過冷却飲料
【課題】簡便に過冷却状態を維持できる飲料を提供する。
【解決手段】下記一般式：
【化１】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他は水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ同じであっても異なっていてもよく、水素原子、水酸基またはメトキシ基である）
で表されるフラボノイド配糖体を０．００１重量％〜０．１重量％の量で含むＨ２Ｏを主成分とする飲料。
【解決手段】下記一般式：
【化１】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他は水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ同じであっても異なっていてもよく、水素原子、水酸基またはメトキシ基である）
で表されるフラボノイド配糖体を０．００１重量％〜０．１重量％の量で含むＨ２Ｏを主成分とする飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過冷却飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、飲料を冷却して飲む場合、その温度は０℃以上である。より低温の飲料を摂取することで、液体を飲みながら清涼感を得ることや、身体の冷却効果が期待できる。現在、水を０℃以下の冷却状態にする技術は幾つかが開示されている（特許文献１、特許文献２）。
【０００３】
しかしながらこれらの技術では、水を過冷却状態にして保管するためには、静電場を発生させる装置および保管庫が必要である。従って、設備が複雑且つ大型化してしまう。
【特許文献１】特開２００５−１５６０４２
【特許文献２】特開２００６−２３０２５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、簡便に過冷却状態を維持できる飲料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するための手段は、
下記一般式：
【化２】
【０００６】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他は水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ同じであっても異なっていてもよく、水素原子、水酸基またはメトキシ基である）
で表されるフラボノイド配糖体を０．００１重量％〜０．１重量％の量で含むＨ２Ｏを主成分とする飲料である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、簡便に過冷却状態を維持できる飲料を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の飲料は、下記一般式：
【化３】
【０００９】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他が水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素原子、水酸基またはメトキシ基であり、これらは互いに同じであっても異なっていてもよい）
で表されるフラボノイド配糖体を含むＨ２Ｏを主成分とする飲料であればよい。
【００１０】
このような本発明の飲料は、刺激的な冷却効果と、きわめて素晴らしい清涼感を有する。また、通常の冷凍庫などにおいて簡便に過冷却状態を維持できるので、従来技術のように特殊な装置、即ち、静電場を発生させる装置および保管庫が不要であるため、簡便に過冷却状態を維持できる。更に、抗酸化剤としての作用を有するため、健康維持に寄与することが可能である。
【００１１】
本発明は、発明者らが、寒冷地に成育する樹木の細胞水が低温で液体状態を保つメカニズムを研究する過程で、その原因となる物質を特定する研究の結果、樹木中に存在する過冷却促進物質を同定したことに基づく。
【００１２】
本発明に使用されるフラボノイド配糖体は、下記一般式：
【化４】
【００１３】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他が水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素原子、水酸基またはメトキシ基であり、これらは互いに同じであっても異なっていてもよい）
で表されるフラボノイド配糖体である。
【００１４】
当該フラボノイド配糖体に含まれる糖残基は、単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた残基であればよく、例えば、下式：
【化５】
【００１５】
の単糖またはオリゴ糖の基本骨格のＣ１炭素の水酸基が除かれた残基であればよい。
【００１６】
当該単糖は、例えば、グルコース、マンノースおよびガラクトースなどを含み、当該オリゴ糖は、例えば、ルチノース、シュークロースおよびラフィノースなどを含んでよい。好ましい例は、グルコース、マンノースおよびガラクトースである。
【００１７】
当該フラボノイド配糖体は、好ましくは、ケンフェロール、アピゲニン、クリシン、ガランギン、アカセチンおよびケルセチン、８−メトキシケンフェロールの配糖体である。本発明の飲料は、これらのうち少なくとも１つのフラボノイド配糖体を単独で、または２つ以上を組み合わせて含んでもよい。
【００１８】
本発明に従うフラボノイド配糖体は、人工的に合成されたものであってもよく、樹木などの植物から抽出された粗抽出物に含まれる形態で当該飲料に添加されてもよい。
【００１９】
