退行性脳疾患を予防及び治療するためのハチ毒精製抽出物を含む組成物
本発明は、退行性脳疾患を予防及び治療するためのハチ毒精製抽出物を含む組成物、並びにその使用に関連する。退行性脳疾患の動物モデルを使用することによって、ハチ毒精製抽出物は、ミクログリア細胞の活性化、及び異常な循環行動に対する強力な阻害効果と、これらによる強力な細胞の保護活性を示し、薬剤として退行性脳疾患の治療及び予防に有用であり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、退行性脳疾患を予防及び治療するためのハチ毒精製抽出物を含む組成物、並びにその使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
２０世紀において、ヒトの平均寿命が、ライフサイエンスと医薬の急速な発展に伴って増加しているため、高齢者の人口比率の増加を含む新たな社会問題が顕著となっている。特に、脳卒中、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）等の老人性ニューロン疾患は、ニューロン系統の致命的な機能障害であり、増加している。
【０００３】
特に、パーキンソン病は、脳の黒質緻密部のニューロン死によって生じ、ニューロン疾患を頻繁に生じる。特に、特発性パーキンソン病は、パーキンソン病患者間で８０％超を占め、高齢者の重度の疾患によって生じる病因である（Ｅｎｎｉｏ Ｅｓｐｏｓｉｔｏら：パーキンソン病の非ステロイド抗炎症剤（Ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．， ２０５， ｐｐ２９５−３１２， ２００７）。
【０００４】
近年の高齢化社会により、パーキンソン病患者数はこれまで増加し、２０１３年の薬市場は、１３９％（すなわち、２００６年と比較して２３億７０００万ドル（米ドル））増加すると考えられている。
【０００５】
現在、パーキンソン病治療の代表的な薬剤であるレボドーパを使用する薬物治療は、これまで従来利用されている。しかしながら、例えば、一貫性のない投与の必要性、基本的な治療等に対する治療の限界又は不都合（例えば、ドーパミン投与によって生じたニューロン損傷、薬物不耐性による低減した薬剤の効能、不随意運動、悪化した運動障害、長期の薬物治療等に関連した他の逆作用の疾患等の治療後の合併症）といった幾つかの問題がある（Ｊｕｄｉｔｈ Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ：パーキンソン病入門（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）， Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ Ｎｕｒｓｉｎｇ， ２３（２）， ｐｐ６９−７３， ２００２；Ｆａｂｉｏ Ｄａｎｉｓｉ：患者の機能と生活の質を改善するパーキンソン病治療の戦略（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）， Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ， ５７（３）， ｐｐ４６−５０， ２００２）。
【０００６】
したがって、新たな抗パーキンソン病薬を開発すること、及び近年の開発が依然として必要であり、研究は、種々のメカニズム（例えば、ドーパミナージックス（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｓ）、ドーパミンアゴニスト、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬、アデノシンａ２ａ受容体拮抗剤；ドーパミン受容体アゴニスト、ＮＭＤＡ受容体アゴニスト、酸化防止剤、ＮＳＡＩＤ、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、神経栄養因子等の神経保護薬；及び、細胞／遺伝子治療、幹細胞分化、移植等の他の治療方法（Ｊｕｎ Ｔａｋａｈａｓｈｉ：パーキンソン病の幹細胞治療（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．， ７（６）， ｐｐ６６７−６７５， ２００７））の態様に焦点を置いている。
【０００７】
ハチ毒は、ミツバチ、バンブルビー（ｂｕｍｂｌｅ ｂｅｅ）、コハナバチ等の種々のハチの腹部から滲出したハチの毒液であり、ｐＨ ５．２で苦味を有する弱い芳香族性を示す。ハチ毒が、ＮＯ、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−ａ等の因子の増加によって生じる炎症経路、及び炎症性遺伝子の発現を妨げ、これによって、神経痛、リューマチ、背部痛等の種々の炎症性疼痛を治療することができる強力な抗炎症活性を発生させることが報告されている（Ｄｏｎｇ Ｊｕ Ｓｏｎら：ハチ毒の抗関節炎、痛みの開放、及び抗癌作用の治療適用、並びにその構成化合物（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， ｐａｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ， ａｎｄ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｅｅ ｖｅｎｏｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １１５， ｐｐ２４６−２７０， ２００７）。約３０％の乾燥生成物、及びメリチン、アパミン、ホスホリパーゼ、アドラピン（ａｄｏｌａｐｉｎｅ）、ヒアルロニダーゼ、ヒスチジン、ヒスタミン等の約７５％のタンパク質が、室温での蒸発後に残存することが報告されている（Ｍｅｉｅｒ Ｊ．らの文献：動物毒の臨床中毒学（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｖｅｎｏｍｓ ａｎｄ ｐｏｉｓｏｎｓ）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９９５）。
【０００８】
しかしながら、上で引用した文献（それらの開示は引用により本明細書中に組み込まれる）のいずれにおいて、精製ハチ毒抽出物の退行性脳疾患の治療効果又は改善効果について、報告又は開示されていない。
【０００９】
退行性脳疾患に対するハチ毒の治療効果を調査するために、本発明の発明者らは、退行性脳疾患の動物モデルを使用する神経保護活性、ミクログリア細胞活性化の阻害効果、及び異常なスピニングモータ等の幾つかの動物モデル試験、並びにヒト臨床実験と共にヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系を集中的に実行した。そして、ハチ毒精製抽出物が、退行性脳疾患の動物モデルを使用することによる、ミクログリア細胞の活性化、及び異常な循環行動に対する強力な阻害効果と、強力な細胞の保護活性を示すことを確認することによって、本発明を完了した。
【００１０】
本発明のこれら及び他の目的は、以下に提供される本発明の詳細な開示から明らかになる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅｎｎｉｏ Ｅｓｐｏｓｉｔｏら、Ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．， ２０５， ｐｐ２９５−３１２， ２００７
【非特許文献２】Ｊｕｄｉｔｈ Ｌ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ Ｎｕｒｓｉｎｇ， ２３（２）， ｐｐ６９−７３， ２００２
【非特許文献３】Ｆａｂｉｏ Ｄａｎｉｓｉ， Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ， Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ， ５７（３）， ｐｐ４６−５０， ２００２
【非特許文献４】Ｊｕｎ Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．， ７（６）， ｐｐ６６７−６７５， ２００７
【非特許文献５】Ｄｏｎｇ Ｊｕ Ｓｏｎら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， ｐａｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ， ａｎｄ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｅｅ ｖｅｎｏｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １１５， ｐｐ２４６−２７０， ２００７
【非特許文献６】Ｍｅｉｅｒ Ｊ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｖｅｎｏｍｓ ａｎｄ ｐｏｉｓｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を予防する治療有効量の有効成分としてのハチ毒精製抽出物を含む、医薬組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、哺乳動物又はヒトのニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療及び予防する医薬組成物の調製のための上述した抽出物の使用も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、ニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療及び予防する有効成分としてのハチ毒精製抽出物を含む、医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１５】
本明細書に開示される用語「精製抽出物」は、ミツバチ、バンブルビー（ｂｕｍｂｌｅ ｂｅｅ）、コハナバチ等のハチ毒の粗精製抽出物及び精製抽出物（好ましくは、ミツバチのハチ毒精製抽出物）を含む。
【００１６】
具体的には、上述のハチ毒粗精製抽出物は、次の工程を含む手順によって調製した抽出物を含み得る：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解した後、その溶液をろ過して、該溶液から不純物を除去し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、本発明のハチ毒粗精製抽出物を得る工程。
【００１７】
上述のハチ毒精製抽出物は、次の工程を含む手順によって調製した抽出物を含み得る：上述の工程で調製した乾燥ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解した後、その溶液を、塩析法、溶媒析出法、及び遠心分離又は透析を行うための透析膜ろ過から選択される少なくとも１つの精製工程に供し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程。
【００１８】
好ましくは、該ハチ毒精製抽出物は、次の工程を含む手順によって調製した抽出物を含み得る：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解して、ハチ毒水溶性抽出物を得る工程（第２工程）；と、その溶液を、膜透析を使用する透析膜ろ過に供して、該膜に含まれる精製抽出物を回収し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、本発明以外の他のハチ毒抽出物よりも強力な薬理効果のある、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程（第３工程）。
【００１９】
非常に強力な薬理効果のある本発明のハチ毒精製抽出物は、有効成分として、約３０％〜９０％（ｗ／ｗ％）、好ましくは約３５％〜８０％（ｗ／ｗ％）、より好ましくは約４０％〜６０％（ｗ／ｗ％）の量のメリチンを含み得る。
【００２０】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物のニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための治療剤の調製におけるハチ毒精製抽出物の使用を提供することを目的とする。
【００２１】
本発明は、治療有効量のハチ毒精製抽出物を、医薬として許容し得るそのキャリアと共に、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物のニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療又は予防する方法を提供することを目的とする。
【００２２】
本明細書に開示される用語「退行性脳疾患」は、アルツハイマー型痴呆、脳血管性痴呆、Ｐｉｃｋ病、クロイツフェルト−ヤコブ病、頭部損傷によって生じた痴呆、パーキンソン病等、好ましくは、ミクログリア細胞の活性化過剰によって生じたパーキンソン病を含む。
【００２３】
本発明のハチ毒精製抽出物は、詳細には次のように調製することができる。
【００２４】
該ハチ毒精製抽出物は、次の工程を含む手順によって調製することができる： ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物（以下、「ＨＰ−１」と表す）を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、その溶液を、塩析法、溶媒析出法、及び遠心分離又は透析を行うための透析膜ろ過から選択される少なくとも１つの精製工程に供し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程（第２工程）。
【００２５】
本発明の第１の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、１０．２％のホスホリパーゼ、４０．５％のメリチン、３．８％のアパミン、１．６％のヒスタミン、１．１％のドーパミン、及び０．３％のアドレナリンを含む、ハチ毒粗精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１」と表す）を得る工程。
【００２６】
本発明の第２の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含むハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解して、ハチ毒水溶性抽出物を得る工程（第２工程）；と、その溶液をゲルろ過クロマトグラフィに供した後、膜透析を使用するタンパク質透析膜ろ過に供して、塩析を行う工程（第３工程）；と、該膜に含まれる精製抽出物を回収し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、１２．４％のホスホリパーゼ、４８．４％のメリチン、４．３％のアパミン、０．９％のヒスタミン、１．４％のドーパミン、及び０．４％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒粗精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１Ｇ」と表す）を得る工程（第４工程）。
【００２７】
本発明の第３の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解して、ハチ毒水溶性抽出物を得る工程（第２工程）；と、 その溶液を塩溶に供した後、硫酸アンモニウム等の塩を使用する塩析を行う工程（第３工程）；と、その溶液を遠心分離及び凍結乾燥し、上清を得て、上清中に、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、８．４％のヒスタミン、３．１％のドーパミン、及び１．２％のアドレナリンを含み（以下、「ＨＰ−０１ＡＬ」と表す）、そして、沈殿物中に、１３．４％のホスホリパーゼ、５３．６％のメリチン、５．１％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む（以下、「ＨＰ−０１ＡＰ」と表す）、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程（第４工程）。
【００２８】
本発明の第４の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール若しくはブタノール等の低級アルコール、又はこれらの混合物から選択される析出溶媒（好ましくは５０−９０％エタノール、より好ましくは６０−８０％エタノール）中で溶解して、析出物を得る工程（第２工程）；と、その溶液を遠心分離及び凍結乾燥し、上清を得て、上清中に、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、１２．１％のヒスタミン、６．４％のドーパミン、及び２．２％のアドレナリンを含み（以下、「ＨＰ−０１ＳＬ」と表す）、そして、沈殿物中に、７．８％のホスホリパーゼ、５６．４％のメリチン、５．８％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む（以下、「ＨＰ−０１ＳＰ」と表す）、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程（第３工程）。
【００２９】
本発明の第５の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール若しくはブタノール等の低級アルコール、又はこれらの混合物から選択される析出溶媒（好ましくは水）中で溶解する工程（第２工程）；と、その溶液を、５０ｋＤａの膜フィルターを装備した超遠心分離機を使用する超遠心分離に供して、７６．２％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、５０ｋＤａより高い高分子量のハチ毒精製抽出物（以下、「ＨＰ−０２Ａ５０」と表す）を得る工程（第３工程）；と、１０ｋＤａ膜フィルターを装備した超遠心分離機を使用することによって、５０ｋＤａ未満の低分子量の画分を再度遠心分離して、＜０．１％のホスホリパーゼ、４３．２％のメリチン、６．２％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの高分子量のハチ毒精製抽出物（以下、「ＨＰ−０３」と表す）、並びに、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、１２．８％のヒスタミン、８．１％のドーパミン、及び１．３％のアドレナリンを含む、１０ｋＤａ未満の低分子量のハチ毒精製抽出物（以下、「ＨＰ−０４」と表す）を得る工程。
【００３０】
本発明の第６の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解して、ハチ毒水溶性抽出物を得る工程（第２工程）；と、その溶液を、タンパク質透析膜を使用する透析に供する工程（第３工程）；と、該膜内の溶液を回収し、該溶液を凍結乾燥して、０．２％のホスホリパーゼ、４０．５％のメリチン、３．８％のアパミン、１．６％のヒスタミン、３．１％のドーパミン、及び０．３％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒精製抽出物（以下、「ＨＰ−０５」と表す）を得る工程。
