明での使用のために好適であるのに十分に高いことを確認することが合理的である。例えば、ヒトおよび哺乳動物細胞での発現のためのオープンリーディングフレームを設計するために日常的にＭａｓｓｅａｅｒらのデータベースを用いており、したがってＣＧＣコドンがアルギニンをコードするのに最も好まれると考えられる場合、得られるオープンリーディングフレームのＣＡＩスコアを決定するときにもこの優勢度参照データを用いるのが合理的である。
【００６７】
本明細書中に記載される方法は、抗体またはその誘導体を発現させる場合に特に好適であり、ＥＦ−１α遺伝子に由来するプロモーターおよび発現エレメントにより駆動される発現カセットと組み合わせる場合に特に有効である。他のプロモーターおよび発現エレメント（例えば、ＲＳＶ ＬＴＲに由来するもの）により駆動される発現カセットもまた好適である。発現カセットエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、マトリックス結合領域（ＭＡＲＳ）、インスレーター、非翻訳領域、イントロンなどの介在配列、およびポリアデニル化部位）は、多くの異なる組み合わせで組み合わせて、好適な発現カセットを作製し、所望のオープンリーディングフレームの発現を駆動し、かつ本発明で用いられる選択・増幅マーカーの発現を駆動することができることは当該技術分野で周知である。
【００６８】
いずれかの所与の細胞株開発プロトコールでのクローンが、無血清改良バッチ産生での産生プラトーに近づくと、さらなる研究は以下のような方法論に最も注目して行われる：（ｉ）最良クローンの単一細胞クローニング、（ｉｉ）血清添加バッチプロセス開発、（ｉｉｉ）灌流型プロセス開発、（ｉｖ）オーダーメード培地ならびに栄養供給配合および処方、ならびに（ｖ）さらなる培養最適化。例えば、１つの個別のクローンについて産生閾値に達したら、それに由来する単一細胞サブクローンは、さらに厳しいレベルの選択・増幅薬剤でのさらなる選択・増幅法により作製された増幅された娘クローンよりも、通常さらに安定であり高収量である。実際、すでに産生閾値に近づいている最終的なクローンのさらなる選択・増幅は、多くの場合、不安定化を招き、最初の改良の後では、しばしば、増幅された親クローンよりも、改良無血清産生モデルバッチ培養において同様か低い力価を最終的にもたらし得る。したがって、時には、稀で偶発的なさらなる増幅イベントが２倍を超えて力価を上昇させることがあり得るが、発現閾値に近づいたら、安定した力価をさらに増加させるために代わりに用いることができる、さらに信頼性のある技術が存在する。
【００６９】
本発明を以下の実施例により例証するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
これまで、１５を超える抗体実験計画にＤＨＦＲ選択法を用いてきた。この方法を用いたすべてのケースにおいて、好適な収量を有する細胞株を作製するために、少なくとも２ラウンドの増幅および選択・維持圧として最低でも５０ｎＭのＭＴＸが必要であった。この方法によりこの期間に得られた典型的な結果は、表１の抗体１、２、３および４に代表される。抗体実験計画１は、その時点で利用可能であった標準的な方法を用いて実施した。抗体実験計画２〜９は、以下の材料および方法に従い実施した。
【００７１】
オープンリーディングフレームのコドン最適化指数（ＣＡＩ）の改善の影響を調べた。
【００７２】
研究のために抗体５を最初に選択した。この研究は、野生型（すなわち、非コドン最適化）重鎖および軽鎖抗体オープンリーディングフレームに由来する抗体生成物（抗体５（ａ）として記録）、可変ドメインコード配列のみを広くコドン最適化した重鎖および軽鎖オープンリーディングフレーム（抗体５（ｂ）または５（ｃ）として記録）、または重鎖および軽鎖オープンリーディングフレームの全体のコドン最適化（抗体５（ｄ）として記録）を発現させることを含んでいた。この研究の結果は表１〜５に示されている。
【００７３】
実施例１：材料および方法
１．１ ＤＮＡクローニングおよびベクター構築
すべてのＤＮＡクローニングは、確立された、制限酵素に基づくサブクローニングおよびＰＣＲアッセンブリ法を用いて行なった（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい）。発現および選択ベクターの代表的な模式図を示す（図１を参照されたい）。示したベクターはＲＳＶプロモーターを例示しているが、表１に従い異なるプロモーターを用いた。他の点では、ベクターに変更は加えなかった。
【００７４】
１．２ コドン最適化
ＣＡＩ最適化ＯＲＦ配列を研究した実験計画では、これらの配列は所望のオーバーラップしたオリゴヌクレオチドを組み合わせて用い、標準的な融合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とその後のクローニングおよび配列確認により作製した。すべて、標準的な方法により行った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）およびＳｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１６４（１）：４９−５３，１９９５を参照されたい）。実験計画５（ｂ）および５（ｃ）のＯＲＦの最適化された領域の配列は、ヒト／哺乳動物細胞についてのＭａｓｓａｅｒコドン使用頻度優勢度を用いて設計した（図１１を参照されたい）。
【００７５】
抗体実験計画５（ｄ）のために、コドン最適化ＯＲＦ配列は、契約供給業者１が設計し、生成した。得られたＯＲＦは、０．９より高いＣＡＩスコアを有していた。抗体実験計画６のための抗体可変ドメインをコードするコドン最適化配列は、契約供給業者２が設計し、生成した。続いて、これらの可変ドメインを、定常領域と可変領域との間に位置するユニークなクローニング部位を用いて（重鎖についてはＳｐｅＩを用い、軽鎖についてはＢｓｉＷＩを用いて）、標準的サブクローニングにより、実験計画５（ｄ）のコドン最適化した定常ドメインコード配列と組み合わせた（実験計画６（ｂ）および６（ｄ））。実験計画６（ｂ）および６（ｄ）のための全長抗体をコードする得られたＯＲＦは、各々、０．９を超えるＣＡＩスコアを有していた。抗体実験計画７のコドン最適化ＯＲＦの全体は、契約供給業者２が設計および作製し、得られたＯＲＦは０．９を超えるＣＡＩスコアを有していた。実験計画８および９のＯＲＦには、可変ドメイン配列を設計するために、Ｌｅｔｏソフトウェアアルゴリズムを用いた。続いて、これらの配列を適切な定常ドメインコード配列と組み合わせることにより、イン・フレームの全長オープンリーディングフレームを作製した（上記のように、再びＳｐｅＩ部位およびＢｓｉＷＩ部位を用いた）。抗体８のために、可変ドメインをコードする配列を、実験計画７からの対応する定常ドメインコード配列と融合させた。抗体９のために、作製した可変ドメインコード配列を、実験計画６（ｄ）からの対応する定常ドメインコード配列と融合させた。実験計画８および９のための重鎖および軽鎖全体をコードする得られたＯＲＦもまた、各々、０．９より高いＣＡＩスコアを有していた。
【００７６】
図１１（Ａ）では、抗体実験計画５のＣＤＲ１をコードする軽鎖配列を、代表的なサンプル配列として示している。このＣＤＲのアミノ酸配列を示している。例示的な、潜在的ａｕｕｕａ不安定化ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を、ボックスで囲み、太字で示している（Ａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ ８３：ｐｐ３１８２−３１８７も参照されたい）。アルギニンコドンも強調してある。第１に、改良したコドン最適化法はＯＲＦにわたって上昇したＣＡＩスコアをもたらした。この抗体は、実験計画５（ｂ）で用いた。示したように、この方法は最も好まれるコドンを含んでいるが（例えば、Ｔｙｒについて）、それはすべての場合についてではない（例えば、Ｌｅｕ）。第２に、最高のＣＡＩスコアは、Ｍａｓｓａｅｒらに従う最も好まれるコドンを用いていた。この配列は、抗体実験計画５（ｃ）で用いた。提供された最終的な配列は、コドン使用頻度データベースウェブサイトで利用可能なものなどのより大きなデータベースに従い最も好まれるコドンを用いていた。この抗体配列は、実験計画５（ｄ）で用いた。図１１（Ｂ）では、Ｍａｓｓａｅｒらから最適化した、ヒトで高度に発現される遺伝子のコドン優勢度表を示す。図１１（Ｃ）では、ヒトについてのコドン使用頻度データベース（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｇ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ）（８９５３３ＣＤ（３８６９１０９１コドン）を含む）から最適化した、ヒト遺伝子についてのコドン優勢度表を示す。