本発明に使用されるフラボノイド配糖体は、樹木の二次代謝物として、非常に多くの種類が植物や樹木中に存在することがよく知られている。しかしながら、フラボノイド配糖体が水の過冷却活性を促進するということは、これまでの研究の結果から本願発明者らによって初めて明らかにされた。
【００２０】
本発明に従うフラボノイド配糖体を抽出することが可能な樹木の例は、これらに限定するものではないが、当該フラボノイド配糖体が多量に含有されている寒冷地に育成する樹木であればよく、例えば、カラマツ、ニオイヒバ、イチイ、スギ、ウラジロモミ、トドマツ、エゾマツ、アカエゾマツ、キタゴヨウ、ストローブマツ、アカマツ、クロマツなどの針葉樹、シラカンバ、ヤマナラシ、クリ、ナナカマド、ハクウンボク、ミズナラ、ハルニレ、カツラなどの広葉樹が含まれる。
【００２１】
当該フラボノイド配糖体は、例えば、上記樹種の辺材、心材を含む木部、樹皮、冬芽、葉から抽出することが可能である。また、これらの物質は、生きている細胞（即ち、柔細胞）内にあるものと考えられるが、細胞外に存在している可能性もある。また、当該フラボノイド配糖体は安定であるので、生立木のみならず、古死木や長期保存された木材からも抽出することが可能であり、そこから抽出されたフラボノイド配糖体も本発明において使用することが可能である。
【００２２】
当該フラボノイド配糖体は、樹木から、例えば、メタノールまたはエタノールにより抽出することが可能である。例えば、樹木を小片化し、液体窒素で凍結し、乳鉢と乳棒で可能な限り小片に粉砕し、得られた粉砕物をメタノールに浸漬すればよい。
【００２３】
上述のように抽出された粗抽出物は凍結乾燥により有機溶媒を除去した後、当該フラボノイド配糖体は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの手段により更に精製されてもよい。また、粗抽出物に含まれる当該フラボノイド配糖体を定量することも望ましい。それにより、所望の濃度のフラボノイドを含有する本発明の飲料を、粗抽出物を用いて調製することが可能である。
【００２４】
また、当該フラボノイド配糖体は人工的に合成したものであってもよく、例えば、それ自体公知の合成方法に従って合成することが可能である。
【００２５】
本発明の飲料において、当該フラボノイド配糖体は、フラボノイド配糖体として０．００１重量％〜０．１重量％、好ましくは０．０１重量％〜０．１重量％、最も好ましくは０．０１重量％の量で含まれる。例えば、粗抽出物の形態で当該フラボノイド配糖体を本発明の飲料に添加する場合には、粗抽出物として、０．０１重量％〜１重量％、好ましくは０．０１重量％〜０．１重量％、最も好ましくは０．１重量％の量で本発明の飲料に含まれればよい。
【００２６】
本発明の飲料において、当該フラボノイド配糖体は、Ｈ２Ｏを主成分とする液体に可溶化または懸濁されて含まれればよい。
【００２７】
また、本発明の飲料は活性酸素を抑え健康を増進する効果も期待できる。
【００２８】
［例］
例１．樹木からのフラボノイド配糖体の抽出
北海道札幌地区に自生するカツラから枝を採集した。このカツラの枝の木部組織を鉛筆削りで小片化した後、液体窒素で凍結し、乳鉢と乳棒で可能な限り小片に粉砕した。得られた木部組織の粉砕物３．７Ｋｇをメタノール２０Ｌに２週間浸漬した。得られた抽出液を１４，０００Ｇで遠心分離し（Hitachi:HIMC CF15R）、上清を回収した。これらを乾燥して粗抽出物を得た。この粗抽出物９３．８ｇを３００ｍＬの水に溶かした。
【００２９】
上述のような方法により得られた粗抽出物の水懸濁液を２０℃で１４，０００Gで遠心分離し、上澄を回収した。この上澄３００ｍＬと酢酸エチル６００ｍＬを混合し、分液ロートにて、水可溶部と酢酸エチル可溶部に分けて乾燥した。
【００３０】
これらの画分の過冷却活性を以下の方法で測定した。氷核活性細菌（Erwinia ananas）の死滅菌体（和光純薬社製）を含む緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）に被測定物０．５ｍｇ／ｍＬを混合し、温度コントロールされた銅板上に２μＬの液滴として載せ、その銅板を０．２℃／ｍｉｎで冷却して凍結する液滴数を肉眼的に観察し、５０％の液滴が凍結した温度を凍結温度とした。この凍結温度と上記緩衝液の凍結温度を測定し、結果を「℃」で示した。水可溶部では２℃程度の、酢酸エチル可溶部では４℃程度の過冷却活性が得られた。
【００３１】
より高い過冷却活性を示した乾燥した酢酸エチル可溶画分を「ヘキサン・２−プロパノール・水」、「クロロホルム・メタノール・水」を用いて自作のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで３０程のフラクションに分けた。このシリカゲルカラムクロマトグラフを図１に示す。次に、各フラクションの物質について、過冷却活性を上記と同様の方法で測定した。その結果、図２に示すように画分９と１０が最大過冷却値を示した。
【００３２】
上記で得られた画分９と１０を、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Wakosil 5C18HG、溶媒；メタノール：水＝１：１、流速１ｍＬ／ｍｉｎ）で分析した結果、図３に示すように７つの物質の存在を示すピーク（１〜７）を得た。
【００３３】
これらのピークのうち、過冷却活性を示したのは４、５、６、７のピーク（以下、それぞれＣｊ４〜７と称す）のみであり、その活性は、それぞれ１．８℃（Ｃｊ４）、９．０℃（Ｃｊ５）、０．２℃（Ｃｊ６）、２．５℃（Ｃｊ７）であった。
【００３４】
これらの物質は何れも２５０〜２７０ｎｍと３００〜３８０ｎｍに吸収ピークを持つ特徴的なＵＶスペクトルを示したことからフラボノール骨格を持つことが予想された。