【００３１】
したがって、本発明は、本発明のハチ毒精製抽出物を得るための上述の方法、及び上述の方法によって調製したハチ毒精製抽出物も提供する。
【００３２】
本発明のハチ毒精製抽出物は、強力な薬理効果があり、有効成分として、約１％〜８０％（ｗ／ｗ％）、好ましくは約３％〜５０％（ｗ／ｗ％）、より好ましくは約５％〜２０％（ｗ／ｗ％）の量のホスホリパーゼ；と、約３０％〜９０％（ｗ／ｗ％）、好ましくは約３５％〜８０％（ｗ／ｗ％）、より好ましくは約４０％〜６０％（ｗ／ｗ％）の量のメリチン；と、約０．１％〜３０％（ｗ／ｗ％）、好ましくは約０．５％〜１５％（ｗ／ｗ％）、より好ましくは約１．０％〜１０％（ｗ／ｗ％）の量のアパミンと、を含み得る。
【００３３】
退行性脳疾患の動物モデルを使用する神経保護活性、ミクログリア細胞活性化の阻害効果、及び異常なスピニングモータ等の幾つかの動物モデル試験、並びにヒト臨床実験と共にヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系によって、ハチ毒精製抽出物が、退行性脳疾患の動物モデルを使用する、ミクログリア細胞の活性化、及び異常な循環行動に対する強力な阻害効果と、強力な細胞の保護活性を示し、薬剤として退行性脳疾患の治療及び予防に有用であり得る。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、該組成物の全重量に基づいて、約０．０１〜５０重量％の上述の抽出物を含み得る。
【００３５】
本発明の他の態様に基づいて、ニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための上述の調製方法によって調製したハチ毒精製抽出物を含む、医薬組成物を提供する。
【００３６】
本発明の別の態様は、ヒトを含む哺乳動物のニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための治療剤の調製における上述の調製方法によって調製したハチ毒精製抽出物の使用である。
【００３７】
本発明は、治療有効量のハチ毒精製抽出物を、医薬として許容し得るそのキャリアと共に、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物のニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療及び予防する方法を提供することを目的とする。
【００３８】
ニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための本発明の組成物は、該組成物の全重量に基づいて、約０．０１〜５０重量％の上述の抽出物を含み得る。
【００３９】
本発明の組成物は、当技術分野で周知の方法の使用に基づいて、従来のキャリア、補助剤又は希釈剤を更に含んでもよい。該キャリアは、使用方法及び適用方法によって、適切な材料として使用することが好ましいが、これに限定されない。適切な希釈剤は、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）で一覧にて記載されている。
【００４０】
次の製剤化方法及び賦形剤は、単なる例示であり、本発明を全く限定するものではない。
【００４１】
本願の組成物を含む医薬製剤は、例えば、固形経口製剤として、凍結乾燥調製物、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、エリキシル剤、丸剤、サシェ剤等の経口剤形；液状経口製剤として、懸濁剤、溶剤、乳剤、シロップ剤、水性薬剤等；クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バーム、パッチ、ペースト、スプレー溶液、エアゾール等の局所用調製物；又は、例えば、坐薬、若しくは滅菌溶液、懸濁剤、凍結乾燥調製物、非水性型注射液等の注射可能な調製物、若しくは水性型注射液（好ましくは滅菌した注射可能な調製物）である、非経口剤形の任意の形態で調製することができる。
【００４２】
本発明による組成物は、医薬として許容し得るキャリア、補助剤若しくは希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アラビアゴム、アルギン、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油）を含む、医薬組成物として提供することができる。該製剤は、溶媒、添加剤、希釈剤、緩衝剤、等張剤、安定剤、酸化防止剤、鎮痛剤、乳化剤、充填剤、凝集防止剤、滑沢剤、湿潤剤、着香料、保存剤等を更に含み得る。具体的には、該溶媒、添加剤又は希釈剤は、滅菌蒸留水、生理食塩水、ｐＨ調整剤、アルブミン、塩化ナトリウム、マンニトール、リンゲル液、グルコース等を含む。粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、エリキシル剤、丸剤、サシェ剤等の該固形経口製剤は、本発明の抽出物と、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチン等の少なくとも１つの補助剤、必要な場合、製剤化するための付加的な添加剤として、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤を混合することによって、調製することができる。懸濁剤、溶剤、乳剤、シロップ剤、水性薬剤等の該液状経口製剤は、本発明の抽出物と、例えば、製剤化するための湿潤剤、着香料、甘味剤、保存剤、水若しくは流動パラフィン等の一般的な希釈剤以外の他のものである少なくとも１つの補助剤を混合することによって、調製することができる。該非経口剤形としては、例えば、滅菌溶液、懸濁剤、凍結乾燥調製物、非水性型注射液、若しくは水性型注射液といった注射可能な製剤は、基剤として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、エチルオラート（ｅｔｈｙｌ ｏｌａｔｅ）等の注射可能なエステルを使用することができる。また、該坐薬は、本発明において、基剤として、ウィテップゾール、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン油、グリセリン−ゼラチン等を使用することができる。
【００４３】
本発明の該組成物は、当技術分野で周知の任意の手順を行うことによって、患者への該組成物投与後の有効成分の急速放出、徐放、又は遅延放出を提供するように、製剤化することができる。
【００４４】
例えば、本発明の組成物は、注射を製造するのに一般に使用する、油、プロピレングリコール、又は他の溶媒中で溶解することができる。キャリアの適切な一例は、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピル等を含むが、これらに限定されない。局所投与において、本発明の抽出物は、軟膏及びクリームの形態で製剤化することができる。
【００４５】
医薬剤形の本発明の組成物は、それらの医薬として許容し得る塩の形態で使用することができ、また、単独又は適切な組み合わせで、及び他の薬学的に活性のある化合物と併用して、使用することもできる。
【００４６】
本発明の抽出物又は組成物の望ましい用量は、対象の症状と体重、剤形、投与の経路と期間によって変動し、当業者によって選択することができる。しかしながら、望ましい結果を得るために、本発明の抽出物を、１マイクログラムから５ ｍｇ／日、好ましくは８マイクログラムから２ｍｇ／日、より好ましくは１６マイクログラムから１ｍｇ／日の量で投与することが一般に推奨される。用量を単回で、又は１日当たり数回に分けて；周期的に（例えば、２日から１週の期間に１回）投与することができるが、これらに限定することは意図されない。本発明の範囲は、当業者によって想到することができる、すべての改良、又は投与量と投与回数の変更、投与経路を含み得る。組成物に関して、本発明の抽出物の量は、該組成物の全重量に基づいて、０．０１〜５０重量％、好ましくは０．５〜４０重量％含み得る。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、種々の経路によって、哺乳動物（ラット、マウス、家畜又はヒト）等の対象動物に投与することができる。投与のすべての方法が考えられ、例えば、投与は、経口的に、直腸内に、又は静脈内、筋肉内、皮下、皮内、鞘内、硬膜外、若しくは脳室内注射によって、行うことができる。
【００４８】
したがって、本発明の抽出物は、毒性及び悪影響がなく、安全に使用することができる。
【００４９】
本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用及び調製において種々の改良及び変更をすることができることは、当業者に明らかである。
【発明の効果】
【００５０】
したがって、本発明の抽出物は、毒性及び悪影響がなく、安全に使用することができる。
【００５１】
本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用及び調製において種々の改良及び変更をすることができることは、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
本発明の上述及び他の目的、特徴及び他の利点は、次の添付の図面を採用すると共に、詳細な説明からより明確に理解される。
【００５３】
【図１】図１は、ＨＰ−０１、ＨＰ−０５、及びメリチン標準のＨＰＬＣクロマトグラム比較を示す。
【図２】図２は、対照グループ、ＭＰＰ＋グループ、及び種々のＨＰ−０１、ＨＰ−０５の濃度のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率を示す。
【図３】図３は、ＭＰＴＰ誘発パーキンソン病動物モデルにおける対照グループ、ＭＰＴＰグループ、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の神経保護活性の比較を示す（Ａ：線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）、Ｂ：ＳＮのドーパミン作動性ニューロンの数の比較、Ｃ：ＳＴのＴＨ染色強度の比較）。
【図４】図４は、ＭＰＴＰ誘発パーキンソン病動物モデルにおけるミクログリア細胞に対する対照グループ、ＭＰＴＰグループ、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の保護効果の比較を表す（矢印：ＣＤ１１Ｂ陽性細胞）。
【図５】図５は、６−ＯＨＤＡ誘発パーキンソン病動物モデルにおける異常循環行動に対する対照グループ、６−ＯＨＤＡグループ、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の阻害効果の比較を示す。
【図６】図６は、６−ＯＨＤＡ誘発パーキンソン病動物モデルにおける対照グループ、６−ＯＨＤＡグループ、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の神経保護効果の比較を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用及び調製において種々の改良及び変更をすることができることは、当業者に明らかである。
【００５５】
本発明は、次の実施例によって、より明確に説明される。しかしながら、本発明が、いかなる方法においてこれらの実施例に限定されないことを理解する必要がある。
【００５６】
次の参考例、実施例、及び試験例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに説明することが意図される。
【実施例】
【００５７】
（実施例１．ハチ毒粗精製抽出物の調製）
ミツバチから回収した１０．０ｇの乾燥ハチ毒を水中で溶解し、シリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＲＣ １５， ０．２０ ｍｉｃｒｏｍ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社（Ｇｅｒｍａｎｙ）製）を使用し、ろ過によって不純物を除去した。そのろ液を凍結乾燥装置（ＦＤＣＦ−１２０１２， Ｏｐｅｒｏｎ社（Ｋｏｒｅａ）製）で乾燥して、９．７６ｇの乾燥ハチ毒粗精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１」と表す）を得た。乾燥粉末を次の試験の試験試料をして使用した。
【００５８】
（実施例２．ゲルろ過クロマトグラフィを使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物１００ｍｇを、１．０ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、２０画分を得るために、表１に開示した条件によって、ゲルろ過クロマトグラフィに供した。それぞれの画分をタンパク質透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ ７， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社（ＵＳＡ）製）に加え、該膜を、５００ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）の入った円筒状のガラスフラスコに浸漬して、９０分間撹拌しながら透析を行った。透析による脱塩工程終了後、該膜内に含まれる脱塩溶液を、凍結乾燥機（ＦＤＣＦ−１２０１２， Ｏｐｅｒｏｎ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して３日間凍結乾燥し、それぞれの精製画分を回収して、７４ｍｇのハチ毒精製抽出物（収率：７４％）（以下、「ＨＰ−０１Ｇ」と表す）を得た。
表１
【００５９】
【００６０】
表７に開示した条件によって、ＨＰＬＣを使用して、ＨＰ−０１及びＨＰ−０１Ｇの成分を分析した。その結果を表２に示した。
【００６１】
表２のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％、ＨＰ−０１Ｇ中にそれぞれ、１２．４％、４８．４％、４．３％、０．９％、１．４％及び０．４％であることが確認された。
表２
【００６２】
【００６３】
（実施例３．塩析法を使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物１００ｍｇを、５．０ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、２０ｍｇ／ｍｌに調整し、３０％硫酸アンモニウム溶液となるように、室温で１時間撹拌しながら、硫酸アンモニウムを滴下することによって、その溶液を塩溶に供した。その溶液をさらに室温で１時間撹拌し、８０％溶液となるように、硫酸アンモニウムを滴下することによって、塩析に供した。
【００６４】
その溶液を０℃で２時間静置して、十分な塩析時間を付与し、超速遠心分離機（Ｕｌｔｒａ ５．０， Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して、１５，０００ｒｐｍの速度で１５分間遠心分離した。上清を回収し、沈澱を蒸留水５ｍｌ（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、それぞれを脱塩及び凍結乾燥して、１９ｍｇの上清精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１ＡＬ」と表す）と、６２ｍｇの沈澱精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１ＡＰ」と表す）を得た（全収率：８１％）。
【００６５】
ＨＰ−０１ＡＬ及びＨＰ−０１ＡＰの成分を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって分析した。その結果を表３に示した。
【００６６】
表３のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０１ＡＬ中にそれぞれ、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％、８．４％、３．１％及び１．２％、ＨＰ−０１ＡＰ中にそれぞれ、１３．４％、５３．６％、５．１％、＜０．１％、＜０．１％及び＜０．１％、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％であることが確認された。
表３
【００６７】
【００６８】
（実施例４．溶媒析出法を使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物１００ｍｇを、２．５ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、−２０℃に維持したエタノールをそれに加えて、１０ｍｌの７５％（ｖ／ｖ）エタノールに調整した。
【００６９】
その溶液を０℃で２時間静置して、十分な溶媒析出時間を付与し、超速遠心分離機（Ｕｌｔｒａ ５．０， Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して、１５，０００ｒｐｍの速度で１５分間遠心分離した。上清及び沈澱物を回収し、それぞれを脱塩及び凍結乾燥して、１３ｍｇの上清精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１ＳＬ」と表す）と、６９ｍｇの沈澱精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１ＳＰ」と表す）を得た（全収率：８２％）。
【００７０】
ＨＰ−０１ＳＬ及びＨＰ−０１ＳＰの成分を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって分析した。その結果を表４に示した。
【００７１】
表４のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０１ＳＬ中にそれぞれ、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％、１２．１％、６．４％及び２．２％、ＨＰ−０１ＳＰ中にそれぞれ、７．８％、５６．４％、５．８％、＜０．１％、＜０．１％及び＜０．１％、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％であることが確認された。
表４
【００７２】
【００７３】
（実施例５．超速遠心分離機を使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物１００ｍｇを、１０ｍｌとなるように蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、試料を５０ｋＤａの膜フィルターを装備したカートリッジに加えた（カートリッジ、Ｃｅｎｔｒｐｒｅｐ ＹＭ−５０， Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製）。該試料を、超速遠心分離機（Ｕｌｔｒａ ５．０， Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して、３，０００Ｇの速度でさらに３０分間遠心分離し、２つの異なる画分、すなわち、５０ｋＤａより高い分子量である高分子量画分（以下、「ＨＰ−０２Ａ５０」と表す）と、５０ｋＤａ未満の分子量である低分子量画分以下、「ＨＰ−０２Ｂ５０」と表す）を得た。