【００７７】
重鎖ＯＲＦと軽鎖ＯＲＦの両方について、オープンリーディングフレームを発現ベクターに挿入するために、ユニークなＨｉｎｄＩＩＩ部位（５’）およびＥｃｏＲＩ部位（３’）を通常用いた。すべての配列を、確認してからトランスフェクションに用いた。
【００７８】
例示的な配列については、図２、３、４、５、６、７、８、および９を参照されたい。これらの図面は、実験計画５の元のおよび最適化したオープンリーディングフレーム配列を示している。実験計画５のうちでは、５（ｄ）のみが、得られるＣＡＩスコアが０．９を超えるようにオープンリーディングフレームの領域で十分にコドン最適化されていたことに留意されたい。
【００７９】
本明細書中で報告するすべてのＣＡＩスコアについて、Ｅｈｕｍ．ｃｕｔコドン使用頻度表を参照のために用いた（ＥＭＢＯＳＳから入手可能）。
【００８０】
これらのスコアは、ＳｈａｒｐおよびＬｉ（上掲）により最初に報告された方法を用いるコドン最適化指数アプリケーションを用いて算出される。このアプリケーションは、ＥＭＢＯＳＳスイートの一部分である。配列のＣＡＩスコアを決定するために、バージョン２．８．０のＥｈｕｍ．ｃｕｔコドン使用頻度ファイルおよび初期値のパラメータ設定を用いた。
【００８１】
表６
ＥＭＢＯＳＳから誘導されたＥｈｕｍ．ｃｕｔコドン使用頻度表である。Ａ欄：コドン配列；Ｂ欄：コードされるアミノ酸；Ｃ欄：その重複セットのうちの所与のコドンの割合；Ｄ欄：１０００コドンあたりのコドン数；Ｅ欄：この表を誘導するために用いたデータセットでコドンが観察される回数。
【表１】
【００８２】
１．３ 細胞培養
懸濁に適応したＣＨＯ ＤＧ４４細胞は、通常、以前に適応させた動物由来成分不含培地中に播種した。この培地は、アミノ酸、微量元素、ビタミン、グルコース、および酵母加水分解物を含有する基本組成からなっていた。この培地には、組み換えインスリン、脂質およびヌクレオシドも添加した。炭酸水素ナトリウムをバッファーとして培地に添加した。当該技術分野では、多くの同等な動物由来成分不含培地処方が公知である。ベクターで形質転換した細胞の最初の選択は、ヌクレオシド除去（ＤＨＦＲ選択のため）およびＧ４１８添加（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択のため）により行なった。力価順位付けに関して、９６ウェルアッセイ力価は、細胞増殖、播種数、培地供給容量、およびプレートにわたる蒸発動態によりばらつきやすかった。結果として、振とうフラスコ産生モデルで生成された力価が、高収量増幅細胞株での細胞株順位についてより示唆的であった。そのようなモデルのために、すべての細胞を、同じ当初密度で播種した。そのようなモデルでは、生存率および増殖もモニタリングした。
【００８３】
１．４ トランスフェクション前のＤＮＡ調製
等量（１５μｇ）の重鎖および軽鎖発現ベクターを、２００μＬ容量エッペンドルフ反応中で完了まで直線化し（ＮｏｔＩを用いて）、続いて、エタノール／酢酸ナトリウム沈殿した。次いでペレットを７０％エタノール中で洗浄し、風乾し、５０μＬの分子生物学グレードの水に再懸濁した。
【００８４】
１．５ トランスフェクション前のＣＨＯ ＤＧ４４細胞の調製
健康な増殖中の細胞、１．２×１０７細胞（トランスフェクションあたり）を１５ｍＬまたは５０ｍＬ試験管中で遠心（１０００ｒｐｍ、２〜１０分）し、１５ｍＬの氷冷ＰＢＳ／スクロース中で洗浄し、再度遠心し、次いで８００μＬの氷冷ＰＢＳスクロース中に再懸濁した。続いて、この細胞懸濁液を、予め調製したＤＮＡに添加し、１５分間氷上に置き、その後、冷却したエレクトロポレーションキュベットに移した。
【００８５】
１．６ エレクトロポレーション
調製したＤＮＡおよび細胞を含むキュベットを、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（２５μＦ、０．３８ｋＶに設定）中でエレクトロポレーションし、続いて１０分間氷上に戻した。次いで細胞を取り出し、２４０ｍＬの非選択培地に添加し、４０×９６ウェルディッシュに非選択培地中で２〜５×１０３細胞／ウェルで播種した（すなわち、５０μＬ／ウェル）。続いてプレートをホイルでくるみ、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。
【００８６】
１．７ 選択、増幅およびクローン同定
エレクトロポレーションの４８時間後、１５０μＬの選択培地を各ウェルに添加した。この選択培地は、Ｇ４１８を含有し、ヌクレオシドを含んでいない。それから１週間後、１４０μＬの培地を、定着した細胞層を崩さないように新鮮な選択培地と交換し、３〜４週間後、すべての増殖中のクローン（典型的にはウェルあたり０．１コロニーの増殖、すなわち、９６ウェルプレートあたり１０ウェルでの増殖）を、抗体産生について力価測定した。続いて、特定された最上位クローン（典型的には２０〜１００）を、同じ選択培地中で２４ウェルディッシュ〜６ウェルディッシュまでスケールアップした。次いでこれらのクローンを９６ウェルディッシュに１０００細胞／ウェルで播種し（クローンあたり９６ウェル）、次いで２００μＬ／ウェルの容量で５ｎＭのメトトレキサートも含有する選択培地にて選択した。さらなる２〜３週間のインキュベーション後、最良クローンを再度スケールアップし、次いで５０ｎＭ ＭＴＸ中に１０００細胞／ウェルで再び播種した。これらのクローンを、２〜３週間の増殖後に９６ウェルプレート中でスクリーニングし、最良クローンをスケールアップして、続いて１５０ｎＭ ＭＴＸを用いて９６ウェルディッシュに１０００細胞／ウェルで播種した。最終的なクローンを産生能について評価するために、続いて１５０ｎＭ ＭＴＸでの最良クローンをスケールアップし、振とうフラスコ産生モデルで、生成される生成物の力価および品質について評価した。実験計画５（ａ）についての最良クローンは、１７−９−６−１と名付けられたクローンであった。これは、無血清産生モデルで０．３ｇ／Ｌの最終力価を生成した。
留意事項：ステップ１．７で必要とされるメトトレキサートのレベルおよび増幅ラウンドの回数は、実験計画および配列がコドン最適化されているかどうかによって変化した。
【００８７】
１．８ 力価分析
９６ウェルプレートから得た培地サンプルについて、ＩＧＥＮ ＭシリーズＭ８／３８４アナライザー（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ，ＭａｒｙＬａｎｄ，米国）での自動化９６ウェルサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、製造業者の推奨および標準的な方法を用いて、抗体力価を測定した。当該サンドイッチは、ストレプトアビジンコーティング磁気コーティングビーズ、ビオチン化プロテインＡおよびルテニウム標識Ｆ（ａｂ）２断片からなっていた。次いで、被験サンプルについて生成されたシグナルを、抗体参照標準の希釈系列と比較した。非常に感度が高いアッセイではあるが、９６ウェル培養での細胞増殖のばらつきと併せたアッセイのばらつきにより、高収量、増幅細胞株についてのこのアッセイのアッセイ中間精度および再現性は比較的低い。振とうフラスコおよびバイオリアクター産生モデルで得られる培地サンプルについて、比濁法（このアッセイでは、反応溶液中の不溶性の免疫沈降素により光線シグナルが散乱する）により、ベックマン・コールター・イメージシステム（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）ならびに製造業者の推奨および標準的な方法を用いて、抗体力価を測定した。被験サンプルについて生成されたシグナルを、再度抗体参照標準の希釈系列と比較した。報告するすべての力価は概算である。
【００８８】
１．９ バイオリアクター振とうフラスコモデル（改良無血清バッチ産生モデル）
典型的には、動物由来成分不含培地を含む通気孔付きのフタをした標準的な２５０ｍＬ組織培養振とうフラスコ中、８００，０００細胞／ｍＬで、総容量１２０ｍＬまで、細胞を播種した。続いて、これらのフラスコを二酸化炭素を富化した空気中で振とうしながら、設定された温度でインキュベートし、細胞増殖を促進し、維持した。各クローンについて種々の条件を試験した（例えば、種々の温度条件）。本明細書中で報告する結果では、各クローンについての最も高い力価（標準的な条件にわたる）を例示している。典型的には、本明細書中で報告する産生モデル終点力価は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ）での標準的なＶｉ−Ｃｅｌｌ ＣＨＯパラメータ設定および製造業者の推奨プロトコールを用いたトリパンブルー排除に基づくアッセイにより決定して、細胞生存率が約５０％まで落ちた時点で記録した。典型的には、この終点力価は、１０〜２０日間のインキュベーションの後にもたらされた。
