複合体
少なくとも１つの標的タンパク質および前記標的タンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも１つの結合分子を含む複合体であって、結合親和性を有する前記分子が、少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合または非共有結合で結合している複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質、結合分子、およびポリマーの複合体に関する。前記複合体の調製法および複合体の使用法も更に開示される。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾患の根底にある分子生物学的原理の理解が進み、ヒトポリペプチドの向上した組換え発現および送達系が利用可能になったことに主に起因して、タンパク質などのポリペプチドを治療応用に使用することが近年広がっている。ポリペプチド療法は、特に遺伝性の遺伝子欠損のため、特定の天然ポリペプチドが患者に欠乏または欠如する疾患に主として使用されている。
【０００３】
例えば、血友病は、特定の血漿タンパク質の欠乏により引き起こされる疾患である。血友病患者は、血液凝固カスケードのタンパク質構成要素の機能障害により引き起こされる出血性の罹患に苦しむ。罹患凝固因子に依存して、２つのタイプの血友病を区別することができる。両方とも、共通して、可溶性フィブリノゲンの不溶性フィブリンクロットへの変換が阻害されている。これらは、主として男性集団が罹患するＸ染色体連鎖劣性遺伝疾患である。
【０００４】
血友病Ａは、男性１００００人当たり１〜２人が罹患する。血友病Ａは、血液凝固カスケードの重要なエレメントであり非常に大型の糖タンパク質（Ｍｗ、およそ３３０ｋＤａ（Furie B., Furie B.C., Cell (1988) 53, 505-518））である第ＶＩＩＩ因子の欠乏または欠損により引き起こされる。このポリペプチドの配列は、３つの領域、いわゆるＡ１およびＡ２ドメインで構成されるＮ末端領域、中央のＢドメイン領域、ならびにＡ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインで構成されるＣ末端領域に細分化することができる。血液中で、第ＶＩＩＩ凝固因子は、不活性前駆物質として存在する。この因子は、安定化担体タンパク質として機能するフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）と強固に非共有結合で結合する。３つの特異的位置（７４０、３７２、１６８９位）におけるトロンビンによる第ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解切断は、この因子のｖＷＦからの解離を導き、カスケード内で凝血促進機能を放出する。その活性型では、第ＶＩＩＩ因子は第ＩＸａ因子の補助因子として機能し、それにより第Ｘ因子のタンパク質分解活性化を数桁加速させる。
【０００５】
血友病Ｂは、男性２５，０００人に約１人に起こる。血友病Ｂは、セリンプロテアーゼである第ＩＸ因子（クリスマス因子）の欠乏により特徴付けられる。この４１５アミノ酸ポリペプチドは、５６ｋＤａの糖タンパク質として肝臓で合成される。これが適切な機能を果たすためには、ビタミンＫの存在下でしか生じない翻訳後カルボキシル化ステップが必要である。
【０００６】
両タイプの出血性疾患の治療は、伝統的に、ヒト血漿由来の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の濃縮タンパク質剤の点滴を伴う。この方法は、血友病の効果的な療法であるが、肝炎またはエイズを引き起こすウイルスなどの種々の感染因子または血栓塞栓因子を伝染させるリスクを伴う。或いは、凝固因子を産生するための幾つかの組換えＤＮＡ技術が記述されている。この目的のために、野生型第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の対応するｃＤＮＡが単離され、好適な発現ベクターにクローニングされた（欧州特許出願公開第１６０４５７号；国際公開第８６／０１９６１号、米国特許第４，７７０，９９９号、第５，５２１，０７０号、および第５，５２１，０７０号）。
【０００７】
第ＶＩＩＩ因子の場合、血液凝固活性を示す複合体を産生するためにサブユニットを組換え発現させることは、当技術分野で公知である（例えば、欧州特許出願公開第１５０７３５号、欧州特許出願公開第２３２１１２号、欧州特許出願公開第０５００７３４号、国際公開第９１／０７４９０号、国際公開第９５／１３３００号、米国特許第５，０４５，４５５号、および第５，７８９，２０３号から）。更に、高度にグリコシル化されたＢドメインをコードする配列を部分的にまたは完全に欠如する短縮型ｃＤＮＡ変種の発現が記述されている（例えば、国際公開第８６／０６１０１号、国際公開第８７／０４１８７号、国際公開第８７／０７１４４号、国際公開第８８／００３８１号、国際公開第９４／２９４７１号、欧州特許出願公開第２５１８４３号、欧州特許出願公開第２５３４５５号、欧州特許出願公開第２５４０７６号、米国特許第４，８６８，１１２号、および第４，９８０，４５６号、欧州特許出願公開第２９４９１０号、欧州特許出願公開第２６５７７８号、欧州特許出願公開第３０３５４０号、ならびに国際公開第９１／０９１２２において）。より最近では、活性化プロテインＣによる第ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解性不活化を阻害するために、または治療患者に阻害性抗体の形成をもたらす免疫原性を低減させるために、様々な選択された点突然変異が導入された（例えば、米国特許第５，８５９，２０４号、５，４２２，２６０号、および第５，４５１，５２１号、国際公開第９７／４９７２５号、国際公開第９９／２９８４８号、ならびにM. L. Liu et al., British J. Haematol. 103: 1051-1060 (1998)を参照）。
【０００８】
しかしながら、第ＶＩＩＩ因子などのポリペプチド療法には、短い循環半減期、免疫原性、およびタンパク質分解を含む多数の欠点が伴う。例えば、ヒト体内のタンパク質第ＶＩＩＩ因子の半減期は約１２時間であるが、重症のフォンビルブランド病（ｖＷＤ）患者では、半減期は約２時間である。最近は、予防的治療が、先進国における血友病患者の最先端治療である。予防的治療では、通常１週当たり２〜４回の点滴が行われる。
【０００９】
例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン、およびモノクローナル抗体など、治療目的に使用される多数の更なるタンパク質が存在する。
【００１０】
多くの場合、治療用タンパク質の半減期を増加させて有効性を増加させるあるいは患者に投与される治療用タンパク質の量を低減させることは有用である。これにより、治療コストも低減される。
【００１１】
従来技術では、ポリペプチド治療薬の循環半減期の短さに対しては、ポリマーをポリペプチドに共有結合で結合(attach)することによって対処している。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を結合(attach)させることにより、幾つかのポリペプチドの半減期がいくらか向上することが示されている。
【００１２】
しかしながら、ポリマーの結合(attachment)には多くの問題が観察されている。例えば、ポリマーの結合(attachment)は、薬物活性の減少をもたらし得る。更に、タンパク質にポリマーを結合するために使用されるある種の試薬は、反応性が不十分であり、従って長い反応時間を必要とし、その間にタンパク質の変性および／または不活化が生じる可能性がある。また、結合(attachment)が不完全または不均一である場合、異なる特性を有する化合物の混合集団が生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の１つの目的は、従来技術の欠点を克服することであり、特に、点滴頻度（infusion rate）を低減させ、患者の生活の質を増加させるために、ヒトまたは動物循環中のタンパク質の半減期を延長させるための改良された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させるための方法に関する。
【００１５】
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの標的タンパク質および前記標的タンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも１つの結合分子を含む複合体であって、結合親和性を有する前記分子が、少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合または非共有結合で結合している複合体を開示する。
【００１６】
驚くべきことに、標的タンパク質を、該タンパク質に強固に結合(associating)可能な結合分子を介してポリマーに非共有結合で結合させることにより、結果として半減期の著しい増加がもたらされることが見出され、患者にとって劇的に有益であることが明らかになった。
【００１７】
結合分子が該タンパク質の特異的結合部位に結合(association)するため、結合分子に結合したポリマーは該タンパク質の近傍に位置することとなり、従って該タンパク質の生理学的特性に影響を及ぼす。該ポリマーのサイズおよび物理的特性のため、腎臓による該タンパク質の循環からのクリアランス、および／または例えば特定の細胞への取り込みによる該タンパク質の分解が妨害されると考えられる。
【００１８】
場合によっては、形成された複合体の全体サイズは、循環から除去され得る分子の最大サイズを超過していてもよい。特に、ポリマーに結合したタンパク質は、腎臓の膜を通過することができず、従って血流中に残り、尿を介して排泄されることはない。
【００１９】
結合分子およびポリマーは、協同して結合体を形成し、標的タンパク質は、前記結合体に非共有結合で結合させられる。好ましくは、結合分子は、前記結合体のポリマーに共有結合で結合させられる。
【００２０】
また、結合体は、細胞によるタンパク質の取り込み、および／または分解酵素によるタンパク質の認識および結合を妨害してもよい。特に、結合体は、タンパク質に結合した際に、タンパク質の分解および／またはクリアランスまたは全体的な電荷の変更に関与する特定のタンパク質領域を遮蔽してもよい。例えば、結合体は、（ｉ）タンパク質の細胞への取り込みを促進する受容体または因子、および／または（ｉｉ）プロテアーゼ、ユビキチン結合酵素、プロテアソームなどの分解経路に関与するタンパク質、によって認識されるタンパク質の結合領域を遮蔽する。
【００２１】
更に、本発明の複合体および方法は、治療に使用されるタンパク質の、循環中での半減期を延長するために、それらタンパク質を化学的に修飾する必要はないという利点も提供する。むしろ、本発明による結合体は、例えばそれらの機能を発揮させるために既存の医薬組成物に組み込むことができる。臨床承認に依存する薬学的応用の場合、このことは、治療用物質が変化しないため従来の結合戦略より有利である。本発明による複合体は、好ましくはｅｘ ｖｉｖｏで形成される。
【００２２】
従って、第１の態様では、本発明は、少なくとも１つの標的タンパク質および前記標的タンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも１つの結合分子を含む複合体であって、結合親和性を有する前記結合分子が、少なくとも１つのポリマーに好ましくは共有結合で結合している複合体を提供する。結合分子およびポリマーは協同して、標的タンパク質の結合部位に結合する結合体を形成する。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の複合体に存在する結合体、および複合体を形成するためのその使用を対象とする。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、第１の態様の複合体を調製するための方法であって、標的タンパク質を結合体と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２５】
第４の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させる方法であって、ポリマーと、標的タンパク質に対する結合能を有する結合分子と、を含む結合体に、標的タンパク質を接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２６】
第５の態様では、本発明は第１の態様の複合体の医薬における使用、および医薬組成物の調製における使用をそれぞれ対象とする。更に、この態様は、第１の態様の複合体を含む医薬組成物をも対象とする。
【００２７】
第６の態様では、本発明は、第３の態様の結合体を調製するための方法であって、ポリマーを結合分子に結合させるステップを含む方法を提供する。
【００２８】
本発明のこれらの態様の具体的実施形態が、下記および添付の特許請求の範囲において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】血液凝固因子ＶＩＩＩの３次元構造を示す図であり、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）とヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）との相互作用部位が強調されている。
【図２】第ＶＩＩＩ因子とヘパリノイド−ＨＥＳの１：１結合体との複合体の構造を示す図である。
【図３】共有結合アプタマー−ＨＥＳ結合体（Ａ＝アプタマー）を有する標的タンパク質の模式図を示す図である。
【図４】翻訳後修飾された標的タンパク質と模倣分子−ＨＥＳ結合体との結合の模式図を示す図である。
【図５】表面プラズモン共鳴を使用した、ＨＥＳヘパリン結合体の結合解析を示す図である。
【図６】ｉｎ ｖｉｔｒｏで第ＶＩＩＩ因子と比較した第ＶＩＩＩ因子ＨＥＳ結合体の半減期延長を示す図である。
【図７】ｉｎ ｖｉｖｏで第ＶＩＩＩ因子と比較した第ＶＩＩＩ因子ＨＥＳ結合体の半減期延長を示す図である。
【図８】フコイダンに対するヒト第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の、表面プラズモン共鳴に基づく結合解析を示す図である。
【図９】活性化ＨＥＳ（Ｃ１マレイミドＨＥＳ−点線）、チオールで修飾されたＬＭＷＨ（実線）、および精製ＬＭＷＨ−ＨＥＳ結合体（破線）のＳＥＣ−ｄＲＩ／ＵＶ／ＭＡＬＳ測定から得られた屈折率クロマトグラムを示す図である。カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ；移動相：１５０ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ＝６．５（ピーク＞４０分：塩）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義：
本明細書中において、以下の表現は、好ましくは下記に示されるような意味を有することが一般的に意図される。ただし、それらの表現が使用されている文脈が異なる意味での使用を示唆している場合は、その限りではない。
【００３１】
本明細書中において、「含む」という表現は、「本質的に〜からなる」および「〜からなる」という表現をも包含し、具体的に指す。
【００３２】
本明細書中において、「複合体」という用語は、特に、複数の化合物間の非共有結合による物理的結合(physical association)を意味する。複合体中の各化合物（ここでは少なくとも標的タンパク質および結合体）は、１つまたは複数の（非共有結合による）分子間力、例えばイオン相互作用、双極子相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および／または疎水性効果、によって結合(associate)している。
【００３３】
「結合体」という用語は、特に、各化合物に由来する特性の少なくとも幾つかが結合体において保持されるように互いに連結している複数の化合物を意味する。連結は、共有結合により達成されてもよくまたは非共有結合により達成されてもよい。好ましくは、結合体の化合物は、共有結合により連結されている。１つの結合体中の種々の化合物は、化合物の原子間の１つまたは複数の共有結合により互いに直接結合していてもよい。或いは、各化合物は、化合物の原子に共有結合で結合しているリンカー分子により互いに結合していてもよい。結合体が２つを超える化合物で構成される場合、例えば、１つの化合物が次の化合物に結合(attach)することでこれら化合物が鎖構造状に連結していてもよく、または幾つかの化合物が各々中央にある１つの化合物に結合(attach)していてもよい。
【００３４】
本明細書中において、「タンパク質」という用語は、アミノ酸の分子鎖、または複数のアミノ酸鎖の複合体を指す。タンパク質は、天然アミノ酸ならびに人工アミノ酸のいずれを含有していてもよく、生物由来であっても合成由来であってもよい。タンパク質は、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、および／またはリン酸化によって、天然に修飾されてもよく（翻訳後修飾）または合成的に修飾されていてもよい。タンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸を含むが、いなかる特定の長さである必要もない。この用語はいかなるサイズ制限も含まない。本出願では、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、互換的に使用される。好ましくは、タンパク質は、少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む。
【００３５】
「核酸」という用語は、一本鎖および二本鎖の核酸およびリボ核酸、ならびにデオキシリボ核酸を包含する。
【００３６】
「結合部位」という用語は、特に、その形状、疎水性、および／または（部分的）電荷の結果としての、タンパク質の領域を指す。好ましくは、結合部位は、例えばヘパリンなどの標的分子と非共有結合により天然で結合(associating)可能である。
【００３７】
結合部位の具体的例は、ヘパリン、ならびに／またはヘパラン硫酸、ヘパリノイド、および／もしくはそれらの誘導体などの緊密に関連した化合物に結合可能なヘパリン結合部位である。別の例は、一価金属イオン、二価金属イオン、三価金属イオン、および四価金属イオンからなる群から選択される金属イオンに結合可能な金属イオン結合部位である。例示的な金属イオンは、亜鉛、銅、コバルト、カドミウム、および水銀イオンである。更なる例は、ＲＧＤペプチド、つまりアミノ酸配列、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）を含有するペプチド、または密接に関連する配列を有するペプチド、および／またはそれらの誘導体に結合可能なＲＧＤ結合部位である。更なる例は、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質（saccharolipid）、ポリケチド、ステロール脂質、プレノール脂質（prenol lipid）、および脂肪酸等の脂質に結合可能な脂質結合部位である。
【００３８】
本明細書中において、「結合分子」という用語は、タンパク質の結合部位に非共有結合で結合可能な化合物を意味する。好ましくは、結合部位への結合は特異的であり、つまり、それは、タンパク質の天然環境、例えばヒトまたは動物循環中に存在する他のほとんどの分子との相互作用より強力である。好ましい実施形態では、生理学的条件下で、１ｍＭ以下、より好ましくは３００μＭ以下、１００μＭ以下、３０μＭ以下、１０μＭ以下、３μＭ以下、１μＭ以下、３００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、および最も好ましくは１０ｎＭまたは１ｎＭ以下の解離定数を有する親和性で結合性部分が結合部位に結合する。結合性部分の構造および組成は、それが結合部位に結合することができる限り、いかなる点においても限定されない。好ましくは、結合性部分は、非毒性であり生理学的許容される。例えば、結合性部分は、ペプチド部分、サッカライド部分、核酸部分、脂質部分、もしくはそれらの模倣化合物、またはそれらの組合せであってもよい。結合分子の具体的な例は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、特にヘパリン模倣ペプチドなどのヘパリン様分子、ＲＧＤペプチド、金属イオン模倣体、および脂質、それらの誘導体、およびそれらの模倣体である。
【００３９】
「ポリマー」という用語は、特に、共有結合で結合したより大型の分子を形成する複数の分子種（「モノマー」）で構成される化合物を指す。ポリマーは、天然であってもよくまたは合成であってもよく、直鎖状であってもよく、分岐状であってもよく、または樹状であってもよい。ポリマーは、反応性基などの好適な置換基で更に誘導体化されてもよい。
【００４０】
「水溶性ポリマー」という用語は、水に可溶性であるポリマーを指す。マイクロタイタープレートおよびチューブなどを生成するために使用される固体ポリマーとは対照的に、水可溶性ポリマーは、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、相分離せずに水との溶液を形成する。
【００４１】
「ヒドロキシアルキルデンプン」または「ＨＡＳ」という用語は、少なくとも１つのヒドロキシアルキル基により置換されているデンプン誘導体を指す。デンプンは、好ましくは、ジャガイモデンプンまたはトウモロコシデンプンなどの天然デンプンである。ヒドロキシアルキル基は、好ましくは、グルコース単位のＣ２、Ｃ３、および／またはＣ６炭素原子で酸素に結合しており、主としてＣ２およびＣ６に存在する。導入されたヒドロキシアルキル基の量は、１グルコース分子当たりのヒドロキシアルキル基の平均数として定義されるモル置換度ＭＳとして表すことができる（最大ＭＳ＝３．０；通常は０．４〜０．７）。結合(attach)したヒドロキシアルキル基は、任意の好適な化学構造を有していてもよいが、好ましくは例えば１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐の低級アルキル基である。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、２〜８個、より好ましくは２〜４個の炭素原子を有する。例えば、ヒドロキシアルキル基は、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、またはヒドロキシブチル基であってもよく、ヒドロキシエチル、特に２−ヒドロキシエチルが最も好ましい。ヒドロキシアルキル基がヒドロキシエチル、好ましくは２−ヒドロキシエチルであるヒドロキシアルキルデンプンは、「ヒドロキシエチルデンプン」または「ＨＥＳ」と呼ばれる。
【００４２】
化合物の「誘導体」は、特に、１つまたは複数の化学的部分によって置換されているかおよび／または１つもしくは複数の化学的部分が欠失している前記化合物を指す。誘導体には、天然のプロセス（例えば、タンパク質のリン酸化、核酸のメチル化など）によって得られるもの、ならびに化学合成によって得られるものが包含される。誘導体の例示的な置換基は、ヒドロキシ、カルボキシ、ケト、アルデヒド、アミノ、亜硫酸、硫酸、およびリン酸基などの官能基、またはアルキル、アリール、アルコキシなどその他の基である
【００４３】
標的化合物の「模倣体」は、本明細書中において、特に、標的化合物の特性と類似した１つまたは複数の特性を有する化合物を意味する。特に、標的化合物が、タンパク質の特異的結合部位に結合可能である場合、標的化合物（例えば、ヘパリン）の模倣体も、好ましくは同様の親和性で前記結合部位に結合することができる。より好ましくは、結合部位に対する親和性を定義する模倣体の解離定数は、標的化合物の解離定数の１０００倍以下、より好ましくは標的化合物の解離定数の５００倍以下、１００倍以下、５０倍以下、２０倍以下、１０倍以下、５倍以下、２倍以下、１．５倍以下、１．２倍以下であり、最も好ましくは、標的化合物の解離定数と等しいかまたはそれより低い。
【００４４】
好ましい実施形態では、模倣体の３次元構造および／または電荷の空間的分布は、少なくとも結合部位への結合に関連する部分またはその一部において、目標化合物の３次元構造および／または電荷の空間的分布と類似している。
【００４５】
「リンカー」とは、複数の標的化合物を互いに連結させる化学的部分である。この目的のため、リンカー分子は、それが目標化合物に結合する前には、標的化合物と共有結合を形成可能な官能基を提示している。２つの標的化合物間の連結は、１つのリンカー分子を使用して形成されてもよく、または第２の（または両方の）標的分子と結合させる前に、一連のリンカー分子を互いに結合させてもよい。
【００４６】
「循環」という用語は、本明細書中において、特に、ヒトまたは動物の心臓血管系および／またはリンパ系、好ましくは心臓、血液、および血管を含む心臓血管系を指す。
【００４７】
化合物の「半減期」は、特に、化合物の量がその初期値の半分に減衰するのに必要な時間を指す。例えば、循環中の化合物の半減期は、循環中の化合物の濃度が、初期濃度（例えば化合物が循環に加えられた時の濃度）の半分に減少するのに必要な時間である。循環中の化合物の半減期は、化合物の腎クリアランス速度、化合物の（酵素性）分解速度、化合物の細胞への取り込み速度などの様々な要因の影響を受ける。
【００４８】
「医薬組成物」という用語は、特に、ヒトまたは動物への投与に好適な組成物、つまり薬学的に許容される成分を含有する組成物を指す。好ましくは、医薬組成物は、担体、希釈剤、または、緩衝剤、保存剤、もしくは張性調節剤などの医薬賦形剤と共に、活性化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグを含む。
【００４９】
化合物の「分子量」という用語は、特に、１モルの前記化合物の重量を指す。化合物が多分散である場合、分子量は、多分散混合物の重量平均分子量を指し、従って混合物に含まれる個々の化合物は、示された重量平均分子量より高いかまたは低い分子量を有していてもよい。
【００５０】
本明細書中で言及された特許、特許出願、科学論文、および他の文書は全て、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００５１】
本発明は、ヒトまたは動物循環中の標的タンパク質の半減期を、ポリマーに結合させた結合分子を使用して、該ポリマーを該標的タンパク質に非共有結合で結合させることにより増加させることができるという知見に基づく。
【００５２】
この点で、本発明は、標的タンパク質と、ポリマー性部分および該標的タンパク質に対して結合能を有する結合性部分を含む結合体とを含み、該標的タンパク質が該結合体に非共有結合で結合している複合体に関する。
【００５３】
