試料中の異常核酸の増幅を確実にするための方法
本発明は、一般には、試料中の核酸全体の一部として存在する異常核酸の増幅を確実するための方法に関する。ある実施形態においては、本発明の方法は、被験体からの試料を提供すること（ここで、試料は核酸全体を含み、全体の一部は異常核酸である）、核酸全体を試料から抽出すること、抽出された核酸を定量的に分析し、それによって試料中の増幅可能な核酸の量を決定すること、および増幅反応のために核酸を、試料中の異常核酸の増幅を確実にする量で提供すること（ここで、提供される量は定量的分析工程の結果に基づく）を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この発明は２０１０年１月１９日に出願された米国特許出願番号第１２／６８９，５９７号（本出願）の利益、およびこの出願への優先権を主張する。上記出願の全容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般には、試料中の核酸全体の一部として存在する異常核酸の増幅を確実にするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
体液からの核酸分子を変異の存在について分析することに依存するアッセイが開発されており、このことは、がんなどのある種の疾患の早期診断を導いている。しかし、典型的な体液試料においては、大多数の核酸は分解しており、目的とする変異を含む任意の変化した核酸は、体液試料中の核酸総量に対して少量（例えば１％未満）で存在する。その結果、確率的なサンプリングバイアスによる、少量の異常核酸の検出の失敗を生じる。
【０００４】
試料中の異常核酸を検出するために、典型的には増幅反応が行われる。しかし、増幅反応の確率的な性質のために、試料中に少量存在する分子集団が見落とされることが多い。実際、希少核酸が最初の数回の増幅で増幅されない場合、この希少事象が確実に検出されるという可能性はますます低くなる。したがって、結果として得られる偏った増幅後の核酸集団は、それが得られた試料の真の状態を表していない。
【０００５】
確率的なサンプリングを回避するために、異常核酸が増幅後の集団中に確実に示されるように、増幅反応に供給する必要がある核酸分子の適切な量を決定するための増幅前プロトコルが企てられている。一般に、体液からの核酸は精製され、試料中の核酸全体の濃度が測定される。試料中の核酸の総濃度を使用して、異常核酸が増幅前および増幅後の反応物中に示される可能性を増加させるのに必要な核酸量を決定する。
【０００６】
試料調製物からの予想核酸収量を決定する標準方法は、試料中に存在する核酸の総量を（例えば、光学濃度測定に基づいて）決定することである。しかし、この方法は、核酸全体を示すものであって、少量の異常核酸にアクセスするのに重要である増幅可能な集団を示すものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、一般には、試料からの異常核酸の増幅を確実にするための方法に関する。本発明の方法は、試料中の核酸の総量を単に決定することを越えて、増幅に使用可能な核酸のベースラインを提供する。これらの方法は、核酸集団すべて（例えば、正常および変異）が、使用可能な量の核酸生成物を生成する増幅を使用したアッセイにおいて、確実に示されるようにする。本質的に、本発明の方法は、確率的なサンプリングバイアスを伴わずに、不均一試料における異常核酸の小集団の検出を可能にする。
【０００８】
本発明の方法は、後続の増幅反応のために増幅可能な核酸のベースラインを提供する。本発明の方法を使用すると、試料中に存在する核酸種の多様性の分析に十分な核酸集団が確保される。好ましい方法は、調査（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）のために代表的な量の異常核酸が存在することを確実にするのに必要とされる、核酸のベースライン量を確立するための、試料中の増幅可能な核酸全体の定量化を含む。増幅可能な核酸を定量化するのに任意の公知の方法を使用することができる。しかし、好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、特に定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。
【０００９】
本発明の方法は、核酸を試料から抽出することを含むことができる。核酸抽出は、当該技術分野で公知の任意の方法によって達成される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）を参照されたい。ある実施形態においては、試料をアフィニティーカラムに適用し、それによって核酸をカラムに結合させ、次いで結合核酸をカラムから溶出させる。
【００１０】
ある実施形態においては、試料は細胞外循環核酸分子を含む。別の実施形態においては、核酸は部分的に分解している。別の実施形態においては、異常核酸は、試料中の核酸分子の総量の約１％以下で存在する。一般に、異常核酸分子は、がんなどの疾患を示す。例示的ながんとしては、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、頚部、乳房、胃、卵巣、食道、頸、頭部、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、がん腫、肉腫、グリア芽細胞腫、多発性骨髄腫、血液または胃腸が挙げられる。
【００１１】
本発明の別の一態様は、確率的なバイアスを伴わずに異常核酸の検出を可能にする量の核酸全体を含む試料の分析を含む、被験体における疾患を診断するための方法を提供する。この方法は、さらに、核酸全体を試料から抽出すること、抽出核酸を定量的に分析すること、およびそれによって疾患の徴候の存在の更なる分析に有用である試料中の増幅可能な核酸分子の量を決定することを含むことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細）
本発明は、一般には、代表的な増幅可能な核酸集団を不均一試料から提供するための方法に関する。本発明の方法は、不均一な核酸集団を含む任意の試料に適用可能である。
【００１３】
本発明の方法は、異常または変異配列の検出に特に有用である。異常または変異核酸は、がんまたは前がん細胞を示す。本発明は、任意の特定のタイプの異形の検出に限定されず、変異は、付加変異、付加−欠失変異、欠失変異、フレームシフト変異、ミスセンス変異、点変異、読み枠シフト変異、復帰変異、転位変異および転換変異、並びにマイクロサテライト変化を含めて、多数の形態を取り得る。
【００１４】
ある実施形態においては、異常核酸分子は、がんなどの疾患を示す。がんを示す変異は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｈｅｓｋｅｔｈ（Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９５）を参照されたい。
【００１５】
試料は、ほ乳動物試料、例えば、ヒトの組織または体液とすることができる。本発明のある方法は、さらに、核酸全体を試料から抽出することを含む。一般に、核酸は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０−２８１，１９８２）によって記述されたものなどの種々の技術によって生物試料から抽出される。ある実施形態においては、抽出は、試料をアフィニティーカラムに導入し、それによって試料中の核酸分子をカラムに結合させること、および結合した核酸分子をカラムから溶出させ、それによって核酸分子を試料から抽出することを含む。例えば、Ａｂｄａｌｌａ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ １０，ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ａｓ Ｌｉｔｔｌｅ ａｓ ２５μＬ ｏｆ Ｕｒｉｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ｎｏｒｇｅｎ’ｓ Ｕｒｉｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を参照されたい。
【００１６】