【００８９】
１．１０ バイオリアクター培養法
すべての場合で、標準的なバイオリアクター培養法および装置を用いた。一連のシードを作製するために、典型的には、細胞をより大きな容量までスケールアップし、反復する３日〜４日法で１週間に２回継代した。図１３に示す実験のために、シード細胞を用いて、以下のプロセス条件で駆動された３リットルＡｐｐｌｉｋｏｎ卓上バイオリアクター（実施容量：２Ｌ）に播種した：温度３４℃、ｐＨ設定値６．９５、ＤＯ設定値３０％。振とうフラスコモデルの場合と同様に、細胞生存率が約５０％に落ちるまで培養を続けた。これらのバイオリアクターは、振とうフラスコならびに治験材料等を供給するために用いるさらに大きなバイオリアクターの両方の終点力価を大まかに模倣する。
【００９０】
１．１１ ＲＴ−ＱＰＣＲ解析（結果については、図１０を参照されたい）
ＭａｇＮＡ ＰｕｒｅならびにＲＮＡ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＮＡ単離キットおよびプロトコール（Ｒｏｃｈｅ）を用いる自動化シリカベース抽出により、ＣＨＯ ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＱＰＣＲ反応を行なった。ランダムヘキサマーを用いる逆転写に続いて、ＡＢＩ−７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲ反応を行い、標準的な方法を用いてΔΔＣｔ相対定量アルゴリズムにより解析した。反応を多重にし（１８Ｓ＋標的遺伝子［重鎖／軽鎖］）、ここで最も存在量が多い標的である１８Ｓはプライマーを制限し、標的反応の阻害を妨げた。Ｑ−ＰＣＲに用いたプローブおよび隣接プライマー対を、配列番号１〜９に従って用いた。
【００９１】
上記の重鎖および軽鎖プローブ／プライマーは、実験計画５（ｄ）では上昇したＯＲＦコドン最適化のための使用に好適ではなく、図１０（Ａ）からは排除したことに留意されたい。
【００９２】
１．１２ ウエスタンブロット解析（結果については図１０を参照されたい）
標準的な方法を用い、これは別の文献に詳細に説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上掲）を参照されたい）。簡潔には、ポリクローナルな等価な細胞抽出物を、全細胞溶解およびタンパク質抽出バッファーを用いて作製した。等量の各抽出物を、Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーとともに加熱インキュベートし、次いでＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルにロードし、Ｔｒｉｓ−グリシン泳動バッファーを用いて泳動し、タンパク質画分を分離した。分離したら、続いてタンパク質をニトロセルロースメンブレンに電気的トランスファーブロッティングし、全抗ヒトＩｇＧ（ＨＲＰコンジュゲート化）を用いてプローブ付けした。ＨＲＰ基質とのインキュベーションによりシグナルを生成させ、Ｘ線フィルムに記録した。実験計画５（ａ）のための抗体軽鎖生成物を検出するためには、追加のさらに長い露出が必要であった。
【００９３】
１．１３ 所望の組み換えタンパク質を産生するクローンでのＤＨＦＲレベルを決定するための蛍光メトトレキサート染色
各クローンをメトトレキサートなしで４〜５日間培養した後、１０μＭのＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８−メトトレキサート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ）を、１８〜２２時間、３７℃、５％ＣＯ２で、７００，０００個の生存細胞に添加した。続いて染色した細胞を回収し、培地で洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。回収した細胞を培地で再度洗浄し、培地中に再懸濁し、濾過し、生／死排除色素であるヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）を添加した後、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡで解析した。図１４（Ａ）に示したデータは、ゲートされた生細胞のみのものである。
【００９４】
１．１４ ＤＨＦＲおよびＮｅｏレベルについてのゲノムＤＮＡのｑＰＣＲ解析
Ｑｉａｇｅｎから入手した標準的なキットを用いて、ＣＨＯゲノムＤＮＡ抽出を行なった。分光光度計測定を用いてＤＮＡ定量化および標準化を行なった後、ＡＢＩ−７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲ反応を行い、標準的な方法を用いてΔＣｔ相対定量アルゴリズムにより解析した。Ｑ−ＰＣＲに用いたプローブおよび隣接プライマー対は、配列番号２０〜２５に従い使用した。結果を図１４（Ｂ）に示す。
【００９５】
実施例２．ＣＨＯ細胞でのモノクローナル抗体重鎖および軽鎖の発現
驚くべきことに、高いＣＡＩスコアのＯＲＦではあるが、しかし天然のスコア（すなわち、ＬＣＥ１Ａ；ＮＭ１７８３４８０の後期角化エンベロープなどの最も高い観察される天然のヒトＯＲＦのものよりも低くスコア付けされている）である実験計画５（ｃ）が、実験計画５（ｄ）の天然に存在しない高いＣＡＩスコアのオープンリーディングフレームよりも高い最高力価を生成し、５（ｄ）の高産生細胞の範囲（数）が改善された（表５を参照されたい）。続いて、５（ａ）、（ｃ）および（ｄ）のうち最良のクローンを増幅し、さらに評価した。このさらなる評価のために、５（ａ）のクローンを対照として進め、本明細書中に記載される結果以前に観察された典型的な実験計画力価を代表させた。この実験の結果、予想外に早く、少ない増幅レベルで、実験計画５（ｄ）から、高産生で安定なクローン（力価および増幅は４０回の継代にわたって観察された）がもたらされた。実際、５（ｄ）からの最終的な細胞株を作製するのに必要とされたメトトレキサートのレベルは、実験計画５（ａ）の非コドン最適化オープンリーディングフレームからの同じタンパク質生成物を同様かより低いレベルで発現する等価な細胞株を作製するのに必要とされるレベルと比較して、顕著に低かった（９７％少ないメトトレキサート）（表１を参照されたい）。さらに詳細な解析を実施した。表２〜４を参照されたい。
【００９６】
改変されたＣＡＩスコア付けされたＯＲＦにより生成される得られる組み換えタンパク質の結合特性が、コドン最適化によって変化しているか否かを調べるために、ＣＡＩスコア０．８０９（ＨＣ）／０．７６１（ＬＣ）のＯＲＦ、またはＣＡＩスコア０．９８２（ＨＣ）／０．９７６（ＬＣ）のＯＲＦによりコードされる実験計画５の抗体について、結合特性を比較し、解析した。両方の材料をバイオリアクターで生成し、同様の精製方法により精製した。この比較を通して、抗体の結合特性はこの抗体をコードしたＯＲＦに対するＣＡＩの変化により影響を受けていないことが示された。
【００９７】
実験計画５（ｄ）からの最上位産生クローンであるＯ９７−７（表１に示す）を、細胞株のクローン性を確かなものにするために単一細胞クローン化し、最良のサブクローンにより得られた力価は、非クローン化親細胞と比較して、無血清改良バッチ培養において２倍近い増加をもたらした。図１３に示されている力価は、１．１０に記載されているような、２つの別個の３リットルＡｐｐｌｉｋｏｎ卓上バイオリアクターでの無血清バッチ培養によりもたらされた。
【００９８】
表１
各実験計画について、引き続くさらなる開発およびバンク化のために選択した最終的なクローンを示す。細胞株開発の各段階での各最終クローンについて生成された９６ウェル力価（ｎｇ／ｍＬ）も強調してある。本明細書中に記載される結果以前に得られた典型的なデータは、抗体実験計画１、２、３および４として代表される。実験計画２と実験計画４とは、同じ生成物を発現することに留意されたい。実験計画２および４に関して、すべての実験は、同じベクター、宿主細胞およびプロトコールを用いて、しかし異なる実験者および装置を用いて、２つの独立した研究室で実施した。０、５、５０および１５０ｎＭ ＭＴＸでの、以下に示すすべての力価は、９６ウェル段階で得られたものである。より高い力価はバッチ産生モデルで顕著な改善を示さなかったので、より低いＭＴＸのクローンを進めた（表２を参照されたい）。ＦＩＯ＝情報としてのみ、必要ではない。実験計画６（ａ）は、実験計画６（ｂ）〜６（ｄ）からのよりよい力価によって、プラトーに達する前に中止された。