循環半減期を増加させる標的タンパク質は、該結合性部分と結合(associating)可能な結合部位を提示している限り、いかなるタンパク質であってもよい。好ましくは、タンパク質は水溶性である。ある実施形態では、タンパク質は、ヒトおよび／または動物において薬理活性を有し、好ましくは、疾患（例えば後に述べるような疾患）の治療に有用である。好ましくは、標的タンパク質は、治療の際に例えば静脈内または動脈内注射により、循環に直接投与される。
【００５４】
好ましい実施形態では、標的タンパク質は治療活性を有する。好適な標的タンパク質は、ヘパリン結合部位、ＲＧＤペプチド結合部位、ＲＧＤモチーフ、金属イオン結合部位、脂質結合部位、および核酸結合部位からなる群から選択される結合部位を含む。
【００５５】
好適な標的タンパク質は、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子（野生型およびＢドメイン欠失）、第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子、トロンビン、抗トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、およびフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）などの血液凝固タンパク質、エリトロポイエチンなどの増殖因子、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキンなどのサイトカイン、アルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、インテグリン、ディスインテグリン（disintegrin）などのプロテアーゼ阻害剤、フィブロネクチンおよびビトロネクチン（vitroncectin）などの細胞外マトリックスタンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼおよびＡＤＡＭ／ＡＤＡＭＴＳタンパク質などのメタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アポリポタンパク質、輸送タンパク質、ホルモン、阻害または制御作用性タンパク質、ならびにそれらの誘導体および変異体から選択される。
【００５６】
幾つかの実施形態では、標的タンパク質は、１０ｋＤａ以上の、好ましくは３０ｋＤａ以上の、および最も好ましくは５０ｋＤａ以上の分子量を有する。更に、タンパク質は、１０００ｋＤａ以下の、好ましくは５００ｋＤａ以下、最も好ましくは２００ｋＤａ以下の分子量を有していてもよい。
【００５７】
ヘパリン結合部位を含む好適な標的タンパク質は、例えば、抗トロンビン、トロンビン、フォンビルブラント因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ビトロネクチン、プロテインＣインヒビター、組織因子経路インヒビター、血小板第４因子、ヒスチジンに富む糖タンパク質、トロンボスポンジン、ウロキナーゼ、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、リパーゼ、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅである。
【００５８】
本発明に好適な結合部位の例は、ヘパリン結合部位、ＲＧＤペプチド結合部位、ＲＧＤモチーフ、Ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメイン、Ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメイン、金属イオン結合部位、脂質結合部位、および核酸結合部位である。好ましい実施形態では、タンパク質は、図１に示されている血液凝固因子ＶＩＩＩの結合部位などのヘパリン結合部位を含む。
【００５９】
ＲＧＤ結合部位を含む標的タンパク質には、例えばインテグリンが包含される。ＲＧＤモチーフ含有標的タンパク質の例は、ディスインテグリン、ならびにフィブロネクチンおよびビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質である。
【００６０】
金属イオン結合部位を含む標的タンパク質には、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼおよびＡＤＡＭ／ＡＤＡＭＴＳタンパク質などのメタロプロテアーゼ；およびメタロチオネイン（metallotheonein）が包含される。
【００６１】
脂質結合部位を含む標的タンパク質には、例えば、アポリポタンパク質が包含される。
【００６２】
好ましい実施形態では、標的タンパク質は、標的タンパク質の分解および／またはクリアランスに少なくとも部分的に寄与する結合性部分に対する結合部位を含む。
【００６３】
結合体の結合性部分は、循環中のその半減期が増加される標的タンパク質に応じて選択されなければならない。好ましくは、結合性部分は、標的タンパク質に対して選択的に結合する。通常、標的タンパク質および結合体の複合体は、結合性部分に結合可能な他のタンパク質の非存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで形成される。
【００６４】
標的タンパク質に対する結合性部分の強力な親和性および特異性は、複合体が特定の期間無傷のまま存在する（つまり投与の際に結合(associate)する）ことを確実にするために好ましい。これは、半減期の延長を達成するために重要である。２つの化合物の相互作用の結合強度は、通常、その解離定数Ｋｄによって表される。解離定数Ｋｄは、平衡定数であり、結合化合物に対する未結合化合物の比率、例えばタンパク質−結合体複合体に対する遊離標的タンパク質および遊離結合体の濃度を記述する。生体系における典型的な範囲は、マイクロモル〜ピコモルである。例えば、生理学的な塩濃度下では、タンパク質（つまり、ヘパリン結合タンパク質）に対するヘパリン結合のＫｄ値は、低〜高ナノモルの範囲にある。例えば、Olson et al., 1981 J. Biol. Chem., 256, 11073-11079では、抗トロンビンＩＩＩに対するヘパリンの結合について、７．２＋／−１．９×１０−８Ｍの解離平衡定数が決定されており、これは、タンパク質−ヘパリノイド相互作用が高親和性であることを実証している。
【００６５】
従って、標的タンパク質−結合性部分相互作用、および同様に標的タンパク質−結合体相互作用の解離定数Ｋｄは、好ましくは、マイクロモルまたはそれ未満の範囲にある。好ましくは、前記解離定数は、１００μＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下である。
【００６６】
結合分子は、ペプチド部分、サッカライド部分、核酸部分、脂質部分その他の有機化合物などの任意の化学的性質のものでよい。
【００６７】
１つの実施形態では、結合分子は、標的タンパク質の天然リガンド、または標的タンパク質に結合可能なリガンドの一部を含む。しかしながら、結合分子は、標的タンパク質の天然リガンドを含まなくてもよい。１つの実施形態では、結合分子は、標的タンパク質の天然リガンドの模倣体を含む。そのような模倣体は、いかなる化学的性質であってもよく、好ましくは、天然および／または人工アミノ酸を含むペプチド模倣体、天然および／または人工モノサッカライドを含むサッカライド模倣体、通常のリン酸ジエステル結合または人工的結合により結合させた天然および／または人工ヌクレオチドまたはペプチド核酸を含む核酸模倣体または有機化合物模倣体である。
【００６８】
従って、標的タンパク質がヘパリン結合部位を含む場合、結合分子は、ヘパリン部分、ヘパラン硫酸部分、またはフコイダン、硫酸化フカン、もしくはヘパリノイドのような、つまり高度に酸性の、例えば高度に硫酸化された多糖類、もしくはそれらの模倣体などのヘパリン様部分でもよい。ヘパリンは、エノキサパリン（クレキサン；Ｍｗ＝４，２ｋＤａ）または完全合成ペンタサッカリドフォンダパリヌクス（アリクストラ；１７２６．７７ｇ／ｍｏｌ）などの、約８０００Ｄａ未満の重量平均分子量を有する低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）でもよい。好ましくは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、またはヘパリノイドは、平均して、ペンタサッカリドなどの３〜２０個のモノサッカリド単位、より好ましくは５〜１５個のモノサッカリド単位で構成される。
【００６９】
好ましくは、ヘパリン様分子は、ヘパリン模倣ペプチドなどの、標的タンパク質のヘパリン結合部位に結合するペプチドである。従って、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の模倣体は、好ましくはＧｌｕまたはＡｓｐのような負電荷アミノ酸、硫酸化アミノ酸などの負電荷基で修飾されたアミノ酸、特に硫酸化チロシン、およびリン酸化アミノ酸、特にリン酸化チロシン、セリン、もしくはトレオニン、および／または側鎖に酸性部分を有する非天然アミノ酸を含むペプチドでもよい。好ましくは、ヘパリン模倣ペプチドは、硫酸化チロシンなどの１つまたは複数の硫酸化アミノ酸を含む。１つの実施形態では、模倣ペプチドは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｙ（ＳＯ３）−Ｘ２−Ｙ（ＳＯ３）を含み、式中、Ｙ（ＳＯ３）は、硫酸化チロシンであり、Ｘ１は、負電荷アミノ酸、セリン、アラニン、またはグリシンであり、Ｘ２はアスパルテート、アラニンであるかまたは存在しない。例示的な模倣ペプチドは、以下のアミノ酸モチーフを含む。
− ＳＹ（ＳＯ３）ＤＹ（ＳＯ３）、
− ＳＹ（ＳＯ３）ＤＹ（ＳＯ３）ＳＹ（ＳＯ３）ＤＹ（ＳＯ３）または
− Ｙ（ＳＯ３）Ｙ（ＳＯ３）ＧＧＹ（ＳＯ３）ＤＹ（ＳＯ３）。
【００７０】
更に、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の模倣体は、スラミンまたはその誘導体などの化学的な化合物、スルホン化ポリマー、アミノ酸側鎖を有するポリマー、モノサッカリドまたはジサッカリド側鎖を有するポリマーなどの有機ポリマーまたは硫酸化サッカライド、特に硫酸化ペンタサッカライドでもよい。
【００７１】
ヘパリンの好適な模倣体は、例えば、H. H. A. M. Hassan, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 7:1206-1235 (2007)、S. H. Kim and K. L. Kiick, Peptides 28:2125-2136 (2007)、およびH. D. Maynard and J.A. Hubbell, Acta Biomateriala 1:451-459 (2005)に記載されており、これら文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
標的タンパク質がＲＧＤ結合部位を含む場合、結合性部分は、ＲＧＤモチーフを含む天然または合成ペプチドでもよい。好適な配列は、ディスインテグリンおよび細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチンなどのインテグリン結合タンパク質に見出すことができる。
【００７３】
標的タンパク質がＲＧＤモチーフを含む場合、結合性部分は、例えば、幾つかのインテグリン、またはＲＧＤモチーフに特異的に結合する合成化合物、例えば国際公開第９０／０３９８３号または国際公開第９７／０８２０３号に記載されているような環状ペプチドに見出されるようなＲＧＤ結合タンパク質ドメインなどの、ＲＧＤ結合ペプチドでもよい。
【００７４】
標的タンパク質がＳＨ２ドメインを含む場合、結合性部分は、好ましくはチロシン残基、より好ましくはリン酸化チロシン残基を含むＳＨ２結合ペプチド、またはＳＨ２結合ペプチドの模倣体でもよい。
【００７５】
標的タンパク質がＳＨ３ドメインを含む場合、結合性部分は、好ましくはプロリン残基を含むＳＨ３結合ペプチド、またはＳＨ３結合ペプチドの模倣体でもよい。好ましくは、ＳＨ３結合ペプチドは、Ｐがプロリン、Ｘが任意のアミノ酸、好ましくは脂肪族アミノ酸であるアミノ酸モチーフＰ−Ｘ−Ｘ−ＰまたはＲがアルギニン、Ｋがリジン、およびＸが任意のアミノ酸であるアミノ酸モチーフＲ−Ｘ−Ｘ−Ｋを含む。
【００７６】
標的タンパク質が金属イオン結合部位を含む場合、結合分子は、アミン、カルボン酸、またはチオールなどの金属錯体の配位子でもよい。
【００７７】
標的タンパク質が脂質結合部位を含む場合、結合性部分は、リン脂質または脂肪酸などの脂質でもよい。
【００７８】
標的タンパク質が核酸結合部位を含む場合、結合性部分は、一本鎖または二本鎖のリボ核酸またはデオキシリボ核酸などの天然または合成核酸、またはペプチド核酸などのその模倣体でもよい。核酸結合部位が配列特異的である場合、結合性部分は、好ましくは、結合モチーフの配列全体と約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を有する配列などの、必要な配列または密接に関連する配列を有する核酸である。
【００７９】
１つの実施形態によると、結合分子は、抗体、またはその可変領域もしくは結合性部分を含む抗体の一部ではない。更なる実施形態によると、標的タンパク質は、抗体、またはその可変領域もしくは結合性部分を含む抗体の一部ではない。更に、１つの実施形態によると、結合分子も標的タンパク質も、抗体、またはその可変領域もしくは結合性部分を含む抗体の一部ではない。
【００８０】
好ましい実施形態では、標的タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子などのヘパリン結合部位を有するタンパク質であり、結合性部分は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパリノイド、またはそれらの模倣体である。
【００８１】
標的タンパク質の機能に対する結合分子の影響を最小限に抑えるために、結合性部分は、好ましくは可能な限り小さくあるべきである。従って、結合性部分は、好ましくは５０ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、更により好ましくは５ｋＤａ以下の分子量を有する。更に、結合分子は、１００Ｄａ以上、例えば５００Ｄａ以上の分子量を有していてもよい。
【００８２】
標的タンパク質の半減期の増加は、主として結合体の結合に起因する。従って、結合体は、標的タンパク質に結合すると、好ましくは、ヒトまたは動物体内の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させる。例えば、結合体は、標的タンパク質に結合すると、標的タンパク質の循環からのクリアランスまたは標的タンパク質の分解を妨害することができてもよく、ならびに／または細胞による標的タンパク質の取り込み、および／もしくは分解酵素による標的タンパク質の認識および結合に関与する標的タンパク質の１つまたは複数の領域を遮蔽することができてもよい。
【００８３】
ポリマーは、少なくとも１つの天然または合成の直鎖、分岐、または樹状ポリマーを包含し、好ましくは水および体液に可溶性であり、より好ましくは親水性である。好ましい実施形態では、ポリマー部分は、生物学的に不活性であり、および／または薬学的に許容される
【００８４】
ポリマーは、所望の目的に好適な任意のサイズであり得る。これを考慮すると、ポリマーは、好ましくは、５ｋＤａ以上、より好ましくは１０ｋＤａ以上の分子量を有する。上限としては、ポリマーは、１０００ｋＤａ以下の、より好ましくは３００ｋＤａ以下、および最も好ましくは２００ｋＤａ以下の分子量を有する。
【００８５】
特定の実施形態では、ポリマーは、多糖類、ポリペプチド、核酸、ポリエーテル、ポリエステル、およびポリオレフィンからなる群から選択されるポリマーを含む。好ましくは、ポリマー部分は、以下からなる群から選択されるポリマーを含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧホモポリマー、ｍＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマー、プロピレングリコールを有するエチレングリコールのコポリマーを含み、前記ホモポリマーおよびコポリマーが、置換されていないかまたは１つの末端が例えばアシル基で置換されているポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリグリセリンまたはポリシアル酸、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）およびそのコポリマー、ポリグルタミン酸、炭水化物、セルロース、およびメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）およびデキストリン、ならびにそれらの誘導体などのデンプン、硫酸デキストラン（dextransulfat）、カルボキシメチルデキストラン、架橋デキストラン、およびカルボキシメチルデキストリンなどのデキストランおよびデキストラン誘導体、キトサン、ポリビニルアルコール、およびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrollidon）、アルファ，ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド、ポリオキシエチル化ポリオール。
【００８６】
特定の実施形態では、ポリマーは、少なくとも５ｋＤａ、および好ましくは最大１０００ｋＤａ、より好ましくは８〜５００ｋＤａ、および更により好ましくは１０〜３００ｋａ、および１００〜３００ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有するヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンを含む。ポリマーは、１グルコース単位当たり約０．４〜約１．３、好ましくは０．４〜０．９または０．４〜０．７のヒドロキシアルキル（ヒドロキシエチル）によるモル置換度を有していてもよい。
【００８７】
ポリマーは、結合性部分に直接結合させてもよい。ポリマー部分および／または結合性部分が、適切な結合基を有していない場合、それらが他方の分子上の少なくとも１つの反応性基と反応して結合体を形成することができるように、１つまたは複数のリンカーを使用してポリマーおよび／または結合分子を適切に修飾することができる。この目的のためには、当技術分野で公知の任意の好適な結合戦略を使用することができる。好適なリンカー、ポリマー部分、および結合方法は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１０１６９８号およびOrlando, Michele、学位論文、Modification of proteins and low molecular weight substances with hydroxyethyl starch (HES)、Justus-Liebig-Universitat、ギーセン、ドイツ、２００３年にも詳細に記載されている。好ましくは、結合は特異的であり、その結果結合分子および／またはポリマーの１つまたは規定数の反応性基のみが結合に使用される。ポリマー、結合分子、および所望により用いてもよい１つまたは複数のリンカー、を相互に結合させるには、任意の好適な反応性基を使用することができる。
【００８８】
従って、結合分子またはポリマーがペプチドを含む場合、結合反応は、アルファ鎖アミノ基もしくはカルボキシ基を、または好ましくはペプチドに一度だけ生じるアミノ酸の側鎖反応性基を特異的に対象とすることができる。好適な側鎖反応性基の例は、システインのチオール基、リジン、アルギニン、またはヒスチジンのアミノ基、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシ基、アスパルテートまたはグルタメートのアミド基、およびセリン、トレオニン、またはチロシン（thyrosine）のヒドロキシ基である。しかしながら、人工アミノ酸により導入された反応性基も、結合に使用することができる。
【００８９】
結合分子またはポリマーがペプチドを含む場合、もう一方の部分に存在するかまたは導入された以下の反応性基を結合に使用することができる。
− ペプチドのアミノ基と反応するアシル化基、例えば酸無水物基、Ｎ−アシルイミダゾール基、アジド基、Ｎ−カルボキシ無水物基、ジケテン基、ジアルキルピロカルボン酸基、イミドエステル基、カルボジイミド活性化カルボキシル基。上記の基は全て、例えばタンパク質のアミノ基と反応して、アシルまたは類似の結合を伴う共有結合を形成することが知られている。
− ハロ−カルボキシル基、マレイミド基、活性化ビニル基、エチレンイミン基、ハロゲン化アリール基、２−ヒドロキシ−５−ニトロ−ベンジルブロミド基などの、ペプチドのスルフヒドリル（メルカプト）基、チオメチル基、イミダゾ基、またはアミノ基と反応するアルキル化基、およびペプチドのアミノ基と反応し、還元剤と共に用いられる脂肪族アルデヒド基およびケトン基。
− ジアゾカルボキシレート基、ならびにカルボジイミドおよびアミン基の組み合わせ、などの、ペプチドのカルボキシル基と反応するエステルおよびアミド形成基。
− ヨウ素などの酸化剤の存在下でスルフヒドリル基と反応する５、５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）基、オルト−ピリジルジスルフィド基、およびアルキルメルカプタン基などの、ペプチドのスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基。
− シクロヘキサンジオン基などのジカルボニル基、およびペプチドのグアニジン部分と反応する他の１，２−ジケトン基。
− ペプチドのフェノール基と反応するジアゾ基。
− ペプチドのアミノ基と反応する、臭化シアンと多糖類との反応に由来する反応性基。
【００９０】
結合反応を実施するのに好適なアミノ酸が、ペプチドを含む結合性部分／ポリマー部分にない場合、ペプチドにそれぞれのアミノ酸を、好ましくはそのアミノ終末端またはカルボキシ終末端に導入することができる。
【００９１】
結合性部分および／またはポリマー部分がサッカライドを含む場合、結合反応は、サッカライドの還元末端のアルデヒド／ヘミアセタール基またはケト／ヘミケタール基をそれぞれ特異的に対象とすることができる。好適な結合戦略は、例えば、国際公開第２００４／０２４７７６号Ａ１に記載されている。
【００９２】
例えば、還元末端のアルデヒド（aldhyde）／ヘミアセタール基を、他方の部分に存在するかまたは導入された第一級アミノ基による還元的アミノ化に供してもよい。この反応は、好ましくは、水素化ホウ素（例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム）または有機ホウ素複合体などの還元剤の存在下で実施される。或いは、アルデヒド／ヘミアセタール基を、ヨウ素、臭素、または好適な金属イオンなどの酸化剤を使用した選択的酸化または電気化学的酸化に供してもよく、その結果としてエステル、ラクトン、またはアミドなどのカルボキシ基または活性化カルボキシ基がもたらされる。その後、（活性化）カルボキシ基を、例えば以下のものなどの活性化剤の存在下でアミノ基と反応させてもよい。Ｎ−ヒドロキシサクシニミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、チオフェノール、ｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＨＯＯＢｔ）、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸（ＨＮＳＡ）、２−ヒドロキシピリジン、３−ヒドロキシピリジン、３，４−ジヒドロ−４−オキソベンゾトリアジン−３−オール、４−ヒドロキシ−２、５−ジフェニル−３（２Ｈ）−チオフェノン−１，１−ジオキシド、３−フェニル−１−（ｐ−ニトロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン）、［１−ベンゾトリアゾリル−Ｎ−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート］（ＢＯＰ）、［１−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ビス（ペンタメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、またはカルボジイミド、例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）。
【００９３】
結合性部分および／またはポリマー部分が核酸を含む場合、結合は、２’−ヒドロキシ基、３’−ヒドロキシ基、または５’−ヒドロキシ基によって行うことができる。結合性部分が脂肪酸を含む場合、そのカルボキシ基を使用することができる。ポリマー部分が、ポリエステル、ポリエーテル、またはポリオレフィンなどの有機ポリマーを含む場合、もし存在すればポリマーの終端の反応性基、ポリマーの単量体単位の反応性基、または導入された反応性基を、結合に使用することができる。
【００９４】
従って、本発明による結合体は、所望によっては、まずポリマー部分および／または結合性部分を化学的に修飾して、他方の部分で利用可能であるかまたは他方の部分に導入された化学基と反応可能な少なくとも１つの化学基をその上に有するポリマー部分および／または結合性部分を生成し、次にポリマー部分および結合性部分を共に反応させて、共有結合で結合したそれらの結合体を形成することによって、製作することができる。或いは、所望によっては修飾されていてもよいポリマー部分または所望によっては修飾されていてもよい結合性部分を、まず（更なる）リンカーに結合させ、次にリンカーを所望によっては修飾されていてもよい他方の部分に結合させてもよい。
【００９５】
結合反応の特定の実施形態では、第１のリンカーはポリマー部分に結合させられ、ここで前記第１のリンカーは、ポリマー部分と反応せず、ポリマー部分に存在しない反応性基を保持する。第２のリンカーは結合性部分に結合させられ、ここで前記第２のリンカーは、結合性部分と反応せず、結合性部分に存在しない反応性基を保持する。その後、第３のリンカーが、第１および第２のリンカーに順次または同時に結合させられる。第１および第２のリンカーに第３のリンカーを結合させるのに使用される反応性基は、この目的に好適な任意の反応性基であり得る。更に、第１および第２のリンカーをそれぞれポリマー部分および結合性部分に結合させる間、リンカーの反応性基は保護基により保護されていてもよい。
【００９６】
