角層の評価方法
【課題】本発明は、角層の細胞間脂質の秩序度や流動性の測定精度及び解析精度を向上させることが可能な角層の評価方法を提供することを目的とする。
【解決手段】角層の評価方法は、接着剤３を付着させた支持体１を用いて、皮膚０から角層２を剥離する工程、角層２が接着した支持体１を所定の条件下で所定時間放置する工程、支持体１上に接着した角層２をスピンプローブ剤で処理する工程及びスピンプローブ剤で処理した角層２が接着した支持体１を用いて、電子スピン共鳴スペクトルを測定する工程を少なくとも有し、スピンプローブ剤で処理する際に、スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を用いることを特徴とする。
【解決手段】角層の評価方法は、接着剤３を付着させた支持体１を用いて、皮膚０から角層２を剥離する工程、角層２が接着した支持体１を所定の条件下で所定時間放置する工程、支持体１上に接着した角層２をスピンプローブ剤で処理する工程及びスピンプローブ剤で処理した角層２が接着した支持体１を用いて、電子スピン共鳴スペクトルを測定する工程を少なくとも有し、スピンプローブ剤で処理する際に、スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を用いることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角層の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
厚さが約１０〜２０μｍであって、皮膚最外層の組織である角層は、生体内に必須な水を保持し、生体外から有害物質の侵入を防ぐ皮膚のバリアー機能の主体である。中でも、セラミド、コレステロール、脂肪酸から形成される細胞間脂質は、バリアー機構に重要な働きをしていると考えられている。細胞間脂質の構造を解析する方法としては、熱量測定（ＤＳＣ）法、Ｘ線回折法、赤外吸収法等が知られている。これらの方法を用いると、細胞間脂質の状態をおおよそ把握することができるものの、バリアー性と関連付けて解析することができない。
【０００３】
そこで、角層をスピンプローブ剤（スピンラベル剤）で処理することによって、角層の細胞間脂質の構造を評価することが可能な電子スピン共鳴（ＥＳＲ）が注目されている。ＥＳＲを用いて測定される角層の細胞間脂質の流動性は、秩序度Ｓとして表される（非特許文献１参照）。しかしながら、ｅｘ ｖｉｖｏのＥＳＲスペクトルから幾何学的手法を用いて得られる秩序度Ｓは、角層を界面活性剤で処理した場合でも変化量が微小であり、データのバラツキも大きい。
【０００４】
これに対して、皮膚角層のＥＳＲスペクトルを、コンピューターシミュレーション法を用いて解析することにより得られる秩序度Ｓ０は、細胞間脂質の流動性の微妙な変化を検出することが可能であることが報告されている（非特許文献２参照）。しかしながら、角層の細胞間脂質の秩序度Ｓ及びＳ０の測定精度の更なる向上が求められている。
【０００５】
一方、皮膚刺激性試験、経皮吸収試験、皮膚基礎科学研究等で用いられるウサギ、モルモット等の試験動物を代替する評価キットとして、培養皮膚（表皮）モデルが知られている（非特許文献３参照）。このような培養皮膚（表皮）モデルの皮膚（表皮）組織の構造を評価する方法としては、Ｈ＆Ｅ染色や免疫染色を用いる光学顕微鏡観察、透過型電子顕微鏡観察等が知られている（非特許文献４参照）。しかしながら、皮膚（表皮）組織の角層の細胞間脂質の状態をバリアー性と関連付けて解析することができない。
【非特許文献１】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１９７：１９３−２０２，２０００
【非特許文献２】ＳＰＥＣＴＲＯＣＨＩＭＩＣＡ ＡＣＴＡ ＰＡＲＴ Ａ ６３ ８１６−８２０，２００６
【非特許文献３】ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ ＪＯＵＲＮＡＬ，５６−６０，２００６−１
【非特許文献４】Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ ２８５：４６６−４７４，１９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、角層の細胞間脂質の秩序度や流動性の測定精度及び解析精度を向上させることが可能な角層の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に記載の発明は、角層の評価方法において、支持体に角層を付着させる工程と、該支持体に付着した角層をスピンプローブ剤（スピンラベル剤）で処理する工程と、該スピンプローブ剤で処理した角層が付着した支持体を用いて、電子スピン共鳴スペクトルを測定する工程を少なくとも有し、該スピンプローブ剤で処理する際に、該スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を用いることを特徴とする。
【０００８】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の角層の評価方法において、前記支持体に角層を付着させる工程は、接着剤を付着させた前記支持体を用いて、角層を剥離する工程と、該剥離された角層が付着した支持体を所定の条件下で所定時間放置する工程を有することを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の角層の評価方法において、前記接着剤は、シアノアクリレートを含有することを特徴とする。
【００１０】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記スピンプローブ剤は、炭素数が８以上２５以下の長鎖脂肪酸のドキシル誘導体であることを特徴とする。
【００１１】
請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記支持体は、石英ガラス、ガラス、アクリル樹脂及び硬質樹脂からなる群より選択される非磁性材料からなることを特徴とする。
【００１２】
請求項６に記載の発明は、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記水溶性溶媒は、炭素数が１以上４以下であり、水酸基数が１以上３以下であるアルコール類を含有することを特徴とする。
【００１３】
請求項７に記載の発明は、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記測定された電子スピン共鳴スペクトルから前記角層の細胞間脂質の秩序度を求める工程をさらに有することを特徴とする。
【００１４】
請求項８に記載の発明は、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記測定された電子スピン共鳴スペクトルを、コンピューターシミュレーション法を用いて解析する工程をさらに有することを特徴とする。
【００１５】
請求項９に記載の発明は、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記測定された電子スピン共鳴スペクトルから前記角層中の皮脂を検出する工程をさらに有することを特徴とする。
【００１６】
請求項１０に記載の発明は、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記角層は、培養により形成されていることを特徴とする。
【００１７】
請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載の角層の評価方法において、前記培養時に薬剤を添加することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、角層の細胞間脂質の秩序度や流動性の測定精度及び解析精度を向上させることが可能な角層の評価方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に、本発明を実施するための最良の形態を図面と共に説明する。
【００２０】
本発明の角層の評価方法は、支持体に角層を付着させる工程と、支持体に付着した角層をスピンプローブ剤（スピンラベル剤）で処理する工程と、スピンプローブ剤で処理した角層が付着した支持体を用いて、電子スピン共鳴スペクトルを測定する工程を少なくとも有し、スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を用いて、支持体に付着した角層を処理する。
【００２１】