【表２】
【００９９】
表５
標準的トランスフェクションにより作製された非増幅細胞と、選択プロトコールにより作製され、続いてヌクレオシド除去およびＧ４１８添加により選択された非増幅細胞との比較である。すべての細胞株は、（実験計画５の）同じ抗体を発現する同じベクターであるが、抗体が、異なるＣＡＩスコアを有してこれをコードするオープンリーディングフレームから発現されるベクターを含んでいる。実験計画５（ａ）（非最適化）のために、３回のさらなるトランスフェクションを実施したが、結果が基本的にバックグラウンドであったため、示していない。図（Ａ）では、「５ｎｇを超える力価の％」とは、スクリーニング後に５ｎｇ／ｍＬを超える力価を示したウェルの割合（％）を意味し、「５０ｎｇ／ｍＬを超える力価の％」とは、スクリーニング後に５０ｎｇ／ｍＬを超える力価を示したウェルの割合（％）を意味する。「最上位力価」とは、スクリーニングしたすべてのうちで最高スコアの力価を意味する。「５０位値」とは、スクリーニングした５０番目に高い力価を意味する。「２０位値」とは、スクリーニングした２０番目に高い力価を意味する。（Ｂ）では、（Ａ）で報告した最上位、２０位および５０位の力価をヒストグラム形式で表している。
【表３】
【０１００】
表３
表１の実験計画の９６ウェルプレートでの詳細な力価分析である。Ｇ４１８添加およびヌクレオシド除去選択後であるが、メトトレキサート添加を用いていない、最良クローンおよび５０番目によいクローンの力価を示している。
【表４】
【０１０１】
表４
実験計画５および６で観察された上位２０〜１００位のクローンを、続いて６ウェルディッシュまでスケールアップし、その後、５ｎＭメトトレキサートを含有する培地中で９６ウェルプレートに再度播種した。９６ウェルディッシュで、５ｎＭ（Ａ１）および５０ｎＭ（Ａ２）濃度のメトトレキサート抗葉酸剤で選択した、実験５および６で観察された増殖中のクローンの平均力価および最高力価を示す。
【表５】
【０１０２】
表２
産生プラトーの実施例である。実施例（Ａ）：実験計画５（ｄ）のために最終的に選択したクローンを、５０ｎＭのＭＴＸ中でさらに増幅した。親クローン（網かけ）の無血清産生モデル力価および得られた「増幅」娘クローンの最高力価を示す。同様の実施例（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）も示す。各実施例について、さらなる増幅後の娘クローンの最高力価を記録している。
【０１０３】
これにより、より早くより高い力価に到達することが、さらなる増幅ラウンドを通じてより高い力価に到達させようと試みることよりも、有益であることが示されている。
【表６】
【０１０４】
実施例３．抗体６および７ならびにＥＦ−１ａプロモーター
抗体６のために重鎖および軽鎖の両方のオープンリーディングフレームのコドン最適化を実施し、ＯＲＦにわたって０．９を超える最終的なＣＡＩスコアを再びもたらした（表１を参照されたい）。野生型／出発オープンリーディングフレームおよびコドン最適化オープンリーディングフレームを、ＲＳＶに基づくプロモーター発現ベクターならびにヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１ａ）プロモーターに基づく発現ベクター（ｃｉｓ作用インスレーター、エンハンサーおよびプロモーター発現エレメントを代わりに非ウイルス性プロモーター供給源から供給している）で発現させた。この実験の結果はまた、所望のタンパク質のオープンリーディングフレームを最初にコドン最適化した場合、最終的な高産生細胞株を得るのに、顕著に少ないメトトレキサートが必要であったことを実証した。実際に、抗体６が非最適化ＯＲＦ（すなわち、０．９未満のＣＡＩスコア）によりコードされていたトランスフェクション６（ａ）は、産生プラトー付近の細胞の作製前に、５ｎＭ ＭＴＸの段階で中止された。０．９を超えるＯＲＦを用いた細胞株（すなわち、トランスフェクション６（ｂ）および６（ｄ））からすでに得られていた収量と比較して、同等なタンパク質収量を産生することが可能な細胞株を作製するのには、顕著により多くの資源および時間が必要であろうことが明らかであったので、トランスフェクション６（ａ）では増幅法をさらに行なわなかった。さらに、コドン最適化ありまたはなしの同一条件のベクターを比較した場合、コドン最適化は常に、必要とされる抗葉酸剤レベルを低減させたことが観察された。また、実験計画７のために、実験計画６と同様にしてコドン最適化を実施し（表１を参照されたい）、コドン最適化したＯＲＦ（０．９を超えるＣＡＩ）を、ＲＳＶならびにＥＦ−１ａプロモーターに基づく発現ベクターで発現させた。またしても、プロモーターに関係なく、ＣＡＩ最適化ＯＲＦからは、組み換え産物をコードするために非最適化ＯＲＦを用いたすべての以前の実験計画と比較して、同等の高収量細胞株が、より早い時間で、より少ないメトトレキサートを用いて作製された（表１にまとめてある）。
【０１０５】
実施例４．ｍＲＮＡレベル
この方法についてさらに研究するために、生成されるｍＲＮＡのレベルに対するコドン最適化の影響を、同じベクターから、しかし異なるＣＡＩスコアを示すオープンリーディングフレームからの同じ生成物（実験計画５の抗体）を発現する同一条件のポリクローナル細胞集団で調べた。
【０１０６】
ＣＨＯ細胞を、同じタンパク質生成物（実験計画５の抗体）をコードする、重鎖（ＨＣ）コード発現ベクターおよび軽鎖（ＬＣ）コード発現ベクターで共トランスフェクションした。各トランスフェクション集団は、ポリクローナルなプールとして維持した。各ベクター対は、同じ抗体重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）をコードするが、異なるＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームからのものである。
【０１０７】
この実験の結果は、図１０に示され、重鎖および軽鎖メッセンジャーの両方について、非最適化対照と比較してＣＡＩスコアが上昇している場合、ｍＲＮＡレベルの顕著な増加倍率が観察されることを明らかにしている。ＲＮＡレベルの同等な上昇（出発非最適化配列と比較して）が、解析したすべての最適化配列で生じた。同様に、またウエスタンブロットアッセイの範囲内で、すべての最適化配列について、細胞内タンパク質レベルの同等な上昇が見られた。しかしながら、細胞内タンパク質レベルではそのような同等性が見られたものの、分泌されるレベルには差異があった。天然に存在しない高いＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを含む細胞は、より高いポリクローナル力価をもたらした。このことはさらに、細胞株開発プロトコールで天然に存在しない高いＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを用いる場合、高産生クローンの範囲が改善されるとの知見を支持するものである。
【０１０８】
図１０
（Ａ）：ＲＴ−ＱＰＣＲにより測定したＨＣおよびＬＣメッセンジャーの細胞内ＲＮＡレベルである：リボソームＲＮＡに対して標準化したすべてのシグナルおよび増加倍率は、非コドン最適化オープンリーディングフレームによりコードされる出発ＨＣおよびＬＣについて生成されたシグナルに対するものである。Ｙ軸：ＲＮＡシグナルの０〜５０倍増加にわたる値である。Ｘ軸：ａ（ｈ）は、非トランスフェクション細胞から取得したＲＮＡ抽出物から生成された陰性対照ＨＣシグナル（二重）を表す；ｂ（ｈ）は、実験計画５（ａ）について用いたのと同様の非コドン最適化ＨＣおよびＬＣ発現ベクター（ＣＡＩスコアは、ＨＣについて０．８０９、ＬＣについて０．７６１）でトランスフェクションした細胞に由来するＲＮＡ抽出物から生成されたＨＣシグナルを表す；ｃ（ｈ）は、実験計画５（ｂ）で用いたのと同様のコドン最適化ＨＣおよびＬＣ発現ベクター（ＣＡＩスコアは、ＨＣについて０．８４７、ＬＣについて０．８３３）でトランスフェクションした細胞に由来するＲＮＡ抽出物から生成されたＨＣシグナルを表す；ｄ（ｈ）は、実験計画５（ｃ）で用いたのと同様のさらなるコドン最適化ＨＣおよびＬＣ発現ベクター（ＣＡＩスコアは、ＨＣについて０．８７２、ＬＣについて０．８９４）でトランスフェクションした細胞に由来するＲＮＡ抽出物から生成されたＨＣシグナルを表す。上記のものと同じＲＮＡ抽出物から生成された軽鎖シグナルは、ａ（ｌ）、ｂ（ｌ）、ｃ（ｌ）およびｄ（ｌ）にそれぞれ示されている。
【０１０９】