ポリマー部分、結合性部分、および所望により用いてもよい１つまたは複数のリンカーを互いに結合するために使用することができる例示的な反応性基は、Ｃ−Ｃ二重結合またはＣ−Ｃ三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合、ハロゲン化アシル、ハロ、ヒドロキシ、アルデヒド、アミド、アミノ、アミノオキシ、ヒドロキシアミノ、カルボニル、カルボキシ、活性化エステル、シアノ、チオシアノ、イミノ、ニトロ、ニトロソ、ニトリル、ペルオキシ、ホスホ、スルホニル、スルフィニル、チオール、ヒドラジン、およびヒドラジド基である。リンカーを互いに結合させるのに有用な反応性基対は、例えば、アミノ基およびスクシンイミドエステル基、チオール基およびマレイミド基である。
【００９７】
結合反応に使用することができる保護基の例は以下の通りである：
− アルコール保護用：アセチル（Ａｃ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、およびトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテルなどのシリルエーテル、メチルエーテル、およびエトキシエチルエーテル（ＥＥ）。
− アミン保護用：カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トシル（Ｔｓ）、およびスルホンアミド（Ｎｏｓｙｌ＆Ｎｐｓ）。
− カルボニル基保護用：アセタール、ケタール、アシラール、およびジチアン；および
− カルボン酸保護用：メチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびシリルエステル。
【００９８】
結合体中の結合分子数およびポリマー数は、適合する限り自由に選択することができる。従って、結合体は、１つだけ、２つ以上、３つ以上、および４つ以上などの１つまたは複数の結合分子を含んでいてもよい。同様に、結合体は、１つだけ、２つ以上、３つ以上、および４つ以上などの１つまたは複数のポリマーを含んでいてもよい。１つの実施形態では、結合体は、１つの結合分子および１つのポリマーを含む。
【００９９】
結合分子をポリマーに結合させるためにリンカーが使用される場合、１つのリンカーは、２つの分子を互いに、例えば１つの結合性部分を１つのポリマー部分に結合させることができ、または１つのリンカーは、２つを超える分子を互いに、例えば１つの結合性部分を２つ以上のポリマーに、２つ以上の結合分子を１つのポリマーに、または２つ以上の結合分子を２つ以上のポリマーに結合させることができる。
【０１００】
リンカーは、任意の好適な長さであり得るが、できるだけ短いことが好ましい。しかしながら、リンカーは、ポリマー部分が結合性部分および標的タンパク質の相互作用を妨害しないように、十分に長いことが望ましい。分子の結合に好適なリンカーは、従来技術において周知であり、商業的に入手可能でもある。
【０１０１】
結合体におけるリンカーの形成に好適な分子は、リンカーを結合分子、ポリマーおよび／または別のリンカー分子に結合させるために、２つ以上の官能基（上述のような）を含む。これら官能基は、好ましくは、脂肪族または芳香族炭水化物に由来するものなどの、薬学的に許容される架橋基により結合させられる。リンカーは、ホモ二官能性であってもよく、またはヘテロ二官能性であってもよい。
【０１０２】
結合体全体は、所望の応用に好適な任意のサイズを有することができる。しかしながら、結合体は、好ましくは５〜１０００ｋＤａ、好ましくは２０〜３００ｋＤａの分子量を有する。
【０１０３】
本発明の複合体は、１つまたは複数の、例えば１、２、３、または４つ以上の標的タンパク質、および１つまたは複数の、例えば１、２、３、または４つ以上の結合体で構成されていてもよい。１つの実施形態では、複合体は、１つの標的タンパク質のみおよび１つの結合体のみを含む。
【０１０４】
ヒトまたは動物の循環に投与された際の、本発明の複合体中の標的タンパク質の半減期は、好ましくは、その遊離形態（例えば、小型イオンと結合しているに過ぎず、本発明の結合体とは結合していない）で投与された際の半減期と比較して、少なくとも１．１倍、より好ましくは少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、および最も好ましくは少なくとも１０倍増加される。
【０１０５】
本発明の複合体は、医学に使用することができる。好ましくは、複合体中の標的タンパク質は、特定の疾患の治療または予防に有用な医薬活性を有する。より好ましくは、標的タンパク質は、ヒトまたは動物患者の循環においてその医薬活性を発揮する。好ましくは、治療または予防される疾患は、ヒトまたは動物体内の天然タンパク質の欠損または量の減少または非存在によって引き起こされる。
【０１０６】
特に、該疾患は、特定のタンパク質の遺伝子における先天性または後天性の欠損によって引き起こされてもよい。そのような疾患の具体的な例は、血友病Ａおよび血友病Ｂである。例えば、標的タンパク質は第ＶＩＩＩ因子であってもよく、複合体は血友病Ａの治療に使用されてもよく、または標的タンパク質は第ＩＸ因子であってもよく、複合体は血友病Ｂの治療に使用されてもよい。
【０１０７】
従って、別の態様では、本発明は、本発明の複合体を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、ヒトまたは動物患者に複合体を投与するのに好適な、任意の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を更に含むことができる。これらは、好ましくは非経口的に、特に注射、例えば静脈内または動脈内注射により投与される。
【０１０８】
好ましくは、医薬組成物は、１ｐＭ〜１ｍＭの濃度の本発明の複合体、または１用量当たり１ｐｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１００ｎｇ〜５００ｍｇ、の量の本発明の複合体を含む。
【０１０９】
本発明の複合体は、標的タンパク質を結合体と接触させることにより調製することができる。標的タンパク質は、例えば生理学的塩濃度および約６．０〜約８．５の範囲にある生理学的ｐＨを有する好適な溶媒、好ましくは水性溶媒中で結合体と接触させてもよい。しかしながら、溶媒および条件が複合体の形成を阻害しない限り、他の溶媒および条件で標的タンパク質を結合体と結合させてもよい。
【０１１０】
更なる態様では、本発明は、複合体を形成するために使用される結合体に関する。結合体の特定の実施形態は、本発明の複合体に関するセクションに上述されており、それは上記開示に参照されている。更に、本発明は、本発明の複合体を調製するための、それぞれの結合体の使用に関する。好ましくは、前記複合体はｅｘ ｖｉｖｏで調製される。
【０１１１】
更に、本発明は、ヒトまたは動物の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させる方法であって、ポリマー部分と、標的タンパク質に対する結合能を有する結合性部分と、を含む本発明の結合体に、標的タンパク質を接触させるステップを含む方法を提供する。標的タンパク質を結合体と接触させた後、それらは複合体を形成する。複合体は、接触の際に直接形成されてもよく、または例えばヒトまたは動物の循環などの適切な環境へと標的タンパク質および結合体を移す際にのみ形成されてもよい。好ましくは、ヒトまたは動物体内への投与前に、標的タンパク質を結合体と接触させる。特定の実施形態では、本方法は、ヒトまたは動物身体の外部で実施される。
【０１１２】
標的タンパク質を、１０：１〜１：１００００、好ましくは１．２：１〜１：１００、およびより好ましくは１：１〜１：１０のモル比で結合体と接触させる。
【０１１３】
以下においては、標的タンパク質がヘパリン結合部位を含む好ましい実施形態をより詳細に記述する。
【０１１４】
止血に関与する多数のタンパク質が、ヘパリンまたはヘパリノイドに結合する。中でも、アンチトロンビン、トロンビン、フォンビルブラント因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子は、ヘパリンまたはヘパリン様の酸性多糖類に結合する。ヘパリノイドの結合は、タンパク質表面上に発現されるいわゆるヘパリン結合ドメインにより媒介される。ヘパリノイドタンパク質相互作用は比較的親和性が高いため、ヘパリノイドまたは化学的に修飾されたその誘導体による、ヘパリン結合タンパク質の非共有結合による修飾が可能になる。
【０１１５】
血液凝固第ＶＩＩＩ因子の結晶構造に見ることができるように（図１を参照）、Ｓ５５８〜Ｑ５６５位のヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ヒドロキシアルキルデンプンの結合に利用可能である。
【０１１６】
加えて、Ｒ４８４〜Ｆ５０９位および／またはＥ１８１１〜Ｋ１８１８位で第ＦＶＩＩＩ因子に結合した低密度リポタンパク質受容体関連タンパク（ＬＲＰ）を、結合の標的とすることができる（図１を参照）。
【０１１７】
一般的に、生物学的機構の修飾は、異化および／または活性などが、特定の分子間相互作用の増大または阻害を結果としてもたらすように意図されている。その結果として、標的タンパク質の半減期が増加する。
【０１１８】
結合リガンドは、例えばヘパリンなどの酸性で負電荷の多糖類、または模倣ペプチド、核酸、および／もしくは有機分子などの他の結合物質でもよい。
【０１１９】
結合分子として、これらの高親和性リガンド（highly affine ligand）をそのまま、または特定の修飾をして使用することができる。
【０１２０】
結合体を形成するためには、それらを、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ／ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびオリゴ糖などのポリマーに結合させなければならない。
【０１２１】
酸性多糖類は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および例えばフコイダン、硫酸化フカン、またはガラクタンのような、他の酸性好ましくは陰イオン性の炭水化物ポリマーでもよい。
【０１２２】
「ヘパリノイド」と呼ばれるヘパリン様酸性オリゴ糖は、高度に酸性の、例えば高度に硫酸化された多糖類である。ヘパリノイドは、ほとんどの種に広範に見出され、少なくともヘパラン硫酸は、事実上全ての動物に見出される。
【０１２３】
ヘパリンは、典型的には、Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸のいずれかでできている二糖の繰り返しで構成される。Ｄ−グルコサミン（D-gulcosamin）は、Ｎ―アセチル化またはＮ−硫酸化アミノヘキソースとして存在することができ、Ｃ６またはＣ３で更に硫酸化されていてもよい。ポリサッカライド鎖は、典型的には、３ｋＤａ〜４０ｋＤａに及ぶ分子量を有する様々な長さであり得、還元末端および非還元末端を有する。還元末端は、多くの化学反応に、つまりタンパク質、炭水化物、および他の反応パートナーに結合させるために使用することができる。ヘパリン、ヘパリン硫酸の構造は、‘Heparin-Binding Proteins’ by H. Edward Conrad, Academic Press, 1998に詳細に記述されている。
【０１２４】
ヘパリンは、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗凝固用に、および医療用具の表面被覆用に商業的に使用されている。
【０１２５】
ヘパリンおよびヘパリノイドの顕著な特性は、多数のいわゆるヘパリン結合タンパク質との強力な相互作用である。１００個を超えるタンパク質がヘパリノイドに結合することが見出されている。それらの中で、凝固第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子だけでなく、凝固およびフィブリン溶解だけに関連しているわけではない多数の他のタンパク質が、特異的かつ強力にヘパリノイドと結合する。ヘパリン結合タンパク質の最も顕著で典型的な例は、アンチトロンビンである。
【０１２６】
他のヘパリン結合タンパク質は、例えば、アンチトロンビン、トロンビン、フォンビルブラント因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ビトロネクチン、プロテインＣインヒビター、組織因子経路インヒビター、血小板第４因子、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、トロンボスポンジン、ウロキナーゼ、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、リパーゼ、アポリポタンパク質Ｂ、およびアポリポタンパク質Ｅである。
【０１２７】
それらの中で、凝固およびフィブリン溶解に関連する多数のタンパク質が、特異的かつ強力にヘパリノイド（heparonoid）と結合する。ヘパリン結合タンパク質の最も顕著で典型的な例は、アンチトロンビンである。
【０１２８】
ヘパリン結合タンパク質は、少なくとも１つのいわゆるヘパリン結合ドメインを示す。ヘパリン結合ドメインの性質および共通の構造的特徴は、例えば、H. E. Conrad, ‘Heparin-Binding Proteins’, Academic Press, 1998により、以前に記述されている。
【０１２９】
ヘパリン−タンパク質結合の際立った特性は、その比較的高い親和性である。ヘパリノイド−タンパク結合の結合強度は、通常、上述のようにその解離定数Ｋｄによって表される。
【０１３０】
タンパク質のヘパリン結合部位に非共有結合で結合する人工酸性多糖類を合成することは、リガンド間の、つまり人工酸性多糖類と結合するタンパク質との間の更に高い結合親和性をその結果としてもたらすことができる。
【０１３１】
従って、ヘパリノイドのような酸性多糖類および特別に合成された人工酸性多糖類は、高親和性、非共有結合でヘパリン結合タンパク質、例えばヒトまたは組換え凝固第ＶＩＩＩ因子、ヒトまたは組換え凝固第ＩＸ因子、ヒトまたは組換えフォンビルブラント因子、および他の結合タンパク質のような止血に関与するヘパリン結合タンパク質に結合する理想的なリガンドである。
【０１３２】
ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、大量に存在する分子であり、多種多様な異なる結合パートナーと相互作用し、従ってある種の乱交雑的な結合挙動を示す。
【０１３３】
ヘパリンを他のヘパリノイドに置換することにより、標的タンパク質に対する結合親和性および特異性を誘発および最適化できるであろう。更に、例えば、人工的に合成されたまたは植物由来の陰イオン性多糖類に切り換えることにより、またはヘパリン模倣ペプチドを使用することにより、ウイルスまたはプリオンなどの伝染因子を含有するリスクを低減できるであろう。
【０１３４】
１つの考え得るヘパリン代替物は、フコイダンまたは硫酸化フカンである。
【０１３５】
フコイダンは、世界中の沿岸水域に大量に存在する硫酸化植物多糖類（Ｍｗは平均２０．０００Ｄａ）である。それらは、褐藻類（Ｐｈｙａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）および海生無脊椎動物に主として見出される。褐藻類に由来するフコイダンは、複雑な高度に分岐した硫酸化多糖類構造を含むが、海生無脊椎動物に由来する硫酸化フカンは、単一の連結タイプのみを含み、規則的な反復オリゴ糖構造だが多様な硫酸化パターンを示すフコースの直鎖ホモポリマーである（Pomin & Mourao, 2008；Berteau & Mulloy, Glycobiology 13, 2003に概説）。フコイダンおよび硫酸化フカンは、グリコサミノグリカンおよび他の硫酸化グルカンの硫酸置換パターンを模倣できることによって多くの生物活性を共有するため（Berteau & Mulloy, 2003）、ヘパリン代替物として示唆されている。それらは、ヘパリンのように、凝固のモジュレーターとして機能することができ（Chargaff et al., 1936）、炎症、細胞増殖および接着、ウイルス感染、ならびに受精などの多くの生物活性に影響を及ぼすことができる（Boisson-Vidal et al., 1995）。フコイダンは、植物由来であるため、ウイルスまたはプリオンなどの感染因子を含有する可能性はより低い。これにより、フコイダンは、半減期延長目的用でヘパリン結合タンパク質と非共有結合で結合するフコイダン−ポリマー結合体のような、ヘパリンの望ましい代替物となる。
【０１３６】
ヘパリンおよびヘパリノイドに依存せず、前記標的タンパク質に対して高度に特異的で親和性な非共有結合による結合パートナーとして多数の可能な種が存在する。これらの結合種には、特異的結合ペプチド（例えば抗体認識ドメインに由来する配列）もしくは模倣ペプチド、非中和抗体、低分子、またはＤＮＡ／ＲＮＡ断片（例えば、アプタマー）が包含される。
【０１３７】
アプタマーとは、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション法または同等のＳＥＬＥＸ法（指数関数的濃縮によるリガンドの系統進化）（Tuerk. & Gold (1990) Science）の過程を繰り返すことにより、低分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的に結合するように、ならびに細胞、組織、および生物などにさえ結合するように操作された核酸種である（Ellington & Szostak (1990) Nature）。アプタマーは、一般に使用されている生体分子、抗体の分子認識特性に匹敵する分子認識特性、すなわち低ナノモルからピコモル範囲の高特異性および親和性を提供するため、治療応用に有用である。それらの識別認識に加えて、アプタマーは、完全に試験管内で操作することができ、化学合成により容易に生成され、望ましい保管特性を有し、治療応用において免疫原性をほとんどまたは全く誘発しないため、抗体より有利な点を提供する。
【０１３８】
アプタマーは、標的タンパク質に対する非常に特異的かつ高親和性の結合を示すため、アプタマーは本明細書において、アプタマー−ポリマー結合体内の、標的タンパク質に対する非共有結合による結合パートナーとして示唆される（図３を参照）。アプタマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来であるため、ウイルスまたはプリオンなどの感染因子を全く含まず、そのため半減期を延長させる手法のための望ましい成分となる。
【０１３９】
わずかに異なる手法では、半減期延長のための非共有結合による結合パートナーとの特異的相互作用の有望な標的として翻訳後修飾（グリコシル化などのＰＴＭ）が注目されている。
【０１４０】
一例として、本明細書には、グリコシル化ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体が挙げられる。ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦの脱シアリル化は、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ；Sodetz et al., JBC 1977 & 1978）による迅速な血漿クリアランスの要因である。これら十分に特徴がわかっているＡＳＧＰ−Ｒ相互作用に関する知識（Meier 2005）に基づいて、ＡＳＧＰ−Ｒ模倣ペプチドを生成および合成し、短いリンカーを介してポリマー、例えばＨＥＳ／ＨＡＳ部分に結合することができるであろう（図４を参照）。その後、この結合体を使用してＡＳＧＰ−Ｒ結合部位を遮断し、遮蔽効果または立体障害による受容体媒介性クリアランスを阻害することができ、従って血漿半減期を延長することができるであろう。
【０１４１】
標的タンパク質と酵素との特異的な非共有結合による相互作用に基づく模倣ペプチドを使用する別の例は、エラスターゼとＧ−ＣＳＦとの相互作用である：
【０１４２】
エラスターゼは、好中球エラスターゼ（ＮＥ）またはヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）としても知られており、Ｇ−ＣＳＦと特異的に結合する（Hunter et al., 2003）。エラスターゼ結合領域のアミノ酸配列に基づいて、模倣ペプチドを生成および合成し、ポリマーに（例えば短いリンカーを介してＨＥＳ／ＨＡＳ部分に）結合させて、Ｇ−ＣＳＦの半減期を延長することができるであろう。
【０１４３】
既存のＧ−ＣＳＦ（Hill et al., PNAS (90) 1993）のＸ線構造および幾つかの既知の非中和抗Ｇ−ＣＳＦ抗体のＸ線構造（Layton et al., JBC (266) 1991）に基づいて、標的とする現象を模倣する模倣ペプチドを、非共有結合によるポリマーの標的タンパク質への結合を行うために生成することができるであろう。この例では標的タンパク質はＧ−ＣＳＦであり、前記非共有結合によるポリマーの標的タンパク質への結合はＧ−ＣＳＦ医薬の半減期を延長するために行われる。
【０１４４】
特定の実施形態では、本発明は、ヘパリン結合部位を有する少なくとも１つのタンパク質、および少なくとも１つのヘパリンまたはヘパリン様分子を含む複合体であって、ヘパリンまたはヘパリン様分子が、ヒドロキシアルキルデンプンに共有結合で結合した複合体に関する。
【０１４５】
タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子、アンチトロンビン、トロンビン、フォンビルブラント因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および第ＩＸ因子から選択されてもよい。
【０１４６】
ヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエチルデンプンであってもよい。ヒドロキシアルキルデンプンの分子量は、例えば１００〜３００ｋＤの範囲にある。少なくとも１つのヘパリンまたはヘパリン様分子の結合の他、１つのヒドロキシアルキルデンプン分子に少なくとも２つのヘパリン分子またはヘパリン様分子を共有結合で結合させてもよい。
【０１４７】
更に、本発明は、上述のような複合体を調製するための方法であって、以下のステップを含む方法を提供する。
− 少なくとも１つのヘパリン分子またはヘパリン様分子を、少なくとも１つのヒドロキシアルキルデンプンに結合させて、ヘパリン−ヒドロキシアルキルデンプン結合体を得ること、
− 結合体をヘパリン結合部位を有するタンパク質と共にインキュベートすること。
【０１４８】
本方法では、ヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエチルデンプンであってもよい。少なくとも１つのヘパリン分子またはヘパリン様分子は、例えばホモ二官能性であってもヘテロ二官能性であってもよい二官能性リンカーを介して、少なくとも１つのＨＡＳ分子に結合してもよい。
【０１４９】
ヘパリンまたはヘパリン様分子、およびヒドロキシアルキルデンプンのうち少なくとも１つは、以下のステップにより修飾されてもよい。
− アルデヒド基を導入するために酸化すること、
− 還元的アミノ化。
【０１５０】
１つの実施形態では、少なくとも２つのヘパリン分子またはヘパリン様分子を、１つのヒドロキシアルキルデンプン分子に結合させる。
【０１５１】
本発明はさらに、
ヘパリン−ヒドロキシアルキルデンプンまたはヘパリン様分子−ヒドロキシアルキルデンプン結合体、
上述の複合体を含む医薬組成物、ここで前記タンパク質は第ＶＩＩＩ因子であってもよい、および
出血性疾患の治療用薬剤を調製するための上述の複合体の使用、
に関する。
【０１５２】
１つの実施形態では、複合体は、ヘパリン結合部位を有する少なくとも１つのタンパク質と、ヘパリンまたはヘパリン様分子がヒドロキシアルキルデンプンに共有結合で結合している少なくとも１つのヘパリンまたはヘパリン様分子とを、両方は含まない。
【０１５３】
１つの実施形態では、複合体を調製するための方法は、以下のステップの両方は含まない。
− 少なくとも１つのヘパリン分子またはヘパリン様分子を、少なくとも１つのヒドロキシアルキルデンプンに結合させて、ヘパリン−ヒドロキシアルキルデンプン結合体を得ること、
− ヘパリン結合部位を有するタンパク質と共に結合体をインキュベートすること。
【０１５４】
１つの実施形態では、結合体は、ヘパリン−ヒドロキシアルキルデンプン結合体でもヘパリン様分子−ヒドロキシアルキルデンプン結合体でもない。
【実施例】
【０１５５】
実施例１：合成化学：ＨＥＳ−ヘパリノイド−結合体
組換え第ＶＩＩＩ因子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長の１つの手法は、第ＶＩＩＩ因子の選択的結合部位により非共有結合で結合した巨大分子担体としてのヒドロキシエチルデンプンに基づく。この非共有結合によるヘパリン結合の場合、その誘導体またはその模倣体を、第ＶＩＩＩ因子結合分子として使用することができる。ＨＥＳをこれらヘパリノイドに結合させて、タンパク質表面の一部を覆って保護する大型複合体を形成する。
【０１５６】
この原理の検証は、表面プラズモン共鳴法による第ＶＩＩＩ因子結合の解析、その後ヘパリノイドとヒドロキシエチルデンプンとの共有結合による１：１結合体を使用した広範なｉｎ ｖｉｖｏ解析により評価した。図２は、ヘパリノイド−ＨＥＳの１：１結合体と複合体化している第ＶＩＩＩ因子の３次元構造を示す。
【０１５７】
この１：１結合体を得るために、ヘパリンおよびＨＥＳを両方とも、選択的結合を可能にした相補的官能基で１箇所のみ化学的に修飾した。どちらの分子も、これら分子にある他の全ての官能基とは化学的に異なるユニークな官能基（ポリサッカライド鎖の還元末端のアルデヒド／セミアセタール基）を正確に１つ有する。従って、開発された合成戦略は、還元末端の誘導体化に基づくものであった。
【０１５８】
ヒドロキシエチルデンプンを、２つの異なるサイズ画分に分離することができ、第ＶＩＩ因子結合分子として、低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）、例えばエノキサパリンを使用することができる。Ｃ１がＬＭＷＨで修飾されたＣ１活性化ヒドロキシエチルデンプンの１：１結合は、遊離チオールとマレイミド官能基のマイケル付加反応に基づく。
【０１５９】
ＨＥＳ４５０／０．７の加水分解および分画
【０１６０】
【化１】
スキーム１：ヒドロキシエチルデンプン
３０ｇのＨＥＳ４５０／０．７（４５０ｋＤａの重量平均分子量、および１グルコース単位当たり０．７モル置換度のヒドロキシエチルを有するヒドロキシエチルデンプン）を３００ｍｌの水に溶解し、ｐＨが２．０に達するまで１Ｍ塩酸をゆっくりと添加した。その後、溶液を８０℃まで加熱し、１６時間激しく撹拌した。その後、溶液を５０℃未満に冷却し、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加することによりｐＨを５〜６にした。部分的に加水分解されたＨＥＳ４５０／０．７を、蠕動ポンプおよび異なる分子量カットオフ（例えば、ＭＷＣＯ＝１００、３０、１０、および５ｋＤａ）を有するＰＥＳ限外ろ過膜を使用して、連続的な接線流限外ろ過工程により分画した。
【０１６１】
使用したＨＥＳ画分：ＨＥＳ２５／０．７（Ｍｗ＝２５ｋＤａ）およびＨＥＳ５４／０．７（５４ｋＤａ）