スピンプローブ剤は、角層の細胞間脂質又は角層と共存する脂質中に導入してその状態を判定するために、脂質と類似した構造を有することが好ましく、例えば、細胞間脂質、皮脂に含まれる脂質、化粧品あるいは外用剤として用いられる成分としての脂質に類似した構造を有するスピンプローブ剤が挙げられる。中でも、炭素数が８〜２５の長鎖脂肪酸のドキシル誘導体が好ましい。さらに好ましくは、炭素数が１０〜１８、特に炭素数が１８の長鎖脂肪酸が適している。具体的には、１−ドキシルステアリン酸、２−ドキシルステアリン酸、３−ドキシルステアリン酸、４−ドキシルステアリン酸、５−ドキシルステアリン酸、６−ドキシルステアリン酸、７−ドキシルステアリン酸、８−ドキシルステアリン酸、９−ドキシルステアリン酸、１０−ドキシルステアリン酸、１１−ドキシルステアリン酸、１２−ドキシルステアリン酸、１３−ドキシルステアリン酸、１４−ドキシルステアリン酸、１５−ドキシルステアリン酸、１６−ドキシルステアリン酸、１７−ドキシルステアリン酸、１８−ドキシルステアリン酸等が挙げられ、目的に応じて、適宜選択することができる。
【００２２】
支持体は、石英ガラス、ガラス、アクリル樹脂及び硬質樹脂からなる群より選択される非磁性材料からなることが好ましい。中でも、ＥＳＲを測定する際に、不純物からのバックグラウンド信号が発生しないように、石英ガラス等の高純度の非磁性材料を用いることが特に好ましい。また、支持体の形状は、角層を接着することができる形状であれば、特に限定されないが、平板状であることが好ましい。これにより、角層の細胞間脂質のＥＳＲを測定する際に、角層の方向が揃いやすくなり、測定精度を向上させることができる。また、支持体の大きさは、ＥＳＲ測定装置の空洞共振器内に挿入することができれば、特に限定されない。
【００２３】
本発明において、支持体に角層を付着させる工程は、接着剤を付着させた支持体を用いて、角層を剥離する工程と、剥離された角層が付着した支持体を所定の条件下で所定時間放置する工程から構成することができる。
【００２４】
接着剤は、ＥＳＲを測定する際に、バックグラウンド信号が発生しないことが好ましい。また、支持体上に付着した角層の量が少ないと、ＥＳＲの測定精度が低下することがあるため、接着剤は、接着力が大きいことが好ましい。このような接着剤の具体例としては、シアノアクリレート系接着剤、ベンゾールガム系接着剤、エポキシ系接着剤、エマルジョン系接着剤等が挙げられる。中でも、ＥＳＲの測定精度を向上させることができることから、シアノアクリレート系接着剤が好ましい。
【００２５】
シアノアクリレートは、一般式
ＣＨ２＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＲ
で示され、一般に、瞬間接着剤として、用いられているが、水を触媒として重合するため、角層を皮膚から剥離するために用いることができる。なお、上記一般式における官能基Ｒの具体例としては、メチル基、エチル基、２−メトキシエチル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基等が挙げられる。
【００２６】
図１に、皮膚から角層を剥離する方法を示す。図１に示す方法では、支持体１に接着剤３を付着させた後に、支持体１の接着剤３を付着させた面をヒトの皮膚０に接触させる（図１（ａ）参照）ことにより、角層２を非破壊的（非侵襲的）に支持体１上に固定することができる（図１（ｂ）参照）。また、ＥＳＲを測定する際に、磁場に対する角層の設置方向を所定の方向に設定することができる。
【００２７】
本発明において、角層が付着した支持体を放置することにより、接着剤が硬化し、接着剤由来のバックグラウンド信号の発生を抑制することができ、ＥＳＲの測定精度を向上させることができる。放置条件及び放置時間は、特に限定されないが、常温常湿で１０〜１４日間であることが好ましい。常温常湿とは一般の実験室における条件であり通常１０〜３０℃、１０〜８０％ＲＨであり、好ましくは、１５〜２７℃、３０〜６０％ＲＨである。４０℃を超えた高温で長期に放置すると、脂質の酸化、蛋白質の変性等が起きるために、正しい評価ができなくなることがある。
【００２８】
図２に、５−ドキシルステアリン酸を添加したシアノアクリレートのＥＳＲスペクトルの経時変化を示す。なお、図２（ａ）〜（ｇ）は、それぞれ常温常湿で３０分、１時間、３時間、５時間、３日間、７日間及び１０日間で放置したことを表す。図２から、放置時間が短いと、硬化が不十分であるため、シアノアクリレート由来のピークが検出されるが、１０日間放置すると、このピークがほぼ消失することがわかる。
【００２９】
本発明においては、支持体上に付着した角層をスピンプローブ剤で処理する際に、スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を角層に添加することにより、図３（ａ）に示すＥＳＲスペクトルが得られ、図３（ｂ）に示すスピンプローブ剤を直接水に溶解させて用いる場合と比較して、ＥＳＲの測定精度を向上させることができる。なお、水溶性溶媒に対するスピンプローブ剤の重量比は、０．０００１〜１であることが好ましい。この重量比が１を超えると、支持体上に接着した角層の状態の変化が大きくなることがあり、０．０００１未満では、ＥＳＲの測定精度を向上させる効果が得られなくなることがある。また、スピンプローブ剤溶液中のスピンプローブ剤の濃度は、０．００００１〜０．１重量％であることが好ましい。この濃度が０．１重量％を超えると、スピンプローブ剤の添加量が多くなるため、支持体上に接着した角層の状態の変化が大きくなることがあり、０．００００１重量％未満であると、スピンプローブ剤の添加量が少なくなるため、角層をスピンプローブ剤で均一に処理することが難しくなることがある。
【００３０】
水溶性溶媒としては、炭素数が１〜４である１〜３価のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等が挙げられ、二種以上併用してもよい。中でも、炭素数が１〜４である１〜３価のアルコール類が好ましく、エタノールが特に好ましい。
【００３１】
スピンプローブ剤で処理した角層が付着した支持体を用いて、ＥＳＲを測定する際には、特に限定されないが、以下に示す試料ホルダを用いることが好ましい。
【００３２】
図４に、本発明で用いられる試料ホルダの一例を示す。なお、図４（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ正面図及び側面図を表す。図４に示す試料ホルダは、支持体１上に角層２が接着剤３を用いて接着されており、支持体１は、押さえ金具４により、支持体固定部材５に着脱自在に固定されている。
【００３３】
押さえ金具４は、支持体１を支持体固定部材５に着脱自在に固定することができるものであれば、形状、材質等は、特に限定されない。なお、図４では、押さえ金具４は、ネジ６を用いて、支持体固定部材５に固定されているが、他の手段を用いても構わない。
【００３４】
支持体固定部材５の形状は、ＥＳＲ測定装置の空洞共振器内に固定することができる構造であれば、特に限定されない。また、支持体固定部材５の材質は、特に限定されないが、テフロン（登録商標）等の樹脂が挙げられる。
【００３５】
図４においては、支持体１を支持体固定部材５に着脱自在に固定する手段として、押さえ金具４を使用しているが、他の手段を用いてもよく、例えば、図５に示すように、押さえネジ７が挙げられる。押さえネジ７の材質は、特に限定されないが、テフロン（登録商標）、アクリル樹脂、硬質プラスチック、金属（非磁性体）等が挙げられる。また、支持体１と押さえネジ７の間に、ゴム等の部材を設けて固定しても構わない。
【００３６】
なお、図５に示すように、試料ホルダには、ＥＳＲ測定装置の空洞共振器内で、支持体１の位置がわかるように、目印８を設けても構わない。
【００３７】
本発明においては、角層の細胞間脂質のＥＳＲスペクトルから細胞間脂質の秩序度Ｓを求めることができる。細胞間脂質の秩序度Ｓは、以下の式から求められる。
【００３８】
Ｓ＝［Ａ（ｐａｒａｌｌｅｌ）−Ａ（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）］／［Ａｚｚ−１／２（Ａｘｘ＋Ａｙｙ）］・（ａ０’／ａ０）
ａ０’＝（Ａｘｘ＋Ａｙｙ＋Ａｚｚ）／３
（Ａｘｘ，Ａｙｙ，Ａｚｚ）＝（６．１，６．１，３２．４）Ｇａｕｓｓ
ａ０＝［Ａ（ｐａｒａｌｌｅｌ）＋２Ａ（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）］／３
なお、Ａ（ｐａｒａｌｌｅｌ）及びＡ（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）は、図６に示すように、ＥＳＲスペクトルから求められる。このとき、細胞間脂質の秩序度Ｓは、０〜１であるが、図７に示すように、細胞間脂質の秩序度Ｓが大きい程、細胞間脂質の構造の規則性が高い。また、図８に、秩序度Ｓが異なる細胞間脂質のＥＳＲスペクトルを示す。なお、図８（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれＳが０．６、０．５７及び０．１９であることを表す。
【００３９】
本発明においては、細胞間脂質のＥＳＲスペクトルを、コンピューターシミュレーション法を用いて解析することが好ましい。これにより、細胞間脂質の秩序度Ｓの精度をさらに向上させることができる。コンピューターシミュレーション法としては、ＮＬＬＳ（Ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ ｌｅａｓｔ−ｓｑｕａｒｅｓ）フィッティングプログラムを用いる方法が挙げられる。このようにして求められる細胞間脂質の秩序度Ｓ０は、式