（Ｂ）：ウエスタンブロット分析：同等の細胞抽出物をＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離し、ブロッティングし、抗生成物抗体（ＨＲＰコンジュゲート化）で標識した。非トランスフェクション細胞の対照をレーン１に示す。生成物である重鎖および軽鎖オープンリーディングフレームを発現するポリクローナル細胞は以下のとおりである：レーン２および３：ＨＣ（ＣＡＩスコア０．８０９）およびＬＣ（ＣＡＩスコア０．７６１）（上記の実験ｂ（ｈ）およびｂ（ｌ）から発現されたタンパク質、実験計画５（ａ）で用いたのと等価なベクター）；レーン４および５：ＨＣ（ＣＡＩスコア０．８４７）およびＬＣ（ＣＡＩスコア０．８３３）（上記の実験ｃ（ｈ）およびｃ（ｌ）から発現されたタンパク質、実験計画５（ｂ）で用いたのと等価なベクター）；レーン６および７：ＨＣ（ＣＡＩスコア０．８７２）およびＬＣ（ＣＡＩスコア０．８９４）（上記の実験ｄ（ｈ）およびｄ（ｌ）から発現されたタンパク質、実験計画５（ｃ）で用いたのと等価なベクター）；レーン８および９：ＨＣ（ＣＡＩスコア０．９８２）およびＬＣ（ＣＡＩスコア０．９７６）（実験計画５（ｄ）で用いたものと等価なベクターにより発現されるタンパク質）。
【０１１０】
（Ｃ）：図１０（Ｂ）に記載されるポリクローナル細胞についての、ｎｇ／ｍＬで示される２４時間生成物力価を示す。
【０１１１】
実施例５．高ＣＡＩを達成するための種々の方法。実施例（ａ）実験計画８および実施例（ｂ）実験計画９
（ａ）実験計画８のために、Ｌｅｔｏソフトウェアを用いて可変ドメインを設計した。続いて、それらを、実験計画７のために予め作製した同一の定常ドメインと、標準的な制限酵素消化・ライゲーション法を用いて融合させた。得られた重鎖および軽鎖ＯＲＦのスコアは、それぞれ０．９５４および０．９１９であった。次に、これらを細胞株開発計画に用い、またしても、これまでにコドン最適化前に用いたどれよりも、より早い時間枠で、より少ないメトトレキサートで、高収量細胞株がもたらされた（表１を参照されたい）。
【０１１２】
（ｂ）実験計画９のために、Ｌｅｔｏソフトウェアを再び用いて、可変ドメインを設計した。続いて、これらを、実験計画６（ｄ）のために予め作製した同一の定常ドメインと、標準的な制限酵素消化・ライゲーション法を用いて融合させた。得られた重鎖および軽鎖ＯＲＦのスコアは、それぞれ０．９７５および０．９７３であった。次に、これらを細胞株開発計画に用い、またしても、これまでにコドン最適化前に用いたどれよりも、より早い時間枠で、より少ないメトトレキサートで、高収量細胞株がもたらされた（表１を参照されたい）。
【０１１３】
実施例６．グリコシル化に対する影響
両方の状況で、発現のために同じ宿主、培養培地およびＤＨＦＲ選択・増幅系を用いたにもかかわらず、非最適化オープンリーディングフレームから発現させた場合に生成されるレベルと比較して、コドン最適化オープンリーディングフレームから発現させた場合に、非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）のレベルが顕著に低いことが明らかになった。さらに興味深いことに、同様な高レベルのＮＧＨＣは、同じ非最適化オープンリーディングフレームを、異なる培養条件および異なるベクター、選択・増幅法（グルタミン合成酵素／ＭＳＸ）を用いて異なる宿主細胞で代わりに発現させた場合にも見られた（図１２を参照されたい）。オープンリーディングフレームのコドン最適化と非グリコシル化重鎖の低下したレベルとのこの相関は、オープンリーディングフレームのＣＡＩスコアを上昇させることによって、生成物の全体的な品質も向上させられることを明らかにする。
【０１１４】
６．１ Ｌｏｎｚａ ＣＨＯＫ１ＳＶおよびグルタミン合成酵素選択系を用いる細胞株開発（図１２）
ベクター構築および細胞株開発は、推奨されたＬｏｎｚａ（Ｓｌｏｕｇｈ）プロトコールに従い実施した。すべての場合で、用いた培地はＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。非最適化オープンリーディングフレームを有する抗体実験計画５（ａ）で用いたオープンリーディンフレームを、最初にＬｏｎｚａベクターｐＥＥ１４．４（軽鎖に対して）およびｐＥＥ６．４（重鎖に対して）にサブクローニングした。続いて、これらのベクターを推奨Ｌｏｚａプロトコールに従って組み合わせて、重鎖及び軽鎖を発現する単一の二遺伝子ベクターにした。次に、このベクターを、Ｌｏｎｚａ推奨使用説明書に従って、エレクトロポレーションを用いて、ＣＨＯＫ１ＳＶ宿主細胞と名付けられたＬｏｎｚａ懸濁液適合ＣＨＯＫ１株に送達し、これもまた推奨であるグルタミン除去およびＭＳＸの添加を用いて、選択および増幅した。得られたクローンを９６ウェルで力価測定し、最良クローンを振とうフラスコにスケールアップして、さらに評価した。最良クローンを選択し、大規模バイオリアクターで生成物を生成した。このアプローチに関するさらなる一般的な詳細については、ｄｅ Ｌａ Ｃｒｕｚ Ｅｄｍｏｎｄｓら、２００６ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：１７９−１９０を参照されたい。
【０１１５】
６．２ 生成物ＮＧＨＣ分析
プロテインＡカラムを用いて、培養上清からタンパク質を精製した。次に、生成物をＳＤＳキャピラリー電気泳動バイオアナライザーラボチップ（Lab-on-a-chip）装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，英国）を用いて、還元条件下で、製造業者のプロトコールに従って分析した。非グリコシル化重鎖は、主要なグリコシル化重鎖分子種と比較してわずかに速く移動する分子種として観察される（図１２Ｂを参照されたい）。
【０１１６】
図１２：表（Ａ）は、すべての分析からの代表的なデータを示す。異なる宿主細胞、ベクター、培地および培養法を用いて異なる選択・増幅プロトコール（グルタミン合成酵素／メトトレキサート）で非最適化オープンリーディングフレームを発現させるために実施した追加の実験も含められている（上記の実施例６．１を参照されたい）。（Ｂ）出発非最適化ＯＲＦおよびコドン最適化ＯＲＦから観察された例示的なＮＧＨＣトレースを示す。この分析は、同等の規模（１０００リットル）のバイオリアクターから精製した生成物について実施した。これらの代表的なトレースの重ね合わせでは、非最適化ＯＲＦ（ＣＡＩ：ＨＣ ０．８０９、ＬＣ ０．７６１）からの生成物を発現するバイオリアクター細胞培養の回収物は、最適化したＯＲＦ（ＣＡＩ：ＨＣ ０．９８２、ＬＣ ０．９７６）から生成される生成物（わずか１．５％の非グリコシル化重鎖を含んでいた）と比較して、低下したグリコシル化部位占有率を有する重鎖をもたらした（１０％の非グリコシル化重鎖）。
【０１１７】
実施例７．最終的な細胞株での選択・増幅薬剤のレベルに対する影響
ＤＨＦＲ選択系での漸増量のＭＴＸ選択・増幅薬剤の追加のまたは段階的な力価測定を、遺伝子コピー数の増加により発現を増加させるために行なう。トランスフェクションされたプラスミドＤＮＡの遺伝子コピー数に対するコドン最適化の影響を調べるために、２種類の異なる半定量法を用いた（実験の説明については、１．１３節および１．１４節を参照されたい）。
【０１１８】
まず、ＦＡＣＳ解析を用いた。この目的のために、実験計画２、３、４、５（ｄ）、６（ｄ）および７（ｂ）について、最終的な細胞株またはその単一細胞クローンを蛍光メトトレキサートで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。結果（図１４Ａに示されている）から、平均蛍光強度により示されるメトトレキサートのレベル、およびしたがってＤＨＦＲのレベルが、細胞株の増幅レベルと相関することが実証され、すなわち、５ｎＭ ＭＴＸで選択された最終的な細胞株（実験計画５（ｄ）、６（ｄ）および７（ｄ））が最も低いＤＨＦＲレベルを有し、１５０ｎＭ ＭＴＸで選択された最終的な細胞株（実験計画３）が最も高いＤＨＦＲレベルを有する。さらに、ＤＨＦＲおよびＮｅｏについてのｑＰＣＲを、実験計画３、４、５（ａ）、５（ｄ）、７（ｂ）および９についての最終的な細胞株またはその単一細胞クローンから抽出されたゲノムＤＮＡに対して実施した。結果（図１４Ｂに示す）から、５ｎＭ ＭＴＸで選択された株（実験計画５（ｄ）、７（ｂ）および９）が、１５０ｎＭ ＭＴＸで選択された株（実験計画３、４および５（ａ））よりも、顕著に低いＤＨＦＲおよびＮｅｏのＤＮＡレベルを、したがってより少ないコピー数を有していることが実証される。
【０１１９】
