超高純度ＦＶＩＩａの治療製剤および治療製剤を得るための方法
【課題】超高純度ＦＶＩＩａの治療製剤および治療製剤を得るための方法を提供すること。
【解決手段】少なくとも１０００ＩＵ／ｍｇタンパク質の純度を有するＦＶＩＩａの治療製剤は、前記製剤が非ヒト由来のタンパク質を含まないことを特徴とする。ＦＶＩＩを得るための方法において、精製は、ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩ、またはＣｏｈｎ分画の相当物から始まり、ＰＥＧによる沈殿、クロマトグラフ、およびそれに続く活性化を含む。
【解決手段】少なくとも１０００ＩＵ／ｍｇタンパク質の純度を有するＦＶＩＩａの治療製剤は、前記製剤が非ヒト由来のタンパク質を含まないことを特徴とする。ＦＶＩＩを得るための方法において、精製は、ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩ、またはＣｏｈｎ分画の相当物から始まり、ＰＥＧによる沈殿、クロマトグラフ、およびそれに続く活性化を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規性および進歩性の顕著な特性を有する、超高純度ＦＶＩＩａの治療製剤およびその治療製剤を得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病および肝疾患などの他の関連する疾患における出血の問題の治療には、凝固因子による補充療法が実施されている。
【０００３】
血友病Ａ（凝固第ＶＩＩＩ因子の欠乏）の最適な治療は、予防レベルと急性発症のいずれでも前記第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の投与を含む。残念なことに、ＦＶＩＩＩによる治療の問題の１つは、ＦＶＩＩＩ阻害抗体の出現であり、これはこの治療の有効性を低下させる。
【０００４】
他の代替え治療には、活性化プロトロンビン複合体（ＡＰＣＣ）濃縮製剤の投与が含まれる。ＡＰＣＣは、ビタミンＫ依存性凝固因子（第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ因子）および他の随伴タンパク質（基本的にタンパク質Ｃとタンパク質Ｓ）の混合物からなる。これらのＡＰＣＣによる治療では、不足していない因子のレベルが高まり、さらにその因子のいくつかは活性型で認められ、そのため、ＡＰＣＣは、患者に播種性血管内凝固などの血栓形成現象を引き起こす可能性がある。
【０００５】
第ＶＩＩＩ因子の活性とは無関係に凝固を開始するための活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）の能力は、治療上大いに有用であり、それは、第ＶＩＩＩ因子を阻害する抗体が生じ、したがって補充療法に十分に反応しない血友病患者の止血能力を復活させることができるからである。他の因子と比較すると、ＦＶＩＩａは、短い生物学的半減期（約４時間）を有するが、ＡＰＣＣの他の因子は、それよりも長い半減期を有し、そのため蓄積を引き起こす。
【０００６】
精製されたＦＶＩＩａによる治療の他の利点は、その作用が、その補因子である、損傷部位（関節血症、抜歯、外科的介入など）で放出される組織因子の効用により局在化されることである。現在、ＦＶＩＩａは、特に、ジクマリンの過剰投与、肝不全、および止血不能な出血など広範な適応症を有する包括的止血剤として考えられる傾向がある。
【０００７】
加えて、高純度ＦＶＩＩａを投与する場合、その高い活性のために、タンパク質の注入は最小限に抑えられ、他の不要なタンパク質は注入されない。
【０００８】
血漿由来のＦＶＩＩａの製剤は、現在まで、本発明のものと比較して、比較的低いＦＶＩＩａ活性を示している。ＢＡＸＴＥＲ ＴＲＡＶＥＮＯＬ ＬＡＢの「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ」に関する米国特許第４４７９９３８号では、低純度ＦＶＩＩａを示しており、ＦＯＮＤ ＮＡＴ ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ ＳＡＮＧＵＩＮＥの「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ ｆｒａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ａｓ ａ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ」に関する欧州特許第０３４６２４１号も同様に、低純度ＦＶＩＩの製剤を示し、これは９５から１３０ＩＵ／ｍｇのＦＶＩＩａタンパク質の活性を持つものである。
【０００９】
ＦＶＩＩａを工業レベルで精製する知られている方法は、欧州特許第０３４６２４１号により示されているように、プロトロンビン複合体または血漿分画の相当フラクションから出発し、選択的沈殿を含む方法および沈殿物を分離するための方法としての遠心分離の使用に基づいている。すでに検証されているように、沈殿に基づく精製プロセスでは、得られる精製度は限られており、さらに、沈殿物の分離が遠心分離による複雑なプロセスを記載しており、これは工業的に複雑で費用のかかる方法である。
【００１０】
ＣＥＮＴＲＡＬ ＢＬＯＯＤ ＬＡＢ ＡＵＴＨＯＲＩＴＹ の「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ」に関する欧州特許第０３９１９７４号では、基本的に、ＦＩＸの精製を参照しており、これは、金属キレートカラムを使用するクロマトグラフィーを用いて、プロトロンビン複合体から出発する。ＦＩＸを得るための洗浄により生じる副産物として、ＦＶＩＩａではなく、ＦＶＩＩを得ることが要求されている。得られたＦＶＩＩは、低純度（タンパク質１ｍｇ当たり約１ＩＵ）であり、ＦＩＩを含まないことを特徴としているが、かなりの量の他のビタミンＫ依存因子を含みうる。記載されている方法では、高純度のＦＶＩＩａを得ることはできない。金属キレートカラムにおけるクロマトグラフィーでは、銅とともに活性化した樹脂を使用する。本発明で記載されている方法では、金属キレート・クロマトグラフィーは、樹脂をニッケルと共に使用し、これは事前の活性化を必要としない。というのも、洗浄を、高伝導性で行い、そのため、カラム内のＦＶＩＩの安定化が可能になり、溶離は、アミノ酸が存在することを必要としないためである。このことにより、出発点がより高純度の物質であるという事実にも関連して、欧州特許第０３９１９７４号では得られないであろう、高純度の生成物を得ることが可能になる。
【００１１】