【００７４】
該５０ｋＤａ未満の分子量である低分子量画分を、１０ｋＤａの膜フィルターを装備したカートリッジに加えた（カートリッジ、Ｃｅｎｔｒｐｒｅｐ ＹＭ−１０， Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製）。試料を、超速遠心分離機（Ｕｌｔｒａ ５．０， Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して、３，０００Ｇの速度でさらに３０分間遠心分離し、２つの異なる画分、すなわち、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量である高分子量画分（以下、「ＨＰ−０３」と表す）と、１０ｋＤａ未満の分子量である低分子量画分以下、「ＨＰ−０４」と表す）を得た。
【００７５】
回収した画分を凍結乾燥し、１０ ｍｇのＨＰ−０２Ａ５０、６２ ｍｇのＨＰ−０３、及び１２ ｍｇのＨＰ−０４をそれぞれ得た（全収率：８４％）。
【００７６】
ＨＰ−０２Ａ５０、ＨＰ−０３及びＨＰ−０４の成分を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって分析した。その結果を表５に示した。
【００７７】
表５のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０２Ａ５０中にそれぞれ、７６．２％、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％及び＜０．１％；ＨＰ−０３中にそれぞれ、＜０．１％、４３．２％、６．２％、＜０．１％、＜０．１％及び＜０．１％；及び、ＨＰ−０４中にそれぞれ、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％、１２．８％、８．１％及び１．３％、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％であることが確認された。
表５
【００７８】
【００７９】
（実施例６．透析法を使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物５００ｍｇを、電子天秤（ＣＰ２２５Ｄ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社（Ｇｅｒｍａｎｙ）製）で秤量し、２ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解した。試料をタンパク質透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ ７， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社（ＵＳＡ）製）に加え、該膜を、２００ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）の入った円筒状のガラスフラスコに浸漬して、９０分間撹拌しながら透析を行った。透析による脱塩工程終了後、該膜内に含まれる脱塩溶液を、凍結乾燥機（ＦＤＣＦ−１２０１２， Ｏｐｅｒｏｎ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して３日間凍結乾燥し、４４０ｍｇのハチ毒精製抽出物（収率：８８％）（以下、「ＨＰ−０５」と表す）を得た。
【００８０】
ＨＰ−０５の成分を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって分析した。その結果を表６に示した。
【００８１】
表６のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０５中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％であることが確認された。
表６
【００８２】
【００８３】
（試験例１．メリチンの量の測定）
ハチ毒の主成分であるメリチンの量を測定するために、ハチ毒のメリチンの量を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって測定した。その結果を次の数式１を使用して分析した。
【００８４】
数１
ＡＭ（％）＝ＡＴ（ｍｇ） Ｘ ＰＳ（％）／１００ Ｘ （ＰＭＳＭ）／（ＰＭＳＴ） Ｘ １００／ＡＳＳ（ｍｇ）
ＡＭ：メリチン（Ｃ１３１Ｈ２２９Ｎ３９Ｏ３１）の量
ＡＴ：標準の量
ＰＳ：標準の純度
ＰＭＳＭ：試料中のメリチンのピーク面積
ＰＭＳＴ：標準中のメリチンのピーク面積
ＡＳＳ：サンプリング試料の量
表７
【００８５】
【００８６】
図１のとおり、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５中のメリチンの量はそれぞれ、４０．５％及び４３．７％である。
【００８７】
（試験例２．神経芽腫細胞系を使用するハチ毒の神経保護活性）
ハチ毒抽出物の神経保護活性を評価するために、ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を使用して、手順（Ｙｏｓｈｉｈｉｓａ Ｋｉｔａｍｕｒａら：１−メチル−４−フェニルピリジニウム誘発ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のアポトーシス死に対する抗パーキンソン病薬の保護効果（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ−Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｎｉａｎ ｄｒｕｇｓ Ｔａｌｉｐｅｘｏｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｍｉｐｅｘｏｌｅ ａｇａｉｎｓｔ 『ｃ（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ｃ』 ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｓ）， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５４ ｐｐ１０４６−１０５４， １９９８）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の神経保護活性を測定した。
【００８８】
ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系（韓国細胞株バンク、大韓民国）を、１０％ウシ胎仔血清及び１％抗生物質−抗真菌剤溶液を含有する最小必須培地で、３７℃、６％ ＣＯ２雰囲気下で培養した。
【００８９】
細胞を４８穴プレートで、１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で２４時間培養し、種々の濃度のＨＰ−０１（０， １， １０， １００ｎｇ／ｍｌ）及びＨＰ−０５（０．８８， ８．８， ８８ｎｇ／ｍｌ）で処理し、３時間培養した。
【００９０】
１ｍＭ ＭＰＰ＋（Ｎ−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン；Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）で処理し、２４時間培養した。５ｇのＭＴＴ溶液（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、５ ｍｇ／ｍｌとなるように１ＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で溶解し、該細胞を０．０５ ｍｇ／ｗｅｌｌになるように３７℃で４時間処理した。培養後、分光計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＰＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ社（ＵＳＡ）製）を使用して、５４０ｎｍで、試料の吸光度を測定した。
【００９１】
結果としては、図２のとおり、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５が共に、ニューロン細胞死を顕著に阻害し、強力な神経保護活性を有することが確認された（図２参照）。
【００９２】
（試験例３．ＭＰＴＰ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用するハチ毒の神経保護活性）
ハチ毒抽出物の神経保護活性を評価するために、ＭＰＴＰ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用して、手順（Ｖｅｒｎｉｃｅ Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｌｅｗｉｓ及びＳｅｒｇｅ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ：パーキンソン病のＭＰＴＰマウス方式のプロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＭＰＴＰ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２（１） ｐｐ．１４１−１５１， ２００７）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の神経保護活性を測定した。
【００９３】
体重２３〜２６ｇの１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｓａｍｔａｋｏ社（Ｋｏｒｅａ））を、使用前に１週間環境に順応させた。飼育部屋を自動照明システムによって、午前７時から午後７時までの１２時間、温度を２４℃に調整して制御し、該マウスに、水及び餌を自由に利用できるようにした。
【００９４】
パーキンソン病誘発動物モデルを用意するために、該マウスに、食塩水中ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、３０ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、０．０２ｍｌの０．０５％試料液（ＨＰ−０１、ＨＰ−０５）と共に、２４時間毎に５日間、筋肉内注射した。同様に、負の対照として、食塩水を該マウスに注射した。ＭＰＴＰ誘発によるドーパミン作動性ニューロン系統が損傷するか否か、及びハチ毒処置が該系統を保護することができるか否かについて調査するために、ＭＰＴＰ処置の終了時に、免疫組織化学的染色法を使用して、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）のＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）発現の変化を観察した。
【００９５】
結果としては、図３のとおり、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５で処置したグループが、ＭＰＴＰ単独処置グループ（パーキンソン病誘発グループ）と比較して、強力な神経保護活性を示すが、ＴＨ陽性グループの数、及びＭＰＴＰで腹腔内処置したグループのニューロンは、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）で急激に減少することが確認された（図３参照）。
【００９６】
ＭＰＴＰ処置グループの黒質（ＳＮ）に含まれるＴＨ陽性細胞の数は、正常グループと比較して、顕著に減少したが、ＨＰ−０１で処置したグループは、ドーパミン作動性ニューロンに対して保護効果を示した。特に、ＨＰ−０５で処置したグループは、試料中で最も強力な神経保護活性を示し（ＭＰＴＰに対してｐ＜ ０．０５）、また、該ＨＰ−０５で処置したグループは、ＭＰＴＰ処置グループと比較して、吸光度（ＯＤ）の値が増加する傾向を示した。したがって、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５が共に、退行性脳疾患とパーキンソン病の治療に有用であり得ることが確認された。
【００９７】
（試験例４．ＭＰＴＰ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用する、ミクログリア細胞の活性化に対するハチ毒の阻害効果）
ミクログリア細胞の活性化に対するハチ毒抽出物の阻害効果を評価するために、ＭＰＴＰ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用して、手順（Ｖｅｒｎｉｃｅ Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｌｅｗｉｓ及びＳｅｒｇｅ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ：パーキンソン病のＭＰＴＰマウス方式のプロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＭＰＴＰ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２（１） ｐｐ．１４１−１５１， ２００７；Ｅｒｗｉｎ ｂｅｚａｒｄら：パーキンソン病の遅い発達を再生する慢性ＭＰＴＰモデル；サルの非運動症状の発達（Ａ ｃｈｒｏｎｉｃ ＭＰＴＰ ｍｏｄｅｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｓｌｏｗ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ； ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｎｋｅｙ）， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．， ７６６ ｐｐ．１０７−１１２， １９９７）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の阻害効果を決定した。
【００９８】
体重２３〜２６ｇの１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｓａｍｔａｋｏ社（Ｋｏｒｅａ））を、使用前に１週間環境に順応させた。飼育部屋を自動照明システムによって、午前７時から午後７時までの１２時間、温度を２４℃に調整して制御し、該マウスに、水及び餌を自由に利用できるようにした。
【００９９】
パーキンソン病誘発動物モデルを用意するために、該マウスに、食塩水中ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、３０ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、０．０２ｍｌの０．０５％試料液（ＨＰ−０１、ＨＰ−０５）と共に、２４時間毎に５日間、筋肉内注射した。同様に、負の対照として、食塩水を該マウスに注射した。ＭＰＴＰ誘発によるドーパミン作動性ニューロン系統が損傷するか否か、及びハチ毒処置が該系統を保護することができるか否かについて調査するために、ＭＰＴＰ処置の終了後７日目で、免疫組織化学的染色法を使用して、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）のＣＤ１１Ｂで染色されたミクログリア細胞の変化を観察した。
【０１００】
結果としては、図４のとおり、ＨＰ−０１で処置したグループのミクログリア細胞、ＴＨ陽性細胞、及びニューロン細胞の数が顕著に減少し、また、ＨＰ−０５で処置したグループは、いずれの細胞で減少を示さなかったが、多くのミクログリア細胞は、ＭＰＴＰ処置グループでみられた（図４参照）。
【０１０１】
ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の分子生物学的機構を検討するために、ＣＤ１１Ｂの変化、ミクログリア細胞マーカーを決定し、ＭＰＴＰ誘発パーキンソン病動物モデルのミクログリア細胞の活性が増加したが、ＨＰ−０５で処置したグループは、ミクログリア細胞の活性を示さなかった。結果では、ＨＰ−０５が、脳の炎症反応だけでなく、ミクログリア細胞の活性化も阻害することが確認された。
【０１０２】
（試験例５．６−ＯＨＤＡ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用する、異常な循環行動の変化に対するハチ毒の阻害効果）
異常な循環行動の変化に対するハチ毒抽出物の阻害効果を評価するために、６−ＯＨＤＡ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用して、手順（Ａｎｄｒｅａｓ Ｓｃｈｏｂｅｒ：パーキンソン病の古典的毒素誘発動物モデル：６−ＯＨＤＡ及びＭＰＴＰ（Ｃｌａｓｓｉｃ ｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ６−ＯＨＤＡ ａｎｄ ＭＰＴＰ）， Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．， ３１８ ｐｐ．２１５−２２４， ２００４）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の効果を決定した。
【０１０３】
体重２００〜２２０ｇの雄ＳＤラット（Ｓａｍｔａｋｏ社（Ｋｏｒｅａ））を、使用前に１週間環境に順応させた。飼育部屋を自動照明システムによって、午前７時から午後７時までの１２時間、温度を２４℃に調整して制御し、該ラットに、水及び餌を自由に利用できるようにした。
【０１０４】
パーキンソン病誘発動物モデルを用意するために、ペントバルビタール注射（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を、麻酔として使用し、６−ＯＨＤＡ溶液（２５μｇ／４μｌ、０．０１％ Ｌ−アスコルビン酸含有、Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、使用前に、暗くした冷蔵庫に保存した。６−ＯＨＤＡを、２５μｇ／４μｌの用量で、１μｌ／分の速度で、２６ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジによって、特定の脳領域（前頂部に基づいて、ＡＰ−０．７ｍｍ，ｍｌ−２．６ｍｍ，Ｖ−４．５ｍｍ）に注射した。
【０１０５】
６−ＯＨＤＡを該ラットに注射した後、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５を、処置後１４日目及び６−ＯＨＤＡの注射１週後に該ラットに投与し、アポモルヒネ（０．５ｍｇ／ｋｇ、皮下、Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を該ラットに注射した。該ラットの回転数を、自動ロトメーターチャンバを使用して、３０及び６０分毎に測定した。
【０１０６】
結果としては、６−ＯＨＤＡ処置グループと比較して、ＨＰ−０１で処置したグループの循環行動が減少し、特に、ＨＰ−０５で処置したグループが、異常な循環行動を強く阻害することが確認された。したがって、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５が共に、退行性脳疾患とパーキンソン病の治療に有用であり得ることが確認された。
【０１０７】