【００４０】
【数１】
で表され、スピンプローブ剤として、５−ドキシルステアリン酸を用いた場合、図９に示すように、ニトロキシドの回転拡散の角度の広がりが求められる。なお、γは、回転拡散対称軸とｚ軸のなす角であり、Ωは、状態数、Ｕは、内部エネルギー、ｋは、ボルツマン定数、Ｔは、絶対温度を表す。
【００４１】
本発明において、角層としては、所定の条件下で所定時間培養することにより形成されているものを用いることができる。角層を培養により形成する際には、特に限定されないが、表皮層のみを有する表皮組織及び表皮層と、セラミド、コラーゲン等の擬似真皮層を有する皮膚組織を用いることができる。なお、培養する際には、必要に応じて、ＦＢＳ（増殖因子）を添加してもよい。また、細胞間脂質の秩序度を向上させるためには、ＳＫ−Ｉｎｆｌｕｘ、ＳｙｍＲｅｐａｉｒ等の薬剤を添加することが好ましい。このとき、薬剤は、培地に添加してもよいが、角層に直接添加することが好ましい。表皮組織を用いて培養する培養表皮モデルとしては、ＬＡＢＣＹＴＥ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ社製）等が挙げられ、皮膚組織を用いて培養する培養皮膚モデルとしては、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（東洋紡社製）、Ｎｅｏｄｅｒｍ−ＥＤ（ＴＥＧＯ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）等が挙げられる。例えば、ＬＡＢＣＹＴＥ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬで用いられる表皮組織は、ヒトの正常皮膚細胞を用いて培養し、重層化したものであり、形態的にヒトの皮膚と類似した構造を有しており、基底層、有棘層、顆粒層及び角層が順次積層されている。
【００４２】
図１５に、支持体に培養した皮膚（表皮）組織を付着させる方法を示す。図１５に示す方法では、培養した皮膚（表皮）組織１１をピンセット１２で取り出し（図１５（ａ）参照）、支持体１上に載せることにより、皮膚（表皮）組織１１を支持体１上に固定することができる（図１５（ｂ）参照）。このように、皮膚（表皮）組織１１は、接着剤を使用しなくても固定することができるため、接着剤を硬化させるために放置する必要がない。なお、ＥＳＲスペクトルを測定する際には、特に限定されないが、角層２及び接着剤３の代わりに、皮膚（表皮）組織１１を用いた以外は、図４又は図５と同様の試料ホルダを用いることが好ましい。また、秩序度Ｓ及びＳ０は、前述と同様に、求めることができる。このとき、皮膚（表皮）組織１１と、皮膚（表皮）組織１１から剥離した角層の秩序度Ｓは、実験誤差範囲内で同一である。
【００４３】
本発明の角層の評価方法は、化粧料を付与した前後の角層に適用することにより、化粧料の効果、紫外線等の光照射や温度変化による角層の変化を評価することができる。
【実施例１】
【００４４】
７０ｍｍ×８ｍｍ×０．５ｍｍの石英ガラスからなる平板（支持体１）に、シアノアクリレート系の接着剤３として、アロンアルファＡ三共（三共製薬社製）を付着させたものを５枚用いて、図１に示すように、男性Ａの前腕内側部の皮膚から角層２を表層から５層採取した。次に、各角層２が接着した支持体１を常温常湿で１０日間放置した後、１ｍｇ／ｄｌの５−ドキシルステアリン酸溶液を用いて、３７℃で１時間浸漬処理した。さらに、蒸留水で洗浄して過剰な５−ドキシルステアリン酸を除去し、押さえ金具４、支持体固定部材５及びネジ６を用いて、図４に示すような試料ホルダを作製した。このとき、１ｍｇ／ｄｌの５−ドキシルステアリン酸溶液は、１ｍｇの５−ドキシルステアリン酸を１００μｌのエタノールに溶解させた後に、蒸留水で希釈することにより調製した。
【００４５】
得られた試料ホルダを、Ｘ−バンドＥＳＲ測定装置ＪＥＳ−ＲＥＩＸ型（日本電子社製）の空洞共振器内に挿入し、中心磁場３３６ｍＴ、掃引幅１５ｍＴ、掃引時間８分、磁場変調幅０．２ｍＴ、時定数１秒、倍率１．２５×１０００、マイクロ波周波数９ＧＨｚ、マイクロ波出力１０ｍＷの条件で、室温において、ＥＳＲ測定した。得られたＥＳＲスペクトルを図１０に点線で示す。なお、図１０（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ剥離した角層の表層（１層目）〜５層目であることを表す。さらに、細胞間脂質の秩序度Ｓを求めた。この結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
次に、ＮＬＬＳフィッティングプログラムを用いて、コンピューターシミュレーション法により、ＥＳＲスペクトルを解析した。その結果を図１０に実線で示す。さらに、細胞間脂質の秩序度Ｓ０を求めた。この結果を表１に示す。
【００４７】
また、各角層の表層２を採取する前後に水分蒸散計（Ｖａｐｏｍｅｔｅｒ Ｄｅｌｆｉｎ社製）で経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の測定を実施した。図１１に、Ｓ０とＴＥＷＬの関係を示す。
【００４８】
図１０の点線で示すＥＳＲスペクトルにおいて、（ａ）は、（ｂ）〜（ｅ）と比較して、矢印で示すピークが特徴的であることがわかる。そこで、男性Ｂの前腕内側部及び洗顔前後の額部から角層２の表層を採取した以外は、上記と同様にして、ＥＳＲ測定したところ、図１２に示すようなＥＳＲスペクトルが得られた。なお、図１２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ前腕内側部、洗顔前の額部及び洗顔後の額部を表す。図１２においても、図１０と同様に、矢印で示すピークが見られることから、このピークは、皮脂由来のものであると考えられる。この理由として、皮脂の多い洗顔前の額部（ｂ）において、強いピークが観察されること及び洗顔後の額部（ｃ）において、このピークが減少することが挙げられる。このため、角層の細胞間脂質の構造を評価する際には、皮脂由来のピークを有するＥＳＲスペクトルを除いて解析することが好ましい。
【００４９】
また、図１０において、（ａ）では、点線で示すＥＳＲスペクトルと実線で示すコンピューターシミュレーション法により解析したＥＳＲスペクトルの間に、皮脂由来のピークに起因すると考えられる差異が見られるが、（ｂ）〜（ｅ）では、このような差異は見られない。これは、５−ドキシルステアリン酸が細胞間脂質に良好に取り込まれているためと考えられる。
【００５０】
さらに、表１から、（ａ）は、（ｂ）〜（ｅ）と比較して、Ｓ０が小さいことがわかり、図１１から、Ｓ０が高い値で一定になる角層の中層から下層でＴＥＷＬが上昇（バリア破壊）することがわかる。なお、電子顕微鏡により、角層の表層において、脂質二重層が消失することが報告されているため（Ｐｒｏｃ １７ｔｈ ＩＦＳＣＣ，２：８６５−８８０，１９９２参照）、上記の結果を支持するものである。
【００５１】
次に、男性Ｂの前腕内側部の皮膚から角層２を表層から６層採取した以外は、上記と同様にして、Ｓ０及びＴＥＷＬを求めたところ、図１３に示す結果が得られた。一般に、角化外膜（コーニファイドエンベロープ；ＣＥ）は、角層細胞を包む蛋白性の袋であるが、これが角層中で親水性から疎水性に成熟して変化し、この疎水性のＣＥを土台として、細胞間脂質が固定されるものと考えられている。この変化は、下層からゆっくりと始まり、中層で疎水性への変化が完了することがわかっているので、中層でＳ０が上昇するのは、角層の細胞間脂質が疎水性に変化したＣＥの表面に固定され、下層と比較して運動性が低下するためであると考えられる。中層から下層においては、細胞間脂質の規則性が高くなってＳ０が上昇するが、ＣＥの表面が未熟であるために、ＣＥとの接合が不十分な細胞間脂質の運動性が高くなって、Ｓ０が低下すると考えられる。このため、角層の中層で成熟したＣＥの上に固定された細胞間脂質が皮膚のバリアー機能に寄与している可能性があると考えられる。
【００５２】
なお、Ｓ０を規定する要因は二つあると考えられる。一つ目は、脂質鎖の規則性であり、規則性が上昇すると、Ｓ０が上昇する。二つ目は、運動性であり、乾燥によって運動性が減少すると、Ｓ０が上昇する。以下に、具体例を説明する。男性Ｃの前腕内側部の皮膚から角層２を表層から３層採取した以外は、上記と同様にして、Ｓ０を求めたところ、図１４の乾燥前に示す結果が得られた。さらに、６時間凍結乾燥した後にＳ０を求めたところ、図１４の乾燥後に示す結果が得られた。なお、角層が乾燥した状態では、角層の細胞間脂質の構造が乱れているにも関わらず、運動性の低下により、Ｓ０が上昇することが報告されている（Ｊ．Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２５：１３０−１３５，２００１参照）ため、上記の結果を支持するものである。実際に、角層中では下層から上層に向かって水分は、徐々に減少すると考えられているため、水分の影響、すなわち運動性だけを考慮すれば、Ｓ０が上昇してもおかしくはない。しかしながら、角層は、最終的に剥離するために、デスモソームや細胞間脂質が酵素による分解を受け、上層に向かうに従って、細胞間脂質の構造が壊れていくと考えられる。表１に示す結果で、（ｃ）と比較して、（ｂ）のＳ０がやや低くなる傾向が認められるのは、角層中の水分量の減少による運動性の低下を、規則性の低下が上回ったためであると考えられる。