【００３５】
また、これら４つのピークに含まれる物質について質量分析装置（JEOL:JMS- SX102A）にてｎｅｇａｔｉｖｅ−ＨＲＦＡＢ−ＭＳ分析を行った。これらの物質のそれぞれの質量は、４６３．０８９３（Ｃｊ４）、４４７．０９４２（Ｃｊ５）、４７７．１０３８（Ｃｊ６）、４４７．０９５８（Ｃｊ７）であり、分子式はＣ２１Ｈ２０Ｏ１２（Ｃｊ４）、Ｃ２１Ｈ２０Ｏ１１（Ｃｊ５）、Ｃ２２Ｈ２２Ｏ１２（Ｃｊ６）、Ｃ２１Ｈ２０Ｏ１１（Ｃｊ７）と予想された。
【００３６】
更に、これらの物質をアセチル化し、高分解能核磁気共鳴装置（BRUKER:AMX-500）により、反応生成物の各種について1次元および２次元ＮＭＲスペクトル分析を行った。アセチル化反応は、約１０ｍｇの乾燥試料を２００μＬのメタノールで溶解し、そこに２ｍＬの無水酢酸と１ｍＬのピリジンを加えて、７０℃で１．５時間処理することで行った。得られたアセチル化物を分取ＴＬＣで精製した後に、重クロロホルムに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＣＯＭ、ＤＥＰＴ、１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、ＨＳＱＣのＮＭＲスペクトル分析を行った。それぞれのアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４〜７に示す。
【００３７】
Ｃｊ７のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、７つのアセチル基によるシグナル（δ １．９２〜２．４５）、Ｂ環の２’、３’、５’、６’位の水素によるシグナル（δ ７．２３、８．０４）、芳香環に結合した２つの水素によるシグナルを示した（δ ６．８４、７．３０）。また、β−グルコース残基の存在も確認された（δ ３．６０、３．９２、４．００、５．０４、５．１７、５．２８、５．５３）。グルコースのアノメリック炭素に結合した水素とアグリコンの３位の炭素との間にＨＭＢＣ相関が見られた。以上の結果からＣｊ７はケンフェロール−３−Ｏ−β−グルコシドであると同定した（図７）。
【００３８】
Ｃｊ４のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＣｊ７のものと比較すると、Ｃｊ４ではアセチル基によるシグナル（δ １．９２〜２．４５）は８つであり、Ｂ環の２’、５’、６’に結合した水素によるシグナル（δ ７．３３、７．９３、７．９６）が見られた。この結果とＨＭＢＣ相関からＣｊ４はケルセチン−３−Ｏ−β−グルコシドであった（図４）。
【００３９】
Ｃｊ６のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＣｊ７のものと比較すると、Ｃｊ６では芳香環に結合した水素は１つであり（δ ６．７９）、メトキシル基によるシグナル（δ３．９７）が現れていた。この結果とＨＭＢＣ相関からＣｊ６は８−メトキシケンフェロール−３−Ｏ−β−グルコシドであると同定した（図６）。
【００４０】
Ｃｊ５のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｃｊ７のものと同様に７つのアセチル基によるシグナル（δ １．９２〜２．４５）、Ｂ環の２’、３’、５’、６’位の水素によるシグナル（δ ７．２７、７．８４）、芳香環に結合した２つの水素によるシグナルを示した（δ ６．７３、７．０１）。また、Ｃｊ５の酸化加水分解をアセチル化して得られた構成糖のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、アセチル化したグルコースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと一致した。構成糖の１位の水素とアグリコンの７位の炭素との間にＨＭＢＣ相関が見られたことからＣｊ５は、ケンフェロール−７−Ｏ−β−グルコシドであった（図５）。
【００４１】
これら質量分析およびＮＭＲスペクトル分析の結果から、これら物質は何れもフラボノイド配糖体であり、アグリコンは、ケルセチン、ケンフェロール、８−メトキシケンフェロールの何れかであり、これらアグリコンにグルコースが１つ付いた配糖体であると結論付けられた。
【００４２】
即ち、抽出された過冷却促進物質は、下式で表されるフラボノイド配糖体であった。
【化６】
【００４３】
例２．樹木からのフラボノイド配糖体の抽出
北海道札幌地区に自生するカツラから枝を採集した。このカツラの枝の木部組織を鉛筆削りで小片化した後、液体窒素で凍結し、乳鉢と乳棒で可能な限り小片に粉砕した。得られた木部組織の粉砕物３．７Ｋｇをメタノール２０Ｌに２週間浸漬した。得られた抽出液を１４，０００Ｇで遠心分離し（Hitachi:HIMC CF15R）、上清を回収した。これらを凍結乾燥し、粗抽出物とした。この粗抽出物０．０３ｇを３００ｍＬの水に溶かし（０．０１％）、以下の例５において使用した。
【００４４】
当該粗抽出物に含まれるフラボノイド配糖体の同定および定量を以下のように行った。同定はHPLCにより行い、ケンフェロール−７−Ｏ−グルコシドを含む、フラボノイド配糖体のピークを、ルチンを基準物質として定量した。
【００４５】
その結果、当該粗抽出物には、ケンフェロール−７−Ｏ−グルコシド、ケンフェロール−３−Ｏ−グルコシド、ケルセチン−３−０−グルコシド、８−メトキシケンフェロール−３−０−グルコシドが含まれ、活性成分としての総フラボノイド配糖体の含有量は１０％であった。
【００４６】
例３．飲用水の調製
