遠心分離装置および細胞分離方法
【課題】細胞へのダメージを抑制しつつ、短時間で細胞分離を行うことができる遠心分離装置および細胞分離方法を提供する。
【解決手段】相対回転可能に支持された軸体３１およびハウジング３２を有するロータリージョイント３０と、軸体３１を中心軸線回りに回転駆動するモータ４０と、モータ４０の回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアームと、該アームにより軸体３１の半径方向外方に接続された消化容器１０および洗浄容器２０と、洗浄液を貯留する洗浄液バッグ５０と、廃液を収容する廃液バッグ５１と、これらを接続する流路１３，１５，２３，２５，４１，４２，５３，５５と、流路４１，４２に設けられたポンプ４５，４６と、各流路に設けられた弁６１，６２，６３，６４とを備える遠心分離装置１を採用する。
【解決手段】相対回転可能に支持された軸体３１およびハウジング３２を有するロータリージョイント３０と、軸体３１を中心軸線回りに回転駆動するモータ４０と、モータ４０の回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアームと、該アームにより軸体３１の半径方向外方に接続された消化容器１０および洗浄容器２０と、洗浄液を貯留する洗浄液バッグ５０と、廃液を収容する廃液バッグ５１と、これらを接続する流路１３，１５，２３，２５，４１，４２，５３，５５と、流路４１，４２に設けられたポンプ４５，４６と、各流路に設けられた弁６１，６２，６３，６４とを備える遠心分離装置１を採用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遠心分離装置および細胞分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、脂肪組織等の生体組織から細胞を分離する方法として、成分の密度差を利用して重力により層分離を行う方法や、フィルタを用いた分離方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２４８０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、重力による層分離を行う方法では、分離処理に長時間を要するという不都合がある。また、フィルタを用いた分離方法では、細胞がフィルタを通過する際に、フィルタのせん断力により、細胞にダメージを与えてしまうという不都合がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞へのダメージを抑制しつつ、短時間で細胞分離を行うことができる遠心分離装置および細胞分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明の第１の態様は、回転軸を有するモータと、該モータの回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアームと、該アームに周方向に等間隔をあけて半径方向に直交する軸線回りに揺動可能に支持された第１の容器および第２の容器と、該第１の容器および該第２の容器内の底部近傍に両端を開口させた第１の管路と、洗浄液を貯留する洗浄液容器と、該洗浄液容器と前記第１の管路の途中位置とに接続される第２の管路と、前記第１の管路における前記途中位置と前記第２の容器との間に設けられた第１のポンプと、前記第１の容器から前記第２の容器までの流路と前記洗浄液容器から前記第２の容器までの流路とを切り替え可能な流路切替手段と、前記第２の容器の深さ方向の途中位置に一端を開口させた第３の管路と、該第３の管路から流体を吸引する吸引手段とを備える遠心分離装置である。
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、第１の容器に脂肪組織と消化酵素液との混合液を導入してモータの作動によりアームを回転させると、該アームに支持された２つの容器が半径方向に直交する軸線回りに揺動させられる。これにより、第１の容器内の混合液が攪拌され、消化酵素液内の消化酵素により脂肪組織が消化されて細胞懸濁液が生成される。細胞懸濁液は、脂肪組織よりも比重が重いので、遠心分離または静置により下層に沈降する。そこで、流路切替手段によって第１の容器から第２の容器までの流路を選択し、第１のポンプを駆動すると、第１の容器の底部近傍に開口する第１の管路を介して、細胞懸濁液が第２の容器へと移動される。
【０００８】
そして、モータを作動させて第２の容器内の細胞懸濁液を遠心分離すると、第２の容器の底部最下層には比重の大きな細胞群が集められ、その上層には脂質や血漿等の上清が集められる。遠心分離された上清は、吸引手段により途中位置に開口する第３の管路を介して第２の容器の外部に排出される。そして、流路切替手段によって洗浄液容器から第２の容器までの流路に切り替えて、第１のポンプを駆動すると、洗浄液容器内の洗浄液が第２の管路および第１の管路を介して第２の容器内に導入され、細胞群が洗浄液によって再懸濁される。このように、遠心分離、上清の排出、洗浄液の供給を繰り返すことで、細胞群を洗浄して、含有されている不純物を除去することができる。
【０００９】
