転移抑制のための抗ＰＥＣＡＭ治療
本発明は、新生物疾患の処置に有用な抗転移薬に関連する新規組成物、方法、キットおよびその使用を提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
相互参照
本願は、２００３年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／５１９，９８６号に優先権を主張し、それは参照により本明細書に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、患者において新生物細胞の転移能を阻害するための方法および関連組成物の同定に関する。本方法および組成物には、抗体などのＰＥＣＡＭ結合物質、ならびに新生物細胞の浸潤性および転移能を調節するためにＰＥＣＡＭ結合物質を用いて疾患を処置または防止する方法が含まれる。
【０００３】
発明の背景
腫瘍形成は、Foulds(1958)により多段階の生物学的過程として記載され、それは現在、遺伝子損傷の蓄積により生じることが分かっている。分子レベルでの多段階過程の腫瘍形成は、正および負の調節エフェクターの両方の破壊を伴う(Weinberg, 1989)。ヒト結腸癌についての分子機序には、多くの癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子および修復遺伝子が関係することがVogelsteinおよびcoworkers(1990)により主張されている。同様に、網膜芽腫の進行をもたらす欠損には、別の腫瘍抑制遺伝子が関連している(Lee et al., 1987)。さらに他の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子も、様々な他の悪性腫瘍において同定されている。残念ながら、不適切な数の処置可能な癌が残っており、癌の影響は、米国だけで一年に５０万人以上の死をもたらすほど壊滅的である。
【０００４】
癌は、基本的に細胞ＤＮＡへの損傷が細胞増殖を制御する正常な機構の崩壊をもたらす遺伝子疾患である。腫瘍抑制因子がゲノムの完全性を維持する２つの作用機構は、細胞周期を停止し、それにより損傷ＤＮＡの修復をすること、またはアポトーシスによる損傷ＤＮＡの除去を可能にすることである(Ellisen and Haber, 1998; Evan and Littlewood, 1998)。アポトーシスは、他に“プログラムされた細胞死”とも称され、不可逆的に損傷を受けた細胞の除去を目的とした細胞の自殺プログラムとして働く緻密に制御されたネットワークの生化学的事象である。アポトーシスは、腫瘍壊死因子の結合、ＤＮＡ損傷、増殖因子の停止、およびＦａｓ受容体の抗体架橋を含む多くの方法で引き起こされ得る。アポトーシス過程に役割を果たすいくつかの遺伝子が同定されているが、アポトーシスを誘導する経路は十分に明らかにされていない。多くの研究者が、新規のアポトーシス促進遺伝子の同定を、かかる遺伝子が患者の癌を処置するために新生物細胞のアポトーシス感受性を誘導する手段を提供するだろうという目的を持って、試みている。
【０００５】
癌を処置するための別の方法には、エンドスタチン（商標）または抗ＶＥＧＦ抗体などの薬剤を用いる血管形成の抑制が含まれる。この方法にて、その目標は、原発腫瘍のさらなる血管形成を防止すること、および場合によっては実質的な血管増殖なしに新生物細胞の生存を支持し得る程度に転移病変のサイズを抑制することである。
【０００６】
血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１；ＣＤ３１）は、内皮細胞および好中球で発見されたタンパク質であり、内皮細胞を越える白血球の遊走に関係していることが示されている。血栓症、血管閉塞、卒中などの心血管状態の処置のため、および血液凝固疾患を処置するためまたは発症を減ずるためのＰＥＣＡＭ−１の活性の調節は、ＷＯ０３０５５５１６Ａ１で開示される。ＰＥＣＡＭ−１はまた、炎症過程に関係があるとされ、抗ＰＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体は、インビボでの好中球動員を阻止することが報告されている(Nakada et al. (2000) J. Immunol. 164: 452-462)。正常な白血球遊走、血小板凝集、および血管生長を有することが明らかなＰＥＣＡＭ−１ノックアウトマウスが報告されており、それはＰＥＣＡＭ−１の欠失を補うことができる余分な接着分子があることを示唆する(Duncan et al. (1999) J. Immunol. 162: 3022-3030)。ＰＥＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体は、マウス内皮管形成を防止することが報告されており、それは腫瘍移植モデル(Zhou et al. (1999) Angiogenesis 3: 181−188）およびヒト皮膚移植モデル(Cao et al. (2002) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282: C1181-C1190)での血管形成の関連指標である。しかしながら、腫瘍血管形成におけるＰＥＣＡＭ−１の役割は、あるとしても、未だ明らかにされないままである。
【０００７】
抗血管形成法を用いる癌および腫瘍の転移を阻害する実質的な効果にも関わらず、今日までに、血管形成の阻害のみによって癌を処置するための、承認され、かつ市販されている薬剤はない。実際に、新生物形成および転移の過程におけるＰＥＣＡＭ−１を含む様々な接着分子の特別な役割は知られていない。
【０００８】
患者における癌細胞の転移能を阻害するための方法および関連組成物が、当技術分野で必要とされている。本発明は、この必要を満たし、本分野における当業者により望まれる関連局面を提供する。
【０００９】
本明細書中に言及した引用文献は、本出願の出願日前にそれらが発表されたことについてのためのみ提供する。ここでは、先の発明によってかかる開示内容に先立つ権利がないとの発明者らの容認と解釈されてはならない。本明細書中にて参照されるすべての特許および刊行物は、その開示の全体の内容が本明細書にて機械的または電子的に複製されたかのように、すべての目的のために参照により包含される。
【００１０】
発明の概要
本発明は、ＰＥＣＡＭ−１と結合する抗体の全身的投与が、一般的にヒトにおいて致命的な多種多様な異なる腫瘍型の転移拡散を抑制するという予期せぬ発見に関係し、この効果は、あるとすれば、血管形成の何らかの阻害とは独立して達成される。この予期せぬ発見は、新規の抗癌処置剤および医薬の作製の基礎を提供し、ここで全身的投与量の抗ＰＥＣＡＭ抗体または同様の機能的結果を提供する代用物の供給が、患者における新生物細胞の侵襲性および／または転移能を阻害または低下するために患者に投与される。
【００１１】
本発明は、細胞における悪性形質転換を抑制または防止するための方法であって、形質転換された表現型を阻害し、かつ細胞の検出可能な侵襲性および／または転移能を低下するための有効量で全身的に抗ＰＥＣＡＭ抗体を投与することを含む方法を提供する。１つの態様にて、前記抗ＰＥＣＡＭ抗体は、非新生物性体細胞に位置するＰＥＣＡＭに結合し得るか、または新生物細胞に存在するＰＥＣＡＭあるいは交差反応性の高分子と結合し得る。
【００１２】
抗ＰＥＣＡＭ結合種を、新生物を有すると診断された患者に当業者に公知の何らかの様々な手段により接触するか、または導入することができるが、抗ＰＥＣＡＭ結合剤を全身的に送達することが好ましいことが多い。本発明に関して、抗ＰＥＣＡＭ結合種には、ヒト化またはヒト配列モノクローナル抗体などの抗体、およびＦ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ９ａｂ、Ｆ（ａｂ）、Ｄａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃまたは少なくとも約１×１０８Ｍの親和性でヒトＰＥＣＡＭ−１と結合する特性を有する抗体の最小認識単位を含む抗体断片が含まれ得る。他の結合種にはまた、ＵＳ２００３０１５７５６１Ａ１に記載のタンパク質性の結合多量体、高親和性のペプチドおよび等価体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様にて、前記抗ＰＥＣＡＭ結合種は、３０Ｋの直鎖ＰＥＧなどのポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）、または、４０Ｋ、６０Ｋもしくはより大きな分岐鎖ＰＥＧ部分、またはより大きな直鎖または分岐鎖ＰＥＧ部分と、単結合または多重結合のいずれかにより共有結合する。
【００１３】
本発明のいくつかの態様にて、全身的に投与された抗ＰＥＣＡＭ結合種が転移を阻害し得るという本発明者らの発見は、他の抗形質転換／抗癌治療と併用して用いられるだろう。これらの他の治療は、本出願時に公知であり得るか、または本出願の日後に明らかとなり得る。例えば、ヒト化またはヒト配列抗ＰＥＣＡＭ抗体を、他の治療ポリペプチド、他の治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または化学療法剤と併用することができる。１つの代表的な態様では、前記化学療法剤はタキソールである。前記抗ＰＥＣＡＭ結合種はまた、放射線治療と併用することもできる。放射線治療を構成する電離放射線の型は、Ｘ線、γ線、およびマイクロ波を含む群から選択され得る。任意の態様にて、電離放射線は、外部ビーム照射によるか、または放射性核種の投与によりもたらされ得る。前記抗ＰＥＣＡＭ結合種はまた、遺伝子治療レジメンと共に用いられ得る。
【００１４】
本発明はまた、多くのヒト癌のための処置方法を提供する。その処置方法には、新生物、典型的には癌腫または肉腫または他の固形癌種を有すると診断された患者を、好ましくは皮下または静脈内投与によるか、または脳転移を阻害するために脳内への鞘内投与により送達される全身的投与量の抗ＰＥＣＡＭ結合種で処置することが含まれる。好ましい変法には、皮下または静脈などの全身的経路によりヒト化またはヒト配列抗ＰＥＣＡＭモノクローナル抗体などの抗ＰＥＣＡＭ結合種の有効投与量を投与することにより、乳癌、肺癌、または結腸癌を有すると診断された患者を処置することが含まれる。
【００１５】
本発明の任意の他の局面にて、適する容器中に抗ＰＥＣＡＭ結合種の製剤を含む治療キットが提供される。かかるキットは、治療ポリペプチド、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または化学療法剤の製剤をさらに含み得る。かかるキットは、増感剤、新生物−特に肺癌、結腸癌、あるいは乳癌、または様々な黒色腫−を有すると診断されたヒト患者への全身的送達による抗ＰＥＣＡＭ結合種の投与のための説明書を含み得る。好ましい変法にて、前記キットは、ＰＥＧ化されるヒト化またはヒト配列抗ＰＥＣＡＭモノクローナル抗体を含む。
【００１６】
本発明はまた、少なくとも約１×１０７Ｍ−１の親和性でヒトＰＥＣＡＭ−１と結合し、かつ他のＰＥＣＡＭ関連ポリペプチドに対する特異的高親和性結合を欠く抗体を提供する。かかる抗体は、全身的、頭蓋内、または（例えば、カチオン化によるか、またはリポソームもしくは免疫リポソーム送達による）新生物細胞への標的化送達により、治療的に用いられ得る。
【００１７】
本発明はまた、ＰＥＣＡＭ−１機能を調整することにより、新生物形成、侵襲性および／または転移を阻害し、かつ血管形成を阻害しない治療薬を提供する；かかる薬剤は、医薬として用いることができる。
【００１８】
本発明は、固形腫瘍を有すると診断された患者であって、その血管形成阻害が弊害をもたらすかもしれない患者、例えば、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、冠状動脈または大脳血管系のアテローム性動脈硬化症に最近罹患した患者、または損傷もしくは大手術の結果として生じ、かつ循環系の治癒または回復を補助するために血管形成の恩恵を受ける重大な創傷治癒過程にある者などを処置するための方法を提供する。
【００１９】
本発明の変法にて、免疫原性の用量の変性ヒトＰＥＣＡＭ−１、または霊長類、マウス、ラット、イヌあるいはブタのＰＥＣＡＭ−１タンパク質もしくはその一部分などの非ヒトＰＣＡＭ−１を、新生物を有すると診断されたヒト患者に対して、典型的にはアジュバントおよび／またはDynavax社またはColey Pharmaceuticals社により開示されたような共有結合あるいは非結合の免疫刺激性ポリヌクレオチドと併用して投与する。本方法にて、前記ヒト患者は、抗体応答を含む免疫応答を起こすことができ、それはこうしなければ寛容である患者自身のＰＥＣＡＭ−１タンパク質と交差反応し得る。
【００２０】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、本明細書の残りの部分および図面を参照することにより明らかとなるであろう。
【００２１】
本発明の他の目的、特徴、および利点は下記の詳しい説明で明らかになるだろう。しかしながら、詳しい説明および具体的な実施例は、本発明の精神および範囲内の様々な変化および修飾がこの詳しい説明から当業者に明らかになり得るため、本発明の好ましい態様を示すが、説明のためだけに供されると理解されるべきである。
【００２２】
図面の説明
図１Ａおよび１Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
図２Ａおよび２Ｂは、抗体処理の効果を示す。
図３Ａおよび３Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
図４Ａおよび４Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
図５Ａおよび５Ｂは、抗体処理の効果を示す。
【００２３】
好ましい態様の説明
他に定義されない限り、本明細書中に用いられるすべての技術的および化学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の何らかの方法および材料と同じかまたは等価なものを、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的に関して、下記の用語を以下に定義する。
【００２４】
下記の特許文献は参照により本明細書中に含まれる：米国特許第５，９６８，５１１号；ＷＯ０１５５１７８；米国特許第６，６３９，０５５号；米国特許第６，１３３，４２６号；ＷＯ０３０５５５１６；ＷＯ０２０８５４０５；および、米国特許第６，６２７，１９６号−それらの中に記載の方法および材料を包含する。
【００２５】
定義
物について用いられるような、本明細書で用いる用語“天然に存在する”とは、その物を天然において発見することができるという事実を示す。例えば、天然源から単離され得、それらが研究室で人間により意図的に改変されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。一般的に、天然に存在するという用語は、種に典型的であり得るように、非病理学的（病気でない）個体に存在するものを示す。
【００２６】
下記の用語は、２個またはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を記載するのに用いられる：“参照配列”、“比較ウインドウ（comparison window）”、“配列同一性”、“配列同一性の割合”、および“実質的同一性”。“参照配列”とは、配列比較の基準として用いられる定義された配列である；参照配列は、例えば、図２のポリヌクレオチド配列などの配列表に与えられる全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列の断片のような、より大きな配列の下位集団であり得るか、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含み得る。一般的に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長、しばしば少なくとも２５ヌクレオチド長、およびしばしば少なくとも５０ヌクレオチド長である。２個のポリヌクレオチドは、それぞれ（１）２個のポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部）を含み得、そして（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含み得るため、２個（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は一般的に、配列類似性の領域を同定および比較するために“比較ウインドウ”上で２個のポリヌクレオチドの配列を比較することにより行われる。
【００２７】
本明細書で用いる“比較ウインドウ”は、少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの位置の概念的断片を示し、ここでポリヌクレオチド配列は、少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの参照配列と比較され得、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２個の配列の最適なアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まないもの）と比較して２０パーセントまたはそれ以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウをアライニングするための配列の最適なアライメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム(1981) Adv. Appl. Math. 2: 482、NeedlemanおよびWunschの相同性アライメントアルゴリズム(1970) J. Mol. Biol. 48: 443、PearsonおよびLipmanの類似法の探求(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行により（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または検査により行われ得、そして様々な方法により得られた最も良いアライメント（すなわち、比較ウインドウ上での最高の相同性割合をもたらす）を選択する。
【００２８】
用語“配列同一性”は、２個のポリヌクレオチド配列が比較ウインドウ上で（すなわち、ヌクレオチド−ヌクレオチド塩基ごとに）同一であることを意味する。用語“配列同一性の割合”を、比較ウインドウ上で２個の最適に整列された配列を比較し、一致した位置の数を得るため同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が両配列に生じる位置の数を決定し、比較ウインドウ（すなわち、ウインドウサイズ）中で一致する位置の数を位置の全数で割り、そして結果を１００倍し、配列同一性の割合を得ることにより計算する。本明細書で用いる用語“実質的同一性”は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウインドウ上（しばしば少なくとも２５−５０ヌクレオチドのウインドウ上）で参照配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５パーセントの同一性およびしばしば９０から９５パーセントの配列同一性、より通常には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、ここで、配列同一性の割合は、参照配列と、比較ウインドウ上で全体で２０パーセントまたはそれ以下の参照配列の欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列を比較することにより計算する。前記参照配列は、より大きな配列の下位集団であり得る。
【００２９】
ポリペプチドについて用いられるような、用語“実質的同一性”は、２個のペプチド配列が規定値のギャップ重量を用いてＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによるなどして最適に整列されるとき、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントまたはそれ以上の配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００３０】
保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を示す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族性側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；そして、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００３１】
本明細書で用いる用語“断片”は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、全長ｃＤＮＡから推定された配列における対応する位置と同一であるポリペプチドを示す。断片は一般的に、少なくとも１４のアミノ酸長、好ましくは少なくとも２０のアミノ酸長、通常少なくとも５０のアミノ酸長またはそれ以上、天然に存在するポリペプチドの全長までの長さである。
【００３２】
本明細書で用いる用語“薬剤”は、化合物、化合物の混合物、空間的に限局された化合物のアレイ（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ、ポリヌクレオチドアレイ、および／または組合せ小分子アレイ）、生体高分子、バクテリオファージペプチド提示ライブラリ、バクテリオファージ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）提示ライブラリ、ポリソームペプチド提示ライブラリ、または細菌、植物、真菌もしくは動物（特に、哺乳動物）の細胞または組織などの生物学的材料から作製された抽出物を示す。薬剤を、以下に記載のスクリーニング分析に付すことにより抗新生物薬、抗炎症薬、またはアポトーシス調節薬としての潜在的活性について評価する。薬剤を、以下に記載のスクリーニング分析に付すことにより特定のタンパク質相互作用阻害剤（すなわち、２個の所定のポリペプチド間の結合相互作用を選択的に阻害するが、細胞生存能を実質的に妨げない薬剤）としての潜在的活性について評価する。
【００３３】
本明細書で用いる用語“タンパク質相互作用阻害剤”は、第一の相互作用ポリペプチドおよび第二の相互作用ポリペプチド間のタンパク質−タンパク質結合を選択的に阻害する薬剤として、本発明の１個またはそれ以上のスクリーニング方法により同定される薬剤を示す。いくつかのタンパク質相互作用阻害剤は、ヒトが使用するための薬剤として治療可能性を有し得、および／または研究室での研究またはバイオプロセス制御のための市販薬として供給され得る。故に、候補薬剤であるタンパク質相互作用阻害剤はさらに、非ヒト動物へのインビボ投与、およびしばしば承認された臨床試験でのヒトへの投与を含む、ヒトおよび動物用薬剤としての使用への適性を予測するために常套的に用いられる分析にて活性について試験される。