血漿ＦＶＩＩａを精製する他の方法は、（モノクローナル抗体による）免疫親和性によるＦＶＩＩの単離および分離に基づく［Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（２００３）８４、５４〜６４頁］。この方法では、高純度は得られるが（４０，０００ＩＵ／ｍｇタンパク質のオーダーの比活性）、最終生成物中での使用される樹脂により放出されるモノクローナル抗体に由来する非ヒト由来のタンパク質の存在をなくすことはできない。これらの非ヒトタンパク質は、治療される患者の抗原反応に関わるであろう。
【００１２】
注目すべき他の態様は、ＦＶＩＩａ精製プロセスの出発物質であるが、これは、従来、プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）または同等のフラクションであった。これは、この物質が２つの生成物のうちの１つ、つまりＰＴＣまたはＦＶＩＩａのいずれかを得ることのみを意図されている可能性のあることを意味している。ＦｒＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液の沈殿物などの、分画で使用されない廃画分であってもよい代替物質から出発してＦＶＩＩａを精製することが可能になると、分画された血漿をより効率的に利用できる可能性が広がる。
【特許文献１】米国特許第４４７９９３８号
【特許文献２】欧州特許第０３４６２４１号
【特許文献３】欧州特許第０３９１９７４号
【非特許文献１】Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（２００３）８４、５４〜６４頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の方法により、超高純度ＦＶＩＩａの治療製剤は、ヒト血漿から始めて、少なくとも１０００ＩＵ／ｍｇタンパク質または好ましくは６０００ＩＵ／ｍｇタンパク質で、少なくとも１２０００ＩＵ／ｍｌの濃度で得られる。このＦＶＩＩａを得る方法は、ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩ、またはＣｏｈｎ分画の相当物から出発し、ＰＥＧによる沈殿およびクロマトグラフィーを含み、その結果得られる生成物は、非ヒト由来のタンパク質を含まない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では、ヒト血漿から開始したＦＶＩＩａの治療製剤が説明され、請求されており、これは、少なくとも１０００ＩＵ／ｍｇタンパク質純度を有し、６０００ＩＵ／ｍｇタンパク質超に到達することができるものである。このＦＶＩＩａの治療製剤は、非ヒト由来タンパク質を含まず、ＦＶＩＩａは、その中に、少なくとも１２０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。
【００１５】
このＦＶＩＩは、ヒト血漿の分画の画分ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分ＩＩＩまたは相当物から出発して精製され、精製方法は、ＰＥＧによる沈殿およびクロマトグラフィーを含む。
【００１６】
第１段階では、出発画分（ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩまたは相当物）の懸濁液を、３から５％の範囲のＰＥＧ濃度で沈殿させ、その結果得られる沈殿物を、溶解し、５から７％のＰＥＧ濃度で再沈殿させ、この沈殿物から上清を回収する。
【００１７】
この上清から出発して、ＦＶＩＩを、ＱセファロースまたはＱセラミック・タイプの樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより捕捉し、ｐＨを変えて溶離を行う。
【００１８】
ＦＶＩＩに富むこの溶出液は、適宜、オクチル・セファロース型の樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製する。この手順の特徴は、アンモニウム塩の非存在下で行われるという点である。
【００１９】
加えて、ＮｉセファロースＨＰ樹脂を用いた金属キレート・クロマトグラフによるＦＶＩＩの精製の段階を実施する。
ＦＶＩＩを、カルシウムの存在下で活性化する。
【００２０】
これは生体由来の生成物であるため、病原因子を排除する少なくとも１つ、好ましくは２つまたはそれ以上の段階を含むようにすることが推奨される。際立った有効性のため、例えば、いずれのクロマトグラフ段階にも先立って溶媒／界面活性剤を使用した処理によるウイルス除去の段階を含むことが好都合である。この方法および得られる生成物は、例えば、ナノ濾過による追加のウイルス除去段階を含むことも可能である。
【００２１】
記載されている方法の好ましい一実施形態では、５から５．４の範囲のｐＨで３．５から４．５％のＰＥＧを使用した沈殿により、ＦｒＩＩ＋ＩＩＩから開始して、ＦＶＩＩを精製する。得られた沈殿物は再懸濁し、６から７の範囲のｐＨで５．５から６．５％のＰＥＧにより沈殿させる。この沈殿の上清からのＦＶＩＩの吸着は、中性に近いｐＨでＱ−セファロースＦＦタイプの樹脂を使用したイオン交換および５から６までの範囲のｐＨでＦＶＩＩを溶離することにより実施する。
【００２２】
その後、ＦＶＩＩは、適宜、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製し、オクチル・セファロースＦＦタイプの樹脂中でＦＶＩＩを吸着させる。この吸着は、中性ｐＨで行う。精製ＦＶＩＩは、中性ｐＨで１０ｍｍｏｌ／ｌ無水リン酸二ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸三ナトリウム二水和物、５００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを含む溶液を使って溶離する。
【００２３】
ＦＶＩＩに富む溶出液を、ＮｉセファロースＨＰ樹脂を使用した金属キレートカラムにかけ、７．５から８．５の範囲のｐＨでＦＶＩＩを吸着する。この樹脂により、高伝導状態で、さらに６から７の範囲のｐＨで、洗浄を実施することが可能になる。１０ｍｍｏｌ／ｌ無水リン酸二ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを含む中性ｐＨに調整した溶液でＦＶＩＩを溶離することにより、比活性が約２００ＩＵ／ｍｇタンパク質である高純度のＦＶＩＩを得ることが可能になる。
【００２４】
ＦＶＩＩの活性化は、カルシウムの添加により実施でき、精製プロセスの中間物質または最終物質のいずれにも適用することができ、これは前記したＦＶＩＩを得るための条件を変えることがない。
【００２５】