（実施例６．６−ＯＨＤＡ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用するハチ毒の神経保護効果）
ハチ毒抽出物の神経保護活性を評価するために、６−ＯＨＤＡ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用して、手順（Ａｎｄｒｅａｓ Ｓｃｈｏｂｅｒ：パーキンソン病の古典的毒素誘発動物モデル：６−ＯＨＤＡ及びＭＰＴＰ（Ｃｌａｓｓｉｃ ｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ６−ＯＨＤＡ ａｎｄ ＭＰＴＰ）， Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．， ３１８ ｐｐ．２１５−２２４，２００４）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の神経保護効果を決定した。
【０１０８】
体重２００〜２２０ｇの雄ＳＤラット（Ｓａｍｔａｋｏ社（Ｋｏｒｅａ））を、使用前に１週間環境に順応させた。飼育部屋を自動照明システムによって、午前７時から午後７時までの１２時間、温度を２４℃に調整して制御し、該ラットに、水及び餌を自由に利用できるようにした。
【０１０９】
パーキンソン病誘発動物モデルを用意するために、ペントバルビタール注射（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を、麻酔として使用し、６−ＯＨＤＡ溶液（２５μｇ／４μｌ、０．０１％ Ｌ−アスコルビン酸含有、Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、使用前に、暗くした冷蔵庫に保存した。６−ＯＨＤＡを、２５μｇ／４μｌの用量で、１μｌ／分の速度で、２６ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジによって、特定の脳領域（前頂部に基づいて、ＡＰ−０．７ ｍｍ，ｍｌ−２．６ ｍｍ， Ｖ−４．５ｍｍ）に注射した。
【０１１０】
６−ＯＨＤＡ誘発によるドーパミン作動性ニューロン系統が損傷するか否か、及びハチ毒処置が該系統を保護することができるか否かについて調査するために、６−ＯＨＤＡ処置の終了時に、ＴＨ免疫組織化学的染色法を使用して、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）のドーパミン作動性細胞を観察した。
【０１１１】
図６のとおり、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５で処置したグループが、ＳＴでの６−ＯＨＤＡ処置グループと比較して、強力な神経保護活性を示すが、ＴＨ陽性グループの数、及び６−ＯＨＤＡで処置したグループのニューロンは、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）で急激に減少した（図６参照）。
【０１１２】
６−ＯＨＤＡ処置グループの黒質（ＳＮ）に含まれるＴＨ陽性細胞の数は、正常グループと比較して、顕著に減少したが、ＨＰ−０１で処置したグループは、ドーパミン作動性ニューロンに対して保護効果を示した。特に、ＨＰ−０５で処置したグループは、黒質（ＳＮ）及び線条体（ＳＴ）の試験で、ＨＰ−０１で処置したグループよりも強力な神経保護活性を示した。したがって、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５が共に、退行性脳疾患とパーキンソン病の治療に有用であり得ることが確認された。
【０１１３】
（試験例７．臨床試験）
パーキンソン病患者に対するハチ毒抽出物の治療効果を明らかにするために、次の臨床試験を行った。
【０１１４】
２０μｇのＨＰ−０１を、４人の男性と６人の女性から成る１０人のボランティアの脚の特定の経穴（ポイントＧＢ ３４）に、３日間隔で１５日間、筋肉内注射した。試験の前後に、一般規格、すなわちＵＰＤＲＳ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ）によって、試験試料の治療活性を測定した。ＵＰＤＲＳの基準を４つのグループに分類した。すなわち、ＵＰＤＲＳ Ｉ（言及、行動、気分：１〜４の内容、全スコア１６ポイント）；ＵＰＤＲＳ ＩＩ（日常生活動作：５〜１７の内容、全スコア５２ポイント）；ＵＰＤＲＳ ＩＩＩ（運動器健診：１８〜３１の内容、全スコア１０８ポイント）；及び、ＵＰＤＲＳ ＩＶ（運動障害：３２〜４２の内容、全スコア３２ポイント）である。スコアが高くなると、疾患の重症度が悪化するとカウントされる。
【０１１５】
評価は、試験後のボランティアと評価者間のインタビューによって決定し、ＵＰＤＲＳの変化は、該評価によって互いに比較した。
【０１１６】
結果では、ボランティア間で個人差が存在するが、ほとんどのボランティアは、全ＵＰＤＲＳ値が約１０ポイント減少することを示した（表８及び９参照）。
表８
【０１１７】
表９
【０１１８】
【０１１９】
ＳＰＳＳ／ＰＣ＋パッケージを使用して、一元配置ＡＮＯＶＡ分析によって試験結果を分析し（ｐ＜０．０５）、ダンカンの多重試験によって事後多重比較を分析した。それぞれのグループの値を平均±ＳＤで表した。
【０１２０】
以下に、製剤化方法及び賦形剤の種類を説明するが、本発明は、それらに限定されない。代表的な調製例を次に説明した。
【０１２１】
（粉末剤の調製）
ＨＰ−０１の乾燥粉末３００ｍｇ
ラクトース１００ｍｇ
タルク１０ｍｇ
上述の成分を混合し、密封包装に充填することによって、粉末調製物を調製した。
【０１２２】
（錠剤の調製）
ＨＰ−０２Ａ５０の乾燥粉末５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉１００ｍｇ
ラクトース１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
上述の成分を混合し、錠剤化することによって、錠剤調製物を調製した。
【０１２３】
（カプセル剤の調製）
ＨＰ−０３の乾燥粉末５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉１００ｍｇ
ラクトース１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
上述の成分を混合し、従来のゼラチン調製法によりゼラチンカプセルに充填することによって、カプセル調製物を調製した。
【０１２４】
（注射液の調製（１））
ＨＰ−０５の乾燥粉末２ｍｇ
注射最適量の蒸留水
最適量のｐＨ調整剤
有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調整した後、すべての成分を２ｍｌのアンプルに充填し、従来の注射液調製法により滅菌することによって、注射液調製物を調製した。
【０１２５】
（注射液の調製（２））
ＨＰ−０１の乾燥粉末１ｍｇ
注射最適量の蒸留水
最適量のｐＨ調整剤
有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調整した後、すべての成分を１ｍｌのアンプルに充填し、従来の注射液調製法により滅菌することによって、注射液調製物を調製した。
【０１２６】
（注射液の調製（３））
１ｇのＨＰ−０１を１０００ｍｌの生理食塩水中で溶解した。ウイルス、細菌及び他の不純物等の種々の汚染物質を、抗細菌ろ過器を使用して除去した後、すべての溶液を１ｍｌのバイアルに加えた。その溶液を凍結乾燥によって乾燥し、注射液調製物として使用した。
【０１２７】
（注射液の調製（４））
ＨＰ−０５の乾燥粉末０．８８ｍｇ
上述の成分を滅菌バイアルに充填し、注射用の生理食塩水で希釈した。
【０１２８】
（注射液の調製（５））
ＨＰ−０５の乾燥粉末０．８８ｍｇ
上述の成分を注射用の生理食塩水中で溶解した。ウイルス、細菌及び他の不純物等の種々の汚染物質を、抗細菌ろ過器を使用して除去した後、すべての溶液を１ｍｌのバイアルに加えた。その溶液を凍結乾燥によって乾燥し、注射液調製物として使用した。
【０１２９】
このように記載された本発明では、同様のものを多くの方法で変更してもよい。このような変更は、本発明の精神及び範囲を逸脱するとはみなされず、すべてのこのような改良は、当業者によって明らかなように、次の特許請求の範囲の範囲内に含まれるように意図される。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明に記載されるとおり、退行性脳疾患の動物モデルを使用することによって、ハチ毒精製抽出物は、ミクログリア細胞の活性化、及び異常な循環行動に対する強力な阻害効果と、これらによる強力な細胞の保護活性を示し、薬剤として退行性脳疾患の治療及び予防に有用であり得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、退行性脳疾患を予防及び治療するためのハチ毒精製抽出物を含む組成物、並びにその使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
２０世紀において、ヒトの平均寿命が、ライフサイエンスと医薬の急速な発展に伴って増加しているため、高齢者の人口比率の増加を含む新たな社会問題が顕著となっている。特に、脳卒中、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）等の老人性ニューロン疾患は、ニューロン系統の致命的な機能障害であり、増加している。
【０００３】
特に、パーキンソン病は、脳の黒質緻密部のニューロン死によって生じ、ニューロン疾患を頻繁に生じる。特に、特発性パーキンソン病は、パーキンソン病患者間で８０％超を占め、高齢者の重度の疾患によって生じる病因である（Ｅｎｎｉｏ Ｅｓｐｏｓｉｔｏら：パーキンソン病の非ステロイド抗炎症剤（Ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．， ２０５， ｐｐ２９５−３１２， ２００７）。
【０００４】
近年の高齢化社会により、パーキンソン病患者数はこれまで増加し、２０１３年の薬市場は、１３９％（すなわち、２００６年と比較して２３億７０００万ドル（米ドル））増加すると考えられている。
【０００５】
現在、パーキンソン病治療の代表的な薬剤であるレボドーパを使用する薬物治療は、これまで従来利用されている。しかしながら、例えば、一貫性のない投与の必要性、基本的な治療等に対する治療の限界又は不都合（例えば、ドーパミン投与によって生じたニューロン損傷、薬物不耐性による低減した薬剤の効能、不随意運動、悪化した運動障害、長期の薬物治療等に関連した他の逆作用の疾患等の治療後の合併症）といった幾つかの問題がある（Ｊｕｄｉｔｈ Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ：パーキンソン病入門（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）， Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ Ｎｕｒｓｉｎｇ， ２３（２）， ｐｐ６９−７３， ２００２；Ｆａｂｉｏ Ｄａｎｉｓｉ：患者の機能と生活の質を改善するパーキンソン病治療の戦略（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）， Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ， ５７（３）， ｐｐ４６−５０， ２００２）。
【０００６】
したがって、新たな抗パーキンソン病薬を開発すること、及び近年の開発が依然として必要であり、研究は、種々のメカニズム（例えば、ドーパミナージックス（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｓ）、ドーパミンアゴニスト、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬、アデノシンａ２ａ受容体拮抗剤；ドーパミン受容体アゴニスト、ＮＭＤＡ受容体アゴニスト、酸化防止剤、ＮＳＡＩＤ、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、神経栄養因子等の神経保護薬；及び、細胞／遺伝子治療、幹細胞分化、移植等の他の治療方法（Ｊｕｎ Ｔａｋａｈａｓｈｉ：パーキンソン病の幹細胞治療（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．， ７（６）， ｐｐ６６７−６７５， ２００７））の態様に焦点を置いている。
【０００７】
ハチ毒は、ミツバチ、バンブルビー（ｂｕｍｂｌｅ ｂｅｅ）、コハナバチ等の種々のハチの腹部から滲出したハチの毒液であり、ｐＨ ５．２で苦味を有する弱い芳香族性を示す。ハチ毒が、ＮＯ、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−ａ等の因子の増加によって生じる炎症経路、及び炎症性遺伝子の発現を妨げ、これによって、神経痛、リューマチ、背部痛等の種々の炎症性疼痛を治療することができる強力な抗炎症活性を発生させることが報告されている（Ｄｏｎｇ Ｊｕ Ｓｏｎら：ハチ毒の抗関節炎、痛みの開放、及び抗癌作用の治療適用、並びにその構成化合物（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， ｐａｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ， ａｎｄ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｅｅ ｖｅｎｏｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １１５， ｐｐ２４６−２７０， ２００７）。約３０％の乾燥生成物、及びメリチン、アパミン、ホスホリパーゼ、アドラピン（ａｄｏｌａｐｉｎｅ）、ヒアルロニダーゼ、ヒスチジン、ヒスタミン等の約７５％のタンパク質が、室温での蒸発後に残存することが報告されている（Ｍｅｉｅｒ Ｊ．らの文献：動物毒の臨床中毒学（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｖｅｎｏｍｓ ａｎｄ ｐｏｉｓｏｎｓ）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９９５）。
【０００８】
しかしながら、上で引用した文献（それらの開示は引用により本明細書中に組み込まれる）のいずれにおいて、精製ハチ毒抽出物の退行性脳疾患の治療効果又は改善効果について、報告又は開示されていない。
【０００９】
退行性脳疾患に対するハチ毒の治療効果を調査するために、本発明の発明者らは、退行性脳疾患の動物モデルを使用する神経保護活性、ミクログリア細胞活性化の阻害効果、及び異常なスピニングモータ等の幾つかの動物モデル試験、並びにヒト臨床実験と共にヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系を集中的に実行した。そして、ハチ毒精製抽出物が、退行性脳疾患の動物モデルを使用することによる、ミクログリア細胞の活性化、及び異常な循環行動に対する強力な阻害効果と、強力な細胞の保護活性を示すことを確認することによって、本発明を完了した。
【００１０】
本発明のこれら及び他の目的は、以下に提供される本発明の詳細な開示から明らかになる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅｎｎｉｏ Ｅｓｐｏｓｉｔｏら、Ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．， ２０５， ｐｐ２９５−３１２， ２００７
【非特許文献２】Ｊｕｄｉｔｈ Ｌ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ Ｎｕｒｓｉｎｇ， ２３（２）， ｐｐ６９−７３， ２００２
【非特許文献３】Ｆａｂｉｏ Ｄａｎｉｓｉ， Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐａｔｉｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ， Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ， ５７（３）， ｐｐ４６−５０， ２００２
【非特許文献４】Ｊｕｎ Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．， ７（６）， ｐｐ６６７−６７５， ２００７
【非特許文献５】Ｄｏｎｇ Ｊｕ Ｓｏｎら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ａｒｔｈｒｉｔｉｓ， ｐａｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ， ａｎｄ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｅｅ ｖｅｎｏｍ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １１５， ｐｐ２４６−２７０， ２００７
【非特許文献６】Ｍｅｉｅｒ Ｊ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｖｅｎｏｍｓ ａｎｄ ｐｏｉｓｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を予防する治療有効量の有効成分としてのハチ毒精製抽出物を含む、医薬組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、哺乳動物又はヒトのニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療及び予防する医薬組成物の調製のための上述した抽出物の使用も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、ニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療及び予防する有効成分としてのハチ毒精製抽出物を含む、医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１５】
本明細書に開示される用語「精製抽出物」は、ミツバチ、バンブルビー（ｂｕｍｂｌｅ ｂｅｅ）、コハナバチ等のハチ毒の粗精製抽出物及び精製抽出物（好ましくは、ミツバチのハチ毒精製抽出物）を含む。
【００１６】
具体的には、上述のハチ毒粗精製抽出物は、次の工程を含む手順によって調製した抽出物を含み得る：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解した後、その溶液をろ過して、該溶液から不純物を除去し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、本発明のハチ毒粗精製抽出物を得る工程。
【００１７】
上述のハチ毒精製抽出物は、次の工程を含む手順によって調製した抽出物を含み得る：上述の工程で調製した乾燥ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解した後、その溶液を、塩析法、溶媒析出法、及び遠心分離又は透析を行うための透析膜ろ過から選択される少なくとも１つの精製工程に供し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程。