以上のように、本発明によれば、フィルタ等を用いることなく、細胞懸濁液を細胞群と上清とに分離して、分離した細胞群を洗浄することができ、細胞にダメージを与えることなく、脂肪組織から高純度の細胞群を取り出すことができる。
【００１０】
上記態様において、廃液を収容する廃液容器と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第１の容器との間と前記廃液容器とに接続される第４の管路とを備え、前記第３の管路の他端が、前記第１のポンプと前記第２の容器との間において前記第１の管路に接続され、前記流路切替手段は、さらに、前記第２の容器から前記廃液容器までの流路にも切り替え可能であることとしてもよい。
【００１１】
このようにすることで、吸引手段として第１のポンプを用いることができ、流路切替手段により第２の容器から廃液容器までの流路に切り替えた状態で第１のポンプを駆動させることにより、第３の管路を介して第２の容器の途中位置から上清等の不要な流体を吸引することができる。
【００１２】
上記態様において、前記第３の管路との接続部と前記第２の容器との間における前記第１の管路が、前記第２の容器内への給液方向のみに流体を流通させ、前記第３の管路が、前記第２の容器内からの排液方向のみに流体を流通させることとしてもよい。
【００１３】
このようにすることで、第１のポンプの送液方向を切り替えて駆動させることにより、第１の管路を介して第２の容器の底部近傍から洗浄液を供給できるとともに、第３の管路を介して第２の容器の途中位置から上清を吸引することができる。
【００１４】
上記態様において、前記第１の管路における前記途中位置と前記第１の容器との間に第２のポンプを備えることとしてもよい。
このようにすることで、第２のポンプを駆動させることにより、洗浄液容器から第２の管路および第１の管路を介して、第１の容器に洗浄液を供給することができる。これにより、第１の容器と第２の容器の重量を等しくして、第２の容器内に移動させた細胞懸濁液を遠心分離する際のバランスを保つことができる。
【００１５】
上記態様において、前記第１の管路が、前記第１の容器内の途中位置に開口し前記第１の容器内への給液方向のみに流体を流通させる給液管路と、前記第１の容器内の底部近傍に開口し前記第１の容器内からの排液方向のみに流体を流通させる排液管路とに分岐することとしてもよい。
【００１６】
このようにすることで、第２のポンプの送液方向を切り替えて駆動させることにより、給液管路を介して第１の容器の途中位置から洗浄液を供給できるとともに、排液管路を介して第１の容器内の底部近傍から流体を吸引することができる。
【００１７】
上記態様において、前記流路切替手段が、前記第２の管路に設けられた第１の弁と、前記第４の管路に設けられた第２の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第２の容器との間に設けられた第３の弁と、前記第１の管路における前記第２のポンプと前記第１の容器との間に設けられた第４の弁とを有することとしてもよい。
【００１８】
このようにすることで、第１の弁および第２の弁を閉として第３の弁および第４の弁を開とすることにより、第１の容器から第２の容器までの流路を形成することができる。また、第２の弁および第４の弁を閉として第１の弁および第３の弁を開とすることにより、洗浄液容器から第２の容器までの流路を形成することができる。さらに、第１の弁および第４の弁を閉として第２の弁および第３の弁を開とすることにより、第２の容器から廃液容器までの流路を形成することができる。このように、各弁を開閉動作させることにより、流路を択一的に切り替えることができる。
【００１９】
上記態様において、前記流路切替手段が、前記第２の管路に設けられた第１の弁と、前記第４の管路に設けられた第２の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第２の容器との間に設けられた第３の弁と、前記第１の管路における前記第２の管路と前記第１の容器との間に設けられた第４の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第３の弁との間と前記第４の弁と前記第１の容器との間とを接続するバイパス管路と、該バイパス管路に設けられた第５の弁とを有することとしてもよい。
【００２０】
このようにすることで、第１の弁、第２の弁、および第５の弁を閉として第３の弁および第４の弁を開とすることにより、第１の容器から第２の容器までの流路を形成することができる。また、第２の弁、第４の弁、および第５を閉として第１の弁および第３の弁を開とすることにより、洗浄液容器から第２の容器までの流路を形成することができる。また、第１の弁、第４の弁、および第５の弁を閉として第２の弁および第３の弁を開とすることにより、第２の容器から廃液容器までの流路を形成することができる。さらに、第２の弁、第３の弁、および第４を閉として第１の弁および第５の弁を開とすることにより、洗浄液容器から第１の容器までの流路を形成することができる。このように、各弁を開閉動作させることにより、流路を択一的に切り替えることができる。
【００２１】