抽出後、核酸を定量化して、増幅可能な核酸の量を決定する。増幅可能な核酸を定量化するのに任意の公知の方法を使用することができる。しかし、好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特に定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）である。ＱＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術であり、標的核酸分子を増幅し、同時に定量化するのに使用される。ＱＰＣＲは、ＤＮＡ試料中の特定の配列の検出と定量化（絶対的複製数としての、またはＤＮＡ入力もしくは追加の正規化遺伝子に対して正規化されたときの相対量としての）の両方を可能にする。手順は、ポリメラーゼ連鎖反応の一般的原理に従い、更なる特徴として、増幅されたＤＮＡは、各増幅サイクル後にリアルタイムで、反応物中に蓄積される際に定量化される。ＱＰＣＲは、例えば、Ｋｕｒｎｉｔ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，０３３，８５４号）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，５６７，５８３号および同５，３４８，８５３号）、Ｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２（３），２００６）、Ｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９８６−９９４，１９９６）、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６）、ならびにＨｉｇｕｃｈｉ（米国特許第６，１７１，７８５号および同５，９９４，０５６号）に記載されている。これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００１７】
２つの一般的定量化方法、（１）二本鎖ＤＮＡに挿入される蛍光色素の使用、および（２）相補ＤＮＡとハイブリッドを形成すると蛍光を発する修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブがある。第１の方法では、ＤＮＡ結合色素は、ＰＣＲにおいて二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡすべてに結合し、色素の蛍光を発する。したがって、ＰＣＲ中のＤＮＡ産物の増加は、蛍光強度を増加させ、これは、各サイクルで測定され、したがってＤＮＡ濃度を定量化することができる。反応物は標準ＰＣＲ反応物と同様に調製されるが、蛍光（ｄｓ）ＤＮＡ色素が追加される。反応は、サーマルサイクラー中で実施され、各サイクル後に、蛍光レベルが検出器によって測定される。色素は、（ｄｓ）ＤＮＡ（すなわち、ＰＣＲ産物）に結合したときにのみ蛍光を発する。標準希釈物を基準にして、ＰＣＲにおける（ｄｓ）ＤＮＡ濃度を測定することができる。他のリアルタイムＰＣＲ法と同様に、得られた値は、それに付随する絶対的単位をもたない。測定されたＤＮＡ／ＲＮＡ試料と標準希釈物との比較から、標準に対する試料の割合または比が得られ、異なる組織または実験条件間の相対比較が可能になる。定量化の精度を保証するために、安定的に発現される遺伝子に対して標的遺伝子の発現を正規化することが重要である。これによって、試料間の核酸の量または質における起こり得る差を補正することができる。
【００１８】
第２の方法は、配列特異的ＲＮＡまたはＤＮＡベースのプローブを使用して、プローブ配列を含むＤＮＡのみを定量化する。したがって、レポータープローブを使用すると特異性が顕著に増加し、多少の非特異的ＤＮＡ増幅の存在下でも定量化することができる。そのため、遺伝子すべてが類似した効率で増幅されるのであれば、多重増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）、すなわち、同じ反応において異なる色の標識を有する特異的プローブを使用することによって幾つかの遺伝子をアッセイすることができる。
【００１９】
この方法は、一般に、蛍光レポーター（例えば、６−カルボキシフルオレセイン）をプローブの一端に有し、蛍光のクエンチャー（例えば、６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）を反対側の端に有する、ＤＮＡベースのプローブを用いて実施される。レポーターがクエンチャーに近接すると、その蛍光の検出が妨げられる。ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）の５’から３’方向のエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが破壊されると、レポーター−クエンチャーの近接が打破され、したがって蛍光発光がクエンチされずに検出される。各ＰＣＲサイクルにおいてレポータープローブによって標的とされる産物が増加すると、プローブの破壊とレポーターの遊離によって、蛍光が比例して増加することになる。反応物は標準ＰＣＲ反応物と同様に調製されるが、レポータープローブが追加される。反応が開始すると、ＰＣＲのアニーリング段階中にプローブとプライマーの両方がＤＮＡ標的にアニールされる。新しいＤＮＡ鎖の重合はプライマーから出発し、ポリメラーゼがプローブに達すると、その５’−３’−エキソヌクレアーゼがプローブを分解し、蛍光レポーターをクエンチャーから物理的に分離させて、蛍光が増加する。蛍光はリアルタイムＰＣＲサーマルサイクラー中で検出され、測定され、産物の指数関数的増加に対応する蛍光の幾何的増加を利用して、各反応における閾値サイクルを決定する。
【００２０】
反応の指数関数期中、存在するＤＮＡの相対濃度は、蛍光をサイクル数に対して対数スケールでプロットすることによって決定される（したがって、指数関数的に増加する量は直線になる）。バックグラウンドを超える蛍光の検出のための閾値が決定される。試料の蛍光が閾値を超えるサイクルは、サイクル閾値Ｃｔと呼ばれる。ＤＮＡ量は指数関数期中はサイクルごとに倍加するので、ＤＮＡ相対量を計算することができる。例えば、Ｃｔが他よりも３サイクル早い試料は、２３＝８倍テンプレートが多い。核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の量は、次いで、既知量の核酸の連続希釈物（例えば、非希釈物、１：４、１：１６、１：６４）のリアルタイムＰＣＲによって作成される標準曲線と結果とを比較することによって決定される。
【００２１】
ある実施形態においては、ＱＰＣＲ反応は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用する二重フルオロフォア手法、例えば、２種類のオリゴヌクレオチドプローブがアンプリコンにアニールするＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲハイブリダイゼーションプローブを含む（例えば、米国特許第６，１７４，６７０号参照）。オリゴヌクレオチドは、効率的なエネルギー移動に適合した距離で分離されたフルオロフォアと、頭−尾配向（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）でハイブリダイズするように設計される。核酸に結合したとき、または伸長産物に組み込まれたときに、シグナルを発するように構成された標識オリゴヌクレオチドの別の例としては、ＳＣＯＲＰＩＯＮＳプローブ（例えば、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８０４−８０７，１９９９および米国特許第６，３２６，１４５号）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（またはＡＭＰＬＩＦＬＯＵＲ）プライマー（例えば、Ｎａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５１６−２５２１，１９９７および米国特許第６，１１７，６３５号）、およびＬＵＸプライマーとＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＥＡＣＯＮＳプローブ（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８，１９９６および米国特許第５，９８９，８２３号）が挙げられる。
【００２２】
別の実施形態においては、ＱＰＣＲ反応は、蛍光Ｔａｑｍａｎ法、および蛍光をリアルタイムで測定可能な機器（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用する。Ｔａｑｍａｎ反応は、２つの異なる蛍光色素で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。一方の色素はレポーター色素（６−カルボキシフルオレセイン）であり、他方はクエンチング色素（６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）である。プローブがインタクトであると、蛍光エネルギー移動が起こり、レポーター色素蛍光発光がクエンチング色素によって吸収される。ＰＣＲサイクルの伸長期中に、蛍光ハイブリダイゼーションプローブが、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性によって切断される。プローブが切断されると、レポーター色素発光はもはやクエンチング色素に効率的に移動されず、その結果として、レポーター色素蛍光発光スペクトルが増加する。