【実施例２】
【００５３】
培養表皮モデルＬＡＢＣＹＴＥ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ社製）を用いて、下記の操作をクリーンベンチ内で無菌的に行った。
（１）培地を３７℃のウォーターバスで温める。
（２）１２ウェルプレートの各ウェルに、温めた培地を１ｍｌずつ分注する。
（３）ヒトの表皮組織が入った培養カップを滅菌済みピンセットで取り出し、１２ウェルプレートの各ウェルに移す。
（４）１２ウェルプレートに蓋をして、ＣＯ２インキュベーターに入れ、翌日取り出す。
（５）各ウェルの培養カップの外側の培地を吸引除去する。
（６）各ウェルの培養カップの外側に、温めた培地を１ｍｌずつ分注して培地交換を行う。
（７）以後、（４）〜（６）の操作を繰り返す。
【００５４】
上記の操作において、７〜１３日目に、毎日、表２に示す薬剤０．１ｍｌ（無添加とは、薬剤を含まない水０．１ｍｌを意味する）を表皮組織上に添加し、１４日目に秩序度Ｓを測定した（表２（ａ）参照）。また、上記の操作において、７〜１３日目に、毎日、表２に示す薬剤０．１ｍｌを温めた培地１ｍｌに添加し、１４日目に秩序度Ｓを測定した（表２（ｂ）参照）。さらに、上記の操作において、１３日目に、表２に示す薬剤０．１ｍｌを表皮組織上に添加し、１４日目に秩序度Ｓを測定した（表２（ｃ）参照）。
【００５５】
秩序度Ｓを測定する際には、まず、７０ｍｍ×８ｍｍ×０．５ｍｍの石英ガラスからなる平板（支持体１）に、図１５に示すように、培養した表皮組織を付着させた。次に、１ｍｇ／ｄｌの５−ドキシルステアリン酸溶液を用いて、３７℃で１時間浸漬処理した。さらに、蒸留水で洗浄して過剰な５−ドキシルステアリン酸を除去し、押さえ金具４、支持体固定部材５及びネジ６を用いて、図４と同様の試料ホルダを作製した。このとき、１ｍｇ／ｄｌの５−ドキシルステアリン酸溶液は、１ｍｇの５−ドキシルステアリン酸を１００μｌのエタノールに溶解させた後に、蒸留水で希釈することにより調製した。
【００５６】
得られた試料ホルダを、Ｘ−バンドＥＳＲ測定装置ＪＥＳ−ＲＥＩＸ型（日本電子社製）の空洞共振器内に挿入し、中心磁場３３６ｍＴ、掃引幅１５ｍＴ、掃引時間８分、磁場変調幅０．２ｍＴ、時定数１秒、倍率１．２５×１０００、マイクロ波周波数９ＧＨｚ、マイクロ波出力１０ｍＷの条件で、室温において、ＥＳＲ測定した。さらに、細胞間脂質の秩序度Ｓを求めた。
【００５７】
【表２】
なお、ＳＫ−Ｉｎｆｌｕｘ（Ｄｅｇｕｓｓａ社製）の組成は、脂質成分６．０％、水ｑ．ｓ．１００％、乳酸エステル１０％、カーボマー０．３％、キサンタンガム０．３％、メチルパラベン０．３％及びプロピルパラベン０．２％からなる。また、脂質成分６．０％は、セラミド複合体１．５％、コレステロール０．５％、遊離脂肪酸３．５％及びフィトスフィンゴシン０．５％からなり、セラミド複合体１．５％は、０．００１％のセラミドＩ、０．５％のセラミドＩＩＩ、０．５％のセラミドＩＩＩＢ及び０．５％のセラミドＶＩからなる。
【実施例３】
【００５８】
７〜１３日目に、毎日、表３に示す薬剤０．１ｍｌを温めた培地１ｍｌに添加し、１４日目に秩序度Ｓを測定した以外は、実施例２と同様に、細胞間脂質の秩序度Ｓを求めた。なお、各薬剤につき、３個の試料を作製した。
【００５９】
【表３】
また、図１６に、表３の無添加（１）（図１６（ａ）参照）及び１％ＳＫ−Ｉｎｆｌｕｘ水溶液（１）（図１６（ｂ）参照）のＥＳＲスペクトルを示す。表３より、ＳＫ−Ｉｎｆｌｕｘ及びＳｙｍＲｅｐａｉｒ（Ｓｙｍｐｒｉｓｅ社製）は、細胞間脂質の秩序度Ｓを向上させる効果を有することがわかる。なお、ＳｙｍＲｅｐａｉｒは、ヘキシルデカノール、ビサボロール、セチルヒドロキシプロリンパルミタミド、ステアリン酸及びアブラナ種子ステロールからなる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】皮膚から角層を剥離する方法を示す図である。
【図２】５−ドキシルステアリン酸を添加したシアノアクリレートのＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）の経時変化を示す図である。
【図３】スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させることによる効果を説明するＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【図４】本発明で用いられる試料ホルダの一例を示す断面図であり、（ａ）は、正面図、（ｂ）は、側面図である。
【図５】本発明で用いられる試料ホルダの他の例を示す断面図であり、（ａ）は、正面図、（ｂ）は、側面図である。
【図６】Ａ（ｐａｒａｌｌｅｌ）及びＡ（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）を求める方法を説明する図である。
【図７】細胞間脂質の秩序度Ｓと細胞間脂質の構造の規則性の関係を説明する図である。
【図８】秩序度Ｓが異なる細胞間脂質のＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【図９】細胞間脂質の秩序度Ｓ０を説明する図である。
【図１０】実施例１で得られたＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【図１１】Ｓ０とＴＥＷＬの関係を示す図である。
【図１２】実施例１で得られたＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【図１３】Ｓ０とＴＥＷＬの関係を示す図である。
【図１４】乾燥前後のＳ０を示す図である。
【図１５】支持体に培養した皮膚（表皮）組織を付着させる方法を示す図である。
【図１６】実施例３で得られたＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【符号の説明】
【００６１】
０ 皮膚
１ 支持体
２ 角層
３ 接着剤
４ 押さえ金具
５ ホルダ
６ ネジ
７ 押さえネジ
８ 目印
９ 細胞間脂質
１０ スピンプローブ剤
１１ 皮膚（表皮）組織
１２ ピンセット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角層の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
厚さが約１０〜２０μｍであって、皮膚最外層の組織である角層は、生体内に必須な水を保持し、生体外から有害物質の侵入を防ぐ皮膚のバリアー機能の主体である。中でも、セラミド、コレステロール、脂肪酸から形成される細胞間脂質は、バリアー機構に重要な働きをしていると考えられている。細胞間脂質の構造を解析する方法としては、熱量測定（ＤＳＣ）法、Ｘ線回折法、赤外吸収法等が知られている。これらの方法を用いると、細胞間脂質の状態をおおよそ把握することができるものの、バリアー性と関連付けて解析することができない。
【０００３】
そこで、角層をスピンプローブ剤（スピンラベル剤）で処理することによって、角層の細胞間脂質の構造を評価することが可能な電子スピン共鳴（ＥＳＲ）が注目されている。ＥＳＲを用いて測定される角層の細胞間脂質の流動性は、秩序度Ｓとして表される（非特許文献１参照）。しかしながら、ｅｘ ｖｉｖｏのＥＳＲスペクトルから幾何学的手法を用いて得られる秩序度Ｓは、角層を界面活性剤で処理した場合でも変化量が微小であり、データのバラツキも大きい。
【０００４】
これに対して、皮膚角層のＥＳＲスペクトルを、コンピューターシミュレーション法を用いて解析することにより得られる秩序度Ｓ０は、細胞間脂質の流動性の微妙な変化を検出することが可能であることが報告されている（非特許文献２参照）。しかしながら、角層の細胞間脂質の秩序度Ｓ及びＳ０の測定精度の更なる向上が求められている。
【０００５】
一方、皮膚刺激性試験、経皮吸収試験、皮膚基礎科学研究等で用いられるウサギ、モルモット等の試験動物を代替する評価キットとして、培養皮膚（表皮）モデルが知られている（非特許文献３参照）。このような培養皮膚（表皮）モデルの皮膚（表皮）組織の構造を評価する方法としては、Ｈ＆Ｅ染色や免疫染色を用いる光学顕微鏡観察、透過型電子顕微鏡観察等が知られている（非特許文献４参照）。しかしながら、皮膚（表皮）組織の角層の細胞間脂質の状態をバリアー性と関連付けて解析することができない。
【非特許文献１】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１９７：１９３−２０２，２０００
【非特許文献２】ＳＰＥＣＴＲＯＣＨＩＭＩＣＡ ＡＣＴＡ ＰＡＲＴ Ａ ６３ ８１６−８２０，２００６
