転写産物の作成方法
【課題】転写産物の作成方法の提供。
【解決手段】本発明は、：
プライマー領域及び目的の領域を含む、増幅すべきＲＮＡ配列、並びに
プロモーター領域、及び、増幅すべきＲＮＡ配列のプライマー領域にハイブリダイズできる領域を含む増幅プライマー：
から転写産物を作成する方法であって、
一定温度で実施され、かつ、工程：
ａ プライマーと増幅すべきＲＮＡとをハイブリダイズする工程、
ｂ 酵素でプライマーを伸長させて、増幅すべきＲＮＡのｃＤＮＡ配列を作成する工程、
ｃ ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡを酵素で切断し、ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ 増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、酵素で伸長させ、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ 酵素で、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡ転写産物を得る工程：を含む方法に関する。
【解決手段】本発明は、：
プライマー領域及び目的の領域を含む、増幅すべきＲＮＡ配列、並びに
プロモーター領域、及び、増幅すべきＲＮＡ配列のプライマー領域にハイブリダイズできる領域を含む増幅プライマー：
から転写産物を作成する方法であって、
一定温度で実施され、かつ、工程：
ａ プライマーと増幅すべきＲＮＡとをハイブリダイズする工程、
ｂ 酵素でプライマーを伸長させて、増幅すべきＲＮＡのｃＤＮＡ配列を作成する工程、
ｃ ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡを酵素で切断し、ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ 増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、酵素で伸長させ、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ 酵素で、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡ転写産物を得る工程：を含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸配列を増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸及び遺伝子材料に関する技術において、生体、この生体の細胞抽出物又は任意の他の生物試料中に遺伝子、遺伝子の一部又はヌクレオチド配列が存在するかどうかを決定することがしばしば必要とされる。特定のヌクレオチド配列の探索、特に病原性生物の検出、対立遺伝子の存在の検出、宿主ゲノム中の損傷の検出、及び、特異的ｍＲＮＡ又は細胞宿主の修飾の検出において、非常に有利である。従って、特定の遺伝子の発現を分析し、さらにはこれを定量することによって、多くの遺伝的疾患を診断することができる。また、こうした遺伝子発現の定量は、基本的なことでもある。
【０００３】
核酸の検出方法は、種々の方法が文献中に記載されている。これらの方法、特にポリヌクレオチドの検出を要する方法は、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖中の二本鎖ＤＮＡの塩基アデニンとチミンの間（Ａ−Ｔ）並びに塩基グアニンとシトシンの間（Ｇ−Ｃ）、又は、ＤＮＡ−ＲＮＡ若しくはＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖中の塩基アデニンとウラシルの間（Ａ−Ｕ）での水素結合の形成による、核酸の相補鎖の対形成特性に基づく。核酸鎖の対形成は、一般的に、「核酸ハイブリダイゼーション」、又は、単に「ハイブリダイゼーション」と呼ばれる。
【０００４】
一般的に、分析したい生物又は疾患について特異的な配列を同定した後、核酸を試料から抽出して、この配列（「目的の配列」ともいう）が存在するかどうかも決定しなければならない。この目的のために、多くの検出方法が開発されている。
【０００５】
核酸試料中において目的の配列を検出する最も直接的な方法は、標的核酸の一部と十分に相補的な配列を有していて標的核酸とハイブリダイズできる「プローブ」の取得である。この合成プローブを核酸含有試料と接触させると、目的の配列が存在する場合には、プローブがハイブリダイズして反応産物が形成される。目的の配列が存在せず、かつ、非特異的なハイブリダイゼーション現象が妨げられる場合には、反応産物は形成されない。合成プローブが検出可能な標識に結合すると、標識の存在量を測定することによって反応産物を検出することができる。使用可能な方法の例としては、サザンブロッティング（非特許文献１）又はノーザンブロッティング又はドットブロット技術又はサンドウィッチハイブリダイゼーション（非特許文献２）が挙げられる。
【０００６】
しかし、このアプローチの主要な難点は、試料中に存在する目的の配列のコピー数が少ない場合にはこのアプローチを直接適用できないということである。これらの条件下では、この反応のバックグラウンドノイズよりも大きな重要なシグナルを識別すること（すなわち、目的とする配列へのプローブの特異的結合と、目的の配列以外の配列とプローブとの間の非特異的結合とを区別すること）は難しい。この問題を解決する方法の１つとして、補助的な反応による検出シグナルの増強がある。その結果として、これらのハイブリダイゼーション技術の検出能力を増強する種々の方法が報告されている。これらの「増幅」方法は、標的増幅、プロ増幅（ｐｒｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又はシグナル増幅の３つのカテゴリーに分類することができる。論文としては、まず、Ｌｅｗｉｓ（非特許文献３）が、次いで、Ａｂｒａｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ（非特許文献４）が、これらの方法の優良な総説を構成している。
【０００７】
標的増幅は、試料中に存在する核酸断片を特異的に増加させることからなる。これにより、検出すべき標的核酸配列のコピー数を大いに増加させることができる。
【０００８】
文献に記載された標的増幅技術は、主に、増幅すべき標的配列にハイブリダイズしたヌクレオチドプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ合成サイクルの反復（ＰＣＲと呼ばれる「ポリメラーゼ連鎖反応」、特許文献１〜４を参照；「修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」又はＲＣＲと呼ばれる方法：特許文献５を参照；「鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（ＳＤＡ）と呼ばれる方法：特許文献６を参照；「エキソヌクレアーゼ媒介鎖置換増幅（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」法：特許文献７を参照）に基づくか、あるいは、ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写反応によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成サイクルの反復に基づく。
【０００９】
転写産物の増幅に基づくこれらの標的増幅方法のいくつかが記載されている。特許文献８に記載された「ＴＡＳ」法は、３工程サイクルの反復からなる。第一の工程によって、逆転写酵素及びファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターに特異的な配列を含むデオキシヌクレオチドプライマーの存在下において、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することができる。ＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二本鎖を熱変性させた後、アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの存在下において、逆転写酵素により、一本鎖ｃＤＮＡ鎖を複製する。この第二の工程で上記のように得られるＤＮＡホモ二本鎖は、ファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが結合し得る二本鎖プロモーターを含む。第三の工程は転写であり、鋳型１つ当たりＲＮＡ分子が３０〜１０００個作成され、続いてこれらはｃＤＮＡ合成用の鋳型として用いられて、増幅サイクルが続行される（非特許文献５）。
【００１０】
種々のＴＡＳ由来の方法が存在し、特許文献９及び１０に記載の「自己持続配列複製」（すなわち３ＳＲ）、特許文献１１及び１２に記載の「核酸配列に基づく増幅」（すなわちＮＡＳＢＡ）法、並びに、特許文献１３に記載の「単一プライマー配列複製」（すなわちＳＰＳＲ）法が挙げられる。
【００１１】
これらの方法は、一般的に、以下の３つの酵素活性の組み合わせを共通して有する：ＲＮＡ依存性及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ、大腸菌及び／又は逆転写酵素に関連する酵素活性を有する酵素）、並びに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼ）。これらの方法は同じ原理に基づいており、逆転写反応及び転写反応の連続的なプロセスに従って一定温度（３７〜４５℃）で実施され、ｃＤＮＡによって標的ＲＮＡが複製される。ＴＡＳの場合と同様、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ファージ）結合部位は、逆転写工程に用いられるプライマーによってｃＤＮＡ中に導入される。しかし、ＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二本鎖の変性は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性によるこのヘテロ二本鎖のＲＮＡの特異的加水分解によって等温的に実施される。続いて、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、逆転写酵素により、遊離のｃＤＮＡが複製される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ／ＤＮＡホモ二本鎖がＲＮＡに転写され、このＲＮＡが、その後のサイクルの鋳型として再び使用され得る。
【００１２】
「ライゲーション活性転写（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）」（又はＬＡＴ）と呼ばれる他の方法が特許文献１３に記載されているが、この方法は、３ＳＲ、ＳＰＳＲ及びＮＡＳＢＡ法と同じ酵素活性を用い、かつ同じサイクルで操作される。しかし、上記方法は、プロモーター配列を設置する方法であるという点で異なり、この場合、上記配列は、ＤＮＡリガーゼの存在下で、プロモーターを含むステム−ループ構造のライゲーションにより、ｃＤＮＡの末端上に導入される。
【００１３】
また、転写産物の増幅に基づいた標的増幅には、上記以外にも２つあり、これらは特許文献１４に記載されている。そのうちの１つは、プロモーターが２つの異なるオリゴヌクレオチドからなるということ以外はＬＡＴと同じである。他方は、リガーゼと、二本鎖ＤＮＡプロモーターを認識してＲＮＡ鋳型に沿って伸長できるＲＮＡポリメラーゼとの２つの酵素活性を用いる。可動プロモーターと呼ばれるプロモーターは、２つのオリゴヌクレオチドからなる。一方は、標的ＲＮＡの３’末端におけるハイブリダイゼーションのためのセンスプロモーター配列及びプローブ配列を有し、他方は、アンチセンスプロモーター配列のみを有する。アンチセンスプロモーターオリゴヌクレオチドの５’末端は、ハイブリダイゼーションによって標的の３’末端と並列しており、その後、この末端に結合する。適切なＲＮＡポリメラーゼで転写されることによって、複数の転写産物が合成される。これらの転写産物は、ハイブリダイズして、第二の可動プロモーターに結合する。ＲＮＡ鋳型が転写されることによって、相補的転写産物が合成される。このプロセスの反復によって、最初の標的配列を指数関数的に増幅することができる。
【００１４】
特許文献１５に記載された方法についても述べると、これは、核酸を非特異的に増幅する方法である。この増幅方法は転写にも基づくものであるが、プライマーは１つしか必要としない。後者は、３’位が封鎖されていて、これにより、センスＲＮＡの３’位に位置するＴ７プロモーター配列が付着できる。従って、この配列によって、アンチセンスｃＲＮＡの転写が可能となる。この方法は非特異的である、というのは、使用されるプライマーがｍＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズするからである。
【００１５】
一般的に、ＰＣＲ又はＮＡＳＢＡのような増幅方法は、増幅物を得るためにプライマーを２つ必要とする。その結果、増幅反応の産物自身が次の増幅の鋳型となり、増幅は指数関数的となる。これらの方法によれば増幅収量を非常に良好とすることができるが、いくつかの標的を同時増幅（複数増幅という）する際には（いくつかの遺伝子の発現特性を調べることが望ましい場合にこの工程は重要であるが）、依然として不向きである。さらに、特許文献１５に記載された方法は、総ｍＲＮＡの増幅に基づくものであり、このことはＤＮＡチップの分析においてバックグラウンドノイズの発生の原因となり得る。また、この方法は、遺伝子の３’領域に限定される。従って、この方法は、遺伝子の中間又は５’領域に位置する標的領域の変異を研究する際には不向きである。
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献３】米国特許第４，８００，１５９号
【特許文献４】欧州特許第２０１１８４号
【特許文献５】ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０１０６９号
【特許文献６】欧州特許第０４９７２７２号
【特許文献７】欧州特許第５００２２４号
【特許文献８】ＰＣＴ特許出願ＷＯ８８／１０３１５号
【特許文献９】ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０６９９５号
【特許文献１０】欧州特許第０３７３９６０号
【特許文献１１】ＰＣＴ特許出願Ｗ０９１／０２８１８号
【特許文献１２】欧州特許第３２９８２２号
【特許文献１３】米国特許第５１９４３７０号
【特許文献１４】欧州特許出願第３６９７７５号
【特許文献１５】ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９９／４３８５号
【非特許文献１】Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３（１９７５）
【非特許文献２】ＤＵＮＮ Ａ，Ｒ，ａｎｄ ＨＡＳＳＥＬ Ｊ．Ｋ．，Ｃｅｌｌ，１２，２３（１９７７）
【非特許文献３】Ｌｅｗｉｓ，１９９２，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １２：ｌ−９
【非特許文献４】Ａｂｒａｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ，１９９３，Ｃｕｒｅｒ．Ｏｐｕｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４１４７
【非特許文献５】ＤＡＶＩＳら，１９９０．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：１３−２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、異なる遺伝子の標的領域を同時に増幅できる特異的な連続増幅方法であって、遺伝子の３’位、５’位又は中間に位置する上記標的領域に対して実施可能な方法を提供することによって、先行技術の欠点を全て解決することを提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これについて、本発明は、
以下：
・“プライマー”領域及び目的の領域を含む、増幅すべきＲＮＡ配列、並びに
・プロモーター領域、及び、上記増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む増幅プライマー：
から転写産物を作成する方法であって、
上記方法は、一定温度で実施され、かつ、以下の工程：
ａ．上記プライマーと増幅すべきＲＮＡとをハイブリダイズする工程、
ｂ．逆転写酵素酵素活性によってプライマーを伸長させて、増幅すべきＲＮＡの相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を作成する工程、
ｃ．上記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を使用して切断し、上記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ．上記増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、逆転写酵素及び鎖置換酵素を使用して伸長させ、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ．ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を使用して、工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡ転写産物を得る工程：
を含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明の目的について、用語「“転写産物”」は、転写の産物、すなわち、転写を開始したプロモーターの制御下において鋳型が転写される間に新たに合成されたＲＮＡを意味する。
【００１９】
用語「“配列”」は、ハイブリダイゼーション反応の可能な、天然の塩基（本質的にデオキシリボヌクレオチド配列である場合にはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔであり、本質的にリボヌクレオチド配列である場合にはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕである）及び／又は１つ以上の修飾塩基（例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン又は修飾塩基）を含むヌクレオチド配列を意味するものとする。また、ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド間結合（場合により、例えば、ホスホロチオエート、Ｈホスホネート、アルキルホスホネート結合を含む）が、又は、例えばα−オリゴヌクレオチド（仏国特許第２６０７５０７号）若しくはＰＮＡ（ＥＧＨＯＬＭら，１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５−１８９７）の場合にはその骨格が修飾され得る。修飾ポリヌクレオチド配列においては、上記に示したいくつかの修飾は、組み合わせた状態で存在していてもよい。この配列は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの性質のもの又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラの性質のものであってよく、一般的に少なくともデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド５つの「長さ」を有していてよく、必要に応じて少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでいてよい。配列１つに種々の領域が含まれていてよく、それぞれ種々の機能と関連している。
【００２０】
本発明の方法を実施するにあたって、開始点は増幅すべきＲＮＡ配列であり、これは増幅すべきＲＮＡの第一のモデルとして記載され得る。本発明の目的について、「増幅すべきＲＮＡ」は、任意のリボ核酸配列であってよい。好ましくは、増幅すべきＲＮＡは、メッセージＲＮＡ（ｍｅｓｓａｇｅ ＲＮＡ）である。
【００２１】
増幅すべきＲＮＡは特に、「目的の領域」、すなわち、この目的の領域に特異的なハイブリダイゼーションプローブによりハイブリダイズされ得るポリヌクレオチドを含む。従って、このプローブによれば、本明細書の以下に記載するように、目的の領域が存在するか存在しないかを検出できる。
【００２２】
この増幅すべきＲＮＡはまた、「“プライマー”領域」、すなわち、本発明の以下で定義される増幅プライマーが特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。好ましくは、“プライマー”領域は、増幅すべきＲＮＡ配列の目的の領域の３’領域に位置する。
【００２３】
「“他の配列／領域にハイブリダイズし得る配列又は領域”」という表現は、それぞれの場合に応じて公知の様式で決定され得るハイブリダイゼーション条件下で他の配列／領域にハイブリダイズし得る配列又は領域を意味するものとする。また、相補的配列／領域についても参照される。他の配列又は領域に厳密に相補的な配列又は領域とは、塩基のそれぞれが他の配列とずれることなく対を形成できる配列である。用語「“ハイブリダイゼーション”」は、十分に相補的な配列を有する２つのヌクレオチド断片が、適切な条件下で、安定かつ特異的な水素結合で二本鎖を形成することができるプロセスを意味するものとする。ハイブリダイゼーション条件は、厳密さ（すなわち、操作条件の厳密さ）により決定される。ハイブリダイゼーションを行う厳密さが大きくなるほど、特異性が高くなる。詳細には、厳密さは、プローブ／標的二本鎖の塩基組成により、及び、２つの核酸間のずれの程度により、定義される。厳密さは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質及び濃度、並びに／又は、ハイブリダイゼーション温度等の反応パラメータにも依存する可能性がある。ハイブリダイゼーション反応を行うべき条件の厳密さは、主に、用いるハイブリダイゼーションプローブに応じて異なる。これらのデータは全て周知であり、当業者であれば適切な条件を決定することができる。
【００２４】
本発明の目的のため、用語「“増幅プライマー”」は、増幅すべき（ＤＮＡ又はＲＮＡの性質の）核酸にハイブリダイズされた場合に放出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）反応を開始できる配列を意味するものとする。本発明で用いられるプライマーは、２つの領域に分けることができ、それらは、５’−３’方向に：
・ＲＮＡポリメラーゼにより認識されて転写、すなわちＲＮＡ合成を開始できるプロモーター領域。このプロモーター領域は、プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼにより転写を開始するための部位を含む。このプロモーター領域は、特に、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの鎖の１つを含む。例えば、ＲＮＡポリメラーゼの天然のプロモーター、天然のプロモーター由来であってその機能を保持した短縮配列、又は、ＭＯＬＬＥＧＡＡＲＤ Ｎ．Ｅ．ら １９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３８９２−３８９５に記載の転写を開始できる「ループ」構造を挙げることができる。また、このプロモーター領域は、転写の開始に有利な配列を含んでいてよく、これによって、無駄な転写産物の形成が制限される。ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性であってよく、これによりＤＮＡ配列からＲＮＡを転写することができる；