【００２３】
本発明の方法は、試料中の核酸の総量を単に決定することを越えて、増幅に使用可能な核酸のベースラインを提供する。これらの方法は、核酸集団すべて（例えば、正常および変異）が、使用可能な量の核酸生成物を生成する増幅を使用したアッセイにおいて確実に示されるようにする。
【００２４】
ＱＰＣＲ反応は、後続の増幅反応のために増幅可能な核酸のベースラインを提供する。本発明の方法は、試料中の核酸の総量を単に決定することを越えて、増幅に使用可能な核酸のベースラインを提供する。これらの方法は、核酸集団すべて（例えば、正常および変異）が、使用可能な量の核酸生成物を生成する増幅を使用したアッセイにおいて確実に示されるようにする。
【００２５】
増幅とは、核酸配列の追加のコピーの産生を指し、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応または当該技術分野で周知である別の技術を使用して実施される（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．［１９９５］）。増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖高次構造多型、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、および制限酵素断片長多型など、核酸分子を増幅する当該技術分野で公知の任意の増幅反応とすることができる。
【００２６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、クローン化または精製なしに、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させる、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ（参照により本明細書に援用される米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号）による方法を指す。標的配列を増幅するプロセスは、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に過剰のオリゴヌクレオチドプライマーを導入することと、それに続くＤＮＡポリメラーゼの存在下での正確な順序のサーマルサイクリングを含む。プライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。
【００２７】
増幅を行うために、混合物を変性させ、次いでプライマーを標的分子内のその相補配列にアニールさせる。アニーリング後、新しい相補鎖対を形成するように、プライマーをポリメラーゼで伸長させる。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の工程を多数回繰り返して（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長は１サイクルを構成し、多数のサイクルが存在し得る）、所望の標的配列の高濃度の増幅セグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対位置によって決まり、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。
【００２８】
ＰＣＲでは、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の単一コピーを、幾つかの異なる方法（例えば、染色、標識プローブとのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの組み込み、続くアビジン−酵素結合体検出；増幅セグメントへのｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の組み込み）によって検出することができるレベルに増幅することができる。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列を、適切なプライマー分子セットを用いて増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセス自体によって作製される増幅セグメントは、それ自体が、後続のＰＣＲ増幅の効率的テンプレートである。増幅された標的配列を使用して、組換えベクターに挿入されるＤＮＡ（例えば、遺伝子）のセグメントを得ることができる。
【００２９】
別の増幅方法および戦略を利用して、生物学的液体中の核酸を検出することもできる。例えば、別の一手法は、ＰＣＲとリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を組み合わせたものである。ＰＣＲは、ＬＣＲよりも速く増幅し、開始するのに標的ＤＮＡの少数のコピーしか必要としないので、ＬＣＲの前の第一工程としてＰＣＲを使用することができる。次いで、増幅産物をＬＣＲまたはリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）に対立遺伝子特異的様式で使用し、変異が存在したか否かを示すことができる。別の一手法は、増幅と対立遺伝子特異的識別の両方にＬＣＲまたはＬＤＲを使用する。後者の反応は、線形増幅をもたらす点で有利である。したがって、増幅産物の量は、もともとの検体中の標的ＤＮＡ量を反映し、したがって定量化することができる。
【００３０】
ＬＣＲは、標的配列の全長に相補的である隣接オリゴヌクレオチドの対を利用する（Ｂａｒａｎｙ Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ８８：１８９−１９３；Ｂａｒａｎｙ Ｆ．（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：５−１６）。標的配列がプライマー配列の接合部においてプライマーに完全に相補的である場合、ＤＮＡリガーゼは、隣接３’と５’の末端ヌクレオチドを連結し、結合配列を形成する。熱安定性ＤＮＡリガーゼをサーマルサイクリングに使用すると、結合配列が逐次的に増幅される。オリゴヌクレオチドの接合部における一塩基ミスマッチは、ライゲーションおよび増幅を妨げる。したがって、プロセスは対立遺伝子特異的である。変異体に特異的な３’ヌクレオチドを有する別のオリゴヌクレオチドセットは、変異対立遺伝子を特定する別の反応に使用される。一連の標準条件を使用して、任意の公知の部位における可能な変異すべてを検出することができる。ＬＣＲは、典型的には、ゲノムＤＮＡの両方の鎖を、４種類のプライマーとのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの標的として利用し、その産物は繰り返しのサーマルサイクリングによって指数関数的に増加する。
【００３１】
この反応の一変形は、標的ＤＮＡに相補的であり、ＤＮＡリガーゼによって同様に連結される、２個の隣接するオリゴヌクレオチドを利用するリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）である（Ｂａｒａｎｙ Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ８８：１８９−１９３）。複数のサーマルサイクリング後、産物は線形様式で増幅される。したがって、ＬＤＲの産物量は標的ＤＮＡ量を反映する。プライマーの適切な標識化によって、増幅産物を対立遺伝子特異的様式で検出することができ、もともとの標的ＤＮＡ量を定量化することができる。このタイプの反応の一利点は、自動制御で定量化できることである（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＰＮＡＳ８７：８９２３−８９２７）。
【００３２】
本発明の方法は、さらに、異常核酸分子を検出することを含むこともできる。検出は、当該技術分野で公知の任意の方法によることができる。例示的一方法は、異常核酸分子に結合する光学的に標識されたプローブ、例えば蛍光標識プローブを使用すること、次いで異常核酸分子に結合した標識プローブを検出することを含む。かかる方法は当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｌａｐｉｄｕｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，６７０，３２５号および同５，９２８，８７０号）およびＳｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，２０３，９９３号および同６，２１４，５５８号）を参照されたい。