５００ｍＬのペットボトルに、それぞれコーラ、健康飲料、緑茶または水道水を２５０ｍＬ入れ、これらに終濃度が０．００１重量％となるようにフラボノイド配糖体を加えて溶解した。使用したフラボノイド配糖体は、９５％以上の純度に精製されたケンフェロール−７−Ｏ−グルコシド、および樹木からの粗抽出物であった。
【００４７】
このように調製した飲料を−５℃の冷凍庫の中で７日間保存したところ、これらの飲料は何れも凍結しなかった。更に、これら過冷却状態の飲料を一般的な冷蔵庫に貯蔵された０℃から８℃の飲料と飲み比べた。その結果、刺激的な冷却効果が感じられると共に、きわめて素晴らしい清涼感が得られた。
【００４８】
以上の結果から、通常の冷凍庫などにおいて簡便に過冷却状態を維持できる飲料が提供されたことが明らかになった。このような飲料は、従来技術のように特殊な装置、即ち、静電場を発生させる装置および保管庫が不要であるため、簡便に過冷却状態を維持できる。
【００４９】
例４．比較例
終濃度が０．０００１重量％になるように添加したこと以外は、前述の例３に記載の方法と同様にフラボノイド配糖体を加えたコーラ、健康飲料、緑茶および水道水を調製した。これらを、−５℃の冷凍庫に７日間保存したところ、半数の飲料が凍結してしまい、飲料としては好ましくないことが明らかになった。
【００５０】
例５．粗抽出物による効果
上述の例２に記載の方法により得られた粗抽出物を用いて、フラボノイド配糖体混合物として終濃度０．００１重量％となるように飲料を調製し、上述の例３と同様に試験を行った。即ち、５００ｍＬのペットボトルにそれぞれに入れたコーラ、健康飲料、緑茶および水道水を２５０ｍＬ入れ、そこにフラボノイド配糖体混合物として終濃度が０．００１重量％となるように０．０１重量％の粗抽出物を添加した。その後、−５℃の冷凍庫に７日間保存した。その結果、何れの飲料も凍結しなかった。また、刺激的な冷却効果が感じられると共に、きわめて素晴らしい清涼感が得られた。
【００５１】
以上の結果から、通常の冷凍庫などにおいて簡便に過冷却状態を維持できる飲料が提供された。このような飲料は、従来技術のように特殊な装置、即ち、静電場を発生させる装置および保管庫が不要であるため、簡便に過冷却状態を維持できる。
【００５２】
例５．粗抽出物の抗酸化機能
不飽和脂肪酸ラジカルのモデルとして安定なフリーラジカルα、α−ジフェニル−β−ピクリルヒドラジル（α、α−diphenyl−β−picrylhydrazyl；DPPH・）を用い、一定量の抗酸化剤との反応によって減少する量を測定することにより、これらの抗酸化剤の効果を調べた。
【００５３】
０．１Ｍの酢酸緩衝液（pH5.5）２ｍＬに抗酸化剤０．０１％を溶かし、エタノール２ｍＬおよび０．５mMのDPPH・エタノール溶液１ｍＬを加えて全量を５ｍＬとし、３０分後に５１７nmの吸光度の減少を測定した。
【００５４】
その結果、ケンフェロール−７−O−グルコシドは、強い抗酸化作用が知られているコーヒー酸と同等およびそれ以上の抗酸化活性を持つことが明らかになった（図８）。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】カツラの抽出物の酢酸エチル可溶画分のシリカゲルカラムクロマトグラフを示す図。
【図２】シリカゲルカラムクロマトグラフ画分の過冷却活性を示す図。横軸は、液滴を載せた銅板の温度を示し、縦軸は、凍結した液滴の割合を示す。
【図３】画分９と１０を合わせた画分の高速液体クロマトグラフを示す図。
【図４】Ｃｊ４のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図５】Ｃｊ５のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図６】Ｃｊ６のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図７】Ｃｊ７のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図８】ケンフェロール−７−O−グルコシドの抗酸化作用を示す図。高い抗酸化作用が知られているコーヒー酸との比較により示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過冷却飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、飲料を冷却して飲む場合、その温度は０℃以上である。より低温の飲料を摂取することで、液体を飲みながら清涼感を得ることや、身体の冷却効果が期待できる。現在、水を０℃以下の冷却状態にする技術は幾つかが開示されている（特許文献１、特許文献２）。
【０００３】
しかしながらこれらの技術では、水を過冷却状態にして保管するためには、静電場を発生させる装置および保管庫が必要である。従って、設備が複雑且つ大型化してしまう。
【特許文献１】特開２００５−１５６０４２
【特許文献２】特開２００６−２３０２５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、簡便に過冷却状態を維持できる飲料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するための手段は、
下記一般式：
【化２】
【０００６】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他は水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ同じであっても異なっていてもよく、水素原子、水酸基またはメトキシ基である）