同様に、本発明の本質を変えることなく、病原因子を低減する１つまたは複数の段階を実施し、前記のプロセスに適用することができる。
【実施例】
【００２６】
例示するため以下で述べるのは、連続する段階１から４に分割された、本発明の例示的な一実施形態である。
【００２７】
第１段階
ＩＩ＋ＩＩＩのフラクションの抽出物を沈殿させて、不純物を含むＦＶＩＩのフラクションを得ること：
ＩＩ＋ＩＩＩのフラクションの初期懸濁は、５ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩と５％ソルビトールとの抽出溶液を用いて実施した。
【００２８】
懸濁が完了した後、攪拌しながら２〜６℃で１時間保持した。ｐＨを調整した後、ＰＥＧをフラクションＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液に加えて、最終濃度を４％（ｗ／ｗ）とした。添加した後、懸濁液を３０分間攪拌した。得られた懸濁液に、ベントナイトを加え、その後２０分間攪拌した。この時点から、少なくとも４時間の静置段階を行った。この後、２０分間の遠心分離プロセスを行った。遠心分離プロセスが完了した後、上清を沈殿物から分離した。沈殿物を、リン酸緩衝液中に溶解し、この物質とフラクションＩＩ＋ＩＩＩの初期懸濁液の両方についてＦＶＩＩの分析的評価を実施した。活性試験では、ＣＯＡＳＥＴ（登録商標）ＦＶＩＩ（ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ）キットを使用した。この方法は、２つの工程に基づいている。第１の工程では、外因的経路（ＦＶＩＩ−トロンボプラスチン）により第Ｘ因子をＦＸａに活性化する。第ＶＩＩ因子は、このプロセスでＦＶＩＩａに完全に活性化され、したがって、この試験では、活性化される前のＦＶＩＩによる干渉はない。第２の工程では、生成された第Ｘａ因子は発色基質Ｓ−２７６５を加水分解し、発色基ｐＮＡを放出する。その色は、光度計で４０５ｎｍである。生成された第Ｘａ因子、すなわち色の強さは、試料の第ＶＩＩ因子の活性に比例する。再構成されたＰＥＧ沈殿物は、０．８６ＩＵ／ｍｌの第ＶＩＩ因子の活性を示す。これらの結果から、ＦＶＩＩの活性は、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ中に存在すること、および記載した条件下で４％ＰＥＧを加えることにより得られる沈殿物中においてかなり回収されることがわかる。
【００２９】
第２段階
４％ＰＥＧ沈殿物から開始し、以下の順次的段階に従ってＦＶＩＩのフラクションを得て部分的に精製すること：
１．６％ＰＥＧによる沈殿：
４％ＰＥＧの沈殿物のフラクションの懸濁は、２０〜２５℃の温度で、抽出液（０．５ｍｏｌ／ｌＮａＯＨでｐＨ７．５にした５ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、および５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ）により実施した。再懸濁が完了した後、攪拌しながら２時間保持し、その後、５℃まで冷却し、ｐＨを６．５に調整した。この懸濁液を、５±３℃でｐＨ ６．５の４５ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌからなる溶液で希釈し、最終濃度６％（ｗ／ｗ）のＰＥＧが得られるまでＰＥＧを加えた。最後に、深皿で濾過することにより６％ＰＥＧの上清を清澄にし、ＰＥＧから沈殿物を分離した。このプロセスが完了した後、濾過溶液をＦＶＩＩの活性およびそのタンパク質含有量（光学濃度により評価）に関して分析し、０．１１ＩＵ／ＡＵの比活性を得た。この値は、第１段で説明されている方法により評価した、タンパク質概算値でＦＶＩＩの活性（ＩＵ／ｍｌ）を除算する計算で求められた。
【００３０】
この時点で、界面活性剤と共に有機溶媒を用いた処理によるウイルス不活化の段階を実施する。これらのウイルス不活化試薬は、その後、以下のクロマトグラフ段階において分離する。
【００３１】
２．−イオン交換クロマトグラフィー：
フラクションＩＩ＋ＩＩＩからの６％ＰＥＧの清澄化した上清から開始して、ＡＰＩで２０％まで希釈を行い、ｐＨを７．５に調整し、伝導性を低減させた。次いで、ＱセファロースＦＦ樹脂（すでに平衡化されている）を、得られた溶液に加え、これを、中程度の攪拌をしながら１時間保持した。その後、カラム（ＦＩＮＥ ＬＩＮＥ ＦＦ）への樹脂を含む懸濁液の充填を実施した。充填した後、樹脂を、２〜８℃の温度でｐＨ ７．５に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、１００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを用いて洗浄した。洗浄が完了したら、溶離液Ｑをカラム内に注入した。この溶離は、２〜８℃の温度でｐＨ ５．５に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、２００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを用いて行った。溶出液Ｑを評価したところ、ＦＶＩＩの比活性１．１６ＩＵ／ＡＵが得られた。
【００３２】
３．−疎水性相互作用クロマトグラフィー：
２．５モル／ｌＮａＣｌ、ｐＨ ７．０に調整された、温度２５±３℃のＱセファロース溶出液から始めて、ｐＨ ７．０、２５±３℃の温度で、１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、２５００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを使用してカラム（オクチル・セファロースＦＦ）を平衡化させた。次に、溶出液をカラム内に注入し、同じ平衡液（２５±３℃の温度）で洗浄した。次いで、ｐＨ ７．０、２５±３℃の温度で１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、５００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを用いて溶離を行った。オクチル溶出液を評価したところ、ＦＶＩＩの比活性３．７９ＩＵ／ＡＵという結果が得られた。これからわかるように、この第２段で得られた結果は、清澄化した６％ＰＥＧ上清における初期値の３４倍という３つの段階にわたる比活性の増大を反映している。
【００３３】
第３段階
ＮｉセファロースＨＰにおいてＭＣクロマトグラフィーを使ってオクチル溶出液から始めて、ＦＶＩＩの純粋フラクションを得ること：
