複合体および生産方法
分子内ジスルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミン（例：ヒトαー−ラクトアルブミン）の配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、オレイン酸と接触させることからなる生物学的に活性な複合体を調製する方法と、かかる生物学的に活性な複合体を調製するためのプロセスとを説明し、権利請求する。かかる組換えタンパク質では、天然タンパク質に見出されるシステインが、アラニン等の他のアミノ酸に変化されている。組換え発現、プロセス合理化、および生物学的に活性な複合体の収率の改善と、得られた複合体についても説明し、権利請求する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用のタンパク質複合体の調製方法および該方法に使用される装置および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えα−ラクトアルブミンの変異型が当該技術分野で周知である。フォールドされかつ溶融された球状型に見出される特性の多くは、天然タンパク質に類似することが判明しているが、変異型では安定性が一般に低下することが一般に認められている。α−ラクトアルブミンはそれ自体、部分的に展開されるか溶融された球状の状態で、生物学的に活性な複合体を形成するために以前は使用されていた（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Svensson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97(8) 4221-4226
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、出願人は、特定のタイプの組換えタンパク質が、核磁気共鳴によって実証されるような、固有の組成の特徴および構造を備えた治療上活性な複合体を生産するために使用可能であることを見出した。複合体は、かかる特徴および構造の違いにもかかわらず有用な生物活性を有し、更に、効率的に調製することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明によれば、生物学的に活性な複合体を生産する方法であって、分子内ジスルフィド結合または架橋を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、生物学的に活性な複合体が形成される条件下で、オレイン酸と接触させること、および前記複合体を分離すること、からなる方法が提供される。
【０００６】
組換えタンパク質が分子内ジスルフィド架橋を欠くことを確実にすることにより、該タンパク質分子は、三次元的に非天然型となり、元の内因性生物活性の点で完全に不活性となる。これは例えば、天然α−ラクトアルブミン中のシステイン残基を他の残基（特にはアラニン残基）に変化させることにより達成されるが、他の手段、例えばチオ−ル化合物の添加またはタンパク質のｐＨの変更も考慮され得る。好ましくは、すべてのシステイン残基がアラニン残基等の他の残基に変化される。
【０００７】
本明細書に使用する場合、「生物学的に活性」という語句は、複合体が（特にはアポトーシスにより）腫瘍細胞死を引き起こすか、天然モノマ−のα−ラクトアルブミン型では見られない殺菌効果を奏するかの少なくともいずれかが可能であることを意味する。
【０００８】
用語「そのフラグメント（α−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質のフラグメント）」は、完全なα−ラクトアルブミンのアミノ酸配列を含む複合体と同様な活性を有する複合体を形成する、所与のアミノ酸配列の任意の部分を指す。フラグメントは、ともに連結された、完全長タンパク質の２つ以上の部分を含んでもよい。部分は、適切には、基本配列からの少なくとも５個、好ましくは１０個の連続するアミノ酸を含むだろう。
【０００９】
適切なフラグメントは、長さが少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む欠失変異体である。これらはタンパク質からの複数の小領域または該領域の組み合わせを含む。
【００１０】
適切なフラグメントは、αドメインとβドメイン間の接点（インタ−フェイス）を形成する部位を含む。かかる部位は、ヒトα−ラクトアルブミンでは、構造中の３４−３８位および８２−８６位のアミノ酸により定義される。したがって、適切なフラグメントはかかる部位、好ましくは天然タンパク質の３４−８６位のアミノ酸の全部位を含む。しかしながら、他の活性フラグメントが見出されてもよい。
【００１１】
特には、組換えタンパク質は、ヒトα−ラクトアルブミンの配列に基づくが、ウシまたはヒツジのα−ラクトアルブミンを含む他の供給源由来のα−ラクトアルブミンを組換えタンパク質を得るために使用されてもよい。
【００１２】
組換えタンパク質とオレイン酸を、生物学的に活性な複合体に変換するために使用可能な方法は、例えばＷＯ９９／２６９７９およびＷＯ２００８／１３８３４８で説明されているものと類似している。両文献の内容は引用により本明細書に組み込む。しかしながら、本発明の方法によれば、明確な生物学的に活性な生成物が、良好な収率でより容易に入手可能である。
【００１３】
詳細には、本発明の方法を使用する場合、高収率の生物学的に活性な複合体が、特に、カラムから溶出する単一分画から、好都合に得られ、長期間のフォールディング（折り畳み）プロセスは必要ない。
【００１４】
上記に定義される組換えタンパク質は、イオン交換カラム、特にはＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍカラム（ＢｉｏＳｅｐｒａより入手可能、フランス国Ｖｉｌｌｅ−ｎｅｕｆ所在）等の陰イオン交換カラムでイオン交換が起こる条件下で、オレイン酸と適切に接触させられる。組換えタンパク質がカラムにかけられる前に、カラムはオレイン酸で適切に「事前調整（precondition）される。かかる事前調整は、まずオレイン酸でカラムを溶出するかまたは調整することにより達成され得る。適切には、オレイン酸は、ＤＥＡＥ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ等の新品の未使用のイオン交換材料を含むカラムを通して溶出される。適切な溶出緩衝液は、８．５ｐＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含む。このようにカラムに適用されるオレイン酸組成の量は、カラムのサイズや、生物学的に活性な複合体に変換されるのに必要な組換えタンパク質の量等の要因に基づいて、少なくすることが可能である。例えば、１４ｃｍ×１．６ｃｍのカラムを調整するためには、たった１０ｍｇのオレイン酸を使用すればよい。
【００１５】
組換えタンパク質をカラムに適用した後（例えば適切な緩衝液の溶液に溶かして）、これを直線の塩勾配で溶出し、高い塩（１Ｍ ＮａＣｌまたは等価物）で溶出した分画を分離する。本発明の方法を使用すると、実質的にすべての生成物がこの１つのピ−クから取得可能である。一方、以前は、２つのピ−クが分離されることが常に要求された。
【００１６】
発現されたタンパク質を天然状態に折り畳む必要がなく、かつ複数の分画を得てプールする必要がないので、これは、生産効率および生成物の純度の重要な改善を提供する。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、生物学的に活性な複合体を生産する方法であって、
分子内ジスルフィド結合（架橋）を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、生物学的に活性な複合体が形成される条件下で、陰イオン交換カラムで、オレイン酸と接触させること、
塩勾配でカラムを溶出すること、および
高塩濃度で溶出する単一分画から、複合体を分離すること、
からなる方法を提供する。
【００１７】
「高塩濃度」という語句は、０．５Ｍを超える濃度、例えば０．７５Ｍを超える濃度、特には約１Ｍの濃度の、ハロゲン化物（特には塩化物）等の陽イオンとの塩の濃度を指す。要求される濃度は使用される塩によって変わるが、特定の実施形態では塩はＮａＣｌであり、適切には１Ｍ ＮａＣｌである。
【００１８】
本発明によれば、「α−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質」は、天然の成熟α−ラクトアルブミンの配列を有するが、成熟ヒトα−ラクトアルブミンの完全長配列のうちのシステインに６、２８、６１、７３、７７、９１、１１１、および１２０位に見られるシステインがすべてアラニン等の他のアミノ酸に変異され、それでいてジスルフィド架橋を生じない、タンパク質を包含する。したがって、本発明に従って利用可能な特定のタンパク質は、配列番号１のタンパク質を含む。
【００１９】
【表１】
【００２０】
式中、太字は天然ヒトα−ラクトアルブミンにおけるシステインの変異位置を示す。
出願人は、例えば発現の目的で便利な場合に、いくつかのアミノ酸残基（例えば２０以下のアミノ酸）がタンパク質の末端に取り付けられてもよいことを見出した。従って、配列番号１で示される組換えタンパク質であってＮ末端に追加のメチオニンを備えたもの（以下に示される配列番号２）が、本発明の方法に使用された。この配列を使用して得られた複合体をＣｙｓ５６７ＯＡと名付けた。核磁気共鳴法で検査すると、この複合体は固有の特性を示すため、かかる複合体は本発明の特定の態様を形成する。
【００２１】
本方法に使用される組換えタンパク質は、従来の組換え発現方法を使用して、純粋な型で適切に生産される。詳細には、必要な組換えα−ラクトアルブミンをコードするＤＮＡを、プラスミド等の適切な発現ベクターへ挿入し、次にこれを用いて宿主細胞（例えば大腸菌等の原核細胞または特定の昆虫細胞等の真核細胞）を形質転換することが可能である。
【００２２】
上述の組換えタンパク質の使用により、カルシウムを除去したりおよび溶融した球状物質の存在量を増加したりするために、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のカルシウムキレート剤で処理し、該物質を低ｐＨまたは高温に供するといった前処理工程は不要となる。そのような工程は、生物学的に活性な複合体を生成するために天然ヒトαまたはいくつかのシステイン残基が残っている変異型を使用する場合に一般に好まれる。
【００２３】
適切には、プロセスに使用されるオレイン酸は純粋型であるが、人乳のカゼインを含む画分が、上記物質の便利な供給源を提供することができ、以前に実証されたようにプロセスに使用されてもよい。
【００２４】
前処理されたカラムを、上述したように、α−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントの多くの分画を生物学的に活性な複合体へ変換するために、繰り返し使用することが可能である。一旦カラムが消耗されるか、変換率が許容できないレベルに低下したら、複合体の生産活性を回復するために前処理ステップを繰り返
すことが可能である。
【００２５】
本発明のプロセスを使用して得られた生成物は新規であり、したがって、本発明のさらなる態様を形成する。