・増幅すべきＲＮＡの“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域、すなわち、増幅すべきＲＮＡの上記“プライマー”領域に相補的である領域。この領域は、本質的にＤＮＡであってよい。
【００２５】
従って、プライマーの５’末端は、上記増幅すべきＲＮＡとハイブリダイズしないヌクレオチド（プロモーターのアンチセンス配列、転写開始部位のアンチセンス配列等）を含んでいてよいが、３’末端は、適切な温度及び厳密な条件下でプライマーの伸長を開始できる長さ及びヌクレオチド組成を有している必要がある。本発明の好ましい実施形態によれば、プライマーは本質的にＤＮＡである。プライマーは３’が封鎖されていないため、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを安定化させることができる。
【００２６】
本発明の方法は等温的方法、すなわち、種々の工程の間に温度を変化させる必要のない方法である。本発明の好ましい実施形態によれば、上記方法は、３７℃〜５０℃、好ましくは４０℃〜４５℃、さらに好ましくは４１℃で実施される。
【００２７】
工程ａ）では、上記プライマーを、プライマー／増幅すべきＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションが可能な領域のレベルで、増幅すべきＲＮＡとハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションは、増幅すべきＲＮＡの所定の領域とプライマーの所定の領域との、適切な厳密さ及び温度条件下における相補性によって生じる。本発明の好ましい実施形態によれば、この工程の前に、増幅すべきＲＮＡの、好ましくは６５℃における変性からなる工程が実施される。
【００２８】
工程ｂ）では、プライマーを逆転写酵素酵素活性により伸長させて、増幅すべきＲＮＡの相補的デオキシリボ核酸配列（ｃＤＮＡ）を作成する。この工程には、相補性によるｃＤＮＡの合成のための酵素が使用するデオキシリボヌクレオチドが存在することが必要である。この伸長は、工程ａ）と同程度の適切な厳密さ及び温度条件下で、プライマーの５’−３’の向きで実施される。この逆転写酵素は、好ましくはＡＭＶ逆転写酵素である。
【００２９】
工程ｃ）では、上記ｃＤＮＡにハイブリダイズさせたＲＮＡを、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素で切断し、上記ｃＤＮＡにハイブリダイズさせたＲＮＡの断片を得る。ＲＮＡｓｅ Ｈ活性は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを加水分解できるが、一方、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは加水分解されない。ＲＮＡｓｅ Ｈ活性は、別々の酵素により、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈ酵素により、又は、特にＡＭＶ逆転写酵素などの逆転写酵素のＲＮＡｓｅ Ｈ活性を介して、得ることができる。
【００３０】
工程ｄ）では、上記ＲＮＡ断片の末端は、逆転写酵素及び鎖置換酵素により伸長されて、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡ複合体が得られる。この逆転写酵素は、好ましくはＡＭＶ逆転写酵素である。
【００３１】
工程ｅ）では、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡ複合体からＲＮＡ転写産物が得られる。転写は、転写されたヌクレオチド鎖にアンチパラレルでありかつ相補的なＲＮＡの５’−３’方向の合成により実施される。
【００３２】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有していてかつ使用される酵素は、プライマーのプロモーターに結合でき、かつ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプライマーの転写開始部位からＲＮＡの合成を開始することができる酵素である。本発明の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼであるが、バクテリオファージＴ３、ＳＰ６、ｇｈ−１等のＲＮＡポリメラーゼのような他のポリメラーゼも用いることができる。もちろん、プライマー上に位置するプロモーター配列は、工程ｅ）に用いられるＲＮＡポリメラーゼに対して好適である必要がある。
【００３３】
本発明の増幅方法は、適切な条件下で、その目的に必要とされる全ての化合物（すなわち、増幅すべきＲＮＡ、酵素、増幅プライマー及びデオキシリボヌクレオチド）を添加することにより実施できる。この反応媒体は、増幅プロセスを妨げる可能性がある剤、例えば、必要な酵素の活性を妨げる可能性のある物質、増幅すべきＲＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる可能性のある物質、又は、増幅産物を劣化させる可能性のある物質を含まない。
【００３４】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、工程ａ）〜ｅ）は、十分数の転写産物を得るのに十分な時間にわたって実施される。好ましくは、工程ａ）〜ｅ）は、３０分〜３時間３０分、より好ましくは１時間３０分〜２時間３０分にわたって実施される。
【００３５】
このように得られた転写産物は、続いて、当業者に公知の任意の技術により検出される。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の転写産物の作成方法は、以下の工程：
ｆ．上記目的の領域に特異的なハイブリダイゼーションプローブを使用して、作成されたＲＮＡ転写産物を検出する工程：
をさらに含む。
【００３７】
用語「“検出”」は、物理的方法による直接的検出、又は、標識を用いる検出方法のいずれかを意味するものとする。核酸の検出のために、多くの検出方法が存在する［例えば、Ｋｒｉｃｋａら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｎｏ．４５（４），ｐ．４５３−４５８、又は、Ｋｅｌｌｅｒ Ｇ．Ｈ．ら，ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，ｓｅｃｔｉｏｎ ５ ａｎｄ ６，ｐ．１７３−２４９を参照のこと］。用語「“標識”」は、シグナルを発生することができるトレーサーを意味するものとする。これらのトレースとしては、例えば比色法、蛍光又は発光により検出され得るシグナルを生じる酵素が挙げられ、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ；蛍光、発光又は染料化合物のような発色団；電子顕微鏡、又は、導電性などの電気的特性、アンペロメトリー若しくはボルタンメトリー法、又は、インピーダンス測定法により検出され得る電気的に密な基；デフラクション（ｄｅｆｒａｃｔｉｏｎ）、表面プラズモン共鳴若しくは接触角変動のような光学的方法により、又は、原子力顕微鏡、トンネル効果などの物理的方法により検出され得る基；３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉなどの放射性分子が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の増幅工程の間、ポリヌクレオチドは、例えば、増幅反応用の標識されたヌクレオチド三リン酸を用いて標識することができる。例えば、抗リガンドと反応可能なリガンドのような間接的なシステムを用いることもできる。リガンド／抗リガンド対は当業者に周知であり、この場合、例えば、金属（例えばニッケル）に対する、以下の対が挙げられる：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗遺伝子／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／そのポリヌクレオチドに相補的な配列、「“タグ”」と呼ばれるヒスチジンの連続的配列。この場合、結合剤を有しているのはリガンドである。抗リガンドは、前述されているように、標識により直接的に検出することができる、又は、リガンド／抗リガンドによって検出することができる。
【００３８】
標識されたヌクレオチドは、リボヌクレオチドであろう。また、ポリヌクレオチドは、増幅工程の後に、例えば、ＷＯ−Ａ−９１／１９８１２号に記載されたサンドウィッチハイブリダイゼーション技術により標識プローブをハイブリダイズすることによって標識することができる。このようなプローブはまた、ＰＣＴ特許出願ＷＯ０３／０９８２１７号に記載されるようなＯＬＩＳＡ技術においても用いることができる。
【００３９】
この検出は、本発明の増幅されたＲＮＡの上記目的の領域を認識するハイブリダイゼーションプローブを用いて実施することもできる。用語「“ハイブリダイゼーションプローブ”」は、所定の条件下で目的の領域と共にハイブリダイゼーション複合体を形成するためのハイブリダイゼーション特異性を有する５〜１００のヌクレオチドモチーフ、特に６〜３５のヌクレオチドモチーフを含むヌクレオチド断片を意味するものとする。このハイブリダイゼーションプローブは、「“捕捉”プローブ」であってよい。この場合、標的ヌクレオチド断片は、標識で予め標識されていてよい。“捕捉”プローブは、固定されているか、又は、任意の適切な手段で、すなわち、直接的に又は間接的に、例えば共有結合又は吸着により、固相支持体上に固定されていてよい。次いで、上記プローブと標識された標的ヌクレオチド断片との間でのハイブリダイゼーション反応が行われる。
【００４０】
ハイブリダイゼーションプローブは、「“検出”プローブ」であってもよい。この場合、ハイブリダイゼーションプローブは、標識で標識されていてよい。次いで、上記検出プローブと標的ヌクレオチド断片との間でハイブリダイゼーション反応が行われる。サンドウィッチアッセイにおいては、固相支持体に結合した捕捉プローブを用いてもよく、上記捕捉プローブに標的ヌクレオチド断片がハイブリダイズし、上記標的ヌクレオチド断片に検出プローブがハイブリダイズする。
【００４１】
“捕捉”プローブ又は“検出”プローブのいずれを用いるかには関係なく、「ハイブリダイゼーション反応」は、その上に核酸を固定可能なあらゆる材料を含む固相支持体上で行うことができる。必要に応じて化学修飾した合成材料又は天然材料を固相支持体として用いることができ、特に、セルロース系材料などの多糖類（例えば、紙、酢酸セルロース及びニトロセルロース又はデキストランなどのセルロース誘導体、特にスチレン系モノマーに基づくポリマー、コポリマー、綿などの天然繊維、並びに、ナイロンなどの合成繊維；シリカ、水晶、ガラス、セラミックなどの無機材料；格子；磁性粒子；金属誘導体、ゲルなどが挙げられる。固相支持体は、マイクロタイタープレート、ＰＣＴ特許出願ＷＯ−Ａ−９４／１２６７０号に記載の膜、粒子又はバイオチップの形態であってよい。用語「“バイオチップ”」は、多数の捕捉プローブが所定の位置に付加した、小さな固相支持体を意味するものとする。バイオチップの概念は、より詳細には、１９９０年初頭から始まったＤＮＡチップの概念である。現在では、タンパク質チップが開発され始めたため、この概念は拡大し続けている。これは、マイクロエレクトロニクス、核酸化学、画像分析及び情報技術を統合した複数の学科の技術に基づくものである。作動の原理は、分子生物学：ハイブリダイゼーション現象、すなわち、２つのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列の塩基の相補性による対形成を基礎にして構築される。
【００４２】
バイオチップ法は、固相支持体に結合した捕捉プローブの使用に基づくものであり、蛍光色素で直接的に又は間接的に標識された標的ヌクレオチド断片の試料が上記プローブに作用する。捕捉プローブは、特異的な様式で支持体又はチップ上に位置しており、それぞれのハイブリダイゼーションにより、標的ヌクレオチド断片に関連して、特定の断片的情報が得られる。得られる情報が蓄積されることによって、例えば、１つ又はそれ以上の標的遺伝子の発現レベルを定量できる。標的遺伝子の発現を分析する際に、標的遺伝子の全て又は一部に対応する非常に多数のプローブを有するバイオチップを調製してもよく、これはｍＲＮＡに転写される。次いで、分析が望まれる標的遺伝子由来のｍＲＮＡの相補的ＤＮＡを、例えばハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、支持体又はチップを洗浄し、例えばスキャナで読み取り、蛍光の分析を情報技術により処理する。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社により開発された分子診断用のＤＮＡチップを挙げることができる（“Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ ＤＮＡ ａｒｒａｙｓ”， Ｍ，Ｃｈｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７４，６１０−６１４， “Ｌｉｇｈｔ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”， Ａ．Ｃａｖｉａｎｉ Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，５０２２−５０２６）。この技術において、捕捉プローブは一般的にサイズが小さく、約２０ヌクレオチドである。バイオチップの他の例は、Ｇ．Ｒａｍｓａｙによる刊行物であるＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｎｏ．１６，ｐ．４０−４４； Ｆ．Ｇｉｎｏｔ，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，１９９７，Ｎｏ．１０，ｐ．１−１０； Ｊ．Ｃｈｅｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，１９９６，Ｎｏ．１（３），ｐ．１８３−２００； Ｔ．Ｌｉｖａｃｈｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，Ｎｏ．２２（１５），ｐ．２９１５−２９２１； Ｊ．Ｃｈｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｎｏ．１６，ｐ．５４１−５４６、又は、米国特許ＵＳ−Ａ−４，９８１，７８３号、米国特許ＵＳ−Ａ−５，７００，６３７号、米国特許ＵＳ−Ａ−５，４４５，９３４号、米国特許ＵＳ−Ａ−５，７４４，３０５号及び米国特許ＵＳ−Ａ−５，８０７，５２２号に記載される。ＰＣＴ特許出願ＷＯ０３／０９８２１７号に記載される、Ａｐｉｂｉｏ社により開発された低濃度チップを挙げることもできる。固相支持体の主な特徴は、捕捉プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションの特徴を保持する一方、検出方法についてはバックグラウンドノイズが最小であるものでなければならない。本発明は、これらの低濃度チップシステムに特に適している。
【００４３】
本発明の方法を実施することによって、種々の遺伝子に由来するＲＮＡ転写産物を作成することができる。異なる遺伝子の標的領域を同時に増幅できるということは、本発明のさ
らなる利点の１つであり、上記標的領域は遺伝子の３’位、５’位又は中間に配置されていてよい。
【００４４】
これに関し、本発明はまた、以下：
・少なくとも、“プライマー”領域及び目的の領域を含む第一の増幅すべきＲＮＡ配列、並びに、プロモーター領域、及び、上記第一の増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む第一の増幅プライマー、
・少なくとも、上記第一の増幅すべきＲＮＡ配列とは異なっていてかつ“プライマー”領域及び目的の領域を含む第二の増幅すべきＲＮＡ配列、並びに、プロモーター領域及び上記第二の増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む第二の増幅プライマー：から転写産物を作成する方法であって、
上記方法は、一定温度で行われ、かつ、以下の工程：
ａ）．上記第一及び第二のプライマーを、上記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
ｂ）．上記第一及び第二のプライマーを逆転写酵素の酵素活性により伸長させて、第一の増幅すべきＲＮＡの第一の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列及び第二の増幅すべきＲＮＡの第二の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を作成する工程、
ｃ）．上記第一及び第二のｃＤＮＡにそれぞれハイブリダイズした第一及び第二の増幅すべきＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により切断して、第一のｃＤＮＡにハイブリダイズした第一の増幅すべきＲＮＡの断片及び第二のｃＤＮＡにハイブリダイズした第二の増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ）．上記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、逆転写酵素及び鎖置換酵素により伸長して、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ）．工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、上記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡの転写産物を得る工程：
を含むことを特徴とする。
【００４５】
この方法に類似する方法を使用することによって、３、４、５、１０又はそれ以上の異なる遺伝子由来の増幅すべきＲＮＡから転写産物を作成することができる。
【００４６】
工程ａ）〜ｅ）は、上記に記載された様式に類似する様式で行われ、かつ、上記で定義されるように、十分数の転写産物を得るのに十分な時間にわたって実施される。
【００４７】
転写産物を検出するためには、好ましくは、工程ｆ）において、第一の増幅すべきＲＮＡの転写産物を検出するための第一のハイブリダイゼーションプローブ、及び、第二の増幅すべきＲＮＡの転写産物を検出するための第二のハイブリダイゼーションプローブが用いられる。
【００４８】
好ましくは、上記で定義されるように、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであり、より好ましくは、Ｔ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
添付の図面は、説明のための例示を目的とするものであり、いかなる場合も本質的に限定するものではない。これらにより、本発明をより明確に理解できるであろう。
【００５０】
図１は、本発明の方法の工程を概略的に表す。
【００５１】
図２は、本発明に従って及び実施例２に記載されるように得られた転写産物にハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブにより放射されたシグナルを表す。
【００５２】
図３は、実施例３に記載されたプロトコルに従って特定範囲の転写産物（１×１０７、１×１０８、１×１０９及び１×１０１０コピー）を増幅した後に得られる連続回帰を表す。
【００５３】
図４は、実施例４に記載されたプロトコルに従って得られる増幅産物のハイブリダイゼーション及び可視化後に、それぞれの特異的プローブについて放射されたシグナル（３回の平均）及びその標準偏差を表す。
【００５４】
図１において、リボ核酸性の配列は波線で表され、一方、デオキシリボ核酸性の配列は直線で表される。
【００５５】
工程ａ）において、ＤＮＡ性のプライマー（長い点線で表される）は、鋳型ＲＮＡの“プライマー”領域（太線で表される）にハイブリダイズするが、プライマーの５’位のプロモーター配列は鋳型ＲＮＡにハイブリダイズしない。本発明をより明確に理解するため、増幅期後に検出することが望ましい目的の配列を、“プライマー”領域の５’側に短い点線で表す。しかし、目的の配列及び“プライマー”配列は、１つの同じ配列であってよい。
【００５６】
工程ｂ）において、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する酵素を作用させることによって、鋳型ＲＮＡにハイブリダイズしたプライマーを５’−３’方向に伸長させる。鋳型ＲＮＡの配列に相補的な配列を有するＤＮＡ（ｃＤＮＡ、点線で表される）が得られる。従って、鋳型ＲＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖ハイブリッド配列が、標的領域と鋳型ＲＮＡの５’末端との間で得られる。相補性を有さないため、プライマーのプロモーター配列と、標的ＲＮＡの標的領域の３’側に位置する配列とは、ハイブリダイズしていない（一本鎖）配列のままである。
【００５７】
工程ｃ）において、ＲＮＡｓｅ Ｈ活性を有する酵素を作用させて、鋳型ＲＮＡ内において切断を誘発する。この切断は非特異的であり、ｃＤＮＡにハイブリダイズしたＲＮＡの断片の３’ＯＨ末端（十字で表される）が離れることができる。
【００５８】
工程ｄ）において、このようにして離れた３’ＯＨ末端は、逆転写酵素活性及び鎖置換活性を有する酵素により伸長される。プライマーのプロモーター配列に相補的な鎖が合成されると、伸長が停止する。このようにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用下で転写を開始し得る二本鎖プロモーター領域（円で表される）を含む種々のＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖ハイブリッド配列が得られる。２つの異なる切断部位から得られる２つの異なるハイブリッドは、例えばこのように表される。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素の作用により、工程ｅ）において、工程ｄ）で得られる種々のハイブリッドに対応するＲＮＡ転写産物を得ることができる。このようにして、大きさは異なるが、検出が望ましい目的の領域を全て含む転写産物の集団が得られる。
【００５９】
以下の実施例は、例示を目的とするものであり、いかなる場合も本質的に限定するものではない。これらにより、本発明をより明確に理解できるであろう。
【実施例１】
【００６０】
＜増幅すべきＲＮＡ配列の取得＞
配列番号１：
ＧＵＣＡＣＵＧＵＣＡ ＡＧＣＣＵＣＣＡＧＡ ＵＧＣＣＡＵＣＣＣＵ
ＵＵＧＡＣＵＵＧＡＡ ＡＡＣＵＣＡＧＣＣＡ ＧＵＵＵＧＧＧＵＧＧ
ＡＵＣＡＧＵＧＧＣＣ ＧＣＵＣＣＣＡＡＡＡ ＡＡＵＡＡＧＣＵＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＵＣＣＡ ＵＡＡＵＵＵＡＧＵＣ ＣＵＧＧＡＡＣＡＧＵ
ＵＡＧＡＡＵＵＧＧＧ ＡＣＡＣＡＵＵＧＡＧ ＧＡＡＵＣＵＵＵＣＵ
ＣＵＣＣＡＵＧＧＡＡ ＵＵＣＡＣＵＵＧＵＣ ＵＵＵＧＵＵＡＵＣＣ
ＡＡＡＡＧＡＡＡＵＣ ＵＧＧＧＧＡＡＡＡＣ ＡＧＡＧＡＡＵＧＣＵ
ＣＡＣＵＣＡＵＣＵＵ ＡＧＧＧＣＡＧＵＵＡ ＡＵＧＣＵＧＵＡＣＵ
ＵＣＡＡＣＣＵＣＵＧ ＧＧＧＡＣＡＵＵＡＣ ＡＡＵＣＵＧＧＣＵＵ
ＡＣＣＣＵＣＣＣＧＣ ＵＣＵＡＵＧＣＵＣＧ ＣＵＧＡＧＵＡＵＵＧ
