調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法及び予防方法
【課題】ＭＫの発現または活性を抑制することにより、調節性Ｔ細胞を増加させ、１型ヘルパーＴ細胞が引き起こす自己免疫機序を抑制できる、新規薬剤の提供。
【解決手段】ミッドカインに対するアプタマーを有効成分として含有する、調節性Ｔ細胞増殖剤および、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、甲状腺異常、炎症性腸炎、１型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは筋萎縮性側索硬化症である。
【解決手段】ミッドカインに対するアプタマーを有効成分として含有する、調節性Ｔ細胞増殖剤および、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、甲状腺異常、炎症性腸炎、１型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは筋萎縮性側索硬化症である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミッドカイン阻害剤を有効成分として含有する調節性Ｔ細胞増殖剤および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤に関する。また、ミッドカインを阻害することによる調節性Ｔ細胞増殖方法および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法または予防方法、ミッドカイン阻害剤を投与することからなる調節性Ｔ細胞増殖方法および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法または予防方法、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法に関する。さらに、ミッドカインの発現量を測定する工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミッドカイン（以下ＭＫと記載することもある）はヘパリン結合成長因子ファミリーに属し、レチノイン酸反応性遺伝子の産物として見出された低分子の非糖化タンパク質である。その受容体は受容体型チロシンフォスファターゼζ、ＬＲＰ（low density lipoprotein receptor-related protein）、ＡＬＫ（anaplastic leukemia kinase）インテグリンおよびシンデカンからなる複合体と考えられている。ＭＫは細胞遊走、血管新生に対する作用を持ち、癌化や炎症の誘導にも多様な生物活性を有することが明らかになっている。胃癌、大腸癌、乳癌など多くの癌組織でＭＫが過剰発現していることも報告されている（非特許文献１、２）。一方、ＭＫ欠損マウスでは血管内膜障害がおき、虚血性の腎障害起こることも報告されている（非特許文献３、４）。
【０００３】
近年、ＭＫが炎症細胞の遊走や破骨細胞の分化を引き起こし、リウマチ性疾患においても重要な役割を果たしている可能性が示されたが（非特許文献５、６）、ＭＫの免疫能における役割はいまだ不明である。
【０００４】
種々の病原体に対する生体防御のシステムとしての免疫系の中心的役割を担う細胞群の一つにＴ細胞がある。Ｔ細胞は大別してＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞とＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞に分けられる。ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞は抗原刺激後の特定の分化成熟段階でのサイトカイン産生パターンによって、主にＩＦＮ−γを産生するＴｈ１細胞、ＩＬ−４を産生するＴｈ２細胞などに分類可能である。一般的に前者は細胞性免疫、後者は液性免疫として生体防御に深く関与している。免疫応答はこのような性質の異なるＴ細胞の働きによって巧妙なバランスのもとに病原体の排除や感染抵抗性の獲得に深く関与している。通常健全な免疫応答においては外来の非自己抗原に対してそれを排除する機構が働く。一方、生体を形成する自己抗原に対しては免疫学的寛容が成立しており排除機構は働かない。このように生体は自己と非自己を識別し、非自己のみを排除する機構を備えている。自己免疫疾患はこの免疫学的恒常性が破綻し、自己抗原に対する過剰な免疫応答が原因となっている。
【０００５】
Ｔ細胞レベルにおいて種々の免疫学的寛容が誘導される仕組みが分かっている。一つは、中枢寛容と呼ばれる胸腺における自己反応性Ｔ細胞クローンの排除の機構であり、主要組織適合遺伝子複合体を認識できる細胞だけが生き残れるポジティブセレクションと、胸腺細胞が呈示する自己抗原と強く反応する細胞を排除するネガティブセレクションで構成される。もう一つは末梢寛容と呼ばれる機構による自己反応性Ｔ細胞の胸腺外での制御である。後者には、細胞死の誘導あるいは自己抗原に対する不応答性の誘導と共に、調節性Ｔ細胞による能動的な抑制（非特許文献７）の機構が知られている。
【０００６】
調節性Ｔ細胞とは、近年提唱されたＴ細胞の新たな概念であり、他のＴ細胞に対して抑
制的な作用を有するということによって定義付けられる（非特許文献８）。免疫応答は巧妙なバランスのもとに成り立っており、例えばＴｈ１ 細胞及びＴｈ２ 細胞はお互いに夫々の免疫応答に拮抗的に働き、一方が他方に対する調節性Ｔ細胞として作用する。調節性Ｔ細胞としての細胞集団の存在の検証とその性状解析については依然多くの議論が残されている。このような調節性Ｔ細胞はin vitro又はin vivoにおいて特定の免疫応答を抑制又は調節する機能を有する細胞として研究され、細胞表面マーカーや産生サイトカインの種類や抑制および調節の機構などによって、種々の細胞集団として報告されている（非特許文献９）。
【０００７】
これらの調節性Ｔ細胞の中でも最もよく研究されている細胞集団はＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞集団である。正常なマウスやラットのＣＤ４陽性脾臓細胞からＣＤ２５陽性、ＲＴ６．１陽性、ＣＤ５陽性、ＣＤ４５ＲＢ陽性、ＣＤ４５ＲＣ陽性などの細胞を除去して、残りのＴ細胞をＴ細胞及びＢ細胞不全のＳＣＩＤマウスやラットに移入すると、甲状腺炎、胃炎、インスリン依存性自己免疫糖尿病、大腸炎などの臓器特異的自己免疫疾患が誘導される（非特許文献１０、非特許文献１１）。また、ＣＤ２５陰性ＣＤ４陽性細胞をヌードマウスに移入すると臓器特異的自己免疫疾患が生じ、末梢ＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞やＣＤ２５・ＣＤ４陽性ＣＤ８陰性胸腺細胞を共に移入すると発症が抑制される。これらの実験より、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が自己寛容維持に極めて重要な役割を果たしていることがわかってきた。
【０００８】
ヒトにも同様なＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が存在することが知られている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。ヒト末梢血から分離されたＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ陽性のメモリーＴ細胞マーカーを発現しており、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞と比較してＨＬＡ−ＤＲなどの活性化マーカーの発現が高い。また細胞内には定常的にＣＴＬＡ−４を発現しており、刺激によりその発現が上昇する。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体刺激、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激、同種異系の成熟樹状細胞による刺激などでは、ＤＮＡ合成及びサイトカインの産生は見られず、抗原刺激に対する不応答状態となっている。抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５などのサイトカインを加えることで、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のＤＮＡ合成能は高まるが、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞のＤＮＡ合成能は変わらない。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞存在下にＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体又は同種異系の成熟樹状細胞によって刺激した場合、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞非存在下と比較してＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞細胞数依存的な増殖抑制作用が見られる。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞はＩＬ−１０やＴＧＦβ１のような抑制性のサイトカインを産生する能力があるが、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞に対する増殖抑制作用は、これらサイトカインに対する中和抗体では解除されないこと、抑制作用にはＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞とＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の直接的細胞間接触が必要であることが報告されている。このようにヒトにおいてもＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の存在が報告され性状解析が進んでいるが、その詳細な分化機構や抑制作用機構の解明は途上にある。
【０００９】
マウスおよびヒトにおいて、ＩＬ−１０存在下での同種異系の抗原刺激や同種異系の未成熟樹状細胞による繰り返し刺激によって誘導される調節性Ｔ細胞についても報告されている（非特許文献１８、非特許文献１９）。これらの細胞は、Ｔｈ１，Ｔｈ２ 細胞とは異なり大量のＩＬ−１０を産生するものの、ＴＧＦ−β１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５の産生は高くなく、低レベルのＩＬ−２を産生し、ＩＬ−４を産生しないことを特徴としており、Ｔｒ１細胞と呼ばれている。Ｔｒ１細胞もＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞と同様に不応答状態であるが、Ｔ細胞抑制機構は産生されるＩＬ−１０やＴＧＦ−β１によって一部説明可能である。しかしながら、Ｔｒ１細胞とＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が全く異なるＴ細胞サブセットであるのか、或いは分化活性化段階の異なる同一の細胞である
かについては不明な点が多い。
【００１０】
Ｘ染色体性劣性遺伝を示すＩＰＥＸと呼ばれる遺伝病では、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎など臓器特異的自己免疫疾患、炎症性腸炎、アレルギーが高率に発症する。その原因遺伝子はＦＯＸＰ３であると考えられている。Ｆｏｘｐ３はＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞に選択的に発現していることが知られている。また、他のＴ細胞にこの遺伝子を発現させると、機能的にＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞に転換できる。さらに、この遺伝子の異常を持つマウスは重篤な自己免疫病変を発症するが、正常マウスから調整したＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞を移入すれば発症を阻止できる（非特許文献２０）。
【００１１】
ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞は多発性硬化症と深く関係していることがわかっている。再発寛解型多発性硬化症の患者ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が顕著に減少している（非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３）。また、多発性硬化症のモデルと考えられている実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルマウスを用いた実験では、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞がミエリンオリゴデンドロサイトグリコプロテイン（ＭＯＧ）に対するＴ細胞の増殖およびＩＦＮ−γの産生を抑制すること、および、ＥＡＥの発症を抑制することが報告されている（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）。重症筋無力症はＣＤ４陽性Ｔ細胞依存の自己免疫疾患と考えられており、重症筋無力症の患者ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の機能異常およびＦＯＸＰ３の発現低下が報告されている（非特許文献２７）。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）またはクローン病とも関係している。ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を免疫不全マウスに移入するとＴｈ１細胞に起因する腸炎を引き起こす。一方、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞と一緒にＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞を移入すると腸炎は起こらない（非特許文献２８、非特許文献２９）。関節リウマチ（ＲＡ）や全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）とＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の関係に関しても多くの研究が行われている。２３人のＳＬＥ患者（１９人がactive、４人がinactive）、１５人のＲＡ患者、２７人の健常者の末梢血中の調節性Ｔ細胞の分析をおこなったところ、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の数はＳＬＥ患者、ＲＡ患者、健常者で変わらなかったが、ＳＬＥ患者とＲＡ患者は健常者と比べて抑制機能が大きく低下していたことが報告されている（非特許文献３０）。この他、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞はＩ型糖尿病（非特許文献３１）、移植時の拒絶反応（非特許文献３２）、癌（非特許文献３３）などと関係することがわかっている。
【００１２】
ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞は、末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞の５〜１０％を占めるに過ぎない希少細胞集団であり、活性化刺激に対して不応答状態である。抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５などのサイトカインを加えることで細胞増殖を促すことが可能である。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞を増やすことで自己免疫疾患、移植、アレルギーなどの治療への応用が期待される。
【００１３】
多発性硬化症（以下ＭＳと記載することもある）は中枢神経系に炎症性脱髄を引き起こす自己免疫疾患であり、種々の免疫系細胞の関与が想定されているが、その本態はいまだ明らかにされていない。近年、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４・ＣＤ２５・Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞）がＭＳの病態を抑制的に調節していることが示された。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞は免疫寛容を維持することにより、自己免疫発現を調節している。そのため、この細胞の機能異常が種々の自己免疫疾患の発症に関与していると考えられているが、本機構の詳細については未だ解明されていない。
【００１４】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Tsutsui, J., et al., Cancer Res., 53, 1281-1285 (1993)
【非特許文献２】Kadomatsu, K., et al., Brit. J. Cancer, 75, 354-359 (1997)
【非特許文献３】Horiba, M., et al., J. Clin. Invest., 105, 489-495 (2000)
【非特許文献４】Sato, W., et al., J. immunol., 167, 3463-3469 (2001)
【非特許文献５】Takada T., et al., J.Biochem, 122(2), 453-458 (1997)
【非特許文献６】Maruyama K., et al., Arthritis Rheum., 50(5), 1420-1429 (2004)
【非特許文献７】Shevach, E.M. 2000. Annu. Rev. Immunol. 18:423-449.
【非特許文献８】McGuirk P., et al., TRENDS in Immunol. 23, 450-455 (2002)
【非特許文献９】Roncarolo, M.G., and M.K. Levings. 2000. Curr. Opinion. Immunol. 12:676-683.
【非特許文献１０】Sakaguchi, S., et al., 1985. J. Exp. Med.161:72
【非特許文献１１】Itoh, M.,et al., 1999. J. Immunol. 162:5317-5326.
【非特許文献１２】Jonuleit, H.et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1285-1294
【非特許文献１３】Levings, M. K. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1295-1301
【非特許文献１４】Dieckmann, D. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1303-1310
【非特許文献１５】Taama, L. S.et al., 2001. Eur. J. Immunol. 31:1122-1131
【非特許文献１６】Stephens, L. A. et al., 2001. Eur. J. Immunol. 31:1247-1245
【非特許文献１７】Baecher-Allan, C. et al., 2001. J. Immunol. 167:1245-1253.
【非特許文献１８】Groux, H. et al.,1997.Nature.389:737-742
【非特許文献１９】Jonuliet, H. et al., 2000. J. Exp. Med.192:1213-1222.