【００３３】
（参照による援用）
特許、特許出願、特許公報、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照およびこれらの引用が、本開示を通してなされた。かかる文書はすべて、参考としてその全体が本明細書に援用される。
【００３４】
（均等物）
本発明は、その精神や本質的特徴から逸脱することなく、他の具体的形態で具現化することができる。したがって、上記実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するものではなく、あらゆる点で例示とみなすべきである。したがって、本発明の範囲は、上記明細書の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、したがって特許請求の範囲の意味および均等範囲に属する変更はすべて、本発明の範囲に包含されるものとする。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この発明は２０１０年１月１９日に出願された米国特許出願番号第１２／６８９，５９７号（本出願）の利益、およびこの出願への優先権を主張する。上記出願の全容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般には、試料中の核酸全体の一部として存在する異常核酸の増幅を確実にするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
体液からの核酸分子を変異の存在について分析することに依存するアッセイが開発されており、このことは、がんなどのある種の疾患の早期診断を導いている。しかし、典型的な体液試料においては、大多数の核酸は分解しており、目的とする変異を含む任意の変化した核酸は、体液試料中の核酸総量に対して少量（例えば１％未満）で存在する。その結果、確率的なサンプリングバイアスによる、少量の異常核酸の検出の失敗を生じる。
【０００４】
試料中の異常核酸を検出するために、典型的には増幅反応が行われる。しかし、増幅反応の確率的な性質のために、試料中に少量存在する分子集団が見落とされることが多い。実際、希少核酸が最初の数回の増幅で増幅されない場合、この希少事象が確実に検出されるという可能性はますます低くなる。したがって、結果として得られる偏った増幅後の核酸集団は、それが得られた試料の真の状態を表していない。
【０００５】
確率的なサンプリングを回避するために、異常核酸が増幅後の集団中に確実に示されるように、増幅反応に供給する必要がある核酸分子の適切な量を決定するための増幅前プロトコルが企てられている。一般に、体液からの核酸は精製され、試料中の核酸全体の濃度が測定される。試料中の核酸の総濃度を使用して、異常核酸が増幅前および増幅後の反応物中に示される可能性を増加させるのに必要な核酸量を決定する。
【０００６】
試料調製物からの予想核酸収量を決定する標準方法は、試料中に存在する核酸の総量を（例えば、光学濃度測定に基づいて）決定することである。しかし、この方法は、核酸全体を示すものであって、少量の異常核酸にアクセスするのに重要である増幅可能な集団を示すものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、一般には、試料からの異常核酸の増幅を確実にするための方法に関する。本発明の方法は、試料中の核酸の総量を単に決定することを越えて、増幅に使用可能な核酸のベースラインを提供する。これらの方法は、核酸集団すべて（例えば、正常および変異）が、使用可能な量の核酸生成物を生成する増幅を使用したアッセイにおいて、確実に示されるようにする。本質的に、本発明の方法は、確率的なサンプリングバイアスを伴わずに、不均一試料における異常核酸の小集団の検出を可能にする。
【０００８】
本発明の方法は、後続の増幅反応のために増幅可能な核酸のベースラインを提供する。本発明の方法を使用すると、試料中に存在する核酸種の多様性の分析に十分な核酸集団が確保される。好ましい方法は、調査（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）のために代表的な量の異常核酸が存在することを確実にするのに必要とされる、核酸のベースライン量を確立するための、試料中の増幅可能な核酸全体の定量化を含む。増幅可能な核酸を定量化するのに任意の公知の方法を使用することができる。しかし、好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、特に定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。
【０００９】
本発明の方法は、核酸を試料から抽出することを含むことができる。核酸抽出は、当該技術分野で公知の任意の方法によって達成される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０−２８１（１９８２）を参照されたい。ある実施形態においては、試料をアフィニティーカラムに適用し、それによって核酸をカラムに結合させ、次いで結合核酸をカラムから溶出させる。
【００１０】
ある実施形態においては、試料は細胞外循環核酸分子を含む。別の実施形態においては、核酸は部分的に分解している。別の実施形態においては、異常核酸は、試料中の核酸分子の総量の約１％以下で存在する。一般に、異常核酸分子は、がんなどの疾患を示す。例示的ながんとしては、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、頚部、乳房、胃、卵巣、食道、頸、頭部、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、がん腫、肉腫、グリア芽細胞腫、多発性骨髄腫、血液または胃腸が挙げられる。
【００１１】
本発明の別の一態様は、確率的なバイアスを伴わずに異常核酸の検出を可能にする量の核酸全体を含む試料の分析を含む、被験体における疾患を診断するための方法を提供する。この方法は、さらに、核酸全体を試料から抽出すること、抽出核酸を定量的に分析すること、およびそれによって疾患の徴候の存在の更なる分析に有用である試料中の増幅可能な核酸分子の量を決定することを含むことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細）
本発明は、一般には、代表的な増幅可能な核酸集団を不均一試料から提供するための方法に関する。本発明の方法は、不均一な核酸集団を含む任意の試料に適用可能である。
【００１３】
本発明の方法は、異常または変異配列の検出に特に有用である。異常または変異核酸は、がんまたは前がん細胞を示す。本発明は、任意の特定のタイプの異形の検出に限定されず、変異は、付加変異、付加−欠失変異、欠失変異、フレームシフト変異、ミスセンス変異、点変異、読み枠シフト変異、復帰変異、転位変異および転換変異、並びにマイクロサテライト変化を含めて、多数の形態を取り得る。
【００１４】
ある実施形態においては、異常核酸分子は、がんなどの疾患を示す。がんを示す変異は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｈｅｓｋｅｔｈ（Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９５）を参照されたい。
【００１５】
試料は、ほ乳動物試料、例えば、ヒトの組織または体液とすることができる。本発明のある方法は、さらに、核酸全体を試料から抽出することを含む。一般に、核酸は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＭａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０−２８１，１９８２）によって記述されたものなどの種々の技術によって生物試料から抽出される。ある実施形態においては、抽出は、試料をアフィニティーカラムに導入し、それによって試料中の核酸分子をカラムに結合させること、および結合した核酸分子をカラムから溶出させ、それによって核酸分子を試料から抽出することを含む。例えば、Ａｂｄａｌｌａ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ １０，ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ａｓ Ｌｉｔｔｌｅ ａｓ ２５μＬ ｏｆ Ｕｒｉｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ｎｏｒｇｅｎ’ｓ Ｕｒｉｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を参照されたい。