【非特許文献３】ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ ＪＯＵＲＮＡＬ，５６−６０，２００６−１
【非特許文献４】Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ ２８５：４６６−４７４，１９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、角層の細胞間脂質の秩序度や流動性の測定精度及び解析精度を向上させることが可能な角層の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に記載の発明は、角層の評価方法において、支持体に角層を付着させる工程と、該支持体に付着した角層をスピンプローブ剤（スピンラベル剤）で処理する工程と、該スピンプローブ剤で処理した角層が付着した支持体を用いて、電子スピン共鳴スペクトルを測定する工程を少なくとも有し、該スピンプローブ剤で処理する際に、該スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を用いることを特徴とする。
【０００８】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の角層の評価方法において、前記支持体に角層を付着させる工程は、接着剤を付着させた前記支持体を用いて、角層を剥離する工程と、該剥離された角層が付着した支持体を所定の条件下で所定時間放置する工程を有することを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の角層の評価方法において、前記接着剤は、シアノアクリレートを含有することを特徴とする。
【００１０】
請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記スピンプローブ剤は、炭素数が８以上２５以下の長鎖脂肪酸のドキシル誘導体であることを特徴とする。
【００１１】
請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記支持体は、石英ガラス、ガラス、アクリル樹脂及び硬質樹脂からなる群より選択される非磁性材料からなることを特徴とする。
【００１２】
請求項６に記載の発明は、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記水溶性溶媒は、炭素数が１以上４以下であり、水酸基数が１以上３以下であるアルコール類を含有することを特徴とする。
【００１３】
請求項７に記載の発明は、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記測定された電子スピン共鳴スペクトルから前記角層の細胞間脂質の秩序度を求める工程をさらに有することを特徴とする。
【００１４】
請求項８に記載の発明は、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記測定された電子スピン共鳴スペクトルを、コンピューターシミュレーション法を用いて解析する工程をさらに有することを特徴とする。
【００１５】
請求項９に記載の発明は、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記測定された電子スピン共鳴スペクトルから前記角層中の皮脂を検出する工程をさらに有することを特徴とする。
【００１６】
請求項１０に記載の発明は、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の角層の評価方法において、前記角層は、培養により形成されていることを特徴とする。
【００１７】
請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載の角層の評価方法において、前記培養時に薬剤を添加することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、角層の細胞間脂質の秩序度や流動性の測定精度及び解析精度を向上させることが可能な角層の評価方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に、本発明を実施するための最良の形態を図面と共に説明する。
【００２０】
本発明の角層の評価方法は、支持体に角層を付着させる工程と、支持体に付着した角層をスピンプローブ剤（スピンラベル剤）で処理する工程と、スピンプローブ剤で処理した角層が付着した支持体を用いて、電子スピン共鳴スペクトルを測定する工程を少なくとも有し、スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を用いて、支持体に付着した角層を処理する。
【００２１】
スピンプローブ剤は、角層の細胞間脂質又は角層と共存する脂質中に導入してその状態を判定するために、脂質と類似した構造を有することが好ましく、例えば、細胞間脂質、皮脂に含まれる脂質、化粧品あるいは外用剤として用いられる成分としての脂質に類似した構造を有するスピンプローブ剤が挙げられる。中でも、炭素数が８〜２５の長鎖脂肪酸のドキシル誘導体が好ましい。さらに好ましくは、炭素数が１０〜１８、特に炭素数が１８の長鎖脂肪酸が適している。具体的には、１−ドキシルステアリン酸、２−ドキシルステアリン酸、３−ドキシルステアリン酸、４−ドキシルステアリン酸、５−ドキシルステアリン酸、６−ドキシルステアリン酸、７−ドキシルステアリン酸、８−ドキシルステアリン酸、９−ドキシルステアリン酸、１０−ドキシルステアリン酸、１１−ドキシルステアリン酸、１２−ドキシルステアリン酸、１３−ドキシルステアリン酸、１４−ドキシルステアリン酸、１５−ドキシルステアリン酸、１６−ドキシルステアリン酸、１７−ドキシルステアリン酸、１８−ドキシルステアリン酸等が挙げられ、目的に応じて、適宜選択することができる。
【００２２】
支持体は、石英ガラス、ガラス、アクリル樹脂及び硬質樹脂からなる群より選択される非磁性材料からなることが好ましい。中でも、ＥＳＲを測定する際に、不純物からのバックグラウンド信号が発生しないように、石英ガラス等の高純度の非磁性材料を用いることが特に好ましい。また、支持体の形状は、角層を接着することができる形状であれば、特に限定されないが、平板状であることが好ましい。これにより、角層の細胞間脂質のＥＳＲを測定する際に、角層の方向が揃いやすくなり、測定精度を向上させることができる。また、支持体の大きさは、ＥＳＲ測定装置の空洞共振器内に挿入することができれば、特に限定されない。
【００２３】
本発明において、支持体に角層を付着させる工程は、接着剤を付着させた支持体を用いて、角層を剥離する工程と、剥離された角層が付着した支持体を所定の条件下で所定時間放置する工程から構成することができる。
【００２４】
接着剤は、ＥＳＲを測定する際に、バックグラウンド信号が発生しないことが好ましい。また、支持体上に付着した角層の量が少ないと、ＥＳＲの測定精度が低下することがあるため、接着剤は、接着力が大きいことが好ましい。このような接着剤の具体例としては、シアノアクリレート系接着剤、ベンゾールガム系接着剤、エポキシ系接着剤、エマルジョン系接着剤等が挙げられる。中でも、ＥＳＲの測定精度を向上させることができることから、シアノアクリレート系接着剤が好ましい。
【００２５】
シアノアクリレートは、一般式
ＣＨ２＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＲ
で示され、一般に、瞬間接着剤として、用いられているが、水を触媒として重合するため、角層を皮膚から剥離するために用いることができる。なお、上記一般式における官能基Ｒの具体例としては、メチル基、エチル基、２−メトキシエチル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基等が挙げられる。
【００２６】
図１に、皮膚から角層を剥離する方法を示す。図１に示す方法では、支持体１に接着剤３を付着させた後に、支持体１の接着剤３を付着させた面をヒトの皮膚０に接触させる（図１（ａ）参照）ことにより、角層２を非破壊的（非侵襲的）に支持体１上に固定することができる（図１（ｂ）参照）。また、ＥＳＲを測定する際に、磁場に対する角層の設置方向を所定の方向に設定することができる。
【００２７】
本発明において、角層が付着した支持体を放置することにより、接着剤が硬化し、接着剤由来のバックグラウンド信号の発生を抑制することができ、ＥＳＲの測定精度を向上させることができる。放置条件及び放置時間は、特に限定されないが、常温常湿で１０〜１４日間であることが好ましい。常温常湿とは一般の実験室における条件であり通常１０〜３０℃、１０〜８０％ＲＨであり、好ましくは、１５〜２７℃、３０〜６０％ＲＨである。４０℃を超えた高温で長期に放置すると、脂質の酸化、蛋白質の変性等が起きるために、正しい評価ができなくなることがある。
【００２８】