上述の結果から、コドン最適化ＯＲＦ（この実施例については、実験計画５（ｄ）、６（ｄ）、７（ｂ）および９）から誘導された細胞株は、非最適化ＯＲＦから誘導された株（この実施例については、実験計画２、３、４、５（ａ））と比較して少ない遺伝子コピー数を有していることが実証される。したがって、コドン最適化ＯＲＦ（ＣＡＩ＞０．９）の使用は、（非最適化ＯＲＦから誘導された細胞株と比較した場合）同等またはより高い力価を有し、より低いレベルの増幅で、より少ないコピー数のトランスフェクションＤＮＡでの細胞株の作製をもたらす。より少ないコピー数、より少ない増幅された発現ベクターからの同等またはより高いレベルの抗体を生成するクローンの作製は、非常に望ましい。例えば、組み込まれた発現ベクターのコピー数が増加したときに、反復配列誘発遺伝子サイレンシング（ＲＩＧＳ）が誘導される場合があり、そのようなＲＩＧＳは翻って哺乳動物細胞でのそのようなベクターからの発現レベルの低下をもたらし得ることが示されている（例えば、ＭｃＢｕｒｎｅｙ ＭＷ ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００２ ２７４：１−８を参照されたい）。
【０１２０】
図１４（Ａ）：実験計画２、３、４、５（ｄ）、６（ｄ）および７（ｂ）の各々に対する最終的な細胞株について観察された平均蛍光のプロットである。ＤＨＦＲに対する細胞染色は、材料および方法、実施例１に記載されているとおりに行なった。（Ｂ）：実験計画３、４、５（ａ）、５（ｄ）、７（ｂ）および９に対する最終的な細胞株からのゲノムＤＮＡに対するｑＰＣＲによる、ＤＨＦＲおよびＮｅｏ ＤＮＡのレベルを示す。ｑＰＣＲは、材料および方法、実施例１に記載されているとおりに行なった。観察された基準レベルに対して、ＤＨＦＲおよびＮｅｏについての最も低い値（実験計画７（ｂ）で見られた）を１に設定し、すべての他の値をそれ以上の相対的増加倍率としてプロットした。各値の下には、解析された細胞株により発現されるタンパク質が０．９を超えるＣＡＩを有するＯＲＦからのものであるか否か（Ｙ＝Ｙｅｓ、Ｎ＝Ｎｏ）、および該細胞株を作製するのに必要とされたＭＴＸレベル（ｎＭ ＭＴＸ）も示している。
【表７】
【０１２１】
配列番号１
【０１２２】
配列番号２
【０１２３】
配列番号３
【０１２４】
配列番号４
【０１２５】
配列番号５
【０１２６】
配列番号６
【０１２７】
配列番号７
【０１２８】
配列番号８
【０１２９】
配列番号９
【０１３０】
配列番号１０
【０１３１】
配列番号１１
【０１３２】
配列番号１２
【０１３３】
配列番号１３
【０１３４】
配列番号１４
【０１３５】
配列番号１５
【０１３６】
配列番号１６
【０１３７】
配列番号１７
【０１３８】
配列番号１８
【０１３９】
配列番号１９
【０１４０】
配列番号２０
【０１４１】
配列番号２１
【０１４２】
配列番号２２
【０１４３】
配列番号２３
【０１４４】
配列番号２４
【０１４５】
配列番号２５
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質を産生する細胞株を作製する方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも１種の治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
（ｂ）第１のポリヌクレオチド配列を改変して第２のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が、第１のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数より大きく、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは同じ治療用タンパク質をコードするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の第２のポリヌクレオチド配列および細胞内で第２のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列で少なくとも１つの細胞を形質転換するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の第３のポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーを不十分なレベルで発現する細胞株で細胞の増殖を阻害する選択薬剤濃度を含有する培地中で、ステップ（ｃ）の少なくとも１つの細胞を増殖させ、複数の細胞を含む第１の細胞株を作製するステップであって、それにより、第１のポリヌクレオチドで形質転換した細胞株で産生される該タンパク質の同等な産生プラトーに達するのに必要とされるであろうよりも、少ない増幅ラウンドで、かつ／または低い選択薬剤濃度で、第２のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
第１の細胞株をバイオリアクター中で培養し、産生される前記治療用タンパク質を精製する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が０．９より大きい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
選択薬剤レベルが、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して５０％未満まで低下する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
選択薬剤レベルが、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して２５％未満まで低下する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
選択薬剤レベルが、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して５％未満まで低下する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
選択薬剤レベルが、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して３％未満まで低下する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
治療用タンパク質を産生する細胞株を作製する方法であって、以下のステップ：
（ａ）治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、該ポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が０．９より大きいステップ、
（ｂ）該治療用タンパク質をコードする該ポリヌクレオチド配列および細胞株で該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第２のポリヌクレオチド配列で細胞株を形質転換するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の該ポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーを不十分なレベルで発現する細胞の増殖を阻害する上昇濃度または漸増濃度の選択薬剤を含有する培地中で、形質転換された細胞株を増殖させるステップであって、それにより、治療用タンパク質をコードし、０．９未満のコドン最適化指数スコアを有するポリヌクレオチド配列で形質転換した細胞株からの該治療用タンパク質の同じ収量を達成するのに必要とされる濃度と比較して、培地中の選択薬剤濃度が低下するステップ
を含む、上記方法。
【請求項９】
前記治療用タンパク質が、抗体、その誘導体または抗原結合性断片である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療用タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
形質転換される細胞株が、内在性細胞性酵素の破壊または阻害により、代謝的に欠陥がある、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
形質転換される細胞株が、ヌクレオシド合成経路に欠陥がある、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするポリヌクレオチドであり、前記選択薬剤が抗葉酸剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗葉酸剤がメトトレキサートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択マーカーがグルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドであり、前記選択薬剤がメチオニンスルホキシミンである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質産生プラトーに達するのに１回の増幅ラウンドしか必要とされない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