【００１６】
抽出後、核酸を定量化して、増幅可能な核酸の量を決定する。増幅可能な核酸を定量化するのに任意の公知の方法を使用することができる。しかし、好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特に定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）である。ＱＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術であり、標的核酸分子を増幅し、同時に定量化するのに使用される。ＱＰＣＲは、ＤＮＡ試料中の特定の配列の検出と定量化（絶対的複製数としての、またはＤＮＡ入力もしくは追加の正規化遺伝子に対して正規化されたときの相対量としての）の両方を可能にする。手順は、ポリメラーゼ連鎖反応の一般的原理に従い、更なる特徴として、増幅されたＤＮＡは、各増幅サイクル後にリアルタイムで、反応物中に蓄積される際に定量化される。ＱＰＣＲは、例えば、Ｋｕｒｎｉｔ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，０３３，８５４号）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，５６７，５８３号および同５，３４８，８５３号）、Ｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２（３），２００６）、Ｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９８６−９９４，１９９６）、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６）、ならびにＨｉｇｕｃｈｉ（米国特許第６，１７１，７８５号および同５，９９４，０５６号）に記載されている。これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００１７】
２つの一般的定量化方法、（１）二本鎖ＤＮＡに挿入される蛍光色素の使用、および（２）相補ＤＮＡとハイブリッドを形成すると蛍光を発する修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブがある。第１の方法では、ＤＮＡ結合色素は、ＰＣＲにおいて二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡすべてに結合し、色素の蛍光を発する。したがって、ＰＣＲ中のＤＮＡ産物の増加は、蛍光強度を増加させ、これは、各サイクルで測定され、したがってＤＮＡ濃度を定量化することができる。反応物は標準ＰＣＲ反応物と同様に調製されるが、蛍光（ｄｓ）ＤＮＡ色素が追加される。反応は、サーマルサイクラー中で実施され、各サイクル後に、蛍光レベルが検出器によって測定される。色素は、（ｄｓ）ＤＮＡ（すなわち、ＰＣＲ産物）に結合したときにのみ蛍光を発する。標準希釈物を基準にして、ＰＣＲにおける（ｄｓ）ＤＮＡ濃度を測定することができる。他のリアルタイムＰＣＲ法と同様に、得られた値は、それに付随する絶対的単位をもたない。測定されたＤＮＡ／ＲＮＡ試料と標準希釈物との比較から、標準に対する試料の割合または比が得られ、異なる組織または実験条件間の相対比較が可能になる。定量化の精度を保証するために、安定的に発現される遺伝子に対して標的遺伝子の発現を正規化することが重要である。これによって、試料間の核酸の量または質における起こり得る差を補正することができる。
【００１８】
第２の方法は、配列特異的ＲＮＡまたはＤＮＡベースのプローブを使用して、プローブ配列を含むＤＮＡのみを定量化する。したがって、レポータープローブを使用すると特異性が顕著に増加し、多少の非特異的ＤＮＡ増幅の存在下でも定量化することができる。そのため、遺伝子すべてが類似した効率で増幅されるのであれば、多重増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）、すなわち、同じ反応において異なる色の標識を有する特異的プローブを使用することによって幾つかの遺伝子をアッセイすることができる。
【００１９】
この方法は、一般に、蛍光レポーター（例えば、６−カルボキシフルオレセイン）をプローブの一端に有し、蛍光のクエンチャー（例えば、６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）を反対側の端に有する、ＤＮＡベースのプローブを用いて実施される。レポーターがクエンチャーに近接すると、その蛍光の検出が妨げられる。ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）の５’から３’方向のエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが破壊されると、レポーター−クエンチャーの近接が打破され、したがって蛍光発光がクエンチされずに検出される。各ＰＣＲサイクルにおいてレポータープローブによって標的とされる産物が増加すると、プローブの破壊とレポーターの遊離によって、蛍光が比例して増加することになる。反応物は標準ＰＣＲ反応物と同様に調製されるが、レポータープローブが追加される。反応が開始すると、ＰＣＲのアニーリング段階中にプローブとプライマーの両方がＤＮＡ標的にアニールされる。新しいＤＮＡ鎖の重合はプライマーから出発し、ポリメラーゼがプローブに達すると、その５’−３’−エキソヌクレアーゼがプローブを分解し、蛍光レポーターをクエンチャーから物理的に分離させて、蛍光が増加する。蛍光はリアルタイムＰＣＲサーマルサイクラー中で検出され、測定され、産物の指数関数的増加に対応する蛍光の幾何的増加を利用して、各反応における閾値サイクルを決定する。
【００２０】
反応の指数関数期中、存在するＤＮＡの相対濃度は、蛍光をサイクル数に対して対数スケールでプロットすることによって決定される（したがって、指数関数的に増加する量は直線になる）。バックグラウンドを超える蛍光の検出のための閾値が決定される。試料の蛍光が閾値を超えるサイクルは、サイクル閾値Ｃｔと呼ばれる。ＤＮＡ量は指数関数期中はサイクルごとに倍加するので、ＤＮＡ相対量を計算することができる。例えば、Ｃｔが他よりも３サイクル早い試料は、２３＝８倍テンプレートが多い。核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の量は、次いで、既知量の核酸の連続希釈物（例えば、非希釈物、１：４、１：１６、１：６４）のリアルタイムＰＣＲによって作成される標準曲線と結果とを比較することによって決定される。
【００２１】
ある実施形態においては、ＱＰＣＲ反応は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用する二重フルオロフォア手法、例えば、２種類のオリゴヌクレオチドプローブがアンプリコンにアニールするＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲハイブリダイゼーションプローブを含む（例えば、米国特許第６，１７４，６７０号参照）。オリゴヌクレオチドは、効率的なエネルギー移動に適合した距離で分離されたフルオロフォアと、頭−尾配向（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）でハイブリダイズするように設計される。核酸に結合したとき、または伸長産物に組み込まれたときに、シグナルを発するように構成された標識オリゴヌクレオチドの別の例としては、ＳＣＯＲＰＩＯＮＳプローブ（例えば、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８０４−８０７，１９９９および米国特許第６，３２６，１４５号）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（またはＡＭＰＬＩＦＬＯＵＲ）プライマー（例えば、Ｎａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５１６−２５２１，１９９７および米国特許第６，１１７，６３５号）、およびＬＵＸプライマーとＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＥＡＣＯＮＳプローブ（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８，１９９６および米国特許第５，９８９，８２３号）が挙げられる。
【００２２】