【０１６２】
Ｃ１アミノＨＥＳの合成
【０１６３】
【化２】
スキーム２：ヒドロキシエチルデンプンの還元末端の還元的アミノ化。
２００ｍｇのＨＥＳ２５／０．７を１２ｍｌの５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ８．２および０．１６８ｍｌの１，３−ジアミノプロパンに溶解し、５０℃で１時間撹拌した。その後、０．１２６ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、３日間５０℃で撹拌した。産物を、１ｋＤａ限外ろ過膜による限外ろ過で精製し、その後産物を凍結乾燥した。その結果得られた白色固形物を、室温で保管する。
【０１６４】
ＯｘＨＥＳによるＣ１アミノＨＥＳの合成
（博士号学位論文 Michele Orlando、ギーセン、ドイツ、２００３年に基づいて）ＯｘＨＥＳを、水酸化ナトリウム中でのヨウ素による酸化によって得た。
【０１６５】
１ｇのＨＥＳ２５／０．７を水に溶解し、９．０ｍｌの０．１Ｎヨウ素溶液を添加し、その後１．４ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨ溶液を添加した。溶液を終夜撹拌した。反応産物を、１ｋＤａ ＰＥＳ膜による限外ろ過で精製した。最終溶液を、陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０ Ｈ＋）に通し、凍結乾燥した。その結果得られた産物を乾燥させて、残留水をほとんど取り除いた。
【０１６６】
その結果得られた０．１ｇのＯｘＨＥＳを１．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。１１５ｍｇのＨＯＢｔおよび３６．７ｍｇのＤＭＡＰを添加した。次いで、１９０ｍｇのＨＡＴＵおよびその後１，３−ジアミノプロパンを添加し、溶液を３７℃で１時間撹拌した。１９０ｍｇのＨＡＴＵを更に添加し、溶液を３７℃で終夜撹拌した。
【０１６７】
産物を、２５ｍｌのアセトン／エタノール１：１を添加することにより沈殿させ、沈殿物をアセトン／エタノール１：１で洗浄した。ペレットを２ｍｌのＤＭＳＯに再溶解し、２５ｍｌのアセトン／エタノール１：１を添加することにより産物を再沈殿させ、その後更なる洗浄ステップを行った。
【０１６８】
残った産物を、１００ｍｌの水に溶解し、１ｋＤａ膜による限外ろ過で更に精製した。その後、産物を凍結乾燥した。
【０１６９】
Ｃ１マレイミドＨＥＳ（C1MalemideHES）の合成
【０１７０】
【化３】
スキーム３：ヒドロキシエチルデンプンの元々の還元末端のアミノ基のマレイミド活性化。
５００ｍｇのＣ１アミノＨＥＳを、１５ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）に溶解した。１０ｍｌのＮＭＰ中に１４０ｍｇのＮ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステルを溶解した溶液、および８５．６μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。溶液を９０分間撹拌または振とうした。溶液を１００ｍｌのアセトン／エタノール１：１に注ぐことにより産物を沈殿させ、−２０℃に冷却した。沈殿物を遠心沈降させ、上清をデカントし、ペレットをアセトン／エタノール１：１で更に２回洗浄し、遠心沈降させた。１ｋＤａ限外ろ過膜による限外ろ過で産物を精製し、凍結乾燥した。その結果得られた固形産物を、−２０℃で保管した。
【０１７１】
低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の化学的修飾
【０１７２】
【化４】
スキーム４：シスタミンおよび還元剤シアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元末端（Ｃ１）の還元的アミノ化。
【０１７３】
【化５】
スキーム５：還元剤ＤＴＴによるＣ１−シスタミンの還元。
２５０ｍｇの凍結乾燥ＬＭＷＨを、１Ｍの塩化ナトリウムを含有する１２ｍｌの０．３Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．０に溶解した。１．３４ｇのシスタミン二塩酸塩を添加し、溶液を４０℃で１時間撹拌または振とうした。その後、０．３７４ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、混合物を３日間４０℃で撹拌または振とうした。
【０１７４】
産物を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０調製用カラムで、移動相として１００ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５を使用し、４．４ｍｌ／分の流速で、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。１つにまとめられた産物画分を、次のステップで直接使用した。
【０１７５】
その結果得られた画分に、９１．８ｍｇのＤＬ−ｌ，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ、０．６ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、溶液を室温で終夜撹拌した。産物を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０調製用カラムで、移動相として水を使用し、４．４ｍｌ／分の流速で、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。産物画分を１つにまとめて凍結乾燥した。その結果得られた白色固形物を、−２０℃で保管した。
【０１７６】
Ｃ１マレイミドＨＥＳおよびチオＬＭＷＨの結合
【０１７７】
【化６】
スキーム６：マイケル付加反応によるマレイミド活性化ＨＥＳとチオール活性化ＬＭＷＨとの結合。
３２．２ｍｇのＣ１ＬＭＷＨ−システアミンおよび４２０ｍｇのＣ１マレイミドＨＥＳを、合計１４．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、３７℃で終夜混合および振とうした。
【０１７８】
ＬＭＷＨ−ＨＥＳ結合体を、結合用に５０ｍＭのＴｔｉｓＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５、溶出用に１ＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液ｐＨ ７．５を用いて、流速５ｍｌ／分、リニアグラジエントでＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で精製した。３０ｍＳ／ｃｍを超える導電率で溶出した画分を、０．１ＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５および４ｍｌ／分の流速を使用して、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００調製用カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で精製した。移動相として水を使用し、４ｍｌ／分の流速で、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００調製用カラム（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で、産物を脱塩した。クロマトグラムを図９に示す。その結果得られた産物を更に凍結乾燥し、−２０℃で保管した。
【０１７９】
ヘパリン−ＨＥＳ
実施例１および２は、第ＶＩＩＩ凝固因子とＨＥＳ−ヘパリン結合体との非共有結合による複合体で構成される（図２を参照）。ＦＶＩＩＩは、Ａ２ドメインに明確なヘパリン結合部位を有し、ヘパリンおよびヘパリノイド（低分子量ヘパリン（例えば、クレキサン）またはフコイダンなど）と高親和性で結合することができる。ヘパリンまたはヘパリノイドを、ＨＥＳ部分に短いリンカー領域を介して共有結合で結合させる。ＦＶＩＩＩに対するこのＨＥＳ−ヘパリン結合体の非共有結合による結合は、遮蔽効果により半減期延長を媒介する。
【０１８０】
表面プラズモン共鳴結合解析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１ＯＯシステム（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ社製、フライブルク、ドイツ）を使用して実施した。この検出システムは、表面プラズモン共鳴に基づき、分子の相互作用をリアルタイムでモニターする（Malmquist and Karlsson, 1997；Rich and Myszka, 2003；Piliarek 2009）。
【０１８１】
結合反応は、表面プラズモン共鳴の変化を引き起こし、この変化を光学的に検出し、レゾナンスユニットで測定する。１０００ＲＵは、表面プラズモン共鳴角における０．１°の変化に相当し、平均タンパク質の場合、約１ｎｇ／ｍｍ２の表面濃度変化に相当する（Johnsson et al., 1991）。
【０１８２】
分析の前に、ヒト組換え血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、およびヒト組換え血液凝固第ＩＸ因子、ｒＦＩＸを、ＮＡＰ５カラムにロードして１０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ５／ｐＨ５．５と緩衝液交換し、その後サプライヤーの説明の通りにアミンカップリングキットを使用して、ＣＭ５バイオセンサーチップのデキストランマトリックスに固定化した。基準チャネルを、タンパク質の非存在下で活性化およびブロッキングした。
【０１８３】
アナライトであるＨＥＳ−ヘパリン結合体とフコイダンの結合(association)を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．００５％（容積／容積）のツイーン２０（ｐＨ７．４）中、２５℃、１０μｌ／分の流速で３分間評価した。同じ緩衝液流で１５分間解離させた。
【０１８４】
解離の後、８００ｍＭのＮａＣｌを１分間インジェクトすることにより、バイオセンサーチップを再生した。ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩおよびヒトｒＦＩＸ被覆チャネルに対するＨＥＳ−ヘパリン結合体およびフコイダンの結合を、対照チャネルに対する非特異的結合について補正した。
【０１８５】
結合定数の決定には、増加系列の各濃度のアナライトを、固定化されたヒト組換え血液凝固第ＶＩＩＩ因子にアプライした。結合特性を、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して評価し、カイネティクスタイトレーションデータをフィッティングした。カイネティクスデータ（結合定数［ｋａ］、解離定数［ｋｄ］）、ならびに親和性データ（解離平衡定数Ｋｄ）を、結合データのコンピューターに基づく評価により計算した。
【０１８６】
ｒＦＶＩＩＩに対するＨＥＳ−ヘパリン結合体の結合解析を、ＳＰＲ法を使用して実施した。ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩをセンサチップに固定化し、３０ｋＤａのＨＥＳ−ヘパリン結合体の結合および解離を、増加系列の各結合体濃度（１４〜２２７μＭ）においてＳＰＲでモニターした。図５は、一組の典型的な結合曲線を示しており、全濃度でヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩに対するＨＥＳ−ヘパリン結合体の結合を実証している。結合曲線のソフトウェアに基づく解析により、解離定数Ｋｄ ６（±０．６）１０−７Ｍを得て、ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩに対するＨＥＳ−ヘパリン結合体の強力な結合を明白に実証した。
【０１８７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性解析
ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性解析を実施して、薬物動態解析を人工系でシミュレートし、ＨＥＳ−ヘパリン結合体の結合がＦＶＩＩＩ安定性に及ぼす影響を決定した。従って、４ＩＵのヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩを、１：２名目モル比で２つの異なるＨＥＳ結合体（それぞれ、ＨＥＳ（３０ｋＤａ）結合体およびＨＥＳ（６０ｋＤａ）結合体）に混合し、４０μＬ緩衝液に溶解し、１．７ｍＬのＦＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｃｏａｃｈｒｏｍ社製 カタログ番号 ＦＤＰ０８−１０、ロット番号Ｄ８−２２）（体重２０ｇを有する血友病マウスの全血容積を模倣したもの）に添加した。３つの異なる手法（対照としてのヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、ＨＥＳ結合体（３０ｋＤａ）と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、ＨＥＳ結合体（６０ｋＤａ）と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ）を３７℃でインキュベートし、規定の時間間隔の経過後毎に試料を採取し、直ちに−８０℃で凍結した。
【０１８８】
解凍後、試料を、発色アッセイでＦＶＩＩＩ活性について分析した（Ｃｏａｃｈｒｏｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＧｍｂＨ社製、オーダー番号２２１４０２；ロット番号７２５０２−ＰＫ：６）。この発色アッセイは、ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を連続する２ステップで決定する。活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）、リン脂質、およびカルシウムをＦＶＩＩＩ試料に添加することにより、ＦＸがＦＸａに活性化され、その後、後者は添加したＦＸ−基質を切断して、分光光度法で定量化することができる発色団を産生する。適切なアッセイ条件下では、ＦＸａ形成（従って発色団（chromophor）産生）とＦＶＩＩＩ濃度とは線形関係にある。
【０１８９】
ＦＶＩＩＩ欠乏血漿および３７℃でのインキュベーションは、上述のように白血病マウスモデルを模倣する。その後、血漿試料を、発色アッセイ試験を使用してＦＶＩＩＩ：Ｃ活性について分析した。その結果生じたデータを、シグマプロット計算ソフトウェアを使用して半減期に変換した。ＨＥＳ結合体を有しないヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩの相対半減期（％で）をＨＥＳ結合体（６０ｋＤａ）と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩと直接比較すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血漿半減期は１．４倍延長されたことが示された。ＨＥＳ結合体（３０ｋＤａ）を有する複合体は、１．３５倍の半減期延長を示し、非共有結合でＦＶＩＩＩと結合したＨＥＳ結合体両方のｉｎ ｖｉｔｒｏでの半減期延長効果を明白に示した（図６を参照）。
【０１９０】
血友病マウスにおける薬物動態解析
血友病マウスにおける薬物動態学解析を以下のように実施した：
体重が２０〜２５ｇの雄雌混合１２週齢Ｃ５７ ＢＬ／６ ＦＶＩＩＩノックアウトマウスをこの解析に使用した。
【０１９１】
以下のＦＶＩＩＩ異型を下記のように調製及び試験するものとした：
対照としてのヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、６０ｋＤａまたは３０ｋＤａのＨＥＳ−ヘパリン結合体と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、および陰性対照としての緩衝液。ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩを、１：２名目モル比でＨＥＳ−ヘパリン結合体と複合体化させ、無菌ろ過し、ＨＥＳ−ヘパリン結合体を有しない対照ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、および陰性対照緩衝液も同様に無菌ろ過した。
【０１９２】
４ＩＵのＦＶＩＩＩを含有する４０μＬ（約２００ＩＵ／ｋｇに相当）を、単回投与として尾静脈から血友病マウスに注射した。注射前、注射後、および投与後規定の間隔で試料を採取した（１サンプリング時および物質当たり５匹のマウスの群で）。ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を、Ｃｏａｃｈｒｏｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＧｍｂＨ社、ウィーン、オーストリアから市販されている発色アッセイを使用して決定し、これらの結果からＦＶＩＩＩの薬物動態を計算し、シグマプロット計算ソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＧｍｂＨ社製、ドイツ）を使用して、統計的に分析して（ｔ検定を含む）半減時間（Ｔ１／２）を得た。
【０１９３】
以下のＦＶＩＩＩ異型を、血友病マウスにおけるそれらの血漿半減期について比較試験した：
対照としてのヒトＣＬ−ｒＦＶＩＩＩ（群１）、６０ｋＤａのＨＥＳ結合体と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ（群２）、３０ｋＤａのＨＥＳ結合体（と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ（群３）、および陰性対照としての緩衝液（群４）。概して、１物質当たり２５匹の血友病マウスに、１マウス当たり合計４０μｌの注射容積中４ＩＵのｒＦＶＩＩＩを注射した。注射前、注射後および投与後の規定の間隔において１サンプリング時および物質当たり５匹から試料を採取した（例外：群３では、材料の制約のため、合計１９匹のマウスのみを使用した）。
【０１９４】
試料をＦＶＩＩＩ：Ｃ活性について試験し、上述のような薬物動態パラメーターに関してデータを分析し、結果を以下の表に要約する。
【０１９５】
【表１】
【０１９６】
直接比較すると、ＨＥＳ結合体と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩは両方とも、血漿半減期の延長を示す。より小型のＨＥＳ結合体（３０ｋＤａ）との複合体形成の場合、血漿半減期は１．６倍延長され、より大型のＨＥＳ結合体（６０ｋＤａ）との複合体形成は、血漿半減期の１．７倍増加をもたらした（図７を参照）。
【０１９７】
これらのデータは、ＦＶＩＩＩに非共有結合で結合させられたＨＥＳ−ヘパリン結合体の、血友病マウスモデルにおける保護的半減期延長効果を明白に示し、この効果は、より短いＨＥＳ−ヘパリン結合体（３０ｋＤａ）より、より大型のＨＥＳ−ヘパリン結合体（６０ｋＤａ）でわずかにより顕著である。
【０１９８】
陰性対照として、血友病マウスに緩衝液を注射したが、予想通りＦＶＩＩＩ活性は発色アッセイでは見出されなかった（データ非表示）。
【０１９９】
フコイダン
ヘパリンの有望な代替物を例示するために、フコイダンを、凝固第ＶＩＩＩ因子および凝固第ＩＸ因子などのヘパリン結合タンパク質に対する結合性について試験した。ＳＰＲに基づく結合実験により、フコイダンは、標的タンパク質に非共有結合で結合するための、半減期延長性ＨＥＳ−ヘパリン結合体のヘパリンを置換することができたことを示す。
【０２００】
有望なヘパリン代用物としてのフコイダンを評価するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく結合解析を、ヘパリン結合タンパク質としてのヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＩＸに対して実施した。図８は、それぞれｒＦＶＩＩＩ（直線）およびｒＦＩＸ（破線）に対するフコイダンの結合および解離を示しており、調べられたタンパク質に対するフコイダンの結合を明白に実証し、結果的に有望なヘパリン代用物としてその適合性が確認される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質、結合分子、およびポリマーの複合体に関する。前記複合体の調製法および複合体の使用法も更に開示される。
【背景技術】
【０００２】
多くの疾患の根底にある分子生物学的原理の理解が進み、ヒトポリペプチドの向上した組換え発現および送達系が利用可能になったことに主に起因して、タンパク質などのポリペプチドを治療応用に使用することが近年広がっている。ポリペプチド療法は、特に遺伝性の遺伝子欠損のため、特定の天然ポリペプチドが患者に欠乏または欠如する疾患に主として使用されている。
【０００３】
例えば、血友病は、特定の血漿タンパク質の欠乏により引き起こされる疾患である。血友病患者は、血液凝固カスケードのタンパク質構成要素の機能障害により引き起こされる出血性の罹患に苦しむ。罹患凝固因子に依存して、２つのタイプの血友病を区別することができる。両方とも、共通して、可溶性フィブリノゲンの不溶性フィブリンクロットへの変換が阻害されている。これらは、主として男性集団が罹患するＸ染色体連鎖劣性遺伝疾患である。
【０００４】
血友病Ａは、男性１００００人当たり１〜２人が罹患する。血友病Ａは、血液凝固カスケードの重要なエレメントであり非常に大型の糖タンパク質（Ｍｗ、およそ３３０ｋＤａ（Furie B., Furie B.C., Cell (1988) 53, 505-518））である第ＶＩＩＩ因子の欠乏または欠損により引き起こされる。このポリペプチドの配列は、３つの領域、いわゆるＡ１およびＡ２ドメインで構成されるＮ末端領域、中央のＢドメイン領域、ならびにＡ３、Ｃ１、およびＣ２ドメインで構成されるＣ末端領域に細分化することができる。血液中で、第ＶＩＩＩ凝固因子は、不活性前駆物質として存在する。この因子は、安定化担体タンパク質として機能するフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）と強固に非共有結合で結合する。３つの特異的位置（７４０、３７２、１６８９位）におけるトロンビンによる第ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解切断は、この因子のｖＷＦからの解離を導き、カスケード内で凝血促進機能を放出する。その活性型では、第ＶＩＩＩ因子は第ＩＸａ因子の補助因子として機能し、それにより第Ｘ因子のタンパク質分解活性化を数桁加速させる。
【０００５】
血友病Ｂは、男性２５，０００人に約１人に起こる。血友病Ｂは、セリンプロテアーゼである第ＩＸ因子（クリスマス因子）の欠乏により特徴付けられる。この４１５アミノ酸ポリペプチドは、５６ｋＤａの糖タンパク質として肝臓で合成される。これが適切な機能を果たすためには、ビタミンＫの存在下でしか生じない翻訳後カルボキシル化ステップが必要である。
【０００６】
両タイプの出血性疾患の治療は、伝統的に、ヒト血漿由来の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の濃縮タンパク質剤の点滴を伴う。この方法は、血友病の効果的な療法であるが、肝炎またはエイズを引き起こすウイルスなどの種々の感染因子または血栓塞栓因子を伝染させるリスクを伴う。或いは、凝固因子を産生するための幾つかの組換えＤＮＡ技術が記述されている。この目的のために、野生型第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の対応するｃＤＮＡが単離され、好適な発現ベクターにクローニングされた（欧州特許出願公開第１６０４５７号；国際公開第８６／０１９６１号、米国特許第４，７７０，９９９号、第５，５２１，０７０号、および第５，５２１，０７０号）。
【０００７】
第ＶＩＩＩ因子の場合、血液凝固活性を示す複合体を産生するためにサブユニットを組換え発現させることは、当技術分野で公知である（例えば、欧州特許出願公開第１５０７３５号、欧州特許出願公開第２３２１１２号、欧州特許出願公開第０５００７３４号、国際公開第９１／０７４９０号、国際公開第９５／１３３００号、米国特許第５，０４５，４５５号、および第５，７８９，２０３号から）。更に、高度にグリコシル化されたＢドメインをコードする配列を部分的にまたは完全に欠如する短縮型ｃＤＮＡ変種の発現が記述されている（例えば、国際公開第８６／０６１０１号、国際公開第８７／０４１８７号、国際公開第８７／０７１４４号、国際公開第８８／００３８１号、国際公開第９４／２９４７１号、欧州特許出願公開第２５１８４３号、欧州特許出願公開第２５３４５５号、欧州特許出願公開第２５４０７６号、米国特許第４，８６８，１１２号、および第４，９８０，４５６号、欧州特許出願公開第２９４９１０号、欧州特許出願公開第２６５７７８号、欧州特許出願公開第３０３５４０号、ならびに国際公開第９１／０９１２２において）。より最近では、活性化プロテインＣによる第ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解性不活化を阻害するために、または治療患者に阻害性抗体の形成をもたらす免疫原性を低減させるために、様々な選択された点突然変異が導入された（例えば、米国特許第５，８５９，２０４号、５，４２２，２６０号、および第５，４５１，５２１号、国際公開第９７／４９７２５号、国際公開第９９／２９８４８号、ならびにM. L. Liu et al., British J. Haematol. 103: 1051-1060 (1998)を参照）。
【０００８】
しかしながら、第ＶＩＩＩ因子などのポリペプチド療法には、短い循環半減期、免疫原性、およびタンパク質分解を含む多数の欠点が伴う。例えば、ヒト体内のタンパク質第ＶＩＩＩ因子の半減期は約１２時間であるが、重症のフォンビルブランド病（ｖＷＤ）患者では、半減期は約２時間である。最近は、予防的治療が、先進国における血友病患者の最先端治療である。予防的治療では、通常１週当たり２〜４回の点滴が行われる。
【０００９】
例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン、およびモノクローナル抗体など、治療目的に使用される多数の更なるタンパク質が存在する。
【００１０】
多くの場合、治療用タンパク質の半減期を増加させて有効性を増加させるあるいは患者に投与される治療用タンパク質の量を低減させることは有用である。これにより、治療コストも低減される。
【００１１】