【００１８】
好ましくは、該ハチ毒精製抽出物は、次の工程を含む手順によって調製した抽出物を含み得る：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解して、ハチ毒水溶性抽出物を得る工程（第２工程）；と、その溶液を、膜透析を使用する透析膜ろ過に供して、該膜に含まれる精製抽出物を回収し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、本発明以外の他のハチ毒抽出物よりも強力な薬理効果のある、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程（第３工程）。
【００１９】
非常に強力な薬理効果のある本発明のハチ毒精製抽出物は、有効成分として、約３０％〜９０％（ｗ／ｗ％）、好ましくは約３５％〜８０％（ｗ／ｗ％）、より好ましくは約４０％〜６０％（ｗ／ｗ％）の量のメリチンを含み得る。
【００２０】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物のニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための治療剤の調製におけるハチ毒精製抽出物の使用を提供することを目的とする。
【００２１】
本発明は、治療有効量のハチ毒精製抽出物を、医薬として許容し得るそのキャリアと共に、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物のニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療又は予防する方法を提供することを目的とする。
【００２２】
本明細書に開示される用語「退行性脳疾患」は、アルツハイマー型痴呆、脳血管性痴呆、Ｐｉｃｋ病、クロイツフェルト−ヤコブ病、頭部損傷によって生じた痴呆、パーキンソン病等、好ましくは、ミクログリア細胞の活性化過剰によって生じたパーキンソン病を含む。
【００２３】
本発明のハチ毒精製抽出物は、詳細には次のように調製することができる。
【００２４】
該ハチ毒精製抽出物は、次の工程を含む手順によって調製することができる： ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物（以下、「ＨＰ−１」と表す）を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、その溶液を、塩析法、溶媒析出法、及び遠心分離又は透析を行うための透析膜ろ過から選択される少なくとも１つの精製工程に供し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程（第２工程）。
【００２５】
本発明の第１の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、１０．２％のホスホリパーゼ、４０．５％のメリチン、３．８％のアパミン、１．６％のヒスタミン、１．１％のドーパミン、及び０．３％のアドレナリンを含む、ハチ毒粗精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１」と表す）を得る工程。
【００２６】
本発明の第２の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含むハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解して、ハチ毒水溶性抽出物を得る工程（第２工程）；と、その溶液をゲルろ過クロマトグラフィに供した後、膜透析を使用するタンパク質透析膜ろ過に供して、塩析を行う工程（第３工程）；と、該膜に含まれる精製抽出物を回収し、凍結乾燥によってそのろ液を乾燥して、１２．４％のホスホリパーゼ、４８．４％のメリチン、４．３％のアパミン、０．９％のヒスタミン、１．４％のドーパミン、及び０．４％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒粗精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１Ｇ」と表す）を得る工程（第４工程）。
【００２７】
本発明の第３の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解して、ハチ毒水溶性抽出物を得る工程（第２工程）；と、 その溶液を塩溶に供した後、硫酸アンモニウム等の塩を使用する塩析を行う工程（第３工程）；と、その溶液を遠心分離及び凍結乾燥し、上清を得て、上清中に、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、８．４％のヒスタミン、３．１％のドーパミン、及び１．２％のアドレナリンを含み（以下、「ＨＰ−０１ＡＬ」と表す）、そして、沈殿物中に、１３．４％のホスホリパーゼ、５３．６％のメリチン、５．１％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む（以下、「ＨＰ−０１ＡＰ」と表す）、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程（第４工程）。
【００２８】
本発明の第４の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール若しくはブタノール等の低級アルコール、又はこれらの混合物から選択される析出溶媒（好ましくは５０−９０％エタノール、より好ましくは６０−８０％エタノール）中で溶解して、析出物を得る工程（第２工程）；と、その溶液を遠心分離及び凍結乾燥し、上清を得て、上清中に、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、１２．１％のヒスタミン、６．４％のドーパミン、及び２．２％のアドレナリンを含み（以下、「ＨＰ−０１ＳＬ」と表す）、そして、沈殿物中に、７．８％のホスホリパーゼ、５６．４％のメリチン、５．８％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む（以下、「ＨＰ−０１ＳＰ」と表す）、本発明のハチ毒精製抽出物を得る工程（第３工程）。
【００２９】
本発明の第５の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール若しくはブタノール等の低級アルコール、又はこれらの混合物から選択される析出溶媒（好ましくは水）中で溶解する工程（第２工程）；と、その溶液を、５０ｋＤａの膜フィルターを装備した超遠心分離機を使用する超遠心分離に供して、７６．２％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、５０ｋＤａより高い高分子量のハチ毒精製抽出物（以下、「ＨＰ−０２Ａ５０」と表す）を得る工程（第３工程）；と、１０ｋＤａ膜フィルターを装備した超遠心分離機を使用することによって、５０ｋＤａ未満の低分子量の画分を再度遠心分離して、＜０．１％のホスホリパーゼ、４３．２％のメリチン、６．２％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの高分子量のハチ毒精製抽出物（以下、「ＨＰ−０３」と表す）、並びに、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、１２．８％のヒスタミン、８．１％のドーパミン、及び１．３％のアドレナリンを含む、１０ｋＤａ未満の低分子量のハチ毒精製抽出物（以下、「ＨＰ−０４」と表す）を得る工程。
【００３０】
本発明の第６の好ましい実施態様において、本発明は、次の工程を含む手順によるハチ毒精製抽出物を調製する方法も提供する：ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール（好ましくは水）中で溶解し、ろ過して不純物を除去し、凍結乾燥によって乾燥して、ハチ毒粗精製抽出物を得る工程（第１工程）；と、第１工程で調製したハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解して、ハチ毒水溶性抽出物を得る工程（第２工程）；と、その溶液を、タンパク質透析膜を使用する透析に供する工程（第３工程）；と、該膜内の溶液を回収し、該溶液を凍結乾燥して、０．２％のホスホリパーゼ、４０．５％のメリチン、３．８％のアパミン、１．６％のヒスタミン、３．１％のドーパミン、及び０．３％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒精製抽出物（以下、「ＨＰ−０５」と表す）を得る工程。
【００３１】
したがって、本発明は、本発明のハチ毒精製抽出物を得るための上述の方法、及び上述の方法によって調製したハチ毒精製抽出物も提供する。
【００３２】
本発明のハチ毒精製抽出物は、強力な薬理効果があり、有効成分として、約１％〜８０％（ｗ／ｗ％）、好ましくは約３％〜５０％（ｗ／ｗ％）、より好ましくは約５％〜２０％（ｗ／ｗ％）の量のホスホリパーゼ；と、約３０％〜９０％（ｗ／ｗ％）、好ましくは約３５％〜８０％（ｗ／ｗ％）、より好ましくは約４０％〜６０％（ｗ／ｗ％）の量のメリチン；と、約０．１％〜３０％（ｗ／ｗ％）、好ましくは約０．５％〜１５％（ｗ／ｗ％）、より好ましくは約１．０％〜１０％（ｗ／ｗ％）の量のアパミンと、を含み得る。
【００３３】
退行性脳疾患の動物モデルを使用する神経保護活性、ミクログリア細胞活性化の阻害効果、及び異常なスピニングモータ等の幾つかの動物モデル試験、並びにヒト臨床実験と共にヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系によって、ハチ毒精製抽出物が、退行性脳疾患の動物モデルを使用する、ミクログリア細胞の活性化、及び異常な循環行動に対する強力な阻害効果と、強力な細胞の保護活性を示し、薬剤として退行性脳疾患の治療及び予防に有用であり得る。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、該組成物の全重量に基づいて、約０．０１〜５０重量％の上述の抽出物を含み得る。
【００３５】
本発明の他の態様に基づいて、ニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための上述の調製方法によって調製したハチ毒精製抽出物を含む、医薬組成物を提供する。
【００３６】
本発明の別の態様は、ヒトを含む哺乳動物のニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための治療剤の調製における上述の調製方法によって調製したハチ毒精製抽出物の使用である。
【００３７】
本発明は、治療有効量のハチ毒精製抽出物を、医薬として許容し得るそのキャリアと共に、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物のニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療及び予防する方法を提供することを目的とする。
【００３８】
ニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための本発明の組成物は、該組成物の全重量に基づいて、約０．０１〜５０重量％の上述の抽出物を含み得る。
【００３９】
本発明の組成物は、当技術分野で周知の方法の使用に基づいて、従来のキャリア、補助剤又は希釈剤を更に含んでもよい。該キャリアは、使用方法及び適用方法によって、適切な材料として使用することが好ましいが、これに限定されない。適切な希釈剤は、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）で一覧にて記載されている。
【００４０】
次の製剤化方法及び賦形剤は、単なる例示であり、本発明を全く限定するものではない。
【００４１】
本願の組成物を含む医薬製剤は、例えば、固形経口製剤として、凍結乾燥調製物、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、エリキシル剤、丸剤、サシェ剤等の経口剤形；液状経口製剤として、懸濁剤、溶剤、乳剤、シロップ剤、水性薬剤等；クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バーム、パッチ、ペースト、スプレー溶液、エアゾール等の局所用調製物；又は、例えば、坐薬、若しくは滅菌溶液、懸濁剤、凍結乾燥調製物、非水性型注射液等の注射可能な調製物、若しくは水性型注射液（好ましくは滅菌した注射可能な調製物）である、非経口剤形の任意の形態で調製することができる。
【００４２】
本発明による組成物は、医薬として許容し得るキャリア、補助剤若しくは希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アラビアゴム、アルギン、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油）を含む、医薬組成物として提供することができる。該製剤は、溶媒、添加剤、希釈剤、緩衝剤、等張剤、安定剤、酸化防止剤、鎮痛剤、乳化剤、充填剤、凝集防止剤、滑沢剤、湿潤剤、着香料、保存剤等を更に含み得る。具体的には、該溶媒、添加剤又は希釈剤は、滅菌蒸留水、生理食塩水、ｐＨ調整剤、アルブミン、塩化ナトリウム、マンニトール、リンゲル液、グルコース等を含む。粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、エリキシル剤、丸剤、サシェ剤等の該固形経口製剤は、本発明の抽出物と、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチン等の少なくとも１つの補助剤、必要な場合、製剤化するための付加的な添加剤として、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤を混合することによって、調製することができる。懸濁剤、溶剤、乳剤、シロップ剤、水性薬剤等の該液状経口製剤は、本発明の抽出物と、例えば、製剤化するための湿潤剤、着香料、甘味剤、保存剤、水若しくは流動パラフィン等の一般的な希釈剤以外の他のものである少なくとも１つの補助剤を混合することによって、調製することができる。該非経口剤形としては、例えば、滅菌溶液、懸濁剤、凍結乾燥調製物、非水性型注射液、若しくは水性型注射液といった注射可能な製剤は、基剤として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、エチルオラート（ｅｔｈｙｌ ｏｌａｔｅ）等の注射可能なエステルを使用することができる。また、該坐薬は、本発明において、基剤として、ウィテップゾール、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン油、グリセリン−ゼラチン等を使用することができる。
【００４３】
本発明の該組成物は、当技術分野で周知の任意の手順を行うことによって、患者への該組成物投与後の有効成分の急速放出、徐放、又は遅延放出を提供するように、製剤化することができる。
【００４４】
例えば、本発明の組成物は、注射を製造するのに一般に使用する、油、プロピレングリコール、又は他の溶媒中で溶解することができる。キャリアの適切な一例は、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピル等を含むが、これらに限定されない。局所投与において、本発明の抽出物は、軟膏及びクリームの形態で製剤化することができる。
【００４５】
医薬剤形の本発明の組成物は、それらの医薬として許容し得る塩の形態で使用することができ、また、単独又は適切な組み合わせで、及び他の薬学的に活性のある化合物と併用して、使用することもできる。
【００４６】
本発明の抽出物又は組成物の望ましい用量は、対象の症状と体重、剤形、投与の経路と期間によって変動し、当業者によって選択することができる。しかしながら、望ましい結果を得るために、本発明の抽出物を、１マイクログラムから５ ｍｇ／日、好ましくは８マイクログラムから２ｍｇ／日、より好ましくは１６マイクログラムから１ｍｇ／日の量で投与することが一般に推奨される。用量を単回で、又は１日当たり数回に分けて；周期的に（例えば、２日から１週の期間に１回）投与することができるが、これらに限定することは意図されない。本発明の範囲は、当業者によって想到することができる、すべての改良、又は投与量と投与回数の変更、投与経路を含み得る。組成物に関して、本発明の抽出物の量は、該組成物の全重量に基づいて、０．０１〜５０重量％、好ましくは０．５〜４０重量％含み得る。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、種々の経路によって、哺乳動物（ラット、マウス、家畜又はヒト）等の対象動物に投与することができる。投与のすべての方法が考えられ、例えば、投与は、経口的に、直腸内に、又は静脈内、筋肉内、皮下、皮内、鞘内、硬膜外、若しくは脳室内注射によって、行うことができる。
【００４８】
したがって、本発明の抽出物は、毒性及び悪影響がなく、安全に使用することができる。
【００４９】
本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用及び調製において種々の改良及び変更をすることができることは、当業者に明らかである。
【発明の効果】
【００５０】
したがって、本発明の抽出物は、毒性及び悪影響がなく、安全に使用することができる。
【００５１】
本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用及び調製において種々の改良及び変更をすることができることは、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
本発明の上述及び他の目的、特徴及び他の利点は、次の添付の図面を採用すると共に、詳細な説明からより明確に理解される。
【００５３】
【図１】図１は、ＨＰ−０１、ＨＰ−０５、及びメリチン標準のＨＰＬＣクロマトグラム比較を示す。
【図２】図２は、対照グループ、ＭＰＰ＋グループ、及び種々のＨＰ−０１、ＨＰ−０５の濃度のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率を示す。
【図３】図３は、ＭＰＴＰ誘発パーキンソン病動物モデルにおける対照グループ、ＭＰＴＰグループ、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の神経保護活性の比較を示す（Ａ：線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）、Ｂ：ＳＮのドーパミン作動性ニューロンの数の比較、Ｃ：ＳＴのＴＨ染色強度の比較）。
【図４】図４は、ＭＰＴＰ誘発パーキンソン病動物モデルにおけるミクログリア細胞に対する対照グループ、ＭＰＴＰグループ、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の保護効果の比較を表す（矢印：ＣＤ１１Ｂ陽性細胞）。
【図５】図５は、６−ＯＨＤＡ誘発パーキンソン病動物モデルにおける異常循環行動に対する対照グループ、６−ＯＨＤＡグループ、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の阻害効果の比較を示す。