別の実施形態においては、ＱＰＣＲ反応は、蛍光Ｔａｑｍａｎ法、および蛍光をリアルタイムで測定可能な機器（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用する。Ｔａｑｍａｎ反応は、２つの異なる蛍光色素で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。一方の色素はレポーター色素（６−カルボキシフルオレセイン）であり、他方はクエンチング色素（６−カルボキシ−テトラメチルローダミン）である。プローブがインタクトであると、蛍光エネルギー移動が起こり、レポーター色素蛍光発光がクエンチング色素によって吸収される。ＰＣＲサイクルの伸長期中に、蛍光ハイブリダイゼーションプローブが、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’核酸分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性によって切断される。プローブが切断されると、レポーター色素発光はもはやクエンチング色素に効率的に移動されず、その結果として、レポーター色素蛍光発光スペクトルが増加する。
【００２３】
本発明の方法は、試料中の核酸の総量を単に決定することを越えて、増幅に使用可能な核酸のベースラインを提供する。これらの方法は、核酸集団すべて（例えば、正常および変異）が、使用可能な量の核酸生成物を生成する増幅を使用したアッセイにおいて確実に示されるようにする。
【００２４】
ＱＰＣＲ反応は、後続の増幅反応のために増幅可能な核酸のベースラインを提供する。本発明の方法は、試料中の核酸の総量を単に決定することを越えて、増幅に使用可能な核酸のベースラインを提供する。これらの方法は、核酸集団すべて（例えば、正常および変異）が、使用可能な量の核酸生成物を生成する増幅を使用したアッセイにおいて確実に示されるようにする。
【００２５】
増幅とは、核酸配列の追加のコピーの産生を指し、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応または当該技術分野で周知である別の技術を使用して実施される（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．［１９９５］）。増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ連鎖反応−一本鎖高次構造多型、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、および制限酵素断片長多型など、核酸分子を増幅する当該技術分野で公知の任意の増幅反応とすることができる。
【００２６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、クローン化または精製なしに、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させる、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ（参照により本明細書に援用される米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号）による方法を指す。標的配列を増幅するプロセスは、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に過剰のオリゴヌクレオチドプライマーを導入することと、それに続くＤＮＡポリメラーゼの存在下での正確な順序のサーマルサイクリングを含む。プライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。
【００２７】
増幅を行うために、混合物を変性させ、次いでプライマーを標的分子内のその相補配列にアニールさせる。アニーリング後、新しい相補鎖対を形成するように、プライマーをポリメラーゼで伸長させる。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の工程を多数回繰り返して（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長は１サイクルを構成し、多数のサイクルが存在し得る）、所望の標的配列の高濃度の増幅セグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対位置によって決まり、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。
【００２８】
ＰＣＲでは、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の単一コピーを、幾つかの異なる方法（例えば、染色、標識プローブとのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの組み込み、続くアビジン−酵素結合体検出；増幅セグメントへのｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の組み込み）によって検出することができるレベルに増幅することができる。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列を、適切なプライマー分子セットを用いて増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセス自体によって作製される増幅セグメントは、それ自体が、後続のＰＣＲ増幅の効率的テンプレートである。増幅された標的配列を使用して、組換えベクターに挿入されるＤＮＡ（例えば、遺伝子）のセグメントを得ることができる。
【００２９】
別の増幅方法および戦略を利用して、生物学的液体中の核酸を検出することもできる。例えば、別の一手法は、ＰＣＲとリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を組み合わせたものである。ＰＣＲは、ＬＣＲよりも速く増幅し、開始するのに標的ＤＮＡの少数のコピーしか必要としないので、ＬＣＲの前の第一工程としてＰＣＲを使用することができる。次いで、増幅産物をＬＣＲまたはリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）に対立遺伝子特異的様式で使用し、変異が存在したか否かを示すことができる。別の一手法は、増幅と対立遺伝子特異的識別の両方にＬＣＲまたはＬＤＲを使用する。後者の反応は、線形増幅をもたらす点で有利である。したがって、増幅産物の量は、もともとの検体中の標的ＤＮＡ量を反映し、したがって定量化することができる。
【００３０】
ＬＣＲは、標的配列の全長に相補的である隣接オリゴヌクレオチドの対を利用する（Ｂａｒａｎｙ Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ８８：１８９−１９３；Ｂａｒａｎｙ Ｆ．（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：５−１６）。標的配列がプライマー配列の接合部においてプライマーに完全に相補的である場合、ＤＮＡリガーゼは、隣接３’と５’の末端ヌクレオチドを連結し、結合配列を形成する。熱安定性ＤＮＡリガーゼをサーマルサイクリングに使用すると、結合配列が逐次的に増幅される。オリゴヌクレオチドの接合部における一塩基ミスマッチは、ライゲーションおよび増幅を妨げる。したがって、プロセスは対立遺伝子特異的である。変異体に特異的な３’ヌクレオチドを有する別のオリゴヌクレオチドセットは、変異対立遺伝子を特定する別の反応に使用される。一連の標準条件を使用して、任意の公知の部位における可能な変異すべてを検出することができる。ＬＣＲは、典型的には、ゲノムＤＮＡの両方の鎖を、４種類のプライマーとのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの標的として利用し、その産物は繰り返しのサーマルサイクリングによって指数関数的に増加する。
【００３１】
この反応の一変形は、標的ＤＮＡに相補的であり、ＤＮＡリガーゼによって同様に連結される、２個の隣接するオリゴヌクレオチドを利用するリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）である（Ｂａｒａｎｙ Ｆ．（１９９１）ＰＮＡＳ８８：１８９−１９３）。複数のサーマルサイクリング後、産物は線形様式で増幅される。したがって、ＬＤＲの産物量は標的ＤＮＡ量を反映する。プライマーの適切な標識化によって、増幅産物を対立遺伝子特異的様式で検出することができ、もともとの標的ＤＮＡ量を定量化することができる。このタイプの反応の一利点は、自動制御で定量化できることである（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＰＮＡＳ８７：８９２３−８９２７）。
【００３２】