ＧＣＣＵＣＵＡＡＵＣ ＣＵＣＡＵＡＧＡＵＣ ＵＵＡＡＡＧＡＵＵＧ
ＣＵＵＵＵＵＵＡＡＣ ＡＵＵＣＣＡＣＵＧＧ ＣＣＵＣＵＣＡＧＧＡ
ＣＵＵＵＧＡＡＡＡＧ ＵＵＵＧＣＵＵＵＵＡ ＵＧＧＵＣＣＣＵＵＣ
ＣＣＵＣＡＡＣＡＡＵ ＧＵＣＧＣＵＣＡＧＧ ＣＵＡＣＡＵＧＣＵＡ
ＣＵＡＵＵＧＧＡＡＡ ＧＵＣＣＵＡＣＣＡＣ ＡＡＧＧＣＡＵＧＣＵ
ＵＡＡＵＡＧＵＣＣＣ ＡＣＵＡＵＵＵＧＵＣ ＡＧＵＡＵＵＵＵＧＵ
ＧＧＧＧＣＧＵＧＵＧ ＣＵＵＣＡＡＣＣＵＧ ＵＣＡＧＧＧＡＵＣＡ
ＧＵＵＵＣＣＣＣＧＡ ＵＧＵＵＡＣＡＵＣＧ ＵＵＣＡＣＵＡＣＡＵ
ＧＧＡＵＧＡＵＣＵＣ ＣＵＣＵＧＣＡＣＡＧ ＣＣＣＣＣＣＣＡＵＡ
ＣＡＣＣＡＵＵＵＵＧ ＡＵＵＵＣＣＵＧＣＵ ＵＵＵＣＵＧＵＧＡＵ
ＵＣＡＡＣＡＧＧＣＣ ＡＵＵＵＣＡＧＡＡＧ ＣＡＧＧＵＵＵＧＡＣ
ＵＡＵＵＧＣＡＣＣＡ ＧＡＡＡＡＡＡＵＵＣ ＡＡＡＣＵＡＣＣＵＣ
ＵＣＡＵＵＵＵＣＡＡ ＵＡＵＵＵＧＧＧＣＡ ＵＧＣＡＧＵＵＧＧＡ
ＡＧＡＣＡＡＧＣＵＧ ＡＵＵＡＣＡＣＣＡＣ ＡＡＡＡＡＧＵＵＣＡ
ＧＣＵＵＡＧＧＡＧＡ ＧＡＣＧＣＣＵ：
に対応する増幅すべき第一のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＭＬ−４内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００６１】
同様にして、配列番号２：
ＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡ ＵＡＡＧＡＣＣＡＧ ＣＵＣＵＧＧＣＵＡＡ
ＧＣＧＧＵＧＧＣＣＡ ＡＧＡＧＵＧＵＧＧＧ ＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡ
ＣＣＣＵＣＣＡＧＧＧ ＵＵＧＧＣＡＧＵＣＡ ＡＣＣＡＡＧＣＣＣＣ
ＣＧＵＧＣＵＵＡＵＡ ＧＡＡＧＵＵＡＡＧＣ ＣＵＧＧＧＧＵＣＣＡ
ＧＣＣＧＧＵＵＡＧＧ ＣＡＡＡＡＡＣＡＧＵ ＡＣＣＣＧＧＵＣＣＵ
ＣＡＧＡＧＡＡＧＣＵ ＣＵＵＧＡＡＧＧＵＡ ＵＣＣＡＧＧＵＣＣＡ
ＵＣＵＣＡＡＧＵＧＣ ＣＵＡＡＧＡＡＣＣＵ ＵＵＡＧＡＡＵＵＡＵ
ＡＧＵＵＣＣＵＵＧＵ ＣＡＧＵＣＵＣＣＡＵ ＧＧＡＡＣＡＣＵＣＣ
ＣＣＵＣＣＵＧＣＣＵ ＧＵＵＣＣＣＡＡＧＣ ＣＵＧＧＧＡＣＣＡＡ
ＧＧＡＣＵＡＣＡＧＧ ＣＣＧＧＵＡＣＡＧＧ ＡＵＵＵＧＣＧＣＵＵ
ＧＧＵＵＡＡＵＣＡＧ ＧＣＵＡＣＡＧＵＧＡ ＣＵＵＵＡＣＡＵＣＣ
ＡＡＣＡＧＵＡＣＣＵ ＡＡＣＣＵＧＵＡＣＡ ＣＡＵＵＧＣＵＧＧＧ
ＧＵＵＧＣＵＧＣＣＡ ＧＣＵＧＡＧＧＡＣＡ ＧＣＵＧＧＵＵＣＡＣ
ＣＵＧＣＵＵＧＧＡＣ ＣＵＧＡＡＡＧＡＵＧ ＣＣＵＵＣＵＵＵＡＧ
ＣＡＵＣＡＧＡＵＵＡ ＧＣＣＣＣＵＧＡＧＡ ＧＡＣＡＧＡＡＧＣＵ
ＧＵＵＵＧＣＣＵＵＵ ＣＡＧＵＧＧＧＡＡＧ ＡＵＣＣＡＧＡＧＵＣ
ＡＧＧＵＧＵＣＡＣＵ ＡＣＵＣＡＡＵＡＣＡ ＣＵＵＧＧＡＣＣＣＡ
ＧＣＣＵＣＣＣＣＡＡ ＡＧＧＵＵＣＡＡＧＡ ＡＣＵＣＣＣＣＣＡＣ
ＣＡＵＣＵＵＵＧＧＧ ＧＡＧＧＣＧＵＵＧＧ ＣＵＣＧＡＧＡＣＣＵ
ＣＣＡＧＡＡＧＵＵＵ ＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧ ＡＣＣＵＡＧＧＣＵＧ
ＣＧＵＧＵＵＧＣＵＣ ＣＡＧＵＡＣＧＵＵＧ ＡＵＧＡＣＣＵＵＵＵ
ＧＣＵＧＧＧＡＣＡＣ ＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧ ＵＣＧＧＧＵＧＣＧＣ
ＣＡＡＧＧＧＡＡＣＡ ＧＡＵＧＣＵＣＵＡＣ ＵＣＣＧＧＣＡＣＣＵ
ＧＧＡＧＧＡＣＵＧＵ ＧＧＧＵＡＵＡＡＧＧ ＵＧＵＣＣＡＡＧＡＡ
ＡＡＡＡＡＧＣＵＣＡ ＧＡＵＣＵＧＣＣＧＡ ＣＡＧＣＡＧＧＵＡＵ
ＧＵＵＡＣＵＵＧＧＧ ＡＵＵＵＡＣＵＡＵＣ ＣＡＡＣＡＧＧＧＧＧ
ＡＧＣＡＣＡＧＣＣＵ ＧＧＧＡＵＣＡＧＡＡ ＡＧＡＡＡＧＣＡＧＧ
ＵＣＡＵＵＵＧＵＡＡ ＵＣＵＡＣＣＧＧＡＧ ＣＣＵＡＡＧＡＣＣＡ
ＧＡＡＧＧＣＡＧＧＵ ＧＡＧＡＧＡＡＵ：
に対応する増幅すべき第二のＲＮＡ配列は、ＨＥＲＶ−Ｅ４．１内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から作成した。
【実施例２】
【００６２】
＜実施例１で定義されるＲＮＡ配列からの、本発明の方法による転写産物の作成＞
配列番号１のＲＮＡ配列を増幅するため、
・Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（配列番号３において１〜１７番目）及び転写開始部位（配列番号３において１８〜２３番目）を含むプロモーター領域、
・増幅すべきＲＮＡ配列のプライマー領域にハイブリダイズできる領域（配列番号３において下線で示す）
を含む、配列番号３のプライマー配列を用いた。
配列番号３：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ＡＧＡＴＣＴＡＧＣＡ
ＧＣＡＴＡＧＧＧＧＧ ＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧ ＡＧＧＡＧＡＴＣＡＴ ＣＣ
【００６３】
このプライマーを、非−３’封鎖した。
【００６４】
プライマー領域にハイブリダイズできる領域は短くてもよく、特に１５〜３０塩基対を含むものであってよいということに留意すべきである。また、開始部位とプライマー領域にハイブリダイズできる領域との間に、無駄な転写産物の形成を制限するための、開始に有利な配列が含まれることにも留意すべきである。
【００６５】
配列番号２のＲＮＡ配列を増幅するため、
・Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（配列番号４において１〜１７番目）及び転写開始部位（配列番号４において１８〜２３番目）を含むプロモーター領域、
・増幅すべきＲＮＡ配列のプライマー領域にハイブリダイズできる領域（配列番号４において下線で示す）
を含む、配列番号４のプライマー配列を用いた。
配列番号４：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ＡＧＡＴＣＴＡＧＣＡ
ＧＣＡＴＡＣＡＧＣＡ ＡＡＡＧＧＴＣＡＴＣ ＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧ ＡＧ
【００６６】
このプライマーを、非−３’封鎖した。
【００６７】
プライマー領域にハイブリダイズできる領域は短くてもよく、特に１５〜３０塩基対を含むものであってよいということに留意すべきである。また、開始部位とプライマー領域にハイブリダイズできる領域との間に、無駄な転写産物の形成を制限するための、開始に有利な配列が含まれることにも留意すべきである。
【００６８】
転写産物の作成は、逆転写酵素活性を有する酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素（ＲＮａｓｅ Ｈ）及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を含む反応混合物（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓＢａｓｉｃ Ｋｉｔ，ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）中で実施した。
【００６９】
増幅は、以下のものの存在下で実施した：
・配列番号１のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号３のプライマー配列（０．５μＭ）、
・配列番号２のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号４のプライマー配列（０．５μＭ）、
・配列番号１のＲＮＡ配列及び配列番号２のＲＮＡ配列を同時に増幅するための配列番号３のプライマー配列（０．５μＭ）及び配列番号４のプライマー配列（０．５μＭ）。
【００７０】
従って、配列番号１のＲＮＡ配列の増幅及び配列番号２のＲＮＡ配列の増幅は、ビオチンを配合して、
・互いに独立に実施される：
この際、水溶液中の既知量の配列番号１のＲＮＡ又は配列番号２のＲＮＡ（Ｈ２Ｏ ５μｌ中のコピー数１×１０９又は１×１０１０）を、ＵＴＰ−ビオチン（０．６ｍＭ）及び配列番号１又は配列番号２を増幅するためのプライマーを予め添加した反応混合物（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ）１０μｌと混合する：
・同時に実施される：
この際、水溶液中の既知量の配列番号１のＲＮＡ又は配列番号２のＲＮＡを、ＵＴＰ−ビオチン及び配列番号１又は配列番号２を増幅するためのプライマーを予め添加した反応混合物（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ）１０μｌと混合した。
【００７１】
増幅反応のそれぞれにおいて、得られた容積は１５μｌであった（十分量（ｑｓ）ヌクレアーゼを含まない）。続いて、混合物を６５℃で５分間インキュベートし、次いで、４１℃で５分間インキュベートして、増幅すべきＲＮＡにプライマーをハイブリダイズさせた。
【００７２】
続いて、容積５μｌの酵素混合物（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ）を添加した。容積２０μｌの混合物を４１℃で９０分間インキュベートすることによって、以下のことを可能にした：
１．増幅すべきＲＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーション、
２．逆転写酵素の酵素活性を用いたプライマーの伸長による、増幅すべきＲＮＡの相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列の作成、
３．リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を用いた上記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの切断による、上記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの断片の取得、
４．逆転写酵素及び鎖置換酵素を用いた上記増幅すべきＲＮＡの断片の末端の伸長による、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの取得、
５．ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いた、工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡ転写産物の作成。
【００７３】
得られたＲＮＡ転写産物を、ＥＬＯＳＡ法（Ｍａｌｌｅｔ Ｆら，１９９３）により分析した。この方法によれば、マイクロタイタープレートウェルの底にグラフト化したオリゴヌクレオチドプローブ（検出プローブと呼ばれる）に核酸配列をハイブリダイゼーションすることによって、核酸配列を特異的に検出できる。
【００７４】
配列番号１を示すためのプローブは、配列番号５（ＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣ）の配列であった。
【００７５】
配列番号２を示すためのプローブは、配列番号６（ＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣ）の配列であった。
【００７６】
ＲＮＡ転写産物をビオチンで標識することにより、ストレプトアビジン−酵素複合体の作用による、及び、対応する基質の作用によるハイブリダイゼーションを可視化することができた。また、ＯＤは分光法により読み取った。ＯＤは、本発明の方法で作成された転写産物の量に比例していた。
【００７７】
得られた結果を図１に示す。文字Ａ〜Ｄは、配列番号１及び配列番号２を別々に増幅するための条件に対応し（Ａ：１×１０９コピーの配列番号１；Ｂ：１×１０９コピーの配列番号２；Ｃ：１×１０１０コピーの配列番号１；Ｄ：１×１０１０コピーの配列番号２）、一方、文字Ｅ〜Ｈは、配列番号１及び配列番号２の同時増幅に対応する（Ｅ：１×１０９コピーの配列番号１及び１×１０９コピーの配列番号２；Ｆ：１×１０１０コピーの配列番号１及び１×１０１０コピーの配列番号２；Ｇ：１×１０９コピーの配列番号１及び１×１０１０コピーの配列番号２；Ｈ：１×１０１０コピーの配列番号１及び１×１０９コピーの配列番号２）。得られた転写産物を、配列番号５の検出プローブの存在（灰色の欄）によって、又は、配列番号６の検出プローブの存在（黒色の欄）によって、検出した。
【００７８】
この結果から、検出されたシグナルが、別々の増幅と二本鎖内での増幅との中間に匹敵することが示される。
【００７９】
従って、作成された転写産物の数は、増幅すべきＲＮＡが配列番号１又は配列番号２のいずれを有するかにかかわらず、同等であった（条件Ａ及び条件Ｂに従って増幅した場合に、ＯＤの読み取り値は類似していた）。また、増幅すべきＲＮＡの量が多い場合の方が、作成された転写産物の数が多かった（条件Ｃによる増幅よりも条件Ａによる増幅の場合の方が、ＯＤの読み取り値が低かった；同様に、条件Ｄによる増幅よりも条件Ｂによる増幅の場合の方が、ＯＤの読み取り値が低かった）。
【００８０】
最後に、配列番号１及び配列番号２の同時増幅により作成された転写産物の数は、配列番号１及び配列番号２を別々に増幅して作成された転写産物の数と同様であった。１対数だけ異なる量の転写産物に対して同時増幅を行った場合においても、シグナルは、配列番号１及び配列番号２を別々に増幅して得られたシグナルと同じであった。
【００８１】
ＯＬＩＳＡチップ上で作成した転写産物の分析からも、同等の結果が得られた。ＯＬＩＳＡチップは、標準的な９６ウェルプレート形式上に並べた低密度ＤＮＡチップ（１チップ当たりプローブ最大１２８個）である。王冠形に配置されたオリゴヌクレオチド検出プローブを、ウェル底にグラフト化する。プローブ／標的ハイブリッドの色測定による可視化は、標的のビオチン標識化に関与するストレプトアビジン−酵素複合体を用いて行う。
【００８２】
さらなるＲＮａｓｅ消化工程により、検出された産物が実際にｃＲＮＡであることが確認された。
【００８３】
これらの結果から、本発明の方法が、ＤＮＡチップ上で転写産物を定量分析するために転写産物を増幅するのに特に適切であることが示される。というのは、この方法が転写的であって、かつ、増幅産物が増幅用の鋳型になることが全くないために、この増幅が連続的な性質を有し、従ってバイオチップ上での転写産物の定量に非常に適しているからである。
【実施例３】
【００８４】
＜本発明の方法における増幅についての連続性の評価＞
この実施例は、増幅すべきＲＮＡ配列として用いられる配列番号２及び増幅プライマーとして用いられる配列番号４に基づいて行う。
【００８５】
転写産物の作成方法は、実施例２に記載された条件に従って行う。この場合、配列番号２のプライマーを、０．５μＭの濃度で用いる。特定範囲の転写産物（１×１０７、１×１０８、１×１０９及び１×１０１０コピー）を増幅し、実施例２で展開された原理と同様の原理に従って、配列番号６のプローブを用いて反応産物をＯＬＩＳＡチップ上で分析する。
【００８６】
各点の少なくとも４つの測定値について得られた平均値から得られる連続回帰から、図３に表すような較正係数直線Ｒ２＝０．９７８１が得られる。従って、このことから、本発明の方法における増幅について連続性が証明される。
【実施例４】
【００８７】
＜複合的な増幅＞
この実験について、増幅プロトコルを実施例１及び２に記載のように行った。
【００８８】
配列番号７：
ＣＡＣＵＧＵＡＧＡＧ ＣＣＵＣＣＵＡＡＡＣ ＣＣＡＵＡＣＣＡＵＵ
ＡＡＣＵＵＧＧＡＡＡ ＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣ ＵＧＧＵＧＵＧＧＧＵ
ＡＡＡＵＣＡＧＵＧＧ ＣＣＡＣＵＡＣＣＡＡ ＡＡＣＡＡＡＡＡＣＵ
ＧＧＡＧＧＣＵＵＵＡ ＣＡＵＵＵＡＵＵＡＧ ＣＡＡＡＵＧＡＡＣＡ
ＧＵＵＡＧＡＡＡＡＧ ＧＧＵＣＡＵＡＵＵＧ ＡＧＣＣＵＵＣＡＵＵ
ＣＵＣＧＣＣＵＵＧＧ ＡＡＵＵＣＵＣＣＵＧ ＵＧＵＵＵＧＵＡＡＵ
ＵＣＡＧＡＡＧＡＡＡ ＵＣＡＧＧＣＡＡＡＵ ＧＧＣＡＵＡＵＧＵＵ
ＡＡＣＵＧＡＣＵＵＡ ＡＧＧＧＵＣＧＵＡＡ ＡＣＧＣＣＧＵＡＡＵ
ＵＣＡＡＣＣＣＡＵＧ ＧＧＧＣＣＵＣＵＣＣ ＡＡＣＣＣＧＧＧＵＵ
ＧＣＣＣＵＣＵＣＣＧ ＧＣＣＡＵＧＡＵＣＣ ＣＡＡＡＡＧＡＵＵＧ
ＧＣＣＵＵＵＡＧＵＵ ＡＵＡＡＵＵＧＡＵＣ ＵＡＡＡＧＧＡＵＵＧ
ＣＵＵＵＵＵＵＡＣＣ ＡＵＣＣＣＵＣＵＧＧ ＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡ
ＵＵＧＣＧＡＡＡＡＡ ＵＵＵＧＣＣＵＵＵＡ ＣＵＡＵＡＣＣＡＧＣ
ＣＡＵＡＡＡＵＡＡＵ ＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧ ＣＣＡＣＣＡＧＧＵＵ
ＵＣＡＧＵＧＧＡＡＡ ＵＵＧＵＵＡＣＣＵＣ ＡＧＧＧＡＡＵＧＣＵ
ＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡ ＡＣＵＡＵＵＵＧＵＣ ＡＧＡＣＵＵＵＵＧＵ
ＡＧＧＵＣＧＡＧＣＵ ＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧ ＵＵＡＧＡＧＡＣＡＡ
ＧＵＵＵＵＣＡＧＡＣ ＵＧＵＵＡＵＡＵＵＡ ＵＵＣＡＵＵＡＵＡＵ
ＵＧＡＵＧＡＵＡＵＵ ＵＵＡＵＧＵＧＣＵＡ ＣＡＧＡＡＡＣＧＡＧ
ＡＧＡＵＡＡＡＵＵＡ ＡＵＵＧＡＣＵＧＵＵ ＡＵＡＣＡＵＵＵＣＵ
ＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧ ＧＵＵＧＣＣＡＡＵＧ ＣＡＧＧＡＣＵＧＧＣ
ＡＡＵＡＧＣＡＵＣＵ ＧＡＵＡＡＧＡＵＣＣ ＡＡＡＣＣＵＣＵＡＣ
ＵＣＣＵＵＵＵＣＡＵ ＵＡＵＵＵＡＧＧＧＡ ＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡ
ＡＡＡＵＡＧＡＡＡＡ ＡＵＵＡＡＧＣＣＡＣ ＡＡＡＡＡＡＵＡＧＡ
ＡＡＵＡＡＧＡＡＡＡ ＧＡＣＡＣＡＵＵＡＡ ＡＡＡＣＡＣＵＡＡＡ
ＵＧＡＵＵＵＵＣＡＡ ＡＡＡＵＵＧＣＵＧＧ ＧＡＧＡＵＡＵＵＡＡ
ＵＵＧＧＡＵＵＣＧＧ ＣＣＡＡＣＵＣＵＡＧ ＧＣＡＵＵＣＣＵＡＣ
ＵＵＡＵＧＣＣＡＵＧ ＵＣＡＡＡＵＵＵ：
に対応する増幅すべき第一のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＭＬ−２内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００８９】
同様にして、配列番号８：
ＵＡＵＣＣＡＡＵＵＵ ＧＧＧＵＡＧＡＣＣＡ ＧＵＧＧＣＣＵＵＵＡ
ＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡ ＡＡＵＵＧＣＡＡＡＧ ＡＧＣＣＣＡＵＧＡＧ
ＵＵＵＧＵＵＧＡＡＧ ＡＧＣＡＡＵＵＡＡＡ ＡＧＣＣＡＧＣＣＡＵ
ＡＵＡＧＡＡＣＣＡＵ ＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣ ＵＵＧＧＡＡＵＵＣＡ
ＣＣＣＡＵＵＵＵＣＡ ＵＣＡＵＵＣＣＣＡＡ ＡＡＡＧＵＣＵＧＧＵ
ＡＡＡＵＡＧＡＧＡＣ ＵＵＵＵＧＣＡＵＧＡ ＣＵＡＡＣＡＵＧＣＵ
ＡＵＣＡＡＵＧＣＵＡ ＡＵＵＵＧＡＡＡＣＣ ＵＡＵＧＧＧＡＣＣＣ
ＣＵＵＧＡＧＣＡＧＧ ＵＧＵＵＣＵＣＣＵＣ ＣＣＣＵＵＣＡＧＵＧ
ＡＵＵＣＣＵＵＧＡＧ ＡＵＵＧＧＣＡＵＡＵ ＡＡＵＡＧＵＵＡＵＵ
ＧＧＣＵＵＡＡＡＡＵ ＡＣＵＧＣＡＵＵＵＧ ＵＡＣＵＡＵＵＣＣＣ
ＵＵＵＧＣＡＧＡＡＣ ＡＧＧＡＣＡＧＡＧＡ ＡＡＡＡＵＵＵＧＵＧ
ＵＵＵＡＵＡＡＵＡＣ ＣＡＧＣＵＡＵＡＡＡ ＵＡＡＣＧＡＡＡＧＧ
ＣＣＡＧＣＵＣＣＣＣ ＧＡＵＵＵＣＡＣＵＧ ＧＡＡＡＧＵＧＣＵＵ
ＣＣＵＧＡＡＧＧＧＡ ＵＧＣＵＡＡＡＣＡＧ ＵＣＣＵＡＣＣＡＵＧ
ＵＧＵＣＡＧＵＡＵＣ ＡＵＧＵＡＡＡＵＣＡ ＡＧＣＵＵＵＧＣＵＣ
ＣＵＣＡＧＵＡＧＡＡ ＡＡＧＡＡＵＵＵＣＣ ＵＡＡＵＵＧＣＡＡＧ
ＡＣＵＡＵＵＣＡＵＵ ＵＵＡＵＧＧＡＵＧＡ ＵＡＵＵＵＵＡＣＵＡ
ＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡ ＵＧＧＡＵＣＣＡＧＣ ＡＣＵＵＵＵＡＡＧＵ
ＵＵＡＵＧＵＧＣＣＵ ＣＵＧＵＵＧＵＡＡＡ ＧＡＡＵＡＣＡＣＡＧ
ＵＵＡＡＧＡＧＧＵＵ ＵＡＡＵＣＡＵＡＧＣ ＡＣＣＵＧＡＡＡＡＡ
ＧＵＡＣＡＧＡＵＧＵ ＣＣＵＣＵＣＣＵＵＧ ＧＡＡＡＵＡＵＣＵＵ
ＧＧＧＵＡＣＡＵＡＣ ＵＡＡＣＵＵＣＧＵＧ ＧＵＣＡＧＵＡＡＧＡ
ＣＣＵＣＡＡＡＡＧＧ ＵＵＡＡＡＵＵＡＡＡ ＵＡＣＵＡＧＣＡＡＣ
ＵＵＡＣＡＣＡＣＣＵ ＵＡＡＡＵＧＡＵＵＡ ＵＣＡＧＡＡＡＵＵＡ
ＣＵＡＧＧＣＡＡＵＡ ＵＵＡＡＣＵＧＧＣＵ ＵＵＧＣＣＣＣＡＣＣ
ＵＵＧＧＧＣＡＵＡＡ ＣＵＡＣＵＧＡＵＡＡ ＧＵＵＡＣＡＧＡＡＣ
ＣＵＧＵＵＵＵＣＵＡ ＵＣＵＵＡＡＡＡＧＡ ＣＡＡＵＧＣＵＧＣＵ
ＣＵＡＧＡＣＵＣＵＣ ＣＣＡＧＧＵＡＵＵＵ ＡＡＣＵＣＣＵＧＣＡ
ＧＣＡＣＡＡＡＧＧＧ ＡＡＡＵＵＧＡＧＧＡ ＡＧＵＡＧＡＧＣＡＣ：
に対応する増幅すべき第二のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＭＬ−５内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９０】
同様にして、配列番号９：
ＣＡＣＣＣＵＵＡＣＣ ＣＵＧＣＵＣＡＡＵＧ ＣＣＡＡＵＡＵＣＣＣ
ＡＵＣＣＣＡＣＡＧＣ ＡＵＧＣＵＵＵＡＡＡ ＡＧＧＡＵＵＡＡＡＧ
ＣＣＵＧＵＵＡＵＣＡ ＣＵＣＧＣＣＵＧＣＵ ＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧ
ＣＵＵＣＵＡＧＡＡＣ ＣＵＡＵＡＡＡＣＵＣ ＵＣＵＵＵＵＣＡＡＵ
ＵＣＣＣＣＣＡＵＵＵ ＵＡＣＣＵＧＵＣＣＡ ＡＡＡＡＣＣＧＧＡＵ
ＡＡＧＵＣＵＵＡＣＡ ＧＡＣＵＡＧＵＵＣＡ ＧＡＡＵＣＵＧＣＧＵ
ＣＵＵＡＵＣＡＡＣＣ ＡＡＡＵＵＧＵＵＵＵ ＧＣＣＵＡＵＣＣＡＣ
ＣＣＵＧＵＧＧＵＧＣ ＣＣＡＡＣＣＵＧＵＡ ＣＡＣＵＣＵＵＵＵＧ
ＵＣＣＵＣＡＡＵＡＣ ＣＵＵＣＣＵＣＣＡＣ ＡＡＣＵＣＡＣＵＡＵ
ＵＣＣＧＵＧＣＵＵＧ ＡＵＣＵＵＡＡＡＧＡ ＵＧＧＵＵＵＵＵＵＣ
ＡＣＵＡＵＵＣＵＣＣ ＵＧＣＡＣＵＣＣＵＣ ＧＵＣＣＣＡＧＣＣＵ
ＣＵＣＵＵＵＧＣＵＵ ＵＣＡＣＣＵＧＧＡＣ ＵＧＡＣＣＣＵＧＡＣ
ＡＣＣＣＡＵＣＡＧＵ ＣＣＣＡＧＣＡＧＣＵ ＵＡＣＣＵＧＧＡＣＵ
ＧＵＧＣＵＧＣＣＧＣ ＡＡＧＧＵＵＵＣＡＧ ＧＧＡＣＡＧＣＣＣＵ
ＣＧＵＵＡＣＵＵＣＡ ＧＣＣＡＡＧＣＵＣＵ ＵＵＣＵＣＡＵＧＡＵ
ＣＵＡＣＵＵＵＣＣＵ ＵＣＣＡＣＣＣＣＵＣ ＣＧＣＵＵＣＵＣＡＣ
ＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵ ＡＵＡＵＵＧＡＵＧＡ ＧＣＵＵＣＵＵＣＵＵ
ＵＧＵＡＧＣＣＣＣＵ ＣＣＵＵＵＧＡＡＵＣ ＵＵＣＵＣＡＡＵＡＡ
ＧＡＣＡＣＡＣＵＵＣ ＵＧＣＵＣＣＵＵＣＡ ＧＣＡＵＵＵＡＵＵＣ
ＵＣＣＡＡＡＧＧＡＵ ＡＵＣＧＧＧＵＡＵＣ ＣＣＣＣＵＣＣＡＡＡ
ＧＣＵＣＡＡＡＵＵＵ ＣＵＵＣＵＣＣＡＵＣ ＣＧＵＵＡＣＣＵＡＣ
ＣＵＣＧＧＣＡＵＡＡ ＵＵＣＵＵＣＡＵＡＡ ＧＡＡＣＡＣＡＣＧＵ
ＧＣＵＣＵＣＣＣＵＧ ＣＣＧＡＣＣＧＵＧＵ ＣＵＧＡＣＵＡＡＵＣ
ＵＣＵＣＡＡＧＣＣＣ ＣＡＡＣＣＣＣＵＵＣ ＵＡＣＡＡＡＡＣＡＡ
ＣＡＡＣＵＣＣＵＵＵ ＣＣＵＵＣＣＵＧＧＧ ＣＧＵＧＧＵＵＧＧＡ
ＵＡＣＵＵＵＣＧＣＣ ＵＵＵＧＧＡＵＡＣＣ ＵＧＧＵＵＵＵＧＣＣ
ＡＵＣＣＵＡＡＣＡＡ ＡＡＣＣＡＵＵＡＵＡ ＵＡＡＡＣＵＣＡＣＡ
ＡＡＡＧＧＡＡＡＣＵ ＵＡＧＣＵＧＡＣＣＣ ＣＡＵＡＧＡＵＣＣＵ
ＡＡＡＵＣＣＵＵＵＣ ＣＣＣＡＣＵＣＣＵＣ ＵＵＵＣＵＧ：
に対応する増幅すべき第三のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＥＲＶ−Ｈ内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９１】