で表されるフラボノイド配糖体を０．００１重量％〜０．１重量％の量で含むＨ２Ｏを主成分とする飲料である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、簡便に過冷却状態を維持できる飲料を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の飲料は、下記一般式：
【化３】
【０００９】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他が水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素原子、水酸基またはメトキシ基であり、これらは互いに同じであっても異なっていてもよい）
で表されるフラボノイド配糖体を含むＨ２Ｏを主成分とする飲料であればよい。
【００１０】
このような本発明の飲料は、刺激的な冷却効果と、きわめて素晴らしい清涼感を有する。また、通常の冷凍庫などにおいて簡便に過冷却状態を維持できるので、従来技術のように特殊な装置、即ち、静電場を発生させる装置および保管庫が不要であるため、簡便に過冷却状態を維持できる。更に、抗酸化剤としての作用を有するため、健康維持に寄与することが可能である。
【００１１】
本発明は、発明者らが、寒冷地に成育する樹木の細胞水が低温で液体状態を保つメカニズムを研究する過程で、その原因となる物質を特定する研究の結果、樹木中に存在する過冷却促進物質を同定したことに基づく。
【００１２】
本発明に使用されるフラボノイド配糖体は、下記一般式：
【化４】
【００１３】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他が水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、水素原子、水酸基またはメトキシ基であり、これらは互いに同じであっても異なっていてもよい）
で表されるフラボノイド配糖体である。
【００１４】
当該フラボノイド配糖体に含まれる糖残基は、単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた残基であればよく、例えば、下式：
【化５】
【００１５】
の単糖またはオリゴ糖の基本骨格のＣ１炭素の水酸基が除かれた残基であればよい。
【００１６】
当該単糖は、例えば、グルコース、マンノースおよびガラクトースなどを含み、当該オリゴ糖は、例えば、ルチノース、シュークロースおよびラフィノースなどを含んでよい。好ましい例は、グルコース、マンノースおよびガラクトースである。
【００１７】
当該フラボノイド配糖体は、好ましくは、ケンフェロール、アピゲニン、クリシン、ガランギン、アカセチンおよびケルセチン、８−メトキシケンフェロールの配糖体である。本発明の飲料は、これらのうち少なくとも１つのフラボノイド配糖体を単独で、または２つ以上を組み合わせて含んでもよい。
【００１８】
本発明に従うフラボノイド配糖体は、人工的に合成されたものであってもよく、樹木などの植物から抽出された粗抽出物に含まれる形態で当該飲料に添加されてもよい。
【００１９】
本発明に使用されるフラボノイド配糖体は、樹木の二次代謝物として、非常に多くの種類が植物や樹木中に存在することがよく知られている。しかしながら、フラボノイド配糖体が水の過冷却活性を促進するということは、これまでの研究の結果から本願発明者らによって初めて明らかにされた。
【００２０】
本発明に従うフラボノイド配糖体を抽出することが可能な樹木の例は、これらに限定するものではないが、当該フラボノイド配糖体が多量に含有されている寒冷地に育成する樹木であればよく、例えば、カラマツ、ニオイヒバ、イチイ、スギ、ウラジロモミ、トドマツ、エゾマツ、アカエゾマツ、キタゴヨウ、ストローブマツ、アカマツ、クロマツなどの針葉樹、シラカンバ、ヤマナラシ、クリ、ナナカマド、ハクウンボク、ミズナラ、ハルニレ、カツラなどの広葉樹が含まれる。
【００２１】
当該フラボノイド配糖体は、例えば、上記樹種の辺材、心材を含む木部、樹皮、冬芽、葉から抽出することが可能である。また、これらの物質は、生きている細胞（即ち、柔細胞）内にあるものと考えられるが、細胞外に存在している可能性もある。また、当該フラボノイド配糖体は安定であるので、生立木のみならず、古死木や長期保存された木材からも抽出することが可能であり、そこから抽出されたフラボノイド配糖体も本発明において使用することが可能である。
【００２２】
当該フラボノイド配糖体は、樹木から、例えば、メタノールまたはエタノールにより抽出することが可能である。例えば、樹木を小片化し、液体窒素で凍結し、乳鉢と乳棒で可能な限り小片に粉砕し、得られた粉砕物をメタノールに浸漬すればよい。
【００２３】
上述のように抽出された粗抽出物は凍結乾燥により有機溶媒を除去した後、当該フラボノイド配糖体は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの手段により更に精製されてもよい。また、粗抽出物に含まれる当該フラボノイド配糖体を定量することも望ましい。それにより、所望の濃度のフラボノイドを含有する本発明の飲料を、粗抽出物を用いて調製することが可能である。
【００２４】
また、当該フラボノイド配糖体は人工的に合成したものであってもよく、例えば、それ自体公知の合成方法に従って合成することが可能である。
【００２５】
本発明の飲料において、当該フラボノイド配糖体は、フラボノイド配糖体として０．００１重量％〜０．１重量％、好ましくは０．０１重量％〜０．１重量％、最も好ましくは０．０１重量％の量で含まれる。例えば、粗抽出物の形態で当該フラボノイド配糖体を本発明の飲料に添加する場合には、粗抽出物として、０．０１重量％〜１重量％、好ましくは０．０１重量％〜０．１重量％、最も好ましくは０．１重量％の量で本発明の飲料に含まれればよい。