したがって、本発明はさらに、上述したような、α−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントと、オレイン酸とを含む生物学的に活性な複合体を提供する。詳細には、本発明は、配列番号２の組換えタンパク質とオレイン酸を含む、Ｃｙｓ５６７ＯＡと称される生物学的に活性な複合体を提供する。
【００２６】
【表２】
【００２７】
この複合体は、例えばアポト−シスにより腫瘍細胞死を引き起こす活性を有するか、またはＨＡＭＬＥＴ等の他の生物学的に活性な複合体で得られるのと少なくとも等しい殺菌効果を有するかの少なくともいずれかであるという点で、生物学的に活性であることが分かった。
【００２８】
したがって、複合体は、従来の方法で薬学的に許容される担体と複合体とを組み合わせることにより、有用な医薬組成物へ製剤化されてもよい。そのような組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００２９】
本発明のこの態様に従う組成物は、適切には、例えばクリ−ム、軟膏、ゲル剤、または水性もしくは油性溶液もしくは懸濁液としてば局所的使用に適した剤形の医薬組成物である。これらは薬学的に許容される公知の担体、充填剤、および／または手段を含んでもよい。
【００３０】
局所用の溶液またはクリ−ムは、適切には、希釈剤またはクリ−ム基剤と共に、タンパク質複合体用の乳化剤を含む。
複合体の日用量は変化し、通常の臨床実務に従って、患者や治療される症状の性質等によって左右される。一般的なきまりとして、２〜２００ｍｇ／用量の生物学的に活性な複合体が、各回投与に使用される。
【００３１】
本発明のさらなる態様では、癌の治療が必要な患者に上述の生物学的に活性な複合体を投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。
詳細には、複合体はヒト皮膚乳頭腫、ヒト膀胱癌、および膠芽腫等の癌を治療するために使用されてよい。膠芽腫の場合、当該技術分野において周知のように、投与は注入によってもよい。
【００３２】
本発明はさらに、治療、特には癌の治療に使用される上記に定義した生物学的に活性な複合体を提供する。
システイン残基の除去により生物学的に活性な複合体の収率が増大することは、予期しなかったことである。
【００３３】
したがって、本発明のさらなる態様は、α−ラクトアルブミンまたはそのフラグメントをイオン交換条件下でオレイン酸を接触させることを含むプロセスにより取得可能な生物学的に活性な複合体の収率を増加させる方法であって、少なくともいくつかの分子内ジス
ルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、前記プロセスにおいて使用することからなる方法を提供する。
【００３４】
上述したように、ジスルフィド架橋は、システイン残基を他のアミノ酸に変化させることにより適切に除去される。詳細には、例えばすべてのシステイン残基を異なるアミノ酸（例えばアラニン）に変化させることにより、すべてのジスルフィド架橋が除去される。
【００３５】
さらに、本発明は、生物学的に活性な複合体の製造における、分子内ジスルフィド結合または架橋を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントの使用方法を提供する。詳細には、該組換えタンパク質は、システイン残基、特にはすべてのシステイン残基が異なるアミノ酸に変化されているヒトα−ラクトアルブミンの配列またはそのフラグメントを有する。
【００３６】
本発明の上記態様で使用される組換えタンパク質は、上述の追加のアミノ酸を含んでいてもよい。
ここで、本発明を、添付の図面を参照しながら例示により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】α−ラクトアルブミンの構造と、上述の組換えタンパク質および天然α−ラクトアルブミンの、オレイン酸で調整されたマトリックス上での生物学的に活性な複合体への変換とに関する。（Ａ）は、タンパク質全体に配置された４つのジスルフィド結合を形成する８つのシステインを含むα−ラクトアルブミンの構造を示す。ジスルフィド結合を黒で示し、関連するシステインの残基の番号を印す。カルシウムイオンを黒で示す。リボン構造は、ＰＤＢ受入番号１ＨＭＬ（１０）から取得し、ＭＯＬＭＯＬにより修飾した（Anderson et al, Biochemistry 1997 36 (39) 11648-11654）。（Ｂ）低塩（分画１）および高塩（分画２）での経時的な複合体の溶出を示すグラフ。複合体を形成するために、配列番号２の組換えタンパク質をオレイン酸で調整したイオン交換カラムにかけ、複合体をＮａＣｌ勾配で溶出した（伝導度トレース、明灰色）。ヒトα−ラクトアルブミンを、ＥＤＴＡ有りまたはＥＤＴＡ無しで、対照として使用した。（Ｃ）これは、０−１１０分（分画１）および１１０−１４０分（分画２）の（Ｂ）の濃度曲線下面積として決定された変換率を示す表である。
【図２】α−ラクトアルブミンおよび種々の複合体の円偏光二色性分光法の結果を示す。（Ａ）すべてのシステインがアラニンに変換されたα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質（黒色の実線）および該組換えタンパク質から生物学的に活性な複合体（Ｃｙｓ５６７ＯＡと称する）（黒色の点線）の三次構造を、近紫外線ＣＤ分光法により調べた。スペクトルは５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５中で７０μＭの天然α−ラクトアルブミン（灰色の実線）、アポα−ラクトアルブミン（灰色の交差線）、および対照としてのＨＡＭＬＥＴ（灰色の点線）にて、記録した。ヒトα−ラクトアルブミン、α−ラクトアルブミンAll-AlaおよびＨＡＭＬＥＴのスペクトルは以前に記載されたものである。（Ｂ）ＨＡＭＬＥＴ（灰色の点線）およびＣｙｓ５６７ＯＡ（黒色の点線）の二次構造を遠紫外線ＣＤ分光学法で調べた。対照、α−ラクトアルブミン（灰色の実線）およびα−ラクトアルブミンAll-Ala（黒色の実線）の記録されたスペクトルは、以前の報告と一致していた。スペクトルは５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５中で２８μＭにて記録した。
【図３】腫瘍細胞の殺滅におけるＨＡＭＬＥＴおよび本発明の生物学的複合体の効果を比較する。（Ａ）Ｌ１２１０細胞、（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、（Ｃ）ＨｅＬａ細胞および（Ｄ）Ａ５４９細胞を、ＨＡＭＬＥＴまたはＣｙｓ５６７ＯＡに６時間曝露した。リンパ腫細胞（Ｌ２１０細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞）は１４、２８および４２μＭのＨＡＭＬＥＴで処理し、癌細胞（Ａ５４９細胞およびＨｅＬａ細胞）は７、１４および２１μＭのＨＡＭＬＥＴで処理した。細胞死を未処理細胞に対するパーセント（％）で、トリパンブルー排除により決定し、左側のパネルに示した。ＨＡＭＬＥＴ（黒色三角）およびＣｙｓ５６７ＯＡ（黒色丸）によるＡＴＰレベルの減少を、中間対照に対するパーセント（％）で右側のパネルに示す。２〜５回の実験の平均をエラーバーとして標準偏差で示す。α−ラクトアルブミン（灰色三角）およびα−ラクトアルブミンAll-Ala（灰色丸）タンパク質を対照として使用した。Ｃｙｓ５６７ＯＡは、ＨＡＭＬＥＴと同程度に生物学的に活性であり、特にＨｅＬａ細胞株とＡ５４９細胞株でより活性であることが示された。
【図４】Alexaで標識した複合体の細胞内在化を示す。Ａ５４９細胞による本発明の生物学的複合体（Ｃｙｓ５６７ＯＡ）の内在化を、Alexa-Fluorで標識した複合体を使用して、共焦顕微鏡検査法により調べた。α−ラクトアルブミン、すべてのシステインがアラニンで置換されたα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質、およびＨＡＭＬＥＴを対照として使用した。細胞は３５μＭで１５分および３時間処理した。（Ａ）ＨＡＭＬＥＴは１５分後に腫瘍細胞により急速に内在化され、３時間後には更なる内在化が生じた。（Ｂ）Ｃｙｓ５６７ＯＡはＨＡＭＬＥＴよりは遅く内在化されたが、３時間後には類似量が細胞中に存在した。（Ｃ）α−ラクトアルブミンまたは（Ｄ）α−ラクトアルブミンAll-Alaは細胞により内在化されなかった。
【図５】本発明の複合体を含む生物学的に活性な複合体で処理されたヒト肺癌細胞のＴＵＮＥＬ染色の結果を示す。ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡへの曝露後の（Ａ）Ｌ１２１０細胞、（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、（Ｃ）ＨｅＬａ細胞および（Ｄ）Ａ５４９細胞におけるＤＮＡ損傷の証拠をＴＵＮＥＬ染色を使用して調べた。ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡ（リンパ腫細胞では１４μＭ、癌細胞では２８μＭ）は、４つの細胞株で核ＤＮＡ損傷を引き起こし、これが陽性ＴＵＮＥＬ染色によって示された。α−ラクトアルブミンおよびα−ラクトアルブミンAll-Ala（リンパ腫細胞で２１μＭ、癌細胞で４２μＭ）はＤＮＡ損傷を引き起こさなかった。
【図６】ヒトα−ラクトアルブミン（ＨＬＡ）、以下に説明する組換えヒトα−ラクトアルブミン（ｒＨＬＡall-Ala）、およびタンパク質−オレイン酸複合体のＮＭＲ分光法の結果を示す。
【図７】ヒトα−ラクトアルブミン（ＨＬＡ）、以下に説明する組換えヒトα−ラクトアルブミン（ｒＨＬＡall-Ala）、およびタンパク質−オレイン酸複合体のＮＭＲ分光法の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
実施例１
タンパク質発現および精製
野生型α−ラクトアルブミンは、４つのジスルフィド結合を形成する６、２８、６１、７３、７７、９１、１１１および１２０位の８つのシステインを含み、かかるジスルフィド結合は天然状態（図１Ａ）を安定させる。２つのジスルフィド結合がα−ドメインに存在し［６−１２０および２８−１１１］、１つのジスルフィド結合がβ−ドメインに存在し［６１−７７］、１つのジスルフィド結合が２つのドメインの接点に存在する［７３−９１］。かかるタンパク質は、カルシウムイオンによっても安定化され、もしカルシウムイオンが除去されると、α−ラクトアルブミンはその明確な三次構造を失い、溶融された球形の状態をとる。
【００３９】
野生型ベクターｐＡＬＡの、Ｔ７−ポリメラ−ゼに基づく発現ベクターｐＡＥＤ４（FuFF M.E. Curr Opin. Struct. Biol. (2003 13(6), 674-682)でクローニングしたα−ラクトアルブミンに点突然変異を組み込むことにより得ることができる、すべてのシステインがアラニンに変化されたヒトα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質をコードするベクターｐＡＬＡＡＬＡを使用した。ベクターは大腸菌ＢＬ−２１*で形質変換
し、組換えタンパク質を、若干改変したが以前に記載されているように発現および精製した(Peng Z.Y. et al, Biochemistry (1995) 34(104),3241-3252; Schulman B.et al., J.