【非特許文献２０】坂口志文、２００３、実験医学２１：２１６４−２１６８
【非特許文献２１】Viglietta et al., 2004, J. Exp. Med. 199: 971-979
【非特許文献２２】Haas, et al., 2005, Eur. J. Immunol. 35: 3343-3352
【非特許文献２３】Huan et al., 2005, J. Neurosci. Res. 81: 45-52
【非特許文献２４】Furtado et al., 2001, Immunol. Rev. 182: 122-134
【非特許文献２５】Hori et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 8213-8218
【非特許文献２６】Kohm et al., 2002, J. Immunol. 169: 4712-4716
【非特許文献２７】Balandina et al., 2005, Blood 105, 735-741
【非特許文献２８】Coombes et al., 2005, Immunol. Rev. 204: 184-194
【非特許文献２９】Read et al., 2000, J. Exp. Med. 192: 295-302
【非特許文献３０】Alvarado-Sanchez et al., 2006, J. Autoimmunity 27, 110-118
【非特許文献３１】Green et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 10878-10883
【非特許文献３２】Dai et al., 2004, J. Clin. Invest. 113, 310-317
【非特許文献３３】Wei et al., 2004, Cancer Immunol Immunother 53: 73-78
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＭＫ阻害剤を有効成分として含有する調節性Ｔ細胞増殖剤を提供することにある。また、ＭＫ阻害剤を含有する調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤を提供することにある。さらに、ＭＫの発現または活性を阻害し、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法の提供も課題とする。さらにＭＫの発現量を測定する工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法の提供も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ＭＫ欠損マウスにおいて、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が増加していること、ＭＫを投与することによりＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が減少するこ
とを発見した。また、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル（以下ＥＡＥと記載することもある）における研究において以下のような結果を得た。
【００１７】
まず、ＭＫ欠損マウスにおいてＥＡＥを誘導し、その病態を観察したところ、臨床症状の軽減が見られた（図１）。また、本効果はＭＫを投与することにより、消失することも明らかとなった（図１）。
【００１８】
次に、該ＥＡＥモデル動物におけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の動態を検索して、ＭＫのＥＡＥ発現やＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の機能に対する役割を検討した。また同時に、ＥＡＥは１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）により誘導される疾患であるので、ＭＫ欠損マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスを検討し、ＭＫのＴｈ１／Ｔｈ２バランスに対する効果についても検討を行った。
【００１９】
その結果、本モデル動物における臨床症状の軽減は、疾患を誘導するＣＤ４陽性細胞の変化ではなく（図２）、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性の調節性Ｔ細胞の増加が関与していることが明らかとなった（図３、４）。また、ＭＫ欠損マウスにＥＡＥを誘導すると、野生型に比較してＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞は増加しているが、ＭＫを添加することにより、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞が減少することが明らかとなった（図５）。さらに、これらＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の増加により、細胞性免疫を誘導する１型ヘルパーＴ細胞も抑制されることが明らかとなった（図６）。
【００２０】
次に、ＭＫ阻害剤の１つである抗ＭＫ抗体投与による、ＥＡＥモデルマウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動態への影響の解析を行った。その結果、ＭＫ阻害剤の投与により、臨床症状の軽減が見られた（図８）。具体的には、ＭＯＧ３５−５５の免疫接種後、抗ＭＫ抗体を投与したマウス群においては、発病開始の遅れ、疾病重症度の軽減が見られた。（図８）。
さらに、ＥＡＥモデルマウスに、ＭＫ阻害剤であるＭＫアプタマーを投与し、その臨床症状を観察した。その結果、抗ＭＫ抗体投与と同様にＥＡＥモデルマウスの臨床症状の軽減がみられた。（図９）。
【００２１】
即ち、本発明者らは、ＭＫには調節性Ｔ細胞の増殖および機能を抑制する作用があり、ＭＫの発現または活性を抑制することにより、それらの抑制を解除することができることを発見し、これにより本発明を完成するに至った。
【００２２】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔２０〕を提供するものである。
〔１〕ＭＫ阻害剤を有効成分として含有する、調節性Ｔ細胞増殖剤。
〔２〕ＭＫ阻害剤が、抗ＭＫ抗体、ＭＫに対するアプタマー、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡから選択されるＭＫ阻害剤である〔１〕に記載の調節性Ｔ細胞増殖剤。
〔３〕ＭＫ阻害剤が、抗ＭＫ抗体又はＭＫに対するアプタマーである〔１〕に記載の調節性Ｔ細胞増殖剤。
〔４〕ＭＫ阻害剤を有効成分として含有する調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
〔５〕ＭＫ阻害剤が、抗ＭＫ抗体、ＭＫに対するアプタマー、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡから選択されるＭＫ阻害剤である〔４〕に記載の調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
〔６〕ＭＫ阻害剤が、抗ＭＫ抗体又はＭＫに対するアプタマーである〔４〕に記載の調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
〔７〕調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、甲状腺異常、炎症性腸炎、１型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは筋萎縮性側索硬化症である〔４〕から〔６〕
のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
〔８〕調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が、多発性硬化症である〔４〕から〔６〕のいずれか１項に記載の治療剤。
〔９〕ＭＫを阻害することによる、調節性Ｔ細胞の増殖方法。
〔１０〕ＭＫ阻害剤を投与することからなる調節性Ｔ細胞の増殖方法。
〔１１〕調節性Ｔ細胞増殖剤の製造のためのＭＫ阻害剤の使用。
〔１２〕ＭＫを阻害することによる、調節性Ｔ細胞の機能異常に基く疾患の治療方法または予防方法。
〔１３〕ＭＫ阻害剤を投与することからなる調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法または予防方法。
〔１４〕調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患治療剤または予防剤の製造のためのＭＫ阻害剤の使用。
〔１５〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＭＫの発現と結合することにより、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。（ａ）ＭＫに被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＭＫと被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＭＫと結合する被検化合物を選択する工程
〔１６〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＭＫの発現を阻害することにより、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。（ａ）ＭＫ遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＭＫの発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該ＭＫの発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
〔１７〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ＭＫの発現を抑制を阻害することにより調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）ＭＫをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
〔１８〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＭＫの活性を抑制し調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）ＭＫを発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるＭＫの活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下させた被検化合物を選択する工程
〔１９〕ＭＫの発現量を測定する工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法。
〔２０〕ミッドカインと結合する物質を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査薬。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、ＭＫ欠損マウス、ＭＫを投与したＭＫ欠損マウスにおける臨床症状の観察結果を示す図である。免疫接種後２５日までの全動物の平均値を示す。Kaplan-Meier法に従って曲線を描画した。
【図２】ＭＯＧ３５−５５接種後の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）およびＭＫ欠損マウスの末梢リンパ節におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率を示す図である。Ａ：野生型マウスおよびＭＫ欠損マウスの脾臓、腸管膜リンパ節、膝下リンパ節における、in vivo ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞の比率を示す図である。Ｂ：上記３部位における全単核細胞中のＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を示す図である。値をmean±SEMで示す。Ｐ値はスチューデントｔ−検定により算出した。
【図３】ＭＯＧ３５−５５接種後の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）およびＭＫ欠損マウスの末梢リンパ節におけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率を示す図である。Ａ：野生型マウスおよびＭＫ欠損マウスの脾臓、腸管膜リンパ節、膝下リンパ節における、in vivo ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の細胞蛍光特性を示す図である。Ｂ：上記３部位における全単核細胞中のＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の割合を示す図である。値をmean±SEMで示す。Ｐ値はスチューデントｔ−検定により算出した。
【図４】自己免疫性脳脊髄炎モデル動物におけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の動態を示す図である。Ａ：野生型マウス、ＭＫ欠損マウス、ＭＫを投与したＭＫ欠損マウスの各群の脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、該細胞の比率を調べた結果を示す図である。Ｂ：各群の脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、Foxp3 mRNAの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。標準ＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるFoxp3 mRNA発現に対する相対値を示す。
【図５】ＭＫ添加による、ＭＫ欠損マウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動態への影響を示す図である。Ａ：各群の脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性の比率を調べた結果を示す図である。ＣＤ４陽性部分にゲートをかけＣＤ４陽性細胞のみを解析した。Ｂ：各群の脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、Foxp3 mRNAの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。GAPDH mRNA発現に対するFoxp3 mRNAとの相対値を示す。
【図６】ＭＫ欠損マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスを示す図である。マウスの脾細胞から純化し、ＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）存在下で培養したＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養上清におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在量を示す図である。値を５匹のマウスのmean±SEMで示す。γ軸の単位はｐｇ／ｍｌ。Ｐ値はスチューデントｔ−検定により算出した。
【図７】抗ＭＫ抗体添加による、ＥＡＥモデルマウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動態への影響の解析結果を示す図である。抗ＭＫ抗体（ＩＰ−１３）およびコントロール抗体（ＩｇＧ）の存在下、ＥＡＥ誘導マウスの脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞を３０μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５およびＡＰＣにより５日間刺激後、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率を検出した。
【図８】抗ＭＫ抗体添加による、ＥＡＥモデルマウスにおける臨床症状変化の観察結果を示す図である。野生型ＥＡＥモデルマウス（Ｃ５７ＢＬ−６，♀、８週令）に対して、ＭＯＧ３５−５５投与の０，３，７，１０，１４，１７，２１，２４日目に（合計８回）、抗ＭＫ抗体（ＩＰ１４）の投与を行った。マウスを４つの群に分け（一群の匹数：５）、マウス重さ（ｋｇ）あたり、それぞれ７５ｍｇ／ｋｇ（黒菱形）、７．５ｍｇ／ｋｇ（黒四角）、０．７５ｍｇ／ｋｇ（黒三角）、０ｍｇ／ｋｇ（×、コントロール）の量の抗ＭＫ抗体を尾静脈投与した。Ｙ軸は臨床スコア（０：症状なし、１：尾が垂れる、２：仰向けにして起き上がれない、３：不安定歩行、４：軽度の後肢麻痺、５：重度の後肢麻痺、６：死亡）の平均値を表す。
【図９】ＭＫアプタマー添加による、ＥＡＥモデルマウスにおける臨床症状変化の観察結果を示す図である。野生型ＥＡＥモデルマウス（Ｃ５７ＢＬ−６，♀、８週令）に対して、ＭＯＧ３５−５５投与後２日に１回の間隔で計１０回、それぞれ１５ｍｇ／ｋｇ（黒四角），２．５ｍｇ／ｋｇ（黒三角），０．２５ｍｇ／ｋｇ（×）、０ｍｇ／ｋｇ（菱形、コントロール）のアプタマーを腹腔内投与した。Ｙ軸は臨床スコア（０：症状なし、１：尾が垂れる、２：仰向けにして起き上がれない、３：不安定歩行、４：軽度の後肢麻痺、５：重度の後肢麻痺、６：死亡）の平均値を表す。＊＊：ｐ＜１％。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明者らは、ＭＫには調節性Ｔ細胞の増殖および機能を抑制する作用があり、ＭＫの活性または発現を抑制することにより、それらの抑制を解除することができることを見いだした。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００２５】
本発明は、ＭＫ阻害剤を含有する調節性Ｔ細胞増殖剤および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤または予防剤に関する。
【００２６】
本発明において「ＭＫ阻害剤」とは、ＭＫの発現を阻害する物質であってもよいし、ＭＫの活性を阻害する物質であってもよい。ＭＫ阻害剤は、好ましくはＭＫまたはＭＫ受容体の結合に対する阻害作用を有する物質である。本発明において、「ＭＫ受容体」としては、受容体型チロシンフォスファターゼζ、ＬＲＰ（low density lipoprotein receptor-related protein）、ＡＬＫ（anaplastic leukemia kinase）およびシンデカンからなる複合体を挙げることができる。本発明の阻害剤は複合体を構成している、各タンパク質の発現や活性を阻害するものであってもよい。
【００２７】
本発明のＭＫ阻害剤の例としては、抗ＭＫ抗体、抗ＭＫ受容体抗体、ＭＫに対するアプタマー、ＭＫに対するアンチセンスＲＮＡ、ＭＫに対するｄｓＲＮＡよびＭＫに対するリボザイムを挙げることが出来る。また、ＭＫ改変体、可溶性ＭＫ受容体改変体あるいはＭＫ又はＭＫ受容体の部分ペプチド等のドミナントネガティブ体および、これらと同様のＭＫ阻害活性を示す低分子物質が挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のＭＫ阻害剤としては、好ましくは抗ＭＫ抗体、ＭＫに対するアプタマー、ＭＫに対するアンチセンスＲＮＡ、ＭＫに対するｄｓＲＮＡ、ＭＫに対するリボザイムを挙げることが出来る。より好ましくは抗ＭＫ抗体、ＭＫに対するアプタマーを挙げることが出来る。
【００２８】
本発明で使用される抗ＭＫ抗または抗ＭＫ受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＭＫまたはＭＫ受容体と結合することにより、ＭＫのＭＫ受容体への結合を阻害してＭＫの生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗ＭＫ抗体としては、公知の文献（Sun XZ, et al., J.Neuropathol Exp Neurol. 56(12), 1339-48 (1997)、Muramatsu H, et al., J. Biochem 119:1171-76 (2004)）に記載の抗体が挙げられる。
【００２９】
抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＭＫまたはＭＫ受容体を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００３０】
具体的には、抗ＭＫ抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＭＫは、公知の文献（Tomomura, M., et al., J. Biol. Chem. 265, 10765-10770 (1990)、Tsutsui, J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 792-797 (1991)、Iwasaki W, et al., EMBO J. 16(23), 6936-46 (1997)）に開示されたＭＫ遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。本発明の方法に使用されるヒト由来のＭＫのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ＤＮＡがコードするＭＫの
アミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００３１】
ＭＫ受容体蛋白質は、本発明で用いられる抗ＭＫ受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、いずれのＭＫ受容体を使用してもよい。本発明においてＭＫ受容体とは、受容体複合体、または複合体の各構成成分（蛋白質）を示すものとする。
【００３２】
ＭＫまたはＭＫ受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＭＫ蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ＭＫ蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、化学合成によって作製したＭＫ蛋白質（Inui, T., et al., J. Peptide Sci. 2, 28-39 (1996)）またはＭＫ受容体蛋白質も感作抗原として用いてもよい。また、ＭＫ蛋白質またはＭＫ受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
【００３３】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
【００３４】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
【００３５】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００３６】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology
(1978) 81, 1-7）、ＮＳ−１（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519）、ＭＰＣ−１１（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 ）、ＳＰ２／０（Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270）、ＦＯ（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21）、Ｓ１９４（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323）、Ｒ２１０（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133）等が適宜使用される。
【００３７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００３８】
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００３９】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この
種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００４０】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００４１】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
【００４２】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５参照）。
【００４３】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００４４】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００４５】
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
【００４６】
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299）、ＡＧＰＣ法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159）等により全ＲＮＡを調製し、mRNA Purification Kit（Pharmacia製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
【００４７】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡ
の合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには5’-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
【００４８】
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
【００４９】
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００５０】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体、ヒト（human）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００５１】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【００５２】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。
【００５３】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；framework region）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。
【００５４】
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
【００５５】
キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。ヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい
。
【００５６】
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
【００５７】
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
【００５８】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【００５９】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
【００６０】
例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）に従えば容易に実施することができる。
【００６１】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043）に従えばよい。
【００６２】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S. P. et al .,J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
【００６３】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマ
ウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００６４】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００６５】
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（baby hamster kidney）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏなど、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌が知られている。
【００６６】
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。
一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
【００６７】
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
【００６８】