【図６】図６は、６−ＯＨＤＡ誘発パーキンソン病動物モデルにおける対照グループ、６−ＯＨＤＡグループ、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の神経保護効果の比較を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、使用及び調製において種々の改良及び変更をすることができることは、当業者に明らかである。
【００５５】
本発明は、次の実施例によって、より明確に説明される。しかしながら、本発明が、いかなる方法においてこれらの実施例に限定されないことを理解する必要がある。
【００５６】
次の参考例、実施例、及び試験例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに説明することが意図される。
【実施例】
【００５７】
（実施例１．ハチ毒粗精製抽出物の調製）
ミツバチから回収した１０．０ｇの乾燥ハチ毒を水中で溶解し、シリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＲＣ １５， ０．２０ ｍｉｃｒｏｍ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社（Ｇｅｒｍａｎｙ）製）を使用し、ろ過によって不純物を除去した。そのろ液を凍結乾燥装置（ＦＤＣＦ−１２０１２， Ｏｐｅｒｏｎ社（Ｋｏｒｅａ）製）で乾燥して、９．７６ｇの乾燥ハチ毒粗精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１」と表す）を得た。乾燥粉末を次の試験の試験試料をして使用した。
【００５８】
（実施例２．ゲルろ過クロマトグラフィを使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物１００ｍｇを、１．０ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、２０画分を得るために、表１に開示した条件によって、ゲルろ過クロマトグラフィに供した。それぞれの画分をタンパク質透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ ７， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社（ＵＳＡ）製）に加え、該膜を、５００ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）の入った円筒状のガラスフラスコに浸漬して、９０分間撹拌しながら透析を行った。透析による脱塩工程終了後、該膜内に含まれる脱塩溶液を、凍結乾燥機（ＦＤＣＦ−１２０１２， Ｏｐｅｒｏｎ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して３日間凍結乾燥し、それぞれの精製画分を回収して、７４ｍｇのハチ毒精製抽出物（収率：７４％）（以下、「ＨＰ−０１Ｇ」と表す）を得た。
表１
【００５９】
【００６０】
表７に開示した条件によって、ＨＰＬＣを使用して、ＨＰ−０１及びＨＰ−０１Ｇの成分を分析した。その結果を表２に示した。
【００６１】
表２のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％、ＨＰ−０１Ｇ中にそれぞれ、１２．４％、４８．４％、４．３％、０．９％、１．４％及び０．４％であることが確認された。
表２
【００６２】
【００６３】
（実施例３．塩析法を使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物１００ｍｇを、５．０ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、２０ｍｇ／ｍｌに調整し、３０％硫酸アンモニウム溶液となるように、室温で１時間撹拌しながら、硫酸アンモニウムを滴下することによって、その溶液を塩溶に供した。その溶液をさらに室温で１時間撹拌し、８０％溶液となるように、硫酸アンモニウムを滴下することによって、塩析に供した。
【００６４】
その溶液を０℃で２時間静置して、十分な塩析時間を付与し、超速遠心分離機（Ｕｌｔｒａ ５．０， Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して、１５，０００ｒｐｍの速度で１５分間遠心分離した。上清を回収し、沈澱を蒸留水５ｍｌ（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、それぞれを脱塩及び凍結乾燥して、１９ｍｇの上清精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１ＡＬ」と表す）と、６２ｍｇの沈澱精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１ＡＰ」と表す）を得た（全収率：８１％）。
【００６５】
ＨＰ−０１ＡＬ及びＨＰ−０１ＡＰの成分を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって分析した。その結果を表３に示した。
【００６６】
表３のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０１ＡＬ中にそれぞれ、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％、８．４％、３．１％及び１．２％、ＨＰ−０１ＡＰ中にそれぞれ、１３．４％、５３．６％、５．１％、＜０．１％、＜０．１％及び＜０．１％、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％であることが確認された。
表３
【００６７】
【００６８】
（実施例４．溶媒析出法を使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物１００ｍｇを、２．５ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、−２０℃に維持したエタノールをそれに加えて、１０ｍｌの７５％（ｖ／ｖ）エタノールに調整した。
【００６９】
その溶液を０℃で２時間静置して、十分な溶媒析出時間を付与し、超速遠心分離機（Ｕｌｔｒａ ５．０， Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して、１５，０００ｒｐｍの速度で１５分間遠心分離した。上清及び沈澱物を回収し、それぞれを脱塩及び凍結乾燥して、１３ｍｇの上清精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１ＳＬ」と表す）と、６９ｍｇの沈澱精製抽出物（以下、「ＨＰ−０１ＳＰ」と表す）を得た（全収率：８２％）。
【００７０】
ＨＰ−０１ＳＬ及びＨＰ−０１ＳＰの成分を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって分析した。その結果を表４に示した。
【００７１】
表４のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０１ＳＬ中にそれぞれ、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％、１２．１％、６．４％及び２．２％、ＨＰ−０１ＳＰ中にそれぞれ、７．８％、５６．４％、５．８％、＜０．１％、＜０．１％及び＜０．１％、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％であることが確認された。
表４
【００７２】
【００７３】
（実施例５．超速遠心分離機を使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物１００ｍｇを、１０ｍｌとなるように蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解し、試料を５０ｋＤａの膜フィルターを装備したカートリッジに加えた（カートリッジ、Ｃｅｎｔｒｐｒｅｐ ＹＭ−５０， Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製）。該試料を、超速遠心分離機（Ｕｌｔｒａ ５．０， Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して、３，０００Ｇの速度でさらに３０分間遠心分離し、２つの異なる画分、すなわち、５０ｋＤａより高い分子量である高分子量画分（以下、「ＨＰ−０２Ａ５０」と表す）と、５０ｋＤａ未満の分子量である低分子量画分以下、「ＨＰ−０２Ｂ５０」と表す）を得た。
【００７４】
該５０ｋＤａ未満の分子量である低分子量画分を、１０ｋＤａの膜フィルターを装備したカートリッジに加えた（カートリッジ、Ｃｅｎｔｒｐｒｅｐ ＹＭ−１０， Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製）。試料を、超速遠心分離機（Ｕｌｔｒａ ５．０， Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して、３，０００Ｇの速度でさらに３０分間遠心分離し、２つの異なる画分、すなわち、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの分子量である高分子量画分（以下、「ＨＰ−０３」と表す）と、１０ｋＤａ未満の分子量である低分子量画分以下、「ＨＰ−０４」と表す）を得た。
【００７５】
回収した画分を凍結乾燥し、１０ ｍｇのＨＰ−０２Ａ５０、６２ ｍｇのＨＰ−０３、及び１２ ｍｇのＨＰ−０４をそれぞれ得た（全収率：８４％）。
【００７６】
ＨＰ−０２Ａ５０、ＨＰ−０３及びＨＰ−０４の成分を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって分析した。その結果を表５に示した。
【００７７】
表５のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０２Ａ５０中にそれぞれ、７６．２％、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％及び＜０．１％；ＨＰ−０３中にそれぞれ、＜０．１％、４３．２％、６．２％、＜０．１％、＜０．１％及び＜０．１％；及び、ＨＰ−０４中にそれぞれ、＜０．１％、＜０．１％、＜０．１％、１２．８％、８．１％及び１．３％、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％であることが確認された。
表５
【００７８】
【００７９】
（実施例６．透析法を使用するハチ毒精製抽出物の調製）
実施例１で調製した乾燥粗精製抽出物５００ｍｇを、電子天秤（ＣＰ２２５Ｄ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社（Ｇｅｒｍａｎｙ）製）で秤量し、２ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）中で溶解した。試料をタンパク質透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ ７， Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社（ＵＳＡ）製）に加え、該膜を、２００ｍｌの蒸留水（ＨＰＬＣ等級）の入った円筒状のガラスフラスコに浸漬して、９０分間撹拌しながら透析を行った。透析による脱塩工程終了後、該膜内に含まれる脱塩溶液を、凍結乾燥機（ＦＤＣＦ−１２０１２， Ｏｐｅｒｏｎ社（Ｋｏｒｅａ）製）を使用して３日間凍結乾燥し、４４０ｍｇのハチ毒精製抽出物（収率：８８％）（以下、「ＨＰ−０５」と表す）を得た。
【００８０】
ＨＰ−０５の成分を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって分析した。その結果を表６に示した。
【００８１】
表６のとおり、ホスホリパーゼ、メリチン、アパミン、ヒスタミン、ドーパミン、及びアドレナリンの量が、ＨＰ−０５中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％、ＨＰ−０１中にそれぞれ、１０．２％、４０．５％、３．８％、１．６％、１．１％及び０．３％であることが確認された。
表６
【００８２】
【００８３】
（試験例１．メリチンの量の測定）
ハチ毒の主成分であるメリチンの量を測定するために、ハチ毒のメリチンの量を、ＨＰＬＣを使用して、表７に開示した条件によって測定した。その結果を次の数式１を使用して分析した。
【００８４】
数１
ＡＭ（％）＝ＡＴ（ｍｇ） Ｘ ＰＳ（％）／１００ Ｘ （ＰＭＳＭ）／（ＰＭＳＴ） Ｘ １００／ＡＳＳ（ｍｇ）
ＡＭ：メリチン（Ｃ１３１Ｈ２２９Ｎ３９Ｏ３１）の量
ＡＴ：標準の量
ＰＳ：標準の純度
ＰＭＳＭ：試料中のメリチンのピーク面積
ＰＭＳＴ：標準中のメリチンのピーク面積
ＡＳＳ：サンプリング試料の量
表７
【００８５】
【００８６】
図１のとおり、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５中のメリチンの量はそれぞれ、４０．５％及び４３．７％である。
【００８７】
（試験例２．神経芽腫細胞系を使用するハチ毒の神経保護活性）
ハチ毒抽出物の神経保護活性を評価するために、ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を使用して、手順（Ｙｏｓｈｉｈｉｓａ Ｋｉｔａｍｕｒａら：１−メチル−４−フェニルピリジニウム誘発ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のアポトーシス死に対する抗パーキンソン病薬の保護効果（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ−Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｎｉａｎ ｄｒｕｇｓ Ｔａｌｉｐｅｘｏｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｍｉｐｅｘｏｌｅ ａｇａｉｎｓｔ 『ｃ（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ｃ』 ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌｓ）， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ５４ ｐｐ１０４６−１０５４， １９９８）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の神経保護活性を測定した。
【００８８】
ヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系（韓国細胞株バンク、大韓民国）を、１０％ウシ胎仔血清及び１％抗生物質−抗真菌剤溶液を含有する最小必須培地で、３７℃、６％ ＣＯ２雰囲気下で培養した。
【００８９】
細胞を４８穴プレートで、１×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で２４時間培養し、種々の濃度のＨＰ−０１（０， １， １０， １００ｎｇ／ｍｌ）及びＨＰ−０５（０．８８， ８．８， ８８ｎｇ／ｍｌ）で処理し、３時間培養した。
【００９０】
１ｍＭ ＭＰＰ＋（Ｎ−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン；Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）で処理し、２４時間培養した。５ｇのＭＴＴ溶液（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、５ ｍｇ／ｍｌとなるように１ＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で溶解し、該細胞を０．０５ ｍｇ／ｗｅｌｌになるように３７℃で４時間処理した。培養後、分光計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＰＳ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ社（ＵＳＡ）製）を使用して、５４０ｎｍで、試料の吸光度を測定した。
【００９１】
結果としては、図２のとおり、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５が共に、ニューロン細胞死を顕著に阻害し、強力な神経保護活性を有することが確認された（図２参照）。
【００９２】
（試験例３．ＭＰＴＰ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用するハチ毒の神経保護活性）
ハチ毒抽出物の神経保護活性を評価するために、ＭＰＴＰ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用して、手順（Ｖｅｒｎｉｃｅ Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｌｅｗｉｓ及びＳｅｒｇｅ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ：パーキンソン病のＭＰＴＰマウス方式のプロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＭＰＴＰ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２（１） ｐｐ．１４１−１５１， ２００７）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の神経保護活性を測定した。
【００９３】
体重２３〜２６ｇの１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｓａｍｔａｋｏ社（Ｋｏｒｅａ））を、使用前に１週間環境に順応させた。飼育部屋を自動照明システムによって、午前７時から午後７時までの１２時間、温度を２４℃に調整して制御し、該マウスに、水及び餌を自由に利用できるようにした。
【００９４】
パーキンソン病誘発動物モデルを用意するために、該マウスに、食塩水中ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、３０ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、０．０２ｍｌの０．０５％試料液（ＨＰ−０１、ＨＰ−０５）と共に、２４時間毎に５日間、筋肉内注射した。同様に、負の対照として、食塩水を該マウスに注射した。ＭＰＴＰ誘発によるドーパミン作動性ニューロン系統が損傷するか否か、及びハチ毒処置が該系統を保護することができるか否かについて調査するために、ＭＰＴＰ処置の終了時に、免疫組織化学的染色法を使用して、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）のＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）発現の変化を観察した。
【００９５】