まず、ＮｉセファロースＨＰカラムを、ｐＨ ８．０±０．０５に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、１モル／ｌＮａＣｌで平衡化した。次いで、オクチル溶出液をカラム内に注入した。これに続いて、２回洗浄を行った。１回目の洗浄は、高伝導性状態（１モル／ｌＮａＣｌ）の下で、続く２回目の洗浄はｐＨを下げて（６．５）行った。最後に、ｐＨ ７．０に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、２５ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを含む溶液で特異的な溶離を実施した。その結果得られたＮｉ溶出液について分析的評価を実施し、２０４ＩＵ／ＡＵの比活性の結果を得たが、これは、Ｑ溶出液と比較しておよそ５４倍の純度の増大を表している。
【００３４】
第４段階
カルシウムの添加によるＦＶＩＩの活性化：
この段階では、ＦＶＩＩは、Ｎｉセファロース溶出液から開始し、カルシウムの添加によりＦＶＩＩａに活性化した。これのために、ＦＶＩＩを含有するフラクションを、５０ｍｍｏｌ／ｌトリス、３０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、および２ｍｍｏｌ／ｌＣａＣｌ２の存在下で、２０時間、３０℃でインキュベートし、ＦＶＩＩの自動活性化をもたらした。ＦＶＩＩａの活性に関するこれらの試料の分析的評価は、第１国際ＦＶＩＩａ標準に従ってＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）ＶＩＩａ−ｒＴＦキット（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ）を使用することにより実施した。この方法の原理は、ｒｓＴＦがＦＶＩＩａの補因子としての特異的な機能を持つという事実に基づく。ＦＶＩＩａ、リン脂質、およびカルシウムの存在下でのｒｓＴＦは、血漿の血液凝固を生じさせる。このシステムでは、観察された凝固時間は、血漿内に最初に存在するＦＶＩＩのレベルに反比例することを示している。ｒｓＴＦは、ＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化しないため、試験において存在しているＦＶＩＩは、試験に干渉しない。それと平行して、ＦＶＩＩの活性の評価を、第１段階で説明された方法により実施した。こうして得られた活性化されたフラクション中のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａの活性の結果から、３０．３のＩＵ ＦＶＩＩａ／ＩＵ ＦＶＩＩの比が示された。
【００３５】
この４つの段階で説明された手順の組み合わせにより、約６０５６ＩＵ／ＡＵのＮｉ溶出液から得られた活性化された第ＶＩＩ因子の比活性を評価することが可能になる。
【００３６】
存在しうるウイルス粒子または他の病原体を排除することを目的として、孔径１５ナノメーターのナノフィルタによる溶液のナノ濾過の最終段階を実施する。
【００３７】
本発明は、例示的な実施例を含む、前記の説明の中で説明されているが、当業者であれば、開示されている内容に基づいて、本発明の範囲内に含まれる変更形態および代替え形態を導入することができ、また請求項によってのみ限定されることは理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規性および進歩性の顕著な特性を有する、超高純度ＦＶＩＩａの治療製剤およびその治療製剤を得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病および肝疾患などの他の関連する疾患における出血の問題の治療には、凝固因子による補充療法が実施されている。
【０００３】
血友病Ａ（凝固第ＶＩＩＩ因子の欠乏）の最適な治療は、予防レベルと急性発症のいずれでも前記第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の投与を含む。残念なことに、ＦＶＩＩＩによる治療の問題の１つは、ＦＶＩＩＩ阻害抗体の出現であり、これはこの治療の有効性を低下させる。
【０００４】
他の代替え治療には、活性化プロトロンビン複合体（ＡＰＣＣ）濃縮製剤の投与が含まれる。ＡＰＣＣは、ビタミンＫ依存性凝固因子（第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ因子）および他の随伴タンパク質（基本的にタンパク質Ｃとタンパク質Ｓ）の混合物からなる。これらのＡＰＣＣによる治療では、不足していない因子のレベルが高まり、さらにその因子のいくつかは活性型で認められ、そのため、ＡＰＣＣは、患者に播種性血管内凝固などの血栓形成現象を引き起こす可能性がある。
【０００５】
第ＶＩＩＩ因子の活性とは無関係に凝固を開始するための活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）の能力は、治療上大いに有用であり、それは、第ＶＩＩＩ因子を阻害する抗体が生じ、したがって補充療法に十分に反応しない血友病患者の止血能力を復活させることができるからである。他の因子と比較すると、ＦＶＩＩａは、短い生物学的半減期（約４時間）を有するが、ＡＰＣＣの他の因子は、それよりも長い半減期を有し、そのため蓄積を引き起こす。
【０００６】
精製されたＦＶＩＩａによる治療の他の利点は、その作用が、その補因子である、損傷部位（関節血症、抜歯、外科的介入など）で放出される組織因子の効用により局在化されることである。現在、ＦＶＩＩａは、特に、ジクマリンの過剰投与、肝不全、および止血不能な出血など広範な適応症を有する包括的止血剤として考えられる傾向がある。
【０００７】
加えて、高純度ＦＶＩＩａを投与する場合、その高い活性のために、タンパク質の注入は最小限に抑えられ、他の不要なタンパク質は注入されない。
【０００８】
血漿由来のＦＶＩＩａの製剤は、現在まで、本発明のものと比較して、比較的低いＦＶＩＩａ活性を示している。ＢＡＸＴＥＲ ＴＲＡＶＥＮＯＬ ＬＡＢの「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ」に関する米国特許第４４７９９３８号では、低純度ＦＶＩＩａを示しており、ＦＯＮＤ ＮＡＴ ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ ＳＡＮＧＵＩＮＥの「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ ｆｒａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ａｓ ａ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ」に関する欧州特許第０３４６２４１号も同様に、低純度ＦＶＩＩの製剤を示し、これは９５から１３０ＩＵ／ｍｇのＦＶＩＩａタンパク質の活性を持つものである。