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
【００６９】
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(19
94)24, 131-138）。
【００７０】
上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
【００７１】
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、SepharoseF.F.等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
【００７２】
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）に適用し得る。また、逆相ＨＰＬＣ（reverse phase HPLC）を用いてもよい。
【００７３】
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はＥＬＩＳＡ等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、ＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５ＯＤとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＴＡＧ製）１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
【００７４】
洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（BIO SOURCE製）１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
【００７５】
本発明において「アプタマー」とはタンパク質やホルモンなどの各種分子と結合する核酸を意味する。ＭＫアプタマーとはＭＫと結合する核酸を意味する。ＭＫアプタマー阻害剤とはＭＫに結合して、ＭＫとＭＫに結合する分子、例えばＭＫ受容体や細胞外マトリックス、の結合を阻害する核酸を意味する。ＭＫアプタマーはＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、これらのＲＮＡまたはＤＮＡがＭＫに結合するものである限り特に限定はしない。また、リボース、リン酸骨格、核酸塩基、両末端部分に修飾が加えられた核酸であってもよく、これらの核酸がＭＫに結合するものである限り特に限定するものではない。核酸の形態は二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。
【００７６】
アプタマーの長さは標的分子に特異的に結合するために必要な長さを有していれば特に限定はしないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチド、好ましくは、１０〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜８０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオ
チドのものである。
【００７７】
アプタマーはヌクレオチドで構成されたものだけで治療薬として使用することができるが、他の分子、例えば、ポリエチレングリコール、コレステロール、ペプチド、リポソーム、蛍光色素、放射性物質、毒素、他のアプタマーなどを結合させた形態で使用することもできる。本発明において、「アプタマー」はこのような他の分子を結合させたアプタマーも含まれる。
【００７８】
本発明のアプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選別することができる。限定はしないが、例えば、ＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）（Tuerk, C. and Gold, L., 1990, Science, 249: 505-510）により選別することができる。ＳＥＬＥＸ法は、１０１５程度の異なるヌクレオチド配列をもつ核酸プールを標的物質と混合し、標的物質に結合する、または、より強く結合する核酸を選別してくる方法である。選別された核酸はＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲにより増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、目的のアプタマーを取得することができる。
アプタマーを医薬品として使用する場合、最小化および安定化する必要がある。具体的には、活性に影響しないヌクレオチドを削除することで最小化し、修飾を入れることで安定化する。天然型のＲＮＡの血清中での半減期は数秒であるが、例えば、リボースの２’位をＯ−メチル化し両末端にinverted dTを結合することで、半減期が１週間以上に延びる。
【００７９】
本発明の「ＭＫに対するアンチセンスＲＮＡ」は、ＭＫをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡであり、例えば特開２００２−１４２７７８および特開２００３−０１２４４７公報記載のアンチセンスＲＮＡがあげられる。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
【００８０】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、ＭＫ遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であるものと考えられる。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物
に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００８１】
本発明で用いられる「ＭＫに対するｄｓＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＭＫ遺伝子発現を抑制する二重鎖ＲＮＡを意味し、例えば、特開２００４−２７５１６９記載のｄｓＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡ干渉は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約４０〜数百塩基対のｄｓＲＮＡが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Dicer）と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、ｄｓＲＮＡを３’末端から約２１〜２３塩基対ずつ切り出し、ｓｉＲＮＡ（short interference RNA）を生じる。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ：RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はｓｉＲＮＡと同じ配列を認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部で標的遺伝子のｍＲＮＡを切断する。また、この経路とは別にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｓＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成される。このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となって、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅する経路も考えられている。
【００８２】
本発明のｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを挙げることができる。「ｓｉＲＮＡ」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味し、例えば、１５〜４９塩基対と、好適には１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。あるいは、発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的な二重鎖ＲＮＡ部分の長さが、例えば、１５〜４９塩基対、好適には１５〜３５塩基対、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。また、ｓｈＲＮＡは、１本鎖のＲＮＡがヘアピン構造を介して２重鎖を構成しているｓｉＲＮＡである。
【００８３】
ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の相同性を有する。
【００８４】
ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
【００８５】
本発明の「ＭＫに対するリボザイム」は、ＭＫの発現や機能に影響を与える、触媒活性を有した核酸を意味し、ＭＫｍＲＮＡを特異的に切断する核酸を含む。
【００８６】
また、ＭＫ活性の一部はＭＫの２量体化を必要とし、この際にはアミノ末端ドメインが関与することから（Kojima, S., et al., J. Biol. Chem., 272, 9410-9416 (1997)）、ＭＫの部分ペプチド（例えば、ＭＫのアミノ末端ドメインの一部）もＭＫ阻害剤として使用することが出来る。
また、ヒトおよびマウスのＭＫ遺伝子の５’上流域には、レチノイン酸受容体の結合部位が存在し、ＭＫはレチノイン酸応答性遺伝子の産物であることから（Matsubara, S., et al., J. Biochem., 115, 1088-1096 (1994)）、レチノイン酸阻害剤もＭＫの阻害剤として用いることが出来る。
また、ウィルムス腫瘍の抑制遺伝子として知られているＷＴ１は、ＭＫプロモーターによる下流の遺伝子の発現を抑えることから（Adachi, Y., et al., Oncogene, 13, 2197-2203 (1996)）、ＷＴ１もＭＫの阻害剤として用いることが出来る。
さらに、ＭＫはＭＫ受容体、コンドロイチン硫酸、ヘパリンなどの分子と強く結合することから（Ueoka, C., et al., J. Biol. Chem. 275, 37407-37413 (2000)、これらの分子およびこれらの分子の一部もＭＫの阻害剤として用いることができる。
【００８７】
さらに、ＭＫの発現または活性を抑制するＭＫ阻害剤は、後述のスクリーニング方法によっても得ることもできる。
【００８８】
本発明において、「調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療または予防」とは、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の症状、および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患において合併して起こる症状を、抑制または予防することを意味する。
本発明において、「調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患」とは、調節性Ｔ細胞の生体内における細胞数の減少に伴う疾患または調節性Ｔ細胞の機能低下に伴う疾患を意味する。本発明の「調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患」として、好ましくは、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の機能異常に伴う疾患である。
【００８９】
調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患としては、多発性硬化症、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、炎症性腸炎、１型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、慢性関節性リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺異常、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変
（ＰＢＣ）、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血炎症性腸炎、クローン病等を挙げることができる。好ましくは、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、炎症性腸炎、１型糖尿病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症または重症筋無力症をあげることができる。本発明においては、多発性硬化症をより好ましい疾患の例として挙げることができる。
これら上記の疾患において、調節性Ｔ細胞の減少に基づくと診断されたものに関しては、本発明の「調節性Ｔ細胞増殖剤」または「調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患治療剤」は特に有効である。
【００９０】
本発明における調節性Ｔ細胞増殖剤および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤または予防剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる材料が添加されていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の調節性Ｔ細胞の増殖効果または調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療効果を有する材料であってもよいし、当該増殖効果・治療効果を有さない材料であってもよく、上記の増殖剤・治療剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。また、調節性Ｔ細胞の増殖効果または調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療効果を有さない材料であって、ＭＫ阻害剤と併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。
【００９１】
製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。
【００９２】
本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル等のＨＬＢ６〜１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
【００９３】
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
【００９４】
本発明の薬剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
【００９５】
本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等、他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
【００９６】
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭである。
【００９７】
また、本発明の薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
【００９８】
本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
【００９９】
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
【０１００】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
【０１０１】
また、必要に応じ、マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（ “Remington’s Pharmaceutical Science
16th edition”, Oslo Ed., 1980等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も
公知であり、本発明に適用し得る（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277； Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開（ＥＰ）第５８，４８１号； Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556；ＥＰ第１３３，９８８号）。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
本発明は、ＭＫの発現または活性を抑制し調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法に関する。
【０１０３】
本発明の「ＭＫの発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【０１０４】
本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まず、ＭＫに複数の被験化合物を接触させる。
【０１０５】
本発明の方法に使用されるヒト由来のＭＫのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ＤＮＡがコードするＭＫのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、本発明の方法に使用されるＭＫには、上記の公知のＭＫと機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、ＭＫの変異体、アレル、バリアント、ホモログ、ＭＫの部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本発明におけるＭＫの変異体としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のＤＮＡよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、ＭＫの変異体として挙げることができる。
【０１０７】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。
【０１０８】
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、ＭＫと同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、ＭＫの生物学的機能や生化学的機能としては、細胞の増殖促進（繊維芽細胞、ケラチノサイト、または腫瘍細胞の増殖促進）、細胞の生存促進（胎児神経細胞、または腫瘍細胞の生存促進）、細胞の移動促
進（神経細胞、好中球、マクロファージ、骨芽細胞、または血管平滑筋細胞の移動促進）、ケモカインの発現促進、血管新生促進、またはシナプス形成促進等を挙げることができる。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。
【０１０９】
目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、ＭＫの塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、またＭＫ（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＭＫと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうるＭＫと同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。
【０１１０】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件を用いることにより、より相同性の高いＤＮＡの単離を期待することができる。これにより単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％，９６％，９７％，９８％，９９％以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=100、wordlength=12とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=50、wordlength=3とする。ＢＬＡＳＴとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【０１１１】
本発明の方法に使用されるＭＫの由来となる生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。
【０１１２】
第一の態様に用いられるＭＫの状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
【０１１３】
ＭＫの精製は周知の方法で行うことができる。また、ＭＫが発現している細胞としては、内在性のＭＫを発現している細胞、または外来性のＭＫを発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＭＫを発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることが可能である。内在性のＭＫを発現している細胞が由来する生物種としては、特に制限はなく、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。また、上記外来性のＭＫを発現している細胞は、例えば、ＭＫをコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。また
、上記外来性のＭＫを有する細胞は、例えば、ＭＫをコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＭＫが導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
【０１１４】
また、ＭＫが発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＭＫをコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
【０１１５】
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
【０１１６】
また、本発明において「接触」は、ＭＫの状態に応じて行う。例えば、ＭＫが精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＭＫが発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＭＫが発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
【０１１７】
第一の態様では、次いで、ＭＫと被験化合物との結合を検出する。検出方法としては、特に制限はない。ＭＫと被験化合物との結合は、例えば、ＭＫに結合した被験化合物に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識など定量的測定が可能な標識）によって検出することができる。また、ＭＫに標識剤を結合することもできる。被験化合物またはＭＫを樹脂やチップなどに固定化して結合を検出することもできる。ＭＫへの被験化合物の結合により生じるＭＫの活性変化を指標に検出することもできる。
本態様では、次いで、ＭＫと結合する被験化合物を選択する。選択された化合物にはＭＫの発現または活性を減少させる化合物が含まれ、ＭＫの発現または活性を抑制することによって、結果的に調節性Ｔ細胞の増殖作用および機能促進作用をもち、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１１８】
本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まずＭＫを発現する細胞に被検化合物を接触させる。
第二の態様では、次いでＭＫの発現レベルを測定する。ＭＫの発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【０１１９】
また、該遺伝子からコードされるＭＫを含む画分を定法に従って回収し、該ＭＫの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＭＫに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実
施し、ＭＫの発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＭＫに対する抗体については、上記に記載したものを用いることが出来る。
【０１２０】
第二の態様では、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該ＭＫの発現レベルを減少させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、ＭＫの発現を減少させる化合物が含まれ、ＭＫの発現を抑制することによって、結果的に調節性Ｔ細胞の増殖作用および機能促進作用をもち、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１２１】
本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、ＭＫをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
第三の態様において、「機能的に結合した」とは、ＭＫ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＭＫ遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＭＫ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【０１２２】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＭＫをコードするＤＮＡもまた含まれる。
ＭＫをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液は、第一の態様において述べた方法で調製することが可能である。
【０１２３】
第三の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被験試料を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。
【０１２４】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【０１２５】
また、ＭＫ遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、第二の態様に記載された方法で行うことが出来る。
【０１２６】
第三の態様においては、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レ
ポーター遺伝子の発現レベルを減少または増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、ＭＫ遺伝子の発現レベルを減少させる化合物が含まれ、ＭＫの発現を抑制することによって、結果的に調節性Ｔ細胞の増殖作用および機能促進作用をもち、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１２７】
本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず、ＭＫ遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる。
第四の態様では、次いで、上記ＭＫの活性を測定する。ＭＫの活性としては、細胞の増殖促進（繊維芽細胞、ケラチノサイト、または腫瘍細胞の増殖促進）、細胞の生存促進（胎児神経細胞、または腫瘍細胞の生存促進）、細胞の移動促進（神経細胞、好中球、マクロファージ、骨芽細胞、または血管平滑筋細胞の移動促進）、ケモカインの発現促進、血管新生促進、またはシナプス形成促進等を挙げることができる。具体的には、好中球、マクロファージの遊走能の測定、繊維芽細胞の増殖能により間接的にＭＫの活性を測定することができる。次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下もしくは増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、ＭＫの活性を低下させる化合物が含まれ、ＭＫの活性を抑制することによって、結果的に調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１２８】
本発明は、ＭＫを発現する細胞において、ＭＫの発現または活性を抑制させる工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する方法に関する。本発明の方法において、ＭＫの発現または活性を抑制することにより、調節性Ｔ細胞を増加させてもよいし、１型ヘルパーＴ細胞を減少させてもよい。
【０１２９】
本発明において、ＭＫ遺伝子の発現または活性を抑制させるための方法としては、ＭＫをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なＲＮＡ、または該転写産物を特異的に開裂するリボザイムの対象への投与を挙げることができる。ＭＫをコードするＤＮＡとしては配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする天然由来のＤＮＡ等も含まれる。
【０１３０】
本発明の「ＭＫの発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【０１３１】
本発明のＭＫ阻害剤をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。製剤化する場合には、上記に記載の製剤上許容される材料を添加してもよい。