本発明の第２の態様は、生体組織を必要成分と不要成分とに遠心分離して該必要成分を抽出する組織分離工程と、該組織分離工程により抽出された必要成分に消化酵素を作用させて細胞懸濁液を生成する組織消化工程と、該組織消化工程により生成された細胞懸濁液を上清と細胞群とに遠心分離して該細胞群を抽出する細胞分離工程と、該細胞分離工程により抽出された細胞群を遠心分離して濃縮する細胞濃縮工程と、該細胞濃縮工程により濃縮された細胞群を洗浄する細胞洗浄工程とを有する細胞分離方法である。
【００２２】
本発明の第２の態様によれば、組織分離工程により、脂肪組織等の生体組織を細胞群等の必要成分とチュメッセント等の不要成分とに遠心分離して、該必要成分を抽出することで、生体組織から不要成分を除去して、必要成分の純度を高めることができる。そして、組織消化工程により必要成分に消化酵素を作用させることで、消化酵素液により生体組織を消化させて、細胞懸濁液を生成することができる。そして、細胞分離工程により細胞懸濁液を脂質等の上清と細胞群とに遠心分離することで、細胞懸濁液から細胞群を抽出することができる。そして、細胞濃縮工程により細胞群を遠心分離して濃縮するとともに、細胞洗浄工程により細胞群を洗浄することで、細胞群に含まれている不要成分を低減して、高純度の細胞群を取り出すことができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、細胞へのダメージを抑制しつつ、短時間で細胞分離を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る遠心分離容器の概略構成図である。
【図２】図１の遠心分離容器を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【図３】図１の遠心分離容器を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【図４】図２の組織分離工程の状態を説明する図である。
【図５】図２の組織分離工程の状態を説明する図である。
【図６】図２の組織消化工程の状態を説明する図である。
【図７】図２の細胞分離工程の状態を説明する図である。
【図８】図２の細胞分離工程の状態を説明する図である。
【図９】図２の細胞濃縮工程の状態を説明する図である。
【図１０】図２の細胞濃縮工程の状態を説明する図である。
【図１１】図３の細胞洗浄工程の状態を説明する図である。
【図１２】図３の細胞洗浄工程の状態を説明する図である。
【図１３】図３の細胞洗浄工程の状態を説明する図である。
【図１４】図３の細胞洗浄工程の状態を説明する図である。
【図１５】図３の細胞取出工程の状態を説明する図である。
【図１６】図３の細胞取出工程の状態を説明する図である。
【図１７】本発明の第２の実施形態に係る遠心分離容器の概略構成図である。
【図１８】図１７の遠心分離容器を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【図１９】図１７の遠心分離容器を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る遠心分離装置および細胞分離方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る遠心分離装置１は、例えば脂肪組織等の生体組織を成分毎に分離する装置であって、図１に示されるように、相対回転可能に支持された軸体３１およびハウジング３２を有するロータリージョイント３０と、軸体３１を中心軸線回りに回転駆動するモータ４０と、モータ４０の回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアーム（図示略）と、該アームにより軸体３１の半径方向外方に接続された消化容器（第１の容器）１０および洗浄容器（第２の容器）２０と、洗浄液を貯留する洗浄液バッグ（洗浄液容器）５０と、廃液を収容する廃液バッグ（廃液容器）５１と、これらを接続する流路１３，１５，２３，２５，４１，４２，５３，５５と、各流路に設けられた弁（流路切替手段）６１，６２，６３，６４と、各部の動作を制御する制御部（図示略）とを主な構成要素として備えている。
【００２６】
消化容器１０および洗浄容器２０は、周方向に等間隔をあけて配置され、アームにより、半径方向に直交する軸線回りに揺動可能に支持されている。したがって、モータ４０を作動させてアームをモータ４０の中心軸線回りに回転させると、消化容器１０および洗浄容器２０は、底部が半径方向外方に向かうように回転させられる。これにより、消化容器１０および洗浄容器２０は、内部に細胞懸濁液等を収容して回転させることで、細胞懸濁液に含まれている成分の比重の差によって、細胞懸濁液を細胞群と上清とに遠心分離するようになっている。
【００２７】
消化容器１０は、円筒状に形成され、一端が開口し他端がテーパ状に漸次先細になって閉塞された形状を有している。消化容器１０は、開口部を閉塞する蓋体１８を有している。蓋体１８には、脂肪組織Ａおよび消化酵素液Ｂを投入するための投入口１７が設けられている。消化容器１０の内部には、蓋体１８の略中央から消化容器１０の軸線に沿って延びた管路１１，１２が設けられている。管路１１は消化容器１０の途中位置に開口しており、管路１２は消化容器１０の底部近傍に開口している。