【０００９】
ＦＶＩＩａを工業レベルで精製する知られている方法は、欧州特許第０３４６２４１号により示されているように、プロトロンビン複合体または血漿分画の相当フラクションから出発し、選択的沈殿を含む方法および沈殿物を分離するための方法としての遠心分離の使用に基づいている。すでに検証されているように、沈殿に基づく精製プロセスでは、得られる精製度は限られており、さらに、沈殿物の分離が遠心分離による複雑なプロセスを記載しており、これは工業的に複雑で費用のかかる方法である。
【００１０】
ＣＥＮＴＲＡＬ ＢＬＯＯＤ ＬＡＢ ＡＵＴＨＯＲＩＴＹ の「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ」に関する欧州特許第０３９１９７４号では、基本的に、ＦＩＸの精製を参照しており、これは、金属キレートカラムを使用するクロマトグラフィーを用いて、プロトロンビン複合体から出発する。ＦＩＸを得るための洗浄により生じる副産物として、ＦＶＩＩａではなく、ＦＶＩＩを得ることが要求されている。得られたＦＶＩＩは、低純度（タンパク質１ｍｇ当たり約１ＩＵ）であり、ＦＩＩを含まないことを特徴としているが、かなりの量の他のビタミンＫ依存因子を含みうる。記載されている方法では、高純度のＦＶＩＩａを得ることはできない。金属キレートカラムにおけるクロマトグラフィーでは、銅とともに活性化した樹脂を使用する。本発明で記載されている方法では、金属キレート・クロマトグラフィーは、樹脂をニッケルと共に使用し、これは事前の活性化を必要としない。というのも、洗浄を、高伝導性で行い、そのため、カラム内のＦＶＩＩの安定化が可能になり、溶離は、アミノ酸が存在することを必要としないためである。このことにより、出発点がより高純度の物質であるという事実にも関連して、欧州特許第０３９１９７４号では得られないであろう、高純度の生成物を得ることが可能になる。
【００１１】
血漿ＦＶＩＩａを精製する他の方法は、（モノクローナル抗体による）免疫親和性によるＦＶＩＩの単離および分離に基づく［Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（２００３）８４、５４〜６４頁］。この方法では、高純度は得られるが（４０，０００ＩＵ／ｍｇタンパク質のオーダーの比活性）、最終生成物中での使用される樹脂により放出されるモノクローナル抗体に由来する非ヒト由来のタンパク質の存在をなくすことはできない。これらの非ヒトタンパク質は、治療される患者の抗原反応に関わるであろう。
【００１２】
注目すべき他の態様は、ＦＶＩＩａ精製プロセスの出発物質であるが、これは、従来、プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）または同等のフラクションであった。これは、この物質が２つの生成物のうちの１つ、つまりＰＴＣまたはＦＶＩＩａのいずれかを得ることのみを意図されている可能性のあることを意味している。ＦｒＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液の沈殿物などの、分画で使用されない廃画分であってもよい代替物質から出発してＦＶＩＩａを精製することが可能になると、分画された血漿をより効率的に利用できる可能性が広がる。
【特許文献１】米国特許第４４７９９３８号
【特許文献２】欧州特許第０３４６２４１号
【特許文献３】欧州特許第０３９１９７４号
【非特許文献１】Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ（２００３）８４、５４〜６４頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の方法により、超高純度ＦＶＩＩａの治療製剤は、ヒト血漿から始めて、少なくとも１０００ＩＵ／ｍｇタンパク質または好ましくは６０００ＩＵ／ｍｇタンパク質で、少なくとも１２０００ＩＵ／ｍｌの濃度で得られる。このＦＶＩＩａを得る方法は、ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩ、またはＣｏｈｎ分画の相当物から出発し、ＰＥＧによる沈殿およびクロマトグラフィーを含み、その結果得られる生成物は、非ヒト由来のタンパク質を含まない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明では、ヒト血漿から開始したＦＶＩＩａの治療製剤が説明され、請求されており、これは、少なくとも１０００ＩＵ／ｍｇタンパク質純度を有し、６０００ＩＵ／ｍｇタンパク質超に到達することができるものである。このＦＶＩＩａの治療製剤は、非ヒト由来タンパク質を含まず、ＦＶＩＩａは、その中に、少なくとも１２０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。
【００１５】
このＦＶＩＩは、ヒト血漿の分画の画分ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分ＩＩＩまたは相当物から出発して精製され、精製方法は、ＰＥＧによる沈殿およびクロマトグラフィーを含む。
【００１６】
第１段階では、出発画分（ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩまたは相当物）の懸濁液を、３から５％の範囲のＰＥＧ濃度で沈殿させ、その結果得られる沈殿物を、溶解し、５から７％のＰＥＧ濃度で再沈殿させ、この沈殿物から上清を回収する。
【００１７】
この上清から出発して、ＦＶＩＩを、ＱセファロースまたはＱセラミック・タイプの樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより捕捉し、ｐＨを変えて溶離を行う。
【００１８】
ＦＶＩＩに富むこの溶出液は、適宜、オクチル・セファロース型の樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製する。この手順の特徴は、アンモニウム塩の非存在下で行われるという点である。
【００１９】
加えて、ＮｉセファロースＨＰ樹脂を用いた金属キレート・クロマトグラフによるＦＶＩＩの精製の段階を実施する。
ＦＶＩＩを、カルシウムの存在下で活性化する。
【００２０】
これは生体由来の生成物であるため、病原因子を排除する少なくとも１つ、好ましくは２つまたはそれ以上の段階を含むようにすることが推奨される。際立った有効性のため、例えば、いずれのクロマトグラフ段階にも先立って溶媒／界面活性剤を使用した処理によるウイルス除去の段階を含むことが好都合である。この方法および得られる生成物は、例えば、ナノ濾過による追加のウイルス除去段階を含むことも可能である。