最終的な収量が無血清バッチにおいて０．５ｇ／Ｌより多い、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
用いるＭＴＸ濃度が５０ｎＭ未満である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
用いるＭＴＸ濃度が５ｎＭである、請求項１〜１４および１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞株がＣＨＯまたはＮＳ０である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１のポリヌクレオチド配列よりも大きなコドン最適化指数を有する第２のポリヌクレオチド配列で形質転換された第２の細胞株であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは同じ治療用タンパク質をコードし、該細胞株は第１のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含み、該第２の細胞株は、両者を選択培地中で増殖させたときに該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドで形質転換された第１の細胞株と比較して該治療用タンパク質をより高収量で産生する、上記細胞株。
【請求項２３】
治療用タンパク質をコードし、０．９より大きなコドン最適化指数を有する第２のポリヌクレオチド配列で形質転換され、第２のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む第２の細胞株であって、該第２の細胞株は、該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドで形質転換された第１の細胞株と比較してより高収量の該治療用タンパク質を産生し、該第１のポリヌクレオチドは０．９未満のコドン最適化指数を有する、上記細胞株。
【請求項２４】
０．９を超えるＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを含む少なくとも１つの発現カセット、および増幅・選択マーカーを含む第２の発現カセットを含むベクター。
【請求項２５】
宿主細胞に含まれる、０．９を超えるＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを含む増幅された発現カセットであって、増幅・選択マーカーを含む第２の発現カセットに機能的に連結されている、上記発現カセット。
【請求項２６】
請求項２４に記載のベクターまたは請求項２５に記載の発現カセットを含む細胞株。
【請求項２７】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法により取得可能な細胞株またはその子孫。
【請求項２８】
０．９より大きなＣＡＩスコアを有する、増幅・選択マーカーに機能的に連結されたオープンリーディングフレームを含む細胞株。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法により生成される抗体であって、生成された抗体が少なくとも１つの重鎖を含み、５％以下の非グリコシル化重鎖を有する、上記抗体。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が９５％グリコシル化されている、上記抗体。
【請求項３１】
請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が９６％グリコシル化されている、上記抗体。
【請求項３２】
請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が９７％グリコシル化されている、上記抗体。
【請求項３３】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が９８％グリコシル化されている、上記抗体。
【請求項３４】
モノクローナルである、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３５】
抗β−アミロイド抗体である、請求項３３または３４に記載の抗体。
【請求項３６】
配列番号１８の重鎖配列および配列番号１９の軽鎖配列を有する、請求項３５に記載の抗体。
【請求項１】
治療用タンパク質を産生する細胞株を作製する方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも１種の治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列を取得するステップ、
（ｂ）第１のポリヌクレオチド配列を改変して第２のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が、第１のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数より大きく、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは同じ治療用タンパク質をコードするステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の第２のポリヌクレオチド配列および細胞内で第２のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列で少なくとも１つの細胞を形質転換するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の第３のポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーを不十分なレベルで発現する細胞株で細胞の増殖を阻害する選択薬剤濃度を含有する培地中で、ステップ（ｃ）の少なくとも１つの細胞を増殖させ、複数の細胞を含む第１の細胞株を作製するステップであって、それにより、第１のポリヌクレオチドで形質転換した細胞株で産生される該タンパク質の同等な産生プラトーに達するのに必要とされるであろうよりも、少ない増幅ラウンドで、かつ／または低い選択薬剤濃度で、第２のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生プラトーに達するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
第１の細胞株をバイオリアクター中で培養し、産生される前記治療用タンパク質を精製する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２のポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が０．９より大きい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
選択薬剤レベルが、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して５０％未満まで低下する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
選択薬剤レベルが、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して２５％未満まで低下する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
選択薬剤レベルが、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して５％未満まで低下する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
選択薬剤レベルが、第１のポリヌクレオチド配列を用いる同じ方法のために使用される選択薬剤の量と比較して３％未満まで低下する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
治療用タンパク質を産生する細胞株を作製する方法であって、以下のステップ：