【００２８】
管路１１には流路１５が、管路１２には流路１３がそれぞれ接続されている。流路１３と流路１５とは合流してロータリージョイント３０の軸体３１に接続されている。流路１３，１５にはそれぞれ逆止弁１４，１６が設けられており、流路１３は消化容器１０からの排液方向のみに、流路１５は消化容器１０への給液方向のみに流体を流通させるようになっている。
【００２９】
洗浄容器２０は、消化容器１０と同様に、円筒状に形成され、一端が開口し他端がテーパ状に漸次先細になって閉塞された形状を有している。洗浄容器２０は、開口部を閉塞する蓋体２８を有している。蓋体２８には、最終的な生成物である細胞群を取り出すための取出口２７が設けられている。洗浄容器２０の内部には、蓋体２８の略中央から洗浄容器２０の軸線に沿って延びた管路２１，２２が設けられている。管路２２は洗浄容器２０の途中位置に開口しており、管路２１は洗浄容器２０の底部近傍に開口している。
【００３０】
管路２１には流路２５が、管路２２には流路２３がそれぞれ接続されている。流路２３と流路２５とは合流してロータリージョイント３０の軸体３１に接続されている。流路２３，２５にはそれぞれ逆止弁２４，２６が設けられており、流路２３は洗浄容器２０からの排液方向のみに、流路２５は洗浄容器２０への給液方向のみに流体を流通させるようになっている。
【００３１】
ロータリージョイント３０は、円筒形状の軸体３１と、軸体３１の外側に同心円に配置された円筒形状のハウジング３２と、軸体３１およびハウジング３２を中心軸線回りに相対回転可能に支持する回転軸受３３とを備えている。軸体３１の内部には流路３４，３５が形成されており、これら流路３４，３５は軸体３１およびハウジング３２に開口している。
【００３２】
流路１３および流路１５は、合流して軸体３１に接続されており、軸体３１の内部に形成された流路３４を介して、流路４２に接続されている。流路２３および流路２５は、合流して軸体３１に接続されており、軸体３１の内部に形成された流路３５を介して、流路４１に接続されている。
【００３３】
流路４１には弁（第３の弁）６３およびポンプ（第１のポンプ）４５が設けられており、流路４２には弁（第４の弁）６４およびポンプ（第２のポンプ）４６が設けられている。ポンプ４５，４６は、双方向に送液ができるようになっている。流路４１と流路４２は、一旦合流した後に、流路５３と流路５５とに再度分岐する。
【００３４】
流路５３は廃液バッグ５１に接続されており、その流路中には弁（第２の弁）６２が設けられている。流路５５は洗浄液バッグ５０に接続されており、その流路中には弁（第１の弁）６１が設けられている。
モータ４０、弁６１，６２，６３，６４、およびポンプ４５，４６は、図示しない制御部によりその動作が制御されるようになっている。
【００３５】
上記構成を有する遠心分離装置１において、制御部による各弁等の制御と、該制御により実行される細胞分離方法について、図２および図３に示すフローチャートに従って以下に説明する。
図２および図３に示されるように、本実施形態の遠心分離装置１を用いた細胞分離方法は、脂肪組織を脂肪（必要成分）とチュメッセント等（不要成分）とに遠心分離して脂肪を抽出する組織分離工程Ｓ１と、組織分離工程Ｓ１により抽出された脂肪に消化酵素を作用させて細胞懸濁液を生成する組織消化工程Ｓ２と、組織消化工程Ｓ２により生成された細胞懸濁液を脂質と細胞群とに遠心分離して細胞群を抽出する細胞分離工程Ｓ３と、細胞分離工程Ｓ３により抽出された細胞群を遠心分離して濃縮する細胞濃縮工程Ｓ４と、細胞濃縮工程Ｓ４により濃縮された細胞群を洗浄する細胞洗浄工程Ｓ５と、細胞洗浄工程Ｓ５により洗浄された細胞群を取り出す細胞取出工程Ｓ６とを主な工程として有している。
【００３６】
上記の工程において実行される詳細な動作について以下に説明する。
組織分離工程Ｓ１においては、図４に示すように、まず、投入口１７から消化容器１０内に脂肪組織Ａが投入される（Ｓ１１）。次に、弁６１開、弁６２閉、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０に、脂肪組織Ａと等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１２）。これにより、消化容器１０と洗浄容器２０の重量を等しくして、消化容器１０内の脂肪組織Ａを遠心分離する際のバランスを保つことができる。
【００３７】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。すなわち、消化容器１０内に脂肪組織Ａを収容した状態で、消化容器１０の底部が半径方向外方に向かうように回転させる。これにより、図５に示すように、脂肪組織Ａの成分の比重によって、脂肪組織Ａは、消化容器１０の中で、脂肪Ａ１、チュメッセントＡ２、赤血球Ａ３の層に分離される（Ｓ１３）。
【００３８】
次に、図５に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて消化容器１０のチュメッセントＡ２、赤血球Ａ３の層を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１４）。