【００２１】
記載されている方法の好ましい一実施形態では、５から５．４の範囲のｐＨで３．５から４．５％のＰＥＧを使用した沈殿により、ＦｒＩＩ＋ＩＩＩから開始して、ＦＶＩＩを精製する。得られた沈殿物は再懸濁し、６から７の範囲のｐＨで５．５から６．５％のＰＥＧにより沈殿させる。この沈殿の上清からのＦＶＩＩの吸着は、中性に近いｐＨでＱ−セファロースＦＦタイプの樹脂を使用したイオン交換および５から６までの範囲のｐＨでＦＶＩＩを溶離することにより実施する。
【００２２】
その後、ＦＶＩＩは、適宜、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製し、オクチル・セファロースＦＦタイプの樹脂中でＦＶＩＩを吸着させる。この吸着は、中性ｐＨで行う。精製ＦＶＩＩは、中性ｐＨで１０ｍｍｏｌ／ｌ無水リン酸二ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸三ナトリウム二水和物、５００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを含む溶液を使って溶離する。
【００２３】
ＦＶＩＩに富む溶出液を、ＮｉセファロースＨＰ樹脂を使用した金属キレートカラムにかけ、７．５から８．５の範囲のｐＨでＦＶＩＩを吸着する。この樹脂により、高伝導状態で、さらに６から７の範囲のｐＨで、洗浄を実施することが可能になる。１０ｍｍｏｌ／ｌ無水リン酸二ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを含む中性ｐＨに調整した溶液でＦＶＩＩを溶離することにより、比活性が約２００ＩＵ／ｍｇタンパク質である高純度のＦＶＩＩを得ることが可能になる。
【００２４】
ＦＶＩＩの活性化は、カルシウムの添加により実施でき、精製プロセスの中間物質または最終物質のいずれにも適用することができ、これは前記したＦＶＩＩを得るための条件を変えることがない。
【００２５】
同様に、本発明の本質を変えることなく、病原因子を低減する１つまたは複数の段階を実施し、前記のプロセスに適用することができる。
【実施例】
【００２６】
例示するため以下で述べるのは、連続する段階１から４に分割された、本発明の例示的な一実施形態である。
【００２７】
第１段階
ＩＩ＋ＩＩＩのフラクションの抽出物を沈殿させて、不純物を含むＦＶＩＩのフラクションを得ること：
ＩＩ＋ＩＩＩのフラクションの初期懸濁は、５ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩と５％ソルビトールとの抽出溶液を用いて実施した。
【００２８】
懸濁が完了した後、攪拌しながら２〜６℃で１時間保持した。ｐＨを調整した後、ＰＥＧをフラクションＩＩ＋ＩＩＩの懸濁液に加えて、最終濃度を４％（ｗ／ｗ）とした。添加した後、懸濁液を３０分間攪拌した。得られた懸濁液に、ベントナイトを加え、その後２０分間攪拌した。この時点から、少なくとも４時間の静置段階を行った。この後、２０分間の遠心分離プロセスを行った。遠心分離プロセスが完了した後、上清を沈殿物から分離した。沈殿物を、リン酸緩衝液中に溶解し、この物質とフラクションＩＩ＋ＩＩＩの初期懸濁液の両方についてＦＶＩＩの分析的評価を実施した。活性試験では、ＣＯＡＳＥＴ（登録商標）ＦＶＩＩ（ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ）キットを使用した。この方法は、２つの工程に基づいている。第１の工程では、外因的経路（ＦＶＩＩ−トロンボプラスチン）により第Ｘ因子をＦＸａに活性化する。第ＶＩＩ因子は、このプロセスでＦＶＩＩａに完全に活性化され、したがって、この試験では、活性化される前のＦＶＩＩによる干渉はない。第２の工程では、生成された第Ｘａ因子は発色基質Ｓ−２７６５を加水分解し、発色基ｐＮＡを放出する。その色は、光度計で４０５ｎｍである。生成された第Ｘａ因子、すなわち色の強さは、試料の第ＶＩＩ因子の活性に比例する。再構成されたＰＥＧ沈殿物は、０．８６ＩＵ／ｍｌの第ＶＩＩ因子の活性を示す。これらの結果から、ＦＶＩＩの活性は、フラクションＩＩ＋ＩＩＩ中に存在すること、および記載した条件下で４％ＰＥＧを加えることにより得られる沈殿物中においてかなり回収されることがわかる。
【００２９】
第２段階
４％ＰＥＧ沈殿物から開始し、以下の順次的段階に従ってＦＶＩＩのフラクションを得て部分的に精製すること：
１．６％ＰＥＧによる沈殿：
４％ＰＥＧの沈殿物のフラクションの懸濁は、２０〜２５℃の温度で、抽出液（０．５ｍｏｌ／ｌＮａＯＨでｐＨ７．５にした５ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、および５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ）により実施した。再懸濁が完了した後、攪拌しながら２時間保持し、その後、５℃まで冷却し、ｐＨを６．５に調整した。この懸濁液を、５±３℃でｐＨ ６．５の４５ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌからなる溶液で希釈し、最終濃度６％（ｗ／ｗ）のＰＥＧが得られるまでＰＥＧを加えた。最後に、深皿で濾過することにより６％ＰＥＧの上清を清澄にし、ＰＥＧから沈殿物を分離した。このプロセスが完了した後、濾過溶液をＦＶＩＩの活性およびそのタンパク質含有量（光学濃度により評価）に関して分析し、０．１１ＩＵ／ＡＵの比活性を得た。この値は、第１段で説明されている方法により評価した、タンパク質概算値でＦＶＩＩの活性（ＩＵ／ｍｌ）を除算する計算で求められた。
【００３０】
この時点で、界面活性剤と共に有機溶媒を用いた処理によるウイルス不活化の段階を実施する。これらのウイルス不活化試薬は、その後、以下のクロマトグラフ段階において分離する。
【００３１】
２．−イオン交換クロマトグラフィー：
フラクションＩＩ＋ＩＩＩからの６％ＰＥＧの清澄化した上清から開始して、ＡＰＩで２０％まで希釈を行い、ｐＨを７．５に調整し、伝導性を低減させた。次いで、ＱセファロースＦＦ樹脂（すでに平衡化されている）を、得られた溶液に加え、これを、中程度の攪拌をしながら１時間保持した。その後、カラム（ＦＩＮＥ ＬＩＮＥ ＦＦ）への樹脂を含む懸濁液の充填を実施した。充填した後、樹脂を、２〜８℃の温度でｐＨ ７．５に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、１００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを用いて洗浄した。洗浄が完了したら、溶離液Ｑをカラム内に注入した。この溶離は、２〜８℃の温度でｐＨ ５．５に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、２００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを用いて行った。溶出液Ｑを評価したところ、ＦＶＩＩの比活性１．１６ＩＵ／ＡＵが得られた。