本発明の方法は、さらに、異常核酸分子を検出することを含むこともできる。検出は、当該技術分野で公知の任意の方法によることができる。例示的一方法は、異常核酸分子に結合する光学的に標識されたプローブ、例えば蛍光標識プローブを使用すること、次いで異常核酸分子に結合した標識プローブを検出することを含む。かかる方法は当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｌａｐｉｄｕｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，６７０，３２５号および同５，９２８，８７０号）およびＳｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，２０３，９９３号および同６，２１４，５５８号）を参照されたい。
【００３３】
（参照による援用）
特許、特許出願、特許公報、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照およびこれらの引用が、本開示を通してなされた。かかる文書はすべて、参考としてその全体が本明細書に援用される。
【００３４】
（均等物）
本発明は、その精神や本質的特徴から逸脱することなく、他の具体的形態で具現化することができる。したがって、上記実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するものではなく、あらゆる点で例示とみなすべきである。したがって、本発明の範囲は、上記明細書の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、したがって特許請求の範囲の意味および均等範囲に属する変更はすべて、本発明の範囲に包含されるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の核酸全体の一部として存在する異常核酸の増幅を確実にするための方法であって、該方法は、
被験体からの試料を提供する工程であって、ここで該試料は核酸全体を含み、該全体の一部は異常核酸である、工程、
該核酸全体を該試料から抽出する工程、
該抽出された核酸を定量的に分析して、該試料中の増幅可能な核酸の量を決定する工程、および
増幅反応のために該増幅可能な核酸を、該試料中の該異常核酸の増幅を確実にする量で提供する工程であって、ここで該提供される量は該定量的分析工程の結果に基づく、工程
を含む、方法。
【請求項２】
定量的分析工程が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を実施する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抽出工程が、
前記試料をアフィニティーカラムに導入し、前記核酸を該カラムに結合させる工程、および
該結合した核酸を該カラムから溶出させる工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅反応を実施して、前記異常核酸を増幅する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記異常核酸を検出する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
正常核酸および前記異常核酸が無細胞循環核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記無細胞循環核酸が部分的に分解した核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記異常核酸が、前記試料中の前記核酸全体の約１％以下として存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が組織または体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記体液が、血液、血清、血漿、尿、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物および腹膜液からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記異常核酸が疾患を示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患ががんである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記がんが、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、頚部、乳房、胃、卵巣、食道、頸、頭部、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、がん腫、肉腫、グリア芽細胞腫、多発性骨髄腫、血液または胃腸からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
体液中の無細胞循環核酸全体の一部として存在する無細胞循環異常核酸の増幅を確実にするための方法であって、該方法は、
被験体からの体液を提供する工程であって、ここで該体液は無細胞循環核酸全体を含み、該全体の一部は異常核酸である、工程、
該無細胞循環核酸全体を該体液から抽出する工程、
該抽出された核酸に対して定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施して、該体液中の増幅可能な核酸の量を決定する工程、および
ポリメラーゼ連鎖反応のために該増幅可能な核酸を、該体液中の該異常核酸の増幅を確実にする量で提供する工程であって、ここで該提供される量は該定量的ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づく、工程
を含む、方法。
【請求項１６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応を実施して、前記異常核酸を増幅する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、内部ＱＰＣＲ対照の存在下で実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記異常核酸を検出する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記異常核酸が、前記体液中の前記核酸全体の分子の約１％以下として存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記体液が、血液、血清、血漿、尿、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物および腹膜液からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記無細胞循環核酸全体が部分的に分解した核酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
被験体における疾患を診断する方法であって、該方法は、
被験体からの試料を提供する工程であって、ここで該試料は核酸全体を含み、該全体の一部は疾患を示す異常核酸である、工程、
該核酸全体を該試料から抽出する工程、
該抽出された核酸を定量的に分析して、該試料中の増幅可能な核酸の絶対量を決定する工程、
増幅反応のために該増幅可能な核酸を、該試料中の該異常核酸の増幅を確実にする量で提供する工程であって、ここで該提供される量は該定量的分析工程の結果に基づく、工程、
該増幅反応を実施する工程、および
該増幅された核酸を検出する工程であって、ここで該異常核酸の検出は該疾患の存在を示す、工程
を含む、方法。
【請求項２３】
定量的分析工程が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を実施する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
正常核酸および前記異常核酸が無細胞循環核酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料が組織または体液である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記体液が、血液、血清、血漿、尿、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物および腹膜液からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患ががんである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記がんが、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、頚部、乳房、胃、卵巣、食道、頸、頭部、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、がん腫、肉腫、グリア芽細胞腫、多発性骨髄腫、血液または胃腸からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項１】