【０１３２】
本発明におけるすべての薬剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗ＭＫ抗体または抗ＭＫ受容体抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．５ｍｇから４０ｍｇ、好ましくは１ｍｇ
から２０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。ＭＫアプタマーの場合には、血中にフリーのアプタマーが存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．１ｍｇから１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇから４０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。
【０１３３】
本発明は、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法に関する。該方法としては、ＭＫを発現する細胞において、ＭＫの発現量を測定する工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法を挙げることが出来る。ＭＫの発現量の測定は上記に記載の方法で行うことが可能である。
【０１３４】
ＭＫの発現量が増大した場合には、１型ヘルパーＴ細胞が増大している（ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が減少している）と考えられ、ＭＫの発現量を測定することで調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が発症しているかどうかを検査することが可能であるものと考えられる。
【０１３５】
本発明は、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査薬に関する。
該検査薬における「ＭＫと結合する物質」としては、ＭＫ蛋白質、ＭＫ遺伝子領域、ＭＫｍＲＮＡと結合する物質であれば特に限定はなく、例えば、ＭＫ遺伝子領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはＭＫを認識する抗体を挙げることができる。このような、ＭＫ遺伝子領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとしては、例えば、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを挙げることが出来る。
【０１３６】
本発明の検査薬として使用する、オリゴヌクレオチドには、ポリヌクレオチドが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のＭＫをコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、ＭＫ遺伝子の発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明のＭＫタンパク質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡ等）として使用することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡアレイの基板の形態で使用することができる。
【０１３７】
該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１５ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。また、プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的とし、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【０１３８】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のＤＮＡまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【０１３９】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵
素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【０１４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【０１４１】
本発明の検査薬として使用する、抗体は上記のＭＫを認識する限り特に限定されないが、特異的にＭＫを認識する抗体であることが好ましい。抗ＭＫ抗体については上記に記載のものを例示することができる。
【０１４２】
本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
【０１４３】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドまたは抗体以外に、上記に記載の製剤上許容される材料を含んでいてもよい。
【０１４４】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１４５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【０１４６】
〔実施例１〕ＭＫ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導および、臨床症状の観察
まず、ＭＫ欠損マウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導し、その病態を観察した。
３００μｇのMyelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55（ＭＯＧ３５−５５）（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）（配列番号：３）を５００μｇの結核死菌（Mycobacterium tuberculosis）を含む不完全Feund’s adjuvantをともにエマルジョン化し、８−１０週齢の野生型及びＭＫ欠損のＣ５７ＢＬ６マウス（日本、名古屋大学、村松教授より供与、Nakamura, E., et al., Genes Cells 3, 811-822 (1998)）に接種した。さらに、感作直後及び４８時間後に３００ｎｇの百日咳毒素（pertussis toxin）を２００μｌのＰＢＳに溶かし、尾静脈より投与しＥＡＥを誘導した。以後、毎日以下の基準により臨床症状を評価した（図１）。野生型マウス（ｎ＝１６）、ＭＫ欠損マウス（ｎ＝１３）について、毎日臨床スコアが付けられ、臨床症状の評価が行われた。図１における臨床スコア値は、０：症状なし、１：尾が垂れる、２：不安定歩行、３：後肢麻痺、４：四肢麻痺、５：死亡の病状を示し、免疫接種後２５日までの全ての動物の割合が記録された。
その結果、ＭＫ欠損マウスにおいて、臨床症状の軽減が見られた（図１）。具体的には、ＭＯＧ３５−５５の免疫接種後、ＭＫ欠損マウスにおいては、発病開始の遅れ、疾病重症度の軽減が見られた。
【０１４７】
〔実施例２〕ＭＫの投与による、ＭＫ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床症状への効果の検討
実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導させたＭＫ欠損マウスに対して、ＭＫを投与し、臨床
症状へのＭＫの効果を検討した。
ＭＫ欠損マウスに、１ｍｇ／ｍｌに溶解したＭＫをマイクロ浸透ポンプ（Model 1002, Durect Corp. Cupertino, CA）につめて腹腔内に投与した。このマイクロ浸透ポンプにより１時間に０．２５μｌのＭＫを１４日間投与し、総量として２００ｍｇ／日のＭＫを投与した。実施例１と同様の方法により、臨床症状の評価を行った（ｎ＝１３）。ＰＢＳのみをつめたマイクロ浸透ポンプを同様に腹腔内に投与したものを対照とした。
その結果、ＭＫ欠損マウスにおける臨床症状の軽減効果が、消失することが明らかとなった（図１）。
【０１４８】
〔実施例３〕各マウスの病理学的検索
ＥＡＥ発症後（感作後１４日目）の、実施例１および２の各群の脊髄を取り出し、ホルマリン固定後、公知の方法でヘマトキシリン・エオジン染色をし、病理学的検索を行った。
その結果、ＭＫ欠損マウスにおいてＭＯＧ３５−５５の免疫接種後のＣＮＳ炎症の減少が見られた。
【０１４９】
〔実施例４〕自己免疫性脳脊髄炎モデル動物におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞、またはＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の動態の解析
該自己免疫性脳脊髄炎モデル動物におけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の動態を検索して、ＭＫのＥＡＥ発現やＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の機能に対する役割を検討した。
野生型、ＭＫ欠損マウス、ＭＫ投与群のＥＡＥ発症後（免疫接種１２−１４日後）のマウスの脾臓、腸管膜リンパ節、膝下リンパ節よりリンパ球を分離し、ＣＤ４・ＣＤ８陽性細胞およびＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞をフローサイトメトリーにより測定した。
その結果、ＭＯＧ３５−５５接種後の野生型マウスおよびＭＫ欠損マウスの末梢リンパ節においては、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率に大きな違いは見られなかった（図２）。一方、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＭＫ欠損マウスの末梢リンパ節において活性増加が見られた（図３）。
【０１５０】
さらに、磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）によりＣＤ４陽性Ｔ細胞を純化し（＞９５％ ＣＤ４陽性cells）、ＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）存在下で培養し、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率をフローサイトメトリーにより求めた。具体的には、野生型マウスおよびＭＫ欠損マウスに対し、初日に実施例２と同様にマイクロ浸透圧ポンプを用いて１ｍｇ／ｍｌのＭＫまたはＰＢＳを投与し、さらに２００μｇ／マウスのＭＯＧ３５−５５を初日および２日後に投与した。臨床症状のピーク時にマウスの脾細胞からＣＤ４陽性Ｔ細胞を純化し、該細胞（ウェルあたり２×１０５個）を、in vitroにおいてＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）および抗原提示細胞（antigen presenting cell：以下ＡＰＣ、５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで３７℃３０分処理した正常マウスの脾臓細胞、ウェルあたり５×１０６個）存在下で４日間培養した。４日後に、ＦＡＣＳによりＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の発現を解析した。また、ＣＤ４マイクロビーズにより精製されたＣＤ４陽性Ｔ細胞のｃＤＮＡを調製し、Foxp3 mRNAレベルを決定するためにリアルタイムＲＴ−ＲＣＲにより解析を行った。
その結果、ＭＫ欠損マウスにＭＫを投与することで、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の発現が抑えられることが明らかとなった（図４）。
【０１５１】
以上の結果より、本モデル動物における臨床症状の軽減は、疾患を誘導するＣＤ４陽性細胞の変化ではなく（図２）、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性の調節性Ｔ細胞の増加が関与していることが明らかとなった（図３、４）。
【０１５２】
〔実施例５〕ＭＫ添加による、ＭＫ欠損マウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動
態への影響の解析
次に、０、２０、１００ｎｇ／ｍｌのＭＫの存在下、ＭＫ欠損マウスの脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、実施例４と同様の方法で、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率、およびFoxp3 mRNAの発現を解析した。
その結果、添加ＭＫの濃度の増大に伴い、ＭＫ欠損マウスにおいてＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率および発現が低下することが明らかとなった（図５）。
【０１５３】
〔実施例６〕ＭＫ欠損マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの解析
ＥＡＥは１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）により誘導される疾患であるので、ＭＫ欠損マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスを検討し、ＭＫのＴｈ１／Ｔｈ２バランスに対する効果についても検討を行った。
具体的には、ＥＡＥ臨床症状のピーク時にマウスの脾細胞からＣＤ４陽性Ｔ細胞を純化し、該細胞（ウェルあたり２×１０５個）を、in vitroにおいてＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）およびＡＰＣ存在下で３日間培養した。培養上澄み中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を、ＥＬＩＳＡにより解析した。
その結果、ミッドカイン欠損マウスでは、細胞性免疫を誘導する１型ヘルパーＴ細胞も抑制されることが明らかとなった（図６）。
【０１５４】
〔実施例７〕抗ＭＫ抗体添加による、ＥＡＥモデルマウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動態への影響のin vitro解析
マウス抗ヒトＭＫモノクローナル抗体の作製
（ＭＫ遺伝子ノックアウトマウスの作製）
ＭＫ遺伝子ノックアウトマウスは、公知の方法（特開２００２−８５０５８号公報、Nakamura, E. et al. :Genes Cells 3, p.811-822.）により作製した。
【０１５５】
（抗原の作成）
ヒトＭＫｍＲＮＡを、ウィルムス腫瘍由来の培養株細胞Ｇ−４０１より調整した（Tsutsui, J. ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 792-797, 1991）。プライマーとして、制限酵素ＥｃｏＲＩに認識される配列（5’-GAATTC-3’）を含むように設計した、センスＰＣＲプライマー：5’-GCGGAATTCATGCAGCACCGAGGCTTCCTC-3’（配列番号：４）、及び、アンチセンスＰＣＲプライマー：5’-GCGGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCCCTTT-3’（配列番号：５）を用い、ヒトＭＫｍＲＮＡを鋳型として、９３℃→３７℃→７２℃の温度変化を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行い、ＭＫコーディング領域の両端にＥｃｏＲＩ認識部位をもつヒトＭＫｃＤＮＡを調製した。
ＭＫｃＤＮＡ及び酵母ピキア・パトリスＧＳ１１５（Pichia pastoris GS115、以下、「ピキア酵母ＧＳ１１５」という）用発現ベクターｐＨＩＬ３０１（ヒスチジン及びネオマイシン耐性遺伝子含有、特開平２−１０４２９２号、欧州特許公開０３３９５６８号公報参照）を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて結合させ、組み換え発現ベクターを作製した。
エレクトロポレーション法を用いて、上記で調製した組み換え発現ベクターをピキア酵母ＧＳ１１５（インビトロゲン社）へ導入した。ベクターを導入したピキア酵母ＧＳ１１５を、ヒスチジンを含まない、Ｇ４１８含有培地で培養することにより、目的のＭＫ遺伝子を持つ複数のクローンを得た。得られたクローンを、メタノールで誘導しながら培養を行った。培養上清を採取し、ウサギ抗マウスＭＫポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット解析を行うことにより、当該クローンがＭＫを分泌するかどうか確認した。
誘導により、培養上清中にＭＫを分泌するクローンの１つをＴ３Ｌ−５０−４Ｐと名付け、このクローンを培養した（特開平７−３９８８９号公報参照）。培養上清からＭＫの分泌産物を回収し、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンカラムを使用したアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、高純度ＭＫを得た。
【０１５６】
（免疫）
抗原をＭＫノックアウトマウスに免疫した。抗原の調整はマウス１匹あたり１０μｇを生理食塩水で０．１ｍｌに希釈したものを抗原溶液とし、ＦＣＡ０．１ｍｌと混合し乳化させマウスの背皮に皮下投与した。２週間毎に８回免疫操作をした。８回目の免疫は抗原溶液のまま１０μｇを生理食塩水０．１ｍｌに溶解し、マウス尾静脈に静脈注射した。
４回免疫後６日目と、６回免疫後８日目に、マウスの眼底から採取した血清を用いて、血中抗体価をＥＬＩＳＡ法にて調べた。
ＥＬＩＳＡ法は、以下の方法により行った。まず、抗原溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）で、１．０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、５０μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌアッセイプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製、３５３９１２）に分注して４℃で一晩静置して抗原を固相化させた。０．０５％Tween-PBSで３回洗浄後、ブロックエース（大日本製薬製）４倍希釈を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、３７℃で２時間静置してブロッキングを行った。０．０５％Tween-PBSで３回洗浄後、培養上澄原液を５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間静置した。０．０５％Tween-PBSで３回洗浄後、２次抗体として、ブロックエースで１０倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ ＨＲＰ標識（Goat anti-Mouse IgG+IgM HRP conjugate）（BIOSOUCE社製、AMI3704）１００００倍希釈を５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間静置した。０．０５％Tween-PBSで３回洗浄後、ＨＲＰ基質（基質液（クエン酸一水和物 １０．２０６ｍｇ／ｍｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水 ３６．８２mg/ml in distilled Ｈ２Ｏ）２５ｍｌ、ＯＰＤ １０ｍｇ、３０％Ｈ２Ｏ２ ５μｌ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、室温、遮光した状態で２０分間静置した。１Ｎ硫酸５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて反応を停止させ、４９２ｎｍの波長で測定した。
６回免疫後８日目に行なったＥＬＩＳＡ法で十分な抗体価があったので追加で２回免疫した３日後に細胞融合を行なった。
【０１５７】
（細胞融合）
マウスを捕定し胸部をアルコール綿で拭き、２．５ｍｌのシリンジと２３Ｇの針を用いて心臓採血を行った。採血した後、マウスを消毒用アルコール２０ｍｌの入ったビーカーに３分間程度入れた。採血した血液は１．５ｍｌチューブに入れ３７℃で１時間放置した後、４℃で一晩放置し、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を他の１．５ｍｌチューブに移し０．０５％アジ化ナトリウムを加え４℃で保存した。
採血したマウスの上皮をはさみとピンセット用いて剥がした。さらに、内皮を持ち上げ切込みをいれて脾臓を取り出した。あらかじめシャーレ５枚に分注しておいた２００ｍｌのRPMI1640 S.P培地で順に５回洗浄した。洗浄後、脾臓をメッシュに乗せハサミで数回切込みを入れ、ガラス棒ですり潰し、RPMI1640 S.P培地で網を洗い、４０ｍｌのガラス遠沈管に脾臓細胞を集めた。集めた脾臓細胞は１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで吸い上げ、RPMI1640 S.P培地を４０ｍｌ入れ１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた秘蔵細胞にRPMI1640 S.P培地を４０ｍｌ加えよく攪拌し、血球計算版で細胞数を計測した。
シャーレに入っているミエロ―マ細胞（Ｐ３Ｕ１）を、ピペットを用いて数回吹きつけ、５０ｍｌの遠沈管に集めた。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで除きRPMI1640 S.P培地を４０ｍｌ加え、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られたミエローマ細胞にRPMI1640 S.P培地を４０ｍｌ加えてよく攪拌し、血球計算版で細胞数を計測した。
上述の細胞数の計測の結果を基に、脾臓細胞５に対してミエローマ細胞１となるよう、脾臓細胞が入っていた５０ｍｌのガラス遠沈管にミエローマ細胞を入れた。混合した後、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄を吸引ピッペットで吸い取りタッピングをした。タッピング後、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）１ｍｌを、１分間かけて混合しながらゆっくり添加し、そのまま、２分間混合する。ＰＥＧの混合後、あらかじめウォーターバスに入れ３７℃に加温しておいたRPMI1640 S.P培地１ｍｌを、１分間かけて混合しながらゆっくり添加した。これを３回繰り返した。その後、３７℃に加温しておいたRPMI16
40 S.P培地１０ｍｌを、３分間かけて混合しながらゆっくり添加した。培地添加後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５分間加温した後、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで吸いタッピングをした。
タッピング後、（細胞を播種するプレートの枚数）×１０ｍｌのRPMI1640 S.P 15%FCS HAT培地を吹き付け、８連のマイクロピッペット（各１００μｌ）と専用の受け皿を使い、イエローチップを用いて９６ｗｅｌｌプレートに細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７日〜１４日培養し、コロニーの成長具合を見てＥＬＩＳＡで抗体作成能をスクリーニングした。
【０１５８】
（抗ＭＫ陽性抗体産生ハイブリドーマの選択）
細胞融合から１０日後、９６ｗｅｌｌ培養プレートの上清を使用しＥＬＩＳＡ法にて優位に吸光度の高い１２ｗｅｌｌをクローニング用サンプルとした。ハイブリドーマの細胞数を数え、９６ｗｅｌｌ培養プレートの３列に５ cells/well、３列に１ cell/well、２列に０．５ cells/wellとなるようにハイブリドーマ細胞を播種した。また、各ｗｅｌｌにフィダー細胞を１×１０６cells/wellとなるように播種した。クローニング後５日目にコロニーカウントを行い、コロニーが１個であるｗｅｌｌを確認し、２〜３日毎に培地を交換し、コロニーがｗｅｌｌの１／３をしめてきたところでＥＬＩＳＡ法を用いてコロニーが１個で陽性反応を示すｗｅｌｌを選択し、コロニー１個でＥＬＩＳＡにおいて陽性であり、かつ細胞の状態が良好なｗｅｌｌから得られた細胞を樹立株（ＩＰ−１３）とした。
次に、上述の方法で得られた抗ＭＫ抗体（ＩＰ−１３）が、ＭＫのＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞増殖抑制活性を阻害するかどうか、実施例４と同様な方法を用いて調べた。ＥＡＥ臨床症状がピークとなった野生型マウスの脾臓からＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離し、ＩＰ−１３（３０μｇ／ｍＬ）、ＭＯＧ３５−５５（３０μｇ／ｍｌ）およびＡＰＣ存在下で培養した。培養５日後にＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の割合をフローサイトメーターを用いて測定した。コントロールとしてＩＰ−１３抗体の代わりにＩｇＧを用いた実験も平行しておこなった。
その結果、コントロール実験でＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の存在割合が２％であったのに対し、ＩＰ−１３を加えた実験ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の存在割合が４％と上昇していることがわかった。以上より、抗ＭＫ抗体を用いることで、ＭＫのＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞増殖抑制活性を阻害することができることが示された（図７）。
【０１５９】
〔実施例８〕抗ＭＫ抗体添加による、ＥＡＥモデルマウスにおける臨床症状変化の観察
実施例１の方法により実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導したＥＡＥ臨床症状の野生型マウスに対して、抗ＭＫ抗体を投与し、その臨床症状を観察した。
まず、野生型ＥＡＥモデルマウス（Ｃ５７ＢＬ−６，♀、８週令）に対して、ＭＯＧ３５−５５投与後０日目，３日目，７日目，１０日目，１４日目，１７日目，２１日目，２４日目（合計８回）に、抗ＭＫ抗体（ＩＰ１４）の投与を行った。マウスを４つの群に分け（一群の匹数：５）、マウス重さ（ｋｇ）あたり、それぞれ７５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０ｍｇ／ｋｇ（コントロール）の量の抗ＭＫ抗体を尾静脈投与した。次に、６段階の臨床スコア（０：症状なし、１：尾が垂れる、２：仰向けにして起き上がれない、３：不安定歩行、４：軽度の後肢麻痺、５：重度の後肢麻痺、６：死亡）で毎日臨床スコアを付け、臨床症状の評価を行った。
その結果、抗ＭＫ抗体を投与したマウス群において、臨床症状の軽減が見られた（図８）。具体的には、ＭＯＧ３５−５５の免疫接種後、抗ＭＫ抗体を投与したマウス群においては、発病開始の遅れ、疾病重症度の軽減が見られた。
【０１６０】
〔実施例９〕ＭＫアプタマーを用いたＥＡＥモデルマウスの発症抑制実験
実施例１の方法により実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した野生型マウスにＭＫアプタマーを投与し、ＥＡＥ発症抑制効果を観察した。
ＭＫに特異的に結合するアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。得られたアプタマーのうち、１つを、化学合成できる長さまで短くした。また、化学修飾を加えることでヌクレアーゼ耐性を向上させたアプタマーＡを得た。
アプタマーＡがヒトＭＫの細胞遊走活性を阻害するか、ラットの骨芽細胞前駆細胞であるＵＭＲ１０６細胞（ATCC No. CRL1661）を用いて調べた。ケモタキセル（膜孔径８μｍ、クラボウ社製）の膜外面に１．５μＭのＭＫを３０μＬ塗布し、膜外面にＭＫを固定化した。アプタマー５００ｎＭを含む５００μＬの培地（０．３％ウシ血清アルブミン添加、Dulbecco’s Modified Eagle’s medium）を添加した２４穴カルチャープレートに、ＭＫを固定化したケモタキセルを設置した。ケモタキセルチェンバー内層にはＵＭＲ１０６細胞を１×１０６cells/mLの濃度で２００μＬ入れ、３７℃で４時間培養した。ケモタキセルチェンバー内層に残存した細胞を除去し、ＭＫ塗布面に浸潤し接着した細胞をメタノールで固定した。ケモタキセルチェンバーを１％クリスタルバイオレット水溶液に３０分間浸して細胞を染色した。ケモタキセルチェンバーを蒸留水で洗浄、乾燥した後、２００μＬの１％ＳＤＳと１％tritonX100の混合液で色素を抽出した。抽出液の１５０μＬを９６穴マイクロプレートに移し、５９０ｎｍの吸光度を測定した。測定の結果、アプタマーＡは強い細胞遊走阻害活性を有していることがわかった。アプタマーを添加しない場合に移動した細胞の数を１００とした場合、アプタマーＡを添加したときに移動した細胞の数は約２．３であり、９８％の阻害活性が確認された。一方、コントロールとして用いたＲＮＡは阻害活性を示さなかった。
アプタマーＡがＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の増殖に関与するかどうか調べた。実験は実施例７と同様におこなった。ＭＯＧ処理後４週目のＥＡＥ臨床症状を示したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓よりＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離し、該細胞（ウェルあたり２×１０５個）を、in vitroにおいてＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）およびＡＰＣ存在下でアプタマーＡを添加し、３日間培養した。ＦＡＣＳによりＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の発現を解析した。さらに細胞内Ｆｏｘｐ３を抗マウスＦｏｘｐ３染色セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いＣＤ４陽性細胞を同時染色しフローサイトメトリーにより検出した。実験の結果、コントロールとしてＰＢＳを添加した系ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の存在割合が６．２％であったのに対して、アプタマーＡを１２５ｎＭ添加した系ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の存在割合は１１％であり、アプタマーを加えることでＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の割合が増加することが確認された。また、調節性Ｔ細胞の発生や分化に関係しているＦｏｘｐ３の発現を調べたところ、コントロールとしてＰＢＳを添加した系ではＣＤ４陽性細胞のうち２５％の細胞で発現が確認されたのに対し、アプタマーＡを１２５ｎＭ添加した系では３３％と増加していた。以上より、アプタマーＡを加えることでＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が増加することが示された。
アプタマーＡを用いてＥＡＥモデルマウスの発症抑制実験をおこなった。８週令のマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６、♀）にＭＯＧを処理したＥＡＥモデルマウスを用い、ＭＯＧ処理日より、２日に１回の間隔で計１０回、それぞれ１５ｍｇ／ｋｇ，２．５ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ、０ｍｇ／ｋｇ（コントロール）のアプタマーを腹腔内投与した。一群当たりの匹数は５〜６匹とした。観察は毎日行い、次に示す臨床スコアをもとに各個体の臨床症状をスコア化した。０：症状なし、１：尾が垂れる、２：仰向けにして起き上がれない、３：不安定歩行、４：軽度の後肢麻痺、５：重度の後肢麻痺、６：死亡。実験の結果、１５ｍｇ／ｋｇ投与群においてコントロール群に比較しＭＯＧ処理後１５、１６、１７、１８日目においてｐ値が１％以下を示し統計学的な有意差が認められた（図９）。統計学的処理はDunnett検定を用いた。病態発症の遅延効果が、１５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇ投与群で認められた。
以上より、ＭＫ阻害剤であるＭＫに特異的に結合するアプタマーは、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の減少に関連する疾患である多発性硬化症の治療薬として利用可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
ＭＫの発現または活性を抑制することにより、調節性Ｔ細胞が増加することから、本発明は、ＭＫ阻害剤の投与等によりＭＫを阻害することにより、多発性硬化症をはじめとする調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する方法として利用することができる。また、ＭＫ阻害剤は、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤または予防剤として利用することができる。更に、本発明のスクリーニング方法により、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤または予防剤を得ることができる。また、本発明の診断方法は、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を診断する方法として利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミッドカイン阻害剤を有効成分として含有する調節性Ｔ細胞増殖剤および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤に関する。また、ミッドカインを阻害することによる調節性Ｔ細胞増殖方法および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法または予防方法、ミッドカイン阻害剤を投与することからなる調節性Ｔ細胞増殖方法および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法または予防方法、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法に関する。さらに、ミッドカインの発現量を測定する工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミッドカイン（以下ＭＫと記載することもある）はヘパリン結合成長因子ファミリーに属し、レチノイン酸反応性遺伝子の産物として見出された低分子の非糖化タンパク質である。その受容体は受容体型チロシンフォスファターゼζ、ＬＲＰ（low density lipoprotein receptor-related protein）、ＡＬＫ（anaplastic leukemia kinase）インテグリンおよびシンデカンからなる複合体と考えられている。ＭＫは細胞遊走、血管新生に対する作用を持ち、癌化や炎症の誘導にも多様な生物活性を有することが明らかになっている。胃癌、大腸癌、乳癌など多くの癌組織でＭＫが過剰発現していることも報告されている（非特許文献１、２）。一方、ＭＫ欠損マウスでは血管内膜障害がおき、虚血性の腎障害起こることも報告されている（非特許文献３、４）。
【０００３】
近年、ＭＫが炎症細胞の遊走や破骨細胞の分化を引き起こし、リウマチ性疾患においても重要な役割を果たしている可能性が示されたが（非特許文献５、６）、ＭＫの免疫能における役割はいまだ不明である。
【０００４】
種々の病原体に対する生体防御のシステムとしての免疫系の中心的役割を担う細胞群の一つにＴ細胞がある。Ｔ細胞は大別してＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞とＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞に分けられる。ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞は抗原刺激後の特定の分化成熟段階でのサイトカイン産生パターンによって、主にＩＦＮ−γを産生するＴｈ１細胞、ＩＬ−４を産生するＴｈ２細胞などに分類可能である。一般的に前者は細胞性免疫、後者は液性免疫として生体防御に深く関与している。免疫応答はこのような性質の異なるＴ細胞の働きによって巧妙なバランスのもとに病原体の排除や感染抵抗性の獲得に深く関与している。通常健全な免疫応答においては外来の非自己抗原に対してそれを排除する機構が働く。一方、生体を形成する自己抗原に対しては免疫学的寛容が成立しており排除機構は働かない。このように生体は自己と非自己を識別し、非自己のみを排除する機構を備えている。自己免疫疾患はこの免疫学的恒常性が破綻し、自己抗原に対する過剰な免疫応答が原因となっている。
【０００５】
Ｔ細胞レベルにおいて種々の免疫学的寛容が誘導される仕組みが分かっている。一つは、中枢寛容と呼ばれる胸腺における自己反応性Ｔ細胞クローンの排除の機構であり、主要組織適合遺伝子複合体を認識できる細胞だけが生き残れるポジティブセレクションと、胸腺細胞が呈示する自己抗原と強く反応する細胞を排除するネガティブセレクションで構成される。もう一つは末梢寛容と呼ばれる機構による自己反応性Ｔ細胞の胸腺外での制御である。後者には、細胞死の誘導あるいは自己抗原に対する不応答性の誘導と共に、調節性Ｔ細胞による能動的な抑制（非特許文献７）の機構が知られている。
【０００６】
調節性Ｔ細胞とは、近年提唱されたＴ細胞の新たな概念であり、他のＴ細胞に対して抑
制的な作用を有するということによって定義付けられる（非特許文献８）。免疫応答は巧妙なバランスのもとに成り立っており、例えばＴｈ１ 細胞及びＴｈ２ 細胞はお互いに夫々の免疫応答に拮抗的に働き、一方が他方に対する調節性Ｔ細胞として作用する。調節性Ｔ細胞としての細胞集団の存在の検証とその性状解析については依然多くの議論が残されている。このような調節性Ｔ細胞はin vitro又はin vivoにおいて特定の免疫応答を抑制又は調節する機能を有する細胞として研究され、細胞表面マーカーや産生サイトカインの種類や抑制および調節の機構などによって、種々の細胞集団として報告されている（非特許文献９）。
【０００７】
これらの調節性Ｔ細胞の中でも最もよく研究されている細胞集団はＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞集団である。正常なマウスやラットのＣＤ４陽性脾臓細胞からＣＤ２５陽性、ＲＴ６．１陽性、ＣＤ５陽性、ＣＤ４５ＲＢ陽性、ＣＤ４５ＲＣ陽性などの細胞を除去して、残りのＴ細胞をＴ細胞及びＢ細胞不全のＳＣＩＤマウスやラットに移入すると、甲状腺炎、胃炎、インスリン依存性自己免疫糖尿病、大腸炎などの臓器特異的自己免疫疾患が誘導される（非特許文献１０、非特許文献１１）。また、ＣＤ２５陰性ＣＤ４陽性細胞をヌードマウスに移入すると臓器特異的自己免疫疾患が生じ、末梢ＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞やＣＤ２５・ＣＤ４陽性ＣＤ８陰性胸腺細胞を共に移入すると発症が抑制される。これらの実験より、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が自己寛容維持に極めて重要な役割を果たしていることがわかってきた。
【０００８】
ヒトにも同様なＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が存在することが知られている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。ヒト末梢血から分離されたＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ陽性のメモリーＴ細胞マーカーを発現しており、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞と比較してＨＬＡ−ＤＲなどの活性化マーカーの発現が高い。また細胞内には定常的にＣＴＬＡ−４を発現しており、刺激によりその発現が上昇する。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体刺激、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激、同種異系の成熟樹状細胞による刺激などでは、ＤＮＡ合成及びサイトカインの産生は見られず、抗原刺激に対する不応答状態となっている。抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５などのサイトカインを加えることで、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のＤＮＡ合成能は高まるが、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞のＤＮＡ合成能は変わらない。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞存在下にＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体又は同種異系の成熟樹状細胞によって刺激した場合、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞非存在下と比較してＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞細胞数依存的な増殖抑制作用が見られる。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞はＩＬ−１０やＴＧＦβ１のような抑制性のサイトカインを産生する能力があるが、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞に対する増殖抑制作用は、これらサイトカインに対する中和抗体では解除されないこと、抑制作用にはＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞とＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の直接的細胞間接触が必要であることが報告されている。このようにヒトにおいてもＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の存在が報告され性状解析が進んでいるが、その詳細な分化機構や抑制作用機構の解明は途上にある。
【０００９】
マウスおよびヒトにおいて、ＩＬ−１０存在下での同種異系の抗原刺激や同種異系の未成熟樹状細胞による繰り返し刺激によって誘導される調節性Ｔ細胞についても報告されている（非特許文献１８、非特許文献１９）。これらの細胞は、Ｔｈ１，Ｔｈ２ 細胞とは異なり大量のＩＬ−１０を産生するものの、ＴＧＦ−β１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５の産生は高くなく、低レベルのＩＬ−２を産生し、ＩＬ−４を産生しないことを特徴としており、Ｔｒ１細胞と呼ばれている。Ｔｒ１細胞もＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞と同様に不応答状態であるが、Ｔ細胞抑制機構は産生されるＩＬ−１０やＴＧＦ−β１によって一部説明可能である。しかしながら、Ｔｒ１細胞とＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が全く異なるＴ細胞サブセットであるのか、或いは分化活性化段階の異なる同一の細胞である
かについては不明な点が多い。
【００１０】
Ｘ染色体性劣性遺伝を示すＩＰＥＸと呼ばれる遺伝病では、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎など臓器特異的自己免疫疾患、炎症性腸炎、アレルギーが高率に発症する。その原因遺伝子はＦＯＸＰ３であると考えられている。Ｆｏｘｐ３はＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞に選択的に発現していることが知られている。また、他のＴ細胞にこの遺伝子を発現させると、機能的にＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞に転換できる。さらに、この遺伝子の異常を持つマウスは重篤な自己免疫病変を発症するが、正常マウスから調整したＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞を移入すれば発症を阻止できる（非特許文献２０）。
【００１１】
ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞は多発性硬化症と深く関係していることがわかっている。再発寛解型多発性硬化症の患者ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が顕著に減少している（非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３）。また、多発性硬化症のモデルと考えられている実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルマウスを用いた実験では、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞がミエリンオリゴデンドロサイトグリコプロテイン（ＭＯＧ）に対するＴ細胞の増殖およびＩＦＮ−γの産生を抑制すること、および、ＥＡＥの発症を抑制することが報告されている（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）。重症筋無力症はＣＤ４陽性Ｔ細胞依存の自己免疫疾患と考えられており、重症筋無力症の患者ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の機能異常およびＦＯＸＰ３の発現低下が報告されている（非特許文献２７）。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）またはクローン病とも関係している。ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞を免疫不全マウスに移入するとＴｈ１細胞に起因する腸炎を引き起こす。一方、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈＴ細胞と一緒にＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞を移入すると腸炎は起こらない（非特許文献２８、非特許文献２９）。関節リウマチ（ＲＡ）や全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）とＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の関係に関しても多くの研究が行われている。２３人のＳＬＥ患者（１９人がactive、４人がinactive）、１５人のＲＡ患者、２７人の健常者の末梢血中の調節性Ｔ細胞の分析をおこなったところ、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の数はＳＬＥ患者、ＲＡ患者、健常者で変わらなかったが、ＳＬＥ患者とＲＡ患者は健常者と比べて抑制機能が大きく低下していたことが報告されている（非特許文献３０）。この他、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞はＩ型糖尿病（非特許文献３１）、移植時の拒絶反応（非特許文献３２）、癌（非特許文献３３）などと関係することがわかっている。
【００１２】
ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞は、末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞の５〜１０％を占めるに過ぎない希少細胞集団であり、活性化刺激に対して不応答状態である。抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５などのサイトカインを加えることで細胞増殖を促すことが可能である。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞を増やすことで自己免疫疾患、移植、アレルギーなどの治療への応用が期待される。
【００１３】
多発性硬化症（以下ＭＳと記載することもある）は中枢神経系に炎症性脱髄を引き起こす自己免疫疾患であり、種々の免疫系細胞の関与が想定されているが、その本態はいまだ明らかにされていない。近年、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４・ＣＤ２５・Ｆｏｘｐ３陽性Ｔ細胞）がＭＳの病態を抑制的に調節していることが示された。ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞は免疫寛容を維持することにより、自己免疫発現を調節している。そのため、この細胞の機能異常が種々の自己免疫疾患の発症に関与していると考えられているが、本機構の詳細については未だ解明されていない。
【００１４】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Tsutsui, J., et al., Cancer Res., 53, 1281-1285 (1993)
【非特許文献２】Kadomatsu, K., et al., Brit. J. Cancer, 75, 354-359 (1997)
【非特許文献３】Horiba, M., et al., J. Clin. Invest., 105, 489-495 (2000)
【非特許文献４】Sato, W., et al., J. immunol., 167, 3463-3469 (2001)
【非特許文献５】Takada T., et al., J.Biochem, 122(2), 453-458 (1997)
【非特許文献６】Maruyama K., et al., Arthritis Rheum., 50(5), 1420-1429 (2004)
【非特許文献７】Shevach, E.M. 2000. Annu. Rev. Immunol. 18:423-449.
【非特許文献８】McGuirk P., et al., TRENDS in Immunol. 23, 450-455 (2002)
【非特許文献９】Roncarolo, M.G., and M.K. Levings. 2000. Curr. Opinion. Immunol. 12:676-683.
【非特許文献１０】Sakaguchi, S., et al., 1985. J. Exp. Med.161:72
【非特許文献１１】Itoh, M.,et al., 1999. J. Immunol. 162:5317-5326.
【非特許文献１２】Jonuleit, H.et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1285-1294
【非特許文献１３】Levings, M. K. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1295-1301
【非特許文献１４】Dieckmann, D. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1303-1310
【非特許文献１５】Taama, L. S.et al., 2001. Eur. J. Immunol. 31:1122-1131
【非特許文献１６】Stephens, L. A. et al., 2001. Eur. J. Immunol. 31:1247-1245
【非特許文献１７】Baecher-Allan, C. et al., 2001. J. Immunol. 167:1245-1253.
【非特許文献１８】Groux, H. et al.,1997.Nature.389:737-742
【非特許文献１９】Jonuliet, H. et al., 2000. J. Exp. Med.192:1213-1222.
【非特許文献２０】坂口志文、２００３、実験医学２１：２１６４−２１６８
【非特許文献２１】Viglietta et al., 2004, J. Exp. Med. 199: 971-979
【非特許文献２２】Haas, et al., 2005, Eur. J. Immunol. 35: 3343-3352
【非特許文献２３】Huan et al., 2005, J. Neurosci. Res. 81: 45-52
【非特許文献２４】Furtado et al., 2001, Immunol. Rev. 182: 122-134
【非特許文献２５】Hori et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 8213-8218
【非特許文献２６】Kohm et al., 2002, J. Immunol. 169: 4712-4716
【非特許文献２７】Balandina et al., 2005, Blood 105, 735-741
【非特許文献２８】Coombes et al., 2005, Immunol. Rev. 204: 184-194
【非特許文献２９】Read et al., 2000, J. Exp. Med. 192: 295-302
【非特許文献３０】Alvarado-Sanchez et al., 2006, J. Autoimmunity 27, 110-118
【非特許文献３１】Green et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 10878-10883
【非特許文献３２】Dai et al., 2004, J. Clin. Invest. 113, 310-317
【非特許文献３３】Wei et al., 2004, Cancer Immunol Immunother 53: 73-78
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＭＫ阻害剤を有効成分として含有する調節性Ｔ細胞増殖剤を提供することにある。また、ＭＫ阻害剤を含有する調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤を提供することにある。さらに、ＭＫの発現または活性を阻害し、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法の提供も課題とする。さらにＭＫの発現量を測定する工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法の提供も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ＭＫ欠損マウスにおいて、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が増加していること、ＭＫを投与することによりＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が減少するこ
とを発見した。また、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル（以下ＥＡＥと記載することもある）における研究において以下のような結果を得た。
【００１７】
まず、ＭＫ欠損マウスにおいてＥＡＥを誘導し、その病態を観察したところ、臨床症状の軽減が見られた（図１）。また、本効果はＭＫを投与することにより、消失することも明らかとなった（図１）。
【００１８】
次に、該ＥＡＥモデル動物におけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の動態を検索して、ＭＫのＥＡＥ発現やＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の機能に対する役割を検討した。また同時に、ＥＡＥは１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）により誘導される疾患であるので、ＭＫ欠損マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスを検討し、ＭＫのＴｈ１／Ｔｈ２バランスに対する効果についても検討を行った。
【００１９】
その結果、本モデル動物における臨床症状の軽減は、疾患を誘導するＣＤ４陽性細胞の変化ではなく（図２）、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性の調節性Ｔ細胞の増加が関与していることが明らかとなった（図３、４）。また、ＭＫ欠損マウスにＥＡＥを誘導すると、野生型に比較してＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞は増加しているが、ＭＫを添加することにより、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞が減少することが明らかとなった（図５）。さらに、これらＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の増加により、細胞性免疫を誘導する１型ヘルパーＴ細胞も抑制されることが明らかとなった（図６）。
【００２０】
次に、ＭＫ阻害剤の１つである抗ＭＫ抗体投与による、ＥＡＥモデルマウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動態への影響の解析を行った。その結果、ＭＫ阻害剤の投与により、臨床症状の軽減が見られた（図８）。具体的には、ＭＯＧ３５−５５の免疫接種後、抗ＭＫ抗体を投与したマウス群においては、発病開始の遅れ、疾病重症度の軽減が見られた。（図８）。
さらに、ＥＡＥモデルマウスに、ＭＫ阻害剤であるＭＫアプタマーを投与し、その臨床症状を観察した。その結果、抗ＭＫ抗体投与と同様にＥＡＥモデルマウスの臨床症状の軽減がみられた。（図９）。
【００２１】
即ち、本発明者らは、ＭＫには調節性Ｔ細胞の増殖および機能を抑制する作用があり、ＭＫの発現または活性を抑制することにより、それらの抑制を解除することができることを発見し、これにより本発明を完成するに至った。
【００２２】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔２０〕を提供するものである。
〔１〕ＭＫ阻害剤を有効成分として含有する、調節性Ｔ細胞増殖剤。
〔２〕ＭＫ阻害剤が、抗ＭＫ抗体、ＭＫに対するアプタマー、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡから選択されるＭＫ阻害剤である〔１〕に記載の調節性Ｔ細胞増殖剤。
〔３〕ＭＫ阻害剤が、抗ＭＫ抗体又はＭＫに対するアプタマーである〔１〕に記載の調節性Ｔ細胞増殖剤。
〔４〕ＭＫ阻害剤を有効成分として含有する調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
〔５〕ＭＫ阻害剤が、抗ＭＫ抗体、ＭＫに対するアプタマー、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡから選択されるＭＫ阻害剤である〔４〕に記載の調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
〔６〕ＭＫ阻害剤が、抗ＭＫ抗体又はＭＫに対するアプタマーである〔４〕に記載の調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
〔７〕調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、甲状腺異常、炎症性腸炎、１型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは筋萎縮性側索硬化症である〔４〕から〔６〕
のいずれか１項に記載の治療剤又は予防剤。
〔８〕調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が、多発性硬化症である〔４〕から〔６〕のいずれか１項に記載の治療剤。
〔９〕ＭＫを阻害することによる、調節性Ｔ細胞の増殖方法。