【００３４】
本明細書で用いる用語“抗新生物薬”は、ヒトにおける新生物、特に転移性の固形腫瘍型の発症または進行を阻害する機能的特性を有する薬剤である。
【００３５】
本明細書で用いる用語“標識”または“標識した”とは、例えば、放射標識したアミノ酸の挿入、または標識アビジン（例えば、光学的方法または熱量測定法により検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合によるなどの、検出可能マーカーの挿入を示す。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、用いられ得る。ポリペプチドの標識の例には、以下：放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、蛍光ランタニド）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、転写活性ポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様にて、標識は、可能性のある立体障害を減ずるために様々な長さのスペースアームにより結合される。
【００３６】
本明細書で用いる“実質的に純粋”は、目的種が優先的に存在する種であることを意味し（すなわち、モルを基準として、それは組成物中のいずれかの他の個々の高分子種よりも多く存在する）、そして好ましくは実質的に純粋な画分は、前記目的種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルを基準に）を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０から９０％以上を構成するだろう。最も好ましくは、前記目的種は、前記組成物が本質的に単一の高分子種からなる、本質的に均一となる（混入種が、常套的な検出方法により組成物中に検出されない）まで精製される。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種とは見なされない。
【００３７】
本明細書で用いる“正常な血液”または“正常なヒト血液”は、活動性新生物疾患あるいはリンパ球増殖の他の障害、または新生物疾患の発症に関する確認された素因を有さない健常なヒト個体に由来する血液を示す。同様に、“正常細胞”、“正常細胞試料”、“正常組織”および“正常リンパ節”は、活動性新生物疾患または他のリンパ球増殖性疾患を有さない健康なヒト個体から得られたそれぞれの試料を示す。
【００３８】
本明細書で用いる用語“生理的条件”は、生存生物に適合し、および／または生存培養酵母細胞または哺乳動物細胞の細胞内に一般的に存在する温度、ｐＨ、イオン強度、粘度などの生化学的パラメータを示す。例えば、典型的な実験培養条件下で増殖する酵母細胞の細胞内条件は、生理的条件である。インビトロ転写カクテルに適するインビトロ反応条件は一般に、生理的条件である。一般的に、インビトロ生理的条件には、５０−２００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ６．５−８．５、２０−４５℃および０．００１−１０ｍＭの二価陽イオン（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋）が含まれる；好ましくは、約１５０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ７．２−７．６、５ｍＭの二価陽イオン、およびしばしば０．０１−１．０％非特異的タンパク質（例えば、ＢＳＡ）が含まれる。非イオン性界面活性剤（トウィーン、ＮＰ−４０、トライトンＸ−１００）はしばしば、通常約０．００１から２％、典型的に０．０５−０．２％（ｖ／ｖ）存在し得る。特定の水性条件は、常套法に従い当業者が選択することができる。一般的な手引きに関して、以下の緩衝水性条件を適用することができる：１０−２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５−５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ５−８、所望により二価陽イオン（複数）および／または金属キレート剤および／または非イオン性界面活性剤および／または膜画分および／または消泡剤および／またはシンチラントを加えて良い。
【００３９】
本明細書で用いる用語“相互作用ポリペプチド断片”および“相互作用ポリペプチド配列”は、適する結合条件下にて第二のハイブリッドタンパク質の一部と特異的な結合相互作用を形成し得るハイブリッドタンパク質の一部を示す。一般的に、第一のハイブリッドタンパク質の一部は、第二のハイブリッドタンパク質の一部と選択的に結合し、第一および第二のハイブリッドタンパク質を含むヘテロ二量体またはより高次のヘテロ多量体を形成する；各ハイブリッドタンパク質の結合部分は、相互作用ポリペプチド断片と称される。一般的に、相互作用ポリペプチドは、適する生理的条件下で、少なくとも約１×１０３Ｍ−１、通常少なくとも１×１０４Ｍ−１、一般的には少なくとも１×１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１×１０６Ｍ−１から１×１０７Ｍ−１またはそれ以上の解離定数（ＫＤ）を有するヘテロ二量体を形成し得る。
【００４０】
本明細書で用いる用語“多量体”は、二量体およびより高次の複合体（三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体など）を含む。“ホモ多量体”は、同じサブユニット種を含む複合体を示す。“ヘテロ多量体”は、２以上のサブユニット種を含む複合体を示す。
【００４１】
本明細書で用いる用語“組換え”は、タンパク質をコードする遺伝子が、既知の組換えＤＮＡ技術によりクローニングされる、組換えＤＮＡ技術により作製されたＰＥＣＡＭ−１を示す。例えば、ＰＥＣＡＭ−１についてのヒト遺伝子は、細菌プラスミドおよび適する宿主を形質転換するために用いられるプラスミドなどの適するＤＮＡベクターに挿入され得る。故に、前記遺伝子は、組換えタンパク質を製造するために宿主にて発現される。形質転換された宿主は、哺乳動物、酵母、アスペルギルス（Aspergillus）および昆虫細胞を含む、原核または真核であり得る。
【００４２】
“抗体”（Ａｂ）および“免疫グロブリン”（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体および他の抗体様分子の両方を含み抗原特異性を欠く。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系で低レベル、かつ骨髄腫で高レベルで産される。用語“抗体”は、広義の意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２個の無傷の抗体から形成される多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および、それらが所望の生物学的活性を示す限りは抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
“天然の抗体”および“天然の免疫グロブリン”は通常、２個の同じ軽鎖（Ｌ）および２個の同じ重鎖（Ｈ）を含む、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンのイソ型の重鎖によって変わる。重鎖および軽鎖のそれぞれはまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の端の可変ドメイン（ＶＨ）の後に多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他方の末端に定常ドメインを有する；前記軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列され、前記軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の接点を形成すると考えられている。
【００４４】
用語“可変”とは、可変ドメインの任意の部分が抗体間の配列で広範に異なり、その特定の抗原について各特定の抗体の結合および特異性に用いられるという事実を示す。しかしながら、その可変性は、抗体の可変ドメイン中に均一に分散されない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域とも称される３つの断片に関する。可変ドメインのより高度な保存部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と称される。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つのＣＤＲでつながっている大きなβシート構造をとる４個のＦＲ領域を含み、それはループ結合を形成し、そしていくつかの場合にはβシート構造の一部を形成する。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域により他の鎖からのＣＤＲと互いに接近してつながり、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００４５】
本明細書で用いる用語“超可変領域”は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を示す。超可変領域は、“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）；Kabat et al.,Sequence of proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. [1991]）、および／または“超可変ループ”に由来するそれらの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；Clothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 [1987]）を含む。“フレームワーク”または“ＦＲ”残基は、本明細書に定義のような超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。
【００４６】
“抗体断片”は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体（diabody）；直鎖抗体（Zapata et al., protein Eng., 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；および、抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４７】
抗体のパパイン消化は、２個の同一の抗原結合断片、いわゆる“Ｆａｂ”断片（それぞれ、単一の抗原結合部位を有する）および残りの“Ｆｃ”断片（その名称は、すぐに結晶化するその能力を示す）を産する。パパイン処理は、２個の抗原結合部位を有し、抗原を架橋する能力を依然有するＦ（ａｂ’）２断片を産する。
【００４８】
“Ｆｖ”は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、強い、非共有結合での１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。それは、この構造中、それぞれの可変ドメインの３個のＣＤＲがＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するために相互作用する。合わせて、６個のＣＤＲが、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、全体の結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００４９】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体のヒンジ領域由来の１個またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少しの残基を付加することにより、Ｆａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を生じるＦａｂ’を意味する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は本来、それらの間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’断片として製造された。抗体断片の他の化学結合もまた公知である。
【００５０】
脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の“軽鎖”は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２個の明確に異なる型のうちの１つ、いわゆるκ（．ｋａｐｐａ．）およびλ（．ｌａｍｂｄａ．）を表し得る。
【００５１】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスを示し得る。免疫グロブリンには５個の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちいくつかは、さらにサブクラス（イソ型）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構造は公知である。
【００５２】
本明細書に用いるような用語“モノクローナル抗体”は、実質的に相同性の抗体集団から得られる抗体、すなわち前記集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて同一であるものを示す。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対する高い特異性を有する。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体製造とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、有利なことに、他の免疫グロブリンが混入していない、ハイブリドーマ培養により合成される。その修飾“モノクローナル”は、実質的に相同性の抗体の集団から得られるような抗体の特性を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を要すると解釈されてはならない。例えば、本発明に用いられるモノクローナル抗体は、最初にKohler et al., Nature 256:495 [1975]に記載されたハイブリドーマ法により製造され得るか、または組換えＤＮＡ法により製造され得る（例えば、米国特許番号第４，８１６，５６７号を参照のこと）。前記“モノクローナル抗体”はまた、例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 [1991] and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離され得る。
【００５３】
本明細書中のモノクローナル抗体は特に、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同じかまたは相同性であるが、残りの鎖（複数可）は、それらが所望の生物学的活性を示す限りは、他の種に由来する抗体または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにかかる抗体の断片における対応する配列と同じかまたは相同性である“キメラ”抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許番号第４，８１６，５６７号； Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]）。
【００５４】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の“ヒト化”形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原結合配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容者のＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性および可能性を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（供与体抗体）のＣＤＲ由来の残基により置換されるヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。いくつかの例にて、ヒト免疫グロブリンのＦｖ ＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体にも、外来ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾体は、さらなる改良により作製され、抗体性能を最大化する。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み得、ここで非ヒト免疫グロブリンのそれに対応するＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべておよびＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のそれである。前記ヒト化抗体はまた、最適には、少なくとも免疫グロブリン定常部位（Ｆｅ）の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのそれを含み得る。さらに詳細には、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 [1988];および、Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域がマカクザルを所望の抗原で免疫化することにより産される抗体から誘導される、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ．ＴＭ．抗体が含まれる。
【００５５】
“単鎖Ｆｖ”または“ｓＦｖ”抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは、一本のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、前記Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とするＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖのレビューに関しては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994）を参照のこと。
【００５６】
用語“二重特異性抗体”は、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体断片を示し、その断片は、同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２個のドメイン間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーを用いることにより、そのドメインは別の鎖の相補的なドメインとの対形成を強いられ、２個の抗原結合部位が形成される。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に、より十分に記載される。
【００５７】
“単離された”抗体は、その自然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その自然環境の混入成分は、抗体の診断または治療的使用を妨げ得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい態様にて、前記抗体を、（１）Ｌｏｗｒｙ法により測定されるように、抗体の９５重量％以上、最も好ましくは９９重量％以上まで、（２）spinning cup配列決定装置の使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質性となるまで精製することができる。抗体の自然環境の少なくとも１つの要素が存在しないため、単離された抗体は、組換え細胞内の原位置のものも含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程により製造されるだろう。
【００５８】
発明の詳しい説明
以下に用いる学名および下記の細胞培養、分子遺伝学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの実験法は、当技術分野で公知かつ通常用いられる方法を含み得る。標準技術を、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成法、ならびに微生物培養および形質転換法（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に用いる。前記技術および方法を通常、当技術分野における常套法および本明細書の全体を通して供される様々な一般的参考文献（一般的には、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと。それらは参照により本明細書に含まれる）に従い行う。
【００５９】
オリゴヌクレオチドを、製造業者により提供される説明書に従い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍｓのオリゴヌクレオチド合成器で合成することができる。
【００６０】
ＰＣＲ増幅のための方法は、当技術分野にて記載される（PCT Technology：Principles and Applications for DNA Amplification ed. HA Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, Gelfland, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA (1990)；Mattila et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, K.A. and Kunkel, T.A. (1991)；PCR Methods and Applications 1: 17; PCR, eds. McPherson, Quirkes, and Taylor, IRL Press, Oxford；および、米国特許番号第４，６８３，２０２号。それらは参照により本明細書中に含まれる。）。
【００６１】
α−ＰＥＣＡＭ抗体の製造および利用