【００３２】
３．−疎水性相互作用クロマトグラフィー：
２．５モル／ｌＮａＣｌ、ｐＨ ７．０に調整された、温度２５±３℃のＱセファロース溶出液から始めて、ｐＨ ７．０、２５±３℃の温度で、１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、２５００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを使用してカラム（オクチル・セファロースＦＦ）を平衡化させた。次に、溶出液をカラム内に注入し、同じ平衡液（２５±３℃の温度）で洗浄した。次いで、ｐＨ ７．０、２５±３℃の温度で１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、１０ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、５００ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを用いて溶離を行った。オクチル溶出液を評価したところ、ＦＶＩＩの比活性３．７９ＩＵ／ＡＵという結果が得られた。これからわかるように、この第２段で得られた結果は、清澄化した６％ＰＥＧ上清における初期値の３４倍という３つの段階にわたる比活性の増大を反映している。
【００３３】
第３段階
ＮｉセファロースＨＰにおいてＭＣクロマトグラフィーを使ってオクチル溶出液から始めて、ＦＶＩＩの純粋フラクションを得ること：
まず、ＮｉセファロースＨＰカラムを、ｐＨ ８．０±０．０５に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、１モル／ｌＮａＣｌで平衡化した。次いで、オクチル溶出液をカラム内に注入した。これに続いて、２回洗浄を行った。１回目の洗浄は、高伝導性状態（１モル／ｌＮａＣｌ）の下で、続く２回目の洗浄はｐＨを下げて（６．５）行った。最後に、ｐＨ ７．０に調整した１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩、２５ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌを含む溶液で特異的な溶離を実施した。その結果得られたＮｉ溶出液について分析的評価を実施し、２０４ＩＵ／ＡＵの比活性の結果を得たが、これは、Ｑ溶出液と比較しておよそ５４倍の純度の増大を表している。
【００３４】
第４段階
カルシウムの添加によるＦＶＩＩの活性化：
この段階では、ＦＶＩＩは、Ｎｉセファロース溶出液から開始し、カルシウムの添加によりＦＶＩＩａに活性化した。これのために、ＦＶＩＩを含有するフラクションを、５０ｍｍｏｌ／ｌトリス、３０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、および２ｍｍｏｌ／ｌＣａＣｌ２の存在下で、２０時間、３０℃でインキュベートし、ＦＶＩＩの自動活性化をもたらした。ＦＶＩＩａの活性に関するこれらの試料の分析的評価は、第１国際ＦＶＩＩａ標準に従ってＳＴＡＣＬＯＴ（登録商標）ＶＩＩａ−ｒＴＦキット（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＡ ＳＴＡＧＯ）を使用することにより実施した。この方法の原理は、ｒｓＴＦがＦＶＩＩａの補因子としての特異的な機能を持つという事実に基づく。ＦＶＩＩａ、リン脂質、およびカルシウムの存在下でのｒｓＴＦは、血漿の血液凝固を生じさせる。このシステムでは、観察された凝固時間は、血漿内に最初に存在するＦＶＩＩのレベルに反比例することを示している。ｒｓＴＦは、ＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化しないため、試験において存在しているＦＶＩＩは、試験に干渉しない。それと平行して、ＦＶＩＩの活性の評価を、第１段階で説明された方法により実施した。こうして得られた活性化されたフラクション中のＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａの活性の結果から、３０．３のＩＵ ＦＶＩＩａ／ＩＵ ＦＶＩＩの比が示された。
【００３５】
この４つの段階で説明された手順の組み合わせにより、約６０５６ＩＵ／ＡＵのＮｉ溶出液から得られた活性化された第ＶＩＩ因子の比活性を評価することが可能になる。
【００３６】
存在しうるウイルス粒子または他の病原体を排除することを目的として、孔径１５ナノメーターのナノフィルタによる溶液のナノ濾過の最終段階を実施する。
【００３７】
本発明は、例示的な実施例を含む、前記の説明の中で説明されているが、当業者であれば、開示されている内容に基づいて、本発明の範囲内に含まれる変更形態および代替え形態を導入することができ、また請求項によってのみ限定されることは理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０００ＩＵ／ｍｇタンパク質の純度を有し、非ヒト由来のタンパク質を含まないことを特徴とするＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項２】
純度が少なくとも６０００ＩＵ／ｍｇタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項３】
ＦＶＩＩａが少なくとも１２０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項２に記載のＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項４】
ＦＶＩＩａがヒト血漿に由来することを特徴とする請求項１に記載のＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項５】
病原因子を排除する少なくとも１つの段階にかけたことを特徴とする請求項４に記載のＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項６】