〔１０〕ＭＫ阻害剤を投与することからなる調節性Ｔ細胞の増殖方法。
〔１１〕調節性Ｔ細胞増殖剤の製造のためのＭＫ阻害剤の使用。
〔１２〕ＭＫを阻害することによる、調節性Ｔ細胞の機能異常に基く疾患の治療方法または予防方法。
〔１３〕ＭＫ阻害剤を投与することからなる調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法または予防方法。
〔１４〕調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患治療剤または予防剤の製造のためのＭＫ阻害剤の使用。
〔１５〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＭＫの発現と結合することにより、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。（ａ）ＭＫに被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＭＫと被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＭＫと結合する被検化合物を選択する工程
〔１６〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＭＫの発現を阻害することにより、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。（ａ）ＭＫ遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＭＫの発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該ＭＫの発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
〔１７〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、ＭＫの発現を抑制を阻害することにより調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）ＭＫをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させた被検化合物を選択する工程
〔１８〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ＭＫの活性を抑制し調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法。
（ａ）ＭＫを発現する細胞に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該細胞におけるＭＫの活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下させた被検化合物を選択する工程
〔１９〕ＭＫの発現量を測定する工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法。
〔２０〕ミッドカインと結合する物質を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査薬。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、ＭＫ欠損マウス、ＭＫを投与したＭＫ欠損マウスにおける臨床症状の観察結果を示す図である。免疫接種後２５日までの全動物の平均値を示す。Kaplan-Meier法に従って曲線を描画した。
【図２】ＭＯＧ３５−５５接種後の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）およびＭＫ欠損マウスの末梢リンパ節におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率を示す図である。Ａ：野生型マウスおよびＭＫ欠損マウスの脾臓、腸管膜リンパ節、膝下リンパ節における、in vivo ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞の比率を示す図である。Ｂ：上記３部位における全単核細胞中のＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を示す図である。値をmean±SEMで示す。Ｐ値はスチューデントｔ−検定により算出した。
【図３】ＭＯＧ３５−５５接種後の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）およびＭＫ欠損マウスの末梢リンパ節におけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率を示す図である。Ａ：野生型マウスおよびＭＫ欠損マウスの脾臓、腸管膜リンパ節、膝下リンパ節における、in vivo ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の細胞蛍光特性を示す図である。Ｂ：上記３部位における全単核細胞中のＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の割合を示す図である。値をmean±SEMで示す。Ｐ値はスチューデントｔ−検定により算出した。
【図４】自己免疫性脳脊髄炎モデル動物におけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の動態を示す図である。Ａ：野生型マウス、ＭＫ欠損マウス、ＭＫを投与したＭＫ欠損マウスの各群の脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、該細胞の比率を調べた結果を示す図である。Ｂ：各群の脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、Foxp3 mRNAの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。標準ＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるFoxp3 mRNA発現に対する相対値を示す。
【図５】ＭＫ添加による、ＭＫ欠損マウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動態への影響を示す図である。Ａ：各群の脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性の比率を調べた結果を示す図である。ＣＤ４陽性部分にゲートをかけＣＤ４陽性細胞のみを解析した。Ｂ：各群の脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、Foxp3 mRNAの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。GAPDH mRNA発現に対するFoxp3 mRNAとの相対値を示す。
【図６】ＭＫ欠損マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスを示す図である。マウスの脾細胞から純化し、ＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）存在下で培養したＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養上清におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在量を示す図である。値を５匹のマウスのmean±SEMで示す。γ軸の単位はｐｇ／ｍｌ。Ｐ値はスチューデントｔ−検定により算出した。
【図７】抗ＭＫ抗体添加による、ＥＡＥモデルマウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動態への影響の解析結果を示す図である。抗ＭＫ抗体（ＩＰ−１３）およびコントロール抗体（ＩｇＧ）の存在下、ＥＡＥ誘導マウスの脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞を３０μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５およびＡＰＣにより５日間刺激後、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率を検出した。
【図８】抗ＭＫ抗体添加による、ＥＡＥモデルマウスにおける臨床症状変化の観察結果を示す図である。野生型ＥＡＥモデルマウス（Ｃ５７ＢＬ−６，♀、８週令）に対して、ＭＯＧ３５−５５投与の０，３，７，１０，１４，１７，２１，２４日目に（合計８回）、抗ＭＫ抗体（ＩＰ１４）の投与を行った。マウスを４つの群に分け（一群の匹数：５）、マウス重さ（ｋｇ）あたり、それぞれ７５ｍｇ／ｋｇ（黒菱形）、７．５ｍｇ／ｋｇ（黒四角）、０．７５ｍｇ／ｋｇ（黒三角）、０ｍｇ／ｋｇ（×、コントロール）の量の抗ＭＫ抗体を尾静脈投与した。Ｙ軸は臨床スコア（０：症状なし、１：尾が垂れる、２：仰向けにして起き上がれない、３：不安定歩行、４：軽度の後肢麻痺、５：重度の後肢麻痺、６：死亡）の平均値を表す。
【図９】ＭＫアプタマー添加による、ＥＡＥモデルマウスにおける臨床症状変化の観察結果を示す図である。野生型ＥＡＥモデルマウス（Ｃ５７ＢＬ−６，♀、８週令）に対して、ＭＯＧ３５−５５投与後２日に１回の間隔で計１０回、それぞれ１５ｍｇ／ｋｇ（黒四角），２．５ｍｇ／ｋｇ（黒三角），０．２５ｍｇ／ｋｇ（×）、０ｍｇ／ｋｇ（菱形、コントロール）のアプタマーを腹腔内投与した。Ｙ軸は臨床スコア（０：症状なし、１：尾が垂れる、２：仰向けにして起き上がれない、３：不安定歩行、４：軽度の後肢麻痺、５：重度の後肢麻痺、６：死亡）の平均値を表す。＊＊：ｐ＜１％。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明者らは、ＭＫには調節性Ｔ細胞の増殖および機能を抑制する作用があり、ＭＫの活性または発現を抑制することにより、それらの抑制を解除することができることを見いだした。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００２５】
本発明は、ＭＫ阻害剤を含有する調節性Ｔ細胞増殖剤および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤または予防剤に関する。
【００２６】
本発明において「ＭＫ阻害剤」とは、ＭＫの発現を阻害する物質であってもよいし、ＭＫの活性を阻害する物質であってもよい。ＭＫ阻害剤は、好ましくはＭＫまたはＭＫ受容体の結合に対する阻害作用を有する物質である。本発明において、「ＭＫ受容体」としては、受容体型チロシンフォスファターゼζ、ＬＲＰ（low density lipoprotein receptor-related protein）、ＡＬＫ（anaplastic leukemia kinase）およびシンデカンからなる複合体を挙げることができる。本発明の阻害剤は複合体を構成している、各タンパク質の発現や活性を阻害するものであってもよい。
【００２７】
本発明のＭＫ阻害剤の例としては、抗ＭＫ抗体、抗ＭＫ受容体抗体、ＭＫに対するアプタマー、ＭＫに対するアンチセンスＲＮＡ、ＭＫに対するｄｓＲＮＡよびＭＫに対するリボザイムを挙げることが出来る。また、ＭＫ改変体、可溶性ＭＫ受容体改変体あるいはＭＫ又はＭＫ受容体の部分ペプチド等のドミナントネガティブ体および、これらと同様のＭＫ阻害活性を示す低分子物質が挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のＭＫ阻害剤としては、好ましくは抗ＭＫ抗体、ＭＫに対するアプタマー、ＭＫに対するアンチセンスＲＮＡ、ＭＫに対するｄｓＲＮＡ、ＭＫに対するリボザイムを挙げることが出来る。より好ましくは抗ＭＫ抗体、ＭＫに対するアプタマーを挙げることが出来る。
【００２８】
本発明で使用される抗ＭＫ抗または抗ＭＫ受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＭＫまたはＭＫ受容体と結合することにより、ＭＫのＭＫ受容体への結合を阻害してＭＫの生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗ＭＫ抗体としては、公知の文献（Sun XZ, et al., J.Neuropathol Exp Neurol. 56(12), 1339-48 (1997)、Muramatsu H, et al., J. Biochem 119:1171-76 (2004)）に記載の抗体が挙げられる。
【００２９】
抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＭＫまたはＭＫ受容体を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００３０】
具体的には、抗ＭＫ抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＭＫは、公知の文献（Tomomura, M., et al., J. Biol. Chem. 265, 10765-10770 (1990)、Tsutsui, J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 792-797 (1991)、Iwasaki W, et al., EMBO J. 16(23), 6936-46 (1997)）に開示されたＭＫ遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。本発明の方法に使用されるヒト由来のＭＫのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ＤＮＡがコードするＭＫの
アミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００３１】
ＭＫ受容体蛋白質は、本発明で用いられる抗ＭＫ受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、いずれのＭＫ受容体を使用してもよい。本発明においてＭＫ受容体とは、受容体複合体、または複合体の各構成成分（蛋白質）を示すものとする。
【００３２】
ＭＫまたはＭＫ受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＭＫ蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ＭＫ蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、化学合成によって作製したＭＫ蛋白質（Inui, T., et al., J. Peptide Sci. 2, 28-39 (1996)）またはＭＫ受容体蛋白質も感作抗原として用いてもよい。また、ＭＫ蛋白質またはＭＫ受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
【００３３】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
【００３４】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
【００３５】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００３６】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology
(1978) 81, 1-7）、ＮＳ−１（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519）、ＭＰＣ−１１（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 ）、ＳＰ２／０（Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270）、ＦＯ（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21）、Ｓ１９４（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323）、Ｒ２１０（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133）等が適宜使用される。
【００３７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００３８】
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００３９】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この
種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００４０】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００４１】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
【００４２】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５参照）。
【００４３】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００４４】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００４５】
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
【００４６】
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299）、ＡＧＰＣ法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159）等により全ＲＮＡを調製し、mRNA Purification Kit（Pharmacia製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
【００４７】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡ
の合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには5’-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
【００４８】
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
【００４９】
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００５０】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体、ヒト（human）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００５１】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【００５２】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。
【００５３】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；framework region）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。
【００５４】
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
【００５５】
キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。ヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい
。
【００５６】
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
【００５７】
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
【００５８】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【００５９】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
【００６０】
例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）に従えば容易に実施することができる。
【００６１】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043）に従えばよい。
【００６２】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S. P. et al .,J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
【００６３】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマ
ウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００６４】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００６５】
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（baby hamster kidney）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏなど、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌が知られている。
【００６６】
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。
一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
【００６７】
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
【００６８】
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
【００６９】
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(19
94)24, 131-138）。
【００７０】
上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
【００７１】
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、SepharoseF.F.等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
【００７２】
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）に適用し得る。また、逆相ＨＰＬＣ（reverse phase HPLC）を用いてもよい。
【００７３】
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はＥＬＩＳＡ等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、ＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５ＯＤとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＴＡＧ製）１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
【００７４】
洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（BIO SOURCE製）１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
【００７５】
本発明において「アプタマー」とはタンパク質やホルモンなどの各種分子と結合する核酸を意味する。ＭＫアプタマーとはＭＫと結合する核酸を意味する。ＭＫアプタマー阻害剤とはＭＫに結合して、ＭＫとＭＫに結合する分子、例えばＭＫ受容体や細胞外マトリックス、の結合を阻害する核酸を意味する。ＭＫアプタマーはＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、これらのＲＮＡまたはＤＮＡがＭＫに結合するものである限り特に限定はしない。また、リボース、リン酸骨格、核酸塩基、両末端部分に修飾が加えられた核酸であってもよく、これらの核酸がＭＫに結合するものである限り特に限定するものではない。核酸の形態は二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖である。
【００７６】
アプタマーの長さは標的分子に特異的に結合するために必要な長さを有していれば特に限定はしないが、例えば、１０〜２００ヌクレオチド、好ましくは、１０〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜８０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオ
チドのものである。
【００７７】
アプタマーはヌクレオチドで構成されたものだけで治療薬として使用することができるが、他の分子、例えば、ポリエチレングリコール、コレステロール、ペプチド、リポソーム、蛍光色素、放射性物質、毒素、他のアプタマーなどを結合させた形態で使用することもできる。本発明において、「アプタマー」はこのような他の分子を結合させたアプタマーも含まれる。
【００７８】
本発明のアプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選別することができる。限定はしないが、例えば、ＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）（Tuerk, C. and Gold, L., 1990, Science, 249: 505-510）により選別することができる。ＳＥＬＥＸ法は、１０１５程度の異なるヌクレオチド配列をもつ核酸プールを標的物質と混合し、標的物質に結合する、または、より強く結合する核酸を選別してくる方法である。選別された核酸はＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲにより増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、目的のアプタマーを取得することができる。
アプタマーを医薬品として使用する場合、最小化および安定化する必要がある。具体的には、活性に影響しないヌクレオチドを削除することで最小化し、修飾を入れることで安定化する。天然型のＲＮＡの血清中での半減期は数秒であるが、例えば、リボースの２’位をＯ−メチル化し両末端にinverted dTを結合することで、半減期が１週間以上に延びる。
【００７９】
本発明の「ＭＫに対するアンチセンスＲＮＡ」は、ＭＫをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡであり、例えば特開２００２−１４２７７８および特開２００３−０１２４４７公報記載のアンチセンスＲＮＡがあげられる。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
【００８０】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、ＭＫ遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であるものと考えられる。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物
に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００８１】
本発明で用いられる「ＭＫに対するｄｓＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＭＫ遺伝子発現を抑制する二重鎖ＲＮＡを意味し、例えば、特開２００４−２７５１６９記載のｄｓＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡ干渉は、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約４０〜数百塩基対のｄｓＲＮＡが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Dicer）と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、ｄｓＲＮＡを３’末端から約２１〜２３塩基対ずつ切り出し、ｓｉＲＮＡ（short interference RNA）を生じる。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ：RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はｓｉＲＮＡと同じ配列を認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部で標的遺伝子のｍＲＮＡを切断する。また、この経路とは別にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｓＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成される。このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となって、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅する経路も考えられている。
【００８２】