天然のヒトＰＥＣＡＭ−１タンパク質、その断片、またはその類似体を、特定の抗体の製造を目的として動物を免疫するために用いることができる。これらの抗体には、ポリクローナル抗血清が含まれ得るか、またはハイブリドーマ細胞により製造されるモノクローナル抗体が含まれ得る。抗体を製造するための一般法については、Antibodies：A Laboratory Manual, (1988) E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（参照により本明細書に包含される）を参照のこと。
【００６２】
例えば、限定するものではないが、組換え的に作製されたＰＥＣＡＭ−１断片を、免疫応答をもたらすための当業者に公知の免疫プロトコルに従い、アジュバントと共にマウスに注射することができる。典型的に、ポリペプチド長に依存して変化するが、少なくとも約１−５０μｇのＰＥＣＡＭ−１断片または類似体を最初の免疫化に用いる。組換え的に製造されたＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドとは別にまたは併用して、ＰＥＣＡＭ−１配列を有する化学合成ペプチドを、本質的に図１（ａ）に示される配列を有する天然のＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド、天然のヒトＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド、ＰＥＣＡＭ−１エピトープを含むポリペプチド、またはＰＥＣＡＭ−１融合タンパク質などのＰＥＣＡＭ−１タンパク質と結合する抗体を作製するために抗原として用いることができる。少なくとも１×１０７Ｍ−１の親和性で組換え断片と結合する免疫グロブリンを、抗血清として免疫された動物から採取することができ、免疫親和性クロマトグラフィーまたは他の手段によりさらに精製することができる。加えて、脾臓細胞を免疫された動物（典型的にはラットまたはマウス）から採取し、骨髄腫細胞と融合させ、ひとそろいの抗体分泌ハイブリドーマ細胞を作製する。前記ひとそろいのハイブリドーマを、少なくとも１×１０６Ｍ−１の親和性で組換え的に製造されたＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド（または化学的に合成されたＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド）と結合する免疫グロブリンを分泌するクローンについてスクリーニングすることができる。マウスおよびラット以外の動物を、抗体を作製するために用いることができる；例えば、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、およびトリもまた、ＰＥＣＡＭ−１タンパク質と反応する抗体を作製するために用いることができる。実質的にヒト抗体を製造するための能力を有する形質転換マウスもまた、α−ＰＥＣＡＭ−１抗血清の供給源としておよび／またはモノクローナル分泌ハイブリドーマを作製するために免疫し使用することができる。
【００６３】
バクテリオファージ抗体提示ライブラリもまた、全長ＰＥＣＡＭ−１タンパク質、ＰＥＣＡＭ−１断片、またはＰＥＣＡＭ−１エピトープ（一般的に、少なくとも３−５個の隣接アミノ酸）を含むＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド配列を含む融合タンパク質などのＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドと結合するためにスクリーニングすることができる。一般的に、かかるＰＥＣＡＭ−１ペプチドおよび融合タンパク質部分は、ＰＥＣＡＭ−１の少なくとも約３から５個の隣接アミノ酸、しばしばＰＥＣＡＭ−１の少なくとも７個の隣接アミノ酸、通常ＰＥＣＡＭ−１の少なくとも１０個の隣接アミノ酸、そして最も通常には少なくとも１４個の隣接アミノ酸のＰＥＣＡＭ−１配列を含む抗体ライブラリをスクリーニングするためのＰＥＣＡＭ−１配列からなる。
【００６４】
抗体の組合せライブラリは、バクテリオファージプラークとしてかまたは溶原性のコロニーとしてスクリーニングすることができるバクテリオファージλ発現系で作製されている(Huseら、(1989) Science 246: 1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 6450; Mullinaxら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8095; Perssonら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2432)。バクテリオファージ抗体提示ライブラリおよびλファージ発現ライブラリの様々な態様が記載されている（Kangら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 4363; Clacksonら、(1991) Nature 352: 624; McCaffertyら、(1990) Nature 348: 552; Burtonら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 10134; Hoogenboomら、(1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133; Changら、(1991) J. Immunol. 147: 3610; Breitlingら、(1991) Gene 104: 147; Marksら、(1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Barbasら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 4457; HawkinsおよびWinter (1992) J. Immunol. 22: 867; Marksら、(1992) Biotechnology 10: 779; Marksら、(1992) J. Biol. Chem. 267: 16007; Lowmanら、(1991) Biochemistry 30: 10832; Lernerら、(1992) Science 258: 1313, incorporated herein by reference）。典型的には、バクテリオファージ抗体提示ライブラリを、（例えば、親和性クロマトグラフィーにより反応性ファージを豊富にするためにクロマトグラフィー樹脂に共有結合することにより）固定化され、および／または（例えば、プラークまたはコロニーリフトをスクリーニングするために）標識されるＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドでスクリーニングする。
【００６５】
免疫原として有用なＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドは、試料中のα−ＰＥＣＡＭ−１抗体の診断的検出のため、（例えば、標準化競合ＥＬＩＳＡによる）試料中のＰＥＣＡＭ−１タンパク質の診断的検出および定量のため、またはバクテリオファージ抗体提示ライブラリのスクリーニングのために、実質的に純粋な形態、すなわち、典型的に約５０パーセント（ｗ／ｗ）またはそれ以上の純度、実質的に妨害タンパク質および混入物質のない形態で適当に得られる。好ましくは、これらのポリペプチドは、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の純度、より好ましくは少なくとも約９５パーセント（ｗ／ｗ）の純度で、実質的にヒト、マウスの他のタンパク質、または他の混入物質がなく単離または合成される。
【００６６】
免疫交差反応性タンパク質の同定などのこれらの抗体のいくつかの適用に関しては、前記所望の抗血清またはモノクローナル抗体（複数可）は、単一特異性ではない。これらの例では、抗原としてＰＥＣＡＭ−１の合成断片または組換え断片を使用することが、完全な天然タンパク質を用いるよりも好ましいかもしれない。かかる定義されたアミノ末端およびカルボキシ末端を有する組換えまたは合成断片の製造は、ＰＥＣＡＭ−１により供される。
【００６７】
抗血清がβ−ガラクトシダーゼまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼと融合したＰＥＣＡＭ−１免疫原性エピトープを含む融合タンパク質などのＰＥＣＡＭ−１融合ポリペプチドをもたらす場合、前記抗血清は好ましくは、免疫原として働く融合タンパク質の非ＰＥＣＡＭ−１部分と反応する（すなわち、特異的に結合する）抗体の抗血清を枯渇させるために、非ＰＥＣＡＭ−１融合パートナー（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）と共に前吸着される。ヒトおよび／またはマウスのＰＥＣＡＭ−１タンパク質と結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、患者のリンパ球試料から得られた変性タンパク質のウエスタンブロット（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのニトロセルロースブロット）などの、試料中のヒトまたはマウスＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドの存在を検出するために用いることができる。好ましくは定量的検出を、濃度測定スキャン（denistometric scanning）およびウエスタンブロットのシグナル統合（signal integration）などにより行う。モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、変性されたＰＥＣＡＭ−１エピトープと結合し得、当技術分野で公知の方法により標識された第二の抗体または標識された黄色ブドウ球菌タンパク質Ａを用いて視覚的に、または他の光学的方法により同定され得る。
【００６８】
かかる抗体の１つの使用は、新規のＰＥＣＡＭ−１結合因子またはＰＥＣＡＭ−１関連タンパク質の候補である、構造的に関連した免疫交差反応性タンパク質をコードするｃＤＮＡ挿入を含むクローンの同定のために、好ましくは様々な組織からのヒトまたはマウスｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングすることである。ｃＤＮＡ発現ライブラリのかかるスクリーニングは、当技術分野で公知であり、さらにYoung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1194-1198 (1983)（それは参照により本明細書中に含まれる）、ならびに他の刊行物に記載されている。かかる抗体の他の使用は、抗体を作製するために用いられる天然のＰＥＣＡＭ−１タンパク質または対応するＰＥＣＡＭ−１断片（例えば、機能ドメイン；ＰＥＣＡＭ−１相互作用タンパク質結合ドメイン）と構造的または進化的に関連する免疫交差反応性タンパク質を同定および／または精製することである。本発明の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体を、細胞または細胞集団、例えば、患者から得られた細胞移植片（例えば、リンパ球試料）中のＰＥＣＡＭ−１タンパク質のレベルを測定するために用いることができる。抗ＰＥＣＡＭ−１抗体は、限定する物ではないが、以下を含む様々な方法により対応するタンパク質レベルを測定するために用いられ得る：（１）細胞抽出物の標準化ＥＬＩＳＡ、（２）細胞抽出物の免疫沈降、次に、免疫沈降物のポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてＰＥＣＡＭ−１に対応するバンド（複数）の定量、および（３）抗ＰＥＣＡＭ−１抗体での免疫組織化学的染色および標識された二次抗体での検出によるインサイチュウ検出。細胞または細胞集団におけるＰＥＣＡＭ−１と対照ハウスキーピングタンパク質の比の測定は、細胞または細胞集団の侵襲および転移状態についての情報を与える。
【００６９】
本目的のために利用できる抗血清を、常套方法により得ることができる。１つの例示的方法は、ウサギなどの哺乳動物の免疫に関し、それはＰＥＣＡＭ−１に対するポリクローナル抗体の形成を誘導する。モノクローナル抗体はまた、既に免疫されたハムスターからも精製される。この抗体を、ＰＥＣＡＭ−１タンパク質の存在およびレベルを検出するために用いることができる。
【００７０】
標準的分析ならびに放射免疫測定または酵素免疫測定であるマーカーを用いる分析と共に、ＰＥＣＡＭ−１およびその結合物の免疫学的検出のために前記タンパク質を用いることも可能である。
【００７１】
ＰＥＣＡＭ−１の検出および測定は、著しい診断的重要性を有する。例えば、侵襲および転移に好都合なＰＥＣＡＭ−１の減少の検出は、癌治療および肥大の制御において有利であり得る。転移および侵襲に好都合なタンパク質の検出または測定は、癌、神経変性疾患、および虚血性細胞死の検出および診断に有益であり得る。よって、これらのタンパク質およびそれらの抗体を、疾患の経過の観察、検査または検出のためにマーカーとして用いることができる。
【００７２】
ＰＥＣＡＭ−１とＰＥＣＡＭ−１−相互作用ポリペプチドの架橋複合体を免疫原として用いることができ、その結果物である抗血清を、残った抗血清が、複合体に存在するが単量体に存在しない立体構造エピトープ（例えば、複合体特異的エピトープ）と結合する抗体を含むように、ＰＥＣＡＭ−１およびＰＥＣＡＭ−１−相互作用ポリペプチドで前もって吸着させる。複合体特異的ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を同じように作製することができる。かかる抗体を、特定の複合体の存在を診断的に検出および定量し、そしてこのデータを疾患または細胞型などと関連付けるために用いることができる。
【００７３】
ヒト化非ヒト抗体についての方法は、当技術分野にてよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からそれに導入される１個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、“外来”残基と称され、それは典型的に、“外来”可変ドメインから選ばれる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988)］に記載の方法に従い、げっ歯類動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより行うことができる。従って、かかる“ヒト化”抗体は、キメラ抗体（米国特許番号第４，８１６，５６７号）であり、ここで実質的に無傷のヒト可変ドメイン以外は、非ヒト種に由来する対応する配列により置換されている。実際に、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および可能性のあるいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類動物抗体の類似の部位に由来する残基により置換されるヒト抗体である。
【００７４】
ヒト抗体を、ファージ提示ライブラリを含む当技術分野で公知の様々な技術を用いて製造することもできる［Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)]。ColeらおよびBoernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の製造に利用することができる(Cole et al., Monoclonal Antibodied and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)）。同様に、ヒト抗体を、内生の免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されている形質転換動物、例えば、マウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作製することができる。攻撃により、遺伝子再構成、会合、および抗体レパートリーを含むすべての点でヒトに見られるものと非常に似ているヒト抗体製造が観察される。本方法は、例えば、米国特許番号第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、および以下の科学的文献： Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)に記載される。
【００７５】
抗体の治療用製剤を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する抗体と所望により薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を混合することにより貯蔵用に製造する（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. [1980]）。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いる投与量および濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；および、ｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；塩形成カウンターナトリウムなどのイオン；金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ．ＴＭ．、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ．ＴＭ．またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００７６】
本発明の抗ＰＥＣＡＭ結合種を、癌患者に対して、他の化学療法剤および放射線治療増感剤と併用投与することができる。
【００７７】
以下の実施例は、本発明を例示するものであるが、それに限定されるものではない。本明細書中に記載されるすべての％は、他に記載のない限り重量に基づく。すべてのタンパク質分子量は、他に記載のない限り、平均分子量に基づく。
【００７８】
本発明の上記の好ましい態様は、例示および説明を目的として存在している。それらは、包括的であることまたは記載された正確な形態に本発明を限定することを目的とせず、そして多くの改良および変形が上記の教示に照らして可能である。
【００７９】
当業者に明らかであり得るかかる改良および変形は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００８０】
実施例
材料および方法；
６−８週齢の雌マウスを、すべての研究に用いた。Ｃ５７Ｂ１／６およびＢａｌｂＣマウスをSimonson Labs（Gilroy, CA）から購入し、Ｎｕ／ＮｕマウスをCharles Riverから購入した。腫瘍細胞を、尾静脈注射により接種した。Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫腫瘍およびルイス肺癌−高転移性（ＬＬＣ−ＨＭ）肺癌モデルについて、各Ｃ５７Ｂ１／６マウスに２００μｌの培養培地に懸濁した２５，０００の腫瘍細胞を投与した。４Ｔ１マウス乳癌モデルおよびＣＴ２６マウス結腸癌モデルについて、各Ｂａｌｂ／Ｃマウスに２００μ１の培養培地に懸濁した５０，０００の腫瘍細胞を投与した。Ｌｏｘ細胞ヒト黒色腫異種移植モデルについて、Ｎｕ／Ｎｕマウスに、２回の尾静脈注射により培養培地中全量２５０万のＬｏｘ細胞を投与した。初めの注射は朝に行い、次の注射は４時間後に行った。各注射には、３００μｌの培養培地中に１２５万の細胞が含まれる。
【００８１】
第一セットの実験に関して、８匹のマウスの群に、０日目に尾静脈注射により２５，０００のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を供し、その後以下のスケジュールで、ラット抗マウス抗ＰＥＣＡＭ−１（ｍＡｂ３９０）（Dr. H. Delisser, University of Pennsylvaniaにより製造された）またはラットＩｇＧ２（ａ）イソ型対照抗体（Ｓｉｇｍａ）どちらかの２００μｇの５用量を投与した。１つの群のマウスには、ラット抗マウス抗ＰＥＣＡＭ−１（ｍＡｂ３９０）またはラットＩｇＧ２（ａ）イソ型対照抗体どちらかのそれぞれ２００μｇの５用量を０日目（腫瘍細胞注射直後）に投与し始め、その後１、３、６および８日目に投与した。さらに、１つの群のマウスには、ラット抗マウス抗ＰＥＣＡＭ−ｌ（ｍＡｂ３９０）またはラットＩｇＧ２（ａ）イソ型対照抗体どちらかの２００μｇの５用量を腫瘍細胞注射後７日目に投与し、その後、８、１０、１３および１５日目に投与した。ＣＴ２６、４Ｔ１ Ｂ１６およびＬｏｘ細胞を担持するマウスを、腫瘍細胞注入の２０、２２、２３および２８日後にそれぞれ殺した。
【００８２】
それぞれの場合に、各群からのすべてのマウスを、指標動物が重症かまたは死亡したように見えたときに殺し、かなりの数の肺腫瘍が、殺して解剖された肺の分析により報告された。各マウスからの肺を解剖により取り出し、その後計量した。その後、その肺をＢ１６−Ｆ１０黒色腫を担持するマウスに５％緩衝化ホルマリンと一緒に気管内注入した。その後、すべての他の腫瘍担持マウス（４Ｔ１、ＣＴ２６、ＬＬＣ−ＨＭおよびＬｏｘ腫瘍モデル）について、その肺を墨汁を含む固定液と一緒に気管内注入した。その後、すべての肺試料を、５％緩衝化ホルマリン（５０％の１０％緩衝ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ）および５０％ＰＢＳ）中で固定した。肺腫瘍を、観察者にはそれらがどの群に由来するかを伏せて、解剖顕微鏡下で計数した。様々な群間の可能性のある有意な相違を、対応のない、両側スチューデントのｔ検定を用いて評価した。
【００８３】
その後、前記肺を以下の実験に付した。有糸分裂およびアポトーシス数を、慣用の光学顕微鏡を用いて４ミクロンのヘマトキシリンおよびエオシンで染色したスライドで計数した。有糸分裂およびアポトーシス数の実数は、１０個の最も大きな小塊から得られた。アポトーシス体および有糸分裂数は、既述の形態的基準により計数した（１、２）。アポトーシス率および有糸分裂率を、腫瘍細胞性の程度に基づき計算し、そして１０００個の細胞当たりのアポトーシスまたは有糸分裂数の数として現した。切断された、アポトーシスＤＮＡ断片（ＴＵＮＥＬ）のインサイチュウ検出を、製造業者の説明書に従いＴｄＴ−ＦｒａｇＥＬ検出キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて行った。標識された細胞の頻度を、領域内の少なくとも１，０００個の細胞を最大数のＴｄＴ標識された核を数えることにより計算した。マトリゲル分析およびボイデンテャンバー分析を、既報（３）のように行った。アポトーシス、有糸分裂、血管形成および病理組織のすべての分析は、評価される標本の識別を隠された研究員により行われた。評価された様々な腫瘍細胞系のＰＥＣＡＭ−１の発現を、ＦＡＣＳ分析により行った。
【００８４】
参考文献：
1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., & Currie, A. R. (1972) Br. J. Cancer 26, 239-257.