図２に、５−ドキシルステアリン酸を添加したシアノアクリレートのＥＳＲスペクトルの経時変化を示す。なお、図２（ａ）〜（ｇ）は、それぞれ常温常湿で３０分、１時間、３時間、５時間、３日間、７日間及び１０日間で放置したことを表す。図２から、放置時間が短いと、硬化が不十分であるため、シアノアクリレート由来のピークが検出されるが、１０日間放置すると、このピークがほぼ消失することがわかる。
【００２９】
本発明においては、支持体上に付着した角層をスピンプローブ剤で処理する際に、スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を角層に添加することにより、図３（ａ）に示すＥＳＲスペクトルが得られ、図３（ｂ）に示すスピンプローブ剤を直接水に溶解させて用いる場合と比較して、ＥＳＲの測定精度を向上させることができる。なお、水溶性溶媒に対するスピンプローブ剤の重量比は、０．０００１〜１であることが好ましい。この重量比が１を超えると、支持体上に接着した角層の状態の変化が大きくなることがあり、０．０００１未満では、ＥＳＲの測定精度を向上させる効果が得られなくなることがある。また、スピンプローブ剤溶液中のスピンプローブ剤の濃度は、０．００００１〜０．１重量％であることが好ましい。この濃度が０．１重量％を超えると、スピンプローブ剤の添加量が多くなるため、支持体上に接着した角層の状態の変化が大きくなることがあり、０．００００１重量％未満であると、スピンプローブ剤の添加量が少なくなるため、角層をスピンプローブ剤で均一に処理することが難しくなることがある。
【００３０】
水溶性溶媒としては、炭素数が１〜４である１〜３価のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等が挙げられ、二種以上併用してもよい。中でも、炭素数が１〜４である１〜３価のアルコール類が好ましく、エタノールが特に好ましい。
【００３１】
スピンプローブ剤で処理した角層が付着した支持体を用いて、ＥＳＲを測定する際には、特に限定されないが、以下に示す試料ホルダを用いることが好ましい。
【００３２】
図４に、本発明で用いられる試料ホルダの一例を示す。なお、図４（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ正面図及び側面図を表す。図４に示す試料ホルダは、支持体１上に角層２が接着剤３を用いて接着されており、支持体１は、押さえ金具４により、支持体固定部材５に着脱自在に固定されている。
【００３３】
押さえ金具４は、支持体１を支持体固定部材５に着脱自在に固定することができるものであれば、形状、材質等は、特に限定されない。なお、図４では、押さえ金具４は、ネジ６を用いて、支持体固定部材５に固定されているが、他の手段を用いても構わない。
【００３４】
支持体固定部材５の形状は、ＥＳＲ測定装置の空洞共振器内に固定することができる構造であれば、特に限定されない。また、支持体固定部材５の材質は、特に限定されないが、テフロン（登録商標）等の樹脂が挙げられる。
【００３５】
図４においては、支持体１を支持体固定部材５に着脱自在に固定する手段として、押さえ金具４を使用しているが、他の手段を用いてもよく、例えば、図５に示すように、押さえネジ７が挙げられる。押さえネジ７の材質は、特に限定されないが、テフロン（登録商標）、アクリル樹脂、硬質プラスチック、金属（非磁性体）等が挙げられる。また、支持体１と押さえネジ７の間に、ゴム等の部材を設けて固定しても構わない。
【００３６】
なお、図５に示すように、試料ホルダには、ＥＳＲ測定装置の空洞共振器内で、支持体１の位置がわかるように、目印８を設けても構わない。
【００３７】
本発明においては、角層の細胞間脂質のＥＳＲスペクトルから細胞間脂質の秩序度Ｓを求めることができる。細胞間脂質の秩序度Ｓは、以下の式から求められる。
【００３８】
Ｓ＝［Ａ（ｐａｒａｌｌｅｌ）−Ａ（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）］／［Ａｚｚ−１／２（Ａｘｘ＋Ａｙｙ）］・（ａ０’／ａ０）
ａ０’＝（Ａｘｘ＋Ａｙｙ＋Ａｚｚ）／３
（Ａｘｘ，Ａｙｙ，Ａｚｚ）＝（６．１，６．１，３２．４）Ｇａｕｓｓ
ａ０＝［Ａ（ｐａｒａｌｌｅｌ）＋２Ａ（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）］／３
なお、Ａ（ｐａｒａｌｌｅｌ）及びＡ（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）は、図６に示すように、ＥＳＲスペクトルから求められる。このとき、細胞間脂質の秩序度Ｓは、０〜１であるが、図７に示すように、細胞間脂質の秩序度Ｓが大きい程、細胞間脂質の構造の規則性が高い。また、図８に、秩序度Ｓが異なる細胞間脂質のＥＳＲスペクトルを示す。なお、図８（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれＳが０．６、０．５７及び０．１９であることを表す。
【００３９】
本発明においては、細胞間脂質のＥＳＲスペクトルを、コンピューターシミュレーション法を用いて解析することが好ましい。これにより、細胞間脂質の秩序度Ｓの精度をさらに向上させることができる。コンピューターシミュレーション法としては、ＮＬＬＳ（Ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ ｌｅａｓｔ−ｓｑｕａｒｅｓ）フィッティングプログラムを用いる方法が挙げられる。このようにして求められる細胞間脂質の秩序度Ｓ０は、式
【００４０】
【数１】
で表され、スピンプローブ剤として、５−ドキシルステアリン酸を用いた場合、図９に示すように、ニトロキシドの回転拡散の角度の広がりが求められる。なお、γは、回転拡散対称軸とｚ軸のなす角であり、Ωは、状態数、Ｕは、内部エネルギー、ｋは、ボルツマン定数、Ｔは、絶対温度を表す。
【００４１】
本発明において、角層としては、所定の条件下で所定時間培養することにより形成されているものを用いることができる。角層を培養により形成する際には、特に限定されないが、表皮層のみを有する表皮組織及び表皮層と、セラミド、コラーゲン等の擬似真皮層を有する皮膚組織を用いることができる。なお、培養する際には、必要に応じて、ＦＢＳ（増殖因子）を添加してもよい。また、細胞間脂質の秩序度を向上させるためには、ＳＫ−Ｉｎｆｌｕｘ、ＳｙｍＲｅｐａｉｒ等の薬剤を添加することが好ましい。このとき、薬剤は、培地に添加してもよいが、角層に直接添加することが好ましい。表皮組織を用いて培養する培養表皮モデルとしては、ＬＡＢＣＹＴＥ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ社製）等が挙げられ、皮膚組織を用いて培養する培養皮膚モデルとしては、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（東洋紡社製）、Ｎｅｏｄｅｒｍ−ＥＤ（ＴＥＧＯ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）等が挙げられる。例えば、ＬＡＢＣＹＴＥ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬで用いられる表皮組織は、ヒトの正常皮膚細胞を用いて培養し、重層化したものであり、形態的にヒトの皮膚と類似した構造を有しており、基底層、有棘層、顆粒層及び角層が順次積層されている。
【００４２】
図１５に、支持体に培養した皮膚（表皮）組織を付着させる方法を示す。図１５に示す方法では、培養した皮膚（表皮）組織１１をピンセット１２で取り出し（図１５（ａ）参照）、支持体１上に載せることにより、皮膚（表皮）組織１１を支持体１上に固定することができる（図１５（ｂ）参照）。このように、皮膚（表皮）組織１１は、接着剤を使用しなくても固定することができるため、接着剤を硬化させるために放置する必要がない。なお、ＥＳＲスペクトルを測定する際には、特に限定されないが、角層２及び接着剤３の代わりに、皮膚（表皮）組織１１を用いた以外は、図４又は図５と同様の試料ホルダを用いることが好ましい。また、秩序度Ｓ及びＳ０は、前述と同様に、求めることができる。このとき、皮膚（表皮）組織１１と、皮膚（表皮）組織１１から剥離した角層の秩序度Ｓは、実験誤差範囲内で同一である。
【００４３】
本発明の角層の評価方法は、化粧料を付与した前後の角層に適用することにより、化粧料の効果、紫外線等の光照射や温度変化による角層の変化を評価することができる。
【実施例１】
【００４４】
７０ｍｍ×８ｍｍ×０．５ｍｍの石英ガラスからなる平板（支持体１）に、シアノアクリレート系の接着剤３として、アロンアルファＡ三共（三共製薬社製）を付着させたものを５枚用いて、図１に示すように、男性Ａの前腕内側部の皮膚から角層２を表層から５層採取した。次に、各角層２が接着した支持体１を常温常湿で１０日間放置した後、１ｍｇ／ｄｌの５−ドキシルステアリン酸溶液を用いて、３７℃で１時間浸漬処理した。さらに、蒸留水で洗浄して過剰な５−ドキシルステアリン酸を除去し、押さえ金具４、支持体固定部材５及びネジ６を用いて、図４に示すような試料ホルダを作製した。このとき、１ｍｇ／ｄｌの５−ドキシルステアリン酸溶液は、１ｍｇの５−ドキシルステアリン酸を１００μｌのエタノールに溶解させた後に、蒸留水で希釈することにより調製した。