本発明のｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを挙げることができる。「ｓｉＲＮＡ」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味し、例えば、１５〜４９塩基対と、好適には１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。あるいは、発現されるｓｉＲＮＡが転写され最終的な二重鎖ＲＮＡ部分の長さが、例えば、１５〜４９塩基対、好適には１５〜３５塩基対、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。また、ｓｈＲＮＡは、１本鎖のＲＮＡがヘアピン構造を介して２重鎖を構成しているｓｉＲＮＡである。
【００８３】
ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の相同性を有する。
【００８４】
ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
【００８５】
本発明の「ＭＫに対するリボザイム」は、ＭＫの発現や機能に影響を与える、触媒活性を有した核酸を意味し、ＭＫｍＲＮＡを特異的に切断する核酸を含む。
【００８６】
また、ＭＫ活性の一部はＭＫの２量体化を必要とし、この際にはアミノ末端ドメインが関与することから（Kojima, S., et al., J. Biol. Chem., 272, 9410-9416 (1997)）、ＭＫの部分ペプチド（例えば、ＭＫのアミノ末端ドメインの一部）もＭＫ阻害剤として使用することが出来る。
また、ヒトおよびマウスのＭＫ遺伝子の５’上流域には、レチノイン酸受容体の結合部位が存在し、ＭＫはレチノイン酸応答性遺伝子の産物であることから（Matsubara, S., et al., J. Biochem., 115, 1088-1096 (1994)）、レチノイン酸阻害剤もＭＫの阻害剤として用いることが出来る。
また、ウィルムス腫瘍の抑制遺伝子として知られているＷＴ１は、ＭＫプロモーターによる下流の遺伝子の発現を抑えることから（Adachi, Y., et al., Oncogene, 13, 2197-2203 (1996)）、ＷＴ１もＭＫの阻害剤として用いることが出来る。
さらに、ＭＫはＭＫ受容体、コンドロイチン硫酸、ヘパリンなどの分子と強く結合することから（Ueoka, C., et al., J. Biol. Chem. 275, 37407-37413 (2000)、これらの分子およびこれらの分子の一部もＭＫの阻害剤として用いることができる。
【００８７】
さらに、ＭＫの発現または活性を抑制するＭＫ阻害剤は、後述のスクリーニング方法によっても得ることもできる。
【００８８】
本発明において、「調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療または予防」とは、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の症状、および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患において合併して起こる症状を、抑制または予防することを意味する。
本発明において、「調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患」とは、調節性Ｔ細胞の生体内における細胞数の減少に伴う疾患または調節性Ｔ細胞の機能低下に伴う疾患を意味する。本発明の「調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患」として、好ましくは、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の機能異常に伴う疾患である。
【００８９】
調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患としては、多発性硬化症、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、炎症性腸炎、１型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、慢性関節性リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺異常、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変
（ＰＢＣ）、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血炎症性腸炎、クローン病等を挙げることができる。好ましくは、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、炎症性腸炎、１型糖尿病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症または重症筋無力症をあげることができる。本発明においては、多発性硬化症をより好ましい疾患の例として挙げることができる。
これら上記の疾患において、調節性Ｔ細胞の減少に基づくと診断されたものに関しては、本発明の「調節性Ｔ細胞増殖剤」または「調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患治療剤」は特に有効である。
【００９０】
本発明における調節性Ｔ細胞増殖剤および調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤または予防剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる材料が添加されていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の調節性Ｔ細胞の増殖効果または調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療効果を有する材料であってもよいし、当該増殖効果・治療効果を有さない材料であってもよく、上記の増殖剤・治療剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。また、調節性Ｔ細胞の増殖効果または調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療効果を有さない材料であって、ＭＫ阻害剤と併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。
【００９１】
製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。
【００９２】
本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル等のＨＬＢ６〜１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
【００９３】
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
【００９４】
本発明の薬剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
【００９５】
本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等、他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
【００９６】
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭである。
【００９７】
また、本発明の薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
【００９８】
本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
【００９９】
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
【０１００】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
【０１０１】
また、必要に応じ、マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（ “Remington’s Pharmaceutical Science
16th edition”, Oslo Ed., 1980等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も
公知であり、本発明に適用し得る（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277； Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開（ＥＰ）第５８，４８１号； Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556；ＥＰ第１３３，９８８号）。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
本発明は、ＭＫの発現または活性を抑制し調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法に関する。
【０１０３】
本発明の「ＭＫの発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【０１０４】
本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まず、ＭＫに複数の被験化合物を接触させる。
【０１０５】
本発明の方法に使用されるヒト由来のＭＫのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ＤＮＡがコードするＭＫのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、本発明の方法に使用されるＭＫには、上記の公知のＭＫと機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、ＭＫの変異体、アレル、バリアント、ホモログ、ＭＫの部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本発明におけるＭＫの変異体としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることが出来る。また、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のＤＮＡよりコードされるタンパク質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、ＭＫの変異体として挙げることができる。
【０１０７】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。
【０１０８】
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、ＭＫと同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。本発明において、ＭＫの生物学的機能や生化学的機能としては、細胞の増殖促進（繊維芽細胞、ケラチノサイト、または腫瘍細胞の増殖促進）、細胞の生存促進（胎児神経細胞、または腫瘍細胞の生存促進）、細胞の移動促
進（神経細胞、好中球、マクロファージ、骨芽細胞、または血管平滑筋細胞の移動促進）、ケモカインの発現促進、血管新生促進、またはシナプス形成促進等を挙げることができる。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。
【０１０９】
目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、ＭＫの塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、またＭＫ（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＭＫと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうるＭＫと同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。
【０１１０】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件を用いることにより、より相同性の高いＤＮＡの単離を期待することができる。これにより単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％，９６％，９７％，９８％，９９％以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=100、wordlength=12とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=50、wordlength=3とする。ＢＬＡＳＴとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【０１１１】
本発明の方法に使用されるＭＫの由来となる生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。
【０１１２】
第一の態様に用いられるＭＫの状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
【０１１３】
ＭＫの精製は周知の方法で行うことができる。また、ＭＫが発現している細胞としては、内在性のＭＫを発現している細胞、または外来性のＭＫを発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＭＫを発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることが可能である。内在性のＭＫを発現している細胞が由来する生物種としては、特に制限はなく、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。また、上記外来性のＭＫを発現している細胞は、例えば、ＭＫをコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。また
、上記外来性のＭＫを有する細胞は、例えば、ＭＫをコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＭＫが導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
【０１１４】
また、ＭＫが発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＭＫをコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
【０１１５】
本発明の方法における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
【０１１６】
また、本発明において「接触」は、ＭＫの状態に応じて行う。例えば、ＭＫが精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＭＫが発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＭＫが発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
【０１１７】
第一の態様では、次いで、ＭＫと被験化合物との結合を検出する。検出方法としては、特に制限はない。ＭＫと被験化合物との結合は、例えば、ＭＫに結合した被験化合物に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識など定量的測定が可能な標識）によって検出することができる。また、ＭＫに標識剤を結合することもできる。被験化合物またはＭＫを樹脂やチップなどに固定化して結合を検出することもできる。ＭＫへの被験化合物の結合により生じるＭＫの活性変化を指標に検出することもできる。
本態様では、次いで、ＭＫと結合する被験化合物を選択する。選択された化合物にはＭＫの発現または活性を減少させる化合物が含まれ、ＭＫの発現または活性を抑制することによって、結果的に調節性Ｔ細胞の増殖作用および機能促進作用をもち、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１１８】
本発明のスクリーニング方法の第二の態様としては、まずＭＫを発現する細胞に被検化合物を接触させる。
第二の態様では、次いでＭＫの発現レベルを測定する。ＭＫの発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【０１１９】
また、該遺伝子からコードされるＭＫを含む画分を定法に従って回収し、該ＭＫの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＭＫに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実
施し、ＭＫの発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＭＫに対する抗体については、上記に記載したものを用いることが出来る。
【０１２０】
第二の態様では、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該ＭＫの発現レベルを減少させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、ＭＫの発現を減少させる化合物が含まれ、ＭＫの発現を抑制することによって、結果的に調節性Ｔ細胞の増殖作用および機能促進作用をもち、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１２１】
本発明のスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、ＭＫをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
第三の態様において、「機能的に結合した」とは、ＭＫ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＭＫ遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＭＫ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【０１２２】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＭＫをコードするＤＮＡもまた含まれる。
ＭＫをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液は、第一の態様において述べた方法で調製することが可能である。
【０１２３】
第三の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被験試料を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。
【０１２４】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【０１２５】
また、ＭＫ遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、第二の態様に記載された方法で行うことが出来る。
【０１２６】
第三の態様においては、次いで、被検化合物を接触させていない場合と比較して、該レ
ポーター遺伝子の発現レベルを減少または増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、ＭＫ遺伝子の発現レベルを減少させる化合物が含まれ、ＭＫの発現を抑制することによって、結果的に調節性Ｔ細胞の増殖作用および機能促進作用をもち、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１２７】
本発明のスクリーニング方法の第四の態様としては、まず、ＭＫ遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる。
第四の態様では、次いで、上記ＭＫの活性を測定する。ＭＫの活性としては、細胞の増殖促進（繊維芽細胞、ケラチノサイト、または腫瘍細胞の増殖促進）、細胞の生存促進（胎児神経細胞、または腫瘍細胞の生存促進）、細胞の移動促進（神経細胞、好中球、マクロファージ、骨芽細胞、または血管平滑筋細胞の移動促進）、ケモカインの発現促進、血管新生促進、またはシナプス形成促進等を挙げることができる。具体的には、好中球、マクロファージの遊走能の測定、繊維芽細胞の増殖能により間接的にＭＫの活性を測定することができる。次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、上記活性を低下もしくは増加させた被検化合物を選択する。選択された化合物には、ＭＫの活性を低下させる化合物が含まれ、ＭＫの活性を抑制することによって、結果的に調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１２８】
本発明は、ＭＫを発現する細胞において、ＭＫの発現または活性を抑制させる工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する方法に関する。本発明の方法において、ＭＫの発現または活性を抑制することにより、調節性Ｔ細胞を増加させてもよいし、１型ヘルパーＴ細胞を減少させてもよい。
【０１２９】
本発明において、ＭＫ遺伝子の発現または活性を抑制させるための方法としては、ＭＫをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なＲＮＡ、または該転写産物を特異的に開裂するリボザイムの対象への投与を挙げることができる。ＭＫをコードするＤＮＡとしては配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする天然由来のＤＮＡ等も含まれる。
【０１３０】
本発明の「ＭＫの発現を抑制」という記載には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【０１３１】
本発明のＭＫ阻害剤をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。製剤化する場合には、上記に記載の製剤上許容される材料を添加してもよい。
【０１３２】
本発明におけるすべての薬剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗ＭＫ抗体または抗ＭＫ受容体抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．５ｍｇから４０ｍｇ、好ましくは１ｍｇ
から２０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。ＭＫアプタマーの場合には、血中にフリーのアプタマーが存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．１ｍｇから１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇから４０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。
【０１３３】
本発明は、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法に関する。該方法としては、ＭＫを発現する細胞において、ＭＫの発現量を測定する工程を含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査方法を挙げることが出来る。ＭＫの発現量の測定は上記に記載の方法で行うことが可能である。
【０１３４】
ＭＫの発現量が増大した場合には、１型ヘルパーＴ細胞が増大している（ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が減少している）と考えられ、ＭＫの発現量を測定することで調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が発症しているかどうかを検査することが可能であるものと考えられる。
【０１３５】
本発明は、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査薬に関する。
該検査薬における「ＭＫと結合する物質」としては、ＭＫ蛋白質、ＭＫ遺伝子領域、ＭＫｍＲＮＡと結合する物質であれば特に限定はなく、例えば、ＭＫ遺伝子領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはＭＫを認識する抗体を挙げることができる。このような、ＭＫ遺伝子領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとしては、例えば、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを挙げることが出来る。
【０１３６】
本発明の検査薬として使用する、オリゴヌクレオチドには、ポリヌクレオチドが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のＭＫをコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、ＭＫ遺伝子の発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明のＭＫタンパク質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡ等）として使用することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡアレイの基板の形態で使用することができる。
【０１３７】
該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１５ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡまたはその相補鎖の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。また、プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的とし、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【０１３８】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のＤＮＡまたはその相補鎖の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【０１３９】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵
素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【０１４０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【０１４１】
本発明の検査薬として使用する、抗体は上記のＭＫを認識する限り特に限定されないが、特異的にＭＫを認識する抗体であることが好ましい。抗ＭＫ抗体については上記に記載のものを例示することができる。
【０１４２】
本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
【０１４３】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドまたは抗体以外に、上記に記載の製剤上許容される材料を含んでいてもよい。
【０１４４】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１４５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【０１４６】
〔実施例１〕ＭＫ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導および、臨床症状の観察
まず、ＭＫ欠損マウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導し、その病態を観察した。
３００μｇのMyelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55（ＭＯＧ３５−５５）（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）（配列番号：３）を５００μｇの結核死菌（Mycobacterium tuberculosis）を含む不完全Feund’s adjuvantをともにエマルジョン化し、８−１０週齢の野生型及びＭＫ欠損のＣ５７ＢＬ６マウス（日本、名古屋大学、村松教授より供与、Nakamura, E., et al., Genes Cells 3, 811-822 (1998)）に接種した。さらに、感作直後及び４８時間後に３００ｎｇの百日咳毒素（pertussis toxin）を２００μｌのＰＢＳに溶かし、尾静脈より投与しＥＡＥを誘導した。以後、毎日以下の基準により臨床症状を評価した（図１）。野生型マウス（ｎ＝１６）、ＭＫ欠損マウス（ｎ＝１３）について、毎日臨床スコアが付けられ、臨床症状の評価が行われた。図１における臨床スコア値は、０：症状なし、１：尾が垂れる、２：不安定歩行、３：後肢麻痺、４：四肢麻痺、５：死亡の病状を示し、免疫接種後２５日までの全ての動物の割合が記録された。
その結果、ＭＫ欠損マウスにおいて、臨床症状の軽減が見られた（図１）。具体的には、ＭＯＧ３５−５５の免疫接種後、ＭＫ欠損マウスにおいては、発病開始の遅れ、疾病重症度の軽減が見られた。
【０１４７】
〔実施例２〕ＭＫの投与による、ＭＫ欠損マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床症状への効果の検討
実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導させたＭＫ欠損マウスに対して、ＭＫを投与し、臨床
症状へのＭＫの効果を検討した。
ＭＫ欠損マウスに、１ｍｇ／ｍｌに溶解したＭＫをマイクロ浸透ポンプ（Model 1002, Durect Corp. Cupertino, CA）につめて腹腔内に投与した。このマイクロ浸透ポンプにより１時間に０．２５μｌのＭＫを１４日間投与し、総量として２００ｍｇ／日のＭＫを投与した。実施例１と同様の方法により、臨床症状の評価を行った（ｎ＝１３）。ＰＢＳのみをつめたマイクロ浸透ポンプを同様に腹腔内に投与したものを対照とした。