2. van Diest, P. J., Brugal, G., & Baak, J. P. (1998) J. Clin. Pathol. 51, 716-724.
3. Desprez, P. Y., Lin, C.Q., Thomasset, N., Sympson, C.J., Bissell, M.J., & Campisi, J. (1998) Mol. Cell Biol. 18, 4577-4588.
【００８５】
抗転移性腫瘍研究の結果：
様々な腫瘍細胞系に対する抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の結合を試験した。
マウスＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞、マウス４Ｔ１乳癌細胞およびマウスルイス肺癌種−高転移性（ＬＬＣ−ＨＭ）細胞に対する抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の結合を評価した。
【００８６】
ＰＥＣＡＭ−１発現はない（これらの細胞型のいずれかに対する抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の特異的結合は、検出されなかった（データ不掲載））。マウスＣＴ２６結腸癌腫瘍細胞およびヒトＬＯＸ黒色腫細胞におけるＰＥＣＡＭ−１発現の分析は、まだ結果が出ていない。
【００８７】
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫の転移性進行における抗ＰＥＣＡＭ−１の効果。発明者らはまず、５回の、抗ＰＥＣＡＭ−１またはＩｇＧイソ型対照抗体のどちらかの２００μｇの静脈投与を、腫瘍注入の日（０日目）または腫瘍細胞注入後７日（７日目）のどちらかに処理を開始して、可能性のある抗腫瘍効果を比較した。０日目または７日目のどちらかに開始したＩｇＧイソ型対照抗体の注射、ならびに０日目に開始した抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の注射は、非処置の腫瘍担持対照マウスと比較したとき、全肺重量（全体の転移性負荷の指標）または転移性肺腫瘍の全数のどちらかに効果を有しなかった。０日目に開始された抗ＰＥＣＡＭ抗体治療によりもたらされた抗腫瘍効果がないことは、局所的に接種された皮下Ｂ１６黒色腫腫瘍に対する抗ＰＥＣＡＭ抗体のこの投与量およびスケジュールを試験する先の研究結果と対照的である。この先の研究にて、Ｂ１６黒色腫腫瘍の局所的皮下注射としての、５回の、同日（０日目）に開始した同じ抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の２００μｇの腹腔内投与は、かなりの抗腫瘍活性をもたらし、局所的腫瘍増殖を著しく減少させ、ならびに腫瘍血管形成をかなり減少させた（Zhou et al. Angiogenesis 3: 181−188, 1999）。対照的に、発明者らの研究は、０日目に開始したこの同じ抗ＰＥＣＡＭ−ｌ抗体の注射がＢ１６黒色腫肺転移に対して抗腫瘍活性を示さないことを証明した。しかしながら、発明者らは対照マウスと比較したとき、腫瘍細胞注入後７日目に始めた抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の静脈注射が、転移性Ｂ１６黒色腫腫瘍に対して全肺重量（ｐ＜０．００５）および転移性Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫肺腫瘍の全体数（ｐ＜０．０００１）の両方を有意に減少させるといった高い効果を示すことを発見した（図１Ａおよび１Ｂ）。故に、局所腫瘍に対してＩＰ投与された抗ＰＥＣＡＭ抗体を用いて得られた抗腫瘍結果は、転移性腫瘍に対して静脈注射された抗ＰＥＣＡＭ抗体を用いて得られた結果とは実質的に異なり得る。
【００８８】
次に、発明者らは、Ｂ１６−Ｆ１０細胞のＩＶ注射後７日に開始された、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体または前記イソ型対照のどちらかの効果を再び比較して、追跡実験でこれらの結果を繰り返すのを試みた。発明者らは、イソ型対照抗体の同じスケジュールおよび投与で処理したＢ１６−Ｆ１０担持マウスと比較したとき、全肺重量（ｐ＜０．０５）および肺腫瘍の全体数（ｐ＜０．０００１）の両方が有意に減少することを発見した（図２Ａおよび２Ｂ）。（発明者らは、全肺重量および肺腫瘍の全体数がイソ型対照抗体で処理したマウスおよび非処理マウスで相違のないことを上記に示したため、すべての後の実験で対照としてイソ型対照抗体処理マウスを用いた（図１Ａおよび１Ｂを参照のこと））。腫瘍細胞注入後７日目に開始した抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、再び、上記の実験１に見られるような、全体の腫瘍組織量および肺転移腫瘍の全体数を有意に減少させた。この同じ抗ＰＥＣＡＭ抗体の腹腔内投与は、皮下に接種したＢ１６黒色腫腫瘍での腫瘍血管形成の有意な減少について既報されている。本発明者らは、抗ＰＥＣＡＭ−およびイソ型対照抗体注射群からのＢ１６−Ｆ１０肺腫瘍における腫瘍血管形成、ならびに腫瘍アポトーシス率および有糸分裂率を評価した。驚くことに、この相違は統計的な有意性はないが（ｐ＝０．１２）、肺腫瘍の血管数が、イソ型対照処置群（８．７９＋２．９）よりも抗ＰＥＣＡＭ処置群（１７．９＋４．５腫瘍血管／ＨＰＦ（平均＋Ｓ．Ｅ．））で多いことが明らかとなった。抗ＰＥＣＡＭ−対−イソ型対照−処理マウス（９．７＋０．８）での腫瘍アポトーシス（９．９＋１．１）のレベルも同程度であった。しかしながら、腫瘍細胞での有糸分裂の割合は、抗ＰＥＣＡＭ処理マウス（２．９＋０．７）に対してイソ型対照処理マウス（４．７＋０．５）でかなり高かった（ｐ＜０．０５）。病理組織学的には、腫瘍壊死、出血、肺うっ血および／または血管内閉塞が９匹のイソ型抗体処理マウスのうち７匹で見られ、一方これらの発見は、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体処理マウスでは見られなかった（データ不掲載）。概して、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、転移Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍の全数および全体の腫瘍組織量を減少し、ならびに腫瘍細胞有糸分裂率および肺の病理組織学的変化を著しく減少した。抗ＰＥＣＡＭ−ｌ抗体治療は、腫瘍血管形成または腫瘍アポトーシスのどちらも減少させなかった。
【００８９】
抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の抗転移活性が、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍に加えて広く多種多様な固形癌に特異的であることを証明するために、本発明者らは、マウスに注射した様々な他の腫瘍細胞系に対してその可能性のある抗転移作用を試験した。これらの系には、マウス４Ｔ１乳癌細胞、マウスＣＴ２６結腸癌腫瘍細胞、マウスルイス肺癌種−高転移性（ＬＬＣ−ＨＭ）細胞およびヒトＬＯＸ黒色腫細胞が含まれる。本発明者らは、上記の材料および方法の部分に記載のように、これらの系のそれぞれの転移の作製のための確立されたプロトコルを用いた。発明者らは、７日目に開始した５回の、２００μｇのＩＶ投与の抗ＰＥＣＡＭ抗体治療が、腫瘍担持マウスにおけるこれらの腫瘍系のそれぞれに対してかなりの抗転移作用をもたらすことを発見した。
【００９０】
具体的には、抗ＰＥＣＡＭ抗体は、イソ型対照抗体処理マウスと比較したとき、全体の腫瘍組織量（ｐ＜０．００５）および全体の転移性肺腫瘍（ｐ＜０．０００１）の有意な減少をもたらし、４Ｔ１乳癌腫瘍の転移に対して有効性が高い（図３Ａおよび３Ｂを参照のこと）。再び他者らによる既報に反して、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、４Ｔ１腫瘍の転移に対して高い有効性を示すが、それは抗ＰＥＣＡＭ処理マウスが２７．８＋２．５腫瘍血管／ＨＰＦを示し、一方、イソ型対照処理マウスが２６．５＋２．１腫瘍血管／ＨＰＦを示すことから、腫瘍血管増生に効果を有さない（データ不掲載）。故に、皮下腫瘍に対するこの同じ抗ＰＥＣＡＭ抗体の抗腫瘍効果とは異なり（Zhou et al., Angiogenesis 3: 181-188, 1999）、転移性腫瘍に対する抗ＰＥＣＡＭ抗体効果は、腫瘍血管形成への影響を介して仲介されないように思われる（４Ｔ１腫瘍についての腫瘍有糸分裂率およびアポトーシス率における抗ＰＥＣＡＭ抗体の効果の分析は進行中である）。
【００９１】
抗ＰＥＣＡＭ抗体は、イソ型対照抗体処理マウスと比較したとき、ＣＴ２６結腸癌腫瘍の転移に対して活性をほとんど有さないが、転移性肺腫瘍の全数を有意に減少させる（ｐ＜０．０５）（図４Ａおよび４Ｂを参照のこと）。
【００９２】
抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、イソ型対照抗体処理マウス（０．９４±０．１ｇｍ）と比較したとき、ＬＬＣ−ＨＭ腫瘍を担持するマウスにおける肺重量（０．８５±０．２ｇｍ）を有意に減少させない（ｐ＝０．７４）。肺転移が主にこの実験における別々の腫瘍よりむしろ融合塊として増殖したため、正確にマウスにおける個々の肺腫瘍の数を数えるのは不可能であった。しかしながら、肺以外の肺転移の数は抗ＰＥＣＡＭ抗体処理マウスにて著しく減少するように見えた。具体的には、８匹すべてのイソ型対照処理マウスは、胸腔での別個の大きな肺以外の腫瘍を示し、一方、９匹の抗ＰＥＣＡＭ抗体処理マウスのうちたった３匹が肺以外の腫瘍を示した（９匹のイソ型対照抗体処理マウスのうち１匹が、すべての他のマウスが殺される４日前に広範囲の腫瘍組織量で死んだことを特記する）。このマウスは、転移ＬＬＣ−ＨＭ腫瘍の最終的な分析に含まれない。さらに、８匹のイソ型対照処理マウスのうち３匹が肝臓転移を示し、一方、９匹の抗ＰＥＣＡＭ抗体処理マウスのうちたった１匹が肝臓腫瘍を示した。故に、肺転移ＬＬＣ−ＨＭ腫瘍の数を明確に減少させないが、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、ＬＬＣ−ＨＭ腫瘍の肺以外の転移をかなり減少させるように見えた。
【００９３】
最後に、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療が免疫応答性の同種のマウス株の４つの異なるマウス固形癌の転移拡大を減じるため、発明者らは、ヌードマウスのヒトＬＯＸ異種移植腫瘍の転移拡大が変化したか否かを評価した。マウス腫瘍モデルの場合のように、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、イソ型対照抗体で処理したＬＯＸ担持マウスと比較したとき、肺重量（ｐ＜０．０５）および肺腫瘍の全数（ｐ＜０．００５）の両方により測定されるように、ヌードマウスでのＬＯＸ細胞の転移拡大を有意に減少させた（図５Ａおよび５Ｂを参照のこと）。
【００９４】
まとめとして、これらのデータは、全身的な抗ＰＥＣＡＭ抗体治療が、マウス転移モデルにおける多種多様な通常致死的な固形癌（黒色腫、乳癌、結腸癌および肺癌）の転移拡大をかなり減少させ得ることを示す。重要なことには、試験した腫瘍細胞のいずれも検出可能なＰＥＣＡＭ−１を発現せず、このことは抗ＰＥＣＡＭ抗体が腫瘍細胞自体との直接結合によりその抗転移性腫瘍効果をもたらさないことを示す。むしろ、抗ＰＥＣＡＭ抗体は、血管内皮細胞に発現するＰＥＣＡＭ−ｌと結合することにより抗腫瘍薬として機能するように見える。しかしながら、抗ＰＥＣＡＭ抗体は、腫瘍血管形成の効果により抗転移作用を及ぼさないように見える。故に、現在ヒト癌の処置に用いられる抗腫瘍抗体とは異なり、抗ＰＥＣＡＭは、顕著な抗転移効果を生じるために、腫瘍タイプ特性も腫瘍細胞上のその同種の受容体の発現も必要としない。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、抗体処理の効果を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、抗体処理の効果を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
相互参照
本願は、２００３年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／５１９，９８６号に優先権を主張し、それは参照により本明細書に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、患者において新生物細胞の転移能を阻害するための方法および関連組成物の同定に関する。本方法および組成物には、抗体などのＰＥＣＡＭ結合物質、ならびに新生物細胞の浸潤性および転移能を調節するためにＰＥＣＡＭ結合物質を用いて疾患を処置または防止する方法が含まれる。
【０００３】
発明の背景
腫瘍形成は、Foulds(1958)により多段階の生物学的過程として記載され、それは現在、遺伝子損傷の蓄積により生じることが分かっている。分子レベルでの多段階過程の腫瘍形成は、正および負の調節エフェクターの両方の破壊を伴う(Weinberg, 1989)。ヒト結腸癌についての分子機序には、多くの癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子および修復遺伝子が関係することがVogelsteinおよびcoworkers(1990)により主張されている。同様に、網膜芽腫の進行をもたらす欠損には、別の腫瘍抑制遺伝子が関連している(Lee et al., 1987)。さらに他の癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子も、様々な他の悪性腫瘍において同定されている。残念ながら、不適切な数の処置可能な癌が残っており、癌の影響は、米国だけで一年に５０万人以上の死をもたらすほど壊滅的である。
【０００４】
癌は、基本的に細胞ＤＮＡへの損傷が細胞増殖を制御する正常な機構の崩壊をもたらす遺伝子疾患である。腫瘍抑制因子がゲノムの完全性を維持する２つの作用機構は、細胞周期を停止し、それにより損傷ＤＮＡの修復をすること、またはアポトーシスによる損傷ＤＮＡの除去を可能にすることである(Ellisen and Haber, 1998; Evan and Littlewood, 1998)。アポトーシスは、他に“プログラムされた細胞死”とも称され、不可逆的に損傷を受けた細胞の除去を目的とした細胞の自殺プログラムとして働く緻密に制御されたネットワークの生化学的事象である。アポトーシスは、腫瘍壊死因子の結合、ＤＮＡ損傷、増殖因子の停止、およびＦａｓ受容体の抗体架橋を含む多くの方法で引き起こされ得る。アポトーシス過程に役割を果たすいくつかの遺伝子が同定されているが、アポトーシスを誘導する経路は十分に明らかにされていない。多くの研究者が、新規のアポトーシス促進遺伝子の同定を、かかる遺伝子が患者の癌を処置するために新生物細胞のアポトーシス感受性を誘導する手段を提供するだろうという目的を持って、試みている。
【０００５】
癌を処置するための別の方法には、エンドスタチン（商標）または抗ＶＥＧＦ抗体などの薬剤を用いる血管形成の抑制が含まれる。この方法にて、その目標は、原発腫瘍のさらなる血管形成を防止すること、および場合によっては実質的な血管増殖なしに新生物細胞の生存を支持し得る程度に転移病変のサイズを抑制することである。
【０００６】
血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１；ＣＤ３１）は、内皮細胞および好中球で発見されたタンパク質であり、内皮細胞を越える白血球の遊走に関係していることが示されている。血栓症、血管閉塞、卒中などの心血管状態の処置のため、および血液凝固疾患を処置するためまたは発症を減ずるためのＰＥＣＡＭ−１の活性の調節は、ＷＯ０３０５５５１６Ａ１で開示される。ＰＥＣＡＭ−１はまた、炎症過程に関係があるとされ、抗ＰＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体は、インビボでの好中球動員を阻止することが報告されている(Nakada et al. (2000) J. Immunol. 164: 452-462)。正常な白血球遊走、血小板凝集、および血管生長を有することが明らかなＰＥＣＡＭ−１ノックアウトマウスが報告されており、それはＰＥＣＡＭ−１の欠失を補うことができる余分な接着分子があることを示唆する(Duncan et al. (1999) J. Immunol. 162: 3022-3030)。ＰＥＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体は、マウス内皮管形成を防止することが報告されており、それは腫瘍移植モデル(Zhou et al. (1999) Angiogenesis 3: 181−188）およびヒト皮膚移植モデル(Cao et al. (2002) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282: C1181-C1190)での血管形成の関連指標である。しかしながら、腫瘍血管形成におけるＰＥＣＡＭ−１の役割は、あるとしても、未だ明らかにされないままである。
【０００７】
抗血管形成法を用いる癌および腫瘍の転移を阻害する実質的な効果にも関わらず、今日までに、血管形成の阻害のみによって癌を処置するための、承認され、かつ市販されている薬剤はない。実際に、新生物形成および転移の過程におけるＰＥＣＡＭ−１を含む様々な接着分子の特別な役割は知られていない。
【０００８】
患者における癌細胞の転移能を阻害するための方法および関連組成物が、当技術分野で必要とされている。本発明は、この必要を満たし、本分野における当業者により望まれる関連局面を提供する。
【０００９】
本明細書中に言及した引用文献は、本出願の出願日前にそれらが発表されたことについてのためのみ提供する。ここでは、先の発明によってかかる開示内容に先立つ権利がないとの発明者らの容認と解釈されてはならない。本明細書中にて参照されるすべての特許および刊行物は、その開示の全体の内容が本明細書にて機械的または電子的に複製されたかのように、すべての目的のために参照により包含される。
【００１０】
発明の概要
本発明は、ＰＥＣＡＭ−１と結合する抗体の全身的投与が、一般的にヒトにおいて致命的な多種多様な異なる腫瘍型の転移拡散を抑制するという予期せぬ発見に関係し、この効果は、あるとすれば、血管形成の何らかの阻害とは独立して達成される。この予期せぬ発見は、新規の抗癌処置剤および医薬の作製の基礎を提供し、ここで全身的投与量の抗ＰＥＣＡＭ抗体または同様の機能的結果を提供する代用物の供給が、患者における新生物細胞の侵襲性および／または転移能を阻害または低下するために患者に投与される。
【００１１】
本発明は、細胞における悪性形質転換を抑制または防止するための方法であって、形質転換された表現型を阻害し、かつ細胞の検出可能な侵襲性および／または転移能を低下するための有効量で全身的に抗ＰＥＣＡＭ抗体を投与することを含む方法を提供する。１つの態様にて、前記抗ＰＥＣＡＭ抗体は、非新生物性体細胞に位置するＰＥＣＡＭに結合し得るか、または新生物細胞に存在するＰＥＣＡＭあるいは交差反応性の高分子と結合し得る。
【００１２】
抗ＰＥＣＡＭ結合種を、新生物を有すると診断された患者に当業者に公知の何らかの様々な手段により接触するか、または導入することができるが、抗ＰＥＣＡＭ結合剤を全身的に送達することが好ましいことが多い。本発明に関して、抗ＰＥＣＡＭ結合種には、ヒト化またはヒト配列モノクローナル抗体などの抗体、およびＦ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ９ａｂ、Ｆ（ａｂ）、Ｄａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃまたは少なくとも約１×１０８Ｍの親和性でヒトＰＥＣＡＭ−１と結合する特性を有する抗体の最小認識単位を含む抗体断片が含まれ得る。他の結合種にはまた、ＵＳ２００３０１５７５６１Ａ１に記載のタンパク質性の結合多量体、高親和性のペプチドおよび等価体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様にて、前記抗ＰＥＣＡＭ結合種は、３０Ｋの直鎖ＰＥＧなどのポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）、または、４０Ｋ、６０Ｋもしくはより大きな分岐鎖ＰＥＧ部分、またはより大きな直鎖または分岐鎖ＰＥＧ部分と、単結合または多重結合のいずれかにより共有結合する。