【００４５】
得られた試料ホルダを、Ｘ−バンドＥＳＲ測定装置ＪＥＳ−ＲＥＩＸ型（日本電子社製）の空洞共振器内に挿入し、中心磁場３３６ｍＴ、掃引幅１５ｍＴ、掃引時間８分、磁場変調幅０．２ｍＴ、時定数１秒、倍率１．２５×１０００、マイクロ波周波数９ＧＨｚ、マイクロ波出力１０ｍＷの条件で、室温において、ＥＳＲ測定した。得られたＥＳＲスペクトルを図１０に点線で示す。なお、図１０（ａ）〜（ｅ）は、それぞれ剥離した角層の表層（１層目）〜５層目であることを表す。さらに、細胞間脂質の秩序度Ｓを求めた。この結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
次に、ＮＬＬＳフィッティングプログラムを用いて、コンピューターシミュレーション法により、ＥＳＲスペクトルを解析した。その結果を図１０に実線で示す。さらに、細胞間脂質の秩序度Ｓ０を求めた。この結果を表１に示す。
【００４７】
また、各角層の表層２を採取する前後に水分蒸散計（Ｖａｐｏｍｅｔｅｒ Ｄｅｌｆｉｎ社製）で経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の測定を実施した。図１１に、Ｓ０とＴＥＷＬの関係を示す。
【００４８】
図１０の点線で示すＥＳＲスペクトルにおいて、（ａ）は、（ｂ）〜（ｅ）と比較して、矢印で示すピークが特徴的であることがわかる。そこで、男性Ｂの前腕内側部及び洗顔前後の額部から角層２の表層を採取した以外は、上記と同様にして、ＥＳＲ測定したところ、図１２に示すようなＥＳＲスペクトルが得られた。なお、図１２（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ前腕内側部、洗顔前の額部及び洗顔後の額部を表す。図１２においても、図１０と同様に、矢印で示すピークが見られることから、このピークは、皮脂由来のものであると考えられる。この理由として、皮脂の多い洗顔前の額部（ｂ）において、強いピークが観察されること及び洗顔後の額部（ｃ）において、このピークが減少することが挙げられる。このため、角層の細胞間脂質の構造を評価する際には、皮脂由来のピークを有するＥＳＲスペクトルを除いて解析することが好ましい。
【００４９】
また、図１０において、（ａ）では、点線で示すＥＳＲスペクトルと実線で示すコンピューターシミュレーション法により解析したＥＳＲスペクトルの間に、皮脂由来のピークに起因すると考えられる差異が見られるが、（ｂ）〜（ｅ）では、このような差異は見られない。これは、５−ドキシルステアリン酸が細胞間脂質に良好に取り込まれているためと考えられる。
【００５０】
さらに、表１から、（ａ）は、（ｂ）〜（ｅ）と比較して、Ｓ０が小さいことがわかり、図１１から、Ｓ０が高い値で一定になる角層の中層から下層でＴＥＷＬが上昇（バリア破壊）することがわかる。なお、電子顕微鏡により、角層の表層において、脂質二重層が消失することが報告されているため（Ｐｒｏｃ １７ｔｈ ＩＦＳＣＣ，２：８６５−８８０，１９９２参照）、上記の結果を支持するものである。
【００５１】
次に、男性Ｂの前腕内側部の皮膚から角層２を表層から６層採取した以外は、上記と同様にして、Ｓ０及びＴＥＷＬを求めたところ、図１３に示す結果が得られた。一般に、角化外膜（コーニファイドエンベロープ；ＣＥ）は、角層細胞を包む蛋白性の袋であるが、これが角層中で親水性から疎水性に成熟して変化し、この疎水性のＣＥを土台として、細胞間脂質が固定されるものと考えられている。この変化は、下層からゆっくりと始まり、中層で疎水性への変化が完了することがわかっているので、中層でＳ０が上昇するのは、角層の細胞間脂質が疎水性に変化したＣＥの表面に固定され、下層と比較して運動性が低下するためであると考えられる。中層から下層においては、細胞間脂質の規則性が高くなってＳ０が上昇するが、ＣＥの表面が未熟であるために、ＣＥとの接合が不十分な細胞間脂質の運動性が高くなって、Ｓ０が低下すると考えられる。このため、角層の中層で成熟したＣＥの上に固定された細胞間脂質が皮膚のバリアー機能に寄与している可能性があると考えられる。
【００５２】
なお、Ｓ０を規定する要因は二つあると考えられる。一つ目は、脂質鎖の規則性であり、規則性が上昇すると、Ｓ０が上昇する。二つ目は、運動性であり、乾燥によって運動性が減少すると、Ｓ０が上昇する。以下に、具体例を説明する。男性Ｃの前腕内側部の皮膚から角層２を表層から３層採取した以外は、上記と同様にして、Ｓ０を求めたところ、図１４の乾燥前に示す結果が得られた。さらに、６時間凍結乾燥した後にＳ０を求めたところ、図１４の乾燥後に示す結果が得られた。なお、角層が乾燥した状態では、角層の細胞間脂質の構造が乱れているにも関わらず、運動性の低下により、Ｓ０が上昇することが報告されている（Ｊ．Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２５：１３０−１３５，２００１参照）ため、上記の結果を支持するものである。実際に、角層中では下層から上層に向かって水分は、徐々に減少すると考えられているため、水分の影響、すなわち運動性だけを考慮すれば、Ｓ０が上昇してもおかしくはない。しかしながら、角層は、最終的に剥離するために、デスモソームや細胞間脂質が酵素による分解を受け、上層に向かうに従って、細胞間脂質の構造が壊れていくと考えられる。表１に示す結果で、（ｃ）と比較して、（ｂ）のＳ０がやや低くなる傾向が認められるのは、角層中の水分量の減少による運動性の低下を、規則性の低下が上回ったためであると考えられる。
【実施例２】
【００５３】
培養表皮モデルＬＡＢＣＹＴＥ ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ社製）を用いて、下記の操作をクリーンベンチ内で無菌的に行った。
（１）培地を３７℃のウォーターバスで温める。
（２）１２ウェルプレートの各ウェルに、温めた培地を１ｍｌずつ分注する。
（３）ヒトの表皮組織が入った培養カップを滅菌済みピンセットで取り出し、１２ウェルプレートの各ウェルに移す。
（４）１２ウェルプレートに蓋をして、ＣＯ２インキュベーターに入れ、翌日取り出す。
（５）各ウェルの培養カップの外側の培地を吸引除去する。
（６）各ウェルの培養カップの外側に、温めた培地を１ｍｌずつ分注して培地交換を行う。
（７）以後、（４）〜（６）の操作を繰り返す。
【００５４】
上記の操作において、７〜１３日目に、毎日、表２に示す薬剤０．１ｍｌ（無添加とは、薬剤を含まない水０．１ｍｌを意味する）を表皮組織上に添加し、１４日目に秩序度Ｓを測定した（表２（ａ）参照）。また、上記の操作において、７〜１３日目に、毎日、表２に示す薬剤０．１ｍｌを温めた培地１ｍｌに添加し、１４日目に秩序度Ｓを測定した（表２（ｂ）参照）。さらに、上記の操作において、１３日目に、表２に示す薬剤０．１ｍｌを表皮組織上に添加し、１４日目に秩序度Ｓを測定した（表２（ｃ）参照）。
【００５５】
秩序度Ｓを測定する際には、まず、７０ｍｍ×８ｍｍ×０．５ｍｍの石英ガラスからなる平板（支持体１）に、図１５に示すように、培養した表皮組織を付着させた。次に、１ｍｇ／ｄｌの５−ドキシルステアリン酸溶液を用いて、３７℃で１時間浸漬処理した。さらに、蒸留水で洗浄して過剰な５−ドキシルステアリン酸を除去し、押さえ金具４、支持体固定部材５及びネジ６を用いて、図４と同様の試料ホルダを作製した。このとき、１ｍｇ／ｄｌの５−ドキシルステアリン酸溶液は、１ｍｇの５−ドキシルステアリン酸を１００μｌのエタノールに溶解させた後に、蒸留水で希釈することにより調製した。
【００５６】
得られた試料ホルダを、Ｘ−バンドＥＳＲ測定装置ＪＥＳ−ＲＥＩＸ型（日本電子社製）の空洞共振器内に挿入し、中心磁場３３６ｍＴ、掃引幅１５ｍＴ、掃引時間８分、磁場変調幅０．２ｍＴ、時定数１秒、倍率１．２５×１０００、マイクロ波周波数９ＧＨｚ、マイクロ波出力１０ｍＷの条件で、室温において、ＥＳＲ測定した。さらに、細胞間脂質の秩序度Ｓを求めた。
【００５７】
【表２】
なお、ＳＫ−Ｉｎｆｌｕｘ（Ｄｅｇｕｓｓａ社製）の組成は、脂質成分６．０％、水ｑ．ｓ．１００％、乳酸エステル１０％、カーボマー０．３％、キサンタンガム０．３％、メチルパラベン０．３％及びプロピルパラベン０．２％からなる。また、脂質成分６．０％は、セラミド複合体１．５％、コレステロール０．５％、遊離脂肪酸３．５％及びフィトスフィンゴシン０．５％からなり、セラミド複合体１．５％は、０．００１％のセラミドＩ、０．５％のセラミドＩＩＩ、０．５％のセラミドＩＩＩＢ及び０．５％のセラミドＶＩからなる。
【実施例３】
【００５８】
７〜１３日目に、毎日、表３に示す薬剤０．１ｍｌを温めた培地１ｍｌに添加し、１４日目に秩序度Ｓを測定した以外は、実施例２と同様に、細胞間脂質の秩序度Ｓを求めた。なお、各薬剤につき、３個の試料を作製した。
【００５９】
【表３】