MoI. Biol. 253, 651-657)。封入体を尿素緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ 尿素、
５ｍＭ 還元グルタチオン、ｐＨ８．０）で可溶化し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．
０で平衡化したＤＥＡＥセルロ−ス（Whatman、英国Brentford所在）カラムに載せた。カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ 還元グルタチオン、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ
８．０で洗浄し、タンパク質を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、７Ｍ 尿素、０．５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ８．０で溶出した。分画をプールし、静止した水道水で２４時間透析し、次に流した水道水で少なくとも４８時間透析した（Spectra/Pore、カリフォルニア州Laguna Hills所在、分子量カットオフ値３．５ｋＤａ）。透析中に沈澱がある場合、沈殿を５Ｍ 尿素に溶解し、次に流した水道水で透析し、凍結乾燥した。透析したサンプルを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ ７．８で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃ
ｅｌ（Amersham Biosciences、スウェーデン国Uppsala所在）カラムに載せ、その後、直
線の塩勾配（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ2、０−０．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．８）で溶出した。分画をプールし、ｐＨ７の蒸留水に対して透析し（分子量カットオフ値３．５ｋＤａ）、凍結乾燥した。精製された変異タンパク質は、ヒトα−ラクトアルブミンの配列であるが、Ｎ末端に余分なメチオニン残基（これは除去されなかった）を含む配列番号２を有する。
【００４０】
組換えタンパク質は比較的高収率（１００ｍｇ／Ｌの培養）で大腸菌ＢＬ２１*で発現
され、均一になるよう精製された。組換えタンパク質ではすべてのシステインがアラニンに置換されているので、ジスルフィド結合を含まない。しかしながら、天然に類似のトポロジ−が保存されていることが分っている。近紫外線ＣＤ分光法およびＮＭＲにより示されるように、変異型は溶融された球状のコンホメーションをとり、遠紫外線ＣＤ分光学によって示されるように、二次構造が保持されていた。このタンパク質をｒＨＬＡall-Ala
と名付けた。
実施例２
イオン交換クロマトグラフィによるオレイン酸との複合体の形成
カラム（１４ｃｍ×１．６ｃｍ）に１０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ （BioSepra、フランス国Ville-neuf）を充填し、オレイン酸（Ｃ１８：１：９シス）で調整した。これは以前に記載された通りである（Svensson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97(8) 4221-4226 and Pettersson J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2006) 345(1) 260-270）。本質的に、１０ミリグラムのオレイン酸を超音波処理により５００μｌの９９．５％エタノールに溶解させた。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５（１０ｍｌ）を加えた後、溶液をカラムにかけた。５ミリグラムのタンパク質（実施例１で説明したように得られた組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Ala）または天然α−ラ
クトアルブミンを含む対照もしくはまたは過剰のＥＤＴＡで予めインキュベートした天然α−ラクトアルブミンを含む対照を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ８．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ）に溶解し、カラムに個別に加えた。
【００４１】
ＮａＣｌ勾配を適用した後、分画を集めた。
カラムをＮａＣｌ勾配（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含む緩衝液Ａ、次に１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａである緩衝液Ｂ）で溶出し、高い塩の前（分画１（ｔ＝０−１１０分）または後（分画２（ｔ＝１１０−１３０分）で溶出する分画を調べた（図１Ｂ）。実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaを使用して得られた複合体（Ｃ
ｙｓ５６７ＯＡ）は、ＨＡＭＬＥＴと同じ位置で鋭いピークとして溶出された。対照的に、野性型α−ラクトアルブミンは、高い塩を適用した後で溶出する有意な複合体を生産しない（図１Ｂおよび１Ｃ）。実際、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaは、Ｅ
ＤＴＡで処理したα−ラクトアルブミンよりもより効率的に生物学的に活性な複合体に変換されることが分かり、適用されたタンパク質の回収率は７１％（範囲６７−９４％、標準偏差１１．３、ｎ＝５）に比較して９９％（範囲８７−９９％、標準偏差、ｎ＝４．５）であった（図１Ｃ）。これは、変異型タンパク質のコンホメーションの構造的均一性がより大きいことを反映している可能性がある。つまり、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaの割合が大きいほど、脂肪酸が結合された複合体へクロマトグラフィで変換
される条件下で、溶融された球状状態をとるのがより容易になる。
【００４２】
塩を、蒸留水に対する透析で除去し（Spectra/Pore、膜カットオフ値３．５ｋＤａ）、その後凍結乾燥させた。
実施例３
α−ラクトアルブミンの円偏光二色性分光測定
遠紫外線および近紫外線ＣＤスペクトルをα−ラクトアルブミン、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Ala、ＨＡＭＬＥＴ、および実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaを使用して得られたＣｙｓ５６７ＯＡに２５℃で集束させた。凍結乾燥させた材料を、近赤外線および遠紫外線ＣＤスペクトル用にそれぞれ７０および２８μＭの濃度となるように、５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．５に溶解した。近紫外線スペクトルは、２４０ｎｍおよび３２０ｎｍの間、遠紫外線スペクトルは１９０〜２５０ｎｍの間で得た。波長のステップは１ｎｍとし、応答時間は８秒、走査速度は１０ｎｍ／分とした。６回の走査の平均を示し、平均残基楕円率θm（ｄｅｇ・ｃｍ・ｄｍｏｌ-を以前に記載されたように計算した（Svensson M. et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 (10), 6388-6396）。
【００４３】
実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaにおける三次的な相互作用の本質的な弱
まりが近紫外線ＣＤ分光法（図２Ａ）により検出され、これはα−ラクトアルブミンの溶融された球状の場合に合致した。実際、室温では、アポ−α−ラクトアルブミンは完全に溶融した球状というわけではなく（図２Ａ）、代わりに、かなりのタンパク質分子の集団が天然状態および溶融された球状状態に区画され、これが平衡に共存し、スペクトルが平均化している。したがって、同一条件下では、実施例１の分子の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaの割合がより大きいと、本物の溶融された球状状態となり、これは上述のオレ
イン酸による実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaの変換率の観察される増大に
寄与し得る。生物学的に活性な複合体への変換後、複合体の近紫外線スペクトルは、変異型タンパク質のみのスペクトルとほぼ同一であったが、これはオレイン酸の結合が検出可能な三次構造の量を増加させなかったことを示している（図２Ａ）。
【００４４】
二次構造に関し、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaおよび該組換えタンパ
ク質から得られた生物学的に活性な複合体（Ｃｙｓ５６７ＯＡ）は、いずれも、遠紫外線ＣＤ分光法（図２Ｂ）で示される野性型タンパク質の二次構造に質的に類似の内容を保持しており、これも従来の研究とよく相関していた。
実施例４
細胞死分析
マウスリンパ腫細胞（Ｌ１２１０、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２１９）、ヒトリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ、ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−１５２）、ヒト肺癌細胞（Ａ５４９、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１８５）およびヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２）を、Ｃｙｓ５６７ＯＡの殺腫瘍活性の検査に使用した。細胞を採集し、洗浄し、ウシ胎仔血清を含まないＲＰＭＩ １６４０培地（PAA Laboratories GmbH、オーストリア国Pasching）に再懸
濁した。接着細胞に関しては、剥離のためにヴェルセン液（Versene）（１４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２．４ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．６ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を使用した。細胞を１×１０6細胞／ウェルの濃度で２４
ウェルプレ−ト（TPP、スイス国Trasadingen）へ接種した。凍結乾燥した材料を、０．７ｍＭ（分子量１４，２００ｇ／ｍｏｌ）でリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、７〜４２μＭの間の最終濃度でウェルに添加した。ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＣＡの記載された濃度は、タンパク質部分のモル濃度を指す。細胞を５％ＣＯ2雰囲気で３７℃にてイン
キュベートし、１時間後に５％の最終濃度となるようウシ胎児血清を各ウェルに加えた。細胞生存率を、干渉コントラスト顕微鏡（Laborlux 12, ドイツ国Leitz Wetzlar）でトリパンブルー排除を使用して６時間後に決定した。ＡＴＰレベルをATP Lite（発光ＡＴＰ検知アッセイシステム、PerkinElmer社、マサチューセッツ州Boston）を使用して決定し、
発光を照度計（LUMIstar、BMG Labtech社、ドイツ国Offenburg）を使用して検知した。
【００４５】
６時間後の生存率の損失を、ＡＴＰレベルの減少およびトリパンブルー染色の増加として定量した（図３）。Ｃｙｓ５６７ＯＡは用量依存的に腫瘍細胞を殺すこと示された。全細胞のうちの８０％超が、試験された最も高い濃度（リンパ腫細胞で２１μＭおよび癌細胞で４２μＭ）への曝露の６時間後に同様な結果がＨＡＭＬＥＴでも得られ、６０％超の細胞が、最も高い濃度への６時間の曝露後に死滅した。２つの複合体の間には殺腫瘍活性の統計的有意差はなかった（ｐ＞０．０５、one-way ANOVA）。結果は、Ｃｙｓ５６７Ｏ
ＡがＨＡＭＬＥＴと同程度に活性であることを示している。
【００４６】
さらに、天然タンパク質のみの対照と同様に、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaは単独で細胞生存率を現象させなかった（図３）。上述のように得られた複合体で
処理した細胞の生存率と、脂肪酸を含まない組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaで処理し
た細胞の生存率との間には統計学的有意差が観察された（ｐ＜０．００５、one-way ANOVA）。多くの研究が示唆するのは、タンパク質の部分的展開とそれに続くオリゴマー化と
集合が、細胞毒性特性を有するアミロイド構造を生じさせるというものである。α−ラクトアルブミンの酸性の溶融された球状型（「Ａ状態」）の場合には、アミロイド原繊維が実際に高い塩濃度の存在下で生ずることが知られている。しかしながら、そのような溶液条件は、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaに関してはここでは使用しなかっ
たため、溶融された球状型への部分的展開がタンパク質を細胞毒性にしていないことを示している。
【００４７】
細胞生存率に対する効果の差を、一元配置分散分析（one-way analysis of variance ,ANOVA)と、それに続くBonferroni多重比較検定を用いて比較した。分析はGraphPad InStat3(Macintoshバ−ジョン3.0b)を使用して行なった。