同様にして、配列番号１０：
ＣＵＧＡＡＧＣＵＣＵ ＵＡＡＡＧＧＡＵＵＡ ＣＡＧＧＡＵＡＵＵＧ
ＵＵＡＡＡＣＡＵＵＵ ＡＡＡＡＧＣＵＣＡＡ ＧＧＣＵＵＡＧＵＡＡ
ＧＧＡＡＡＵＧＣＡＧ ＣＡＧＵＣＣＣＵＧＣ ＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡ
ＵＵＣＵＡＧＧＡＧＵ ＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡ ＡＡＵＧＧＵＣＡＣＵ
ＧＧＡＧＡＣＵＡＧＵ ＧＣＡＡＧＡＵＣＵＵ ＡＧＡＣＵＣＡＵＣＡ
ＡＵＧＡＧＧＣＡＧＵ ＡＡＵＵＣＣＵＣＵＡ ＵＡＵＣＣＡＧＵＵＧ
ＵＡＣＣＣＡＡＣＣＣ ＣＵＡＵＡＣＣＣＵＧ ＣＵＵＵＣＵＣＡＡＡ
ＵＡＣＣＡＧＡＧＧＡ ＡＧＣＡＧＡＡＵＧＧ ＵＵＣＡＵＧＧＵＵＣ
ＵＧＧＡＣＣＵＣＡＡ ＧＧＡＵＧＣＣＵＵＣ ＵＵＣＵＧＵＵＵＣＣ
ＣＣＵＧＣＡＣＵＣＵ ＧＡＣＵＣＣＣＡＧＵ ＵＵＣＵＧＵＵＵＧＣ
ＣＵＵＵＧＡＧＧＡＵ ＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣ ＡＣＡＣＧＵＣＣＣＡ
ＡＣＵＵＡＣＡＵＧＧ ＡＵＧＧＵＣＵＵＧＣ ＣＡＣＡＡＧＧＧＵＵ
ＵＡＧＧＧＡＵＡＧＣ ＣＣＵＣＡＣＣＵＧＵ ＵＵＧＧＵＣＡＧＧＣ
ＡＣＵＧＧＣＣＣＡＡ ＧＡＵＣＵＡＧＧＣＣ ＡＣＵＵＣＵＣＡＡＧ
ＵＣＣＡＧＧＣＡＣＵ ＵＵＧＧＵＣＣＵＵＣ ＡＧＵＡＵＧＵＧＧＡ
ＵＧＡＵＵＵＡＣＵＵ ＵＵＧＧＣＵＡＣＣＡ ＧＵＵＣＡＧＡＡＧＣ
ＣＵＣＡＵＧＣＣＡＧ ＣＡＧＧＣＵＡＣＵＣ ＵＡＧＡＵＣＵＣＵＵ
ＧＡＡＣＵＵＵＣＵＡ ＣＣＵＡＡＵＣＡＡＧ ＧＧＵＡＣＡＡＧＧＣ
ＡＵＣＵＡＧＧＵＣＡ ＡＡＧＧＵＧＣＡＧＣ ＵＵＵＧＣＵＵＡＣＡ
ＧＣＡＧＧＣＵＡＡＡ ＵＡＵＣＵＡＧＧＣＣ ＵＡＡＵＣＵＵＡＧＣ
ＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣ ＡＧＧＧＣＣＣＵＣＡ ＧＣＡＡＧＧＡＡＵＧ
ＡＡＵＡＣＡＧＣＣＵ ＡＵＡＣＵＧＧＣＵＵ ＡＵＣＣＵＵＧＣＣＣ
ＵＡＡＧＡＣＡＵＵＡ ＡＡＡＣＡＧＵＵＧＣ ＡＧＧＧＧＵＵＣＣＵ
ＵＧＧＡＡＵＣＡＣＣ ＧＧＣＵＵＵＵＧＣＣ ＧＡＣＵＡＵＧＧＡＵ
ＣＣＣＵＧＧＡＵＡＣ ＡＧＵＧＡＧＡＵＡＧ ＵＣＡＧＧＣＣＣＣＵ
ＣＣＡＵＡＣＵＣＵＡ ＡＵＣＡＡＧＧＡＧＡ ＣＣＣ：
に対応する増幅すべき第四のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＥＲＶ−９内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９２】
同様にして、配列番号１１：
ＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣ ＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡ ＣＵＣＣＡＡＡＡＧＡ
ＵＵＧＵＵＡＡＧＧＡ ＣＣＵＡＡＡＡＧＣＣ ＣＡＡＧＧＣＣＵＡＧ
ＵＡＡＡＡＣＣＡＵＧ ＣＡＧＵＡＡＣＣＣＣ ＵＧＣＡＧＵＡＣＵＣ
ＣＡＡＵＵＵＵＡＧＧ ＡＧＵＡＣＡＧＡＡＡ ＣＣＣＡＡＣＡＧＡＣ
ＡＧＵＧＧＡＧＧＵＵ ＡＧＵＧＣＡＡＧＡＵ ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＡ
ＵＣＡＡＵＧＡＧＧＣ ＵＧＵＵＧＵＵＣＣＵ ＣＵＡＵＡＧＣＣＡＧ
ＣＵＧＵＡＣＣＵＡＧ ＣＣＣＵＵＡＵＡＣＵ ＣＵＧＣＵＵＵＣＣＣ
ＡＡＡＵＡＣＣＡＧＡ ＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧ ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＧ
ＵＣＣＵＧＧＡＣＣＵ ＵＣＡＧＧＡＵＧＣＣ ＵＵＣＵＵＣＵＧＣＡ
ＵＣＣＣＵＧＵＡＣＡ ＵＣＣＵＧＡＣＵＣＵ ＣＡＡＵＵＣＵＵＧＵ
ＵＵＧＣＣＵＵＵＧＡ ＡＧＡＵＡＣＵＵＣＡ ＡＡＣＣＣＡＡＣＡＵ
ＣＵＣＡＡＣＵＣＡＣ ＣＵＧＧＡＣＵＵＵＵ ＵＡＣＣＣＣＡＡＧＧ
ＵＵＣＡＧＧＧＡＵＡ ＧＵＣＣＣＣＡＵＣＵ ＡＵＵＵＧＣＣＡＧＧ
ＣＡＵＵＡＧＣＣＣＡ ＡＧＡＣＵＵＧＡＧＣ ＣＡＡＵＣＣＵＣＡＵ
ＡＣＣＵＧＧＡＣＡＣ ＵＵＧＵＣＵＵＣＧＧ ＵＡＧＧＵＧＧＡＵＧ
ＡＵＵＵＡＣＵＵＵＵ ＧＧＣＣＧＣＣＣＡＵ ＵＣＡＧＡＡＡＣＣＵ
ＵＧＵＧＣＣＡＵＣＡ ＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡ ＧＣＧＣＵＣＵＵＣＡ
ＡＵＵＵＣＣＵＣＧＣ ＵＡＣＣＵＧＵＧＧＣ ＵＡＣＡＵＧＧＵＵＵ
ＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡ ＧＧＣＵＣＡＡＣＵＣ ＵＧＣＵＣＡＣＡＧＣ
ＡＧＧＵＵＡＣＵＵＡ ＧＧＧＣＵＡＡＡＡＵ ＵＡＵＣＣＡＡＡＧＧ
ＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣ ＣＵＣＡＧＵＧＡＧＧ ＡＡＣＡＣＡＵＣＣＡ
ＧＣＣＵＡＵＡＣＵＧ ＧＣＵＵＡＵＣＣＵＣ ＡＵＣＣＣＡＡＡＡＣ
ＣＣＵＡＡＡＧＣＡＡ ＣＵＡＡＧＧＧＧＡＵ ＵＣＣＵＵＧＧＣＧＵ
ＡＡＵＡＧＧＵＵＵＣ ＵＧＣＣＧＡＡＡＡＵ ＧＧＡＵＵＣＣＣＡＧ
ＧＵＡＵＧＧＣＧＡＡ ＡＵＡＧＣＣＡＧＧＵ ＣＡＵＵＡＡＡＵＡＣ
ＡＣＵＡＡＵＵＡＡＧ ＧＡＡＡＣＵＣＡＧＡ ＡＡＧＣＣＡＡＵＡＣ
ＣＣＡＵＵＵＡＧＵＡ ＡＧＡＵＧＧＡＣＡＡ ＣＵＧＡＡＧＵＡＧＡ
ＡＧＵＧＧ：
に対応する増幅すべき第五のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＥＲＶ−Ｗ内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９３】
同様にして、配列番号１２：
ＡＵＣＡＵＡＡＵＣＣ ＡＡＵＧＣＣＡＧＵＣ ＡＣＣＣＵＧＧＡＡＣ
ＡＣＵＣＣＡＣＵＵＵ ＵＧＣＵＧＧＵＡＣＡ ＡＡＡＡＣＣＡＵＵＧ
ＣＣＵＧＧＡＣＣＡＧ ＧＡＵＣＵＧＡＵＧＡ ＧＵＡＵＡＵＡＣＵＧ
ＧＵＧＣＡＧＧＧＣＵ ＵＧＣＡＵＧＣＵＧＵ ＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣ
ＡＣＧＧＵＧＡＣＣＡ ＵＡＣＡＵＣＣＡＧＵ ＡＧＵＡＣＣＡＡＡＣ
ＣＵＧＵＡＵＡＣＵＵ ＵＡＡＵＧＧＧＡＣＵ ＵＡＵＵＣＵＡＧＣＡ
ＡＧＵＧＣＣＡＣＣＵ ＧＧＵＵＵＡＣＡＧＵ ＣＣＵＧＧＡＣＵＵＡ
ＡＡＧＧＡＵＧＣＵＵ ＵＣＣＵＣＵＧＵＣＵ ＣＵＡＣＣＵＧＧＣＡ
ＣＣＡＧＵＵＡＧＵＣ ＡＧＣＣＣＡＵＣＵＵ ＵＧＣＡＵＵＵＵＡＡ
ＵＧＧＧＡＣＡＡＵＵ ＣＡＧＵＣＡＣＡＧＧ ＣＡＣＡＧＧＧＧＧＡ
ＣＡＧＣＵＣＧＣＣＵ ＧＧＡＣＵＡＧＵＣＵ ＣＣＣＡＣＡＡＧＧＧ
ＵＵＣＡＡＧＡＡＵＵ ＣＵＣＣＣＡＣＡＡＵ ＣＵＵＵＧＧＧＧＡＡ
ＧＣＡＣＵＧＧＣＣＵ ＣＡＧＡＣＣＵＣＡＡ ＧＧＣＡＵＡＣＡＣＣ
ＣＣＡＣＣＡＡＡＵＧ ＡＣＡＡＣＵＧＣＧＣ ＣＵＵＧＵＵＧＣＡＧ
ＵＡＣＡＵＡＧＡＣＡ ＡＣＣＣＵＵＣＵＵＵ ＵＧＧＣＡＧＣＣＣＣ
ＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡ ＧＧＡＣＵＧＵＡＡＣ ＵＧＧＧＧＧＡＡＣＣ
ＣＡＧＧＡＣＣＵＣＣ ＵＣＣＡＵＣＵＣＵＵ ＡＵＧＧＧＡＡＡＧＣ
ＡＧＧＧＵＡＵＡＧＡ ＧＵＡＵＣＣＡＡＡＡ ＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡ
ＡＡＵＵＵＧＣＣＡＵ ＧＡＡＡＡＧＧＵＵＡ ＡＡＵＡＵＵＵＡＧＧ
ＣＵＵＣＡＵＡＧＵＡ ＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧ ＡＡＣＧＣＵＧＧＣＵ
ＵＧＧＣＣＡＵＧＧＡ ＵＧＡＡＡＧＣＡＡＧ ＣＣＡＵＵＵＧＵＧＣ
ＡＣＵＵＣＣＡＡＣＵ ＣＣＡＡＣＣＡＣＣＵ ＧＧＣＧＣＣＡＡＡＵ
ＡＧＧＧＧＡＡＵＵＣ ＵＵＡＧＧＧＧＣＡＧ ＣＡＧＧＧＵＵＣＵＧ
ＣＣＡＵＡＵＣＵＧＧ ＡＵＣＣＣＡＡＡＵＵ ＵＣＵＣＡＣＵＵＡＵ
ＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣ ＵＵＡＵＡＵＧＡＡＧ ＣＣＡＣＡＡＧＧＧＡ
ＧＧＧＵＧＡＡＡＡＧ ＧＡＡＣＣＣＣＵＣＣ ＵＣＵＧＡＡＡＧＧＣ
ＵＧＡＣＣＡＧＡＡＧ ＡＡＧＧＵＧＵＵＵＡ ＡＡＣＡＡＡＵＣＡＡ
ＡＧＡＡＧＣＵＣＵＡ ＡＣＵＣＡＧＧＣＵＣ ＣＡＧＣＣＵＵＡＧＧ
ＡＣＵＧＣＣＡＧＡＵ ＡＣＵＡＣＵ：
に対応する増幅すべき第六のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＥＲＶ−Ｒ内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９４】
同様にして、配列番号１３：
ＵＵＡＡＵＧＧＡＧＵ ＵＡＵＧＧＣＵＣＡＧ ＧＵＣＵＧＡＣＵＵＡ
ＣＡＧＣＡＧＧＵＣＣ ＡＧＵＧＧＧＵＣＣＣ ＵＧＧＡＣＵＣＡＵＣ
ＣＵＧＵＧＵＵＣＡＵ ＵＵＵＣＣＣＡＧＵＧ ＣＣＡＧＡＡＵＧＣＡ
ＵＡＡＵＵＧＧＣＡＵ ＵＧＵＣＡＵＡＣＵＵ ＡＧＡＧＧＣＵＧＧＣ
ＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡ ＣＡＵＵＧＡＵＵＣＵ ＧＵＧＡＣＵＧＧＵＡ
ＡＧＧＵＧＡＧＧＧＣ ＵＡＵＵＡＵＧＧＵＧ ＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡ
ＡＡＵＧＧＡＡＧＣＣ ＡＵＵＧＧＡＧＣＵＧ ＣＣＵＵＵＡＣＣＵＡ
ＧＧＡＡＡＡＵＡＧＵ ＡＡＡＵＣＡＡＡＡＡ ＣＡＵＵＡＵＣＡＣＣ
ＡＣＣＣＵＧＧＡＧＧ ＧＡＵＵＧＣＡＧＡＧ ＡＵＵＡＧＵＧＣＣＡ
ＣＣＡＵＣＡＡＧＧＡ ＣＵＵＧＡＡＡＡＡＵ ＧＣＡＧＧＧＧＵＧＧ
ＣＧＡＵＵＣＣＣＡＵ ＡＡＣＡＵＣＣＵＵＧ ＵＵＣＡＡＣＵＣＵＣ
ＣＵＵＵＵＵＧＧＣＣ ＵＧＵＧＣＡＧＡＡＧ ＡＣＡＧＡＵＧＧＡＵ
ＣＵＵＧＧＡＧＡＡＵ ＧＡＧＡＧＵＧＧＡＵ ＵＡＵＣＡＵＡＡＧＣ
ＵＵＡＡＣＣＡＡＧＵ ＧＧＵＧＡＣＵＣＣＡ ＡＵＵＧＣＡＧＣＵＧ
ＣＵＡＵＡＣＡＡＧＡ ＵＧＵＧＧＵＵＵＵＣ ＡＵＵＧＣＵＣＡＡＧ
ＣＡＡＡＵＵＡＡＵＡ ＣＡＵＣＵＣＣＵＧＧ ＵＡＣＣＵＵＧＵＡＵ
ＧＣＡＧＣＣＡＵＵＧ ＡＣＵＵＧＧＣＡＡＡ ＵＧＧＣＣＵＵＵＵＡ
ＣＣＣＡＵＵＣＣＡＵ ＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣ ＡＧＡＡＧＣＧＡＵＵ
ＵＧＣＣＵＵＣＡＧＣ ＵＧＧＣＡＡＧＧＣＣ ＡＧＣＡＡＵＧＵＡＵ
ＣＵＵＵＡＣＵＧＵＣ ＣＵＡＣＵＵＣＡＧＧ ＧＧＵＡＵＡＵＣＡＡ
ＣＵＣＵＣＣＧＧＣＵ ＵＵＧＵＧＵＣＡＵＡ ＡＵＣＵＵＡＵＵＣＡ
ＧＡＧＵＧＡＵＣＵＵ ＧＡＵＣＡＣＵＵＵＵ ＣＡＣＵＧＣＣＡＣＡ
ＡＧＡＵＡＵＣＡＣＡ ＣＵＧＧＵＣＣＡＵＵ ＡＣＡＵＵＧＡＵＧＧ
ＣＡＵＵＡＵＧＵＵＧ ＡＵＵＧＧＡＵＣＣＡ ＡＵＧＡＧＣＡＡＧＡ
ＡＧＵＡＧＣＡＡＡＣ ＡＣＡＣＵＧＧＡＣＵ ＵＡＵＵＧＧＵＧＡＧ
ＡＣＡＵＵＵＧＣＡＵ ＧＣＣＡＵＡＧＧＡＵ ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＡ
ＵＣＣＡＡＡＵＡＡＡ ＡＵＵＣＡＣＧＣＡＣ ＣＣＵＣＵＡＣＣＵＣ
ＡＧＵＡＡＡＡＵＵ：
に対応する増幅すべき第七のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＥＲＶ−Ｌ内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９５】
実施例２中に記載されるように、増幅は、以下のものの存在下で実施した：
・配列番号７のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１４（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡ ＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴ
ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１５（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＴＧ ＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴ
ＣＡＴＣＣＡＴＧＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号８のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１６（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴ ＡＧＴＡＡＡＡＴＡＴ
ＣＡＴＣＣＡＴＡＡＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号９のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１７（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＡＡ ＡＧＴＡＧＡＡＧＧＴ
ＣＡＴＣＡＡＴＡＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１０のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１８（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧ ＴＡＡＡＴＣＡＴＣＣ
ＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡ Ｇ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１１のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１９（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＡＡ ＧＴＡＡＡＴＣＡＴＣ
ＣＡＣＧＴＡＣＣＧＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号２のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号２０（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣ ＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴ
ＣＡＴＣＡＡＣＧＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１２のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号２１（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣ ＡＡＡＡＧＡＡＧＧＴ
ＴＧＴＣＴＡＴＧＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１３のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号２２（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＴＣ ＡＲＣＡＴＡＡＴＧＹ
ＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）。
【００９６】
得られたＲＮＡ転写産物を、実施例２に記載されるように、ＯＬＩＳＡチップ上で分析した。
【００９７】
配列番号１を示すためのプローブは、配列番号５（ＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣ）の配列であった。
【００９８】
配列番号２を示すためのプローブは、配列番号６（ＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣ）の配列であった。
【００９９】
配列番号７を示すためのプローブは、配列番号２３（ＣＡＡＣＣＡＧＴＴＡ
ＧＡＧＡＣＡＡＧＴＴ ＴＴＣＡ）の配列であった。
【０１００】
配列番号８を示すためのプローブは、配列番号２４（ＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡ
ＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡ ＡＴＴ）の配列であった。
【０１０１】
配列番号９を示すためのプローブは、配列番号２５（ＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣ
ＡＴＴＡＣＴＴＣＡＧ ＴＣＡＡＧ）の配列であった。
【０１０２】
配列番号１０を示すためのプローブは、配列番号２６（ＣＣＡＡＧＡＴＣＴＡ
ＧＧＣＣＡＣＴＴＣＴ ＣＡ）の配列であった。
【０１０３】
配列番号１１を示すためのプローブは、配列番号２７（ＣＡＴＣＴＡＴＴＴＧ
ＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴ Ａ）の配列であった。
【０１０４】
配列番号１２を示すためのプローブは、配列番号２８（ＡＧＡＣＣＴＣＡＡＧ
ＧＣＡＴＡＣＡＣＣＣ）の配列であった。
【０１０５】
配列番号１３を示すためのプローブは、配列番号２９（ＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣ
ＡＴＡＡＴＣＴＴＡＴ ＴＣＧ）の配列であった。
【０１０６】
別々の増幅から平均値及び標準偏差を計算し、図４に示す。
【０１０７】
本発明の技術により、混合物（本明細書では、異なる転写産物最大９つからなる）中で転写産物を増幅することができる。また、測定したシグナルと、試験した範囲（各転写産物についてコピー数ｌ０６〜１０８）内の反応容積に導入された転写産物の量との間に直線的な関係があることにも留意すべきである。このことから、この技術によって、いくつかの転写産物を同時かつ特異的に増幅できることが示される。従って、この方法により得られる増幅産物をＤＮＡチップ分析（又は、他の方法による分析）することによって、初期試料の転写産物を定量できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、本発明の方法の工程を概略的に表す。
【図２】図２は、本発明に従って及び実施例２に記載されるように得られた転写産物にハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブにより放射されたシグナルを表す。
【図３】図３は、実施例３に記載されたプロトコルに従って特定範囲の転写産物（１×１０７、１×１０８、１×１０９及び１×１０１０コピー）を増幅した後に得られる連続回帰を表す。
【図４】図４は、実施例４に記載されたプロトコルに従って得られる増幅産物のハイブリダイゼーション及び可視化後に、それぞれの特異的プローブについて放射されたシグナル（３回の平均）及びその標準偏差を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸配列を増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸及び遺伝子材料に関する技術において、生体、この生体の細胞抽出物又は任意の他の生物試料中に遺伝子、遺伝子の一部又はヌクレオチド配列が存在するかどうかを決定することがしばしば必要とされる。特定のヌクレオチド配列の探索、特に病原性生物の検出、対立遺伝子の存在の検出、宿主ゲノム中の損傷の検出、及び、特異的ｍＲＮＡ又は細胞宿主の修飾の検出において、非常に有利である。従って、特定の遺伝子の発現を分析し、さらにはこれを定量することによって、多くの遺伝的疾患を診断することができる。また、こうした遺伝子発現の定量は、基本的なことでもある。
【０００３】
核酸の検出方法は、種々の方法が文献中に記載されている。これらの方法、特にポリヌクレオチドの検出を要する方法は、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖中の二本鎖ＤＮＡの塩基アデニンとチミンの間（Ａ−Ｔ）並びに塩基グアニンとシトシンの間（Ｇ−Ｃ）、又は、ＤＮＡ−ＲＮＡ若しくはＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖中の塩基アデニンとウラシルの間（Ａ−Ｕ）での水素結合の形成による、核酸の相補鎖の対形成特性に基づく。核酸鎖の対形成は、一般的に、「核酸ハイブリダイゼーション」、又は、単に「ハイブリダイゼーション」と呼ばれる。
【０００４】
一般的に、分析したい生物又は疾患について特異的な配列を同定した後、核酸を試料から抽出して、この配列（「目的の配列」ともいう）が存在するかどうかも決定しなければならない。この目的のために、多くの検出方法が開発されている。
【０００５】
核酸試料中において目的の配列を検出する最も直接的な方法は、標的核酸の一部と十分に相補的な配列を有していて標的核酸とハイブリダイズできる「プローブ」の取得である。この合成プローブを核酸含有試料と接触させると、目的の配列が存在する場合には、プローブがハイブリダイズして反応産物が形成される。目的の配列が存在せず、かつ、非特異的なハイブリダイゼーション現象が妨げられる場合には、反応産物は形成されない。合成プローブが検出可能な標識に結合すると、標識の存在量を測定することによって反応産物を検出することができる。使用可能な方法の例としては、サザンブロッティング（非特許文献１）又はノーザンブロッティング又はドットブロット技術又はサンドウィッチハイブリダイゼーション（非特許文献２）が挙げられる。
【０００６】
しかし、このアプローチの主要な難点は、試料中に存在する目的の配列のコピー数が少ない場合にはこのアプローチを直接適用できないということである。これらの条件下では、この反応のバックグラウンドノイズよりも大きな重要なシグナルを識別すること（すなわち、目的とする配列へのプローブの特異的結合と、目的の配列以外の配列とプローブとの間の非特異的結合とを区別すること）は難しい。この問題を解決する方法の１つとして、補助的な反応による検出シグナルの増強がある。その結果として、これらのハイブリダイゼーション技術の検出能力を増強する種々の方法が報告されている。これらの「増幅」方法は、標的増幅、プロ増幅（ｐｒｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）又はシグナル増幅の３つのカテゴリーに分類することができる。論文としては、まず、Ｌｅｗｉｓ（非特許文献３）が、次いで、Ａｂｒａｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ（非特許文献４）が、これらの方法の優良な総説を構成している。
【０００７】
標的増幅は、試料中に存在する核酸断片を特異的に増加させることからなる。これにより、検出すべき標的核酸配列のコピー数を大いに増加させることができる。
【０００８】
文献に記載された標的増幅技術は、主に、増幅すべき標的配列にハイブリダイズしたヌクレオチドプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ合成サイクルの反復（ＰＣＲと呼ばれる「ポリメラーゼ連鎖反応」、特許文献１〜４を参照；「修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」又はＲＣＲと呼ばれる方法：特許文献５を参照；「鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（ＳＤＡ）と呼ばれる方法：特許文献６を参照；「エキソヌクレアーゼ媒介鎖置換増幅（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」法：特許文献７を参照）に基づくか、あるいは、ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写反応によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成サイクルの反復に基づく。