また、図１６に、表３の無添加（１）（図１６（ａ）参照）及び１％ＳＫ−Ｉｎｆｌｕｘ水溶液（１）（図１６（ｂ）参照）のＥＳＲスペクトルを示す。表３より、ＳＫ−Ｉｎｆｌｕｘ及びＳｙｍＲｅｐａｉｒ（Ｓｙｍｐｒｉｓｅ社製）は、細胞間脂質の秩序度Ｓを向上させる効果を有することがわかる。なお、ＳｙｍＲｅｐａｉｒは、ヘキシルデカノール、ビサボロール、セチルヒドロキシプロリンパルミタミド、ステアリン酸及びアブラナ種子ステロールからなる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】皮膚から角層を剥離する方法を示す図である。
【図２】５−ドキシルステアリン酸を添加したシアノアクリレートのＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）の経時変化を示す図である。
【図３】スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させることによる効果を説明するＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【図４】本発明で用いられる試料ホルダの一例を示す断面図であり、（ａ）は、正面図、（ｂ）は、側面図である。
【図５】本発明で用いられる試料ホルダの他の例を示す断面図であり、（ａ）は、正面図、（ｂ）は、側面図である。
【図６】Ａ（ｐａｒａｌｌｅｌ）及びＡ（ｐｅｒｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ）を求める方法を説明する図である。
【図７】細胞間脂質の秩序度Ｓと細胞間脂質の構造の規則性の関係を説明する図である。
【図８】秩序度Ｓが異なる細胞間脂質のＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【図９】細胞間脂質の秩序度Ｓ０を説明する図である。
【図１０】実施例１で得られたＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【図１１】Ｓ０とＴＥＷＬの関係を示す図である。
【図１２】実施例１で得られたＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【図１３】Ｓ０とＴＥＷＬの関係を示す図である。
【図１４】乾燥前後のＳ０を示す図である。
【図１５】支持体に培養した皮膚（表皮）組織を付着させる方法を示す図である。
【図１６】実施例３で得られたＥＳＲスペクトル（中心磁場３３６ｍＴ）を示す図である。
【符号の説明】
【００６１】
０ 皮膚
１ 支持体
２ 角層
３ 接着剤
４ 押さえ金具
５ ホルダ
６ ネジ
７ 押さえネジ
８ 目印
９ 細胞間脂質
１０ スピンプローブ剤
１１ 皮膚（表皮）組織
１２ ピンセット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体に、角層を付着させる工程と、
該支持体に付着した角層をスピンプローブ剤（スピンラベル剤）で処理する工程と、
該スピンプローブ剤で処理した角層が付着した支持体を用いて、電子スピン共鳴スペクトルを測定する工程を少なくとも有し、
該スピンプローブ剤で処理する際に、該スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を用いることを特徴とする角層の評価方法。
【請求項２】
前記支持体に、角層を付着させる工程は、
接着剤を付着させた前記支持体を用いて、角層を剥離する工程と、
該剥離された角層が付着した支持体を所定の条件下で所定時間放置する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の角層の評価方法。
【請求項３】
前記接着剤は、シアノアクリレートを含有することを特徴とする請求項２に記載の角層の評価方法。
【請求項４】
前記スピンプローブ剤は、炭素数が８以上２５以下の長鎖脂肪酸のドキシル誘導体であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項５】
前記支持体は、石英ガラス、ガラス、アクリル樹脂及び硬質樹脂からなる群より選択される非磁性材料からなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項６】
前記水溶性溶媒は、炭素数が１以上４以下であり、水酸基数が１以上３以下であるアルコール類を含有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項７】
前記測定された電子スピン共鳴スペクトルから前記角層の細胞間脂質の秩序度（流動性）を求める工程をさらに有することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項８】
前記測定された電子スピン共鳴スペクトルを、コンピューターシミュレーション法を用いて解析する工程をさらに有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項９】
前記測定された電子スピン共鳴スペクトルから皮脂を検出する工程をさらに有することを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項１０】
前記角層は、培養により形成されていることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項１１】
前記培養時に薬剤を添加することを特徴とする請求項１０に記載の角層の評価方法。
【請求項１】
支持体に、角層を付着させる工程と、
該支持体に付着した角層をスピンプローブ剤（スピンラベル剤）で処理する工程と、
該スピンプローブ剤で処理した角層が付着した支持体を用いて、電子スピン共鳴スペクトルを測定する工程を少なくとも有し、
該スピンプローブ剤で処理する際に、該スピンプローブ剤を水溶性溶媒に溶解させた後に水で希釈することにより得られる溶液を用いることを特徴とする角層の評価方法。
【請求項２】
前記支持体に、角層を付着させる工程は、
接着剤を付着させた前記支持体を用いて、角層を剥離する工程と、
該剥離された角層が付着した支持体を所定の条件下で所定時間放置する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の角層の評価方法。
【請求項３】
前記接着剤は、シアノアクリレートを含有することを特徴とする請求項２に記載の角層の評価方法。
【請求項４】
前記スピンプローブ剤は、炭素数が８以上２５以下の長鎖脂肪酸のドキシル誘導体であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項５】
前記支持体は、石英ガラス、ガラス、アクリル樹脂及び硬質樹脂からなる群より選択される非磁性材料からなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項６】
前記水溶性溶媒は、炭素数が１以上４以下であり、水酸基数が１以上３以下であるアルコール類を含有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項７】
前記測定された電子スピン共鳴スペクトルから前記角層の細胞間脂質の秩序度（流動性）を求める工程をさらに有することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項８】
前記測定された電子スピン共鳴スペクトルを、コンピューターシミュレーション法を用いて解析する工程をさらに有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項９】
前記測定された電子スピン共鳴スペクトルから皮脂を検出する工程をさらに有することを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項１０】
前記角層は、培養により形成されていることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の角層の評価方法。
【請求項１１】
前記培養時に薬剤を添加することを特徴とする請求項１０に記載の角層の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００８−３９７６１（Ｐ２００８−３９７６１Ａ）
【公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８９７４３（Ｐ２００７−８９７４３）
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年１１月１４日 ＳＥＳＴ２００６実行委員会発行の「第４５回電子スピンサイエンス学会年会（ＳＥＳＴ２００６）講演要旨集」に発表
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年１１月１４日 ＳＥＳＴ２００６実行委員会発行の「第４５回電子スピンサイエンス学会年会（ＳＥＳＴ２００６）講演要旨集」に発表
【出願人】（０００００１９５９）株式会社資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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