【００１３】
本発明のいくつかの態様にて、全身的に投与された抗ＰＥＣＡＭ結合種が転移を阻害し得るという本発明者らの発見は、他の抗形質転換／抗癌治療と併用して用いられるだろう。これらの他の治療は、本出願時に公知であり得るか、または本出願の日後に明らかとなり得る。例えば、ヒト化またはヒト配列抗ＰＥＣＡＭ抗体を、他の治療ポリペプチド、他の治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または化学療法剤と併用することができる。１つの代表的な態様では、前記化学療法剤はタキソールである。前記抗ＰＥＣＡＭ結合種はまた、放射線治療と併用することもできる。放射線治療を構成する電離放射線の型は、Ｘ線、γ線、およびマイクロ波を含む群から選択され得る。任意の態様にて、電離放射線は、外部ビーム照射によるか、または放射性核種の投与によりもたらされ得る。前記抗ＰＥＣＡＭ結合種はまた、遺伝子治療レジメンと共に用いられ得る。
【００１４】
本発明はまた、多くのヒト癌のための処置方法を提供する。その処置方法には、新生物、典型的には癌腫または肉腫または他の固形癌種を有すると診断された患者を、好ましくは皮下または静脈内投与によるか、または脳転移を阻害するために脳内への鞘内投与により送達される全身的投与量の抗ＰＥＣＡＭ結合種で処置することが含まれる。好ましい変法には、皮下または静脈などの全身的経路によりヒト化またはヒト配列抗ＰＥＣＡＭモノクローナル抗体などの抗ＰＥＣＡＭ結合種の有効投与量を投与することにより、乳癌、肺癌、または結腸癌を有すると診断された患者を処置することが含まれる。
【００１５】
本発明の任意の他の局面にて、適する容器中に抗ＰＥＣＡＭ結合種の製剤を含む治療キットが提供される。かかるキットは、治療ポリペプチド、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または化学療法剤の製剤をさらに含み得る。かかるキットは、増感剤、新生物−特に肺癌、結腸癌、あるいは乳癌、または様々な黒色腫−を有すると診断されたヒト患者への全身的送達による抗ＰＥＣＡＭ結合種の投与のための説明書を含み得る。好ましい変法にて、前記キットは、ＰＥＧ化されるヒト化またはヒト配列抗ＰＥＣＡＭモノクローナル抗体を含む。
【００１６】
本発明はまた、少なくとも約１×１０７Ｍ−１の親和性でヒトＰＥＣＡＭ−１と結合し、かつ他のＰＥＣＡＭ関連ポリペプチドに対する特異的高親和性結合を欠く抗体を提供する。かかる抗体は、全身的、頭蓋内、または（例えば、カチオン化によるか、またはリポソームもしくは免疫リポソーム送達による）新生物細胞への標的化送達により、治療的に用いられ得る。
【００１７】
本発明はまた、ＰＥＣＡＭ−１機能を調整することにより、新生物形成、侵襲性および／または転移を阻害し、かつ血管形成を阻害しない治療薬を提供する；かかる薬剤は、医薬として用いることができる。
【００１８】
本発明は、固形腫瘍を有すると診断された患者であって、その血管形成阻害が弊害をもたらすかもしれない患者、例えば、心筋梗塞、鬱血性心不全、卒中、冠状動脈または大脳血管系のアテローム性動脈硬化症に最近罹患した患者、または損傷もしくは大手術の結果として生じ、かつ循環系の治癒または回復を補助するために血管形成の恩恵を受ける重大な創傷治癒過程にある者などを処置するための方法を提供する。
【００１９】
本発明の変法にて、免疫原性の用量の変性ヒトＰＥＣＡＭ−１、または霊長類、マウス、ラット、イヌあるいはブタのＰＥＣＡＭ−１タンパク質もしくはその一部分などの非ヒトＰＣＡＭ−１を、新生物を有すると診断されたヒト患者に対して、典型的にはアジュバントおよび／またはDynavax社またはColey Pharmaceuticals社により開示されたような共有結合あるいは非結合の免疫刺激性ポリヌクレオチドと併用して投与する。本方法にて、前記ヒト患者は、抗体応答を含む免疫応答を起こすことができ、それはこうしなければ寛容である患者自身のＰＥＣＡＭ−１タンパク質と交差反応し得る。
【００２０】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、本明細書の残りの部分および図面を参照することにより明らかとなるであろう。
【００２１】
本発明の他の目的、特徴、および利点は下記の詳しい説明で明らかになるだろう。しかしながら、詳しい説明および具体的な実施例は、本発明の精神および範囲内の様々な変化および修飾がこの詳しい説明から当業者に明らかになり得るため、本発明の好ましい態様を示すが、説明のためだけに供されると理解されるべきである。
【００２２】
図面の説明
図１Ａおよび１Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
図２Ａおよび２Ｂは、抗体処理の効果を示す。
図３Ａおよび３Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
図４Ａおよび４Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
図５Ａおよび５Ｂは、抗体処理の効果を示す。
【００２３】
好ましい態様の説明
他に定義されない限り、本明細書中に用いられるすべての技術的および化学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の何らかの方法および材料と同じかまたは等価なものを、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的に関して、下記の用語を以下に定義する。
【００２４】
下記の特許文献は参照により本明細書中に含まれる：米国特許第５，９６８，５１１号；ＷＯ０１５５１７８；米国特許第６，６３９，０５５号；米国特許第６，１３３，４２６号；ＷＯ０３０５５５１６；ＷＯ０２０８５４０５；および、米国特許第６，６２７，１９６号−それらの中に記載の方法および材料を包含する。
【００２５】
定義
物について用いられるような、本明細書で用いる用語“天然に存在する”とは、その物を天然において発見することができるという事実を示す。例えば、天然源から単離され得、それらが研究室で人間により意図的に改変されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。一般的に、天然に存在するという用語は、種に典型的であり得るように、非病理学的（病気でない）個体に存在するものを示す。
【００２６】
下記の用語は、２個またはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を記載するのに用いられる：“参照配列”、“比較ウインドウ（comparison window）”、“配列同一性”、“配列同一性の割合”、および“実質的同一性”。“参照配列”とは、配列比較の基準として用いられる定義された配列である；参照配列は、例えば、図２のポリヌクレオチド配列などの配列表に与えられる全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列の断片のような、より大きな配列の下位集団であり得るか、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含み得る。一般的に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長、しばしば少なくとも２５ヌクレオチド長、およびしばしば少なくとも５０ヌクレオチド長である。２個のポリヌクレオチドは、それぞれ（１）２個のポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部）を含み得、そして（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含み得るため、２個（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は一般的に、配列類似性の領域を同定および比較するために“比較ウインドウ”上で２個のポリヌクレオチドの配列を比較することにより行われる。
【００２７】
本明細書で用いる“比較ウインドウ”は、少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの位置の概念的断片を示し、ここでポリヌクレオチド配列は、少なくとも２０個の隣接ヌクレオチドの参照配列と比較され得、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２個の配列の最適なアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まないもの）と比較して２０パーセントまたはそれ以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウをアライニングするための配列の最適なアライメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム(1981) Adv. Appl. Math. 2: 482、NeedlemanおよびWunschの相同性アライメントアルゴリズム(1970) J. Mol. Biol. 48: 443、PearsonおよびLipmanの類似法の探求(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行により（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または検査により行われ得、そして様々な方法により得られた最も良いアライメント（すなわち、比較ウインドウ上での最高の相同性割合をもたらす）を選択する。
【００２８】
用語“配列同一性”は、２個のポリヌクレオチド配列が比較ウインドウ上で（すなわち、ヌクレオチド−ヌクレオチド塩基ごとに）同一であることを意味する。用語“配列同一性の割合”を、比較ウインドウ上で２個の最適に整列された配列を比較し、一致した位置の数を得るため同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が両配列に生じる位置の数を決定し、比較ウインドウ（すなわち、ウインドウサイズ）中で一致する位置の数を位置の全数で割り、そして結果を１００倍し、配列同一性の割合を得ることにより計算する。本明細書で用いる用語“実質的同一性”は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウインドウ上（しばしば少なくとも２５−５０ヌクレオチドのウインドウ上）で参照配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５パーセントの同一性およびしばしば９０から９５パーセントの配列同一性、より通常には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、ここで、配列同一性の割合は、参照配列と、比較ウインドウ上で全体で２０パーセントまたはそれ以下の参照配列の欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列を比較することにより計算する。前記参照配列は、より大きな配列の下位集団であり得る。
【００２９】
ポリペプチドについて用いられるような、用語“実質的同一性”は、２個のペプチド配列が規定値のギャップ重量を用いてＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによるなどして最適に整列されるとき、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントまたはそれ以上の配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００３０】
保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を示す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族性側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；そして、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００３１】
本明細書で用いる用語“断片”は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、全長ｃＤＮＡから推定された配列における対応する位置と同一であるポリペプチドを示す。断片は一般的に、少なくとも１４のアミノ酸長、好ましくは少なくとも２０のアミノ酸長、通常少なくとも５０のアミノ酸長またはそれ以上、天然に存在するポリペプチドの全長までの長さである。
【００３２】
本明細書で用いる用語“薬剤”は、化合物、化合物の混合物、空間的に限局された化合物のアレイ（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ、ポリヌクレオチドアレイ、および／または組合せ小分子アレイ）、生体高分子、バクテリオファージペプチド提示ライブラリ、バクテリオファージ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）提示ライブラリ、ポリソームペプチド提示ライブラリ、または細菌、植物、真菌もしくは動物（特に、哺乳動物）の細胞または組織などの生物学的材料から作製された抽出物を示す。薬剤を、以下に記載のスクリーニング分析に付すことにより抗新生物薬、抗炎症薬、またはアポトーシス調節薬としての潜在的活性について評価する。薬剤を、以下に記載のスクリーニング分析に付すことにより特定のタンパク質相互作用阻害剤（すなわち、２個の所定のポリペプチド間の結合相互作用を選択的に阻害するが、細胞生存能を実質的に妨げない薬剤）としての潜在的活性について評価する。
【００３３】
本明細書で用いる用語“タンパク質相互作用阻害剤”は、第一の相互作用ポリペプチドおよび第二の相互作用ポリペプチド間のタンパク質−タンパク質結合を選択的に阻害する薬剤として、本発明の１個またはそれ以上のスクリーニング方法により同定される薬剤を示す。いくつかのタンパク質相互作用阻害剤は、ヒトが使用するための薬剤として治療可能性を有し得、および／または研究室での研究またはバイオプロセス制御のための市販薬として供給され得る。故に、候補薬剤であるタンパク質相互作用阻害剤はさらに、非ヒト動物へのインビボ投与、およびしばしば承認された臨床試験でのヒトへの投与を含む、ヒトおよび動物用薬剤としての使用への適性を予測するために常套的に用いられる分析にて活性について試験される。
【００３４】
本明細書で用いる用語“抗新生物薬”は、ヒトにおける新生物、特に転移性の固形腫瘍型の発症または進行を阻害する機能的特性を有する薬剤である。
【００３５】
本明細書で用いる用語“標識”または“標識した”とは、例えば、放射標識したアミノ酸の挿入、または標識アビジン（例えば、光学的方法または熱量測定法により検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合によるなどの、検出可能マーカーの挿入を示す。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、用いられ得る。ポリペプチドの標識の例には、以下：放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、蛍光ランタニド）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、転写活性ポリペプチド、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様にて、標識は、可能性のある立体障害を減ずるために様々な長さのスペースアームにより結合される。
【００３６】
本明細書で用いる“実質的に純粋”は、目的種が優先的に存在する種であることを意味し（すなわち、モルを基準として、それは組成物中のいずれかの他の個々の高分子種よりも多く存在する）、そして好ましくは実質的に純粋な画分は、前記目的種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルを基準に）を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０から９０％以上を構成するだろう。最も好ましくは、前記目的種は、前記組成物が本質的に単一の高分子種からなる、本質的に均一となる（混入種が、常套的な検出方法により組成物中に検出されない）まで精製される。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種とは見なされない。
【００３７】
本明細書で用いる“正常な血液”または“正常なヒト血液”は、活動性新生物疾患あるいはリンパ球増殖の他の障害、または新生物疾患の発症に関する確認された素因を有さない健常なヒト個体に由来する血液を示す。同様に、“正常細胞”、“正常細胞試料”、“正常組織”および“正常リンパ節”は、活動性新生物疾患または他のリンパ球増殖性疾患を有さない健康なヒト個体から得られたそれぞれの試料を示す。
【００３８】
本明細書で用いる用語“生理的条件”は、生存生物に適合し、および／または生存培養酵母細胞または哺乳動物細胞の細胞内に一般的に存在する温度、ｐＨ、イオン強度、粘度などの生化学的パラメータを示す。例えば、典型的な実験培養条件下で増殖する酵母細胞の細胞内条件は、生理的条件である。インビトロ転写カクテルに適するインビトロ反応条件は一般に、生理的条件である。一般的に、インビトロ生理的条件には、５０−２００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ６．５−８．５、２０−４５℃および０．００１−１０ｍＭの二価陽イオン（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋）が含まれる；好ましくは、約１５０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ７．２−７．６、５ｍＭの二価陽イオン、およびしばしば０．０１−１．０％非特異的タンパク質（例えば、ＢＳＡ）が含まれる。非イオン性界面活性剤（トウィーン、ＮＰ−４０、トライトンＸ−１００）はしばしば、通常約０．００１から２％、典型的に０．０５−０．２％（ｖ／ｖ）存在し得る。特定の水性条件は、常套法に従い当業者が選択することができる。一般的な手引きに関して、以下の緩衝水性条件を適用することができる：１０−２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５−５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ５−８、所望により二価陽イオン（複数）および／または金属キレート剤および／または非イオン性界面活性剤および／または膜画分および／または消泡剤および／またはシンチラントを加えて良い。
【００３９】
本明細書で用いる用語“相互作用ポリペプチド断片”および“相互作用ポリペプチド配列”は、適する結合条件下にて第二のハイブリッドタンパク質の一部と特異的な結合相互作用を形成し得るハイブリッドタンパク質の一部を示す。一般的に、第一のハイブリッドタンパク質の一部は、第二のハイブリッドタンパク質の一部と選択的に結合し、第一および第二のハイブリッドタンパク質を含むヘテロ二量体またはより高次のヘテロ多量体を形成する；各ハイブリッドタンパク質の結合部分は、相互作用ポリペプチド断片と称される。一般的に、相互作用ポリペプチドは、適する生理的条件下で、少なくとも約１×１０３Ｍ−１、通常少なくとも１×１０４Ｍ−１、一般的には少なくとも１×１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１×１０６Ｍ−１から１×１０７Ｍ−１またはそれ以上の解離定数（ＫＤ）を有するヘテロ二量体を形成し得る。
【００４０】
本明細書で用いる用語“多量体”は、二量体およびより高次の複合体（三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体など）を含む。“ホモ多量体”は、同じサブユニット種を含む複合体を示す。“ヘテロ多量体”は、２以上のサブユニット種を含む複合体を示す。
【００４１】