【０００９】
転写産物の増幅に基づくこれらの標的増幅方法のいくつかが記載されている。特許文献８に記載された「ＴＡＳ」法は、３工程サイクルの反復からなる。第一の工程によって、逆転写酵素及びファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターに特異的な配列を含むデオキシヌクレオチドプライマーの存在下において、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することができる。ＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二本鎖を熱変性させた後、アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの存在下において、逆転写酵素により、一本鎖ｃＤＮＡ鎖を複製する。この第二の工程で上記のように得られるＤＮＡホモ二本鎖は、ファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが結合し得る二本鎖プロモーターを含む。第三の工程は転写であり、鋳型１つ当たりＲＮＡ分子が３０〜１０００個作成され、続いてこれらはｃＤＮＡ合成用の鋳型として用いられて、増幅サイクルが続行される（非特許文献５）。
【００１０】
種々のＴＡＳ由来の方法が存在し、特許文献９及び１０に記載の「自己持続配列複製」（すなわち３ＳＲ）、特許文献１１及び１２に記載の「核酸配列に基づく増幅」（すなわちＮＡＳＢＡ）法、並びに、特許文献１３に記載の「単一プライマー配列複製」（すなわちＳＰＳＲ）法が挙げられる。
【００１１】
これらの方法は、一般的に、以下の３つの酵素活性の組み合わせを共通して有する：ＲＮＡ依存性及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ、大腸菌及び／又は逆転写酵素に関連する酵素活性を有する酵素）、並びに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼ）。これらの方法は同じ原理に基づいており、逆転写反応及び転写反応の連続的なプロセスに従って一定温度（３７〜４５℃）で実施され、ｃＤＮＡによって標的ＲＮＡが複製される。ＴＡＳの場合と同様、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ファージ）結合部位は、逆転写工程に用いられるプライマーによってｃＤＮＡ中に導入される。しかし、ＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二本鎖の変性は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性によるこのヘテロ二本鎖のＲＮＡの特異的加水分解によって等温的に実施される。続いて、第二のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、逆転写酵素により、遊離のｃＤＮＡが複製される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ／ＤＮＡホモ二本鎖がＲＮＡに転写され、このＲＮＡが、その後のサイクルの鋳型として再び使用され得る。
【００１２】
「ライゲーション活性転写（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）」（又はＬＡＴ）と呼ばれる他の方法が特許文献１３に記載されているが、この方法は、３ＳＲ、ＳＰＳＲ及びＮＡＳＢＡ法と同じ酵素活性を用い、かつ同じサイクルで操作される。しかし、上記方法は、プロモーター配列を設置する方法であるという点で異なり、この場合、上記配列は、ＤＮＡリガーゼの存在下で、プロモーターを含むステム−ループ構造のライゲーションにより、ｃＤＮＡの末端上に導入される。
【００１３】
また、転写産物の増幅に基づいた標的増幅には、上記以外にも２つあり、これらは特許文献１４に記載されている。そのうちの１つは、プロモーターが２つの異なるオリゴヌクレオチドからなるということ以外はＬＡＴと同じである。他方は、リガーゼと、二本鎖ＤＮＡプロモーターを認識してＲＮＡ鋳型に沿って伸長できるＲＮＡポリメラーゼとの２つの酵素活性を用いる。可動プロモーターと呼ばれるプロモーターは、２つのオリゴヌクレオチドからなる。一方は、標的ＲＮＡの３’末端におけるハイブリダイゼーションのためのセンスプロモーター配列及びプローブ配列を有し、他方は、アンチセンスプロモーター配列のみを有する。アンチセンスプロモーターオリゴヌクレオチドの５’末端は、ハイブリダイゼーションによって標的の３’末端と並列しており、その後、この末端に結合する。適切なＲＮＡポリメラーゼで転写されることによって、複数の転写産物が合成される。これらの転写産物は、ハイブリダイズして、第二の可動プロモーターに結合する。ＲＮＡ鋳型が転写されることによって、相補的転写産物が合成される。このプロセスの反復によって、最初の標的配列を指数関数的に増幅することができる。
【００１４】
特許文献１５に記載された方法についても述べると、これは、核酸を非特異的に増幅する方法である。この増幅方法は転写にも基づくものであるが、プライマーは１つしか必要としない。後者は、３’位が封鎖されていて、これにより、センスＲＮＡの３’位に位置するＴ７プロモーター配列が付着できる。従って、この配列によって、アンチセンスｃＲＮＡの転写が可能となる。この方法は非特異的である、というのは、使用されるプライマーがｍＲＮＡのポリＡテールにハイブリダイズするからである。
【００１５】
一般的に、ＰＣＲ又はＮＡＳＢＡのような増幅方法は、増幅物を得るためにプライマーを２つ必要とする。その結果、増幅反応の産物自身が次の増幅の鋳型となり、増幅は指数関数的となる。これらの方法によれば増幅収量を非常に良好とすることができるが、いくつかの標的を同時増幅（複数増幅という）する際には（いくつかの遺伝子の発現特性を調べることが望ましい場合にこの工程は重要であるが）、依然として不向きである。さらに、特許文献１５に記載された方法は、総ｍＲＮＡの増幅に基づくものであり、このことはＤＮＡチップの分析においてバックグラウンドノイズの発生の原因となり得る。また、この方法は、遺伝子の３’領域に限定される。従って、この方法は、遺伝子の中間又は５’領域に位置する標的領域の変異を研究する際には不向きである。
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献３】米国特許第４，８００，１５９号
【特許文献４】欧州特許第２０１１８４号
【特許文献５】ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０１０６９号
【特許文献６】欧州特許第０４９７２７２号
【特許文献７】欧州特許第５００２２４号
【特許文献８】ＰＣＴ特許出願ＷＯ８８／１０３１５号
【特許文献９】ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０６９９５号
【特許文献１０】欧州特許第０３７３９６０号
【特許文献１１】ＰＣＴ特許出願Ｗ０９１／０２８１８号
【特許文献１２】欧州特許第３２９８２２号
【特許文献１３】米国特許第５１９４３７０号
【特許文献１４】欧州特許出願第３６９７７５号
【特許文献１５】ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９９／４３８５号
【非特許文献１】Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３（１９７５）
【非特許文献２】ＤＵＮＮ Ａ，Ｒ，ａｎｄ ＨＡＳＳＥＬ Ｊ．Ｋ．，Ｃｅｌｌ，１２，２３（１９７７）
【非特許文献３】Ｌｅｗｉｓ，１９９２，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １２：ｌ−９
【非特許文献４】Ａｂｒａｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ，１９９３，Ｃｕｒｅｒ．Ｏｐｕｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４１４７
【非特許文献５】ＤＡＶＩＳら，１９９０．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：１３−２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、異なる遺伝子の標的領域を同時に増幅できる特異的な連続増幅方法であって、遺伝子の３’位、５’位又は中間に位置する上記標的領域に対して実施可能な方法を提供することによって、先行技術の欠点を全て解決することを提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これについて、本発明は、
以下：
・“プライマー”領域及び目的の領域を含む、増幅すべきＲＮＡ配列、並びに
・プロモーター領域、及び、上記増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む増幅プライマー：
から転写産物を作成する方法であって、
上記方法は、一定温度で実施され、かつ、以下の工程：
ａ．上記プライマーと増幅すべきＲＮＡとをハイブリダイズする工程、
ｂ．逆転写酵素酵素活性によってプライマーを伸長させて、増幅すべきＲＮＡの相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を作成する工程、
ｃ．上記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を使用して切断し、上記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ．上記増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、逆転写酵素及び鎖置換酵素を使用して伸長させ、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ．ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を使用して、工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡ転写産物を得る工程：
を含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明の目的について、用語「“転写産物”」は、転写の産物、すなわち、転写を開始したプロモーターの制御下において鋳型が転写される間に新たに合成されたＲＮＡを意味する。
【００１９】
用語「“配列”」は、ハイブリダイゼーション反応の可能な、天然の塩基（本質的にデオキシリボヌクレオチド配列である場合にはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔであり、本質的にリボヌクレオチド配列である場合にはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕである）及び／又は１つ以上の修飾塩基（例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン又は修飾塩基）を含むヌクレオチド配列を意味するものとする。また、ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド間結合（場合により、例えば、ホスホロチオエート、Ｈホスホネート、アルキルホスホネート結合を含む）が、又は、例えばα−オリゴヌクレオチド（仏国特許第２６０７５０７号）若しくはＰＮＡ（ＥＧＨＯＬＭら，１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５−１８９７）の場合にはその骨格が修飾され得る。修飾ポリヌクレオチド配列においては、上記に示したいくつかの修飾は、組み合わせた状態で存在していてもよい。この配列は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの性質のもの又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラの性質のものであってよく、一般的に少なくともデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド５つの「長さ」を有していてよく、必要に応じて少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでいてよい。配列１つに種々の領域が含まれていてよく、それぞれ種々の機能と関連している。
【００２０】
本発明の方法を実施するにあたって、開始点は増幅すべきＲＮＡ配列であり、これは増幅すべきＲＮＡの第一のモデルとして記載され得る。本発明の目的について、「増幅すべきＲＮＡ」は、任意のリボ核酸配列であってよい。好ましくは、増幅すべきＲＮＡは、メッセージＲＮＡ（ｍｅｓｓａｇｅ ＲＮＡ）である。
【００２１】
増幅すべきＲＮＡは特に、「目的の領域」、すなわち、この目的の領域に特異的なハイブリダイゼーションプローブによりハイブリダイズされ得るポリヌクレオチドを含む。従って、このプローブによれば、本明細書の以下に記載するように、目的の領域が存在するか存在しないかを検出できる。
【００２２】
この増幅すべきＲＮＡはまた、「“プライマー”領域」、すなわち、本発明の以下で定義される増幅プライマーが特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む。好ましくは、“プライマー”領域は、増幅すべきＲＮＡ配列の目的の領域の３’領域に位置する。
【００２３】
「“他の配列／領域にハイブリダイズし得る配列又は領域”」という表現は、それぞれの場合に応じて公知の様式で決定され得るハイブリダイゼーション条件下で他の配列／領域にハイブリダイズし得る配列又は領域を意味するものとする。また、相補的配列／領域についても参照される。他の配列又は領域に厳密に相補的な配列又は領域とは、塩基のそれぞれが他の配列とずれることなく対を形成できる配列である。用語「“ハイブリダイゼーション”」は、十分に相補的な配列を有する２つのヌクレオチド断片が、適切な条件下で、安定かつ特異的な水素結合で二本鎖を形成することができるプロセスを意味するものとする。ハイブリダイゼーション条件は、厳密さ（すなわち、操作条件の厳密さ）により決定される。ハイブリダイゼーションを行う厳密さが大きくなるほど、特異性が高くなる。詳細には、厳密さは、プローブ／標的二本鎖の塩基組成により、及び、２つの核酸間のずれの程度により、定義される。厳密さは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質及び濃度、並びに／又は、ハイブリダイゼーション温度等の反応パラメータにも依存する可能性がある。ハイブリダイゼーション反応を行うべき条件の厳密さは、主に、用いるハイブリダイゼーションプローブに応じて異なる。これらのデータは全て周知であり、当業者であれば適切な条件を決定することができる。
【００２４】
本発明の目的のため、用語「“増幅プライマー”」は、増幅すべき（ＤＮＡ又はＲＮＡの性質の）核酸にハイブリダイズされた場合に放出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）反応を開始できる配列を意味するものとする。本発明で用いられるプライマーは、２つの領域に分けることができ、それらは、５’−３’方向に：
・ＲＮＡポリメラーゼにより認識されて転写、すなわちＲＮＡ合成を開始できるプロモーター領域。このプロモーター領域は、プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼにより転写を開始するための部位を含む。このプロモーター領域は、特に、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの鎖の１つを含む。例えば、ＲＮＡポリメラーゼの天然のプロモーター、天然のプロモーター由来であってその機能を保持した短縮配列、又は、ＭＯＬＬＥＧＡＡＲＤ Ｎ．Ｅ．ら １９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３８９２−３８９５に記載の転写を開始できる「ループ」構造を挙げることができる。また、このプロモーター領域は、転写の開始に有利な配列を含んでいてよく、これによって、無駄な転写産物の形成が制限される。ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性であってよく、これによりＤＮＡ配列からＲＮＡを転写することができる；
・増幅すべきＲＮＡの“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域、すなわち、増幅すべきＲＮＡの上記“プライマー”領域に相補的である領域。この領域は、本質的にＤＮＡであってよい。
【００２５】
従って、プライマーの５’末端は、上記増幅すべきＲＮＡとハイブリダイズしないヌクレオチド（プロモーターのアンチセンス配列、転写開始部位のアンチセンス配列等）を含んでいてよいが、３’末端は、適切な温度及び厳密な条件下でプライマーの伸長を開始できる長さ及びヌクレオチド組成を有している必要がある。本発明の好ましい実施形態によれば、プライマーは本質的にＤＮＡである。プライマーは３’が封鎖されていないため、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを安定化させることができる。
【００２６】
本発明の方法は等温的方法、すなわち、種々の工程の間に温度を変化させる必要のない方法である。本発明の好ましい実施形態によれば、上記方法は、３７℃〜５０℃、好ましくは４０℃〜４５℃、さらに好ましくは４１℃で実施される。
【００２７】
工程ａ）では、上記プライマーを、プライマー／増幅すべきＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションが可能な領域のレベルで、増幅すべきＲＮＡとハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションは、増幅すべきＲＮＡの所定の領域とプライマーの所定の領域との、適切な厳密さ及び温度条件下における相補性によって生じる。本発明の好ましい実施形態によれば、この工程の前に、増幅すべきＲＮＡの、好ましくは６５℃における変性からなる工程が実施される。
【００２８】
工程ｂ）では、プライマーを逆転写酵素酵素活性により伸長させて、増幅すべきＲＮＡの相補的デオキシリボ核酸配列（ｃＤＮＡ）を作成する。この工程には、相補性によるｃＤＮＡの合成のための酵素が使用するデオキシリボヌクレオチドが存在することが必要である。この伸長は、工程ａ）と同程度の適切な厳密さ及び温度条件下で、プライマーの５’−３’の向きで実施される。この逆転写酵素は、好ましくはＡＭＶ逆転写酵素である。
【００２９】
工程ｃ）では、上記ｃＤＮＡにハイブリダイズさせたＲＮＡを、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素で切断し、上記ｃＤＮＡにハイブリダイズさせたＲＮＡの断片を得る。ＲＮＡｓｅ Ｈ活性は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを加水分解できるが、一方、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは加水分解されない。ＲＮＡｓｅ Ｈ活性は、別々の酵素により、特に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ Ｈ酵素により、又は、特にＡＭＶ逆転写酵素などの逆転写酵素のＲＮＡｓｅ Ｈ活性を介して、得ることができる。
【００３０】
工程ｄ）では、上記ＲＮＡ断片の末端は、逆転写酵素及び鎖置換酵素により伸長されて、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡ複合体が得られる。この逆転写酵素は、好ましくはＡＭＶ逆転写酵素である。
【００３１】
工程ｅ）では、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡ複合体からＲＮＡ転写産物が得られる。転写は、転写されたヌクレオチド鎖にアンチパラレルでありかつ相補的なＲＮＡの５’−３’方向の合成により実施される。
【００３２】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有していてかつ使用される酵素は、プライマーのプロモーターに結合でき、かつ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでプライマーの転写開始部位からＲＮＡの合成を開始することができる酵素である。本発明の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼであるが、バクテリオファージＴ３、ＳＰ６、ｇｈ−１等のＲＮＡポリメラーゼのような他のポリメラーゼも用いることができる。もちろん、プライマー上に位置するプロモーター配列は、工程ｅ）に用いられるＲＮＡポリメラーゼに対して好適である必要がある。
【００３３】
本発明の増幅方法は、適切な条件下で、その目的に必要とされる全ての化合物（すなわち、増幅すべきＲＮＡ、酵素、増幅プライマー及びデオキシリボヌクレオチド）を添加することにより実施できる。この反応媒体は、増幅プロセスを妨げる可能性がある剤、例えば、必要な酵素の活性を妨げる可能性のある物質、増幅すべきＲＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる可能性のある物質、又は、増幅産物を劣化させる可能性のある物質を含まない。
【００３４】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、工程ａ）〜ｅ）は、十分数の転写産物を得るのに十分な時間にわたって実施される。好ましくは、工程ａ）〜ｅ）は、３０分〜３時間３０分、より好ましくは１時間３０分〜２時間３０分にわたって実施される。
【００３５】
このように得られた転写産物は、続いて、当業者に公知の任意の技術により検出される。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の転写産物の作成方法は、以下の工程：
ｆ．上記目的の領域に特異的なハイブリダイゼーションプローブを使用して、作成されたＲＮＡ転写産物を検出する工程：
をさらに含む。
【００３７】