【００２６】
本発明の飲料において、当該フラボノイド配糖体は、Ｈ２Ｏを主成分とする液体に可溶化または懸濁されて含まれればよい。
【００２７】
また、本発明の飲料は活性酸素を抑え健康を増進する効果も期待できる。
【００２８】
［例］
例１．樹木からのフラボノイド配糖体の抽出
北海道札幌地区に自生するカツラから枝を採集した。このカツラの枝の木部組織を鉛筆削りで小片化した後、液体窒素で凍結し、乳鉢と乳棒で可能な限り小片に粉砕した。得られた木部組織の粉砕物３．７Ｋｇをメタノール２０Ｌに２週間浸漬した。得られた抽出液を１４，０００Ｇで遠心分離し（Hitachi:HIMC CF15R）、上清を回収した。これらを乾燥して粗抽出物を得た。この粗抽出物９３．８ｇを３００ｍＬの水に溶かした。
【００２９】
上述のような方法により得られた粗抽出物の水懸濁液を２０℃で１４，０００Gで遠心分離し、上澄を回収した。この上澄３００ｍＬと酢酸エチル６００ｍＬを混合し、分液ロートにて、水可溶部と酢酸エチル可溶部に分けて乾燥した。
【００３０】
これらの画分の過冷却活性を以下の方法で測定した。氷核活性細菌（Erwinia ananas）の死滅菌体（和光純薬社製）を含む緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）に被測定物０．５ｍｇ／ｍＬを混合し、温度コントロールされた銅板上に２μＬの液滴として載せ、その銅板を０．２℃／ｍｉｎで冷却して凍結する液滴数を肉眼的に観察し、５０％の液滴が凍結した温度を凍結温度とした。この凍結温度と上記緩衝液の凍結温度を測定し、結果を「℃」で示した。水可溶部では２℃程度の、酢酸エチル可溶部では４℃程度の過冷却活性が得られた。
【００３１】
より高い過冷却活性を示した乾燥した酢酸エチル可溶画分を「ヘキサン・２−プロパノール・水」、「クロロホルム・メタノール・水」を用いて自作のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで３０程のフラクションに分けた。このシリカゲルカラムクロマトグラフを図１に示す。次に、各フラクションの物質について、過冷却活性を上記と同様の方法で測定した。その結果、図２に示すように画分９と１０が最大過冷却値を示した。
【００３２】
上記で得られた画分９と１０を、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Wakosil 5C18HG、溶媒；メタノール：水＝１：１、流速１ｍＬ／ｍｉｎ）で分析した結果、図３に示すように７つの物質の存在を示すピーク（１〜７）を得た。
【００３３】
これらのピークのうち、過冷却活性を示したのは４、５、６、７のピーク（以下、それぞれＣｊ４〜７と称す）のみであり、その活性は、それぞれ１．８℃（Ｃｊ４）、９．０℃（Ｃｊ５）、０．２℃（Ｃｊ６）、２．５℃（Ｃｊ７）であった。
【００３４】
これらの物質は何れも２５０〜２７０ｎｍと３００〜３８０ｎｍに吸収ピークを持つ特徴的なＵＶスペクトルを示したことからフラボノール骨格を持つことが予想された。
【００３５】
また、これら４つのピークに含まれる物質について質量分析装置（JEOL:JMS- SX102A）にてｎｅｇａｔｉｖｅ−ＨＲＦＡＢ−ＭＳ分析を行った。これらの物質のそれぞれの質量は、４６３．０８９３（Ｃｊ４）、４４７．０９４２（Ｃｊ５）、４７７．１０３８（Ｃｊ６）、４４７．０９５８（Ｃｊ７）であり、分子式はＣ２１Ｈ２０Ｏ１２（Ｃｊ４）、Ｃ２１Ｈ２０Ｏ１１（Ｃｊ５）、Ｃ２２Ｈ２２Ｏ１２（Ｃｊ６）、Ｃ２１Ｈ２０Ｏ１１（Ｃｊ７）と予想された。
【００３６】
更に、これらの物質をアセチル化し、高分解能核磁気共鳴装置（BRUKER:AMX-500）により、反応生成物の各種について1次元および２次元ＮＭＲスペクトル分析を行った。アセチル化反応は、約１０ｍｇの乾燥試料を２００μＬのメタノールで溶解し、そこに２ｍＬの無水酢酸と１ｍＬのピリジンを加えて、７０℃で１．５時間処理することで行った。得られたアセチル化物を分取ＴＬＣで精製した後に、重クロロホルムに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＣＯＭ、ＤＥＰＴ、１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、ＨＳＱＣのＮＭＲスペクトル分析を行った。それぞれのアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４〜７に示す。
【００３７】
Ｃｊ７のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、７つのアセチル基によるシグナル（δ １．９２〜２．４５）、Ｂ環の２’、３’、５’、６’位の水素によるシグナル（δ ７．２３、８．０４）、芳香環に結合した２つの水素によるシグナルを示した（δ ６．８４、７．３０）。また、β−グルコース残基の存在も確認された（δ ３．６０、３．９２、４．００、５．０４、５．１７、５．２８、５．５３）。グルコースのアノメリック炭素に結合した水素とアグリコンの３位の炭素との間にＨＭＢＣ相関が見られた。以上の結果からＣｊ７はケンフェロール−３−Ｏ−β−グルコシドであると同定した（図７）。
【００３８】
Ｃｊ４のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＣｊ７のものと比較すると、Ｃｊ４ではアセチル基によるシグナル（δ １．９２〜２．４５）は８つであり、Ｂ環の２’、５’、６’に結合した水素によるシグナル（δ ７．３３、７．９３、７．９６）が見られた。この結果とＨＭＢＣ相関からＣｊ４はケルセチン−３−Ｏ−β−グルコシドであった（図４）。