実施例５
腫瘍細胞におけるＣｙｓ５６７ＯＡの取り込み
組換えタンパク質および該組換えタンパク質から得られたＣｙｓ５６７ＯＡの細胞内取り込みを、AlexaFluor 568で標識したタンパク質（Molecular Probes, Invitrogen社、カリフォルニア州Carlsbad）を使用して調べた。ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）を８ウェルチャンバスライド（Nunc社、ニューヨーク州Rochester）に５０，０００個以下の細胞／ウェ
ルの密度で蒔種し、３７℃、５％ＣＯ2中で一晩インキュベートした。ALEXA標識タンパク質と非標識タンパク質を１：１０の比になるよう混合し、ウシ胎児血清がない状態で３５μＭの最終濃度になるよう細胞を加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ2中でインキュベート
し、１５分後に３．７％のホルムアルデヒド中で固定した。３時間のインキュベート後、１時間後に５％の最終濃度になるようウシ胎仔血清を加えた。細胞取り込みを共焦顕微鏡検査法（LSM510 META共焦システム、Carl Zeiss、ドイツ国Jena）を用いて分析した。結
果を図４に示す。上記の実施例２に記載された天然α−ラクトアルブミンを用いて得られたＨＡＭＬＥＴを対照として使用した。
【００４８】
予想通りに、１５分間の暴露後に示されるように（図４Ａ）、ＨＡＭＬＥＴは腫瘍細胞により急速に内在化された。３時間後、さらなる増加が生じた。Ｃｙｓ５６７ＯＡは、急速に内在化され、その後核へ移動するという類似のパタ−ンを示した（図４Ｂ）。ＨＡＭＬＥＴと比較して１５分後の取り込みは弱かったが、３時間後には同様な数の細胞がＣｙｓ５６７ＯＡを取り込んだ。この取り込み動力学にわずかな差がある理由は直接明確ではなかったが、Ｃｙｓ５６７ＯＡ複合体内の組換えタンパク質の比較的大きな可撓性が最初の取り込みの遅延のある程度の原因となっている可能性があると考えられる。
【００４９】
オレイン酸のない変異型タンパク質の内在化も、Ｃｙｓ５６７ＯＡと比較した（実施例１の３５μＭのＣｙｓ５６７ＯＡまたは組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Ala）（図４Ｃお
よびＤ）。変異型タンパク質は細胞表面に結合したが、腫瘍細胞により内在化されなかった。組換えタンパク質のより大きな凝集体が形成され、１５分目および３時間目には細胞表面に付着しているままだった（図４Ｄ）。
【００５０】
上記結果は、腫瘍細胞への内在化がＨＡＭＬＥＴとＣｙｓ５６７ＯＡの一般的な特徴であることを示しており、これは脂肪酸という補因子が腫瘍細胞への取り込みおよび殺腫瘍活性に必要とされることを示唆している。さらに、組換えタンパク質がそれ自体内在化可能であるという証拠はなかった。
実施例６
ＴＵＮＥＬ染色
ＨＡＭＬＥＴは、ＴＵＮＥＬ分析法を使用して、腫瘍細胞株、およびインビボのヒト腫瘍においてＤＮＡ損傷を引き起こすことが示されている（Mossberg et al. Int. J. Cancer (2007)121(6)1352-1359）。Ｃｙｓ５６７ＯＡに応じたＤＮＡ損傷の程度を調べるために、実施例４で使用した４つの腫瘍細胞株を複合体に６時間暴露した（リンパ腫細胞で１４μＭ、癌細胞で２８μＭ）。
【００５１】
ＨＡＭＬＥＴ、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaおよびα−ラクトアルブ
ミンを、対照として使用した。
細胞を遠心分離により採集し、ＰＢＳで希釈した４％パラホルムアルデヒド中で固定した。細胞を、Ｌ−リジンコーティングした顕微鏡スライド上で遠心分離し（２５×ｇ、５分、Cytospin 3、Shandon社、英国Cheshire）、−２０℃で保存した。核ＤＮＡ損害を有
する細胞をＴＵＮＥＬ分析法（Roche、スイス国Basel）により識別した。簡単に説明すると、スライドを室温で解凍し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％ クエン酸ナトリウム、０．１％ Triton X-100で透過性にした。ＴＵＮＥＬ反応混合物を適用し、スライドを５％
ＣＯ2中で３７℃にて１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回線上し、カ
バーガラスおよび封入剤（Sigma-Aldrich、アメリカ合衆国ミズーリ州St Louise）を載せ、共焦顕微鏡検査法で調べた。
【００５２】
Ｃｙｓ５６７ＯＡは、すべての細胞の種類でＴＵＮＥＬ染色により検出されるＤＮＡ損傷を引き起こした(図５)。ＴＵＮＥＬ陽性の細胞の数はＨＡＭＬＥＴで処理した細胞における数に類似していた。対照的に、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaおよび
α−ラクトアルブミンはＴＵＮＥＬ染色に影響を及ぼさなかった。結果は、オレイン酸および溶融された球状複合体の両方の細胞傷害効果が核ＤＮＡの損傷を含むことを示している。
【００５３】
要約すると、８つのシステイン残基がすべてアラニンに置換されたα−ラクトアルブミンの配列を有する実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaは、すべての条件下で、
オレイン酸の存在下で生物学的に活性な複合体に容易に変換される。実際、生産プロセスは驚くほど良好で、単一ピークの増大された収率を与えた。これは、製造の観点で特に有利である。さらに、得られた複合体は、リンパ腫と癌細胞の細胞系列に対して強い殺腫瘍活性を示した。共焦顕微鏡検査法により、腫瘍細胞の核内に複合体が蓄積することが示され、それにより同一の殺腫瘍活性を有するＨＡＭＬＥＴの細胞往来パターンが再現された。したがって、Ｃｙｓ５６７ＯＡは特に好ましい薬の候補を代表する。
【００５４】
実施例７
Ｃｙｓ５６７ＯＡの構造の研究
（実験手順）
1Ｈ ＮＭＲ分光分析−実施例１で説明した組換えヒトα−ラクトアルブミンｒＨＬＡall-Ala、ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡを、２．０ｍｌ Zebaスピン脱塩カラム（Thermo Scientific）を用いてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、２．０Ｍ尿素）に
溶媒交換した。結合Ｃａ2+イオンを含むヒトＨＬＡを、２．０Ｍ尿素を含む蒸留水に溶媒交換し、ｐＨを７に調節した。すべての場合で、溶媒は１０％のＤ2Ｏを含んでいた。４
つのサンプルの一次元1Ｈ ＮＭＲ分光測定値を、間接検出クリオプローブ（Bruker BioSpin）を備えた６００ＭＨｚ Ultrashield分光計で得た。２０℃、３０℃、４０℃、５０
℃および５５０℃の温度を、可変温度ユニットで維持した。
【００５５】
ＨＬＡとは別に、α−ラクトアルブミンの溶融された球状種に見出されるように、ｒＨＬＡall-Ala、ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡの一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、解像能が悪く、大きく広がった（図６Ａ−Ｄ）。α−ラクトアルブミンの天然または天然に類似の三次元構造の重要なスペクトルの特徴１つは、Ｉｌｅ９５のδＣＨ3プロトン（
３０℃で−０．７ｐｐｍ）およびＶａｌ９２のγＣＨ3プロトン（３０℃で−０．５ｐｐ
ｍ）に対応する強い上部領域にシフトしたメチル共鳴である（図６Ｂおよび７Ａ）。この基準を使用すれば、ＨＡＭＬＥＴは、一般にスペクトル全体にわたりピークが広いにもかかわらず、折り畳まれたＨＬＡよりはるかに低い集団でも、かなりの天然に類似の構造をまだ有することが直ちに明らかとなった（図７Ａ）。これは、ＨＡＭＬＥＴの楕円率振幅がａｐｏ−ＨＬＡとｒＨＬＡall-Ala／Ｃｙｓ５６７ＯＡとの中間である近紫外線ＣＤス
ペクトルと一致していた。サンプルをさらに区別する手段として、各タンパク質またはタンパク質−脂肪酸複合体を、２．０Ｍ尿素の存在下で徐々に高い温度に暴露させた。尿素を加える理由は２つあり、１つ目はタンパク質（特にｒＨＬＡall-Ala）の溶解度を援助
するためであり、２つ目は、分子の動的性質を微妙に増大させて、より速い時間目盛り（折りたたまれていない高度に動的な分子で観察されるもの）からのマイクロ秒からミリ秒までの時間目盛でのコンホメーションの変動（溶融された球体で観察されるもの）を区別するためである。２Ｍ尿素を加えてもタンパク質からオレイン酸が剥離されず、２Ｍ尿素の存在は、ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡの細胞毒性活性に否定的影響を与えなかった（２Ｍ尿素およびリン酸緩衝液と３０分間インキュベート、データは非図示）。
【００５６】
ＨＬＡの場合、完全に折り畳まれた天然構造の結果としての化学シフトの広い分散と明確なピークから始まって（２０℃および３０℃）、ピークは徐々に広がり、化学シフト分散は範囲が狭くなるように見えた（４０℃から５５℃）（図６Ｂ）。高温でも上部領域にシフトしたメチル共鳴の特性がまだ存在したが、ピークの高さはピークが広がるにつれてますます小さくなった（図７Ａ，Ｂ）。これは２．０Ｍ尿素の存在下の５５℃ではかなりの数の溶融された球状分子が存在していることを示唆している。比較のため、α−ラクトアルブミンが古典的な高温の溶融された球状状態になる条件は約９０℃である（ｐＨ７、化学変性剤はなし）。対照的に、ｒＨＬＡall-Alaのスペクトルは、小さい化学シフト分
散と広いピーク（２０℃および３０℃）から始まったが、高温でも、また化学シフトがさらに狭くなった場合でも、ピークは徐々に鋭くなる（４０℃から５５℃）（図６Ａ）。これは、溶融された球状状態からますます緩まった展開状態までタンパク質が変化を受けていることを示す。重要な１つの態様は、この変異型ではどの温度でも上部領域にシフトするメチル共鳴が全く存在しないことである（図７Ａ，Ｂ）。これは、近紫外線ＣＤスペクトル（非図示）に見出される特徴によっても示唆されるように、ｒＨＬＡall-Alaがすべ
ての温度で強い残基間の側鎖相互作用を欠くことを示唆している。
【００５７】
上述したように、ＨＡＭＬＥＴのスペクトル（２０℃および３０℃；図７）は、Ｉｌｅ９５のδＣＨ3プロトン（３０℃で−０．７ｐｐｍ）およびＶａｌ９２（３０℃で−０．
５ｐｐｍ）のγＣＨ3プロトンを示し、ＨＬＡよりも少ない数でも天然に類似の三次元構
造の存在を示している。温度が増大すると、ピークの多くが鋭利になり（図６Ｄ）、これらの上部領域共鳴が消える（図７Ｂ）ため、低温では部分的に天然に類似しているが、ＨＡＭＬＥＴの全体的な挙動が天然ＨＬＡのそれとは著しく異なることを示唆している。実際、ＨＡＭＬＥＴの高磁場領域のＮＭＲスペクトルは５５℃でＣｙｓ５６７ＯＡのそれと同一であることが分かり（図７Ｂ）、０．０５ｐｐｍにおける非常に小さなピ−クを除い
て高磁場領域共鳴はない。驚くべきことに、Ｃｙｓ５６７ＯＡの場合、温度が増加するにつれ、溶融球体は予測通りにピークが鋭くなり（図６Ｃ）、高磁場領域に変化はない（図７Ａ、Ｂ）。
【００５８】
この一連の実験では、温度を変化させた1Ｈ ＮＭＲ分光を使用して、（ｉ）スペクト
ルがよく分散された狭いピークを示す天然状態、（ｉｉ）スペクトルがあまり分散せず広いピークを示す溶融された球状状態、および（ｉｉｉ）スペクトルがあまり分散せず狭い小球ピ−クを示すｒＨＬＡall-Ala、ＨＬＡ、ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡの展
開状態を区別した。α−ラクトアルブミンとその様々な溶融された球状状態、ならびにアポミオグロビン等の他の原型タンパク質について、バックボーン動力学の重要な研究がかなり詳細に行われた。かかる研究の主体は、異なる実験条件下での異なる構造部位の、バックボーン動力学の複雑さと微妙さとを示している。この研究から到達した重要な結論の１つは先ず、Ｃｙｓ５６７ＯＡが生理的条件下ではＨＡＭＬＥＴとは明らかに構造が異なるということである。さらに、ＨＡＭＬＥＴは天然類似の分子集団を含んでいるが、Ｃｙｓ５６７ＯＡには天然類似の側鎖パッキングが完全に欠けており、にもかかわらずＨＡＭＬＥＴと等価な細胞毒性活性を示す。したがって、アミロイド原繊維の例と異なり、慎重に人為設計された非天然の部分的に展開された構造の集団は、その環境に従って、細胞への独立した効果を与えることが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用のタンパク質複合体の調製方法および該方法に使用される装置および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えα−ラクトアルブミンの変異型が当該技術分野で周知である。フォールドされかつ溶融された球状型に見出される特性の多くは、天然タンパク質に類似することが判明しているが、変異型では安定性が一般に低下することが一般に認められている。α−ラクトアルブミンはそれ自体、部分的に展開されるか溶融された球状の状態で、生物学的に活性な複合体を形成するために以前は使用されていた（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Svensson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97(8) 4221-4226