用語「“検出”」は、物理的方法による直接的検出、又は、標識を用いる検出方法のいずれかを意味するものとする。核酸の検出のために、多くの検出方法が存在する［例えば、Ｋｒｉｃｋａら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｎｏ．４５（４），ｐ．４５３−４５８、又は、Ｋｅｌｌｅｒ Ｇ．Ｈ．ら，ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，ｓｅｃｔｉｏｎ ５ ａｎｄ ６，ｐ．１７３−２４９を参照のこと］。用語「“標識”」は、シグナルを発生することができるトレーサーを意味するものとする。これらのトレースとしては、例えば比色法、蛍光又は発光により検出され得るシグナルを生じる酵素が挙げられ、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ；蛍光、発光又は染料化合物のような発色団；電子顕微鏡、又は、導電性などの電気的特性、アンペロメトリー若しくはボルタンメトリー法、又は、インピーダンス測定法により検出され得る電気的に密な基；デフラクション（ｄｅｆｒａｃｔｉｏｎ）、表面プラズモン共鳴若しくは接触角変動のような光学的方法により、又は、原子力顕微鏡、トンネル効果などの物理的方法により検出され得る基；３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉなどの放射性分子が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明の増幅工程の間、ポリヌクレオチドは、例えば、増幅反応用の標識されたヌクレオチド三リン酸を用いて標識することができる。例えば、抗リガンドと反応可能なリガンドのような間接的なシステムを用いることもできる。リガンド／抗リガンド対は当業者に周知であり、この場合、例えば、金属（例えばニッケル）に対する、以下の対が挙げられる：ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗遺伝子／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／そのポリヌクレオチドに相補的な配列、「“タグ”」と呼ばれるヒスチジンの連続的配列。この場合、結合剤を有しているのはリガンドである。抗リガンドは、前述されているように、標識により直接的に検出することができる、又は、リガンド／抗リガンドによって検出することができる。
【００３８】
標識されたヌクレオチドは、リボヌクレオチドであろう。また、ポリヌクレオチドは、増幅工程の後に、例えば、ＷＯ−Ａ−９１／１９８１２号に記載されたサンドウィッチハイブリダイゼーション技術により標識プローブをハイブリダイズすることによって標識することができる。このようなプローブはまた、ＰＣＴ特許出願ＷＯ０３／０９８２１７号に記載されるようなＯＬＩＳＡ技術においても用いることができる。
【００３９】
この検出は、本発明の増幅されたＲＮＡの上記目的の領域を認識するハイブリダイゼーションプローブを用いて実施することもできる。用語「“ハイブリダイゼーションプローブ”」は、所定の条件下で目的の領域と共にハイブリダイゼーション複合体を形成するためのハイブリダイゼーション特異性を有する５〜１００のヌクレオチドモチーフ、特に６〜３５のヌクレオチドモチーフを含むヌクレオチド断片を意味するものとする。このハイブリダイゼーションプローブは、「“捕捉”プローブ」であってよい。この場合、標的ヌクレオチド断片は、標識で予め標識されていてよい。“捕捉”プローブは、固定されているか、又は、任意の適切な手段で、すなわち、直接的に又は間接的に、例えば共有結合又は吸着により、固相支持体上に固定されていてよい。次いで、上記プローブと標識された標的ヌクレオチド断片との間でのハイブリダイゼーション反応が行われる。
【００４０】
ハイブリダイゼーションプローブは、「“検出”プローブ」であってもよい。この場合、ハイブリダイゼーションプローブは、標識で標識されていてよい。次いで、上記検出プローブと標的ヌクレオチド断片との間でハイブリダイゼーション反応が行われる。サンドウィッチアッセイにおいては、固相支持体に結合した捕捉プローブを用いてもよく、上記捕捉プローブに標的ヌクレオチド断片がハイブリダイズし、上記標的ヌクレオチド断片に検出プローブがハイブリダイズする。
【００４１】
“捕捉”プローブ又は“検出”プローブのいずれを用いるかには関係なく、「ハイブリダイゼーション反応」は、その上に核酸を固定可能なあらゆる材料を含む固相支持体上で行うことができる。必要に応じて化学修飾した合成材料又は天然材料を固相支持体として用いることができ、特に、セルロース系材料などの多糖類（例えば、紙、酢酸セルロース及びニトロセルロース又はデキストランなどのセルロース誘導体、特にスチレン系モノマーに基づくポリマー、コポリマー、綿などの天然繊維、並びに、ナイロンなどの合成繊維；シリカ、水晶、ガラス、セラミックなどの無機材料；格子；磁性粒子；金属誘導体、ゲルなどが挙げられる。固相支持体は、マイクロタイタープレート、ＰＣＴ特許出願ＷＯ−Ａ−９４／１２６７０号に記載の膜、粒子又はバイオチップの形態であってよい。用語「“バイオチップ”」は、多数の捕捉プローブが所定の位置に付加した、小さな固相支持体を意味するものとする。バイオチップの概念は、より詳細には、１９９０年初頭から始まったＤＮＡチップの概念である。現在では、タンパク質チップが開発され始めたため、この概念は拡大し続けている。これは、マイクロエレクトロニクス、核酸化学、画像分析及び情報技術を統合した複数の学科の技術に基づくものである。作動の原理は、分子生物学：ハイブリダイゼーション現象、すなわち、２つのＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列の塩基の相補性による対形成を基礎にして構築される。
【００４２】
バイオチップ法は、固相支持体に結合した捕捉プローブの使用に基づくものであり、蛍光色素で直接的に又は間接的に標識された標的ヌクレオチド断片の試料が上記プローブに作用する。捕捉プローブは、特異的な様式で支持体又はチップ上に位置しており、それぞれのハイブリダイゼーションにより、標的ヌクレオチド断片に関連して、特定の断片的情報が得られる。得られる情報が蓄積されることによって、例えば、１つ又はそれ以上の標的遺伝子の発現レベルを定量できる。標的遺伝子の発現を分析する際に、標的遺伝子の全て又は一部に対応する非常に多数のプローブを有するバイオチップを調製してもよく、これはｍＲＮＡに転写される。次いで、分析が望まれる標的遺伝子由来のｍＲＮＡの相補的ＤＮＡを、例えばハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、支持体又はチップを洗浄し、例えばスキャナで読み取り、蛍光の分析を情報技術により処理する。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社により開発された分子診断用のＤＮＡチップを挙げることができる（“Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ ＤＮＡ ａｒｒａｙｓ”， Ｍ，Ｃｈｅｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７４，６１０−６１４， “Ｌｉｇｈｔ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”， Ａ．Ｃａｖｉａｎｉ Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，５０２２−５０２６）。この技術において、捕捉プローブは一般的にサイズが小さく、約２０ヌクレオチドである。バイオチップの他の例は、Ｇ．Ｒａｍｓａｙによる刊行物であるＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｎｏ．１６，ｐ．４０−４４； Ｆ．Ｇｉｎｏｔ，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，１９９７，Ｎｏ．１０，ｐ．１−１０； Ｊ．Ｃｈｅｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，１９９６，Ｎｏ．１（３），ｐ．１８３−２００； Ｔ．Ｌｉｖａｃｈｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，Ｎｏ．２２（１５），ｐ．２９１５−２９２１； Ｊ．Ｃｈｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｎｏ．１６，ｐ．５４１−５４６、又は、米国特許ＵＳ−Ａ−４，９８１，７８３号、米国特許ＵＳ−Ａ−５，７００，６３７号、米国特許ＵＳ−Ａ−５，４４５，９３４号、米国特許ＵＳ−Ａ−５，７４４，３０５号及び米国特許ＵＳ−Ａ−５，８０７，５２２号に記載される。ＰＣＴ特許出願ＷＯ０３／０９８２１７号に記載される、Ａｐｉｂｉｏ社により開発された低濃度チップを挙げることもできる。固相支持体の主な特徴は、捕捉プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションの特徴を保持する一方、検出方法についてはバックグラウンドノイズが最小であるものでなければならない。本発明は、これらの低濃度チップシステムに特に適している。
【００４３】
本発明の方法を実施することによって、種々の遺伝子に由来するＲＮＡ転写産物を作成することができる。異なる遺伝子の標的領域を同時に増幅できるということは、本発明のさ
らなる利点の１つであり、上記標的領域は遺伝子の３’位、５’位又は中間に配置されていてよい。
【００４４】
これに関し、本発明はまた、以下：
・少なくとも、“プライマー”領域及び目的の領域を含む第一の増幅すべきＲＮＡ配列、並びに、プロモーター領域、及び、上記第一の増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む第一の増幅プライマー、
・少なくとも、上記第一の増幅すべきＲＮＡ配列とは異なっていてかつ“プライマー”領域及び目的の領域を含む第二の増幅すべきＲＮＡ配列、並びに、プロモーター領域及び上記第二の増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む第二の増幅プライマー：から転写産物を作成する方法であって、
上記方法は、一定温度で行われ、かつ、以下の工程：
ａ）．上記第一及び第二のプライマーを、上記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
ｂ）．上記第一及び第二のプライマーを逆転写酵素の酵素活性により伸長させて、第一の増幅すべきＲＮＡの第一の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列及び第二の増幅すべきＲＮＡの第二の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を作成する工程、
ｃ）．上記第一及び第二のｃＤＮＡにそれぞれハイブリダイズした第一及び第二の増幅すべきＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により切断して、第一のｃＤＮＡにハイブリダイズした第一の増幅すべきＲＮＡの断片及び第二のｃＤＮＡにハイブリダイズした第二の増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ）．上記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、逆転写酵素及び鎖置換酵素により伸長して、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ）．工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、上記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡの転写産物を得る工程：
を含むことを特徴とする。
【００４５】
この方法に類似する方法を使用することによって、３、４、５、１０又はそれ以上の異なる遺伝子由来の増幅すべきＲＮＡから転写産物を作成することができる。
【００４６】
工程ａ）〜ｅ）は、上記に記載された様式に類似する様式で行われ、かつ、上記で定義されるように、十分数の転写産物を得るのに十分な時間にわたって実施される。
【００４７】
転写産物を検出するためには、好ましくは、工程ｆ）において、第一の増幅すべきＲＮＡの転写産物を検出するための第一のハイブリダイゼーションプローブ、及び、第二の増幅すべきＲＮＡの転写産物を検出するための第二のハイブリダイゼーションプローブが用いられる。
【００４８】
好ましくは、上記で定義されるように、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであり、より好ましくは、Ｔ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
添付の図面は、説明のための例示を目的とするものであり、いかなる場合も本質的に限定するものではない。これらにより、本発明をより明確に理解できるであろう。
【００５０】
図１は、本発明の方法の工程を概略的に表す。
【００５１】
図２は、本発明に従って及び実施例２に記載されるように得られた転写産物にハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブにより放射されたシグナルを表す。
【００５２】
図３は、実施例３に記載されたプロトコルに従って特定範囲の転写産物（１×１０７、１×１０８、１×１０９及び１×１０１０コピー）を増幅した後に得られる連続回帰を表す。
【００５３】
図４は、実施例４に記載されたプロトコルに従って得られる増幅産物のハイブリダイゼーション及び可視化後に、それぞれの特異的プローブについて放射されたシグナル（３回の平均）及びその標準偏差を表す。
【００５４】
図１において、リボ核酸性の配列は波線で表され、一方、デオキシリボ核酸性の配列は直線で表される。
【００５５】
工程ａ）において、ＤＮＡ性のプライマー（長い点線で表される）は、鋳型ＲＮＡの“プライマー”領域（太線で表される）にハイブリダイズするが、プライマーの５’位のプロモーター配列は鋳型ＲＮＡにハイブリダイズしない。本発明をより明確に理解するため、増幅期後に検出することが望ましい目的の配列を、“プライマー”領域の５’側に短い点線で表す。しかし、目的の配列及び“プライマー”配列は、１つの同じ配列であってよい。
【００５６】
工程ｂ）において、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する酵素を作用させることによって、鋳型ＲＮＡにハイブリダイズしたプライマーを５’−３’方向に伸長させる。鋳型ＲＮＡの配列に相補的な配列を有するＤＮＡ（ｃＤＮＡ、点線で表される）が得られる。従って、鋳型ＲＮＡ／ｃＤＮＡ二本鎖ハイブリッド配列が、標的領域と鋳型ＲＮＡの５’末端との間で得られる。相補性を有さないため、プライマーのプロモーター配列と、標的ＲＮＡの標的領域の３’側に位置する配列とは、ハイブリダイズしていない（一本鎖）配列のままである。
【００５７】
工程ｃ）において、ＲＮＡｓｅ Ｈ活性を有する酵素を作用させて、鋳型ＲＮＡ内において切断を誘発する。この切断は非特異的であり、ｃＤＮＡにハイブリダイズしたＲＮＡの断片の３’ＯＨ末端（十字で表される）が離れることができる。
【００５８】
工程ｄ）において、このようにして離れた３’ＯＨ末端は、逆転写酵素活性及び鎖置換活性を有する酵素により伸長される。プライマーのプロモーター配列に相補的な鎖が合成されると、伸長が停止する。このようにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用下で転写を開始し得る二本鎖プロモーター領域（円で表される）を含む種々のＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖ハイブリッド配列が得られる。２つの異なる切断部位から得られる２つの異なるハイブリッドは、例えばこのように表される。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素の作用により、工程ｅ）において、工程ｄ）で得られる種々のハイブリッドに対応するＲＮＡ転写産物を得ることができる。このようにして、大きさは異なるが、検出が望ましい目的の領域を全て含む転写産物の集団が得られる。
【００５９】
以下の実施例は、例示を目的とするものであり、いかなる場合も本質的に限定するものではない。これらにより、本発明をより明確に理解できるであろう。
【実施例１】
【００６０】
＜増幅すべきＲＮＡ配列の取得＞
配列番号１：
ＧＵＣＡＣＵＧＵＣＡ ＡＧＣＣＵＣＣＡＧＡ ＵＧＣＣＡＵＣＣＣＵ
ＵＵＧＡＣＵＵＧＡＡ ＡＡＣＵＣＡＧＣＣＡ ＧＵＵＵＧＧＧＵＧＧ
ＡＵＣＡＧＵＧＧＣＣ ＧＣＵＣＣＣＡＡＡＡ ＡＡＵＡＡＧＣＵＧＧ
ＡＧＧＣＧＣＵＣＣＡ ＵＡＡＵＵＵＡＧＵＣ ＣＵＧＧＡＡＣＡＧＵ
ＵＡＧＡＡＵＵＧＧＧ ＡＣＡＣＡＵＵＧＡＧ ＧＡＡＵＣＵＵＵＣＵ
ＣＵＣＣＡＵＧＧＡＡ ＵＵＣＡＣＵＵＧＵＣ ＵＵＵＧＵＵＡＵＣＣ
ＡＡＡＡＧＡＡＡＵＣ ＵＧＧＧＧＡＡＡＡＣ ＡＧＡＧＡＡＵＧＣＵ
ＣＡＣＵＣＡＵＣＵＵ ＡＧＧＧＣＡＧＵＵＡ ＡＵＧＣＵＧＵＡＣＵ
ＵＣＡＡＣＣＵＣＵＧ ＧＧＧＡＣＡＵＵＡＣ ＡＡＵＣＵＧＧＣＵＵ
ＡＣＣＣＵＣＣＣＧＣ ＵＣＵＡＵＧＣＵＣＧ ＣＵＧＡＧＵＡＵＵＧ
ＧＣＣＵＣＵＡＡＵＣ ＣＵＣＡＵＡＧＡＵＣ ＵＵＡＡＡＧＡＵＵＧ
ＣＵＵＵＵＵＵＡＡＣ ＡＵＵＣＣＡＣＵＧＧ ＣＣＵＣＵＣＡＧＧＡ
ＣＵＵＵＧＡＡＡＡＧ ＵＵＵＧＣＵＵＵＵＡ ＵＧＧＵＣＣＣＵＵＣ
ＣＣＵＣＡＡＣＡＡＵ ＧＵＣＧＣＵＣＡＧＧ ＣＵＡＣＡＵＧＣＵＡ
ＣＵＡＵＵＧＧＡＡＡ ＧＵＣＣＵＡＣＣＡＣ ＡＡＧＧＣＡＵＧＣＵ
ＵＡＡＵＡＧＵＣＣＣ ＡＣＵＡＵＵＵＧＵＣ ＡＧＵＡＵＵＵＵＧＵ
ＧＧＧＧＣＧＵＧＵＧ ＣＵＵＣＡＡＣＣＵＧ ＵＣＡＧＧＧＡＵＣＡ
ＧＵＵＵＣＣＣＣＧＡ ＵＧＵＵＡＣＡＵＣＧ ＵＵＣＡＣＵＡＣＡＵ
ＧＧＡＵＧＡＵＣＵＣ ＣＵＣＵＧＣＡＣＡＧ ＣＣＣＣＣＣＣＡＵＡ
ＣＡＣＣＡＵＵＵＵＧ ＡＵＵＵＣＣＵＧＣＵ ＵＵＵＣＵＧＵＧＡＵ
ＵＣＡＡＣＡＧＧＣＣ ＡＵＵＵＣＡＧＡＡＧ ＣＡＧＧＵＵＵＧＡＣ
ＵＡＵＵＧＣＡＣＣＡ ＧＡＡＡＡＡＡＵＵＣ ＡＡＡＣＵＡＣＣＵＣ
ＵＣＡＵＵＵＵＣＡＡ ＵＡＵＵＵＧＧＧＣＡ ＵＧＣＡＧＵＵＧＧＡ
ＡＧＡＣＡＡＧＣＵＧ ＡＵＵＡＣＡＣＣＡＣ ＡＡＡＡＡＧＵＵＣＡ
ＧＣＵＵＡＧＧＡＧＡ ＧＡＣＧＣＣＵ：
に対応する増幅すべき第一のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＭＬ−４内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００６１】
同様にして、配列番号２：
ＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡ ＵＡＡＧＡＣＣＡＧ ＣＵＣＵＧＧＣＵＡＡ
ＧＣＧＧＵＧＧＣＣＡ ＡＧＡＧＵＧＵＧＧＧ ＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡ
ＣＣＣＵＣＣＡＧＧＧ ＵＵＧＧＣＡＧＵＣＡ ＡＣＣＡＡＧＣＣＣＣ
ＣＧＵＧＣＵＵＡＵＡ ＧＡＡＧＵＵＡＡＧＣ ＣＵＧＧＧＧＵＣＣＡ
ＧＣＣＧＧＵＵＡＧＧ ＣＡＡＡＡＡＣＡＧＵ ＡＣＣＣＧＧＵＣＣＵ
ＣＡＧＡＧＡＡＧＣＵ ＣＵＵＧＡＡＧＧＵＡ ＵＣＣＡＧＧＵＣＣＡ
ＵＣＵＣＡＡＧＵＧＣ ＣＵＡＡＧＡＡＣＣＵ ＵＵＡＧＡＡＵＵＡＵ
ＡＧＵＵＣＣＵＵＧＵ ＣＡＧＵＣＵＣＣＡＵ ＧＧＡＡＣＡＣＵＣＣ
ＣＣＵＣＣＵＧＣＣＵ ＧＵＵＣＣＣＡＡＧＣ ＣＵＧＧＧＡＣＣＡＡ
ＧＧＡＣＵＡＣＡＧＧ ＣＣＧＧＵＡＣＡＧＧ ＡＵＵＵＧＣＧＣＵＵ
ＧＧＵＵＡＡＵＣＡＧ ＧＣＵＡＣＡＧＵＧＡ ＣＵＵＵＡＣＡＵＣＣ
ＡＡＣＡＧＵＡＣＣＵ ＡＡＣＣＵＧＵＡＣＡ ＣＡＵＵＧＣＵＧＧＧ
ＧＵＵＧＣＵＧＣＣＡ ＧＣＵＧＡＧＧＡＣＡ ＧＣＵＧＧＵＵＣＡＣ
ＣＵＧＣＵＵＧＧＡＣ ＣＵＧＡＡＡＧＡＵＧ ＣＣＵＵＣＵＵＵＡＧ
ＣＡＵＣＡＧＡＵＵＡ ＧＣＣＣＣＵＧＡＧＡ ＧＡＣＡＧＡＡＧＣＵ
ＧＵＵＵＧＣＣＵＵＵ ＣＡＧＵＧＧＧＡＡＧ ＡＵＣＣＡＧＡＧＵＣ
ＡＧＧＵＧＵＣＡＣＵ ＡＣＵＣＡＡＵＡＣＡ ＣＵＵＧＧＡＣＣＣＡ
ＧＣＣＵＣＣＣＣＡＡ ＡＧＧＵＵＣＡＡＧＡ ＡＣＵＣＣＣＣＣＡＣ
ＣＡＵＣＵＵＵＧＧＧ ＧＡＧＧＣＧＵＵＧＧ ＣＵＣＧＡＧＡＣＣＵ
ＣＣＡＧＡＡＧＵＵＵ ＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧ ＡＣＣＵＡＧＧＣＵＧ
ＣＧＵＧＵＵＧＣＵＣ ＣＡＧＵＡＣＧＵＵＧ ＡＵＧＡＣＣＵＵＵＵ
ＧＣＵＧＧＧＡＣＡＣ ＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧ ＵＣＧＧＧＵＧＣＧＣ
ＣＡＡＧＧＧＡＡＣＡ ＧＡＵＧＣＵＣＵＡＣ ＵＣＣＧＧＣＡＣＣＵ
ＧＧＡＧＧＡＣＵＧＵ ＧＧＧＵＡＵＡＡＧＧ ＵＧＵＣＣＡＡＧＡＡ
ＡＡＡＡＡＧＣＵＣＡ ＧＡＵＣＵＧＣＣＧＡ ＣＡＧＣＡＧＧＵＡＵ
ＧＵＵＡＣＵＵＧＧＧ ＡＵＵＵＡＣＵＡＵＣ ＣＡＡＣＡＧＧＧＧＧ
ＡＧＣＡＣＡＧＣＣＵ ＧＧＧＡＵＣＡＧＡＡ ＡＧＡＡＡＧＣＡＧＧ
ＵＣＡＵＵＵＧＵＡＡ ＵＣＵＡＣＣＧＧＡＧ ＣＣＵＡＡＧＡＣＣＡ
ＧＡＡＧＧＣＡＧＧＵ ＧＡＧＡＧＡＡＵ：
に対応する増幅すべき第二のＲＮＡ配列は、ＨＥＲＶ−Ｅ４．１内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から作成した。
【実施例２】
【００６２】
＜実施例１で定義されるＲＮＡ配列からの、本発明の方法による転写産物の作成＞
配列番号１のＲＮＡ配列を増幅するため、
・Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（配列番号３において１〜１７番目）及び転写開始部位（配列番号３において１８〜２３番目）を含むプロモーター領域、
・増幅すべきＲＮＡ配列のプライマー領域にハイブリダイズできる領域（配列番号３において下線で示す）
を含む、配列番号３のプライマー配列を用いた。
配列番号３：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ＡＧＡＴＣＴＡＧＣＡ
ＧＣＡＴＡＧＧＧＧＧ ＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧ ＡＧＧＡＧＡＴＣＡＴ ＣＣ
【００６３】
このプライマーを、非−３’封鎖した。
【００６４】
プライマー領域にハイブリダイズできる領域は短くてもよく、特に１５〜３０塩基対を含むものであってよいということに留意すべきである。また、開始部位とプライマー領域にハイブリダイズできる領域との間に、無駄な転写産物の形成を制限するための、開始に有利な配列が含まれることにも留意すべきである。
【００６５】
配列番号２のＲＮＡ配列を増幅するため、
・Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（配列番号４において１〜１７番目）及び転写開始部位（配列番号４において１８〜２３番目）を含むプロモーター領域、
・増幅すべきＲＮＡ配列のプライマー領域にハイブリダイズできる領域（配列番号４において下線で示す）
を含む、配列番号４のプライマー配列を用いた。
配列番号４：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ＡＧＡＴＣＴＡＧＣＡ
ＧＣＡＴＡＣＡＧＣＡ ＡＡＡＧＧＴＣＡＴＣ ＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧ ＡＧ
【００６６】
このプライマーを、非−３’封鎖した。
【００６７】
プライマー領域にハイブリダイズできる領域は短くてもよく、特に１５〜３０塩基対を含むものであってよいということに留意すべきである。また、開始部位とプライマー領域にハイブリダイズできる領域との間に、無駄な転写産物の形成を制限するための、開始に有利な配列が含まれることにも留意すべきである。
【００６８】
転写産物の作成は、逆転写酵素活性を有する酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素（ＲＮａｓｅ Ｈ）及びＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を含む反応混合物（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓＢａｓｉｃ Ｋｉｔ，ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）中で実施した。
【００６９】
増幅は、以下のものの存在下で実施した：