結果としては、図３のとおり、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５で処置したグループが、ＭＰＴＰ単独処置グループ（パーキンソン病誘発グループ）と比較して、強力な神経保護活性を示すが、ＴＨ陽性グループの数、及びＭＰＴＰで腹腔内処置したグループのニューロンは、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）で急激に減少することが確認された（図３参照）。
【００９６】
ＭＰＴＰ処置グループの黒質（ＳＮ）に含まれるＴＨ陽性細胞の数は、正常グループと比較して、顕著に減少したが、ＨＰ−０１で処置したグループは、ドーパミン作動性ニューロンに対して保護効果を示した。特に、ＨＰ−０５で処置したグループは、試料中で最も強力な神経保護活性を示し（ＭＰＴＰに対してｐ＜ ０．０５）、また、該ＨＰ−０５で処置したグループは、ＭＰＴＰ処置グループと比較して、吸光度（ＯＤ）の値が増加する傾向を示した。したがって、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５が共に、退行性脳疾患とパーキンソン病の治療に有用であり得ることが確認された。
【００９７】
（試験例４．ＭＰＴＰ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用する、ミクログリア細胞の活性化に対するハチ毒の阻害効果）
ミクログリア細胞の活性化に対するハチ毒抽出物の阻害効果を評価するために、ＭＰＴＰ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用して、手順（Ｖｅｒｎｉｃｅ Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｌｅｗｉｓ及びＳｅｒｇｅ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ：パーキンソン病のＭＰＴＰマウス方式のプロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＭＰＴＰ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２（１） ｐｐ．１４１−１５１， ２００７；Ｅｒｗｉｎ ｂｅｚａｒｄら：パーキンソン病の遅い発達を再生する慢性ＭＰＴＰモデル；サルの非運動症状の発達（Ａ ｃｈｒｏｎｉｃ ＭＰＴＰ ｍｏｄｅｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｓｌｏｗ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ； ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｎｋｅｙ）， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．， ７６６ ｐｐ．１０７−１１２， １９９７）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の阻害効果を決定した。
【００９８】
体重２３〜２６ｇの１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｓａｍｔａｋｏ社（Ｋｏｒｅａ））を、使用前に１週間環境に順応させた。飼育部屋を自動照明システムによって、午前７時から午後７時までの１２時間、温度を２４℃に調整して制御し、該マウスに、水及び餌を自由に利用できるようにした。
【００９９】
パーキンソン病誘発動物モデルを用意するために、該マウスに、食塩水中ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、３０ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、０．０２ｍｌの０．０５％試料液（ＨＰ−０１、ＨＰ−０５）と共に、２４時間毎に５日間、筋肉内注射した。同様に、負の対照として、食塩水を該マウスに注射した。ＭＰＴＰ誘発によるドーパミン作動性ニューロン系統が損傷するか否か、及びハチ毒処置が該系統を保護することができるか否かについて調査するために、ＭＰＴＰ処置の終了後７日目で、免疫組織化学的染色法を使用して、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）のＣＤ１１Ｂで染色されたミクログリア細胞の変化を観察した。
【０１００】
結果としては、図４のとおり、ＨＰ−０１で処置したグループのミクログリア細胞、ＴＨ陽性細胞、及びニューロン細胞の数が顕著に減少し、また、ＨＰ−０５で処置したグループは、いずれの細胞で減少を示さなかったが、多くのミクログリア細胞は、ＭＰＴＰ処置グループでみられた（図４参照）。
【０１０１】
ＨＰ−０１及びＨＰ−０５の分子生物学的機構を検討するために、ＣＤ１１Ｂの変化、ミクログリア細胞マーカーを決定し、ＭＰＴＰ誘発パーキンソン病動物モデルのミクログリア細胞の活性が増加したが、ＨＰ−０５で処置したグループは、ミクログリア細胞の活性を示さなかった。結果では、ＨＰ−０５が、脳の炎症反応だけでなく、ミクログリア細胞の活性化も阻害することが確認された。
【０１０２】
（試験例５．６−ＯＨＤＡ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用する、異常な循環行動の変化に対するハチ毒の阻害効果）
異常な循環行動の変化に対するハチ毒抽出物の阻害効果を評価するために、６−ＯＨＤＡ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用して、手順（Ａｎｄｒｅａｓ Ｓｃｈｏｂｅｒ：パーキンソン病の古典的毒素誘発動物モデル：６−ＯＨＤＡ及びＭＰＴＰ（Ｃｌａｓｓｉｃ ｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ６−ＯＨＤＡ ａｎｄ ＭＰＴＰ）， Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．， ３１８ ｐｐ．２１５−２２４， ２００４）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の効果を決定した。
【０１０３】
体重２００〜２２０ｇの雄ＳＤラット（Ｓａｍｔａｋｏ社（Ｋｏｒｅａ））を、使用前に１週間環境に順応させた。飼育部屋を自動照明システムによって、午前７時から午後７時までの１２時間、温度を２４℃に調整して制御し、該ラットに、水及び餌を自由に利用できるようにした。
【０１０４】
パーキンソン病誘発動物モデルを用意するために、ペントバルビタール注射（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を、麻酔として使用し、６−ＯＨＤＡ溶液（２５μｇ／４μｌ、０．０１％ Ｌ−アスコルビン酸含有、Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、使用前に、暗くした冷蔵庫に保存した。６−ＯＨＤＡを、２５μｇ／４μｌの用量で、１μｌ／分の速度で、２６ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジによって、特定の脳領域（前頂部に基づいて、ＡＰ−０．７ｍｍ，ｍｌ−２．６ｍｍ，Ｖ−４．５ｍｍ）に注射した。
【０１０５】
６−ＯＨＤＡを該ラットに注射した後、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５を、処置後１４日目及び６−ＯＨＤＡの注射１週後に該ラットに投与し、アポモルヒネ（０．５ｍｇ／ｋｇ、皮下、Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を該ラットに注射した。該ラットの回転数を、自動ロトメーターチャンバを使用して、３０及び６０分毎に測定した。
【０１０６】
結果としては、６−ＯＨＤＡ処置グループと比較して、ＨＰ−０１で処置したグループの循環行動が減少し、特に、ＨＰ−０５で処置したグループが、異常な循環行動を強く阻害することが確認された。したがって、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５が共に、退行性脳疾患とパーキンソン病の治療に有用であり得ることが確認された。
【０１０７】
（実施例６．６−ＯＨＤＡ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用するハチ毒の神経保護効果）
ハチ毒抽出物の神経保護活性を評価するために、６−ＯＨＤＡ誘発退行性脳疾患動物モデルを使用して、手順（Ａｎｄｒｅａｓ Ｓｃｈｏｂｅｒ：パーキンソン病の古典的毒素誘発動物モデル：６−ＯＨＤＡ及びＭＰＴＰ（Ｃｌａｓｓｉｃ ｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ６−ＯＨＤＡ ａｎｄ ＭＰＴＰ）， Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．， ３１８ ｐｐ．２１５−２２４，２００４）に開示された改良手順によって、実施例で調製したハチ毒抽出物の神経保護効果を決定した。
【０１０８】
体重２００〜２２０ｇの雄ＳＤラット（Ｓａｍｔａｋｏ社（Ｋｏｒｅａ））を、使用前に１週間環境に順応させた。飼育部屋を自動照明システムによって、午前７時から午後７時までの１２時間、温度を２４℃に調整して制御し、該ラットに、水及び餌を自由に利用できるようにした。
【０１０９】
パーキンソン病誘発動物モデルを用意するために、ペントバルビタール注射（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を、麻酔として使用し、６−ＯＨＤＡ溶液（２５μｇ／４μｌ、０．０１％ Ｌ−アスコルビン酸含有、Ｓｉｇｍａ社（ＵＳＡ）製）を、使用前に、暗くした冷蔵庫に保存した。６−ＯＨＤＡを、２５μｇ／４μｌの用量で、１μｌ／分の速度で、２６ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジによって、特定の脳領域（前頂部に基づいて、ＡＰ−０．７ ｍｍ，ｍｌ−２．６ ｍｍ， Ｖ−４．５ｍｍ）に注射した。
【０１１０】
６−ＯＨＤＡ誘発によるドーパミン作動性ニューロン系統が損傷するか否か、及びハチ毒処置が該系統を保護することができるか否かについて調査するために、６−ＯＨＤＡ処置の終了時に、ＴＨ免疫組織化学的染色法を使用して、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）のドーパミン作動性細胞を観察した。
【０１１１】
図６のとおり、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５で処置したグループが、ＳＴでの６−ＯＨＤＡ処置グループと比較して、強力な神経保護活性を示すが、ＴＨ陽性グループの数、及び６−ＯＨＤＡで処置したグループのニューロンは、線条体（ＳＴ）及び黒質（ＳＮ）で急激に減少した（図６参照）。
【０１１２】
６−ＯＨＤＡ処置グループの黒質（ＳＮ）に含まれるＴＨ陽性細胞の数は、正常グループと比較して、顕著に減少したが、ＨＰ−０１で処置したグループは、ドーパミン作動性ニューロンに対して保護効果を示した。特に、ＨＰ−０５で処置したグループは、黒質（ＳＮ）及び線条体（ＳＴ）の試験で、ＨＰ−０１で処置したグループよりも強力な神経保護活性を示した。したがって、ＨＰ−０１及びＨＰ−０５が共に、退行性脳疾患とパーキンソン病の治療に有用であり得ることが確認された。
【０１１３】
（試験例７．臨床試験）
パーキンソン病患者に対するハチ毒抽出物の治療効果を明らかにするために、次の臨床試験を行った。
【０１１４】
２０μｇのＨＰ−０１を、４人の男性と６人の女性から成る１０人のボランティアの脚の特定の経穴（ポイントＧＢ ３４）に、３日間隔で１５日間、筋肉内注射した。試験の前後に、一般規格、すなわちＵＰＤＲＳ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ）によって、試験試料の治療活性を測定した。ＵＰＤＲＳの基準を４つのグループに分類した。すなわち、ＵＰＤＲＳ Ｉ（言及、行動、気分：１〜４の内容、全スコア１６ポイント）；ＵＰＤＲＳ ＩＩ（日常生活動作：５〜１７の内容、全スコア５２ポイント）；ＵＰＤＲＳ ＩＩＩ（運動器健診：１８〜３１の内容、全スコア１０８ポイント）；及び、ＵＰＤＲＳ ＩＶ（運動障害：３２〜４２の内容、全スコア３２ポイント）である。スコアが高くなると、疾患の重症度が悪化するとカウントされる。
【０１１５】
評価は、試験後のボランティアと評価者間のインタビューによって決定し、ＵＰＤＲＳの変化は、該評価によって互いに比較した。
【０１１６】
結果では、ボランティア間で個人差が存在するが、ほとんどのボランティアは、全ＵＰＤＲＳ値が約１０ポイント減少することを示した（表８及び９参照）。
表８
【０１１７】
表９
【０１１８】
【０１１９】
ＳＰＳＳ／ＰＣ＋パッケージを使用して、一元配置ＡＮＯＶＡ分析によって試験結果を分析し（ｐ＜０．０５）、ダンカンの多重試験によって事後多重比較を分析した。それぞれのグループの値を平均±ＳＤで表した。
【０１２０】
以下に、製剤化方法及び賦形剤の種類を説明するが、本発明は、それらに限定されない。代表的な調製例を次に説明した。
【０１２１】
（粉末剤の調製）
ＨＰ−０１の乾燥粉末３００ｍｇ
ラクトース１００ｍｇ
タルク１０ｍｇ
上述の成分を混合し、密封包装に充填することによって、粉末調製物を調製した。
【０１２２】
（錠剤の調製）
ＨＰ−０２Ａ５０の乾燥粉末５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉１００ｍｇ
ラクトース１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
上述の成分を混合し、錠剤化することによって、錠剤調製物を調製した。
【０１２３】
（カプセル剤の調製）
ＨＰ−０３の乾燥粉末５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉１００ｍｇ
ラクトース１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
上述の成分を混合し、従来のゼラチン調製法によりゼラチンカプセルに充填することによって、カプセル調製物を調製した。
【０１２４】
（注射液の調製（１））
ＨＰ−０５の乾燥粉末２ｍｇ
注射最適量の蒸留水
最適量のｐＨ調整剤
有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調整した後、すべての成分を２ｍｌのアンプルに充填し、従来の注射液調製法により滅菌することによって、注射液調製物を調製した。
【０１２５】
（注射液の調製（２））
ＨＰ−０１の乾燥粉末１ｍｇ
注射最適量の蒸留水
最適量のｐＨ調整剤
有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調整した後、すべての成分を１ｍｌのアンプルに充填し、従来の注射液調製法により滅菌することによって、注射液調製物を調製した。
【０１２６】
（注射液の調製（３））
１ｇのＨＰ−０１を１０００ｍｌの生理食塩水中で溶解した。ウイルス、細菌及び他の不純物等の種々の汚染物質を、抗細菌ろ過器を使用して除去した後、すべての溶液を１ｍｌのバイアルに加えた。その溶液を凍結乾燥によって乾燥し、注射液調製物として使用した。
【０１２７】
（注射液の調製（４））
ＨＰ−０５の乾燥粉末０．８８ｍｇ
上述の成分を滅菌バイアルに充填し、注射用の生理食塩水で希釈した。
【０１２８】
（注射液の調製（５））
ＨＰ−０５の乾燥粉末０．８８ｍｇ
上述の成分を注射用の生理食塩水中で溶解した。ウイルス、細菌及び他の不純物等の種々の汚染物質を、抗細菌ろ過器を使用して除去した後、すべての溶液を１ｍｌのバイアルに加えた。その溶液を凍結乾燥によって乾燥し、注射液調製物として使用した。
【０１２９】
このように記載された本発明では、同様のものを多くの方法で変更してもよい。このような変更は、本発明の精神及び範囲を逸脱するとはみなされず、すべてのこのような改良は、当業者によって明らかなように、次の特許請求の範囲の範囲内に含まれるように意図される。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明に記載されるとおり、退行性脳疾患の動物モデルを使用することによって、ハチ毒精製抽出物は、ミクログリア細胞の活性化、及び異常な循環行動に対する強力な阻害効果と、これらによる強力な細胞の保護活性を示し、薬剤として退行性脳疾患の治療及び予防に有用であり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための有効成分としてハチ毒精製抽出物を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記精製抽出物が、ミツバチ、バンブルビー、又はコハナバチ等のハチ毒の粗精製抽出物又は精製抽出物である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記精製抽出物が、ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、該溶液をろ過して、該溶液から不純物を除去する工程と、本発明のハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥によって該ろ液を乾燥する工程と、を含む手順によって調製される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記精製抽出物が、上述の工程で調製した前記乾燥ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、該溶液を、塩析法、溶媒析出法、及び遠心分離又は透析を行うための透析膜ろ過から選択される少なくとも１つの精製工程に供する工程と、ハチ毒精製抽出物を得るために凍結乾燥によって該ろ液を乾燥する工程と、を含む手順によって調製される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記精製抽出物が、ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水中で溶解する工程と、不純物を除去するためろ過する工程と、ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、