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、出願人は、特定のタイプの組換えタンパク質が、核磁気共鳴によって実証されるような、固有の組成の特徴および構造を備えた治療上活性な複合体を生産するために使用可能であることを見出した。複合体は、かかる特徴および構造の違いにもかかわらず有用な生物活性を有し、更に、効率的に調製することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明によれば、生物学的に活性な複合体を生産する方法であって、分子内ジスルフィド結合または架橋を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、生物学的に活性な複合体が形成される条件下で、オレイン酸と接触させること、および前記複合体を分離すること、からなる方法が提供される。
【０００６】
組換えタンパク質が分子内ジスルフィド架橋を欠くことを確実にすることにより、該タンパク質分子は、三次元的に非天然型となり、元の内因性生物活性の点で完全に不活性となる。これは例えば、天然α−ラクトアルブミン中のシステイン残基を他の残基（特にはアラニン残基）に変化させることにより達成されるが、他の手段、例えばチオ−ル化合物の添加またはタンパク質のｐＨの変更も考慮され得る。好ましくは、すべてのシステイン残基がアラニン残基等の他の残基に変化される。
【０００７】
本明細書に使用する場合、「生物学的に活性」という語句は、複合体が（特にはアポトーシスにより）腫瘍細胞死を引き起こすか、天然モノマ−のα−ラクトアルブミン型では見られない殺菌効果を奏するかの少なくともいずれかが可能であることを意味する。
【０００８】
用語「そのフラグメント（α−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質のフラグメント）」は、完全なα−ラクトアルブミンのアミノ酸配列を含む複合体と同様な活性を有する複合体を形成する、所与のアミノ酸配列の任意の部分を指す。フラグメントは、ともに連結された、完全長タンパク質の２つ以上の部分を含んでもよい。部分は、適切には、基本配列からの少なくとも５個、好ましくは１０個の連続するアミノ酸を含むだろう。
【０００９】
適切なフラグメントは、長さが少なくとも２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む欠失変異体である。これらはタンパク質からの複数の小領域または該領域の組み合わせを含む。
【００１０】
適切なフラグメントは、αドメインとβドメイン間の接点（インタ−フェイス）を形成する部位を含む。かかる部位は、ヒトα−ラクトアルブミンでは、構造中の３４−３８位および８２−８６位のアミノ酸により定義される。したがって、適切なフラグメントはかかる部位、好ましくは天然タンパク質の３４−８６位のアミノ酸の全部位を含む。しかしながら、他の活性フラグメントが見出されてもよい。
【００１１】
特には、組換えタンパク質は、ヒトα−ラクトアルブミンの配列に基づくが、ウシまたはヒツジのα−ラクトアルブミンを含む他の供給源由来のα−ラクトアルブミンを組換えタンパク質を得るために使用されてもよい。
【００１２】
組換えタンパク質とオレイン酸を、生物学的に活性な複合体に変換するために使用可能な方法は、例えばＷＯ９９／２６９７９およびＷＯ２００８／１３８３４８で説明されているものと類似している。両文献の内容は引用により本明細書に組み込む。しかしながら、本発明の方法によれば、明確な生物学的に活性な生成物が、良好な収率でより容易に入手可能である。
【００１３】
詳細には、本発明の方法を使用する場合、高収率の生物学的に活性な複合体が、特に、カラムから溶出する単一分画から、好都合に得られ、長期間のフォールディング（折り畳み）プロセスは必要ない。
【００１４】
上記に定義される組換えタンパク質は、イオン交換カラム、特にはＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍカラム（ＢｉｏＳｅｐｒａより入手可能、フランス国Ｖｉｌｌｅ−ｎｅｕｆ所在）等の陰イオン交換カラムでイオン交換が起こる条件下で、オレイン酸と適切に接触させられる。組換えタンパク質がカラムにかけられる前に、カラムはオレイン酸で適切に「事前調整（precondition）される。かかる事前調整は、まずオレイン酸でカラムを溶出するかまたは調整することにより達成され得る。適切には、オレイン酸は、ＤＥＡＥ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ等の新品の未使用のイオン交換材料を含むカラムを通して溶出される。適切な溶出緩衝液は、８．５ｐＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含む。このようにカラムに適用されるオレイン酸組成の量は、カラムのサイズや、生物学的に活性な複合体に変換されるのに必要な組換えタンパク質の量等の要因に基づいて、少なくすることが可能である。例えば、１４ｃｍ×１．６ｃｍのカラムを調整するためには、たった１０ｍｇのオレイン酸を使用すればよい。
【００１５】
組換えタンパク質をカラムに適用した後（例えば適切な緩衝液の溶液に溶かして）、これを直線の塩勾配で溶出し、高い塩（１Ｍ ＮａＣｌまたは等価物）で溶出した分画を分離する。本発明の方法を使用すると、実質的にすべての生成物がこの１つのピ−クから取得可能である。一方、以前は、２つのピ−クが分離されることが常に要求された。
【００１６】
発現されたタンパク質を天然状態に折り畳む必要がなく、かつ複数の分画を得てプールする必要がないので、これは、生産効率および生成物の純度の重要な改善を提供する。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、生物学的に活性な複合体を生産する方法であって、
分子内ジスルフィド結合（架橋）を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、生物学的に活性な複合体が形成される条件下で、陰イオン交換カラムで、オレイン酸と接触させること、
塩勾配でカラムを溶出すること、および
高塩濃度で溶出する単一分画から、複合体を分離すること、
からなる方法を提供する。
【００１７】
「高塩濃度」という語句は、０．５Ｍを超える濃度、例えば０．７５Ｍを超える濃度、特には約１Ｍの濃度の、ハロゲン化物（特には塩化物）等の陽イオンとの塩の濃度を指す。要求される濃度は使用される塩によって変わるが、特定の実施形態では塩はＮａＣｌであり、適切には１Ｍ ＮａＣｌである。
【００１８】
本発明によれば、「α−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質」は、天然の成熟α−ラクトアルブミンの配列を有するが、成熟ヒトα−ラクトアルブミンの完全長配列のうちのシステインに６、２８、６１、７３、７７、９１、１１１、および１２０位に見られるシステインがすべてアラニン等の他のアミノ酸に変異され、それでいてジスルフィド架橋を生じない、タンパク質を包含する。したがって、本発明に従って利用可能な特定のタンパク質は、配列番号１のタンパク質を含む。
【００１９】
【表１】
【００２０】
式中、太字は天然ヒトα−ラクトアルブミンにおけるシステインの変異位置を示す。
出願人は、例えば発現の目的で便利な場合に、いくつかのアミノ酸残基（例えば２０以下のアミノ酸）がタンパク質の末端に取り付けられてもよいことを見出した。従って、配列番号１で示される組換えタンパク質であってＮ末端に追加のメチオニンを備えたもの（以下に示される配列番号２）が、本発明の方法に使用された。この配列を使用して得られた複合体をＣｙｓ５６７ＯＡと名付けた。核磁気共鳴法で検査すると、この複合体は固有の特性を示すため、かかる複合体は本発明の特定の態様を形成する。
【００２１】
本方法に使用される組換えタンパク質は、従来の組換え発現方法を使用して、純粋な型で適切に生産される。詳細には、必要な組換えα−ラクトアルブミンをコードするＤＮＡを、プラスミド等の適切な発現ベクターへ挿入し、次にこれを用いて宿主細胞（例えば大腸菌等の原核細胞または特定の昆虫細胞等の真核細胞）を形質転換することが可能である。
【００２２】
上述の組換えタンパク質の使用により、カルシウムを除去したりおよび溶融した球状物質の存在量を増加したりするために、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のカルシウムキレート剤で処理し、該物質を低ｐＨまたは高温に供するといった前処理工程は不要となる。そのような工程は、生物学的に活性な複合体を生成するために天然ヒトαまたはいくつかのシステイン残基が残っている変異型を使用する場合に一般に好まれる。
【００２３】
適切には、プロセスに使用されるオレイン酸は純粋型であるが、人乳のカゼインを含む画分が、上記物質の便利な供給源を提供することができ、以前に実証されたようにプロセスに使用されてもよい。
【００２４】
前処理されたカラムを、上述したように、α−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントの多くの分画を生物学的に活性な複合体へ変換するために、繰り返し使用することが可能である。一旦カラムが消耗されるか、変換率が許容できないレベルに低下したら、複合体の生産活性を回復するために前処理ステップを繰り返
すことが可能である。
【００２５】
本発明のプロセスを使用して得られた生成物は新規であり、したがって、本発明のさらなる態様を形成する。
したがって、本発明はさらに、上述したような、α−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントと、オレイン酸とを含む生物学的に活性な複合体を提供する。詳細には、本発明は、配列番号２の組換えタンパク質とオレイン酸を含む、Ｃｙｓ５６７ＯＡと称される生物学的に活性な複合体を提供する。
【００２６】
【表２】
【００２７】
この複合体は、例えばアポト−シスにより腫瘍細胞死を引き起こす活性を有するか、またはＨＡＭＬＥＴ等の他の生物学的に活性な複合体で得られるのと少なくとも等しい殺菌効果を有するかの少なくともいずれかであるという点で、生物学的に活性であることが分かった。
【００２８】
したがって、複合体は、従来の方法で薬学的に許容される担体と複合体とを組み合わせることにより、有用な医薬組成物へ製剤化されてもよい。そのような組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００２９】
本発明のこの態様に従う組成物は、適切には、例えばクリ−ム、軟膏、ゲル剤、または水性もしくは油性溶液もしくは懸濁液としてば局所的使用に適した剤形の医薬組成物である。これらは薬学的に許容される公知の担体、充填剤、および／または手段を含んでもよい。
【００３０】
局所用の溶液またはクリ−ムは、適切には、希釈剤またはクリ−ム基剤と共に、タンパク質複合体用の乳化剤を含む。
複合体の日用量は変化し、通常の臨床実務に従って、患者や治療される症状の性質等によって左右される。一般的なきまりとして、２〜２００ｍｇ／用量の生物学的に活性な複合体が、各回投与に使用される。
【００３１】
本発明のさらなる態様では、癌の治療が必要な患者に上述の生物学的に活性な複合体を投与することを含む、癌を治療する方法が提供される。
詳細には、複合体はヒト皮膚乳頭腫、ヒト膀胱癌、および膠芽腫等の癌を治療するために使用されてよい。膠芽腫の場合、当該技術分野において周知のように、投与は注入によってもよい。
【００３２】
本発明はさらに、治療、特には癌の治療に使用される上記に定義した生物学的に活性な複合体を提供する。
システイン残基の除去により生物学的に活性な複合体の収率が増大することは、予期しなかったことである。
【００３３】
したがって、本発明のさらなる態様は、α−ラクトアルブミンまたはそのフラグメントをイオン交換条件下でオレイン酸を接触させることを含むプロセスにより取得可能な生物学的に活性な複合体の収率を増加させる方法であって、少なくともいくつかの分子内ジス
ルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、前記プロセスにおいて使用することからなる方法を提供する。
【００３４】
上述したように、ジスルフィド架橋は、システイン残基を他のアミノ酸に変化させることにより適切に除去される。詳細には、例えばすべてのシステイン残基を異なるアミノ酸（例えばアラニン）に変化させることにより、すべてのジスルフィド架橋が除去される。
【００３５】
さらに、本発明は、生物学的に活性な複合体の製造における、分子内ジスルフィド結合または架橋を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントの使用方法を提供する。詳細には、該組換えタンパク質は、システイン残基、特にはすべてのシステイン残基が異なるアミノ酸に変化されているヒトα−ラクトアルブミンの配列またはそのフラグメントを有する。
【００３６】
本発明の上記態様で使用される組換えタンパク質は、上述の追加のアミノ酸を含んでいてもよい。
ここで、本発明を、添付の図面を参照しながら例示により詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】α−ラクトアルブミンの構造と、上述の組換えタンパク質および天然α−ラクトアルブミンの、オレイン酸で調整されたマトリックス上での生物学的に活性な複合体への変換とに関する。（Ａ）は、タンパク質全体に配置された４つのジスルフィド結合を形成する８つのシステインを含むα−ラクトアルブミンの構造を示す。ジスルフィド結合を黒で示し、関連するシステインの残基の番号を印す。カルシウムイオンを黒で示す。リボン構造は、ＰＤＢ受入番号１ＨＭＬ（１０）から取得し、ＭＯＬＭＯＬにより修飾した（Anderson et al, Biochemistry 1997 36 (39) 11648-11654）。（Ｂ）低塩（分画１）および高塩（分画２）での経時的な複合体の溶出を示すグラフ。複合体を形成するために、配列番号２の組換えタンパク質をオレイン酸で調整したイオン交換カラムにかけ、複合体をＮａＣｌ勾配で溶出した（伝導度トレース、明灰色）。ヒトα−ラクトアルブミンを、ＥＤＴＡ有りまたはＥＤＴＡ無しで、対照として使用した。（Ｃ）これは、０−１１０分（分画１）および１１０−１４０分（分画２）の（Ｂ）の濃度曲線下面積として決定された変換率を示す表である。