従来技術では、ポリペプチド治療薬の循環半減期の短さに対しては、ポリマーをポリペプチドに共有結合で結合(attach)することによって対処している。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を結合(attach)させることにより、幾つかのポリペプチドの半減期がいくらか向上することが示されている。
【００１２】
しかしながら、ポリマーの結合(attachment)には多くの問題が観察されている。例えば、ポリマーの結合(attachment)は、薬物活性の減少をもたらし得る。更に、タンパク質にポリマーを結合するために使用されるある種の試薬は、反応性が不十分であり、従って長い反応時間を必要とし、その間にタンパク質の変性および／または不活化が生じる可能性がある。また、結合(attachment)が不完全または不均一である場合、異なる特性を有する化合物の混合集団が生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の１つの目的は、従来技術の欠点を克服することであり、特に、点滴頻度（infusion rate）を低減させ、患者の生活の質を増加させるために、ヒトまたは動物循環中のタンパク質の半減期を延長させるための改良された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、ヒトまたは動物の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させるための方法に関する。
【００１５】
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの標的タンパク質および前記標的タンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも１つの結合分子を含む複合体であって、結合親和性を有する前記分子が、少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合または非共有結合で結合している複合体を開示する。
【００１６】
驚くべきことに、標的タンパク質を、該タンパク質に強固に結合(associating)可能な結合分子を介してポリマーに非共有結合で結合させることにより、結果として半減期の著しい増加がもたらされることが見出され、患者にとって劇的に有益であることが明らかになった。
【００１７】
結合分子が該タンパク質の特異的結合部位に結合(association)するため、結合分子に結合したポリマーは該タンパク質の近傍に位置することとなり、従って該タンパク質の生理学的特性に影響を及ぼす。該ポリマーのサイズおよび物理的特性のため、腎臓による該タンパク質の循環からのクリアランス、および／または例えば特定の細胞への取り込みによる該タンパク質の分解が妨害されると考えられる。
【００１８】
場合によっては、形成された複合体の全体サイズは、循環から除去され得る分子の最大サイズを超過していてもよい。特に、ポリマーに結合したタンパク質は、腎臓の膜を通過することができず、従って血流中に残り、尿を介して排泄されることはない。
【００１９】
結合分子およびポリマーは、協同して結合体を形成し、標的タンパク質は、前記結合体に非共有結合で結合させられる。好ましくは、結合分子は、前記結合体のポリマーに共有結合で結合させられる。
【００２０】
また、結合体は、細胞によるタンパク質の取り込み、および／または分解酵素によるタンパク質の認識および結合を妨害してもよい。特に、結合体は、タンパク質に結合した際に、タンパク質の分解および／またはクリアランスまたは全体的な電荷の変更に関与する特定のタンパク質領域を遮蔽してもよい。例えば、結合体は、（ｉ）タンパク質の細胞への取り込みを促進する受容体または因子、および／または（ｉｉ）プロテアーゼ、ユビキチン結合酵素、プロテアソームなどの分解経路に関与するタンパク質、によって認識されるタンパク質の結合領域を遮蔽する。
【００２１】
更に、本発明の複合体および方法は、治療に使用されるタンパク質の、循環中での半減期を延長するために、それらタンパク質を化学的に修飾する必要はないという利点も提供する。むしろ、本発明による結合体は、例えばそれらの機能を発揮させるために既存の医薬組成物に組み込むことができる。臨床承認に依存する薬学的応用の場合、このことは、治療用物質が変化しないため従来の結合戦略より有利である。本発明による複合体は、好ましくはｅｘ ｖｉｖｏで形成される。
【００２２】
従って、第１の態様では、本発明は、少なくとも１つの標的タンパク質および前記標的タンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも１つの結合分子を含む複合体であって、結合親和性を有する前記結合分子が、少なくとも１つのポリマーに好ましくは共有結合で結合している複合体を提供する。結合分子およびポリマーは協同して、標的タンパク質の結合部位に結合する結合体を形成する。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の複合体に存在する結合体、および複合体を形成するためのその使用を対象とする。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、第１の態様の複合体を調製するための方法であって、標的タンパク質を結合体と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２５】
第４の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させる方法であって、ポリマーと、標的タンパク質に対する結合能を有する結合分子と、を含む結合体に、標的タンパク質を接触させるステップを含む方法を提供する。
【００２６】
第５の態様では、本発明は第１の態様の複合体の医薬における使用、および医薬組成物の調製における使用をそれぞれ対象とする。更に、この態様は、第１の態様の複合体を含む医薬組成物をも対象とする。
【００２７】
第６の態様では、本発明は、第３の態様の結合体を調製するための方法であって、ポリマーを結合分子に結合させるステップを含む方法を提供する。
【００２８】
本発明のこれらの態様の具体的実施形態が、下記および添付の特許請求の範囲において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】血液凝固因子ＶＩＩＩの３次元構造を示す図であり、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）とヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）との相互作用部位が強調されている。
【図２】第ＶＩＩＩ因子とヘパリノイド−ＨＥＳの１：１結合体との複合体の構造を示す図である。
【図３】共有結合アプタマー−ＨＥＳ結合体（Ａ＝アプタマー）を有する標的タンパク質の模式図を示す図である。
【図４】翻訳後修飾された標的タンパク質と模倣分子−ＨＥＳ結合体との結合の模式図を示す図である。
【図５】表面プラズモン共鳴を使用した、ＨＥＳヘパリン結合体の結合解析を示す図である。
【図６】ｉｎ ｖｉｔｒｏで第ＶＩＩＩ因子と比較した第ＶＩＩＩ因子ＨＥＳ結合体の半減期延長を示す図である。
【図７】ｉｎ ｖｉｖｏで第ＶＩＩＩ因子と比較した第ＶＩＩＩ因子ＨＥＳ結合体の半減期延長を示す図である。
【図８】フコイダンに対するヒト第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子の、表面プラズモン共鳴に基づく結合解析を示す図である。
【図９】活性化ＨＥＳ（Ｃ１マレイミドＨＥＳ−点線）、チオールで修飾されたＬＭＷＨ（実線）、および精製ＬＭＷＨ−ＨＥＳ結合体（破線）のＳＥＣ−ｄＲＩ／ＵＶ／ＭＡＬＳ測定から得られた屈折率クロマトグラムを示す図である。カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ；移動相：１５０ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ＝６．５（ピーク＞４０分：塩）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義：
本明細書中において、以下の表現は、好ましくは下記に示されるような意味を有することが一般的に意図される。ただし、それらの表現が使用されている文脈が異なる意味での使用を示唆している場合は、その限りではない。
【００３１】
本明細書中において、「含む」という表現は、「本質的に〜からなる」および「〜からなる」という表現をも包含し、具体的に指す。
【００３２】
本明細書中において、「複合体」という用語は、特に、複数の化合物間の非共有結合による物理的結合(physical association)を意味する。複合体中の各化合物（ここでは少なくとも標的タンパク質および結合体）は、１つまたは複数の（非共有結合による）分子間力、例えばイオン相互作用、双極子相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および／または疎水性効果、によって結合(associate)している。
【００３３】
「結合体」という用語は、特に、各化合物に由来する特性の少なくとも幾つかが結合体において保持されるように互いに連結している複数の化合物を意味する。連結は、共有結合により達成されてもよくまたは非共有結合により達成されてもよい。好ましくは、結合体の化合物は、共有結合により連結されている。１つの結合体中の種々の化合物は、化合物の原子間の１つまたは複数の共有結合により互いに直接結合していてもよい。或いは、各化合物は、化合物の原子に共有結合で結合しているリンカー分子により互いに結合していてもよい。結合体が２つを超える化合物で構成される場合、例えば、１つの化合物が次の化合物に結合(attach)することでこれら化合物が鎖構造状に連結していてもよく、または幾つかの化合物が各々中央にある１つの化合物に結合(attach)していてもよい。
【００３４】
本明細書中において、「タンパク質」という用語は、アミノ酸の分子鎖、または複数のアミノ酸鎖の複合体を指す。タンパク質は、天然アミノ酸ならびに人工アミノ酸のいずれを含有していてもよく、生物由来であっても合成由来であってもよい。タンパク質は、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、および／またはリン酸化によって、天然に修飾されてもよく（翻訳後修飾）または合成的に修飾されていてもよい。タンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸を含むが、いなかる特定の長さである必要もない。この用語はいかなるサイズ制限も含まない。本出願では、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、互換的に使用される。好ましくは、タンパク質は、少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む。
【００３５】
「核酸」という用語は、一本鎖および二本鎖の核酸およびリボ核酸、ならびにデオキシリボ核酸を包含する。
【００３６】
「結合部位」という用語は、特に、その形状、疎水性、および／または（部分的）電荷の結果としての、タンパク質の領域を指す。好ましくは、結合部位は、例えばヘパリンなどの標的分子と非共有結合により天然で結合(associating)可能である。
【００３７】
結合部位の具体的例は、ヘパリン、ならびに／またはヘパラン硫酸、ヘパリノイド、および／もしくはそれらの誘導体などの緊密に関連した化合物に結合可能なヘパリン結合部位である。別の例は、一価金属イオン、二価金属イオン、三価金属イオン、および四価金属イオンからなる群から選択される金属イオンに結合可能な金属イオン結合部位である。例示的な金属イオンは、亜鉛、銅、コバルト、カドミウム、および水銀イオンである。更なる例は、ＲＧＤペプチド、つまりアミノ酸配列、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アスパルテート（Ｄ）を含有するペプチド、または密接に関連する配列を有するペプチド、および／またはそれらの誘導体に結合可能なＲＧＤ結合部位である。更なる例は、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質（saccharolipid）、ポリケチド、ステロール脂質、プレノール脂質（prenol lipid）、および脂肪酸等の脂質に結合可能な脂質結合部位である。
【００３８】
本明細書中において、「結合分子」という用語は、タンパク質の結合部位に非共有結合で結合可能な化合物を意味する。好ましくは、結合部位への結合は特異的であり、つまり、それは、タンパク質の天然環境、例えばヒトまたは動物循環中に存在する他のほとんどの分子との相互作用より強力である。好ましい実施形態では、生理学的条件下で、１ｍＭ以下、より好ましくは３００μＭ以下、１００μＭ以下、３０μＭ以下、１０μＭ以下、３μＭ以下、１μＭ以下、３００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、および最も好ましくは１０ｎＭまたは１ｎＭ以下の解離定数を有する親和性で結合性部分が結合部位に結合する。結合性部分の構造および組成は、それが結合部位に結合することができる限り、いかなる点においても限定されない。好ましくは、結合性部分は、非毒性であり生理学的許容される。例えば、結合性部分は、ペプチド部分、サッカライド部分、核酸部分、脂質部分、もしくはそれらの模倣化合物、またはそれらの組合せであってもよい。結合分子の具体的な例は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、特にヘパリン模倣ペプチドなどのヘパリン様分子、ＲＧＤペプチド、金属イオン模倣体、および脂質、それらの誘導体、およびそれらの模倣体である。
【００３９】
「ポリマー」という用語は、特に、共有結合で結合したより大型の分子を形成する複数の分子種（「モノマー」）で構成される化合物を指す。ポリマーは、天然であってもよくまたは合成であってもよく、直鎖状であってもよく、分岐状であってもよく、または樹状であってもよい。ポリマーは、反応性基などの好適な置換基で更に誘導体化されてもよい。
【００４０】
「水溶性ポリマー」という用語は、水に可溶性であるポリマーを指す。マイクロタイタープレートおよびチューブなどを生成するために使用される固体ポリマーとは対照的に、水可溶性ポリマーは、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、相分離せずに水との溶液を形成する。
【００４１】
「ヒドロキシアルキルデンプン」または「ＨＡＳ」という用語は、少なくとも１つのヒドロキシアルキル基により置換されているデンプン誘導体を指す。デンプンは、好ましくは、ジャガイモデンプンまたはトウモロコシデンプンなどの天然デンプンである。ヒドロキシアルキル基は、好ましくは、グルコース単位のＣ２、Ｃ３、および／またはＣ６炭素原子で酸素に結合しており、主としてＣ２およびＣ６に存在する。導入されたヒドロキシアルキル基の量は、１グルコース分子当たりのヒドロキシアルキル基の平均数として定義されるモル置換度ＭＳとして表すことができる（最大ＭＳ＝３．０；通常は０．４〜０．７）。結合(attach)したヒドロキシアルキル基は、任意の好適な化学構造を有していてもよいが、好ましくは例えば１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐の低級アルキル基である。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、２〜８個、より好ましくは２〜４個の炭素原子を有する。例えば、ヒドロキシアルキル基は、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、またはヒドロキシブチル基であってもよく、ヒドロキシエチル、特に２−ヒドロキシエチルが最も好ましい。ヒドロキシアルキル基がヒドロキシエチル、好ましくは２−ヒドロキシエチルであるヒドロキシアルキルデンプンは、「ヒドロキシエチルデンプン」または「ＨＥＳ」と呼ばれる。
【００４２】
化合物の「誘導体」は、特に、１つまたは複数の化学的部分によって置換されているかおよび／または１つもしくは複数の化学的部分が欠失している前記化合物を指す。誘導体には、天然のプロセス（例えば、タンパク質のリン酸化、核酸のメチル化など）によって得られるもの、ならびに化学合成によって得られるものが包含される。誘導体の例示的な置換基は、ヒドロキシ、カルボキシ、ケト、アルデヒド、アミノ、亜硫酸、硫酸、およびリン酸基などの官能基、またはアルキル、アリール、アルコキシなどその他の基である
【００４３】
標的化合物の「模倣体」は、本明細書中において、特に、標的化合物の特性と類似した１つまたは複数の特性を有する化合物を意味する。特に、標的化合物が、タンパク質の特異的結合部位に結合可能である場合、標的化合物（例えば、ヘパリン）の模倣体も、好ましくは同様の親和性で前記結合部位に結合することができる。より好ましくは、結合部位に対する親和性を定義する模倣体の解離定数は、標的化合物の解離定数の１０００倍以下、より好ましくは標的化合物の解離定数の５００倍以下、１００倍以下、５０倍以下、２０倍以下、１０倍以下、５倍以下、２倍以下、１．５倍以下、１．２倍以下であり、最も好ましくは、標的化合物の解離定数と等しいかまたはそれより低い。
【００４４】
好ましい実施形態では、模倣体の３次元構造および／または電荷の空間的分布は、少なくとも結合部位への結合に関連する部分またはその一部において、目標化合物の３次元構造および／または電荷の空間的分布と類似している。
【００４５】
「リンカー」とは、複数の標的化合物を互いに連結させる化学的部分である。この目的のため、リンカー分子は、それが目標化合物に結合する前には、標的化合物と共有結合を形成可能な官能基を提示している。２つの標的化合物間の連結は、１つのリンカー分子を使用して形成されてもよく、または第２の（または両方の）標的分子と結合させる前に、一連のリンカー分子を互いに結合させてもよい。
【００４６】
「循環」という用語は、本明細書中において、特に、ヒトまたは動物の心臓血管系および／またはリンパ系、好ましくは心臓、血液、および血管を含む心臓血管系を指す。
【００４７】
化合物の「半減期」は、特に、化合物の量がその初期値の半分に減衰するのに必要な時間を指す。例えば、循環中の化合物の半減期は、循環中の化合物の濃度が、初期濃度（例えば化合物が循環に加えられた時の濃度）の半分に減少するのに必要な時間である。循環中の化合物の半減期は、化合物の腎クリアランス速度、化合物の（酵素性）分解速度、化合物の細胞への取り込み速度などの様々な要因の影響を受ける。
【００４８】
「医薬組成物」という用語は、特に、ヒトまたは動物への投与に好適な組成物、つまり薬学的に許容される成分を含有する組成物を指す。好ましくは、医薬組成物は、担体、希釈剤、または、緩衝剤、保存剤、もしくは張性調節剤などの医薬賦形剤と共に、活性化合物またはその塩もしくはそのプロドラッグを含む。
【００４９】
化合物の「分子量」という用語は、特に、１モルの前記化合物の重量を指す。化合物が多分散である場合、分子量は、多分散混合物の重量平均分子量を指し、従って混合物に含まれる個々の化合物は、示された重量平均分子量より高いかまたは低い分子量を有していてもよい。
【００５０】
本明細書中で言及された特許、特許出願、科学論文、および他の文書は全て、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００５１】
本発明は、ヒトまたは動物循環中の標的タンパク質の半減期を、ポリマーに結合させた結合分子を使用して、該ポリマーを該標的タンパク質に非共有結合で結合させることにより増加させることができるという知見に基づく。
【００５２】
この点で、本発明は、標的タンパク質と、ポリマー性部分および該標的タンパク質に対して結合能を有する結合性部分を含む結合体とを含み、該標的タンパク質が該結合体に非共有結合で結合している複合体に関する。
【００５３】
循環半減期を増加させる標的タンパク質は、該結合性部分と結合(associating)可能な結合部位を提示している限り、いかなるタンパク質であってもよい。好ましくは、タンパク質は水溶性である。ある実施形態では、タンパク質は、ヒトおよび／または動物において薬理活性を有し、好ましくは、疾患（例えば後に述べるような疾患）の治療に有用である。好ましくは、標的タンパク質は、治療の際に例えば静脈内または動脈内注射により、循環に直接投与される。
【００５４】
好ましい実施形態では、標的タンパク質は治療活性を有する。好適な標的タンパク質は、ヘパリン結合部位、ＲＧＤペプチド結合部位、ＲＧＤモチーフ、金属イオン結合部位、脂質結合部位、および核酸結合部位からなる群から選択される結合部位を含む。
【００５５】
好適な標的タンパク質は、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子（野生型およびＢドメイン欠失）、第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子、トロンビン、抗トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、およびフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）などの血液凝固タンパク質、エリトロポイエチンなどの増殖因子、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキンなどのサイトカイン、アルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、インテグリン、ディスインテグリン（disintegrin）などのプロテアーゼ阻害剤、フィブロネクチンおよびビトロネクチン（vitroncectin）などの細胞外マトリックスタンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼおよびＡＤＡＭ／ＡＤＡＭＴＳタンパク質などのメタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アポリポタンパク質、輸送タンパク質、ホルモン、阻害または制御作用性タンパク質、ならびにそれらの誘導体および変異体から選択される。
【００５６】
幾つかの実施形態では、標的タンパク質は、１０ｋＤａ以上の、好ましくは３０ｋＤａ以上の、および最も好ましくは５０ｋＤａ以上の分子量を有する。更に、タンパク質は、１０００ｋＤａ以下の、好ましくは５００ｋＤａ以下、最も好ましくは２００ｋＤａ以下の分子量を有していてもよい。
【００５７】
ヘパリン結合部位を含む好適な標的タンパク質は、例えば、抗トロンビン、トロンビン、フォンビルブラント因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ビトロネクチン、プロテインＣインヒビター、組織因子経路インヒビター、血小板第４因子、ヒスチジンに富む糖タンパク質、トロンボスポンジン、ウロキナーゼ、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、リパーゼ、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅである。
【００５８】
本発明に好適な結合部位の例は、ヘパリン結合部位、ＲＧＤペプチド結合部位、ＲＧＤモチーフ、Ｓｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメイン、Ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメイン、金属イオン結合部位、脂質結合部位、および核酸結合部位である。好ましい実施形態では、タンパク質は、図１に示されている血液凝固因子ＶＩＩＩの結合部位などのヘパリン結合部位を含む。
【００５９】
ＲＧＤ結合部位を含む標的タンパク質には、例えばインテグリンが包含される。ＲＧＤモチーフ含有標的タンパク質の例は、ディスインテグリン、ならびにフィブロネクチンおよびビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質である。
【００６０】
金属イオン結合部位を含む標的タンパク質には、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼおよびＡＤＡＭ／ＡＤＡＭＴＳタンパク質などのメタロプロテアーゼ；およびメタロチオネイン（metallotheonein）が包含される。
【００６１】
脂質結合部位を含む標的タンパク質には、例えば、アポリポタンパク質が包含される。
【００６２】
好ましい実施形態では、標的タンパク質は、標的タンパク質の分解および／またはクリアランスに少なくとも部分的に寄与する結合性部分に対する結合部位を含む。
【００６３】
結合体の結合性部分は、循環中のその半減期が増加される標的タンパク質に応じて選択されなければならない。好ましくは、結合性部分は、標的タンパク質に対して選択的に結合する。通常、標的タンパク質および結合体の複合体は、結合性部分に結合可能な他のタンパク質の非存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで形成される。
【００６４】
標的タンパク質に対する結合性部分の強力な親和性および特異性は、複合体が特定の期間無傷のまま存在する（つまり投与の際に結合(associate)する）ことを確実にするために好ましい。これは、半減期の延長を達成するために重要である。２つの化合物の相互作用の結合強度は、通常、その解離定数Ｋｄによって表される。解離定数Ｋｄは、平衡定数であり、結合化合物に対する未結合化合物の比率、例えばタンパク質−結合体複合体に対する遊離標的タンパク質および遊離結合体の濃度を記述する。生体系における典型的な範囲は、マイクロモル〜ピコモルである。例えば、生理学的な塩濃度下では、タンパク質（つまり、ヘパリン結合タンパク質）に対するヘパリン結合のＫｄ値は、低〜高ナノモルの範囲にある。例えば、Olson et al., 1981 J. Biol. Chem., 256, 11073-11079では、抗トロンビンＩＩＩに対するヘパリンの結合について、７．２＋／−１．９×１０−８Ｍの解離平衡定数が決定されており、これは、タンパク質−ヘパリノイド相互作用が高親和性であることを実証している。
【００６５】
従って、標的タンパク質−結合性部分相互作用、および同様に標的タンパク質−結合体相互作用の解離定数Ｋｄは、好ましくは、マイクロモルまたはそれ未満の範囲にある。好ましくは、前記解離定数は、１００μＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下である。
【００６６】
結合分子は、ペプチド部分、サッカライド部分、核酸部分、脂質部分その他の有機化合物などの任意の化学的性質のものでよい。
【００６７】