【００３９】
Ｃｊ６のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＣｊ７のものと比較すると、Ｃｊ６では芳香環に結合した水素は１つであり（δ ６．７９）、メトキシル基によるシグナル（δ３．９７）が現れていた。この結果とＨＭＢＣ相関からＣｊ６は８−メトキシケンフェロール−３−Ｏ−β−グルコシドであると同定した（図６）。
【００４０】
Ｃｊ５のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｃｊ７のものと同様に７つのアセチル基によるシグナル（δ １．９２〜２．４５）、Ｂ環の２’、３’、５’、６’位の水素によるシグナル（δ ７．２７、７．８４）、芳香環に結合した２つの水素によるシグナルを示した（δ ６．７３、７．０１）。また、Ｃｊ５の酸化加水分解をアセチル化して得られた構成糖のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、アセチル化したグルコースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと一致した。構成糖の１位の水素とアグリコンの７位の炭素との間にＨＭＢＣ相関が見られたことからＣｊ５は、ケンフェロール−７−Ｏ−β−グルコシドであった（図５）。
【００４１】
これら質量分析およびＮＭＲスペクトル分析の結果から、これら物質は何れもフラボノイド配糖体であり、アグリコンは、ケルセチン、ケンフェロール、８−メトキシケンフェロールの何れかであり、これらアグリコンにグルコースが１つ付いた配糖体であると結論付けられた。
【００４２】
即ち、抽出された過冷却促進物質は、下式で表されるフラボノイド配糖体であった。
【化６】
【００４３】
例２．樹木からのフラボノイド配糖体の抽出
北海道札幌地区に自生するカツラから枝を採集した。このカツラの枝の木部組織を鉛筆削りで小片化した後、液体窒素で凍結し、乳鉢と乳棒で可能な限り小片に粉砕した。得られた木部組織の粉砕物３．７Ｋｇをメタノール２０Ｌに２週間浸漬した。得られた抽出液を１４，０００Ｇで遠心分離し（Hitachi:HIMC CF15R）、上清を回収した。これらを凍結乾燥し、粗抽出物とした。この粗抽出物０．０３ｇを３００ｍＬの水に溶かし（０．０１％）、以下の例５において使用した。
【００４４】
当該粗抽出物に含まれるフラボノイド配糖体の同定および定量を以下のように行った。同定はHPLCにより行い、ケンフェロール−７−Ｏ−グルコシドを含む、フラボノイド配糖体のピークを、ルチンを基準物質として定量した。
【００４５】
その結果、当該粗抽出物には、ケンフェロール−７−Ｏ−グルコシド、ケンフェロール−３−Ｏ−グルコシド、ケルセチン−３−０−グルコシド、８−メトキシケンフェロール−３−０−グルコシドが含まれ、活性成分としての総フラボノイド配糖体の含有量は１０％であった。
【００４６】
例３．飲用水の調製
５００ｍＬのペットボトルに、それぞれコーラ、健康飲料、緑茶または水道水を２５０ｍＬ入れ、これらに終濃度が０．００１重量％となるようにフラボノイド配糖体を加えて溶解した。使用したフラボノイド配糖体は、９５％以上の純度に精製されたケンフェロール−７−Ｏ−グルコシド、および樹木からの粗抽出物であった。
【００４７】
このように調製した飲料を−５℃の冷凍庫の中で７日間保存したところ、これらの飲料は何れも凍結しなかった。更に、これら過冷却状態の飲料を一般的な冷蔵庫に貯蔵された０℃から８℃の飲料と飲み比べた。その結果、刺激的な冷却効果が感じられると共に、きわめて素晴らしい清涼感が得られた。
【００４８】
以上の結果から、通常の冷凍庫などにおいて簡便に過冷却状態を維持できる飲料が提供されたことが明らかになった。このような飲料は、従来技術のように特殊な装置、即ち、静電場を発生させる装置および保管庫が不要であるため、簡便に過冷却状態を維持できる。
【００４９】
例４．比較例
終濃度が０．０００１重量％になるように添加したこと以外は、前述の例３に記載の方法と同様にフラボノイド配糖体を加えたコーラ、健康飲料、緑茶および水道水を調製した。これらを、−５℃の冷凍庫に７日間保存したところ、半数の飲料が凍結してしまい、飲料としては好ましくないことが明らかになった。
【００５０】
例５．粗抽出物による効果
上述の例２に記載の方法により得られた粗抽出物を用いて、フラボノイド配糖体混合物として終濃度０．００１重量％となるように飲料を調製し、上述の例３と同様に試験を行った。即ち、５００ｍＬのペットボトルにそれぞれに入れたコーラ、健康飲料、緑茶および水道水を２５０ｍＬ入れ、そこにフラボノイド配糖体混合物として終濃度が０．００１重量％となるように０．０１重量％の粗抽出物を添加した。その後、−５℃の冷凍庫に７日間保存した。その結果、何れの飲料も凍結しなかった。また、刺激的な冷却効果が感じられると共に、きわめて素晴らしい清涼感が得られた。
【００５１】
以上の結果から、通常の冷凍庫などにおいて簡便に過冷却状態を維持できる飲料が提供された。このような飲料は、従来技術のように特殊な装置、即ち、静電場を発生させる装置および保管庫が不要であるため、簡便に過冷却状態を維持できる。
【００５２】
例５．粗抽出物の抗酸化機能
不飽和脂肪酸ラジカルのモデルとして安定なフリーラジカルα、α−ジフェニル−β−ピクリルヒドラジル（α、α−diphenyl−β−picrylhydrazyl；DPPH・）を用い、一定量の抗酸化剤との反応によって減少する量を測定することにより、これらの抗酸化剤の効果を調べた。
【００５３】
０．１Ｍの酢酸緩衝液（pH5.5）２ｍＬに抗酸化剤０．０１％を溶かし、エタノール２ｍＬおよび０．５mMのDPPH・エタノール溶液１ｍＬを加えて全量を５ｍＬとし、３０分後に５１７nmの吸光度の減少を測定した。