【図２】α−ラクトアルブミンおよび種々の複合体の円偏光二色性分光法の結果を示す。（Ａ）すべてのシステインがアラニンに変換されたα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質（黒色の実線）および該組換えタンパク質から生物学的に活性な複合体（Ｃｙｓ５６７ＯＡと称する）（黒色の点線）の三次構造を、近紫外線ＣＤ分光法により調べた。スペクトルは５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５中で７０μＭの天然α−ラクトアルブミン（灰色の実線）、アポα−ラクトアルブミン（灰色の交差線）、および対照としてのＨＡＭＬＥＴ（灰色の点線）にて、記録した。ヒトα−ラクトアルブミン、α−ラクトアルブミンAll-AlaおよびＨＡＭＬＥＴのスペクトルは以前に記載されたものである。（Ｂ）ＨＡＭＬＥＴ（灰色の点線）およびＣｙｓ５６７ＯＡ（黒色の点線）の二次構造を遠紫外線ＣＤ分光学法で調べた。対照、α−ラクトアルブミン（灰色の実線）およびα−ラクトアルブミンAll-Ala（黒色の実線）の記録されたスペクトルは、以前の報告と一致していた。スペクトルは５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５中で２８μＭにて記録した。
【図３】腫瘍細胞の殺滅におけるＨＡＭＬＥＴおよび本発明の生物学的複合体の効果を比較する。（Ａ）Ｌ１２１０細胞、（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、（Ｃ）ＨｅＬａ細胞および（Ｄ）Ａ５４９細胞を、ＨＡＭＬＥＴまたはＣｙｓ５６７ＯＡに６時間曝露した。リンパ腫細胞（Ｌ２１０細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞）は１４、２８および４２μＭのＨＡＭＬＥＴで処理し、癌細胞（Ａ５４９細胞およびＨｅＬａ細胞）は７、１４および２１μＭのＨＡＭＬＥＴで処理した。細胞死を未処理細胞に対するパーセント（％）で、トリパンブルー排除により決定し、左側のパネルに示した。ＨＡＭＬＥＴ（黒色三角）およびＣｙｓ５６７ＯＡ（黒色丸）によるＡＴＰレベルの減少を、中間対照に対するパーセント（％）で右側のパネルに示す。２〜５回の実験の平均をエラーバーとして標準偏差で示す。α−ラクトアルブミン（灰色三角）およびα−ラクトアルブミンAll-Ala（灰色丸）タンパク質を対照として使用した。Ｃｙｓ５６７ＯＡは、ＨＡＭＬＥＴと同程度に生物学的に活性であり、特にＨｅＬａ細胞株とＡ５４９細胞株でより活性であることが示された。
【図４】Alexaで標識した複合体の細胞内在化を示す。Ａ５４９細胞による本発明の生物学的複合体（Ｃｙｓ５６７ＯＡ）の内在化を、Alexa-Fluorで標識した複合体を使用して、共焦顕微鏡検査法により調べた。α−ラクトアルブミン、すべてのシステインがアラニンで置換されたα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質、およびＨＡＭＬＥＴを対照として使用した。細胞は３５μＭで１５分および３時間処理した。（Ａ）ＨＡＭＬＥＴは１５分後に腫瘍細胞により急速に内在化され、３時間後には更なる内在化が生じた。（Ｂ）Ｃｙｓ５６７ＯＡはＨＡＭＬＥＴよりは遅く内在化されたが、３時間後には類似量が細胞中に存在した。（Ｃ）α−ラクトアルブミンまたは（Ｄ）α−ラクトアルブミンAll-Alaは細胞により内在化されなかった。
【図５】本発明の複合体を含む生物学的に活性な複合体で処理されたヒト肺癌細胞のＴＵＮＥＬ染色の結果を示す。ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡへの曝露後の（Ａ）Ｌ１２１０細胞、（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞、（Ｃ）ＨｅＬａ細胞および（Ｄ）Ａ５４９細胞におけるＤＮＡ損傷の証拠をＴＵＮＥＬ染色を使用して調べた。ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡ（リンパ腫細胞では１４μＭ、癌細胞では２８μＭ）は、４つの細胞株で核ＤＮＡ損傷を引き起こし、これが陽性ＴＵＮＥＬ染色によって示された。α−ラクトアルブミンおよびα−ラクトアルブミンAll-Ala（リンパ腫細胞で２１μＭ、癌細胞で４２μＭ）はＤＮＡ損傷を引き起こさなかった。
【図６】ヒトα−ラクトアルブミン（ＨＬＡ）、以下に説明する組換えヒトα−ラクトアルブミン（ｒＨＬＡall-Ala）、およびタンパク質−オレイン酸複合体のＮＭＲ分光法の結果を示す。
【図７】ヒトα−ラクトアルブミン（ＨＬＡ）、以下に説明する組換えヒトα−ラクトアルブミン（ｒＨＬＡall-Ala）、およびタンパク質−オレイン酸複合体のＮＭＲ分光法の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
実施例１
タンパク質発現および精製
野生型α−ラクトアルブミンは、４つのジスルフィド結合を形成する６、２８、６１、７３、７７、９１、１１１および１２０位の８つのシステインを含み、かかるジスルフィド結合は天然状態（図１Ａ）を安定させる。２つのジスルフィド結合がα−ドメインに存在し［６−１２０および２８−１１１］、１つのジスルフィド結合がβ−ドメインに存在し［６１−７７］、１つのジスルフィド結合が２つのドメインの接点に存在する［７３−９１］。かかるタンパク質は、カルシウムイオンによっても安定化され、もしカルシウムイオンが除去されると、α−ラクトアルブミンはその明確な三次構造を失い、溶融された球形の状態をとる。
【００３９】
野生型ベクターｐＡＬＡの、Ｔ７−ポリメラ−ゼに基づく発現ベクターｐＡＥＤ４（FuFF M.E. Curr Opin. Struct. Biol. (2003 13(6), 674-682)でクローニングしたα−ラクトアルブミンに点突然変異を組み込むことにより得ることができる、すべてのシステインがアラニンに変化されたヒトα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質をコードするベクターｐＡＬＡＡＬＡを使用した。ベクターは大腸菌ＢＬ−２１*で形質変換
し、組換えタンパク質を、若干改変したが以前に記載されているように発現および精製した(Peng Z.Y. et al, Biochemistry (1995) 34(104),3241-3252; Schulman B.et al., J.
MoI. Biol. 253, 651-657)。封入体を尿素緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ 尿素、
５ｍＭ 還元グルタチオン、ｐＨ８．０）で可溶化し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．
０で平衡化したＤＥＡＥセルロ−ス（Whatman、英国Brentford所在）カラムに載せた。カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ 還元グルタチオン、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ
８．０で洗浄し、タンパク質を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、７Ｍ 尿素、０．５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ８．０で溶出した。分画をプールし、静止した水道水で２４時間透析し、次に流した水道水で少なくとも４８時間透析した（Spectra/Pore、カリフォルニア州Laguna Hills所在、分子量カットオフ値３．５ｋＤａ）。透析中に沈澱がある場合、沈殿を５Ｍ 尿素に溶解し、次に流した水道水で透析し、凍結乾燥した。透析したサンプルを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ ７．８で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃ
ｅｌ（Amersham Biosciences、スウェーデン国Uppsala所在）カラムに載せ、その後、直
線の塩勾配（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ2、０−０．４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．８）で溶出した。分画をプールし、ｐＨ７の蒸留水に対して透析し（分子量カットオフ値３．５ｋＤａ）、凍結乾燥した。精製された変異タンパク質は、ヒトα−ラクトアルブミンの配列であるが、Ｎ末端に余分なメチオニン残基（これは除去されなかった）を含む配列番号２を有する。
【００４０】
組換えタンパク質は比較的高収率（１００ｍｇ／Ｌの培養）で大腸菌ＢＬ２１*で発現
され、均一になるよう精製された。組換えタンパク質ではすべてのシステインがアラニンに置換されているので、ジスルフィド結合を含まない。しかしながら、天然に類似のトポロジ−が保存されていることが分っている。近紫外線ＣＤ分光法およびＮＭＲにより示されるように、変異型は溶融された球状のコンホメーションをとり、遠紫外線ＣＤ分光学によって示されるように、二次構造が保持されていた。このタンパク質をｒＨＬＡall-Ala
と名付けた。
実施例２
イオン交換クロマトグラフィによるオレイン酸との複合体の形成
カラム（１４ｃｍ×１．６ｃｍ）に１０ｍｌのＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ （BioSepra、フランス国Ville-neuf）を充填し、オレイン酸（Ｃ１８：１：９シス）で調整した。これは以前に記載された通りである（Svensson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97(8) 4221-4226 and Pettersson J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2006) 345(1) 260-270）。本質的に、１０ミリグラムのオレイン酸を超音波処理により５００μｌの９９．５％エタノールに溶解させた。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５（１０ｍｌ）を加えた後、溶液をカラムにかけた。５ミリグラムのタンパク質（実施例１で説明したように得られた組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Ala）または天然α−ラ
クトアルブミンを含む対照もしくはまたは過剰のＥＤＴＡで予めインキュベートした天然α−ラクトアルブミンを含む対照を緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ８．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ）に溶解し、カラムに個別に加えた。
【００４１】
ＮａＣｌ勾配を適用した後、分画を集めた。
カラムをＮａＣｌ勾配（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含む緩衝液Ａ、次に１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａである緩衝液Ｂ）で溶出し、高い塩の前（分画１（ｔ＝０−１１０分）または後（分画２（ｔ＝１１０−１３０分）で溶出する分画を調べた（図１Ｂ）。実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaを使用して得られた複合体（Ｃ
ｙｓ５６７ＯＡ）は、ＨＡＭＬＥＴと同じ位置で鋭いピークとして溶出された。対照的に、野性型α−ラクトアルブミンは、高い塩を適用した後で溶出する有意な複合体を生産しない（図１Ｂおよび１Ｃ）。実際、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaは、Ｅ
ＤＴＡで処理したα−ラクトアルブミンよりもより効率的に生物学的に活性な複合体に変換されることが分かり、適用されたタンパク質の回収率は７１％（範囲６７−９４％、標準偏差１１．３、ｎ＝５）に比較して９９％（範囲８７−９９％、標準偏差、ｎ＝４．５）であった（図１Ｃ）。これは、変異型タンパク質のコンホメーションの構造的均一性がより大きいことを反映している可能性がある。つまり、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaの割合が大きいほど、脂肪酸が結合された複合体へクロマトグラフィで変換
される条件下で、溶融された球状状態をとるのがより容易になる。
【００４２】
塩を、蒸留水に対する透析で除去し（Spectra/Pore、膜カットオフ値３．５ｋＤａ）、その後凍結乾燥させた。
実施例３
α−ラクトアルブミンの円偏光二色性分光測定
遠紫外線および近紫外線ＣＤスペクトルをα−ラクトアルブミン、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Ala、ＨＡＭＬＥＴ、および実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaを使用して得られたＣｙｓ５６７ＯＡに２５℃で集束させた。凍結乾燥させた材料を、近赤外線および遠紫外線ＣＤスペクトル用にそれぞれ７０および２８μＭの濃度となるように、５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８．５に溶解した。近紫外線スペクトルは、２４０ｎｍおよび３２０ｎｍの間、遠紫外線スペクトルは１９０〜２５０ｎｍの間で得た。波長のステップは１ｎｍとし、応答時間は８秒、走査速度は１０ｎｍ／分とした。６回の走査の平均を示し、平均残基楕円率θm（ｄｅｇ・ｃｍ・ｄｍｏｌ-を以前に記載されたように計算した（Svensson M. et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 (10), 6388-6396）。