１つの実施形態では、結合分子は、標的タンパク質の天然リガンド、または標的タンパク質に結合可能なリガンドの一部を含む。しかしながら、結合分子は、標的タンパク質の天然リガンドを含まなくてもよい。１つの実施形態では、結合分子は、標的タンパク質の天然リガンドの模倣体を含む。そのような模倣体は、いかなる化学的性質であってもよく、好ましくは、天然および／または人工アミノ酸を含むペプチド模倣体、天然および／または人工モノサッカライドを含むサッカライド模倣体、通常のリン酸ジエステル結合または人工的結合により結合させた天然および／または人工ヌクレオチドまたはペプチド核酸を含む核酸模倣体または有機化合物模倣体である。
【００６８】
従って、標的タンパク質がヘパリン結合部位を含む場合、結合分子は、ヘパリン部分、ヘパラン硫酸部分、またはフコイダン、硫酸化フカン、もしくはヘパリノイドのような、つまり高度に酸性の、例えば高度に硫酸化された多糖類、もしくはそれらの模倣体などのヘパリン様部分でもよい。ヘパリンは、エノキサパリン（クレキサン；Ｍｗ＝４，２ｋＤａ）または完全合成ペンタサッカリドフォンダパリヌクス（アリクストラ；１７２６．７７ｇ／ｍｏｌ）などの、約８０００Ｄａ未満の重量平均分子量を有する低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）でもよい。好ましくは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、またはヘパリノイドは、平均して、ペンタサッカリドなどの３〜２０個のモノサッカリド単位、より好ましくは５〜１５個のモノサッカリド単位で構成される。
【００６９】
好ましくは、ヘパリン様分子は、ヘパリン模倣ペプチドなどの、標的タンパク質のヘパリン結合部位に結合するペプチドである。従って、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の模倣体は、好ましくはＧｌｕまたはＡｓｐのような負電荷アミノ酸、硫酸化アミノ酸などの負電荷基で修飾されたアミノ酸、特に硫酸化チロシン、およびリン酸化アミノ酸、特にリン酸化チロシン、セリン、もしくはトレオニン、および／または側鎖に酸性部分を有する非天然アミノ酸を含むペプチドでもよい。好ましくは、ヘパリン模倣ペプチドは、硫酸化チロシンなどの１つまたは複数の硫酸化アミノ酸を含む。１つの実施形態では、模倣ペプチドは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｙ（ＳＯ３）−Ｘ２−Ｙ（ＳＯ３）を含み、式中、Ｙ（ＳＯ３）は、硫酸化チロシンであり、Ｘ１は、負電荷アミノ酸、セリン、アラニン、またはグリシンであり、Ｘ２はアスパルテート、アラニンであるかまたは存在しない。例示的な模倣ペプチドは、以下のアミノ酸モチーフを含む。
− ＳＹ（ＳＯ３）ＤＹ（ＳＯ３）、
− ＳＹ（ＳＯ３）ＤＹ（ＳＯ３）ＳＹ（ＳＯ３）ＤＹ（ＳＯ３）または
− Ｙ（ＳＯ３）Ｙ（ＳＯ３）ＧＧＹ（ＳＯ３）ＤＹ（ＳＯ３）。
【００７０】
更に、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の模倣体は、スラミンまたはその誘導体などの化学的な化合物、スルホン化ポリマー、アミノ酸側鎖を有するポリマー、モノサッカリドまたはジサッカリド側鎖を有するポリマーなどの有機ポリマーまたは硫酸化サッカライド、特に硫酸化ペンタサッカライドでもよい。
【００７１】
ヘパリンの好適な模倣体は、例えば、H. H. A. M. Hassan, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 7:1206-1235 (2007)、S. H. Kim and K. L. Kiick, Peptides 28:2125-2136 (2007)、およびH. D. Maynard and J.A. Hubbell, Acta Biomateriala 1:451-459 (2005)に記載されており、これら文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
標的タンパク質がＲＧＤ結合部位を含む場合、結合性部分は、ＲＧＤモチーフを含む天然または合成ペプチドでもよい。好適な配列は、ディスインテグリンおよび細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチンなどのインテグリン結合タンパク質に見出すことができる。
【００７３】
標的タンパク質がＲＧＤモチーフを含む場合、結合性部分は、例えば、幾つかのインテグリン、またはＲＧＤモチーフに特異的に結合する合成化合物、例えば国際公開第９０／０３９８３号または国際公開第９７／０８２０３号に記載されているような環状ペプチドに見出されるようなＲＧＤ結合タンパク質ドメインなどの、ＲＧＤ結合ペプチドでもよい。
【００７４】
標的タンパク質がＳＨ２ドメインを含む場合、結合性部分は、好ましくはチロシン残基、より好ましくはリン酸化チロシン残基を含むＳＨ２結合ペプチド、またはＳＨ２結合ペプチドの模倣体でもよい。
【００７５】
標的タンパク質がＳＨ３ドメインを含む場合、結合性部分は、好ましくはプロリン残基を含むＳＨ３結合ペプチド、またはＳＨ３結合ペプチドの模倣体でもよい。好ましくは、ＳＨ３結合ペプチドは、Ｐがプロリン、Ｘが任意のアミノ酸、好ましくは脂肪族アミノ酸であるアミノ酸モチーフＰ−Ｘ−Ｘ−ＰまたはＲがアルギニン、Ｋがリジン、およびＸが任意のアミノ酸であるアミノ酸モチーフＲ−Ｘ−Ｘ−Ｋを含む。
【００７６】
標的タンパク質が金属イオン結合部位を含む場合、結合分子は、アミン、カルボン酸、またはチオールなどの金属錯体の配位子でもよい。
【００７７】
標的タンパク質が脂質結合部位を含む場合、結合性部分は、リン脂質または脂肪酸などの脂質でもよい。
【００７８】
標的タンパク質が核酸結合部位を含む場合、結合性部分は、一本鎖または二本鎖のリボ核酸またはデオキシリボ核酸などの天然または合成核酸、またはペプチド核酸などのその模倣体でもよい。核酸結合部位が配列特異的である場合、結合性部分は、好ましくは、結合モチーフの配列全体と約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を有する配列などの、必要な配列または密接に関連する配列を有する核酸である。
【００７９】
１つの実施形態によると、結合分子は、抗体、またはその可変領域もしくは結合性部分を含む抗体の一部ではない。更なる実施形態によると、標的タンパク質は、抗体、またはその可変領域もしくは結合性部分を含む抗体の一部ではない。更に、１つの実施形態によると、結合分子も標的タンパク質も、抗体、またはその可変領域もしくは結合性部分を含む抗体の一部ではない。
【００８０】
好ましい実施形態では、標的タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子などのヘパリン結合部位を有するタンパク質であり、結合性部分は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパリノイド、またはそれらの模倣体である。
【００８１】
標的タンパク質の機能に対する結合分子の影響を最小限に抑えるために、結合性部分は、好ましくは可能な限り小さくあるべきである。従って、結合性部分は、好ましくは５０ｋＤａ以下、より好ましくは１０ｋＤａ以下、更により好ましくは５ｋＤａ以下の分子量を有する。更に、結合分子は、１００Ｄａ以上、例えば５００Ｄａ以上の分子量を有していてもよい。
【００８２】
標的タンパク質の半減期の増加は、主として結合体の結合に起因する。従って、結合体は、標的タンパク質に結合すると、好ましくは、ヒトまたは動物体内の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させる。例えば、結合体は、標的タンパク質に結合すると、標的タンパク質の循環からのクリアランスまたは標的タンパク質の分解を妨害することができてもよく、ならびに／または細胞による標的タンパク質の取り込み、および／もしくは分解酵素による標的タンパク質の認識および結合に関与する標的タンパク質の１つまたは複数の領域を遮蔽することができてもよい。
【００８３】
ポリマーは、少なくとも１つの天然または合成の直鎖、分岐、または樹状ポリマーを包含し、好ましくは水および体液に可溶性であり、より好ましくは親水性である。好ましい実施形態では、ポリマー部分は、生物学的に不活性であり、および／または薬学的に許容される
【００８４】
ポリマーは、所望の目的に好適な任意のサイズであり得る。これを考慮すると、ポリマーは、好ましくは、５ｋＤａ以上、より好ましくは１０ｋＤａ以上の分子量を有する。上限としては、ポリマーは、１０００ｋＤａ以下の、より好ましくは３００ｋＤａ以下、および最も好ましくは２００ｋＤａ以下の分子量を有する。
【００８５】
特定の実施形態では、ポリマーは、多糖類、ポリペプチド、核酸、ポリエーテル、ポリエステル、およびポリオレフィンからなる群から選択されるポリマーを含む。好ましくは、ポリマー部分は、以下からなる群から選択されるポリマーを含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧホモポリマー、ｍＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマー、プロピレングリコールを有するエチレングリコールのコポリマーを含み、前記ホモポリマーおよびコポリマーが、置換されていないかまたは１つの末端が例えばアシル基で置換されているポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリグリセリンまたはポリシアル酸、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）およびそのコポリマー、ポリグルタミン酸、炭水化物、セルロース、およびメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）およびデキストリン、ならびにそれらの誘導体などのデンプン、硫酸デキストラン（dextransulfat）、カルボキシメチルデキストラン、架橋デキストラン、およびカルボキシメチルデキストリンなどのデキストランおよびデキストラン誘導体、キトサン、ポリビニルアルコール、およびポリビニルエチルエーテル、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrollidon）、アルファ，ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド、ポリオキシエチル化ポリオール。
【００８６】
特定の実施形態では、ポリマーは、少なくとも５ｋＤａ、および好ましくは最大１０００ｋＤａ、より好ましくは８〜５００ｋＤａ、および更により好ましくは１０〜３００ｋａ、および１００〜３００ｋＤａの平均分子量（Ｍｗ）を有するヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンを含む。ポリマーは、１グルコース単位当たり約０．４〜約１．３、好ましくは０．４〜０．９または０．４〜０．７のヒドロキシアルキル（ヒドロキシエチル）によるモル置換度を有していてもよい。
【００８７】
ポリマーは、結合性部分に直接結合させてもよい。ポリマー部分および／または結合性部分が、適切な結合基を有していない場合、それらが他方の分子上の少なくとも１つの反応性基と反応して結合体を形成することができるように、１つまたは複数のリンカーを使用してポリマーおよび／または結合分子を適切に修飾することができる。この目的のためには、当技術分野で公知の任意の好適な結合戦略を使用することができる。好適なリンカー、ポリマー部分、および結合方法は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１０１６９８号およびOrlando, Michele、学位論文、Modification of proteins and low molecular weight substances with hydroxyethyl starch (HES)、Justus-Liebig-Universitat、ギーセン、ドイツ、２００３年にも詳細に記載されている。好ましくは、結合は特異的であり、その結果結合分子および／またはポリマーの１つまたは規定数の反応性基のみが結合に使用される。ポリマー、結合分子、および所望により用いてもよい１つまたは複数のリンカー、を相互に結合させるには、任意の好適な反応性基を使用することができる。
【００８８】
従って、結合分子またはポリマーがペプチドを含む場合、結合反応は、アルファ鎖アミノ基もしくはカルボキシ基を、または好ましくはペプチドに一度だけ生じるアミノ酸の側鎖反応性基を特異的に対象とすることができる。好適な側鎖反応性基の例は、システインのチオール基、リジン、アルギニン、またはヒスチジンのアミノ基、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシ基、アスパルテートまたはグルタメートのアミド基、およびセリン、トレオニン、またはチロシン（thyrosine）のヒドロキシ基である。しかしながら、人工アミノ酸により導入された反応性基も、結合に使用することができる。
【００８９】
結合分子またはポリマーがペプチドを含む場合、もう一方の部分に存在するかまたは導入された以下の反応性基を結合に使用することができる。
− ペプチドのアミノ基と反応するアシル化基、例えば酸無水物基、Ｎ−アシルイミダゾール基、アジド基、Ｎ−カルボキシ無水物基、ジケテン基、ジアルキルピロカルボン酸基、イミドエステル基、カルボジイミド活性化カルボキシル基。上記の基は全て、例えばタンパク質のアミノ基と反応して、アシルまたは類似の結合を伴う共有結合を形成することが知られている。
− ハロ−カルボキシル基、マレイミド基、活性化ビニル基、エチレンイミン基、ハロゲン化アリール基、２−ヒドロキシ−５−ニトロ−ベンジルブロミド基などの、ペプチドのスルフヒドリル（メルカプト）基、チオメチル基、イミダゾ基、またはアミノ基と反応するアルキル化基、およびペプチドのアミノ基と反応し、還元剤と共に用いられる脂肪族アルデヒド基およびケトン基。
− ジアゾカルボキシレート基、ならびにカルボジイミドおよびアミン基の組み合わせ、などの、ペプチドのカルボキシル基と反応するエステルおよびアミド形成基。
− ヨウ素などの酸化剤の存在下でスルフヒドリル基と反応する５、５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）基、オルト−ピリジルジスルフィド基、およびアルキルメルカプタン基などの、ペプチドのスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基。
− シクロヘキサンジオン基などのジカルボニル基、およびペプチドのグアニジン部分と反応する他の１，２−ジケトン基。
− ペプチドのフェノール基と反応するジアゾ基。
− ペプチドのアミノ基と反応する、臭化シアンと多糖類との反応に由来する反応性基。
【００９０】
結合反応を実施するのに好適なアミノ酸が、ペプチドを含む結合性部分／ポリマー部分にない場合、ペプチドにそれぞれのアミノ酸を、好ましくはそのアミノ終末端またはカルボキシ終末端に導入することができる。
【００９１】
結合性部分および／またはポリマー部分がサッカライドを含む場合、結合反応は、サッカライドの還元末端のアルデヒド／ヘミアセタール基またはケト／ヘミケタール基をそれぞれ特異的に対象とすることができる。好適な結合戦略は、例えば、国際公開第２００４／０２４７７６号Ａ１に記載されている。
【００９２】
例えば、還元末端のアルデヒド（aldhyde）／ヘミアセタール基を、他方の部分に存在するかまたは導入された第一級アミノ基による還元的アミノ化に供してもよい。この反応は、好ましくは、水素化ホウ素（例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム）または有機ホウ素複合体などの還元剤の存在下で実施される。或いは、アルデヒド／ヘミアセタール基を、ヨウ素、臭素、または好適な金属イオンなどの酸化剤を使用した選択的酸化または電気化学的酸化に供してもよく、その結果としてエステル、ラクトン、またはアミドなどのカルボキシ基または活性化カルボキシ基がもたらされる。その後、（活性化）カルボキシ基を、例えば以下のものなどの活性化剤の存在下でアミノ基と反応させてもよい。Ｎ−ヒドロキシサクシニミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、チオフェノール、ｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン（ＨＯＯＢｔ）、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸（ＨＮＳＡ）、２−ヒドロキシピリジン、３−ヒドロキシピリジン、３，４−ジヒドロ−４−オキソベンゾトリアジン−３−オール、４−ヒドロキシ−２、５−ジフェニル−３（２Ｈ）−チオフェノン−１，１−ジオキシド、３−フェニル−１−（ｐ−ニトロフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン）、［１−ベンゾトリアゾリル−Ｎ−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート］（ＢＯＰ）、［１−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ビス（ペンタメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート、［Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、またはカルボジイミド、例えば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）。
【００９３】
結合性部分および／またはポリマー部分が核酸を含む場合、結合は、２’−ヒドロキシ基、３’−ヒドロキシ基、または５’−ヒドロキシ基によって行うことができる。結合性部分が脂肪酸を含む場合、そのカルボキシ基を使用することができる。ポリマー部分が、ポリエステル、ポリエーテル、またはポリオレフィンなどの有機ポリマーを含む場合、もし存在すればポリマーの終端の反応性基、ポリマーの単量体単位の反応性基、または導入された反応性基を、結合に使用することができる。
【００９４】
従って、本発明による結合体は、所望によっては、まずポリマー部分および／または結合性部分を化学的に修飾して、他方の部分で利用可能であるかまたは他方の部分に導入された化学基と反応可能な少なくとも１つの化学基をその上に有するポリマー部分および／または結合性部分を生成し、次にポリマー部分および結合性部分を共に反応させて、共有結合で結合したそれらの結合体を形成することによって、製作することができる。或いは、所望によっては修飾されていてもよいポリマー部分または所望によっては修飾されていてもよい結合性部分を、まず（更なる）リンカーに結合させ、次にリンカーを所望によっては修飾されていてもよい他方の部分に結合させてもよい。
【００９５】
結合反応の特定の実施形態では、第１のリンカーはポリマー部分に結合させられ、ここで前記第１のリンカーは、ポリマー部分と反応せず、ポリマー部分に存在しない反応性基を保持する。第２のリンカーは結合性部分に結合させられ、ここで前記第２のリンカーは、結合性部分と反応せず、結合性部分に存在しない反応性基を保持する。その後、第３のリンカーが、第１および第２のリンカーに順次または同時に結合させられる。第１および第２のリンカーに第３のリンカーを結合させるのに使用される反応性基は、この目的に好適な任意の反応性基であり得る。更に、第１および第２のリンカーをそれぞれポリマー部分および結合性部分に結合させる間、リンカーの反応性基は保護基により保護されていてもよい。
【００９６】
ポリマー部分、結合性部分、および所望により用いてもよい１つまたは複数のリンカーを互いに結合するために使用することができる例示的な反応性基は、Ｃ−Ｃ二重結合またはＣ−Ｃ三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合、ハロゲン化アシル、ハロ、ヒドロキシ、アルデヒド、アミド、アミノ、アミノオキシ、ヒドロキシアミノ、カルボニル、カルボキシ、活性化エステル、シアノ、チオシアノ、イミノ、ニトロ、ニトロソ、ニトリル、ペルオキシ、ホスホ、スルホニル、スルフィニル、チオール、ヒドラジン、およびヒドラジド基である。リンカーを互いに結合させるのに有用な反応性基対は、例えば、アミノ基およびスクシンイミドエステル基、チオール基およびマレイミド基である。
【００９７】
結合反応に使用することができる保護基の例は以下の通りである：
− アルコール保護用：アセチル（Ａｃ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、およびトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテルなどのシリルエーテル、メチルエーテル、およびエトキシエチルエーテル（ＥＥ）。
− アミン保護用：カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トシル（Ｔｓ）、およびスルホンアミド（Ｎｏｓｙｌ＆Ｎｐｓ）。
− カルボニル基保護用：アセタール、ケタール、アシラール、およびジチアン；および
− カルボン酸保護用：メチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびシリルエステル。
【００９８】
結合体中の結合分子数およびポリマー数は、適合する限り自由に選択することができる。従って、結合体は、１つだけ、２つ以上、３つ以上、および４つ以上などの１つまたは複数の結合分子を含んでいてもよい。同様に、結合体は、１つだけ、２つ以上、３つ以上、および４つ以上などの１つまたは複数のポリマーを含んでいてもよい。１つの実施形態では、結合体は、１つの結合分子および１つのポリマーを含む。
【００９９】
結合分子をポリマーに結合させるためにリンカーが使用される場合、１つのリンカーは、２つの分子を互いに、例えば１つの結合性部分を１つのポリマー部分に結合させることができ、または１つのリンカーは、２つを超える分子を互いに、例えば１つの結合性部分を２つ以上のポリマーに、２つ以上の結合分子を１つのポリマーに、または２つ以上の結合分子を２つ以上のポリマーに結合させることができる。
【０１００】
リンカーは、任意の好適な長さであり得るが、できるだけ短いことが好ましい。しかしながら、リンカーは、ポリマー部分が結合性部分および標的タンパク質の相互作用を妨害しないように、十分に長いことが望ましい。分子の結合に好適なリンカーは、従来技術において周知であり、商業的に入手可能でもある。
【０１０１】
結合体におけるリンカーの形成に好適な分子は、リンカーを結合分子、ポリマーおよび／または別のリンカー分子に結合させるために、２つ以上の官能基（上述のような）を含む。これら官能基は、好ましくは、脂肪族または芳香族炭水化物に由来するものなどの、薬学的に許容される架橋基により結合させられる。リンカーは、ホモ二官能性であってもよく、またはヘテロ二官能性であってもよい。
【０１０２】
結合体全体は、所望の応用に好適な任意のサイズを有することができる。しかしながら、結合体は、好ましくは５〜１０００ｋＤａ、好ましくは２０〜３００ｋＤａの分子量を有する。
【０１０３】
本発明の複合体は、１つまたは複数の、例えば１、２、３、または４つ以上の標的タンパク質、および１つまたは複数の、例えば１、２、３、または４つ以上の結合体で構成されていてもよい。１つの実施形態では、複合体は、１つの標的タンパク質のみおよび１つの結合体のみを含む。
【０１０４】
ヒトまたは動物の循環に投与された際の、本発明の複合体中の標的タンパク質の半減期は、好ましくは、その遊離形態（例えば、小型イオンと結合しているに過ぎず、本発明の結合体とは結合していない）で投与された際の半減期と比較して、少なくとも１．１倍、より好ましくは少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、および最も好ましくは少なくとも１０倍増加される。
【０１０５】
本発明の複合体は、医学に使用することができる。好ましくは、複合体中の標的タンパク質は、特定の疾患の治療または予防に有用な医薬活性を有する。より好ましくは、標的タンパク質は、ヒトまたは動物患者の循環においてその医薬活性を発揮する。好ましくは、治療または予防される疾患は、ヒトまたは動物体内の天然タンパク質の欠損または量の減少または非存在によって引き起こされる。
【０１０６】
特に、該疾患は、特定のタンパク質の遺伝子における先天性または後天性の欠損によって引き起こされてもよい。そのような疾患の具体的な例は、血友病Ａおよび血友病Ｂである。例えば、標的タンパク質は第ＶＩＩＩ因子であってもよく、複合体は血友病Ａの治療に使用されてもよく、または標的タンパク質は第ＩＸ因子であってもよく、複合体は血友病Ｂの治療に使用されてもよい。
【０１０７】
従って、別の態様では、本発明は、本発明の複合体を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、ヒトまたは動物患者に複合体を投与するのに好適な、任意の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を更に含むことができる。これらは、好ましくは非経口的に、特に注射、例えば静脈内または動脈内注射により投与される。
【０１０８】
好ましくは、医薬組成物は、１ｐＭ〜１ｍＭの濃度の本発明の複合体、または１用量当たり１ｐｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１００ｎｇ〜５００ｍｇ、の量の本発明の複合体を含む。
【０１０９】
本発明の複合体は、標的タンパク質を結合体と接触させることにより調製することができる。標的タンパク質は、例えば生理学的塩濃度および約６．０〜約８．５の範囲にある生理学的ｐＨを有する好適な溶媒、好ましくは水性溶媒中で結合体と接触させてもよい。しかしながら、溶媒および条件が複合体の形成を阻害しない限り、他の溶媒および条件で標的タンパク質を結合体と結合させてもよい。
【０１１０】
更なる態様では、本発明は、複合体を形成するために使用される結合体に関する。結合体の特定の実施形態は、本発明の複合体に関するセクションに上述されており、それは上記開示に参照されている。更に、本発明は、本発明の複合体を調製するための、それぞれの結合体の使用に関する。好ましくは、前記複合体はｅｘ ｖｉｖｏで調製される。
【０１１１】
更に、本発明は、ヒトまたは動物の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させる方法であって、ポリマー部分と、標的タンパク質に対する結合能を有する結合性部分と、を含む本発明の結合体に、標的タンパク質を接触させるステップを含む方法を提供する。標的タンパク質を結合体と接触させた後、それらは複合体を形成する。複合体は、接触の際に直接形成されてもよく、または例えばヒトまたは動物の循環などの適切な環境へと標的タンパク質および結合体を移す際にのみ形成されてもよい。好ましくは、ヒトまたは動物体内への投与前に、標的タンパク質を結合体と接触させる。特定の実施形態では、本方法は、ヒトまたは動物身体の外部で実施される。