【００５４】
その結果、ケンフェロール−７−O−グルコシドは、強い抗酸化作用が知られているコーヒー酸と同等およびそれ以上の抗酸化活性を持つことが明らかになった（図８）。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】カツラの抽出物の酢酸エチル可溶画分のシリカゲルカラムクロマトグラフを示す図。
【図２】シリカゲルカラムクロマトグラフ画分の過冷却活性を示す図。横軸は、液滴を載せた銅板の温度を示し、縦軸は、凍結した液滴の割合を示す。
【図３】画分９と１０を合わせた画分の高速液体クロマトグラフを示す図。
【図４】Ｃｊ４のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図５】Ｃｊ５のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図６】Ｃｊ６のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図７】Ｃｊ７のアセチル化物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。
【図８】ケンフェロール−７−O−グルコシドの抗酸化作用を示す図。高い抗酸化作用が知られているコーヒー酸との比較により示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式：
【化１】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他は水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ同じであっても異なっていてもよく、水素原子、水酸基またはメトキシ基である）
で表されるフラボノイド配糖体を０．００１重量％〜０．１重量％の量で含むＨ２Ｏを主成分とする飲料。
【請求項２】
前記単糖が、グルコース、マンノースまたはガラクトースからなる群、当該オリゴ糖が、ルチノース、シュークロースおよびラフィノースからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の飲料。
【請求項３】
前記フラボノイド配糖体が、ケンフェロール、アピゲニン、クリシン、ガランギン、アカセチン、ケルセチンおよび８−メトキシケンフェロールの配糖体からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の飲料。
【請求項４】
前記フラボノイド配糖体が、９５％以上の純度で精製された物質であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の飲料。
【請求項５】
前記フラボノイド配糖体が、植物由来の粗抽出物として添加されることを特徴とする請求項１または請求項４の何れか１項に記載の飲料。
【請求項６】
前記飲料が、水、ジュース、健康飲料および緑茶からなる群より選択されることを特徴とする請求項１から請求項１〜５の何れか１項に記載の飲料
【請求項１】
下記一般式：
【化１】
（ここで、Ｘ１〜Ｘ４のうち、少なくとも１つが単糖またはオリゴ糖の還元末端部分のヘミアセタール水酸基を除いた糖残基であり、その他は水酸基または水素原子であり、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ同じであっても異なっていてもよく、水素原子、水酸基またはメトキシ基である）
で表されるフラボノイド配糖体を０．００１重量％〜０．１重量％の量で含むＨ２Ｏを主成分とする飲料。
【請求項２】
前記単糖が、グルコース、マンノースまたはガラクトースからなる群、当該オリゴ糖が、ルチノース、シュークロースおよびラフィノースからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の飲料。
【請求項３】
前記フラボノイド配糖体が、ケンフェロール、アピゲニン、クリシン、ガランギン、アカセチン、ケルセチンおよび８−メトキシケンフェロールの配糖体からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の飲料。
【請求項４】
前記フラボノイド配糖体が、９５％以上の純度で精製された物質であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の飲料。
【請求項５】
前記フラボノイド配糖体が、植物由来の粗抽出物として添加されることを特徴とする請求項１または請求項４の何れか１項に記載の飲料。
【請求項６】
前記飲料が、水、ジュース、健康飲料および緑茶からなる群より選択されることを特徴とする請求項１から請求項１〜５の何れか１項に記載の飲料
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２１９３９４（Ｐ２００９−２１９３９４Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６６０１２（Ｐ２００８−６６０１２）
【出願日】平成２０年３月１４日（２００８．３．１４）
【出願人】（５０８０７９２４５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１４日（２００８．３．１４）
【出願人】（５０８０７９２４５）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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