・配列番号１のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号３のプライマー配列（０．５μＭ）、
・配列番号２のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号４のプライマー配列（０．５μＭ）、
・配列番号１のＲＮＡ配列及び配列番号２のＲＮＡ配列を同時に増幅するための配列番号３のプライマー配列（０．５μＭ）及び配列番号４のプライマー配列（０．５μＭ）。
【００７０】
従って、配列番号１のＲＮＡ配列の増幅及び配列番号２のＲＮＡ配列の増幅は、ビオチンを配合して、
・互いに独立に実施される：
この際、水溶液中の既知量の配列番号１のＲＮＡ又は配列番号２のＲＮＡ（Ｈ２Ｏ ５μｌ中のコピー数１×１０９又は１×１０１０）を、ＵＴＰ−ビオチン（０．６ｍＭ）及び配列番号１又は配列番号２を増幅するためのプライマーを予め添加した反応混合物（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ）１０μｌと混合する：
・同時に実施される：
この際、水溶液中の既知量の配列番号１のＲＮＡ又は配列番号２のＲＮＡを、ＵＴＰ−ビオチン及び配列番号１又は配列番号２を増幅するためのプライマーを予め添加した反応混合物（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ）１０μｌと混合した。
【００７１】
増幅反応のそれぞれにおいて、得られた容積は１５μｌであった（十分量（ｑｓ）ヌクレアーゼを含まない）。続いて、混合物を６５℃で５分間インキュベートし、次いで、４１℃で５分間インキュベートして、増幅すべきＲＮＡにプライマーをハイブリダイズさせた。
【００７２】
続いて、容積５μｌの酵素混合物（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ）を添加した。容積２０μｌの混合物を４１℃で９０分間インキュベートすることによって、以下のことを可能にした：
１．増幅すべきＲＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーション、
２．逆転写酵素の酵素活性を用いたプライマーの伸長による、増幅すべきＲＮＡの相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列の作成、
３．リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を用いた上記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの切断による、上記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの断片の取得、
４．逆転写酵素及び鎖置換酵素を用いた上記増幅すべきＲＮＡの断片の末端の伸長による、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの取得、
５．ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いた、工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからのＲＮＡ転写産物の作成。
【００７３】
得られたＲＮＡ転写産物を、ＥＬＯＳＡ法（Ｍａｌｌｅｔ Ｆら，１９９３）により分析した。この方法によれば、マイクロタイタープレートウェルの底にグラフト化したオリゴヌクレオチドプローブ（検出プローブと呼ばれる）に核酸配列をハイブリダイゼーションすることによって、核酸配列を特異的に検出できる。
【００７４】
配列番号１を示すためのプローブは、配列番号５（ＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣ）の配列であった。
【００７５】
配列番号２を示すためのプローブは、配列番号６（ＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣ）の配列であった。
【００７６】
ＲＮＡ転写産物をビオチンで標識することにより、ストレプトアビジン−酵素複合体の作用による、及び、対応する基質の作用によるハイブリダイゼーションを可視化することができた。また、ＯＤは分光法により読み取った。ＯＤは、本発明の方法で作成された転写産物の量に比例していた。
【００７７】
得られた結果を図１に示す。文字Ａ〜Ｄは、配列番号１及び配列番号２を別々に増幅するための条件に対応し（Ａ：１×１０９コピーの配列番号１；Ｂ：１×１０９コピーの配列番号２；Ｃ：１×１０１０コピーの配列番号１；Ｄ：１×１０１０コピーの配列番号２）、一方、文字Ｅ〜Ｈは、配列番号１及び配列番号２の同時増幅に対応する（Ｅ：１×１０９コピーの配列番号１及び１×１０９コピーの配列番号２；Ｆ：１×１０１０コピーの配列番号１及び１×１０１０コピーの配列番号２；Ｇ：１×１０９コピーの配列番号１及び１×１０１０コピーの配列番号２；Ｈ：１×１０１０コピーの配列番号１及び１×１０９コピーの配列番号２）。得られた転写産物を、配列番号５の検出プローブの存在（灰色の欄）によって、又は、配列番号６の検出プローブの存在（黒色の欄）によって、検出した。
【００７８】
この結果から、検出されたシグナルが、別々の増幅と二本鎖内での増幅との中間に匹敵することが示される。
【００７９】
従って、作成された転写産物の数は、増幅すべきＲＮＡが配列番号１又は配列番号２のいずれを有するかにかかわらず、同等であった（条件Ａ及び条件Ｂに従って増幅した場合に、ＯＤの読み取り値は類似していた）。また、増幅すべきＲＮＡの量が多い場合の方が、作成された転写産物の数が多かった（条件Ｃによる増幅よりも条件Ａによる増幅の場合の方が、ＯＤの読み取り値が低かった；同様に、条件Ｄによる増幅よりも条件Ｂによる増幅の場合の方が、ＯＤの読み取り値が低かった）。
【００８０】
最後に、配列番号１及び配列番号２の同時増幅により作成された転写産物の数は、配列番号１及び配列番号２を別々に増幅して作成された転写産物の数と同様であった。１対数だけ異なる量の転写産物に対して同時増幅を行った場合においても、シグナルは、配列番号１及び配列番号２を別々に増幅して得られたシグナルと同じであった。
【００８１】
ＯＬＩＳＡチップ上で作成した転写産物の分析からも、同等の結果が得られた。ＯＬＩＳＡチップは、標準的な９６ウェルプレート形式上に並べた低密度ＤＮＡチップ（１チップ当たりプローブ最大１２８個）である。王冠形に配置されたオリゴヌクレオチド検出プローブを、ウェル底にグラフト化する。プローブ／標的ハイブリッドの色測定による可視化は、標的のビオチン標識化に関与するストレプトアビジン−酵素複合体を用いて行う。
【００８２】
さらなるＲＮａｓｅ消化工程により、検出された産物が実際にｃＲＮＡであることが確認された。
【００８３】
これらの結果から、本発明の方法が、ＤＮＡチップ上で転写産物を定量分析するために転写産物を増幅するのに特に適切であることが示される。というのは、この方法が転写的であって、かつ、増幅産物が増幅用の鋳型になることが全くないために、この増幅が連続的な性質を有し、従ってバイオチップ上での転写産物の定量に非常に適しているからである。
【実施例３】
【００８４】
＜本発明の方法における増幅についての連続性の評価＞
この実施例は、増幅すべきＲＮＡ配列として用いられる配列番号２及び増幅プライマーとして用いられる配列番号４に基づいて行う。
【００８５】
転写産物の作成方法は、実施例２に記載された条件に従って行う。この場合、配列番号２のプライマーを、０．５μＭの濃度で用いる。特定範囲の転写産物（１×１０７、１×１０８、１×１０９及び１×１０１０コピー）を増幅し、実施例２で展開された原理と同様の原理に従って、配列番号６のプローブを用いて反応産物をＯＬＩＳＡチップ上で分析する。
【００８６】
各点の少なくとも４つの測定値について得られた平均値から得られる連続回帰から、図３に表すような較正係数直線Ｒ２＝０．９７８１が得られる。従って、このことから、本発明の方法における増幅について連続性が証明される。
【実施例４】
【００８７】
＜複合的な増幅＞
この実験について、増幅プロトコルを実施例１及び２に記載のように行った。
【００８８】
配列番号７：
ＣＡＣＵＧＵＡＧＡＧ ＣＣＵＣＣＵＡＡＡＣ ＣＣＡＵＡＣＣＡＵＵ
ＡＡＣＵＵＧＧＡＡＡ ＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣ ＵＧＧＵＧＵＧＧＧＵ
ＡＡＡＵＣＡＧＵＧＧ ＣＣＡＣＵＡＣＣＡＡ ＡＡＣＡＡＡＡＡＣＵ
ＧＧＡＧＧＣＵＵＵＡ ＣＡＵＵＵＡＵＵＡＧ ＣＡＡＡＵＧＡＡＣＡ
ＧＵＵＡＧＡＡＡＡＧ ＧＧＵＣＡＵＡＵＵＧ ＡＧＣＣＵＵＣＡＵＵ
ＣＵＣＧＣＣＵＵＧＧ ＡＡＵＵＣＵＣＣＵＧ ＵＧＵＵＵＧＵＡＡＵ
ＵＣＡＧＡＡＧＡＡＡ ＵＣＡＧＧＣＡＡＡＵ ＧＧＣＡＵＡＵＧＵＵ
ＡＡＣＵＧＡＣＵＵＡ ＡＧＧＧＵＣＧＵＡＡ ＡＣＧＣＣＧＵＡＡＵ
ＵＣＡＡＣＣＣＡＵＧ ＧＧＧＣＣＵＣＵＣＣ ＡＡＣＣＣＧＧＧＵＵ
ＧＣＣＣＵＣＵＣＣＧ ＧＣＣＡＵＧＡＵＣＣ ＣＡＡＡＡＧＡＵＵＧ
ＧＣＣＵＵＵＡＧＵＵ ＡＵＡＡＵＵＧＡＵＣ ＵＡＡＡＧＧＡＵＵＧ
ＣＵＵＵＵＵＵＡＣＣ ＡＵＣＣＣＵＣＵＧＧ ＣＧＧＡＧＣＡＧＧＡ
ＵＵＧＣＧＡＡＡＡＡ ＵＵＵＧＣＣＵＵＵＡ ＣＵＡＵＡＣＣＡＧＣ
ＣＡＵＡＡＡＵＡＡＵ ＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧ ＣＣＡＣＣＡＧＧＵＵ
ＵＣＡＧＵＧＧＡＡＡ ＵＵＧＵＵＡＣＣＵＣ ＡＧＧＧＡＡＵＧＣＵ
ＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡ ＡＣＵＡＵＵＵＧＵＣ ＡＧＡＣＵＵＵＵＧＵ
ＡＧＧＵＣＧＡＧＣＵ ＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧ ＵＵＡＧＡＧＡＣＡＡ
ＧＵＵＵＵＣＡＧＡＣ ＵＧＵＵＡＵＡＵＵＡ ＵＵＣＡＵＵＡＵＡＵ
ＵＧＡＵＧＡＵＡＵＵ ＵＵＡＵＧＵＧＣＵＡ ＣＡＧＡＡＡＣＧＡＧ
ＡＧＡＵＡＡＡＵＵＡ ＡＵＵＧＡＣＵＧＵＵ ＡＵＡＣＡＵＵＵＣＵ
ＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧ ＧＵＵＧＣＣＡＡＵＧ ＣＡＧＧＡＣＵＧＧＣ
ＡＡＵＡＧＣＡＵＣＵ ＧＡＵＡＡＧＡＵＣＣ ＡＡＡＣＣＵＣＵＡＣ
ＵＣＣＵＵＵＵＣＡＵ ＵＡＵＵＵＡＧＧＧＡ ＵＧＣＡＧＡＵＡＧＡ
ＡＡＡＵＡＧＡＡＡＡ ＡＵＵＡＡＧＣＣＡＣ ＡＡＡＡＡＡＵＡＧＡ
ＡＡＵＡＡＧＡＡＡＡ ＧＡＣＡＣＡＵＵＡＡ ＡＡＡＣＡＣＵＡＡＡ
ＵＧＡＵＵＵＵＣＡＡ ＡＡＡＵＵＧＣＵＧＧ ＧＡＧＡＵＡＵＵＡＡ
ＵＵＧＧＡＵＵＣＧＧ ＣＣＡＡＣＵＣＵＡＧ ＧＣＡＵＵＣＣＵＡＣ
ＵＵＡＵＧＣＣＡＵＧ ＵＣＡＡＡＵＵＵ：
に対応する増幅すべき第一のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＭＬ−２内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００８９】
同様にして、配列番号８：
ＵＡＵＣＣＡＡＵＵＵ ＧＧＧＵＡＧＡＣＣＡ ＧＵＧＧＣＣＵＵＵＡ
ＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡ ＡＡＵＵＧＣＡＡＡＧ ＡＧＣＣＣＡＵＧＡＧ
ＵＵＵＧＵＵＧＡＡＧ ＡＧＣＡＡＵＵＡＡＡ ＡＧＣＣＡＧＣＣＡＵ
ＡＵＡＧＡＡＣＣＡＵ ＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣ ＵＵＧＧＡＡＵＵＣＡ
ＣＣＣＡＵＵＵＵＣＡ ＵＣＡＵＵＣＣＣＡＡ ＡＡＡＧＵＣＵＧＧＵ
ＡＡＡＵＡＧＡＧＡＣ ＵＵＵＵＧＣＡＵＧＡ ＣＵＡＡＣＡＵＧＣＵ
ＡＵＣＡＡＵＧＣＵＡ ＡＵＵＵＧＡＡＡＣＣ ＵＡＵＧＧＧＡＣＣＣ
ＣＵＵＧＡＧＣＡＧＧ ＵＧＵＵＣＵＣＣＵＣ ＣＣＣＵＵＣＡＧＵＧ
ＡＵＵＣＣＵＵＧＡＧ ＡＵＵＧＧＣＡＵＡＵ ＡＡＵＡＧＵＵＡＵＵ
ＧＧＣＵＵＡＡＡＡＵ ＡＣＵＧＣＡＵＵＵＧ ＵＡＣＵＡＵＵＣＣＣ
ＵＵＵＧＣＡＧＡＡＣ ＡＧＧＡＣＡＧＡＧＡ ＡＡＡＡＵＵＵＧＵＧ
ＵＵＵＡＵＡＡＵＡＣ ＣＡＧＣＵＡＵＡＡＡ ＵＡＡＣＧＡＡＡＧＧ
ＣＣＡＧＣＵＣＣＣＣ ＧＡＵＵＵＣＡＣＵＧ ＧＡＡＡＧＵＧＣＵＵ
ＣＣＵＧＡＡＧＧＧＡ ＵＧＣＵＡＡＡＣＡＧ ＵＣＣＵＡＣＣＡＵＧ
ＵＧＵＣＡＧＵＡＵＣ ＡＵＧＵＡＡＡＵＣＡ ＡＧＣＵＵＵＧＣＵＣ
ＣＵＣＡＧＵＡＧＡＡ ＡＡＧＡＡＵＵＵＣＣ ＵＡＡＵＵＧＣＡＡＧ
ＡＣＵＡＵＵＣＡＵＵ ＵＵＡＵＧＧＡＵＧＡ ＵＡＵＵＵＵＡＣＵＡ
ＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡ ＵＧＧＡＵＣＣＡＧＣ ＡＣＵＵＵＵＡＡＧＵ
ＵＵＡＵＧＵＧＣＣＵ ＣＵＧＵＵＧＵＡＡＡ ＧＡＡＵＡＣＡＣＡＧ
ＵＵＡＡＧＡＧＧＵＵ ＵＡＡＵＣＡＵＡＧＣ ＡＣＣＵＧＡＡＡＡＡ
ＧＵＡＣＡＧＡＵＧＵ ＣＣＵＣＵＣＣＵＵＧ ＧＡＡＡＵＡＵＣＵＵ
ＧＧＧＵＡＣＡＵＡＣ ＵＡＡＣＵＵＣＧＵＧ ＧＵＣＡＧＵＡＡＧＡ
ＣＣＵＣＡＡＡＡＧＧ ＵＵＡＡＡＵＵＡＡＡ ＵＡＣＵＡＧＣＡＡＣ
ＵＵＡＣＡＣＡＣＣＵ ＵＡＡＡＵＧＡＵＵＡ ＵＣＡＧＡＡＡＵＵＡ
ＣＵＡＧＧＣＡＡＵＡ ＵＵＡＡＣＵＧＧＣＵ ＵＵＧＣＣＣＣＡＣＣ
ＵＵＧＧＧＣＡＵＡＡ ＣＵＡＣＵＧＡＵＡＡ ＧＵＵＡＣＡＧＡＡＣ
ＣＵＧＵＵＵＵＣＵＡ ＵＣＵＵＡＡＡＡＧＡ ＣＡＡＵＧＣＵＧＣＵ
ＣＵＡＧＡＣＵＣＵＣ ＣＣＡＧＧＵＡＵＵＵ ＡＡＣＵＣＣＵＧＣＡ
ＧＣＡＣＡＡＡＧＧＧ ＡＡＡＵＵＧＡＧＧＡ ＡＧＵＡＧＡＧＣＡＣ：
に対応する増幅すべき第二のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＭＬ−５内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９０】
同様にして、配列番号９：
ＣＡＣＣＣＵＵＡＣＣ ＣＵＧＣＵＣＡＡＵＧ ＣＣＡＡＵＡＵＣＣＣ
ＡＵＣＣＣＡＣＡＧＣ ＡＵＧＣＵＵＵＡＡＡ ＡＧＧＡＵＵＡＡＡＧ
ＣＣＵＧＵＵＡＵＣＡ ＣＵＣＧＣＣＵＧＣＵ ＡＣＡＧＣＡＵＧＧＧ
ＣＵＵＣＵＡＧＡＡＣ ＣＵＡＵＡＡＡＣＵＣ ＵＣＵＵＵＵＣＡＡＵ
ＵＣＣＣＣＣＡＵＵＵ ＵＡＣＣＵＧＵＣＣＡ ＡＡＡＡＣＣＧＧＡＵ
ＡＡＧＵＣＵＵＡＣＡ ＧＡＣＵＡＧＵＵＣＡ ＧＡＡＵＣＵＧＣＧＵ
ＣＵＵＡＵＣＡＡＣＣ ＡＡＡＵＵＧＵＵＵＵ ＧＣＣＵＡＵＣＣＡＣ
ＣＣＵＧＵＧＧＵＧＣ ＣＣＡＡＣＣＵＧＵＡ ＣＡＣＵＣＵＵＵＵＧ
ＵＣＣＵＣＡＡＵＡＣ ＣＵＵＣＣＵＣＣＡＣ ＡＡＣＵＣＡＣＵＡＵ
ＵＣＣＧＵＧＣＵＵＧ ＡＵＣＵＵＡＡＡＧＡ ＵＧＧＵＵＵＵＵＵＣ
ＡＣＵＡＵＵＣＵＣＣ ＵＧＣＡＣＵＣＣＵＣ ＧＵＣＣＣＡＧＣＣＵ
ＣＵＣＵＵＵＧＣＵＵ ＵＣＡＣＣＵＧＧＡＣ ＵＧＡＣＣＣＵＧＡＣ
ＡＣＣＣＡＵＣＡＧＵ ＣＣＣＡＧＣＡＧＣＵ ＵＡＣＣＵＧＧＡＣＵ
ＧＵＧＣＵＧＣＣＧＣ ＡＡＧＧＵＵＵＣＡＧ ＧＧＡＣＡＧＣＣＣＵ
ＣＧＵＵＡＣＵＵＣＡ ＧＣＣＡＡＧＣＵＣＵ ＵＵＣＵＣＡＵＧＡＵ
ＣＵＡＣＵＵＵＣＣＵ ＵＣＣＡＣＣＣＣＵＣ ＣＧＣＵＵＣＵＣＡＣ
ＣＵＵＡＵＵＣＡＡＵ ＡＵＡＵＵＧＡＵＧＡ ＧＣＵＵＣＵＵＣＵＵ
ＵＧＵＡＧＣＣＣＣＵ ＣＣＵＵＵＧＡＡＵＣ ＵＵＣＵＣＡＡＵＡＡ
ＧＡＣＡＣＡＣＵＵＣ ＵＧＣＵＣＣＵＵＣＡ ＧＣＡＵＵＵＡＵＵＣ
ＵＣＣＡＡＡＧＧＡＵ ＡＵＣＧＧＧＵＡＵＣ ＣＣＣＣＵＣＣＡＡＡ
ＧＣＵＣＡＡＡＵＵＵ ＣＵＵＣＵＣＣＡＵＣ ＣＧＵＵＡＣＣＵＡＣ
ＣＵＣＧＧＣＡＵＡＡ ＵＵＣＵＵＣＡＵＡＡ ＧＡＡＣＡＣＡＣＧＵ
ＧＣＵＣＵＣＣＣＵＧ ＣＣＧＡＣＣＧＵＧＵ ＣＵＧＡＣＵＡＡＵＣ
ＵＣＵＣＡＡＧＣＣＣ ＣＡＡＣＣＣＣＵＵＣ ＵＡＣＡＡＡＡＣＡＡ
ＣＡＡＣＵＣＣＵＵＵ ＣＣＵＵＣＣＵＧＧＧ ＣＧＵＧＧＵＵＧＧＡ
ＵＡＣＵＵＵＣＧＣＣ ＵＵＵＧＧＡＵＡＣＣ ＵＧＧＵＵＵＵＧＣＣ
ＡＵＣＣＵＡＡＣＡＡ ＡＡＣＣＡＵＵＡＵＡ ＵＡＡＡＣＵＣＡＣＡ
ＡＡＡＧＧＡＡＡＣＵ ＵＡＧＣＵＧＡＣＣＣ ＣＡＵＡＧＡＵＣＣＵ
ＡＡＡＵＣＣＵＵＵＣ ＣＣＣＡＣＵＣＣＵＣ ＵＵＵＣＵＧ：
に対応する増幅すべき第三のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＥＲＶ−Ｈ内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９１】
同様にして、配列番号１０：
ＣＵＧＡＡＧＣＵＣＵ ＵＡＡＡＧＧＡＵＵＡ ＣＡＧＧＡＵＡＵＵＧ
ＵＵＡＡＡＣＡＵＵＵ ＡＡＡＡＧＣＵＣＡＡ ＧＧＣＵＵＡＧＵＡＡ
ＧＧＡＡＡＵＧＣＡＧ ＣＡＧＵＣＣＣＵＧＣ ＡＡＣＡＣＣＣＣＡＡ
ＵＵＣＵＡＧＧＡＧＵ ＡＣＡＡＡＡＡＣＣＡ ＡＡＵＧＧＵＣＡＣＵ
ＧＧＡＧＡＣＵＡＧＵ ＧＣＡＡＧＡＵＣＵＵ ＡＧＡＣＵＣＡＵＣＡ
ＡＵＧＡＧＧＣＡＧＵ ＡＡＵＵＣＣＵＣＵＡ ＵＡＵＣＣＡＧＵＵＧ
ＵＡＣＣＣＡＡＣＣＣ ＣＵＡＵＡＣＣＣＵＧ ＣＵＵＵＣＵＣＡＡＡ
ＵＡＣＣＡＧＡＧＧＡ ＡＧＣＡＧＡＡＵＧＧ ＵＵＣＡＵＧＧＵＵＣ
ＵＧＧＡＣＣＵＣＡＡ ＧＧＡＵＧＣＣＵＵＣ ＵＵＣＵＧＵＵＵＣＣ
ＣＣＵＧＣＡＣＵＣＵ ＧＡＣＵＣＣＣＡＧＵ ＵＵＣＵＧＵＵＵＧＣ
ＣＵＵＵＧＡＧＧＡＵ ＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣ ＡＣＡＣＧＵＣＣＣＡ
ＡＣＵＵＡＣＡＵＧＧ ＡＵＧＧＵＣＵＵＧＣ ＣＡＣＡＡＧＧＧＵＵ
ＵＡＧＧＧＡＵＡＧＣ ＣＣＵＣＡＣＣＵＧＵ ＵＵＧＧＵＣＡＧＧＣ
ＡＣＵＧＧＣＣＣＡＡ ＧＡＵＣＵＡＧＧＣＣ ＡＣＵＵＣＵＣＡＡＧ
ＵＣＣＡＧＧＣＡＣＵ ＵＵＧＧＵＣＣＵＵＣ ＡＧＵＡＵＧＵＧＧＡ
ＵＧＡＵＵＵＡＣＵＵ ＵＵＧＧＣＵＡＣＣＡ ＧＵＵＣＡＧＡＡＧＣ
ＣＵＣＡＵＧＣＣＡＧ ＣＡＧＧＣＵＡＣＵＣ ＵＡＧＡＵＣＵＣＵＵ
ＧＡＡＣＵＵＵＣＵＡ ＣＣＵＡＡＵＣＡＡＧ ＧＧＵＡＣＡＡＧＧＣ
ＡＵＣＵＡＧＧＵＣＡ ＡＡＧＧＵＧＣＡＧＣ ＵＵＵＧＣＵＵＡＣＡ
ＧＣＡＧＧＣＵＡＡＡ ＵＡＵＣＵＡＧＧＣＣ ＵＡＡＵＣＵＵＡＧＣ
ＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣ ＡＧＧＧＣＣＣＵＣＡ ＧＣＡＡＧＧＡＡＵＧ
ＡＡＵＡＣＡＧＣＣＵ ＡＵＡＣＵＧＧＣＵＵ ＡＵＣＣＵＵＧＣＣＣ
ＵＡＡＧＡＣＡＵＵＡ ＡＡＡＣＡＧＵＵＧＣ ＡＧＧＧＧＵＵＣＣＵ
ＵＧＧＡＡＵＣＡＣＣ ＧＧＣＵＵＵＵＧＣＣ ＧＡＣＵＡＵＧＧＡＵ
ＣＣＣＵＧＧＡＵＡＣ ＡＧＵＧＡＧＡＵＡＧ ＵＣＡＧＧＣＣＣＣＵ
ＣＣＡＵＡＣＵＣＵＡ ＡＵＣＡＡＧＧＡＧＡ ＣＣＣ：
に対応する増幅すべき第四のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＥＲＶ−９内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９２】
同様にして、配列番号１１：
ＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣ ＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡ ＣＵＣＣＡＡＡＡＧＡ
ＵＵＧＵＵＡＡＧＧＡ ＣＣＵＡＡＡＡＧＣＣ ＣＡＡＧＧＣＣＵＡＧ
ＵＡＡＡＡＣＣＡＵＧ ＣＡＧＵＡＡＣＣＣＣ ＵＧＣＡＧＵＡＣＵＣ
ＣＡＡＵＵＵＵＡＧＧ ＡＧＵＡＣＡＧＡＡＡ ＣＣＣＡＡＣＡＧＡＣ
ＡＧＵＧＧＡＧＧＵＵ ＡＧＵＧＣＡＡＧＡＵ ＣＵＣＡＧＧＡＵＵＡ
ＵＣＡＡＵＧＡＧＧＣ ＵＧＵＵＧＵＵＣＣＵ ＣＵＡＵＡＧＣＣＡＧ
ＣＵＧＵＡＣＣＵＡＧ ＣＣＣＵＵＡＵＡＣＵ ＣＵＧＣＵＵＵＣＣＣ
ＡＡＡＵＡＣＣＡＧＡ ＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧ ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＧ
ＵＣＣＵＧＧＡＣＣＵ ＵＣＡＧＧＡＵＧＣＣ ＵＵＣＵＵＣＵＧＣＡ
ＵＣＣＣＵＧＵＡＣＡ ＵＣＣＵＧＡＣＵＣＵ ＣＡＡＵＵＣＵＵＧＵ
ＵＵＧＣＣＵＵＵＧＡ ＡＧＡＵＡＣＵＵＣＡ ＡＡＣＣＣＡＡＣＡＵ
ＣＵＣＡＡＣＵＣＡＣ ＣＵＧＧＡＣＵＵＵＵ ＵＡＣＣＣＣＡＡＧＧ
ＵＵＣＡＧＧＧＡＵＡ ＧＵＣＣＣＣＡＵＣＵ ＡＵＵＵＧＣＣＡＧＧ
ＣＡＵＵＡＧＣＣＣＡ ＡＧＡＣＵＵＧＡＧＣ ＣＡＡＵＣＣＵＣＡＵ
ＡＣＣＵＧＧＡＣＡＣ ＵＵＧＵＣＵＵＣＧＧ ＵＡＧＧＵＧＧＡＵＧ
ＡＵＵＵＡＣＵＵＵＵ ＧＧＣＣＧＣＣＣＡＵ ＵＣＡＧＡＡＡＣＣＵ
ＵＧＵＧＣＣＡＵＣＡ ＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡ ＧＣＧＣＵＣＵＵＣＡ
ＡＵＵＵＣＣＵＣＧＣ ＵＡＣＣＵＧＵＧＧＣ ＵＡＣＡＵＧＧＵＵＵ
ＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡ ＧＧＣＵＣＡＡＣＵＣ ＵＧＣＵＣＡＣＡＧＣ
ＡＧＧＵＵＡＣＵＵＡ ＧＧＧＣＵＡＡＡＡＵ ＵＡＵＣＣＡＡＡＧＧ
ＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣ ＣＵＣＡＧＵＧＡＧＧ ＡＡＣＡＣＡＵＣＣＡ
ＧＣＣＵＡＵＡＣＵＧ ＧＣＵＵＡＵＣＣＵＣ ＡＵＣＣＣＡＡＡＡＣ
ＣＣＵＡＡＡＧＣＡＡ ＣＵＡＡＧＧＧＧＡＵ ＵＣＣＵＵＧＧＣＧＵ
ＡＡＵＡＧＧＵＵＵＣ ＵＧＣＣＧＡＡＡＡＵ ＧＧＡＵＵＣＣＣＡＧ
ＧＵＡＵＧＧＣＧＡＡ ＡＵＡＧＣＣＡＧＧＵ ＣＡＵＵＡＡＡＵＡＣ
ＡＣＵＡＡＵＵＡＡＧ ＧＡＡＡＣＵＣＡＧＡ ＡＡＧＣＣＡＡＵＡＣ
ＣＣＡＵＵＵＡＧＵＡ ＡＧＡＵＧＧＡＣＡＡ ＣＵＧＡＡＧＵＡＧＡ
ＡＧＵＧＧ：
に対応する増幅すべき第五のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＥＲＶ−Ｗ内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９３】
同様にして、配列番号１２：
ＡＵＣＡＵＡＡＵＣＣ ＡＡＵＧＣＣＡＧＵＣ ＡＣＣＣＵＧＧＡＡＣ
ＡＣＵＣＣＡＣＵＵＵ ＵＧＣＵＧＧＵＡＣＡ ＡＡＡＡＣＣＡＵＵＧ
ＣＣＵＧＧＡＣＣＡＧ ＧＡＵＣＵＧＡＵＧＡ ＧＵＡＵＡＵＡＣＵＧ
ＧＵＧＣＡＧＧＧＣＵ ＵＧＣＡＵＧＣＵＧＵ ＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣ
ＡＣＧＧＵＧＡＣＣＡ ＵＡＣＡＵＣＣＡＧＵ ＡＧＵＡＣＣＡＡＡＣ
ＣＵＧＵＡＵＡＣＵＵ ＵＡＡＵＧＧＧＡＣＵ ＵＡＵＵＣＵＡＧＣＡ
ＡＧＵＧＣＣＡＣＣＵ ＧＧＵＵＵＡＣＡＧＵ ＣＣＵＧＧＡＣＵＵＡ
ＡＡＧＧＡＵＧＣＵＵ ＵＣＣＵＣＵＧＵＣＵ ＣＵＡＣＣＵＧＧＣＡ
ＣＣＡＧＵＵＡＧＵＣ ＡＧＣＣＣＡＵＣＵＵ ＵＧＣＡＵＵＵＵＡＡ
ＵＧＧＧＡＣＡＡＵＵ ＣＡＧＵＣＡＣＡＧＧ ＣＡＣＡＧＧＧＧＧＡ
ＣＡＧＣＵＣＧＣＣＵ ＧＧＡＣＵＡＧＵＣＵ ＣＣＣＡＣＡＡＧＧＧ
ＵＵＣＡＡＧＡＡＵＵ ＣＵＣＣＣＡＣＡＡＵ ＣＵＵＵＧＧＧＧＡＡ
ＧＣＡＣＵＧＧＣＣＵ ＣＡＧＡＣＣＵＣＡＡ ＧＧＣＡＵＡＣＡＣＣ
ＣＣＡＣＣＡＡＡＵＧ ＡＣＡＡＣＵＧＣＧＣ ＣＵＵＧＵＵＧＣＡＧ
ＵＡＣＡＵＡＧＡＣＡ ＡＣＣＣＵＵＣＵＵＵ ＵＧＧＣＡＧＣＣＣＣ
ＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡ ＧＧＡＣＵＧＵＡＡＣ ＵＧＧＧＧＧＡＡＣＣ
ＣＡＧＧＡＣＣＵＣＣ ＵＣＣＡＵＣＵＣＵＵ ＡＵＧＧＧＡＡＡＧＣ
ＡＧＧＧＵＡＵＡＧＡ ＧＵＡＵＣＣＡＡＡＡ ＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡ
ＡＡＵＵＵＧＣＣＡＵ ＧＡＡＡＡＧＧＵＵＡ ＡＡＵＡＵＵＵＡＧＧ
ＣＵＵＣＡＵＡＧＵＡ ＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧ ＡＡＣＧＣＵＧＧＣＵ
ＵＧＧＣＣＡＵＧＧＡ ＵＧＡＡＡＧＣＡＡＧ ＣＣＡＵＵＵＧＵＧＣ
ＡＣＵＵＣＣＡＡＣＵ ＣＣＡＡＣＣＡＣＣＵ ＧＧＣＧＣＣＡＡＡＵ
ＡＧＧＧＧＡＡＵＵＣ ＵＵＡＧＧＧＧＣＡＧ ＣＡＧＧＧＵＵＣＵＧ
ＣＣＡＵＡＵＣＵＧＧ ＡＵＣＣＣＡＡＡＵＵ ＵＣＵＣＡＣＵＵＡＵ
ＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣ ＵＵＡＵＡＵＧＡＡＧ ＣＣＡＣＡＡＧＧＧＡ
ＧＧＧＵＧＡＡＡＡＧ ＧＡＡＣＣＣＣＵＣＣ ＵＣＵＧＡＡＡＧＧＣ
ＵＧＡＣＣＡＧＡＡＧ ＡＡＧＧＵＧＵＵＵＡ ＡＡＣＡＡＡＵＣＡＡ
ＡＧＡＡＧＣＵＣＵＡ ＡＣＵＣＡＧＧＣＵＣ ＣＡＧＣＣＵＵＡＧＧ
ＡＣＵＧＣＣＡＧＡＵ ＡＣＵＡＣＵ：
に対応する増幅すべき第六のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＥＲＶ−Ｒ内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９４】
同様にして、配列番号１３：
ＵＵＡＡＵＧＧＡＧＵ ＵＡＵＧＧＣＵＣＡＧ ＧＵＣＵＧＡＣＵＵＡ
ＣＡＧＣＡＧＧＵＣＣ ＡＧＵＧＧＧＵＣＣＣ ＵＧＧＡＣＵＣＡＵＣ
ＣＵＧＵＧＵＵＣＡＵ ＵＵＵＣＣＣＡＧＵＧ ＣＣＡＧＡＡＵＧＣＡ
ＵＡＡＵＵＧＧＣＡＵ ＵＧＵＣＡＵＡＣＵＵ ＡＧＡＧＧＣＵＧＧＣ
ＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡ ＣＡＵＵＧＡＵＵＣＵ ＧＵＧＡＣＵＧＧＵＡ
ＡＧＧＵＧＡＧＧＧＣ ＵＡＵＵＡＵＧＧＵＧ ＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡ
ＡＡＵＧＧＡＡＧＣＣ ＡＵＵＧＧＡＧＣＵＧ ＣＣＵＵＵＡＣＣＵＡ
ＧＧＡＡＡＡＵＡＧＵ ＡＡＡＵＣＡＡＡＡＡ ＣＡＵＵＡＵＣＡＣＣ
ＡＣＣＣＵＧＧＡＧＧ ＧＡＵＵＧＣＡＧＡＧ ＡＵＵＡＧＵＧＣＣＡ
ＣＣＡＵＣＡＡＧＧＡ ＣＵＵＧＡＡＡＡＡＵ ＧＣＡＧＧＧＧＵＧＧ
ＣＧＡＵＵＣＣＣＡＵ ＡＡＣＡＵＣＣＵＵＧ ＵＵＣＡＡＣＵＣＵＣ
ＣＵＵＵＵＵＧＧＣＣ ＵＧＵＧＣＡＧＡＡＧ ＡＣＡＧＡＵＧＧＡＵ
ＣＵＵＧＧＡＧＡＡＵ ＧＡＧＡＧＵＧＧＡＵ ＵＡＵＣＡＵＡＡＧＣ
ＵＵＡＡＣＣＡＡＧＵ ＧＧＵＧＡＣＵＣＣＡ ＡＵＵＧＣＡＧＣＵＧ
ＣＵＡＵＡＣＡＡＧＡ ＵＧＵＧＧＵＵＵＵＣ ＡＵＵＧＣＵＣＡＡＧ
ＣＡＡＡＵＵＡＡＵＡ ＣＡＵＣＵＣＣＵＧＧ ＵＡＣＣＵＵＧＵＡＵ
ＧＣＡＧＣＣＡＵＵＧ ＡＣＵＵＧＧＣＡＡＡ ＵＧＧＣＣＵＵＵＵＡ
ＣＣＣＡＵＵＣＣＡＵ ＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣ ＡＧＡＡＧＣＧＡＵＵ
ＵＧＣＣＵＵＣＡＧＣ ＵＧＧＣＡＡＧＧＣＣ ＡＧＣＡＡＵＧＵＡＵ
ＣＵＵＵＡＣＵＧＵＣ ＣＵＡＣＵＵＣＡＧＧ ＧＧＵＡＵＡＵＣＡＡ
ＣＵＣＵＣＣＧＧＣＵ ＵＵＧＵＧＵＣＡＵＡ ＡＵＣＵＵＡＵＵＣＡ
ＧＡＧＵＧＡＵＣＵＵ ＧＡＵＣＡＣＵＵＵＵ ＣＡＣＵＧＣＣＡＣＡ
ＡＧＡＵＡＵＣＡＣＡ ＣＵＧＧＵＣＣＡＵＵ ＡＣＡＵＵＧＡＵＧＧ
ＣＡＵＵＡＵＧＵＵＧ ＡＵＵＧＧＡＵＣＣＡ ＡＵＧＡＧＣＡＡＧＡ
ＡＧＵＡＧＣＡＡＡＣ ＡＣＡＣＵＧＧＡＣＵ ＵＡＵＵＧＧＵＧＡＧ
ＡＣＡＵＵＵＧＣＡＵ ＧＣＣＡＵＡＧＧＡＵ ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＡ
ＵＣＣＡＡＡＵＡＡＡ ＡＵＵＣＡＣＧＣＡＣ ＣＣＵＣＵＡＣＣＵＣ
ＡＧＵＡＡＡＡＵＵ：
に対応する増幅すべき第七のＲＮＡ配列は、入手先の推奨するプロトコルに従って、ＨＥＲＶ−Ｌ内在性レトロウイルスのｐｏｌ遺伝子の領域由来のクローン配列から、ＤｕａｌプロモーターベクターｐＣＲ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で作成した。転写は、入手先の推奨するプロトコルに従って、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて行った。
【００９５】
実施例２中に記載されるように、増幅は、以下のものの存在下で実施した：
・配列番号７のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１４（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡ ＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴ
ＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１５（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＴＧ ＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴ
ＣＡＴＣＣＡＴＧＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号８のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１６（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴ ＡＧＴＡＡＡＡＴＡＴ
ＣＡＴＣＣＡＴＡＡＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号９のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１７（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＡＡ ＡＧＴＡＧＡＡＧＧＴ
ＣＡＴＣＡＡＴＡＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１０のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１８（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧ ＴＡＡＡＴＣＡＴＣＣ
ＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡ Ｇ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１１のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号１９（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＡＡ ＧＴＡＡＡＴＣＡＴＣ
ＣＡＣＧＴＡＣＣＧＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号２のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号２０（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣ ＡＧＣＡＡＡＡＧＧＴ
ＣＡＴＣＡＡＣＧＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１２のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号２１（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣ ＡＡＡＡＧＡＡＧＧＴ
ＴＧＴＣＴＡＴＧＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）、
・配列番号１３のＲＮＡ配列を増幅するための配列番号２２（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡ
ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＡＧＡＴＣ ＡＲＣＡＴＡＡＴＧＹ
ＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡ）のプライマー配列（０．７５μＭ）。
【００９６】
得られたＲＮＡ転写産物を、実施例２に記載されるように、ＯＬＩＳＡチップ上で分析した。
【００９７】
配列番号１を示すためのプローブは、配列番号５（ＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣ）の配列であった。
【００９８】
配列番号２を示すためのプローブは、配列番号６（ＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣ）の配列であった。
【００９９】
配列番号７を示すためのプローブは、配列番号２３（ＣＡＡＣＣＡＧＴＴＡ
ＧＡＧＡＣＡＡＧＴＴ ＴＴＣＡ）の配列であった。
【０１００】
配列番号８を示すためのプローブは、配列番号２４（ＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡ
ＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡ ＡＴＴ）の配列であった。
【０１０１】
配列番号９を示すためのプローブは、配列番号２５（ＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣ
ＡＴＴＡＣＴＴＣＡＧ ＴＣＡＡＧ）の配列であった。
【０１０２】
配列番号１０を示すためのプローブは、配列番号２６（ＣＣＡＡＧＡＴＣＴＡ
ＧＧＣＣＡＣＴＴＣＴ ＣＡ）の配列であった。
【０１０３】
配列番号１１を示すためのプローブは、配列番号２７（ＣＡＴＣＴＡＴＴＴＧ
ＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴ Ａ）の配列であった。
【０１０４】
配列番号１２を示すためのプローブは、配列番号２８（ＡＧＡＣＣＴＣＡＡＧ
ＧＣＡＴＡＣＡＣＣＣ）の配列であった。
【０１０５】
配列番号１３を示すためのプローブは、配列番号２９（ＧＣＴＴＴＧＴＧＴＣ
ＡＴＡＡＴＣＴＴＡＴ ＴＣＧ）の配列であった。
【０１０６】
別々の増幅から平均値及び標準偏差を計算し、図４に示す。
【０１０７】
本発明の技術により、混合物（本明細書では、異なる転写産物最大９つからなる）中で転写産物を増幅することができる。また、測定したシグナルと、試験した範囲（各転写産物についてコピー数ｌ０６〜１０８）内の反応容積に導入された転写産物の量との間に直線的な関係があることにも留意すべきである。このことから、この技術によって、いくつかの転写産物を同時かつ特異的に増幅できることが示される。従って、この方法により得られる増幅産物をＤＮＡチップ分析（又は、他の方法による分析）することによって、初期試料の転写産物を定量できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、本発明の方法の工程を概略的に表す。
【図２】図２は、本発明に従って及び実施例２に記載されるように得られた転写産物にハイブリダイズしたハイブリダイゼーションプローブにより放射されたシグナルを表す。
【図３】図３は、実施例３に記載されたプロトコルに従って特定範囲の転写産物（１×１０７、１×１０８、１×１０９及び１×１０１０コピー）を増幅した後に得られる連続回帰を表す。
【図４】図４は、実施例４に記載されたプロトコルに従って得られる増幅産物のハイブリダイゼーション及び可視化後に、それぞれの特異的プローブについて放射されたシグナル（３回の平均）及びその標準偏差を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
・“プライマー”領域及び目的の領域を含む、少なくとも１つの増幅すべきＲＮＡ配列、並びに
・プロモーター領域、及び、前記増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む増幅プライマー：
から転写産物を作成する方法であって、
一定温度で実施され、かつ、以下の工程：
ａ） 前記プライマーと増幅すべきＲＮＡとをハイブリダイズする工程、
ｂ） 逆転写酵素酵素活性によってプライマーを伸長させて、増幅すべきＲＮＡの相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を作成する工程、
ｃ） 前記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を使用して切断し、前記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ） 前記増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、逆転写酵素及び鎖置換酵素を使用して伸長させ、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ） ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を使用して、工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡ転写産物を得る工程：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
以下の工程：
ｆ．前記目的の領域に特異的なハイブリダイゼーションプローブを使用して、作成されたＲＮＡ転写産物を検出する工程：をさらに含む
ことを特徴とする請求項１に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項３】
工程ａ）〜ｅ）は、十分数の転写産物を得るのに十分な時間にわたって実施される
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項４】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼである
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項５】
以下：
・少なくとも、“プライマー”領域及び目的の領域を含む第一の増幅すべきＲＮＡ配列、並びに、プロモーター領域、及び、前記第一の増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む第一の増幅プライマー、
・少なくとも、前記第一の増幅すべきＲＮＡ配列とは異なっていてかつ“プライマー”領域及び目的の領域を含む第二の増幅すべきＲＮＡ配列、並びに、プロモーター領域及び前記第二の増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む第二の増幅プライマー：から転写産物を作成する方法であって、
一定温度で行われ、かつ、以下の工程：
ａ）．前記第一及び第二のプライマーを、前記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
ｂ）．前記第一及び第二のプライマーを逆転写酵素の酵素活性により伸長させて、第一の増幅すべきＲＮＡの第一の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列及び第二の増幅すべきＲＮＡの第二の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を作成する工程、
ｃ）．前記第一及び第二のｃＤＮＡにそれぞれハイブリダイズした第一及び第二の増幅すべきＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により切断して、第一のｃＤＮＡにハイブリダイズした第一の増幅すべきＲＮＡの断片及び第二のｃＤＮＡにハイブリダイズした第二の増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ）．前記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、逆転写酵素及び鎖置換酵素により伸長して、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ）．工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡの転写産物を得る工程：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
以下の工程：
ｆ．第一のハイブリダイゼーションプローブを用いて第一の増幅すべきＲＮＡの転写産物を検出し、かつ、第二のハイブリダイゼーションプローブを用いて第二の増幅すべきＲＮＡの転写産物を検出する工程：をさらに含む
ことを特徴とする請求項５に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項７】
工程ａ）〜ｅ）は、十分数の転写産物を得るのに十分な時間にわたって実施される
ことを特徴とする請求項５又は６に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項８】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼである
ことを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項１】
以下：
・“プライマー”領域及び目的の領域を含む、少なくとも１つの増幅すべきＲＮＡ配列、並びに
・プロモーター領域、及び、前記増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む増幅プライマー：
から転写産物を作成する方法であって、
一定温度で実施され、かつ、以下の工程：
ａ） 前記プライマーと増幅すべきＲＮＡとをハイブリダイズする工程、
ｂ） 逆転写酵素酵素活性によってプライマーを伸長させて、増幅すべきＲＮＡの相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を作成する工程、
ｃ） 前記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を使用して切断し、前記ｃＤＮＡにハイブリダイズした増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ） 前記増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、逆転写酵素及び鎖置換酵素を使用して伸長させ、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ） ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を使用して、工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡ転写産物を得る工程：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
以下の工程：
ｆ．前記目的の領域に特異的なハイブリダイゼーションプローブを使用して、作成されたＲＮＡ転写産物を検出する工程：をさらに含む
ことを特徴とする請求項１に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項３】
工程ａ）〜ｅ）は、十分数の転写産物を得るのに十分な時間にわたって実施される
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項４】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼである
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項５】
以下：
・少なくとも、“プライマー”領域及び目的の領域を含む第一の増幅すべきＲＮＡ配列、並びに、プロモーター領域、及び、前記第一の増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む第一の増幅プライマー、
・少なくとも、前記第一の増幅すべきＲＮＡ配列とは異なっていてかつ“プライマー”領域及び目的の領域を含む第二の増幅すべきＲＮＡ配列、並びに、プロモーター領域及び前記第二の増幅すべきＲＮＡ配列の“プライマー”領域にハイブリダイズできる領域を含む第二の増幅プライマー：から転写産物を作成する方法であって、
一定温度で行われ、かつ、以下の工程：
ａ）．前記第一及び第二のプライマーを、前記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡにハイブリダイズさせる工程、
ｂ）．前記第一及び第二のプライマーを逆転写酵素の酵素活性により伸長させて、第一の増幅すべきＲＮＡの第一の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列及び第二の増幅すべきＲＮＡの第二の相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）配列を作成する工程、
ｃ）．前記第一及び第二のｃＤＮＡにそれぞれハイブリダイズした第一及び第二の増幅すべきＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素により切断して、第一のｃＤＮＡにハイブリダイズした第一の増幅すべきＲＮＡの断片及び第二のｃＤＮＡにハイブリダイズした第二の増幅すべきＲＮＡの断片を得る工程、
ｄ）．前記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡの断片の末端を、逆転写酵素及び鎖置換酵素により伸長して、ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを得る工程、
ｅ）．工程ｄ）で形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により、前記第一及び第二の増幅すべきＲＮＡの転写産物を得る工程：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
以下の工程：
ｆ．第一のハイブリダイゼーションプローブを用いて第一の増幅すべきＲＮＡの転写産物を検出し、かつ、第二のハイブリダイゼーションプローブを用いて第二の増幅すべきＲＮＡの転写産物を検出する工程：をさらに含む
ことを特徴とする請求項５に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項７】
工程ａ）〜ｅ）は、十分数の転写産物を得るのに十分な時間にわたって実施される
ことを特徴とする請求項５又は６に記載の転写産物を作成する方法。
【請求項８】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼである
ことを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の転写産物を作成する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５１４２２０（Ｐ２００８−５１４２２０Ａ）
【公表日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３４０５８（Ｐ２００７−５３４０５８）
【出願日】平成１７年９月２３日（２００５．９．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／０５０７７５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５４００３
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２３日（２００５．９．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／０５０７７５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５４００３
【国際公開日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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