【０１１２】
標的タンパク質を、１０：１〜１：１００００、好ましくは１．２：１〜１：１００、およびより好ましくは１：１〜１：１０のモル比で結合体と接触させる。
【０１１３】
以下においては、標的タンパク質がヘパリン結合部位を含む好ましい実施形態をより詳細に記述する。
【０１１４】
止血に関与する多数のタンパク質が、ヘパリンまたはヘパリノイドに結合する。中でも、アンチトロンビン、トロンビン、フォンビルブラント因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子は、ヘパリンまたはヘパリン様の酸性多糖類に結合する。ヘパリノイドの結合は、タンパク質表面上に発現されるいわゆるヘパリン結合ドメインにより媒介される。ヘパリノイドタンパク質相互作用は比較的親和性が高いため、ヘパリノイドまたは化学的に修飾されたその誘導体による、ヘパリン結合タンパク質の非共有結合による修飾が可能になる。
【０１１５】
血液凝固第ＶＩＩＩ因子の結晶構造に見ることができるように（図１を参照）、Ｓ５５８〜Ｑ５６５位のヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ヒドロキシアルキルデンプンの結合に利用可能である。
【０１１６】
加えて、Ｒ４８４〜Ｆ５０９位および／またはＥ１８１１〜Ｋ１８１８位で第ＦＶＩＩＩ因子に結合した低密度リポタンパク質受容体関連タンパク（ＬＲＰ）を、結合の標的とすることができる（図１を参照）。
【０１１７】
一般的に、生物学的機構の修飾は、異化および／または活性などが、特定の分子間相互作用の増大または阻害を結果としてもたらすように意図されている。その結果として、標的タンパク質の半減期が増加する。
【０１１８】
結合リガンドは、例えばヘパリンなどの酸性で負電荷の多糖類、または模倣ペプチド、核酸、および／もしくは有機分子などの他の結合物質でもよい。
【０１１９】
結合分子として、これらの高親和性リガンド（highly affine ligand）をそのまま、または特定の修飾をして使用することができる。
【０１２０】
結合体を形成するためには、それらを、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ／ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびオリゴ糖などのポリマーに結合させなければならない。
【０１２１】
酸性多糖類は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および例えばフコイダン、硫酸化フカン、またはガラクタンのような、他の酸性好ましくは陰イオン性の炭水化物ポリマーでもよい。
【０１２２】
「ヘパリノイド」と呼ばれるヘパリン様酸性オリゴ糖は、高度に酸性の、例えば高度に硫酸化された多糖類である。ヘパリノイドは、ほとんどの種に広範に見出され、少なくともヘパラン硫酸は、事実上全ての動物に見出される。
【０１２３】
ヘパリンは、典型的には、Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸のいずれかでできている二糖の繰り返しで構成される。Ｄ−グルコサミン（D-gulcosamin）は、Ｎ―アセチル化またはＮ−硫酸化アミノヘキソースとして存在することができ、Ｃ６またはＣ３で更に硫酸化されていてもよい。ポリサッカライド鎖は、典型的には、３ｋＤａ〜４０ｋＤａに及ぶ分子量を有する様々な長さであり得、還元末端および非還元末端を有する。還元末端は、多くの化学反応に、つまりタンパク質、炭水化物、および他の反応パートナーに結合させるために使用することができる。ヘパリン、ヘパリン硫酸の構造は、‘Heparin-Binding Proteins’ by H. Edward Conrad, Academic Press, 1998に詳細に記述されている。
【０１２４】
ヘパリンは、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗凝固用に、および医療用具の表面被覆用に商業的に使用されている。
【０１２５】
ヘパリンおよびヘパリノイドの顕著な特性は、多数のいわゆるヘパリン結合タンパク質との強力な相互作用である。１００個を超えるタンパク質がヘパリノイドに結合することが見出されている。それらの中で、凝固第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子だけでなく、凝固およびフィブリン溶解だけに関連しているわけではない多数の他のタンパク質が、特異的かつ強力にヘパリノイドと結合する。ヘパリン結合タンパク質の最も顕著で典型的な例は、アンチトロンビンである。
【０１２６】
他のヘパリン結合タンパク質は、例えば、アンチトロンビン、トロンビン、フォンビルブラント因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ビトロネクチン、プロテインＣインヒビター、組織因子経路インヒビター、血小板第４因子、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、トロンボスポンジン、ウロキナーゼ、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、リパーゼ、アポリポタンパク質Ｂ、およびアポリポタンパク質Ｅである。
【０１２７】
それらの中で、凝固およびフィブリン溶解に関連する多数のタンパク質が、特異的かつ強力にヘパリノイド（heparonoid）と結合する。ヘパリン結合タンパク質の最も顕著で典型的な例は、アンチトロンビンである。
【０１２８】
ヘパリン結合タンパク質は、少なくとも１つのいわゆるヘパリン結合ドメインを示す。ヘパリン結合ドメインの性質および共通の構造的特徴は、例えば、H. E. Conrad, ‘Heparin-Binding Proteins’, Academic Press, 1998により、以前に記述されている。
【０１２９】
ヘパリン−タンパク質結合の際立った特性は、その比較的高い親和性である。ヘパリノイド−タンパク結合の結合強度は、通常、上述のようにその解離定数Ｋｄによって表される。
【０１３０】
タンパク質のヘパリン結合部位に非共有結合で結合する人工酸性多糖類を合成することは、リガンド間の、つまり人工酸性多糖類と結合するタンパク質との間の更に高い結合親和性をその結果としてもたらすことができる。
【０１３１】
従って、ヘパリノイドのような酸性多糖類および特別に合成された人工酸性多糖類は、高親和性、非共有結合でヘパリン結合タンパク質、例えばヒトまたは組換え凝固第ＶＩＩＩ因子、ヒトまたは組換え凝固第ＩＸ因子、ヒトまたは組換えフォンビルブラント因子、および他の結合タンパク質のような止血に関与するヘパリン結合タンパク質に結合する理想的なリガンドである。
【０１３２】
ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、大量に存在する分子であり、多種多様な異なる結合パートナーと相互作用し、従ってある種の乱交雑的な結合挙動を示す。
【０１３３】
ヘパリンを他のヘパリノイドに置換することにより、標的タンパク質に対する結合親和性および特異性を誘発および最適化できるであろう。更に、例えば、人工的に合成されたまたは植物由来の陰イオン性多糖類に切り換えることにより、またはヘパリン模倣ペプチドを使用することにより、ウイルスまたはプリオンなどの伝染因子を含有するリスクを低減できるであろう。
【０１３４】
１つの考え得るヘパリン代替物は、フコイダンまたは硫酸化フカンである。
【０１３５】
フコイダンは、世界中の沿岸水域に大量に存在する硫酸化植物多糖類（Ｍｗは平均２０．０００Ｄａ）である。それらは、褐藻類（Ｐｈｙａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）および海生無脊椎動物に主として見出される。褐藻類に由来するフコイダンは、複雑な高度に分岐した硫酸化多糖類構造を含むが、海生無脊椎動物に由来する硫酸化フカンは、単一の連結タイプのみを含み、規則的な反復オリゴ糖構造だが多様な硫酸化パターンを示すフコースの直鎖ホモポリマーである（Pomin & Mourao, 2008；Berteau & Mulloy, Glycobiology 13, 2003に概説）。フコイダンおよび硫酸化フカンは、グリコサミノグリカンおよび他の硫酸化グルカンの硫酸置換パターンを模倣できることによって多くの生物活性を共有するため（Berteau & Mulloy, 2003）、ヘパリン代替物として示唆されている。それらは、ヘパリンのように、凝固のモジュレーターとして機能することができ（Chargaff et al., 1936）、炎症、細胞増殖および接着、ウイルス感染、ならびに受精などの多くの生物活性に影響を及ぼすことができる（Boisson-Vidal et al., 1995）。フコイダンは、植物由来であるため、ウイルスまたはプリオンなどの感染因子を含有する可能性はより低い。これにより、フコイダンは、半減期延長目的用でヘパリン結合タンパク質と非共有結合で結合するフコイダン−ポリマー結合体のような、ヘパリンの望ましい代替物となる。
【０１３６】
ヘパリンおよびヘパリノイドに依存せず、前記標的タンパク質に対して高度に特異的で親和性な非共有結合による結合パートナーとして多数の可能な種が存在する。これらの結合種には、特異的結合ペプチド（例えば抗体認識ドメインに由来する配列）もしくは模倣ペプチド、非中和抗体、低分子、またはＤＮＡ／ＲＮＡ断片（例えば、アプタマー）が包含される。
【０１３７】
アプタマーとは、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション法または同等のＳＥＬＥＸ法（指数関数的濃縮によるリガンドの系統進化）（Tuerk. & Gold (1990) Science）の過程を繰り返すことにより、低分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的に結合するように、ならびに細胞、組織、および生物などにさえ結合するように操作された核酸種である（Ellington & Szostak (1990) Nature）。アプタマーは、一般に使用されている生体分子、抗体の分子認識特性に匹敵する分子認識特性、すなわち低ナノモルからピコモル範囲の高特異性および親和性を提供するため、治療応用に有用である。それらの識別認識に加えて、アプタマーは、完全に試験管内で操作することができ、化学合成により容易に生成され、望ましい保管特性を有し、治療応用において免疫原性をほとんどまたは全く誘発しないため、抗体より有利な点を提供する。
【０１３８】
アプタマーは、標的タンパク質に対する非常に特異的かつ高親和性の結合を示すため、アプタマーは本明細書において、アプタマー−ポリマー結合体内の、標的タンパク質に対する非共有結合による結合パートナーとして示唆される（図３を参照）。アプタマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来であるため、ウイルスまたはプリオンなどの感染因子を全く含まず、そのため半減期を延長させる手法のための望ましい成分となる。
【０１３９】
わずかに異なる手法では、半減期延長のための非共有結合による結合パートナーとの特異的相互作用の有望な標的として翻訳後修飾（グリコシル化などのＰＴＭ）が注目されている。
【０１４０】
一例として、本明細書には、グリコシル化ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体が挙げられる。ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦの脱シアリル化は、例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ；Sodetz et al., JBC 1977 & 1978）による迅速な血漿クリアランスの要因である。これら十分に特徴がわかっているＡＳＧＰ−Ｒ相互作用に関する知識（Meier 2005）に基づいて、ＡＳＧＰ−Ｒ模倣ペプチドを生成および合成し、短いリンカーを介してポリマー、例えばＨＥＳ／ＨＡＳ部分に結合することができるであろう（図４を参照）。その後、この結合体を使用してＡＳＧＰ−Ｒ結合部位を遮断し、遮蔽効果または立体障害による受容体媒介性クリアランスを阻害することができ、従って血漿半減期を延長することができるであろう。
【０１４１】
標的タンパク質と酵素との特異的な非共有結合による相互作用に基づく模倣ペプチドを使用する別の例は、エラスターゼとＧ−ＣＳＦとの相互作用である：
【０１４２】
エラスターゼは、好中球エラスターゼ（ＮＥ）またはヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）としても知られており、Ｇ−ＣＳＦと特異的に結合する（Hunter et al., 2003）。エラスターゼ結合領域のアミノ酸配列に基づいて、模倣ペプチドを生成および合成し、ポリマーに（例えば短いリンカーを介してＨＥＳ／ＨＡＳ部分に）結合させて、Ｇ−ＣＳＦの半減期を延長することができるであろう。
【０１４３】
既存のＧ−ＣＳＦ（Hill et al., PNAS (90) 1993）のＸ線構造および幾つかの既知の非中和抗Ｇ−ＣＳＦ抗体のＸ線構造（Layton et al., JBC (266) 1991）に基づいて、標的とする現象を模倣する模倣ペプチドを、非共有結合によるポリマーの標的タンパク質への結合を行うために生成することができるであろう。この例では標的タンパク質はＧ−ＣＳＦであり、前記非共有結合によるポリマーの標的タンパク質への結合はＧ−ＣＳＦ医薬の半減期を延長するために行われる。
【０１４４】
特定の実施形態では、本発明は、ヘパリン結合部位を有する少なくとも１つのタンパク質、および少なくとも１つのヘパリンまたはヘパリン様分子を含む複合体であって、ヘパリンまたはヘパリン様分子が、ヒドロキシアルキルデンプンに共有結合で結合した複合体に関する。
【０１４５】
タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子、アンチトロンビン、トロンビン、フォンビルブラント因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および第ＩＸ因子から選択されてもよい。
【０１４６】
ヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエチルデンプンであってもよい。ヒドロキシアルキルデンプンの分子量は、例えば１００〜３００ｋＤの範囲にある。少なくとも１つのヘパリンまたはヘパリン様分子の結合の他、１つのヒドロキシアルキルデンプン分子に少なくとも２つのヘパリン分子またはヘパリン様分子を共有結合で結合させてもよい。
【０１４７】
更に、本発明は、上述のような複合体を調製するための方法であって、以下のステップを含む方法を提供する。
− 少なくとも１つのヘパリン分子またはヘパリン様分子を、少なくとも１つのヒドロキシアルキルデンプンに結合させて、ヘパリン−ヒドロキシアルキルデンプン結合体を得ること、
− 結合体をヘパリン結合部位を有するタンパク質と共にインキュベートすること。
【０１４８】
本方法では、ヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエチルデンプンであってもよい。少なくとも１つのヘパリン分子またはヘパリン様分子は、例えばホモ二官能性であってもヘテロ二官能性であってもよい二官能性リンカーを介して、少なくとも１つのＨＡＳ分子に結合してもよい。
【０１４９】
ヘパリンまたはヘパリン様分子、およびヒドロキシアルキルデンプンのうち少なくとも１つは、以下のステップにより修飾されてもよい。
− アルデヒド基を導入するために酸化すること、
− 還元的アミノ化。
【０１５０】
１つの実施形態では、少なくとも２つのヘパリン分子またはヘパリン様分子を、１つのヒドロキシアルキルデンプン分子に結合させる。
【０１５１】
本発明はさらに、
ヘパリン−ヒドロキシアルキルデンプンまたはヘパリン様分子−ヒドロキシアルキルデンプン結合体、
上述の複合体を含む医薬組成物、ここで前記タンパク質は第ＶＩＩＩ因子であってもよい、および
出血性疾患の治療用薬剤を調製するための上述の複合体の使用、
に関する。
【０１５２】
１つの実施形態では、複合体は、ヘパリン結合部位を有する少なくとも１つのタンパク質と、ヘパリンまたはヘパリン様分子がヒドロキシアルキルデンプンに共有結合で結合している少なくとも１つのヘパリンまたはヘパリン様分子とを、両方は含まない。
【０１５３】
１つの実施形態では、複合体を調製するための方法は、以下のステップの両方は含まない。
− 少なくとも１つのヘパリン分子またはヘパリン様分子を、少なくとも１つのヒドロキシアルキルデンプンに結合させて、ヘパリン−ヒドロキシアルキルデンプン結合体を得ること、
− ヘパリン結合部位を有するタンパク質と共に結合体をインキュベートすること。
【０１５４】
１つの実施形態では、結合体は、ヘパリン−ヒドロキシアルキルデンプン結合体でもヘパリン様分子−ヒドロキシアルキルデンプン結合体でもない。
【実施例】
【０１５５】
実施例１：合成化学：ＨＥＳ−ヘパリノイド−結合体
組換え第ＶＩＩＩ因子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長の１つの手法は、第ＶＩＩＩ因子の選択的結合部位により非共有結合で結合した巨大分子担体としてのヒドロキシエチルデンプンに基づく。この非共有結合によるヘパリン結合の場合、その誘導体またはその模倣体を、第ＶＩＩＩ因子結合分子として使用することができる。ＨＥＳをこれらヘパリノイドに結合させて、タンパク質表面の一部を覆って保護する大型複合体を形成する。
【０１５６】
この原理の検証は、表面プラズモン共鳴法による第ＶＩＩＩ因子結合の解析、その後ヘパリノイドとヒドロキシエチルデンプンとの共有結合による１：１結合体を使用した広範なｉｎ ｖｉｖｏ解析により評価した。図２は、ヘパリノイド−ＨＥＳの１：１結合体と複合体化している第ＶＩＩＩ因子の３次元構造を示す。
【０１５７】
この１：１結合体を得るために、ヘパリンおよびＨＥＳを両方とも、選択的結合を可能にした相補的官能基で１箇所のみ化学的に修飾した。どちらの分子も、これら分子にある他の全ての官能基とは化学的に異なるユニークな官能基（ポリサッカライド鎖の還元末端のアルデヒド／セミアセタール基）を正確に１つ有する。従って、開発された合成戦略は、還元末端の誘導体化に基づくものであった。
【０１５８】
ヒドロキシエチルデンプンを、２つの異なるサイズ画分に分離することができ、第ＶＩＩ因子結合分子として、低分子ヘパリン（ＬＭＷＨ）、例えばエノキサパリンを使用することができる。Ｃ１がＬＭＷＨで修飾されたＣ１活性化ヒドロキシエチルデンプンの１：１結合は、遊離チオールとマレイミド官能基のマイケル付加反応に基づく。
【０１５９】
ＨＥＳ４５０／０．７の加水分解および分画
【０１６０】
【化１】
スキーム１：ヒドロキシエチルデンプン
３０ｇのＨＥＳ４５０／０．７（４５０ｋＤａの重量平均分子量、および１グルコース単位当たり０．７モル置換度のヒドロキシエチルを有するヒドロキシエチルデンプン）を３００ｍｌの水に溶解し、ｐＨが２．０に達するまで１Ｍ塩酸をゆっくりと添加した。その後、溶液を８０℃まで加熱し、１６時間激しく撹拌した。その後、溶液を５０℃未満に冷却し、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加することによりｐＨを５〜６にした。部分的に加水分解されたＨＥＳ４５０／０．７を、蠕動ポンプおよび異なる分子量カットオフ（例えば、ＭＷＣＯ＝１００、３０、１０、および５ｋＤａ）を有するＰＥＳ限外ろ過膜を使用して、連続的な接線流限外ろ過工程により分画した。
【０１６１】
使用したＨＥＳ画分：ＨＥＳ２５／０．７（Ｍｗ＝２５ｋＤａ）およびＨＥＳ５４／０．７（５４ｋＤａ）
【０１６２】
Ｃ１アミノＨＥＳの合成
【０１６３】
【化２】
スキーム２：ヒドロキシエチルデンプンの還元末端の還元的アミノ化。
２００ｍｇのＨＥＳ２５／０．７を１２ｍｌの５０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ８．２および０．１６８ｍｌの１，３−ジアミノプロパンに溶解し、５０℃で１時間撹拌した。その後、０．１２６ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、３日間５０℃で撹拌した。産物を、１ｋＤａ限外ろ過膜による限外ろ過で精製し、その後産物を凍結乾燥した。その結果得られた白色固形物を、室温で保管する。
【０１６４】
ＯｘＨＥＳによるＣ１アミノＨＥＳの合成
（博士号学位論文 Michele Orlando、ギーセン、ドイツ、２００３年に基づいて）ＯｘＨＥＳを、水酸化ナトリウム中でのヨウ素による酸化によって得た。
【０１６５】
１ｇのＨＥＳ２５／０．７を水に溶解し、９．０ｍｌの０．１Ｎヨウ素溶液を添加し、その後１．４ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨ溶液を添加した。溶液を終夜撹拌した。反応産物を、１ｋＤａ ＰＥＳ膜による限外ろ過で精製した。最終溶液を、陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−１２０ Ｈ＋）に通し、凍結乾燥した。その結果得られた産物を乾燥させて、残留水をほとんど取り除いた。
【０１６６】
その結果得られた０．１ｇのＯｘＨＥＳを１．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。１１５ｍｇのＨＯＢｔおよび３６．７ｍｇのＤＭＡＰを添加した。次いで、１９０ｍｇのＨＡＴＵおよびその後１，３−ジアミノプロパンを添加し、溶液を３７℃で１時間撹拌した。１９０ｍｇのＨＡＴＵを更に添加し、溶液を３７℃で終夜撹拌した。
【０１６７】
産物を、２５ｍｌのアセトン／エタノール１：１を添加することにより沈殿させ、沈殿物をアセトン／エタノール１：１で洗浄した。ペレットを２ｍｌのＤＭＳＯに再溶解し、２５ｍｌのアセトン／エタノール１：１を添加することにより産物を再沈殿させ、その後更なる洗浄ステップを行った。
【０１６８】
残った産物を、１００ｍｌの水に溶解し、１ｋＤａ膜による限外ろ過で更に精製した。その後、産物を凍結乾燥した。
【０１６９】
Ｃ１マレイミドＨＥＳ（C1MalemideHES）の合成
【０１７０】
【化３】
スキーム３：ヒドロキシエチルデンプンの元々の還元末端のアミノ基のマレイミド活性化。
５００ｍｇのＣ１アミノＨＥＳを、１５ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）に溶解した。１０ｍｌのＮＭＰ中に１４０ｍｇのＮ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステルを溶解した溶液、および８５．６μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加した。溶液を９０分間撹拌または振とうした。溶液を１００ｍｌのアセトン／エタノール１：１に注ぐことにより産物を沈殿させ、−２０℃に冷却した。沈殿物を遠心沈降させ、上清をデカントし、ペレットをアセトン／エタノール１：１で更に２回洗浄し、遠心沈降させた。１ｋＤａ限外ろ過膜による限外ろ過で産物を精製し、凍結乾燥した。その結果得られた固形産物を、−２０℃で保管した。
【０１７１】
低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の化学的修飾
【０１７２】
【化４】
スキーム４：シスタミンおよび還元剤シアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元末端（Ｃ１）の還元的アミノ化。
【０１７３】
【化５】
スキーム５：還元剤ＤＴＴによるＣ１−シスタミンの還元。
２５０ｍｇの凍結乾燥ＬＭＷＨを、１Ｍの塩化ナトリウムを含有する１２ｍｌの０．３Ｍリン酸緩衝液ｐＨ５．０に溶解した。１．３４ｇのシスタミン二塩酸塩を添加し、溶液を４０℃で１時間撹拌または振とうした。その後、０．３７４ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、混合物を３日間４０℃で撹拌または振とうした。
【０１７４】
産物を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０調製用カラムで、移動相として１００ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５を使用し、４．４ｍｌ／分の流速で、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。１つにまとめられた産物画分を、次のステップで直接使用した。
【０１７５】
その結果得られた画分に、９１．８ｍｇのＤＬ−ｌ，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ、０．６ｍｍｏｌ、１０当量）を添加し、溶液を室温で終夜撹拌した。産物を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ３０調製用カラムで、移動相として水を使用し、４．４ｍｌ／分の流速で、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。産物画分を１つにまとめて凍結乾燥した。その結果得られた白色固形物を、−２０℃で保管した。
【０１７６】
Ｃ１マレイミドＨＥＳおよびチオＬＭＷＨの結合
【０１７７】
【化６】
スキーム６：マイケル付加反応によるマレイミド活性化ＨＥＳとチオール活性化ＬＭＷＨとの結合。
３２．２ｍｇのＣ１ＬＭＷＨ−システアミンおよび４２０ｍｇのＣ１マレイミドＨＥＳを、合計１４．５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５に溶解し、３７℃で終夜混合および振とうした。
【０１７８】
ＬＭＷＨ−ＨＥＳ結合体を、結合用に５０ｍＭのＴｔｉｓＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５、溶出用に１ＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液ｐＨ ７．５を用いて、流速５ｍｌ／分、リニアグラジエントでＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で精製した。３０ｍＳ／ｃｍを超える導電率で溶出した画分を、０．１ＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．５および４ｍｌ／分の流速を使用して、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００調製用カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で精製した。移動相として水を使用し、４ｍｌ／分の流速で、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００調製用カラム（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で、産物を脱塩した。クロマトグラムを図９に示す。その結果得られた産物を更に凍結乾燥し、−２０℃で保管した。