【００４３】
実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaにおける三次的な相互作用の本質的な弱
まりが近紫外線ＣＤ分光法（図２Ａ）により検出され、これはα−ラクトアルブミンの溶融された球状の場合に合致した。実際、室温では、アポ−α−ラクトアルブミンは完全に溶融した球状というわけではなく（図２Ａ）、代わりに、かなりのタンパク質分子の集団が天然状態および溶融された球状状態に区画され、これが平衡に共存し、スペクトルが平均化している。したがって、同一条件下では、実施例１の分子の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaの割合がより大きいと、本物の溶融された球状状態となり、これは上述のオレ
イン酸による実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaの変換率の観察される増大に
寄与し得る。生物学的に活性な複合体への変換後、複合体の近紫外線スペクトルは、変異型タンパク質のみのスペクトルとほぼ同一であったが、これはオレイン酸の結合が検出可能な三次構造の量を増加させなかったことを示している（図２Ａ）。
【００４４】
二次構造に関し、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaおよび該組換えタンパ
ク質から得られた生物学的に活性な複合体（Ｃｙｓ５６７ＯＡ）は、いずれも、遠紫外線ＣＤ分光法（図２Ｂ）で示される野性型タンパク質の二次構造に質的に類似の内容を保持しており、これも従来の研究とよく相関していた。
実施例４
細胞死分析
マウスリンパ腫細胞（Ｌ１２１０、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２１９）、ヒトリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ、ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−１５２）、ヒト肺癌細胞（Ａ５４９、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１８５）およびヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２）を、Ｃｙｓ５６７ＯＡの殺腫瘍活性の検査に使用した。細胞を採集し、洗浄し、ウシ胎仔血清を含まないＲＰＭＩ １６４０培地（PAA Laboratories GmbH、オーストリア国Pasching）に再懸
濁した。接着細胞に関しては、剥離のためにヴェルセン液（Versene）（１４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２．４ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．６ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）を使用した。細胞を１×１０6細胞／ウェルの濃度で２４
ウェルプレ−ト（TPP、スイス国Trasadingen）へ接種した。凍結乾燥した材料を、０．７ｍＭ（分子量１４，２００ｇ／ｍｏｌ）でリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、７〜４２μＭの間の最終濃度でウェルに添加した。ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＣＡの記載された濃度は、タンパク質部分のモル濃度を指す。細胞を５％ＣＯ2雰囲気で３７℃にてイン
キュベートし、１時間後に５％の最終濃度となるようウシ胎児血清を各ウェルに加えた。細胞生存率を、干渉コントラスト顕微鏡（Laborlux 12, ドイツ国Leitz Wetzlar）でトリパンブルー排除を使用して６時間後に決定した。ＡＴＰレベルをATP Lite（発光ＡＴＰ検知アッセイシステム、PerkinElmer社、マサチューセッツ州Boston）を使用して決定し、
発光を照度計（LUMIstar、BMG Labtech社、ドイツ国Offenburg）を使用して検知した。
【００４５】
６時間後の生存率の損失を、ＡＴＰレベルの減少およびトリパンブルー染色の増加として定量した（図３）。Ｃｙｓ５６７ＯＡは用量依存的に腫瘍細胞を殺すこと示された。全細胞のうちの８０％超が、試験された最も高い濃度（リンパ腫細胞で２１μＭおよび癌細胞で４２μＭ）への曝露の６時間後に同様な結果がＨＡＭＬＥＴでも得られ、６０％超の細胞が、最も高い濃度への６時間の曝露後に死滅した。２つの複合体の間には殺腫瘍活性の統計的有意差はなかった（ｐ＞０．０５、one-way ANOVA）。結果は、Ｃｙｓ５６７Ｏ
ＡがＨＡＭＬＥＴと同程度に活性であることを示している。
【００４６】
さらに、天然タンパク質のみの対照と同様に、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaは単独で細胞生存率を現象させなかった（図３）。上述のように得られた複合体で
処理した細胞の生存率と、脂肪酸を含まない組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaで処理し
た細胞の生存率との間には統計学的有意差が観察された（ｐ＜０．００５、one-way ANOVA）。多くの研究が示唆するのは、タンパク質の部分的展開とそれに続くオリゴマー化と
集合が、細胞毒性特性を有するアミロイド構造を生じさせるというものである。α−ラクトアルブミンの酸性の溶融された球状型（「Ａ状態」）の場合には、アミロイド原繊維が実際に高い塩濃度の存在下で生ずることが知られている。しかしながら、そのような溶液条件は、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaに関してはここでは使用しなかっ
たため、溶融された球状型への部分的展開がタンパク質を細胞毒性にしていないことを示している。
【００４７】
細胞生存率に対する効果の差を、一元配置分散分析（one-way analysis of variance ,ANOVA)と、それに続くBonferroni多重比較検定を用いて比較した。分析はGraphPad InStat3(Macintoshバ−ジョン3.0b)を使用して行なった。
実施例５
腫瘍細胞におけるＣｙｓ５６７ＯＡの取り込み
組換えタンパク質および該組換えタンパク質から得られたＣｙｓ５６７ＯＡの細胞内取り込みを、AlexaFluor 568で標識したタンパク質（Molecular Probes, Invitrogen社、カリフォルニア州Carlsbad）を使用して調べた。ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）を８ウェルチャンバスライド（Nunc社、ニューヨーク州Rochester）に５０，０００個以下の細胞／ウェ
ルの密度で蒔種し、３７℃、５％ＣＯ2中で一晩インキュベートした。ALEXA標識タンパク質と非標識タンパク質を１：１０の比になるよう混合し、ウシ胎児血清がない状態で３５μＭの最終濃度になるよう細胞を加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ2中でインキュベート
し、１５分後に３．７％のホルムアルデヒド中で固定した。３時間のインキュベート後、１時間後に５％の最終濃度になるようウシ胎仔血清を加えた。細胞取り込みを共焦顕微鏡検査法（LSM510 META共焦システム、Carl Zeiss、ドイツ国Jena）を用いて分析した。結
果を図４に示す。上記の実施例２に記載された天然α−ラクトアルブミンを用いて得られたＨＡＭＬＥＴを対照として使用した。
【００４８】
予想通りに、１５分間の暴露後に示されるように（図４Ａ）、ＨＡＭＬＥＴは腫瘍細胞により急速に内在化された。３時間後、さらなる増加が生じた。Ｃｙｓ５６７ＯＡは、急速に内在化され、その後核へ移動するという類似のパタ−ンを示した（図４Ｂ）。ＨＡＭＬＥＴと比較して１５分後の取り込みは弱かったが、３時間後には同様な数の細胞がＣｙｓ５６７ＯＡを取り込んだ。この取り込み動力学にわずかな差がある理由は直接明確ではなかったが、Ｃｙｓ５６７ＯＡ複合体内の組換えタンパク質の比較的大きな可撓性が最初の取り込みの遅延のある程度の原因となっている可能性があると考えられる。
【００４９】
オレイン酸のない変異型タンパク質の内在化も、Ｃｙｓ５６７ＯＡと比較した（実施例１の３５μＭのＣｙｓ５６７ＯＡまたは組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Ala）（図４Ｃお
よびＤ）。変異型タンパク質は細胞表面に結合したが、腫瘍細胞により内在化されなかった。組換えタンパク質のより大きな凝集体が形成され、１５分目および３時間目には細胞表面に付着しているままだった（図４Ｄ）。
【００５０】
上記結果は、腫瘍細胞への内在化がＨＡＭＬＥＴとＣｙｓ５６７ＯＡの一般的な特徴であることを示しており、これは脂肪酸という補因子が腫瘍細胞への取り込みおよび殺腫瘍活性に必要とされることを示唆している。さらに、組換えタンパク質がそれ自体内在化可能であるという証拠はなかった。
実施例６
ＴＵＮＥＬ染色
ＨＡＭＬＥＴは、ＴＵＮＥＬ分析法を使用して、腫瘍細胞株、およびインビボのヒト腫瘍においてＤＮＡ損傷を引き起こすことが示されている（Mossberg et al. Int. J. Cancer (2007)121(6)1352-1359）。Ｃｙｓ５６７ＯＡに応じたＤＮＡ損傷の程度を調べるために、実施例４で使用した４つの腫瘍細胞株を複合体に６時間暴露した（リンパ腫細胞で１４μＭ、癌細胞で２８μＭ）。
【００５１】
ＨＡＭＬＥＴ、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaおよびα−ラクトアルブ
ミンを、対照として使用した。
細胞を遠心分離により採集し、ＰＢＳで希釈した４％パラホルムアルデヒド中で固定した。細胞を、Ｌ−リジンコーティングした顕微鏡スライド上で遠心分離し（２５×ｇ、５分、Cytospin 3、Shandon社、英国Cheshire）、−２０℃で保存した。核ＤＮＡ損害を有
する細胞をＴＵＮＥＬ分析法（Roche、スイス国Basel）により識別した。簡単に説明すると、スライドを室温で解凍し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％ クエン酸ナトリウム、０．１％ Triton X-100で透過性にした。ＴＵＮＥＬ反応混合物を適用し、スライドを５％
ＣＯ2中で３７℃にて１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回線上し、カ
バーガラスおよび封入剤（Sigma-Aldrich、アメリカ合衆国ミズーリ州St Louise）を載せ、共焦顕微鏡検査法で調べた。
【００５２】
Ｃｙｓ５６７ＯＡは、すべての細胞の種類でＴＵＮＥＬ染色により検出されるＤＮＡ損傷を引き起こした(図５)。ＴＵＮＥＬ陽性の細胞の数はＨＡＭＬＥＴで処理した細胞における数に類似していた。対照的に、実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaおよび
α−ラクトアルブミンはＴＵＮＥＬ染色に影響を及ぼさなかった。結果は、オレイン酸および溶融された球状複合体の両方の細胞傷害効果が核ＤＮＡの損傷を含むことを示している。
【００５３】
要約すると、８つのシステイン残基がすべてアラニンに置換されたα−ラクトアルブミンの配列を有する実施例１の組換えタンパク質ｒＨＬＡall-Alaは、すべての条件下で、
オレイン酸の存在下で生物学的に活性な複合体に容易に変換される。実際、生産プロセスは驚くほど良好で、単一ピークの増大された収率を与えた。これは、製造の観点で特に有利である。さらに、得られた複合体は、リンパ腫と癌細胞の細胞系列に対して強い殺腫瘍活性を示した。共焦顕微鏡検査法により、腫瘍細胞の核内に複合体が蓄積することが示され、それにより同一の殺腫瘍活性を有するＨＡＭＬＥＴの細胞往来パターンが再現された。したがって、Ｃｙｓ５６７ＯＡは特に好ましい薬の候補を代表する。
【００５４】
実施例７
Ｃｙｓ５６７ＯＡの構造の研究
（実験手順）
1Ｈ ＮＭＲ分光分析−実施例１で説明した組換えヒトα−ラクトアルブミンｒＨＬＡall-Ala、ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡを、２．０ｍｌ Zebaスピン脱塩カラム（Thermo Scientific）を用いてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、２．０Ｍ尿素）に
溶媒交換した。結合Ｃａ2+イオンを含むヒトＨＬＡを、２．０Ｍ尿素を含む蒸留水に溶媒交換し、ｐＨを７に調節した。すべての場合で、溶媒は１０％のＤ2Ｏを含んでいた。４
つのサンプルの一次元1Ｈ ＮＭＲ分光測定値を、間接検出クリオプローブ（Bruker BioSpin）を備えた６００ＭＨｚ Ultrashield分光計で得た。２０℃、３０℃、４０℃、５０
℃および５５０℃の温度を、可変温度ユニットで維持した。
【００５５】
ＨＬＡとは別に、α−ラクトアルブミンの溶融された球状種に見出されるように、ｒＨＬＡall-Ala、ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡの一次元1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、解像能が悪く、大きく広がった（図６Ａ−Ｄ）。α−ラクトアルブミンの天然または天然に類似の三次元構造の重要なスペクトルの特徴１つは、Ｉｌｅ９５のδＣＨ3プロトン（