（ａ）治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列を取得するステップであって、該ポリヌクレオチド配列のコドン最適化指数が０．９より大きいステップ、
（ｂ）該治療用タンパク質をコードする該ポリヌクレオチド配列および細胞株で該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第２のポリヌクレオチド配列で細胞株を形質転換するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の該ポリヌクレオチドによりコードされる選択マーカーを不十分なレベルで発現する細胞の増殖を阻害する上昇濃度または漸増濃度の選択薬剤を含有する培地中で、形質転換された細胞株を増殖させるステップであって、それにより、治療用タンパク質をコードし、０．９未満のコドン最適化指数スコアを有するポリヌクレオチド配列で形質転換した細胞株からの該治療用タンパク質の同じ収量を達成するのに必要とされる濃度と比較して、培地中の選択薬剤濃度が低下するステップ
を含む、上記方法。
【請求項９】
前記治療用タンパク質が、抗体、その誘導体または抗原結合性断片である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療用タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
形質転換される細胞株が、内在性細胞性酵素の破壊または阻害により、代謝的に欠陥がある、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
形質転換される細胞株が、ヌクレオシド合成経路に欠陥がある、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードするポリヌクレオチドであり、前記選択薬剤が抗葉酸剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗葉酸剤がメトトレキサートである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択マーカーがグルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチドであり、前記選択薬剤がメチオニンスルホキシミンである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質産生プラトーに達するのに１回の増幅ラウンドしか必要とされない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
最終的な収量が無血清バッチにおいて０．５ｇ／Ｌより多い、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
用いるＭＴＸ濃度が５０ｎＭ未満である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
用いるＭＴＸ濃度が５ｎＭである、請求項１〜１４および１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞株がＣＨＯまたはＮＳ０である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１のポリヌクレオチド配列よりも大きなコドン最適化指数を有する第２のポリヌクレオチド配列で形質転換された第２の細胞株であって、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは同じ治療用タンパク質をコードし、該細胞株は第１のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含み、該第２の細胞株は、両者を選択培地中で増殖させたときに該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドで形質転換された第１の細胞株と比較して該治療用タンパク質をより高収量で産生する、上記細胞株。
【請求項２３】
治療用タンパク質をコードし、０．９より大きなコドン最適化指数を有する第２のポリヌクレオチド配列で形質転換され、第２のポリヌクレオチド配列の増幅をもたらすことが可能な選択マーカーをコードする第３のポリヌクレオチド配列をさらに含む第２の細胞株であって、該第２の細胞株は、該治療用タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドで形質転換された第１の細胞株と比較してより高収量の該治療用タンパク質を産生し、該第１のポリヌクレオチドは０．９未満のコドン最適化指数を有する、上記細胞株。
【請求項２４】
０．９を超えるＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを含む少なくとも１つの発現カセット、および増幅・選択マーカーを含む第２の発現カセットを含むベクター。
【請求項２５】
宿主細胞に含まれる、０．９を超えるＣＡＩスコアを有するオープンリーディングフレームを含む増幅された発現カセットであって、増幅・選択マーカーを含む第２の発現カセットに機能的に連結されている、上記発現カセット。
【請求項２６】
請求項２４に記載のベクターまたは請求項２５に記載の発現カセットを含む細胞株。
【請求項２７】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法により取得可能な細胞株またはその子孫。
【請求項２８】
０．９より大きなＣＡＩスコアを有する、増幅・選択マーカーに機能的に連結されたオープンリーディングフレームを含む細胞株。
【請求項２９】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法により生成される抗体であって、生成された抗体が少なくとも１つの重鎖を含み、５％以下の非グリコシル化重鎖を有する、上記抗体。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が９５％グリコシル化されている、上記抗体。
【請求項３１】
請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が９６％グリコシル化されている、上記抗体。
【請求項３２】
請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が９７％グリコシル化されている、上記抗体。
【請求項３３】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて生成される抗体であって、該抗体の重鎖が９８％グリコシル化されている、上記抗体。
【請求項３４】
モノクローナルである、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３５】
抗β−アミロイド抗体である、請求項３３または３４に記載の抗体。
【請求項３６】
配列番号１８の重鎖配列および配列番号１９の軽鎖配列を有する、請求項３５に記載の抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５３６３５８（Ｐ２０１０−５３６３５８Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２１４０９（Ｐ２０１０−５２１４０９）
【出願日】平成２０年８月１９日（２００８．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０８３４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４５６７
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１９日（２００８．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０８３４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４５６７
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（３９７００９９３４）グラクソ グループ リミテッド (832)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯ ＧＲＯＵＰ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ
【Ｆターム（参考）】
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