第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、ハチ毒水溶性抽出物を得るため、蒸留水等の溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、該溶液を、膜に含まれる精製抽出物を回収するため、膜透析を使用する透析膜ろ過に供する工程と、他のハチ毒抽出物よりも強力な薬理効果のある、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、凍結乾燥によって該ろ液を乾燥する工程の第３工程と、を含む手順によって調製される、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ハチ毒精製抽出物が有効成分として、約３０％〜９０％（ｗ／ｗ％）の量のメリチンを含む、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記退行性脳疾患が、アルツハイマー型痴呆、脳血管性痴呆、Ｐｉｃｋ病、クロイツフェルト−ヤコブ病、頭部損傷によって生じた痴呆、又はパーキンソン病である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記退行性脳疾患がパーキンソン病である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記退行性脳疾患が、ミクログリア細胞の活性化過剰によって生じたパーキンソン病である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、固形経口製剤、液状経口製剤、局所用調製物又は非経口剤形の形態である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、凍結乾燥調製物、乳剤、非水性型注射液又は水性型注射液である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、筋肉内に、皮下に又は皮内に投与される水性型注射である、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、請求項１にて説明した本発明の抽出物を、８マイクログラムから２ｍｇ／日の量で投与される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ヒトを含む哺乳動物のニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための治療剤の調製のための請求項１にて説明した前記ハチ毒精製抽出物の使用。
【請求項１５】
請求項１にて説明した治療有効量の前記ハチ毒精製抽出物を、哺乳動物への医薬として許容し得るそのキャリアと共に投与することを含む、ヒトを含む該哺乳動物のニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療又は予防する方法
【請求項１６】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、１０．２％のホスホリパーゼ、４０．５％のメリチン、３．８％のアパミン、１．６％のヒスタミン、１．１％のドーパミン、及び０．３％のアドレナリンを含むハチ毒粗精製抽出物を得るため、凍結乾燥で乾燥する工程と、を含む、請求項１にて説明した前記ハチ毒精製抽出物を調製する方法。
【請求項１７】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、請求項１６にて説明した前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、 第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、該溶液を、塩析法、溶媒析出法、及び遠心分離又は透析を行うための透析膜ろ過から選択される少なくとも１つの精製工程に供する工程と、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、凍結乾燥で該ろ液を乾燥する工程との第２工程；と、を含む、請求項１にて説明した前記ハチ毒精製抽出物を調製する方法。
【請求項１８】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、ハチ毒水溶性抽出物を得るため、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、該溶液をゲルろ過クロマトグラフィに供した後、膜透析を使用するタンパク質透析膜ろ過に供して、塩析を行う工程の第３工程；と、該膜に含まれる精製抽出物を回収する工程と、１２．４％のホスホリパーゼ、４８．４％のメリチン、４．３％のアパミン、０．９％のヒスタミン、１．４％のドーパミン、及び０．４％のアドレナリンを含む本発明のハチ毒粗精製抽出物を得るため、凍結乾燥で該ろ液を乾燥する工程の第４工程；と、を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、ハチ毒水溶性抽出物を得るため、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、該溶液を塩溶に供した後、硫酸アンモニウム等の塩を使用する塩析を行う工程の第３工程；と、上清を得て、該上清中に、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、８．４％のヒスタミン、３．１％のドーパミン、及び１．２％のアドレナリンを含み、そして、沈殿物中に、１３．４％のホスホリパーゼ、５３．６％のメリチン、５．１％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、該溶液を遠心分離及び凍結乾燥する工程の第４工程；と、を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール若しくはブタノール等の低級アルコール、又はこれらの混合物から選択される析出溶媒中で溶解して、析出物を得る工程の第２工程；と、上清を得て、該上清中に、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、１２．１％のヒスタミン、６．４％のドーパミン、及び２．２％のアドレナリンを含み、そして、沈殿物中に、７．８％のホスホリパーゼ、５６．４％のメリチン、５．８％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、該溶液を遠心分離及び凍結乾燥する工程の第３工程；と、を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール若しくはブタノール等の低級アルコール、又はこれらの混合物から選択される析出溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、
該溶液を、５０ｋＤａの膜フィルターを装備した超遠心分離機を使用する超遠心分離に供して、７６．２％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、５０ｋＤａより高い高分子量のハチ毒精製抽出物を得る工程の第３工程；と、＜０．１％のホスホリパーゼ、４３．２％のメリチン、６．２％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの高分子量のハチ毒精製抽出物、並びに、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、１２．８％のヒスタミン、８．１％のドーパミン、及び１．３％のアドレナリンを含む、１０ｋＤａ未満の低分子量のハチ毒精製抽出物を得るため、１０ｋＤａ膜フィルターを装備した超遠心分離機を使用することによって、５０ｋＤａ未満の低分子量の画分を遠心分離する工程；と、を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、ハチ毒水溶性抽出物を得るため、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、該溶液を、タンパク質透析膜を使用する透析に供する工程の第３工程；と、１０．２％のホスホリパーゼ、４０．５％のメリチン、３．８％のアパミン、１．６％のヒスタミン、３．１％のドーパミン、及び０．３％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、該膜内の溶液を回収し、該溶液を凍結乾燥する工程を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１】
ニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための有効成分としてハチ毒精製抽出物を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記精製抽出物が、ミツバチ、バンブルビー、又はコハナバチ等のハチ毒の粗精製抽出物又は精製抽出物である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記精製抽出物が、ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、該溶液をろ過して、該溶液から不純物を除去する工程と、本発明のハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥によって該ろ液を乾燥する工程と、を含む手順によって調製される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記精製抽出物が、上述の工程で調製した前記乾燥ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、該溶液を、塩析法、溶媒析出法、及び遠心分離又は透析を行うための透析膜ろ過から選択される少なくとも１つの精製工程に供する工程と、ハチ毒精製抽出物を得るために凍結乾燥によって該ろ液を乾燥する工程と、を含む手順によって調製される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記精製抽出物が、ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水中で溶解する工程と、不純物を除去するためろ過する工程と、ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、
第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、ハチ毒水溶性抽出物を得るため、蒸留水等の溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、該溶液を、膜に含まれる精製抽出物を回収するため、膜透析を使用する透析膜ろ過に供する工程と、他のハチ毒抽出物よりも強力な薬理効果のある、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、凍結乾燥によって該ろ液を乾燥する工程の第３工程と、を含む手順によって調製される、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ハチ毒精製抽出物が有効成分として、約３０％〜９０％（ｗ／ｗ％）の量のメリチンを含む、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記退行性脳疾患が、アルツハイマー型痴呆、脳血管性痴呆、Ｐｉｃｋ病、クロイツフェルト−ヤコブ病、頭部損傷によって生じた痴呆、又はパーキンソン病である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記退行性脳疾患がパーキンソン病である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記退行性脳疾患が、ミクログリア細胞の活性化過剰によって生じたパーキンソン病である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、固形経口製剤、液状経口製剤、局所用調製物又は非経口剤形の形態である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、凍結乾燥調製物、乳剤、非水性型注射液又は水性型注射液である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、筋肉内に、皮下に又は皮内に投与される水性型注射である、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、請求項１にて説明した本発明の抽出物を、８マイクログラムから２ｍｇ／日の量で投与される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ヒトを含む哺乳動物のニューロン細胞を保護することによる退行性脳疾患の治療及び予防のための治療剤の調製のための請求項１にて説明した前記ハチ毒精製抽出物の使用。
【請求項１５】
請求項１にて説明した治療有効量の前記ハチ毒精製抽出物を、哺乳動物への医薬として許容し得るそのキャリアと共に投与することを含む、ヒトを含む該哺乳動物のニューロン細胞を保護することによって退行性脳疾患を治療又は予防する方法
【請求項１６】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、１０．２％のホスホリパーゼ、４０．５％のメリチン、３．８％のアパミン、１．６％のヒスタミン、１．１％のドーパミン、及び０．３％のアドレナリンを含むハチ毒粗精製抽出物を得るため、凍結乾燥で乾燥する工程と、を含む、請求項１にて説明した前記ハチ毒精製抽出物を調製する方法。
【請求項１７】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、請求項１６にて説明した前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、 第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、該溶液を、塩析法、溶媒析出法、及び遠心分離又は透析を行うための透析膜ろ過から選択される少なくとも１つの精製工程に供する工程と、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、凍結乾燥で該ろ液を乾燥する工程との第２工程；と、を含む、請求項１にて説明した前記ハチ毒精製抽出物を調製する方法。
【請求項１８】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、ハチ毒水溶性抽出物を得るため、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、該溶液をゲルろ過クロマトグラフィに供した後、膜透析を使用するタンパク質透析膜ろ過に供して、塩析を行う工程の第３工程；と、該膜に含まれる精製抽出物を回収する工程と、１２．４％のホスホリパーゼ、４８．４％のメリチン、４．３％のアパミン、０．９％のヒスタミン、１．４％のドーパミン、及び０．４％のアドレナリンを含む本発明のハチ毒粗精製抽出物を得るため、凍結乾燥で該ろ液を乾燥する工程の第４工程；と、を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、ハチ毒水溶性抽出物を得るため、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、該溶液を塩溶に供した後、硫酸アンモニウム等の塩を使用する塩析を行う工程の第３工程；と、上清を得て、該上清中に、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、８．４％のヒスタミン、３．１％のドーパミン、及び１．２％のアドレナリンを含み、そして、沈殿物中に、１３．４％のホスホリパーゼ、５３．６％のメリチン、５．１％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、該溶液を遠心分離及び凍結乾燥する工程の第４工程；と、を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール若しくはブタノール等の低級アルコール、又はこれらの混合物から選択される析出溶媒中で溶解して、析出物を得る工程の第２工程；と、上清を得て、該上清中に、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、１２．１％のヒスタミン、６．４％のドーパミン、及び２．２％のアドレナリンを含み、そして、沈殿物中に、７．８％のホスホリパーゼ、５６．４％のメリチン、５．８％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、該溶液を遠心分離及び凍結乾燥する工程の第３工程；と、を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、水、メタノール、エタノール若しくはブタノール等の低級アルコール、又はこれらの混合物から選択される析出溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、
該溶液を、５０ｋＤａの膜フィルターを装備した超遠心分離機を使用する超遠心分離に供して、７６．２％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、５０ｋＤａより高い高分子量のハチ毒精製抽出物を得る工程の第３工程；と、＜０．１％のホスホリパーゼ、４３．２％のメリチン、６．２％のアパミン、＜０．１％のヒスタミン、＜０．１％のドーパミン、及び＜０．１％のアドレナリンを含む、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａの高分子量のハチ毒精製抽出物、並びに、＜０．１％のホスホリパーゼ、＜０．１％のメリチン、＜０．１％のアパミン、１２．８％のヒスタミン、８．１％のドーパミン、及び１．３％のアドレナリンを含む、１０ｋＤａ未満の低分子量のハチ毒精製抽出物を得るため、１０ｋＤａ膜フィルターを装備した超遠心分離機を使用することによって、５０ｋＤａ未満の低分子量の画分を遠心分離する工程；と、を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
ミツバチから回収した乾燥ハチ毒を水、メタノール、エタノール又はブタノール等の低級アルコール中で溶解する工程と、不純物を除去するためにろ過する工程と、前記ハチ毒粗精製抽出物を得るために凍結乾燥で乾燥する工程の第１工程；と、ハチ毒水溶性抽出物を得るため、第１工程で調製した該ハチ毒粗精製抽出物を、蒸留水等の溶媒中で溶解する工程の第２工程；と、該溶液を、タンパク質透析膜を使用する透析に供する工程の第３工程；と、１０．２％のホスホリパーゼ、４０．５％のメリチン、３．８％のアパミン、１．６％のヒスタミン、３．１％のドーパミン、及び０．３％のアドレナリンを含む、本発明のハチ毒精製抽出物を得るため、該膜内の溶液を回収し、該溶液を凍結乾燥する工程を含む、請求項１７記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２７４４９（Ｐ２０１２−５２７４４９Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１７４６（Ｐ２０１２−５１１７４６）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００７２３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４６７６
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２４１２５１）ヒュオンス カンパニー，リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００７２３４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３４６７６
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５１１２４１２５１）ヒュオンス カンパニー，リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]