本明細書で用いる用語“組換え”は、タンパク質をコードする遺伝子が、既知の組換えＤＮＡ技術によりクローニングされる、組換えＤＮＡ技術により作製されたＰＥＣＡＭ−１を示す。例えば、ＰＥＣＡＭ−１についてのヒト遺伝子は、細菌プラスミドおよび適する宿主を形質転換するために用いられるプラスミドなどの適するＤＮＡベクターに挿入され得る。故に、前記遺伝子は、組換えタンパク質を製造するために宿主にて発現される。形質転換された宿主は、哺乳動物、酵母、アスペルギルス（Aspergillus）および昆虫細胞を含む、原核または真核であり得る。
【００４２】
“抗体”（Ａｂ）および“免疫グロブリン”（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体および他の抗体様分子の両方を含み抗原特異性を欠く。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系で低レベル、かつ骨髄腫で高レベルで産される。用語“抗体”は、広義の意味で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２個の無傷の抗体から形成される多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および、それらが所望の生物学的活性を示す限りは抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
“天然の抗体”および“天然の免疫グロブリン”は通常、２個の同じ軽鎖（Ｌ）および２個の同じ重鎖（Ｈ）を含む、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンのイソ型の重鎖によって変わる。重鎖および軽鎖のそれぞれはまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の端の可変ドメイン（ＶＨ）の後に多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他方の末端に定常ドメインを有する；前記軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列され、前記軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の接点を形成すると考えられている。
【００４４】
用語“可変”とは、可変ドメインの任意の部分が抗体間の配列で広範に異なり、その特定の抗原について各特定の抗体の結合および特異性に用いられるという事実を示す。しかしながら、その可変性は、抗体の可変ドメイン中に均一に分散されない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域とも称される３つの断片に関する。可変ドメインのより高度な保存部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と称される。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つのＣＤＲでつながっている大きなβシート構造をとる４個のＦＲ領域を含み、それはループ結合を形成し、そしていくつかの場合にはβシート構造の一部を形成する。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域により他の鎖からのＣＤＲと互いに接近してつながり、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００４５】
本明細書で用いる用語“超可変領域”は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を示す。超可変領域は、“相補性決定領域”または“ＣＤＲ”に由来するアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）；Kabat et al.,Sequence of proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. [1991]）、および／または“超可変ループ”に由来するそれらの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；Clothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 [1987]）を含む。“フレームワーク”または“ＦＲ”残基は、本明細書に定義のような超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。
【００４６】
“抗体断片”は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体（diabody）；直鎖抗体（Zapata et al., protein Eng., 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；および、抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４７】
抗体のパパイン消化は、２個の同一の抗原結合断片、いわゆる“Ｆａｂ”断片（それぞれ、単一の抗原結合部位を有する）および残りの“Ｆｃ”断片（その名称は、すぐに結晶化するその能力を示す）を産する。パパイン処理は、２個の抗原結合部位を有し、抗原を架橋する能力を依然有するＦ（ａｂ’）２断片を産する。
【００４８】
“Ｆｖ”は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、強い、非共有結合での１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。それは、この構造中、それぞれの可変ドメインの３個のＣＤＲがＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するために相互作用する。合わせて、６個のＣＤＲが、抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、全体の結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００４９】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体のヒンジ領域由来の１個またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少しの残基を付加することにより、Ｆａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を生じるＦａｂ’を意味する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は本来、それらの間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’断片として製造された。抗体断片の他の化学結合もまた公知である。
【００５０】
脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の“軽鎖”は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２個の明確に異なる型のうちの１つ、いわゆるκ（．ｋａｐｐａ．）およびλ（．ｌａｍｂｄａ．）を表し得る。
【００５１】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスを示し得る。免疫グロブリンには５個の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちいくつかは、さらにサブクラス（イソ型）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構造は公知である。
【００５２】
本明細書に用いるような用語“モノクローナル抗体”は、実質的に相同性の抗体集団から得られる抗体、すなわち前記集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性を除いて同一であるものを示す。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対する高い特異性を有する。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体製造とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、有利なことに、他の免疫グロブリンが混入していない、ハイブリドーマ培養により合成される。その修飾“モノクローナル”は、実質的に相同性の抗体の集団から得られるような抗体の特性を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を要すると解釈されてはならない。例えば、本発明に用いられるモノクローナル抗体は、最初にKohler et al., Nature 256:495 [1975]に記載されたハイブリドーマ法により製造され得るか、または組換えＤＮＡ法により製造され得る（例えば、米国特許番号第４，８１６，５６７号を参照のこと）。前記“モノクローナル抗体”はまた、例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 [1991] and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離され得る。
【００５３】
本明細書中のモノクローナル抗体は特に、重鎖および／または軽鎖の一部は、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同じかまたは相同性であるが、残りの鎖（複数可）は、それらが所望の生物学的活性を示す限りは、他の種に由来する抗体または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにかかる抗体の断片における対応する配列と同じかまたは相同性である“キメラ”抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許番号第４，８１６，５６７号； Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]）。
【００５４】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の“ヒト化”形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原結合配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容者のＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性および可能性を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（供与体抗体）のＣＤＲ由来の残基により置換されるヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。いくつかの例にて、ヒト免疫グロブリンのＦｖ ＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体にも、外来ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾体は、さらなる改良により作製され、抗体性能を最大化する。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み得、ここで非ヒト免疫グロブリンのそれに対応するＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべておよびＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のそれである。前記ヒト化抗体はまた、最適には、少なくとも免疫グロブリン定常部位（Ｆｅ）の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのそれを含み得る。さらに詳細には、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 [1988];および、Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域がマカクザルを所望の抗原で免疫化することにより産される抗体から誘導される、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ．ＴＭ．抗体が含まれる。
【００５５】
“単鎖Ｆｖ”または“ｓＦｖ”抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは、一本のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、前記Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とするＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖのレビューに関しては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994）を参照のこと。
【００５６】
用語“二重特異性抗体”は、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体断片を示し、その断片は、同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２個のドメイン間の対形成を可能とするには短すぎるリンカーを用いることにより、そのドメインは別の鎖の相補的なドメインとの対形成を強いられ、２個の抗原結合部位が形成される。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に、より十分に記載される。
【００５７】
“単離された”抗体は、その自然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その自然環境の混入成分は、抗体の診断または治療的使用を妨げ得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい態様にて、前記抗体を、（１）Ｌｏｗｒｙ法により測定されるように、抗体の９５重量％以上、最も好ましくは９９重量％以上まで、（２）spinning cup配列決定装置の使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質性となるまで精製することができる。抗体の自然環境の少なくとも１つの要素が存在しないため、単離された抗体は、組換え細胞内の原位置のものも含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程により製造されるだろう。
【００５８】
発明の詳しい説明
以下に用いる学名および下記の細胞培養、分子遺伝学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの実験法は、当技術分野で公知かつ通常用いられる方法を含み得る。標準技術を、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成法、ならびに微生物培養および形質転換法（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に用いる。前記技術および方法を通常、当技術分野における常套法および本明細書の全体を通して供される様々な一般的参考文献（一般的には、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと。それらは参照により本明細書に含まれる）に従い行う。
【００５９】
オリゴヌクレオチドを、製造業者により提供される説明書に従い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍｓのオリゴヌクレオチド合成器で合成することができる。
【００６０】
ＰＣＲ増幅のための方法は、当技術分野にて記載される（PCT Technology：Principles and Applications for DNA Amplification ed. HA Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications, eds. Innis, Gelfland, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA (1990)；Mattila et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, K.A. and Kunkel, T.A. (1991)；PCR Methods and Applications 1: 17; PCR, eds. McPherson, Quirkes, and Taylor, IRL Press, Oxford；および、米国特許番号第４，６８３，２０２号。それらは参照により本明細書中に含まれる。）。
【００６１】
α−ＰＥＣＡＭ抗体の製造および利用
天然のヒトＰＥＣＡＭ−１タンパク質、その断片、またはその類似体を、特定の抗体の製造を目的として動物を免疫するために用いることができる。これらの抗体には、ポリクローナル抗血清が含まれ得るか、またはハイブリドーマ細胞により製造されるモノクローナル抗体が含まれ得る。抗体を製造するための一般法については、Antibodies：A Laboratory Manual, (1988) E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（参照により本明細書に包含される）を参照のこと。
【００６２】
例えば、限定するものではないが、組換え的に作製されたＰＥＣＡＭ−１断片を、免疫応答をもたらすための当業者に公知の免疫プロトコルに従い、アジュバントと共にマウスに注射することができる。典型的に、ポリペプチド長に依存して変化するが、少なくとも約１−５０μｇのＰＥＣＡＭ−１断片または類似体を最初の免疫化に用いる。組換え的に製造されたＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドとは別にまたは併用して、ＰＥＣＡＭ−１配列を有する化学合成ペプチドを、本質的に図１（ａ）に示される配列を有する天然のＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド、天然のヒトＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド、ＰＥＣＡＭ−１エピトープを含むポリペプチド、またはＰＥＣＡＭ−１融合タンパク質などのＰＥＣＡＭ−１タンパク質と結合する抗体を作製するために抗原として用いることができる。少なくとも１×１０７Ｍ−１の親和性で組換え断片と結合する免疫グロブリンを、抗血清として免疫された動物から採取することができ、免疫親和性クロマトグラフィーまたは他の手段によりさらに精製することができる。加えて、脾臓細胞を免疫された動物（典型的にはラットまたはマウス）から採取し、骨髄腫細胞と融合させ、ひとそろいの抗体分泌ハイブリドーマ細胞を作製する。前記ひとそろいのハイブリドーマを、少なくとも１×１０６Ｍ−１の親和性で組換え的に製造されたＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド（または化学的に合成されたＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド）と結合する免疫グロブリンを分泌するクローンについてスクリーニングすることができる。マウスおよびラット以外の動物を、抗体を作製するために用いることができる；例えば、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、およびトリもまた、ＰＥＣＡＭ−１タンパク質と反応する抗体を作製するために用いることができる。実質的にヒト抗体を製造するための能力を有する形質転換マウスもまた、α−ＰＥＣＡＭ−１抗血清の供給源としておよび／またはモノクローナル分泌ハイブリドーマを作製するために免疫し使用することができる。
【００６３】