ＦＶＩＩを、ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩ、またはＣｏｈｎ分画の相当物から始めて精製し、ＰＥＧによる沈殿、クロマトグラフィー、およびその活性化を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項７】
ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩ、または相当物の懸濁液を、３から７％の間のＰＥＧ濃度で沈殿させることを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項８】
ＦＶＩＩを、イオン交換クロマトグラフィーにより捕捉することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項９】
クロマトグラフ溶離を、ｐＨの変化により実施することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１０】
ＦＶＩＩを、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１１】
前記手順を、アンモニウム塩の非存在下で実施することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１２】
ＦＶＩＩの精製の段階を、金属キレート・クロマトグラフィーにより実施することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１３】
金属キレート樹脂がＮｉセファロースＨＰであることを特徴とする請求項１２に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１４】
ＦＶＩＩを、カルシウムの存在下で活性化することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１５】
ウイルス除去の少なくとも１つの特定の段階を含むことを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１６】
ナノ濾過によるウイルス除去の段階を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１７】
溶媒／界面活性剤を用いた処理によるウイルス除去の段階を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１】
少なくとも１０００ＩＵ／ｍｇタンパク質の純度を有し、非ヒト由来のタンパク質を含まないことを特徴とするＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項２】
純度が少なくとも６０００ＩＵ／ｍｇタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項３】
ＦＶＩＩａが少なくとも１２０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項２に記載のＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項４】
ＦＶＩＩａがヒト血漿に由来することを特徴とする請求項１に記載のＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項５】
病原因子を排除する少なくとも１つの段階にかけたことを特徴とする請求項４に記載のＦＶＩＩａの治療製剤。
【請求項６】
ＦＶＩＩを、ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩ、またはＣｏｈｎ分画の相当物から始めて精製し、ＰＥＧによる沈殿、クロマトグラフィー、およびその活性化を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項７】
ＦｒＩＩ＋ＩＩＩ、ＦｒＩＩＩ、または相当物の懸濁液を、３から７％の間のＰＥＧ濃度で沈殿させることを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項８】
ＦＶＩＩを、イオン交換クロマトグラフィーにより捕捉することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項９】
クロマトグラフ溶離を、ｐＨの変化により実施することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１０】
ＦＶＩＩを、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１１】
前記手順を、アンモニウム塩の非存在下で実施することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１２】
ＦＶＩＩの精製の段階を、金属キレート・クロマトグラフィーにより実施することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１３】
金属キレート樹脂がＮｉセファロースＨＰであることを特徴とする請求項１２に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１４】
ＦＶＩＩを、カルシウムの存在下で活性化することを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１５】
ウイルス除去の少なくとも１つの特定の段階を含むことを特徴とする請求項６に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１６】
ナノ濾過によるウイルス除去の段階を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【請求項１７】
溶媒／界面活性剤を用いた処理によるウイルス除去の段階を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＦＶＩＩａの治療製剤を得るための方法。
【公開番号】特開２００７−２１７４１５（Ｐ２００７−２１７４１５Ａ）
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３５６７３（Ｐ２００７−３５６７３）
【出願日】平成１９年２月１６日（２００７．２．１６）
【出願人】（５０５３９５９７３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１６日（２００７．２．１６）
【出願人】（５０５３９５９７３）
【Ｆターム（参考）】
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