その結果、ＭＫ欠損マウスにおける臨床症状の軽減効果が、消失することが明らかとなった（図１）。
【０１４８】
〔実施例３〕各マウスの病理学的検索
ＥＡＥ発症後（感作後１４日目）の、実施例１および２の各群の脊髄を取り出し、ホルマリン固定後、公知の方法でヘマトキシリン・エオジン染色をし、病理学的検索を行った。
その結果、ＭＫ欠損マウスにおいてＭＯＧ３５−５５の免疫接種後のＣＮＳ炎症の減少が見られた。
【０１４９】
〔実施例４〕自己免疫性脳脊髄炎モデル動物におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞、またはＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の動態の解析
該自己免疫性脳脊髄炎モデル動物におけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の動態を検索して、ＭＫのＥＡＥ発現やＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の機能に対する役割を検討した。
野生型、ＭＫ欠損マウス、ＭＫ投与群のＥＡＥ発症後（免疫接種１２−１４日後）のマウスの脾臓、腸管膜リンパ節、膝下リンパ節よりリンパ球を分離し、ＣＤ４・ＣＤ８陽性細胞およびＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞をフローサイトメトリーにより測定した。
その結果、ＭＯＧ３５−５５接種後の野生型マウスおよびＭＫ欠損マウスの末梢リンパ節においては、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の比率に大きな違いは見られなかった（図２）。一方、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＭＫ欠損マウスの末梢リンパ節において活性増加が見られた（図３）。
【０１５０】
さらに、磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）によりＣＤ４陽性Ｔ細胞を純化し（＞９５％ ＣＤ４陽性cells）、ＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）存在下で培養し、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率をフローサイトメトリーにより求めた。具体的には、野生型マウスおよびＭＫ欠損マウスに対し、初日に実施例２と同様にマイクロ浸透圧ポンプを用いて１ｍｇ／ｍｌのＭＫまたはＰＢＳを投与し、さらに２００μｇ／マウスのＭＯＧ３５−５５を初日および２日後に投与した。臨床症状のピーク時にマウスの脾細胞からＣＤ４陽性Ｔ細胞を純化し、該細胞（ウェルあたり２×１０５個）を、in vitroにおいてＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）および抗原提示細胞（antigen presenting cell：以下ＡＰＣ、５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで３７℃３０分処理した正常マウスの脾臓細胞、ウェルあたり５×１０６個）存在下で４日間培養した。４日後に、ＦＡＣＳによりＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の発現を解析した。また、ＣＤ４マイクロビーズにより精製されたＣＤ４陽性Ｔ細胞のｃＤＮＡを調製し、Foxp3 mRNAレベルを決定するためにリアルタイムＲＴ−ＲＣＲにより解析を行った。
その結果、ＭＫ欠損マウスにＭＫを投与することで、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の発現が抑えられることが明らかとなった（図４）。
【０１５１】
以上の結果より、本モデル動物における臨床症状の軽減は、疾患を誘導するＣＤ４陽性細胞の変化ではなく（図２）、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性の調節性Ｔ細胞の増加が関与していることが明らかとなった（図３、４）。
【０１５２】
〔実施例５〕ＭＫ添加による、ＭＫ欠損マウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動
態への影響の解析
次に、０、２０、１００ｎｇ／ｍｌのＭＫの存在下、ＭＫ欠損マウスの脾臓由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＭＯＧ３５−５５により刺激後、実施例４と同様の方法で、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率、およびFoxp3 mRNAの発現を解析した。
その結果、添加ＭＫの濃度の増大に伴い、ＭＫ欠損マウスにおいてＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の比率および発現が低下することが明らかとなった（図５）。
【０１５３】
〔実施例６〕ＭＫ欠損マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスの解析
ＥＡＥは１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）により誘導される疾患であるので、ＭＫ欠損マウスにおけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスを検討し、ＭＫのＴｈ１／Ｔｈ２バランスに対する効果についても検討を行った。
具体的には、ＥＡＥ臨床症状のピーク時にマウスの脾細胞からＣＤ４陽性Ｔ細胞を純化し、該細胞（ウェルあたり２×１０５個）を、in vitroにおいてＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）およびＡＰＣ存在下で３日間培養した。培養上澄み中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を、ＥＬＩＳＡにより解析した。
その結果、ミッドカイン欠損マウスでは、細胞性免疫を誘導する１型ヘルパーＴ細胞も抑制されることが明らかとなった（図６）。
【０１５４】
〔実施例７〕抗ＭＫ抗体添加による、ＥＡＥモデルマウスにおけるＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の動態への影響のin vitro解析
マウス抗ヒトＭＫモノクローナル抗体の作製
（ＭＫ遺伝子ノックアウトマウスの作製）
ＭＫ遺伝子ノックアウトマウスは、公知の方法（特開２００２−８５０５８号公報、Nakamura, E. et al. :Genes Cells 3, p.811-822.）により作製した。
【０１５５】
（抗原の作成）
ヒトＭＫｍＲＮＡを、ウィルムス腫瘍由来の培養株細胞Ｇ−４０１より調整した（Tsutsui, J. ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 792-797, 1991）。プライマーとして、制限酵素ＥｃｏＲＩに認識される配列（5’-GAATTC-3’）を含むように設計した、センスＰＣＲプライマー：5’-GCGGAATTCATGCAGCACCGAGGCTTCCTC-3’（配列番号：４）、及び、アンチセンスＰＣＲプライマー：5’-GCGGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCCCTTT-3’（配列番号：５）を用い、ヒトＭＫｍＲＮＡを鋳型として、９３℃→３７℃→７２℃の温度変化を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行い、ＭＫコーディング領域の両端にＥｃｏＲＩ認識部位をもつヒトＭＫｃＤＮＡを調製した。
ＭＫｃＤＮＡ及び酵母ピキア・パトリスＧＳ１１５（Pichia pastoris GS115、以下、「ピキア酵母ＧＳ１１５」という）用発現ベクターｐＨＩＬ３０１（ヒスチジン及びネオマイシン耐性遺伝子含有、特開平２−１０４２９２号、欧州特許公開０３３９５６８号公報参照）を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて結合させ、組み換え発現ベクターを作製した。
エレクトロポレーション法を用いて、上記で調製した組み換え発現ベクターをピキア酵母ＧＳ１１５（インビトロゲン社）へ導入した。ベクターを導入したピキア酵母ＧＳ１１５を、ヒスチジンを含まない、Ｇ４１８含有培地で培養することにより、目的のＭＫ遺伝子を持つ複数のクローンを得た。得られたクローンを、メタノールで誘導しながら培養を行った。培養上清を採取し、ウサギ抗マウスＭＫポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット解析を行うことにより、当該クローンがＭＫを分泌するかどうか確認した。
誘導により、培養上清中にＭＫを分泌するクローンの１つをＴ３Ｌ−５０−４Ｐと名付け、このクローンを培養した（特開平７−３９８８９号公報参照）。培養上清からＭＫの分泌産物を回収し、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンカラムを使用したアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、高純度ＭＫを得た。
【０１５６】
（免疫）
抗原をＭＫノックアウトマウスに免疫した。抗原の調整はマウス１匹あたり１０μｇを生理食塩水で０．１ｍｌに希釈したものを抗原溶液とし、ＦＣＡ０．１ｍｌと混合し乳化させマウスの背皮に皮下投与した。２週間毎に８回免疫操作をした。８回目の免疫は抗原溶液のまま１０μｇを生理食塩水０．１ｍｌに溶解し、マウス尾静脈に静脈注射した。
４回免疫後６日目と、６回免疫後８日目に、マウスの眼底から採取した血清を用いて、血中抗体価をＥＬＩＳＡ法にて調べた。
ＥＬＩＳＡ法は、以下の方法により行った。まず、抗原溶液をＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）で、１．０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、５０μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌアッセイプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製、３５３９１２）に分注して４℃で一晩静置して抗原を固相化させた。０．０５％Tween-PBSで３回洗浄後、ブロックエース（大日本製薬製）４倍希釈を１００μｌ／ｗｅｌｌで加え、３７℃で２時間静置してブロッキングを行った。０．０５％Tween-PBSで３回洗浄後、培養上澄原液を５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間静置した。０．０５％Tween-PBSで３回洗浄後、２次抗体として、ブロックエースで１０倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ ＨＲＰ標識（Goat anti-Mouse IgG+IgM HRP conjugate）（BIOSOUCE社製、AMI3704）１００００倍希釈を５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃で１時間静置した。０．０５％Tween-PBSで３回洗浄後、ＨＲＰ基質（基質液（クエン酸一水和物 １０．２０６ｍｇ／ｍｌ、リン酸水素二ナトリウム１２水 ３６．８２mg/ml in distilled Ｈ２Ｏ）２５ｍｌ、ＯＰＤ １０ｍｇ、３０％Ｈ２Ｏ２ ５μｌ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、室温、遮光した状態で２０分間静置した。１Ｎ硫酸５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて反応を停止させ、４９２ｎｍの波長で測定した。
６回免疫後８日目に行なったＥＬＩＳＡ法で十分な抗体価があったので追加で２回免疫した３日後に細胞融合を行なった。
【０１５７】
（細胞融合）
マウスを捕定し胸部をアルコール綿で拭き、２．５ｍｌのシリンジと２３Ｇの針を用いて心臓採血を行った。採血した後、マウスを消毒用アルコール２０ｍｌの入ったビーカーに３分間程度入れた。採血した血液は１．５ｍｌチューブに入れ３７℃で１時間放置した後、４℃で一晩放置し、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を他の１．５ｍｌチューブに移し０．０５％アジ化ナトリウムを加え４℃で保存した。
採血したマウスの上皮をはさみとピンセット用いて剥がした。さらに、内皮を持ち上げ切込みをいれて脾臓を取り出した。あらかじめシャーレ５枚に分注しておいた２００ｍｌのRPMI1640 S.P培地で順に５回洗浄した。洗浄後、脾臓をメッシュに乗せハサミで数回切込みを入れ、ガラス棒ですり潰し、RPMI1640 S.P培地で網を洗い、４０ｍｌのガラス遠沈管に脾臓細胞を集めた。集めた脾臓細胞は１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで吸い上げ、RPMI1640 S.P培地を４０ｍｌ入れ１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた秘蔵細胞にRPMI1640 S.P培地を４０ｍｌ加えよく攪拌し、血球計算版で細胞数を計測した。
シャーレに入っているミエロ―マ細胞（Ｐ３Ｕ１）を、ピペットを用いて数回吹きつけ、５０ｍｌの遠沈管に集めた。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで除きRPMI1640 S.P培地を４０ｍｌ加え、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られたミエローマ細胞にRPMI1640 S.P培地を４０ｍｌ加えてよく攪拌し、血球計算版で細胞数を計測した。
上述の細胞数の計測の結果を基に、脾臓細胞５に対してミエローマ細胞１となるよう、脾臓細胞が入っていた５０ｍｌのガラス遠沈管にミエローマ細胞を入れた。混合した後、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄を吸引ピッペットで吸い取りタッピングをした。タッピング後、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）１ｍｌを、１分間かけて混合しながらゆっくり添加し、そのまま、２分間混合する。ＰＥＧの混合後、あらかじめウォーターバスに入れ３７℃に加温しておいたRPMI1640 S.P培地１ｍｌを、１分間かけて混合しながらゆっくり添加した。これを３回繰り返した。その後、３７℃に加温しておいたRPMI16
40 S.P培地１０ｍｌを、３分間かけて混合しながらゆっくり添加した。培地添加後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５分間加温した後、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで吸いタッピングをした。
タッピング後、（細胞を播種するプレートの枚数）×１０ｍｌのRPMI1640 S.P 15%FCS HAT培地を吹き付け、８連のマイクロピッペット（各１００μｌ）と専用の受け皿を使い、イエローチップを用いて９６ｗｅｌｌプレートに細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７日〜１４日培養し、コロニーの成長具合を見てＥＬＩＳＡで抗体作成能をスクリーニングした。
【０１５８】
（抗ＭＫ陽性抗体産生ハイブリドーマの選択）
細胞融合から１０日後、９６ｗｅｌｌ培養プレートの上清を使用しＥＬＩＳＡ法にて優位に吸光度の高い１２ｗｅｌｌをクローニング用サンプルとした。ハイブリドーマの細胞数を数え、９６ｗｅｌｌ培養プレートの３列に５ cells/well、３列に１ cell/well、２列に０．５ cells/wellとなるようにハイブリドーマ細胞を播種した。また、各ｗｅｌｌにフィダー細胞を１×１０６cells/wellとなるように播種した。クローニング後５日目にコロニーカウントを行い、コロニーが１個であるｗｅｌｌを確認し、２〜３日毎に培地を交換し、コロニーがｗｅｌｌの１／３をしめてきたところでＥＬＩＳＡ法を用いてコロニーが１個で陽性反応を示すｗｅｌｌを選択し、コロニー１個でＥＬＩＳＡにおいて陽性であり、かつ細胞の状態が良好なｗｅｌｌから得られた細胞を樹立株（ＩＰ−１３）とした。
次に、上述の方法で得られた抗ＭＫ抗体（ＩＰ−１３）が、ＭＫのＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞増殖抑制活性を阻害するかどうか、実施例４と同様な方法を用いて調べた。ＥＡＥ臨床症状がピークとなった野生型マウスの脾臓からＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離し、ＩＰ−１３（３０μｇ／ｍＬ）、ＭＯＧ３５−５５（３０μｇ／ｍｌ）およびＡＰＣ存在下で培養した。培養５日後にＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の割合をフローサイトメーターを用いて測定した。コントロールとしてＩＰ−１３抗体の代わりにＩｇＧを用いた実験も平行しておこなった。
その結果、コントロール実験でＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の存在割合が２％であったのに対し、ＩＰ−１３を加えた実験ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の存在割合が４％と上昇していることがわかった。以上より、抗ＭＫ抗体を用いることで、ＭＫのＣＤ４・ＣＤ２５陽性細胞増殖抑制活性を阻害することができることが示された（図７）。
【０１５９】
〔実施例８〕抗ＭＫ抗体添加による、ＥＡＥモデルマウスにおける臨床症状変化の観察
実施例１の方法により実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導したＥＡＥ臨床症状の野生型マウスに対して、抗ＭＫ抗体を投与し、その臨床症状を観察した。
まず、野生型ＥＡＥモデルマウス（Ｃ５７ＢＬ−６，♀、８週令）に対して、ＭＯＧ３５−５５投与後０日目，３日目，７日目，１０日目，１４日目，１７日目，２１日目，２４日目（合計８回）に、抗ＭＫ抗体（ＩＰ１４）の投与を行った。マウスを４つの群に分け（一群の匹数：５）、マウス重さ（ｋｇ）あたり、それぞれ７５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０ｍｇ／ｋｇ（コントロール）の量の抗ＭＫ抗体を尾静脈投与した。次に、６段階の臨床スコア（０：症状なし、１：尾が垂れる、２：仰向けにして起き上がれない、３：不安定歩行、４：軽度の後肢麻痺、５：重度の後肢麻痺、６：死亡）で毎日臨床スコアを付け、臨床症状の評価を行った。
その結果、抗ＭＫ抗体を投与したマウス群において、臨床症状の軽減が見られた（図８）。具体的には、ＭＯＧ３５−５５の免疫接種後、抗ＭＫ抗体を投与したマウス群においては、発病開始の遅れ、疾病重症度の軽減が見られた。
【０１６０】
〔実施例９〕ＭＫアプタマーを用いたＥＡＥモデルマウスの発症抑制実験
実施例１の方法により実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した野生型マウスにＭＫアプタマーを投与し、ＥＡＥ発症抑制効果を観察した。
ＭＫに特異的に結合するアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。得られたアプタマーのうち、１つを、化学合成できる長さまで短くした。また、化学修飾を加えることでヌクレアーゼ耐性を向上させたアプタマーＡを得た。
アプタマーＡがヒトＭＫの細胞遊走活性を阻害するか、ラットの骨芽細胞前駆細胞であるＵＭＲ１０６細胞（ATCC No. CRL1661）を用いて調べた。ケモタキセル（膜孔径８μｍ、クラボウ社製）の膜外面に１．５μＭのＭＫを３０μＬ塗布し、膜外面にＭＫを固定化した。アプタマー５００ｎＭを含む５００μＬの培地（０．３％ウシ血清アルブミン添加、Dulbecco’s Modified Eagle’s medium）を添加した２４穴カルチャープレートに、ＭＫを固定化したケモタキセルを設置した。ケモタキセルチェンバー内層にはＵＭＲ１０６細胞を１×１０６cells/mLの濃度で２００μＬ入れ、３７℃で４時間培養した。ケモタキセルチェンバー内層に残存した細胞を除去し、ＭＫ塗布面に浸潤し接着した細胞をメタノールで固定した。ケモタキセルチェンバーを１％クリスタルバイオレット水溶液に３０分間浸して細胞を染色した。ケモタキセルチェンバーを蒸留水で洗浄、乾燥した後、２００μＬの１％ＳＤＳと１％tritonX100の混合液で色素を抽出した。抽出液の１５０μＬを９６穴マイクロプレートに移し、５９０ｎｍの吸光度を測定した。測定の結果、アプタマーＡは強い細胞遊走阻害活性を有していることがわかった。アプタマーを添加しない場合に移動した細胞の数を１００とした場合、アプタマーＡを添加したときに移動した細胞の数は約２．３であり、９８％の阻害活性が確認された。一方、コントロールとして用いたＲＮＡは阻害活性を示さなかった。
アプタマーＡがＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の増殖に関与するかどうか調べた。実験は実施例７と同様におこなった。ＭＯＧ処理後４週目のＥＡＥ臨床症状を示したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓よりＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離し、該細胞（ウェルあたり２×１０５個）を、in vitroにおいてＭＯＧ３５−５５（２０μｇ／ｍｌ）およびＡＰＣ存在下でアプタマーＡを添加し、３日間培養した。ＦＡＣＳによりＣＤ４・ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の発現を解析した。さらに細胞内Ｆｏｘｐ３を抗マウスＦｏｘｐ３染色セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いＣＤ４陽性細胞を同時染色しフローサイトメトリーにより検出した。実験の結果、コントロールとしてＰＢＳを添加した系ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の存在割合が６．２％であったのに対して、アプタマーＡを１２５ｎＭ添加した系ではＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の存在割合は１１％であり、アプタマーを加えることでＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の割合が増加することが確認された。また、調節性Ｔ細胞の発生や分化に関係しているＦｏｘｐ３の発現を調べたところ、コントロールとしてＰＢＳを添加した系ではＣＤ４陽性細胞のうち２５％の細胞で発現が確認されたのに対し、アプタマーＡを１２５ｎＭ添加した系では３３％と増加していた。以上より、アプタマーＡを加えることでＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞が増加することが示された。
アプタマーＡを用いてＥＡＥモデルマウスの発症抑制実験をおこなった。８週令のマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６、♀）にＭＯＧを処理したＥＡＥモデルマウスを用い、ＭＯＧ処理日より、２日に１回の間隔で計１０回、それぞれ１５ｍｇ／ｋｇ，２．５ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ、０ｍｇ／ｋｇ（コントロール）のアプタマーを腹腔内投与した。一群当たりの匹数は５〜６匹とした。観察は毎日行い、次に示す臨床スコアをもとに各個体の臨床症状をスコア化した。０：症状なし、１：尾が垂れる、２：仰向けにして起き上がれない、３：不安定歩行、４：軽度の後肢麻痺、５：重度の後肢麻痺、６：死亡。実験の結果、１５ｍｇ／ｋｇ投与群においてコントロール群に比較しＭＯＧ処理後１５、１６、１７、１８日目においてｐ値が１％以下を示し統計学的な有意差が認められた（図９）。統計学的処理はDunnett検定を用いた。病態発症の遅延効果が、１５ｍｇ／ｋｇおよび２．５ｍｇ／ｋｇ投与群で認められた。
以上より、ＭＫ阻害剤であるＭＫに特異的に結合するアプタマーは、ＣＤ４・ＣＤ２５陽性調節性Ｔ細胞の減少に関連する疾患である多発性硬化症の治療薬として利用可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
ＭＫの発現または活性を抑制することにより、調節性Ｔ細胞が増加することから、本発明は、ＭＫ阻害剤の投与等によりＭＫを阻害することにより、多発性硬化症をはじめとする調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を治療または予防する方法として利用することができる。また、ＭＫ阻害剤は、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤または予防剤として利用することができる。更に、本発明のスクリーニング方法により、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤または予防剤を得ることができる。また、本発明の診断方法は、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患を診断する方法として利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカインに対するアプタマーを有効成分として含有する、調節性Ｔ細胞増殖剤。
【請求項２】
ミッドカインに対するアプタマーを有効成分として含有する調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、甲状腺異常、炎症性腸炎、１型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは筋萎縮性側索硬化症である請求項１又は請求項２に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が、多発性硬化症である請求項１又は請求項２に記載の治療剤。
【請求項５】
ミッドカインに対するアプタマーによりミッドカインを阻害することによる、調節性Ｔ細胞の増殖方法。
【請求項６】
ミッドカインに対するアプタマーを投与することからなる調節性Ｔ細胞の増殖方法。
【請求項７】
調節性Ｔ細胞増殖剤の製造のためのミッドカインに対するアプタマーの使用。
【請求項８】
ミッドカインに対するアプタマーによりミッドカインを阻害することによる、調節性Ｔ細胞の機能異常に基く疾患の治療方法または予防方法。
【請求項９】
ミッドカインに対するアプタマーを投与することからなる調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法または予防方法。
【請求項１０】
調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患治療剤または予防剤の製造のためのミッドカインに対するアプタマーの使用。
【請求項１１】
ミッドカインに対するアプタマーを含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査薬。
【請求項１】
ミッドカインに対するアプタマーを有効成分として含有する、調節性Ｔ細胞増殖剤。
【請求項２】
ミッドカインに対するアプタマーを有効成分として含有する調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、移植時の慢性拒絶、甲状腺異常、炎症性腸炎、１型糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは筋萎縮性側索硬化症である請求項１又は請求項２に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患が、多発性硬化症である請求項１又は請求項２に記載の治療剤。
【請求項５】
ミッドカインに対するアプタマーによりミッドカインを阻害することによる、調節性Ｔ細胞の増殖方法。
【請求項６】
ミッドカインに対するアプタマーを投与することからなる調節性Ｔ細胞の増殖方法。
【請求項７】
調節性Ｔ細胞増殖剤の製造のためのミッドカインに対するアプタマーの使用。
【請求項８】
ミッドカインに対するアプタマーによりミッドカインを阻害することによる、調節性Ｔ細胞の機能異常に基く疾患の治療方法または予防方法。
【請求項９】
ミッドカインに対するアプタマーを投与することからなる調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の治療方法または予防方法。
【請求項１０】
調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患治療剤または予防剤の製造のためのミッドカインに対するアプタマーの使用。
【請求項１１】
ミッドカインに対するアプタマーを含む、調節性Ｔ細胞の機能異常に基づく疾患の検査薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１０２１１１（Ｐ２０１２−１０２１１１Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２７７４５１（Ｐ２０１１−２７７４５１）
【出願日】平成２３年１２月１９日（２０１１．１２．１９）
【分割の表示】特願２００７−５４４２３６（Ｐ２００７−５４４２３６）の分割
【原出願日】平成１８年１１月１４日（２００６．１１．１４）
【出願人】（５０５２５４１７５）株式会社リボミック (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月１９日（２０１１．１２．１９）
【分割の表示】特願２００７−５４４２３６（Ｐ２００７−５４４２３６）の分割
【原出願日】平成１８年１１月１４日（２００６．１１．１４）
【出願人】（５０５２５４１７５）株式会社リボミック (4)
【Ｆターム（参考）】
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