バクテリオファージ抗体提示ライブラリもまた、全長ＰＥＣＡＭ−１タンパク質、ＰＥＣＡＭ−１断片、またはＰＥＣＡＭ−１エピトープ（一般的に、少なくとも３−５個の隣接アミノ酸）を含むＰＥＣＡＭ−１ポリペプチド配列を含む融合タンパク質などのＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドと結合するためにスクリーニングすることができる。一般的に、かかるＰＥＣＡＭ−１ペプチドおよび融合タンパク質部分は、ＰＥＣＡＭ−１の少なくとも約３から５個の隣接アミノ酸、しばしばＰＥＣＡＭ−１の少なくとも７個の隣接アミノ酸、通常ＰＥＣＡＭ−１の少なくとも１０個の隣接アミノ酸、そして最も通常には少なくとも１４個の隣接アミノ酸のＰＥＣＡＭ−１配列を含む抗体ライブラリをスクリーニングするためのＰＥＣＡＭ−１配列からなる。
【００６４】
抗体の組合せライブラリは、バクテリオファージプラークとしてかまたは溶原性のコロニーとしてスクリーニングすることができるバクテリオファージλ発現系で作製されている(Huseら、(1989) Science 246: 1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 6450; Mullinaxら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8095; Perssonら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2432)。バクテリオファージ抗体提示ライブラリおよびλファージ発現ライブラリの様々な態様が記載されている（Kangら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 4363; Clacksonら、(1991) Nature 352: 624; McCaffertyら、(1990) Nature 348: 552; Burtonら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 10134; Hoogenboomら、(1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133; Changら、(1991) J. Immunol. 147: 3610; Breitlingら、(1991) Gene 104: 147; Marksら、(1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Barbasら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 4457; HawkinsおよびWinter (1992) J. Immunol. 22: 867; Marksら、(1992) Biotechnology 10: 779; Marksら、(1992) J. Biol. Chem. 267: 16007; Lowmanら、(1991) Biochemistry 30: 10832; Lernerら、(1992) Science 258: 1313, incorporated herein by reference）。典型的には、バクテリオファージ抗体提示ライブラリを、（例えば、親和性クロマトグラフィーにより反応性ファージを豊富にするためにクロマトグラフィー樹脂に共有結合することにより）固定化され、および／または（例えば、プラークまたはコロニーリフトをスクリーニングするために）標識されるＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドでスクリーニングする。
【００６５】
免疫原として有用なＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドは、試料中のα−ＰＥＣＡＭ−１抗体の診断的検出のため、（例えば、標準化競合ＥＬＩＳＡによる）試料中のＰＥＣＡＭ−１タンパク質の診断的検出および定量のため、またはバクテリオファージ抗体提示ライブラリのスクリーニングのために、実質的に純粋な形態、すなわち、典型的に約５０パーセント（ｗ／ｗ）またはそれ以上の純度、実質的に妨害タンパク質および混入物質のない形態で適当に得られる。好ましくは、これらのポリペプチドは、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の純度、より好ましくは少なくとも約９５パーセント（ｗ／ｗ）の純度で、実質的にヒト、マウスの他のタンパク質、または他の混入物質がなく単離または合成される。
【００６６】
免疫交差反応性タンパク質の同定などのこれらの抗体のいくつかの適用に関しては、前記所望の抗血清またはモノクローナル抗体（複数可）は、単一特異性ではない。これらの例では、抗原としてＰＥＣＡＭ−１の合成断片または組換え断片を使用することが、完全な天然タンパク質を用いるよりも好ましいかもしれない。かかる定義されたアミノ末端およびカルボキシ末端を有する組換えまたは合成断片の製造は、ＰＥＣＡＭ−１により供される。
【００６７】
抗血清がβ−ガラクトシダーゼまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼと融合したＰＥＣＡＭ−１免疫原性エピトープを含む融合タンパク質などのＰＥＣＡＭ−１融合ポリペプチドをもたらす場合、前記抗血清は好ましくは、免疫原として働く融合タンパク質の非ＰＥＣＡＭ−１部分と反応する（すなわち、特異的に結合する）抗体の抗血清を枯渇させるために、非ＰＥＣＡＭ−１融合パートナー（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）と共に前吸着される。ヒトおよび／またはマウスのＰＥＣＡＭ−１タンパク質と結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、患者のリンパ球試料から得られた変性タンパク質のウエスタンブロット（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのニトロセルロースブロット）などの、試料中のヒトまたはマウスＰＥＣＡＭ−１ポリペプチドの存在を検出するために用いることができる。好ましくは定量的検出を、濃度測定スキャン（denistometric scanning）およびウエスタンブロットのシグナル統合（signal integration）などにより行う。モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、変性されたＰＥＣＡＭ−１エピトープと結合し得、当技術分野で公知の方法により標識された第二の抗体または標識された黄色ブドウ球菌タンパク質Ａを用いて視覚的に、または他の光学的方法により同定され得る。
【００６８】
かかる抗体の１つの使用は、新規のＰＥＣＡＭ−１結合因子またはＰＥＣＡＭ−１関連タンパク質の候補である、構造的に関連した免疫交差反応性タンパク質をコードするｃＤＮＡ挿入を含むクローンの同定のために、好ましくは様々な組織からのヒトまたはマウスｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングすることである。ｃＤＮＡ発現ライブラリのかかるスクリーニングは、当技術分野で公知であり、さらにYoung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1194-1198 (1983)（それは参照により本明細書中に含まれる）、ならびに他の刊行物に記載されている。かかる抗体の他の使用は、抗体を作製するために用いられる天然のＰＥＣＡＭ−１タンパク質または対応するＰＥＣＡＭ−１断片（例えば、機能ドメイン；ＰＥＣＡＭ−１相互作用タンパク質結合ドメイン）と構造的または進化的に関連する免疫交差反応性タンパク質を同定および／または精製することである。本発明の抗ＰＥＣＡＭ−１抗体を、細胞または細胞集団、例えば、患者から得られた細胞移植片（例えば、リンパ球試料）中のＰＥＣＡＭ−１タンパク質のレベルを測定するために用いることができる。抗ＰＥＣＡＭ−１抗体は、限定する物ではないが、以下を含む様々な方法により対応するタンパク質レベルを測定するために用いられ得る：（１）細胞抽出物の標準化ＥＬＩＳＡ、（２）細胞抽出物の免疫沈降、次に、免疫沈降物のポリアクリルアミドゲル電気泳動、そしてＰＥＣＡＭ−１に対応するバンド（複数）の定量、および（３）抗ＰＥＣＡＭ−１抗体での免疫組織化学的染色および標識された二次抗体での検出によるインサイチュウ検出。細胞または細胞集団におけるＰＥＣＡＭ−１と対照ハウスキーピングタンパク質の比の測定は、細胞または細胞集団の侵襲および転移状態についての情報を与える。
【００６９】
本目的のために利用できる抗血清を、常套方法により得ることができる。１つの例示的方法は、ウサギなどの哺乳動物の免疫に関し、それはＰＥＣＡＭ−１に対するポリクローナル抗体の形成を誘導する。モノクローナル抗体はまた、既に免疫されたハムスターからも精製される。この抗体を、ＰＥＣＡＭ−１タンパク質の存在およびレベルを検出するために用いることができる。
【００７０】
標準的分析ならびに放射免疫測定または酵素免疫測定であるマーカーを用いる分析と共に、ＰＥＣＡＭ−１およびその結合物の免疫学的検出のために前記タンパク質を用いることも可能である。
【００７１】
ＰＥＣＡＭ−１の検出および測定は、著しい診断的重要性を有する。例えば、侵襲および転移に好都合なＰＥＣＡＭ−１の減少の検出は、癌治療および肥大の制御において有利であり得る。転移および侵襲に好都合なタンパク質の検出または測定は、癌、神経変性疾患、および虚血性細胞死の検出および診断に有益であり得る。よって、これらのタンパク質およびそれらの抗体を、疾患の経過の観察、検査または検出のためにマーカーとして用いることができる。
【００７２】
ＰＥＣＡＭ−１とＰＥＣＡＭ−１−相互作用ポリペプチドの架橋複合体を免疫原として用いることができ、その結果物である抗血清を、残った抗血清が、複合体に存在するが単量体に存在しない立体構造エピトープ（例えば、複合体特異的エピトープ）と結合する抗体を含むように、ＰＥＣＡＭ−１およびＰＥＣＡＭ−１−相互作用ポリペプチドで前もって吸着させる。複合体特異的ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を同じように作製することができる。かかる抗体を、特定の複合体の存在を診断的に検出および定量し、そしてこのデータを疾患または細胞型などと関連付けるために用いることができる。
【００７３】
ヒト化非ヒト抗体についての方法は、当技術分野にてよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からそれに導入される１個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、“外来”残基と称され、それは典型的に、“外来”可変ドメインから選ばれる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988)］に記載の方法に従い、げっ歯類動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより行うことができる。従って、かかる“ヒト化”抗体は、キメラ抗体（米国特許番号第４，８１６，５６７号）であり、ここで実質的に無傷のヒト可変ドメイン以外は、非ヒト種に由来する対応する配列により置換されている。実際に、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および可能性のあるいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類動物抗体の類似の部位に由来する残基により置換されるヒト抗体である。
【００７４】
ヒト抗体を、ファージ提示ライブラリを含む当技術分野で公知の様々な技術を用いて製造することもできる［Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)]。ColeらおよびBoernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の製造に利用することができる(Cole et al., Monoclonal Antibodied and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)）。同様に、ヒト抗体を、内生の免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されている形質転換動物、例えば、マウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作製することができる。攻撃により、遺伝子再構成、会合、および抗体レパートリーを含むすべての点でヒトに見られるものと非常に似ているヒト抗体製造が観察される。本方法は、例えば、米国特許番号第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、および以下の科学的文献： Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)に記載される。
【００７５】
抗体の治療用製剤を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する抗体と所望により薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を混合することにより貯蔵用に製造する（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. [1980]）。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いる投与量および濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；および、ｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；塩形成カウンターナトリウムなどのイオン；金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ．ＴＭ．、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ．ＴＭ．またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００７６】
本発明の抗ＰＥＣＡＭ結合種を、癌患者に対して、他の化学療法剤および放射線治療増感剤と併用投与することができる。
【００７７】
以下の実施例は、本発明を例示するものであるが、それに限定されるものではない。本明細書中に記載されるすべての％は、他に記載のない限り重量に基づく。すべてのタンパク質分子量は、他に記載のない限り、平均分子量に基づく。
【００７８】
本発明の上記の好ましい態様は、例示および説明を目的として存在している。それらは、包括的であることまたは記載された正確な形態に本発明を限定することを目的とせず、そして多くの改良および変形が上記の教示に照らして可能である。
【００７９】
当業者に明らかであり得るかかる改良および変形は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００８０】
実施例
材料および方法；
６−８週齢の雌マウスを、すべての研究に用いた。Ｃ５７Ｂ１／６およびＢａｌｂＣマウスをSimonson Labs（Gilroy, CA）から購入し、Ｎｕ／ＮｕマウスをCharles Riverから購入した。腫瘍細胞を、尾静脈注射により接種した。Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫腫瘍およびルイス肺癌−高転移性（ＬＬＣ−ＨＭ）肺癌モデルについて、各Ｃ５７Ｂ１／６マウスに２００μｌの培養培地に懸濁した２５，０００の腫瘍細胞を投与した。４Ｔ１マウス乳癌モデルおよびＣＴ２６マウス結腸癌モデルについて、各Ｂａｌｂ／Ｃマウスに２００μ１の培養培地に懸濁した５０，０００の腫瘍細胞を投与した。Ｌｏｘ細胞ヒト黒色腫異種移植モデルについて、Ｎｕ／Ｎｕマウスに、２回の尾静脈注射により培養培地中全量２５０万のＬｏｘ細胞を投与した。初めの注射は朝に行い、次の注射は４時間後に行った。各注射には、３００μｌの培養培地中に１２５万の細胞が含まれる。
【００８１】
第一セットの実験に関して、８匹のマウスの群に、０日目に尾静脈注射により２５，０００のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を供し、その後以下のスケジュールで、ラット抗マウス抗ＰＥＣＡＭ−１（ｍＡｂ３９０）（Dr. H. Delisser, University of Pennsylvaniaにより製造された）またはラットＩｇＧ２（ａ）イソ型対照抗体（Ｓｉｇｍａ）どちらかの２００μｇの５用量を投与した。１つの群のマウスには、ラット抗マウス抗ＰＥＣＡＭ−１（ｍＡｂ３９０）またはラットＩｇＧ２（ａ）イソ型対照抗体どちらかのそれぞれ２００μｇの５用量を０日目（腫瘍細胞注射直後）に投与し始め、その後１、３、６および８日目に投与した。さらに、１つの群のマウスには、ラット抗マウス抗ＰＥＣＡＭ−ｌ（ｍＡｂ３９０）またはラットＩｇＧ２（ａ）イソ型対照抗体どちらかの２００μｇの５用量を腫瘍細胞注射後７日目に投与し、その後、８、１０、１３および１５日目に投与した。ＣＴ２６、４Ｔ１ Ｂ１６およびＬｏｘ細胞を担持するマウスを、腫瘍細胞注入の２０、２２、２３および２８日後にそれぞれ殺した。
【００８２】
それぞれの場合に、各群からのすべてのマウスを、指標動物が重症かまたは死亡したように見えたときに殺し、かなりの数の肺腫瘍が、殺して解剖された肺の分析により報告された。各マウスからの肺を解剖により取り出し、その後計量した。その後、その肺をＢ１６−Ｆ１０黒色腫を担持するマウスに５％緩衝化ホルマリンと一緒に気管内注入した。その後、すべての他の腫瘍担持マウス（４Ｔ１、ＣＴ２６、ＬＬＣ−ＨＭおよびＬｏｘ腫瘍モデル）について、その肺を墨汁を含む固定液と一緒に気管内注入した。その後、すべての肺試料を、５％緩衝化ホルマリン（５０％の１０％緩衝ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ）および５０％ＰＢＳ）中で固定した。肺腫瘍を、観察者にはそれらがどの群に由来するかを伏せて、解剖顕微鏡下で計数した。様々な群間の可能性のある有意な相違を、対応のない、両側スチューデントのｔ検定を用いて評価した。
【００８３】
その後、前記肺を以下の実験に付した。有糸分裂およびアポトーシス数を、慣用の光学顕微鏡を用いて４ミクロンのヘマトキシリンおよびエオシンで染色したスライドで計数した。有糸分裂およびアポトーシス数の実数は、１０個の最も大きな小塊から得られた。アポトーシス体および有糸分裂数は、既述の形態的基準により計数した（１、２）。アポトーシス率および有糸分裂率を、腫瘍細胞性の程度に基づき計算し、そして１０００個の細胞当たりのアポトーシスまたは有糸分裂数の数として現した。切断された、アポトーシスＤＮＡ断片（ＴＵＮＥＬ）のインサイチュウ検出を、製造業者の説明書に従いＴｄＴ−ＦｒａｇＥＬ検出キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて行った。標識された細胞の頻度を、領域内の少なくとも１，０００個の細胞を最大数のＴｄＴ標識された核を数えることにより計算した。マトリゲル分析およびボイデンテャンバー分析を、既報（３）のように行った。アポトーシス、有糸分裂、血管形成および病理組織のすべての分析は、評価される標本の識別を隠された研究員により行われた。評価された様々な腫瘍細胞系のＰＥＣＡＭ−１の発現を、ＦＡＣＳ分析により行った。
【００８４】
参考文献：
1. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., & Currie, A. R. (1972) Br. J. Cancer 26, 239-257.
2. van Diest, P. J., Brugal, G., & Baak, J. P. (1998) J. Clin. Pathol. 51, 716-724.
3. Desprez, P. Y., Lin, C.Q., Thomasset, N., Sympson, C.J., Bissell, M.J., & Campisi, J. (1998) Mol. Cell Biol. 18, 4577-4588.