試料中の核酸全体の一部として存在する異常核酸の増幅を確実にするための方法であって、該方法は、
被験体からの試料を提供する工程であって、ここで該試料は核酸全体を含み、該全体の一部は異常核酸である、工程、
該核酸全体を該試料から抽出する工程、
該抽出された核酸を定量的に分析して、該試料中の増幅可能な核酸の量を決定する工程、および
増幅反応のために該増幅可能な核酸を、該試料中の該異常核酸の増幅を確実にする量で提供する工程であって、ここで該提供される量は該定量的分析工程の結果に基づく、工程
を含む、方法。
【請求項２】
定量的分析工程が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を実施する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抽出工程が、
前記試料をアフィニティーカラムに導入し、前記核酸を該カラムに結合させる工程、および
該結合した核酸を該カラムから溶出させる工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅反応を実施して、前記異常核酸を増幅する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記異常核酸を検出する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
正常核酸および前記異常核酸が無細胞循環核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記無細胞循環核酸が部分的に分解した核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記異常核酸が、前記試料中の前記核酸全体の約１％以下として存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が組織または体液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記体液が、血液、血清、血漿、尿、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物および腹膜液からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記異常核酸が疾患を示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患ががんである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記がんが、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、頚部、乳房、胃、卵巣、食道、頸、頭部、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、がん腫、肉腫、グリア芽細胞腫、多発性骨髄腫、血液または胃腸からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
体液中の無細胞循環核酸全体の一部として存在する無細胞循環異常核酸の増幅を確実にするための方法であって、該方法は、
被験体からの体液を提供する工程であって、ここで該体液は無細胞循環核酸全体を含み、該全体の一部は異常核酸である、工程、
該無細胞循環核酸全体を該体液から抽出する工程、
該抽出された核酸に対して定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施して、該体液中の増幅可能な核酸の量を決定する工程、および
ポリメラーゼ連鎖反応のために該増幅可能な核酸を、該体液中の該異常核酸の増幅を確実にする量で提供する工程であって、ここで該提供される量は該定量的ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づく、工程
を含む、方法。
【請求項１６】
前記ポリメラーゼ連鎖反応を実施して、前記異常核酸を増幅する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、内部ＱＰＣＲ対照の存在下で実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記異常核酸を検出する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記異常核酸が、前記体液中の前記核酸全体の分子の約１％以下として存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記体液が、血液、血清、血漿、尿、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物および腹膜液からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記無細胞循環核酸全体が部分的に分解した核酸を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
被験体における疾患を診断する方法であって、該方法は、
被験体からの試料を提供する工程であって、ここで該試料は核酸全体を含み、該全体の一部は疾患を示す異常核酸である、工程、
該核酸全体を該試料から抽出する工程、
該抽出された核酸を定量的に分析して、該試料中の増幅可能な核酸の絶対量を決定する工程、
増幅反応のために該増幅可能な核酸を、該試料中の該異常核酸の増幅を確実にする量で提供する工程であって、ここで該提供される量は該定量的分析工程の結果に基づく、工程、
該増幅反応を実施する工程、および
該増幅された核酸を検出する工程であって、ここで該異常核酸の検出は該疾患の存在を示す、工程
を含む、方法。
【請求項２３】
定量的分析工程が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を実施する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
正常核酸および前記異常核酸が無細胞循環核酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料が組織または体液である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記体液が、血液、血清、血漿、尿、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物および腹膜液からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患ががんである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記がんが、脳、腎臓、肝臓、副腎、膀胱、頚部、乳房、胃、卵巣、食道、頸、頭部、皮膚、結腸、直腸、前立腺、膵臓、肝臓、肺、膣、甲状腺、がん腫、肉腫、グリア芽細胞腫、多発性骨髄腫、血液または胃腸からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【公表番号】特表２０１３−５１６９８４（Ｐ２０１３−５１６９８４Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４８９３１（Ｐ２０１２−５４８９３１）
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０１９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９０５１７
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０９２３８４４３）プレディクティブ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０１９５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９０５１７
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０９２３８４４３）プレディクティブ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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