【０１７９】
ヘパリン−ＨＥＳ
実施例１および２は、第ＶＩＩＩ凝固因子とＨＥＳ−ヘパリン結合体との非共有結合による複合体で構成される（図２を参照）。ＦＶＩＩＩは、Ａ２ドメインに明確なヘパリン結合部位を有し、ヘパリンおよびヘパリノイド（低分子量ヘパリン（例えば、クレキサン）またはフコイダンなど）と高親和性で結合することができる。ヘパリンまたはヘパリノイドを、ＨＥＳ部分に短いリンカー領域を介して共有結合で結合させる。ＦＶＩＩＩに対するこのＨＥＳ−ヘパリン結合体の非共有結合による結合は、遮蔽効果により半減期延長を媒介する。
【０１８０】
表面プラズモン共鳴結合解析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１ＯＯシステム（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ社製、フライブルク、ドイツ）を使用して実施した。この検出システムは、表面プラズモン共鳴に基づき、分子の相互作用をリアルタイムでモニターする（Malmquist and Karlsson, 1997；Rich and Myszka, 2003；Piliarek 2009）。
【０１８１】
結合反応は、表面プラズモン共鳴の変化を引き起こし、この変化を光学的に検出し、レゾナンスユニットで測定する。１０００ＲＵは、表面プラズモン共鳴角における０．１°の変化に相当し、平均タンパク質の場合、約１ｎｇ／ｍｍ２の表面濃度変化に相当する（Johnsson et al., 1991）。
【０１８２】
分析の前に、ヒト組換え血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、およびヒト組換え血液凝固第ＩＸ因子、ｒＦＩＸを、ＮＡＰ５カラムにロードして１０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ５／ｐＨ５．５と緩衝液交換し、その後サプライヤーの説明の通りにアミンカップリングキットを使用して、ＣＭ５バイオセンサーチップのデキストランマトリックスに固定化した。基準チャネルを、タンパク質の非存在下で活性化およびブロッキングした。
【０１８３】
アナライトであるＨＥＳ−ヘパリン結合体とフコイダンの結合(association)を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．００５％（容積／容積）のツイーン２０（ｐＨ７．４）中、２５℃、１０μｌ／分の流速で３分間評価した。同じ緩衝液流で１５分間解離させた。
【０１８４】
解離の後、８００ｍＭのＮａＣｌを１分間インジェクトすることにより、バイオセンサーチップを再生した。ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩおよびヒトｒＦＩＸ被覆チャネルに対するＨＥＳ−ヘパリン結合体およびフコイダンの結合を、対照チャネルに対する非特異的結合について補正した。
【０１８５】
結合定数の決定には、増加系列の各濃度のアナライトを、固定化されたヒト組換え血液凝固第ＶＩＩＩ因子にアプライした。結合特性を、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して評価し、カイネティクスタイトレーションデータをフィッティングした。カイネティクスデータ（結合定数［ｋａ］、解離定数［ｋｄ］）、ならびに親和性データ（解離平衡定数Ｋｄ）を、結合データのコンピューターに基づく評価により計算した。
【０１８６】
ｒＦＶＩＩＩに対するＨＥＳ−ヘパリン結合体の結合解析を、ＳＰＲ法を使用して実施した。ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩをセンサチップに固定化し、３０ｋＤａのＨＥＳ−ヘパリン結合体の結合および解離を、増加系列の各結合体濃度（１４〜２２７μＭ）においてＳＰＲでモニターした。図５は、一組の典型的な結合曲線を示しており、全濃度でヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩに対するＨＥＳ−ヘパリン結合体の結合を実証している。結合曲線のソフトウェアに基づく解析により、解離定数Ｋｄ ６（±０．６）１０−７Ｍを得て、ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩに対するＨＥＳ−ヘパリン結合体の強力な結合を明白に実証した。
【０１８７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性解析
ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性解析を実施して、薬物動態解析を人工系でシミュレートし、ＨＥＳ−ヘパリン結合体の結合がＦＶＩＩＩ安定性に及ぼす影響を決定した。従って、４ＩＵのヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩを、１：２名目モル比で２つの異なるＨＥＳ結合体（それぞれ、ＨＥＳ（３０ｋＤａ）結合体およびＨＥＳ（６０ｋＤａ）結合体）に混合し、４０μＬ緩衝液に溶解し、１．７ｍＬのＦＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｃｏａｃｈｒｏｍ社製 カタログ番号 ＦＤＰ０８−１０、ロット番号Ｄ８−２２）（体重２０ｇを有する血友病マウスの全血容積を模倣したもの）に添加した。３つの異なる手法（対照としてのヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、ＨＥＳ結合体（３０ｋＤａ）と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、ＨＥＳ結合体（６０ｋＤａ）と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ）を３７℃でインキュベートし、規定の時間間隔の経過後毎に試料を採取し、直ちに−８０℃で凍結した。
【０１８８】
解凍後、試料を、発色アッセイでＦＶＩＩＩ活性について分析した（Ｃｏａｃｈｒｏｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＧｍｂＨ社製、オーダー番号２２１４０２；ロット番号７２５０２−ＰＫ：６）。この発色アッセイは、ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を連続する２ステップで決定する。活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）、リン脂質、およびカルシウムをＦＶＩＩＩ試料に添加することにより、ＦＸがＦＸａに活性化され、その後、後者は添加したＦＸ−基質を切断して、分光光度法で定量化することができる発色団を産生する。適切なアッセイ条件下では、ＦＸａ形成（従って発色団（chromophor）産生）とＦＶＩＩＩ濃度とは線形関係にある。
【０１８９】
ＦＶＩＩＩ欠乏血漿および３７℃でのインキュベーションは、上述のように白血病マウスモデルを模倣する。その後、血漿試料を、発色アッセイ試験を使用してＦＶＩＩＩ：Ｃ活性について分析した。その結果生じたデータを、シグマプロット計算ソフトウェアを使用して半減期に変換した。ＨＥＳ結合体を有しないヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩの相対半減期（％で）をＨＥＳ結合体（６０ｋＤａ）と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩと直接比較すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血漿半減期は１．４倍延長されたことが示された。ＨＥＳ結合体（３０ｋＤａ）を有する複合体は、１．３５倍の半減期延長を示し、非共有結合でＦＶＩＩＩと結合したＨＥＳ結合体両方のｉｎ ｖｉｔｒｏでの半減期延長効果を明白に示した（図６を参照）。
【０１９０】
血友病マウスにおける薬物動態解析
血友病マウスにおける薬物動態学解析を以下のように実施した：
体重が２０〜２５ｇの雄雌混合１２週齢Ｃ５７ ＢＬ／６ ＦＶＩＩＩノックアウトマウスをこの解析に使用した。
【０１９１】
以下のＦＶＩＩＩ異型を下記のように調製及び試験するものとした：
対照としてのヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、６０ｋＤａまたは３０ｋＤａのＨＥＳ−ヘパリン結合体と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、および陰性対照としての緩衝液。ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩを、１：２名目モル比でＨＥＳ−ヘパリン結合体と複合体化させ、無菌ろ過し、ＨＥＳ−ヘパリン結合体を有しない対照ヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ、および陰性対照緩衝液も同様に無菌ろ過した。
【０１９２】
４ＩＵのＦＶＩＩＩを含有する４０μＬ（約２００ＩＵ／ｋｇに相当）を、単回投与として尾静脈から血友病マウスに注射した。注射前、注射後、および投与後規定の間隔で試料を採取した（１サンプリング時および物質当たり５匹のマウスの群で）。ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を、Ｃｏａｃｈｒｏｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＧｍｂＨ社、ウィーン、オーストリアから市販されている発色アッセイを使用して決定し、これらの結果からＦＶＩＩＩの薬物動態を計算し、シグマプロット計算ソフトウェア（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＧｍｂＨ社製、ドイツ）を使用して、統計的に分析して（ｔ検定を含む）半減時間（Ｔ１／２）を得た。
【０１９３】
以下のＦＶＩＩＩ異型を、血友病マウスにおけるそれらの血漿半減期について比較試験した：
対照としてのヒトＣＬ−ｒＦＶＩＩＩ（群１）、６０ｋＤａのＨＥＳ結合体と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ（群２）、３０ｋＤａのＨＥＳ結合体（と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩ（群３）、および陰性対照としての緩衝液（群４）。概して、１物質当たり２５匹の血友病マウスに、１マウス当たり合計４０μｌの注射容積中４ＩＵのｒＦＶＩＩＩを注射した。注射前、注射後および投与後の規定の間隔において１サンプリング時および物質当たり５匹から試料を採取した（例外：群３では、材料の制約のため、合計１９匹のマウスのみを使用した）。
【０１９４】
試料をＦＶＩＩＩ：Ｃ活性について試験し、上述のような薬物動態パラメーターに関してデータを分析し、結果を以下の表に要約する。
【０１９５】
【表１】
【０１９６】
直接比較すると、ＨＥＳ結合体と複合体化したヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩは両方とも、血漿半減期の延長を示す。より小型のＨＥＳ結合体（３０ｋＤａ）との複合体形成の場合、血漿半減期は１．６倍延長され、より大型のＨＥＳ結合体（６０ｋＤａ）との複合体形成は、血漿半減期の１．７倍増加をもたらした（図７を参照）。
【０１９７】
これらのデータは、ＦＶＩＩＩに非共有結合で結合させられたＨＥＳ−ヘパリン結合体の、血友病マウスモデルにおける保護的半減期延長効果を明白に示し、この効果は、より短いＨＥＳ−ヘパリン結合体（３０ｋＤａ）より、より大型のＨＥＳ−ヘパリン結合体（６０ｋＤａ）でわずかにより顕著である。
【０１９８】
陰性対照として、血友病マウスに緩衝液を注射したが、予想通りＦＶＩＩＩ活性は発色アッセイでは見出されなかった（データ非表示）。
【０１９９】
フコイダン
ヘパリンの有望な代替物を例示するために、フコイダンを、凝固第ＶＩＩＩ因子および凝固第ＩＸ因子などのヘパリン結合タンパク質に対する結合性について試験した。ＳＰＲに基づく結合実験により、フコイダンは、標的タンパク質に非共有結合で結合するための、半減期延長性ＨＥＳ−ヘパリン結合体のヘパリンを置換することができたことを示す。
【０２００】
有望なヘパリン代用物としてのフコイダンを評価するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく結合解析を、ヘパリン結合タンパク質としてのヒトＣＬ ｒＦＶＩＩＩおよびｒＦＩＸに対して実施した。図８は、それぞれｒＦＶＩＩＩ（直線）およびｒＦＩＸ（破線）に対するフコイダンの結合および解離を示しており、調べられたタンパク質に対するフコイダンの結合を明白に実証し、結果的に有望なヘパリン代用物としてその適合性が確認される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの標的タンパク質および前記標的タンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも１つの結合分子を含む複合体であって、結合親和性を有する前記分子が、少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合または非共有結合で結合している複合体。
【請求項２】
前記少なくとも１つの結合分子および前記少なくとも１つの可溶性ポリマーが結合体を形成し、前記結合体が非共有結合で前記標的タンパク質に結合している、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記タンパク質が、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子（野生型およびＢドメイン欠失）、第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子、トロンビン、アンチトロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、およびフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）などの（血漿由来または組換え）血液凝固タンパク質、エリスロポエチンなどの増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキンなどのサイトカイン、アルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）などのプロテアーゼインヒビター、インテグリン、ディスインテグリン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼおよびＡＤＡＭ／ＡＤＡＭＴＳタンパク質などのメタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アポリポタンパク質、輸送タンパク質、ホルモン、阻害または制御作用性タンパク質、ならびにそれらの誘導体および変異体から選択される、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記少なくとも１つの結合分子は、５０ｋＤ未満、好ましくは１０ｋＤ未満の分子量を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
前記結合分子が、ＲＧＤペプチドおよびＲＧＤ結合ドメインなどのペプチド部分、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびヘパリン様分子などのサッカライド部分、ヘパリン模倣分子、核酸部分、脂肪酸などの脂質部分、それらの誘導体、およびそれらの模倣体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記ヘパリン様分子が、ヘパリン−模倣ペプチドである、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記ヘパリン模倣ペプチドが、アミノ酸モチーフＸ１−Ｙ（ＳＯ３）Ｘ２−Ｙ（ＳＯ３）を含み、前記Ｙ（ＳＯ３）が硫酸化チロシンであり、Ｘ１は負電荷アミノ酸、セリン、アラニン、またはグリシンであり、Ｘ２はアスパルテート、アラニンであるかまたは存在しない、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記可溶性ポリマーが、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびデキストランから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記水溶性ポリマーの分子量が、１０〜５００ｋＤ、１０〜３００ｋＤ、２０〜２００ｋＤ、３０〜１５０ｋＤ、または１００〜３００ｋＤの範囲にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記結合体が、
− １つのみの結合分子および２つ以上のポリマー、
− ２つ以上の結合分子および１つのみのポリマー、または
− ２つ以上の結合分子および２つ以上のポリマーを含む、請求項２〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体を調製するための方法であって、
− 標的タンパク質に対する結合親和性を有する少なくとも１つの結合分子を、少なくとも１つの水溶性ポリマーに結合させて、結合体を形成するステップと、
− 前記結合体を、前記分子が結合親和性を有する前記標的タンパク質と共にインキュベートするステップとを含む方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの結合分子が、二官能性のリンカーを介して前記水溶性ポリマーに結合している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体が、ｅｘ−ｖｉｖｏで形成される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質に対して結合親和性を有する分子および水溶性ポリマーの結合体。
【請求項１５】
ヒトまたは動物の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させるための方法であって、前記標的タンパク質を、請求項１４に記載の結合体と接触させるステップを含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
薬剤の調製のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの標的タンパク質が第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子（野生型およびＢ−ドメイン欠失）から選択され、前記少なくとも１つの結合分子がヘパリン模倣分子であり、前記少なくとも１つのポリマーがヒドロキシエチルデンプンである、請求項１〜１０に記載の複合体。
【請求項１】
少なくとも１つの標的タンパク質および前記標的タンパク質に対して結合親和性を有する少なくとも１つの結合分子を含む複合体であって、結合親和性を有する前記分子が、少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合または非共有結合で結合している複合体。
【請求項２】
前記少なくとも１つの結合分子および前記少なくとも１つの可溶性ポリマーが結合体を形成し、前記結合体が非共有結合で前記標的タンパク質に結合している、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記タンパク質が、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子（野生型およびＢドメイン欠失）、第ＶＩＩ因子／第ＶＩＩａ因子、トロンビン、アンチトロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、およびフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）などの（血漿由来または組換え）血液凝固タンパク質、エリスロポエチンなどの増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキンなどのサイトカイン、アルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）などのプロテアーゼインヒビター、インテグリン、ディスインテグリン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼおよびＡＤＡＭ／ＡＤＡＭＴＳタンパク質などのメタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アポリポタンパク質、輸送タンパク質、ホルモン、阻害または制御作用性タンパク質、ならびにそれらの誘導体および変異体から選択される、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記少なくとも１つの結合分子は、５０ｋＤ未満、好ましくは１０ｋＤ未満の分子量を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
前記結合分子が、ＲＧＤペプチドおよびＲＧＤ結合ドメインなどのペプチド部分、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびヘパリン様分子などのサッカライド部分、ヘパリン模倣分子、核酸部分、脂肪酸などの脂質部分、それらの誘導体、およびそれらの模倣体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記ヘパリン様分子が、ヘパリン−模倣ペプチドである、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記ヘパリン模倣ペプチドが、アミノ酸モチーフＸ１−Ｙ（ＳＯ３）Ｘ２−Ｙ（ＳＯ３）を含み、前記Ｙ（ＳＯ３）が硫酸化チロシンであり、Ｘ１は負電荷アミノ酸、セリン、アラニン、またはグリシンであり、Ｘ２はアスパルテート、アラニンであるかまたは存在しない、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記可溶性ポリマーが、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびデキストランから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記水溶性ポリマーの分子量が、１０〜５００ｋＤ、１０〜３００ｋＤ、２０〜２００ｋＤ、３０〜１５０ｋＤ、または１００〜３００ｋＤの範囲にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記結合体が、
− １つのみの結合分子および２つ以上のポリマー、
− ２つ以上の結合分子および１つのみのポリマー、または
− ２つ以上の結合分子および２つ以上のポリマーを含む、請求項２〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体を調製するための方法であって、
− 標的タンパク質に対する結合親和性を有する少なくとも１つの結合分子を、少なくとも１つの水溶性ポリマーに結合させて、結合体を形成するステップと、
− 前記結合体を、前記分子が結合親和性を有する前記標的タンパク質と共にインキュベートするステップとを含む方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの結合分子が、二官能性のリンカーを介して前記水溶性ポリマーに結合している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複合体が、ｅｘ−ｖｉｖｏで形成される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質に対して結合親和性を有する分子および水溶性ポリマーの結合体。
【請求項１５】
ヒトまたは動物の循環中の標的タンパク質の半減期を増加させるための方法であって、前記標的タンパク質を、請求項１４に記載の結合体と接触させるステップを含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
薬剤の調製のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの標的タンパク質が第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子（野生型およびＢ−ドメイン欠失）から選択され、前記少なくとも１つの結合分子がヘパリン模倣分子であり、前記少なくとも１つのポリマーがヒドロキシエチルデンプンである、請求項１〜１０に記載の複合体。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５１９８９８（Ｐ２０１１−５１９８９８Ａ）
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０７９１９（Ｐ２０１１−５０７９１９）
【出願日】平成２１年５月６日（２００９．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５５０３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３５８８８
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５００３７６７０４）オクタファルマ・アーゲー (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月６日（２００９．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５５０３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３５８８８
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５００３７６７０４）オクタファルマ・アーゲー (4)
【Ｆターム（参考）】
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