【００８５】
抗転移性腫瘍研究の結果：
様々な腫瘍細胞系に対する抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の結合を試験した。
マウスＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞、マウス４Ｔ１乳癌細胞およびマウスルイス肺癌種−高転移性（ＬＬＣ−ＨＭ）細胞に対する抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の結合を評価した。
【００８６】
ＰＥＣＡＭ−１発現はない（これらの細胞型のいずれかに対する抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の特異的結合は、検出されなかった（データ不掲載））。マウスＣＴ２６結腸癌腫瘍細胞およびヒトＬＯＸ黒色腫細胞におけるＰＥＣＡＭ−１発現の分析は、まだ結果が出ていない。
【００８７】
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫の転移性進行における抗ＰＥＣＡＭ−１の効果。発明者らはまず、５回の、抗ＰＥＣＡＭ−１またはＩｇＧイソ型対照抗体のどちらかの２００μｇの静脈投与を、腫瘍注入の日（０日目）または腫瘍細胞注入後７日（７日目）のどちらかに処理を開始して、可能性のある抗腫瘍効果を比較した。０日目または７日目のどちらかに開始したＩｇＧイソ型対照抗体の注射、ならびに０日目に開始した抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の注射は、非処置の腫瘍担持対照マウスと比較したとき、全肺重量（全体の転移性負荷の指標）または転移性肺腫瘍の全数のどちらかに効果を有しなかった。０日目に開始された抗ＰＥＣＡＭ抗体治療によりもたらされた抗腫瘍効果がないことは、局所的に接種された皮下Ｂ１６黒色腫腫瘍に対する抗ＰＥＣＡＭ抗体のこの投与量およびスケジュールを試験する先の研究結果と対照的である。この先の研究にて、Ｂ１６黒色腫腫瘍の局所的皮下注射としての、５回の、同日（０日目）に開始した同じ抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の２００μｇの腹腔内投与は、かなりの抗腫瘍活性をもたらし、局所的腫瘍増殖を著しく減少させ、ならびに腫瘍血管形成をかなり減少させた（Zhou et al. Angiogenesis 3: 181−188, 1999）。対照的に、発明者らの研究は、０日目に開始したこの同じ抗ＰＥＣＡＭ−ｌ抗体の注射がＢ１６黒色腫肺転移に対して抗腫瘍活性を示さないことを証明した。しかしながら、発明者らは対照マウスと比較したとき、腫瘍細胞注入後７日目に始めた抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の静脈注射が、転移性Ｂ１６黒色腫腫瘍に対して全肺重量（ｐ＜０．００５）および転移性Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫肺腫瘍の全体数（ｐ＜０．０００１）の両方を有意に減少させるといった高い効果を示すことを発見した（図１Ａおよび１Ｂ）。故に、局所腫瘍に対してＩＰ投与された抗ＰＥＣＡＭ抗体を用いて得られた抗腫瘍結果は、転移性腫瘍に対して静脈注射された抗ＰＥＣＡＭ抗体を用いて得られた結果とは実質的に異なり得る。
【００８８】
次に、発明者らは、Ｂ１６−Ｆ１０細胞のＩＶ注射後７日に開始された、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体または前記イソ型対照のどちらかの効果を再び比較して、追跡実験でこれらの結果を繰り返すのを試みた。発明者らは、イソ型対照抗体の同じスケジュールおよび投与で処理したＢ１６−Ｆ１０担持マウスと比較したとき、全肺重量（ｐ＜０．０５）および肺腫瘍の全体数（ｐ＜０．０００１）の両方が有意に減少することを発見した（図２Ａおよび２Ｂ）。（発明者らは、全肺重量および肺腫瘍の全体数がイソ型対照抗体で処理したマウスおよび非処理マウスで相違のないことを上記に示したため、すべての後の実験で対照としてイソ型対照抗体処理マウスを用いた（図１Ａおよび１Ｂを参照のこと））。腫瘍細胞注入後７日目に開始した抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、再び、上記の実験１に見られるような、全体の腫瘍組織量および肺転移腫瘍の全体数を有意に減少させた。この同じ抗ＰＥＣＡＭ抗体の腹腔内投与は、皮下に接種したＢ１６黒色腫腫瘍での腫瘍血管形成の有意な減少について既報されている。本発明者らは、抗ＰＥＣＡＭ−およびイソ型対照抗体注射群からのＢ１６−Ｆ１０肺腫瘍における腫瘍血管形成、ならびに腫瘍アポトーシス率および有糸分裂率を評価した。驚くことに、この相違は統計的な有意性はないが（ｐ＝０．１２）、肺腫瘍の血管数が、イソ型対照処置群（８．７９＋２．９）よりも抗ＰＥＣＡＭ処置群（１７．９＋４．５腫瘍血管／ＨＰＦ（平均＋Ｓ．Ｅ．））で多いことが明らかとなった。抗ＰＥＣＡＭ−対−イソ型対照−処理マウス（９．７＋０．８）での腫瘍アポトーシス（９．９＋１．１）のレベルも同程度であった。しかしながら、腫瘍細胞での有糸分裂の割合は、抗ＰＥＣＡＭ処理マウス（２．９＋０．７）に対してイソ型対照処理マウス（４．７＋０．５）でかなり高かった（ｐ＜０．０５）。病理組織学的には、腫瘍壊死、出血、肺うっ血および／または血管内閉塞が９匹のイソ型抗体処理マウスのうち７匹で見られ、一方これらの発見は、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体処理マウスでは見られなかった（データ不掲載）。概して、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、転移Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍の全数および全体の腫瘍組織量を減少し、ならびに腫瘍細胞有糸分裂率および肺の病理組織学的変化を著しく減少した。抗ＰＥＣＡＭ−ｌ抗体治療は、腫瘍血管形成または腫瘍アポトーシスのどちらも減少させなかった。
【００８９】
抗ＰＥＣＡＭ−１抗体の抗転移活性が、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍に加えて広く多種多様な固形癌に特異的であることを証明するために、本発明者らは、マウスに注射した様々な他の腫瘍細胞系に対してその可能性のある抗転移作用を試験した。これらの系には、マウス４Ｔ１乳癌細胞、マウスＣＴ２６結腸癌腫瘍細胞、マウスルイス肺癌種−高転移性（ＬＬＣ−ＨＭ）細胞およびヒトＬＯＸ黒色腫細胞が含まれる。本発明者らは、上記の材料および方法の部分に記載のように、これらの系のそれぞれの転移の作製のための確立されたプロトコルを用いた。発明者らは、７日目に開始した５回の、２００μｇのＩＶ投与の抗ＰＥＣＡＭ抗体治療が、腫瘍担持マウスにおけるこれらの腫瘍系のそれぞれに対してかなりの抗転移作用をもたらすことを発見した。
【００９０】
具体的には、抗ＰＥＣＡＭ抗体は、イソ型対照抗体処理マウスと比較したとき、全体の腫瘍組織量（ｐ＜０．００５）および全体の転移性肺腫瘍（ｐ＜０．０００１）の有意な減少をもたらし、４Ｔ１乳癌腫瘍の転移に対して有効性が高い（図３Ａおよび３Ｂを参照のこと）。再び他者らによる既報に反して、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、４Ｔ１腫瘍の転移に対して高い有効性を示すが、それは抗ＰＥＣＡＭ処理マウスが２７．８＋２．５腫瘍血管／ＨＰＦを示し、一方、イソ型対照処理マウスが２６．５＋２．１腫瘍血管／ＨＰＦを示すことから、腫瘍血管増生に効果を有さない（データ不掲載）。故に、皮下腫瘍に対するこの同じ抗ＰＥＣＡＭ抗体の抗腫瘍効果とは異なり（Zhou et al., Angiogenesis 3: 181-188, 1999）、転移性腫瘍に対する抗ＰＥＣＡＭ抗体効果は、腫瘍血管形成への影響を介して仲介されないように思われる（４Ｔ１腫瘍についての腫瘍有糸分裂率およびアポトーシス率における抗ＰＥＣＡＭ抗体の効果の分析は進行中である）。
【００９１】
抗ＰＥＣＡＭ抗体は、イソ型対照抗体処理マウスと比較したとき、ＣＴ２６結腸癌腫瘍の転移に対して活性をほとんど有さないが、転移性肺腫瘍の全数を有意に減少させる（ｐ＜０．０５）（図４Ａおよび４Ｂを参照のこと）。
【００９２】
抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、イソ型対照抗体処理マウス（０．９４±０．１ｇｍ）と比較したとき、ＬＬＣ−ＨＭ腫瘍を担持するマウスにおける肺重量（０．８５±０．２ｇｍ）を有意に減少させない（ｐ＝０．７４）。肺転移が主にこの実験における別々の腫瘍よりむしろ融合塊として増殖したため、正確にマウスにおける個々の肺腫瘍の数を数えるのは不可能であった。しかしながら、肺以外の肺転移の数は抗ＰＥＣＡＭ抗体処理マウスにて著しく減少するように見えた。具体的には、８匹すべてのイソ型対照処理マウスは、胸腔での別個の大きな肺以外の腫瘍を示し、一方、９匹の抗ＰＥＣＡＭ抗体処理マウスのうちたった３匹が肺以外の腫瘍を示した（９匹のイソ型対照抗体処理マウスのうち１匹が、すべての他のマウスが殺される４日前に広範囲の腫瘍組織量で死んだことを特記する）。このマウスは、転移ＬＬＣ−ＨＭ腫瘍の最終的な分析に含まれない。さらに、８匹のイソ型対照処理マウスのうち３匹が肝臓転移を示し、一方、９匹の抗ＰＥＣＡＭ抗体処理マウスのうちたった１匹が肝臓腫瘍を示した。故に、肺転移ＬＬＣ−ＨＭ腫瘍の数を明確に減少させないが、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、ＬＬＣ−ＨＭ腫瘍の肺以外の転移をかなり減少させるように見えた。
【００９３】
最後に、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療が免疫応答性の同種のマウス株の４つの異なるマウス固形癌の転移拡大を減じるため、発明者らは、ヌードマウスのヒトＬＯＸ異種移植腫瘍の転移拡大が変化したか否かを評価した。マウス腫瘍モデルの場合のように、抗ＰＥＣＡＭ抗体治療は、イソ型対照抗体で処理したＬＯＸ担持マウスと比較したとき、肺重量（ｐ＜０．０５）および肺腫瘍の全数（ｐ＜０．００５）の両方により測定されるように、ヌードマウスでのＬＯＸ細胞の転移拡大を有意に減少させた（図５Ａおよび５Ｂを参照のこと）。
【００９４】
まとめとして、これらのデータは、全身的な抗ＰＥＣＡＭ抗体治療が、マウス転移モデルにおける多種多様な通常致死的な固形癌（黒色腫、乳癌、結腸癌および肺癌）の転移拡大をかなり減少させ得ることを示す。重要なことには、試験した腫瘍細胞のいずれも検出可能なＰＥＣＡＭ−１を発現せず、このことは抗ＰＥＣＡＭ抗体が腫瘍細胞自体との直接結合によりその抗転移性腫瘍効果をもたらさないことを示す。むしろ、抗ＰＥＣＡＭ抗体は、血管内皮細胞に発現するＰＥＣＡＭ−ｌと結合することにより抗腫瘍薬として機能するように見える。しかしながら、抗ＰＥＣＡＭ抗体は、腫瘍血管形成の効果により抗転移作用を及ぼさないように見える。故に、現在ヒト癌の処置に用いられる抗腫瘍抗体とは異なり、抗ＰＥＣＡＭは、顕著な抗転移効果を生じるために、腫瘍タイプ特性も腫瘍細胞上のその同種の受容体の発現も必要としない。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、抗体処理の効果を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、マウスにおける抗体処理の効果を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、抗体処理の効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において新生物細胞の転移または浸潤を抑制または防止するための方法であって、該哺乳動物に対して全身投与により治療的有効量の抗ＰＥＣＡＭ結合種を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記抗ＰＥＣＡＭ結合種がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記新生物細胞が、黒色腫細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、または肺癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記新生物細胞が実質的に抗ＰＥＣＡＭ抗体への結合を欠き、ＰＥＣＡＭが実質的に該新生物細胞上で検出不可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記新生物細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、腹腔内投与により哺乳動物に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体の投与を、腫瘍増殖が該哺乳動物に確立された後に開始する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体を、腫瘍細胞が該モノクローナル抗体の投与前に少なくとも７日間該哺乳動物の循環系に存在した後に投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍増殖が、新生物細胞の少なくとも１個の多細胞コロニーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記新生物細胞がヒト腫瘍細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＰＥＣＡＭ結合種を複数回の投与で前記哺乳動物に投与する請求項１に記載の方法であって、ここで各投与が少なくとも２００マイクログラムの抗ＰＥＣＡＭ結合種を含み、かつ該複数回の投与が、各投与が少なくとも２日の間隔で少なくとも５回の投与を含む、方法。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体を、腫瘍細胞が該モノクローナル抗体の投与前に少なくとも７日間、該哺乳動物の循環系に存在した後に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞が、ヒト新生物細胞の少なくとも１個の多細胞コロニーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物において新生物細胞の転移または浸潤を抑制または防止するためのキットであって、治療的有効量の抗ＰＥＣＡＭ結合種および該哺乳動物への該抗ＰＥＣＡＭ結合種の全身投与のための説明書を含むキット。
【請求項１５】
前記抗ＰＥＣＡＭ結合種がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記説明書が、各投与が少なくとも２００マイクログラムの該モノクローナル抗体を含む、複数回の投与の投与方法を明記するものである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記説明書が、該モノクローナル抗体を、各投与を複数回の他の投与から少なくとも２日の間隔で少なくとも５回の投与で投与することを明記するものである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記説明書が、上記モノクローナル抗体を他の抗新生物治療と組合せ得ることを明記するものである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
前記他の抗新生物治療が、電離放射線、化学療法剤、熱剥離、ＰＥＣＡＭと結合しない抗腫瘍モノクローナル抗体、放射性同位体種晶の注入、および外科手術を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
抗ＰＥＣＡＭモノクローナル抗体の投与前に少なくとも７日間その体内に新生物細胞を有していた哺乳動物での、新生物細胞の転移を抑制または防止するための抗ＰＥＣＡＭモノクローナル抗体の使用。
【請求項１】
哺乳動物において新生物細胞の転移または浸潤を抑制または防止するための方法であって、該哺乳動物に対して全身投与により治療的有効量の抗ＰＥＣＡＭ結合種を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記抗ＰＥＣＡＭ結合種がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記新生物細胞が、黒色腫細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、または肺癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記新生物細胞が実質的に抗ＰＥＣＡＭ抗体への結合を欠き、ＰＥＣＡＭが実質的に該新生物細胞上で検出不可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記新生物細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、腹腔内投与により哺乳動物に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体の投与を、腫瘍増殖が該哺乳動物に確立された後に開始する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体を、腫瘍細胞が該モノクローナル抗体の投与前に少なくとも７日間該哺乳動物の循環系に存在した後に投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍増殖が、新生物細胞の少なくとも１個の多細胞コロニーを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記新生物細胞がヒト腫瘍細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＰＥＣＡＭ結合種を複数回の投与で前記哺乳動物に投与する請求項１に記載の方法であって、ここで各投与が少なくとも２００マイクログラムの抗ＰＥＣＡＭ結合種を含み、かつ該複数回の投与が、各投与が少なくとも２日の間隔で少なくとも５回の投与を含む、方法。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体を、腫瘍細胞が該モノクローナル抗体の投与前に少なくとも７日間、該哺乳動物の循環系に存在した後に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞が、ヒト新生物細胞の少なくとも１個の多細胞コロニーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物において新生物細胞の転移または浸潤を抑制または防止するためのキットであって、治療的有効量の抗ＰＥＣＡＭ結合種および該哺乳動物への該抗ＰＥＣＡＭ結合種の全身投与のための説明書を含むキット。
【請求項１５】
前記抗ＰＥＣＡＭ結合種がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記説明書が、各投与が少なくとも２００マイクログラムの該モノクローナル抗体を含む、複数回の投与の投与方法を明記するものである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記説明書が、該モノクローナル抗体を、各投与を複数回の他の投与から少なくとも２日の間隔で少なくとも５回の投与で投与することを明記するものである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記説明書が、上記モノクローナル抗体を他の抗新生物治療と組合せ得ることを明記するものである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
前記他の抗新生物治療が、電離放射線、化学療法剤、熱剥離、ＰＥＣＡＭと結合しない抗腫瘍モノクローナル抗体、放射性同位体種晶の注入、および外科手術を含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
抗ＰＥＣＡＭモノクローナル抗体の投与前に少なくとも７日間その体内に新生物細胞を有していた哺乳動物での、新生物細胞の転移を抑制または防止するための抗ＰＥＣＡＭモノクローナル抗体の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５１１５３１（Ｐ２００７−５１１５３１Ａ）
【公表日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３９９３４（Ｐ２００６−５３９９３４）
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７９２４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４８９３８
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５０３３１６９４９）カリフォルニア パシフィック メディカル センター (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７９２４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４８９３８
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５０３３１６９４９）カリフォルニア パシフィック メディカル センター (7)
【Ｆターム（参考）】
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