３０℃で−０．７ｐｐｍ）およびＶａｌ９２のγＣＨ3プロトン（３０℃で−０．５ｐｐ
ｍ）に対応する強い上部領域にシフトしたメチル共鳴である（図６Ｂおよび７Ａ）。この基準を使用すれば、ＨＡＭＬＥＴは、一般にスペクトル全体にわたりピークが広いにもかかわらず、折り畳まれたＨＬＡよりはるかに低い集団でも、かなりの天然に類似の構造をまだ有することが直ちに明らかとなった（図７Ａ）。これは、ＨＡＭＬＥＴの楕円率振幅がａｐｏ−ＨＬＡとｒＨＬＡall-Ala／Ｃｙｓ５６７ＯＡとの中間である近紫外線ＣＤス
ペクトルと一致していた。サンプルをさらに区別する手段として、各タンパク質またはタンパク質−脂肪酸複合体を、２．０Ｍ尿素の存在下で徐々に高い温度に暴露させた。尿素を加える理由は２つあり、１つ目はタンパク質（特にｒＨＬＡall-Ala）の溶解度を援助
するためであり、２つ目は、分子の動的性質を微妙に増大させて、より速い時間目盛り（折りたたまれていない高度に動的な分子で観察されるもの）からのマイクロ秒からミリ秒までの時間目盛でのコンホメーションの変動（溶融された球体で観察されるもの）を区別するためである。２Ｍ尿素を加えてもタンパク質からオレイン酸が剥離されず、２Ｍ尿素の存在は、ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡの細胞毒性活性に否定的影響を与えなかった（２Ｍ尿素およびリン酸緩衝液と３０分間インキュベート、データは非図示）。
【００５６】
ＨＬＡの場合、完全に折り畳まれた天然構造の結果としての化学シフトの広い分散と明確なピークから始まって（２０℃および３０℃）、ピークは徐々に広がり、化学シフト分散は範囲が狭くなるように見えた（４０℃から５５℃）（図６Ｂ）。高温でも上部領域にシフトしたメチル共鳴の特性がまだ存在したが、ピークの高さはピークが広がるにつれてますます小さくなった（図７Ａ，Ｂ）。これは２．０Ｍ尿素の存在下の５５℃ではかなりの数の溶融された球状分子が存在していることを示唆している。比較のため、α−ラクトアルブミンが古典的な高温の溶融された球状状態になる条件は約９０℃である（ｐＨ７、化学変性剤はなし）。対照的に、ｒＨＬＡall-Alaのスペクトルは、小さい化学シフト分
散と広いピーク（２０℃および３０℃）から始まったが、高温でも、また化学シフトがさらに狭くなった場合でも、ピークは徐々に鋭くなる（４０℃から５５℃）（図６Ａ）。これは、溶融された球状状態からますます緩まった展開状態までタンパク質が変化を受けていることを示す。重要な１つの態様は、この変異型ではどの温度でも上部領域にシフトするメチル共鳴が全く存在しないことである（図７Ａ，Ｂ）。これは、近紫外線ＣＤスペクトル（非図示）に見出される特徴によっても示唆されるように、ｒＨＬＡall-Alaがすべ
ての温度で強い残基間の側鎖相互作用を欠くことを示唆している。
【００５７】
上述したように、ＨＡＭＬＥＴのスペクトル（２０℃および３０℃；図７）は、Ｉｌｅ９５のδＣＨ3プロトン（３０℃で−０．７ｐｐｍ）およびＶａｌ９２（３０℃で−０．
５ｐｐｍ）のγＣＨ3プロトンを示し、ＨＬＡよりも少ない数でも天然に類似の三次元構
造の存在を示している。温度が増大すると、ピークの多くが鋭利になり（図６Ｄ）、これらの上部領域共鳴が消える（図７Ｂ）ため、低温では部分的に天然に類似しているが、ＨＡＭＬＥＴの全体的な挙動が天然ＨＬＡのそれとは著しく異なることを示唆している。実際、ＨＡＭＬＥＴの高磁場領域のＮＭＲスペクトルは５５℃でＣｙｓ５６７ＯＡのそれと同一であることが分かり（図７Ｂ）、０．０５ｐｐｍにおける非常に小さなピ−クを除い
て高磁場領域共鳴はない。驚くべきことに、Ｃｙｓ５６７ＯＡの場合、温度が増加するにつれ、溶融球体は予測通りにピークが鋭くなり（図６Ｃ）、高磁場領域に変化はない（図７Ａ、Ｂ）。
【００５８】
この一連の実験では、温度を変化させた1Ｈ ＮＭＲ分光を使用して、（ｉ）スペクト
ルがよく分散された狭いピークを示す天然状態、（ｉｉ）スペクトルがあまり分散せず広いピークを示す溶融された球状状態、および（ｉｉｉ）スペクトルがあまり分散せず狭い小球ピ−クを示すｒＨＬＡall-Ala、ＨＬＡ、ＨＡＭＬＥＴおよびＣｙｓ５６７ＯＡの展
開状態を区別した。α−ラクトアルブミンとその様々な溶融された球状状態、ならびにアポミオグロビン等の他の原型タンパク質について、バックボーン動力学の重要な研究がかなり詳細に行われた。かかる研究の主体は、異なる実験条件下での異なる構造部位の、バックボーン動力学の複雑さと微妙さとを示している。この研究から到達した重要な結論の１つは先ず、Ｃｙｓ５６７ＯＡが生理的条件下ではＨＡＭＬＥＴとは明らかに構造が異なるということである。さらに、ＨＡＭＬＥＴは天然類似の分子集団を含んでいるが、Ｃｙｓ５６７ＯＡには天然類似の側鎖パッキングが完全に欠けており、にもかかわらずＨＡＭＬＥＴと等価な細胞毒性活性を示す。したがって、アミロイド原繊維の例と異なり、慎重に人為設計された非天然の部分的に展開された構造の集団は、その環境に従って、細胞への独立した効果を与えることが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性な複合体を生産する方法であって、
分子内ジスルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、生物学的に活性な複合体が形成される条件下で、オレイン酸と接触させること、および
前記複合体を分離すること、
からなる方法。
【請求項２】
前記組換えタンパク質は、すべてのシステイン残基が別のアミノ酸に変化されたα−ラクトアルブミンからなる請求項１に記載に記載の方法。
【請求項３】
α−ラクトアルブミン中のシステイン残基がアラニン残基に変化されている請求項２に記載の方法。
【請求項４】
α−ラクトアルブミンはヒトα−ラクトアルブミンである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載のα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、イオン交換カラム、特には陰イオン交換カラムでオレイン酸と接触させる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記カラムは直線の塩勾配で溶出され、前記生物学的に活性な複合体は高塩濃度で溶出する単一の分画から分離される請求項５に記載に記載の方法。
【請求項７】
高塩濃度は１Ｍ ＮａＣｌまたはその等価物である請求項６に記載に記載の方法。
【請求項８】
組換えタンパク質が、配列番号１：
【表１】
と、
該配列番号１のタンパク質の末端に取り付けられた任意選択の２０以下のアミノ酸と、を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換えタンパク質が、配列番号２：
【表２】
を有する請求項８に記載に記載の方法。
【請求項１０】
分子内ジスルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントと、オレイン酸とを含む生物学的に活性な複合体。
【請求項１１】
前記組換えタンパク質は配列番号１または配列番号２を有する請求項１０の生物学的に活性な複合体。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載の複合体と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１３】
治療に使用される請求項１０または請求項１１に記載の生物学的に活性な複合体。
【請求項１４】
癌の治療に使用される請求項１３に記載の生物学的に活性な複合体。
【請求項１５】
α−ラクトアルブミンまたはそのフラグメントをイオン交換条件下でオレイン酸を接触させることを含むプロセスにより取得可能な生物学的に活性な複合体の収率を増加させる方法であって、
少なくともいくつかの分子内ジスルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、前記プロセスにおいて使用することからなる方法。
【請求項１６】
少なくともいくつかのシステイン残基が別のアミノ酸に変化される請求項１６に記載に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的に活性な複合体の製造における、分子内ジスルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントの使用方法であって、該組換えタンパク質またはそのフラグメントにおいて、例えばシステイン残基、詳細にはすべてのシステイン残基が別のアミノ酸に変化されている、使用方法。
【請求項１】
生物学的に活性な複合体を生産する方法であって、
分子内ジスルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、生物学的に活性な複合体が形成される条件下で、オレイン酸と接触させること、および
前記複合体を分離すること、
からなる方法。
【請求項２】
前記組換えタンパク質は、すべてのシステイン残基が別のアミノ酸に変化されたα−ラクトアルブミンからなる請求項１に記載に記載の方法。
【請求項３】
α−ラクトアルブミン中のシステイン残基がアラニン残基に変化されている請求項２に記載の方法。
【請求項４】
α−ラクトアルブミンはヒトα−ラクトアルブミンである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載のα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、イオン交換カラム、特には陰イオン交換カラムでオレイン酸と接触させる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記カラムは直線の塩勾配で溶出され、前記生物学的に活性な複合体は高塩濃度で溶出する単一の分画から分離される請求項５に記載に記載の方法。
【請求項７】
高塩濃度は１Ｍ ＮａＣｌまたはその等価物である請求項６に記載に記載の方法。
【請求項８】
組換えタンパク質が、配列番号１：
【表１】
と、
該配列番号１のタンパク質の末端に取り付けられた任意選択の２０以下のアミノ酸と、を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換えタンパク質が、配列番号２：
【表２】
を有する請求項８に記載に記載の方法。
【請求項１０】
分子内ジスルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントと、オレイン酸とを含む生物学的に活性な複合体。
【請求項１１】
前記組換えタンパク質は配列番号１または配列番号２を有する請求項１０の生物学的に活性な複合体。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載の複合体と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１３】
治療に使用される請求項１０または請求項１１に記載の生物学的に活性な複合体。
【請求項１４】
癌の治療に使用される請求項１３に記載の生物学的に活性な複合体。
【請求項１５】
α−ラクトアルブミンまたはそのフラグメントをイオン交換条件下でオレイン酸を接触させることを含むプロセスにより取得可能な生物学的に活性な複合体の収率を増加させる方法であって、
少なくともいくつかの分子内ジスルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントを、前記プロセスにおいて使用することからなる方法。
【請求項１６】
少なくともいくつかのシステイン残基が別のアミノ酸に変化される請求項１６に記載に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的に活性な複合体の製造における、分子内ジスルフィド結合を欠くα−ラクトアルブミンの配列を有する組換えタンパク質またはそのフラグメントの使用方法であって、該組換えタンパク質またはそのフラグメントにおいて、例えばシステイン残基、詳細にはすべてのシステイン残基が別のアミノ酸に変化されている、使用方法。
【図２】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図１】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図１】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５１４４６６（Ｐ２０１２−５１４４６６Ａ）
【公表日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４９２６（Ｐ２０１１−５４４９２６）
【出願日】平成２２年１月８日（２０１０．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５００２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９３６２
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５０６２９１８６３）ハムレット・ファルマ・アーベー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月８日（２０１０．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５００２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９３６２
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５０６２９１８６３）ハムレット・ファルマ・アーベー (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]