このようにすることで、脂肪採取時に注入されるチュメッセントＡ２や脂肪組織Ａに含まれている赤血球Ａ３等の不要成分を除去することができ、必要成分である脂肪Ａ１を効率的に分離することができる。
【００３９】
組織消化工程Ｓ２においては、図６に示すように、まず、弁６１開、弁６２閉、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に洗浄液Ｄを供給する（Ｓ２１）。
【００４０】
次に、図６に示すように、シリンジ７０により、投入口１７から脂肪Ａ１を消化するための消化酵素液Ｂを注入する（Ｓ２２）。この際、脂肪Ａ１への異物や雑菌等の混入を防止するため、シリンジ７０の出口側に滅菌フィルタ７１をつけて使用する。
【００４１】
次に、モータ４０を動作させて、例えば０Ｇから２０Ｇを１ｃｙｃｌｅ／ｓｅｃで２０分間繰り返すことで、消化容器１０が揺動させられて、消化容器１０の内部が撹拌される（Ｓ２３）。これにより、消化酵素液Ｂに含まれている消化酵素により脂肪Ａ１が分解され、細胞が脂肪Ａ１から分離されて細胞懸濁液が生成される。
【００４２】
細胞分離工程Ｓ３においては、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。これにより、図７に示すように、消化容器１０内の細胞懸濁液の成分の比重によって、細胞懸濁液は、消化容器１０の中で、不要物である脂質Ｃ１と必要物である細胞群を含む懸濁液Ｃ２の層に分離される（Ｓ３１）。
【００４３】
次に、図７に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄容器２０の洗浄液Ｄを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ３２）。
【００４４】
次に、図８に示すように、弁６１閉、弁６２閉、弁６３開、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４５およびポンプ４６を動作させて消化容器１０内の懸濁液Ｃ２を洗浄容器２０に移動させる（Ｓ３３）。
【００４５】
細胞濃縮工程Ｓ４においては、図９に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて消化容器１０の脂質Ｃ１を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ４１）。
【００４６】
次に、図１０に示すように、弁６１開、弁６２閉、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に懸濁液Ｃ２と等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ４２）。これにより、消化容器１０と洗浄容器２０の重量を等しくして、洗浄容器２０内の懸濁液Ｃ２を遠心分離する際のバランスを保つことができる。
【００４７】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。これにより、図１０に示すように、懸濁液Ｃ２は、懸濁液Ｃ２内の成分の比重によって、洗浄容器２０の中で、上清Ｃ３とペレット状の細胞群Ｃ４とに分離される（Ｓ４３）。
【００４８】
細胞洗浄工程Ｓ５においては、図１１に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄容器２０の上清Ｃ３を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ５１）。
【００４９】
次に、図１２に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて消化容器１０内の洗浄液Ｄを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ５２）。
【００５０】
次に、図１３に示すように、弁６１開、弁６２閉、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０に洗浄液Ｄを供給する（Ｓ５３）。このようにすることで、細胞群Ｃ４が遠心力によりペレット状に凝集してしまった場合にも、洗浄液Ｄの流動エネルギによって細胞群Ｃ４を攪拌し、ペレット状の細胞群Ｃ４が解れて分散させられる。これにより、細胞群Ｃ４内に含まれている不要成分を洗浄液Ｄ内に解放して放出させることができる。
【００５１】
次に、図１４に示すように、弁６１開、弁６２閉、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に洗浄容器２０と等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ５４）。これにより、遠心分離の際のバランスが保たれる。
【００５２】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う（Ｓ５５）。これにより、洗浄容器２０内の細胞群Ｃ４と洗浄液Ｄとの混合液が、上清Ｅと細胞群Ｃ４とに遠心分離される。
そして、上記の細胞洗浄工程Ｓ５を最初から２回繰り返す（Ｓ５６）。このようにすることで、細胞群に含まれる不要成分をさらに低減することができる。
【００５３】
細胞取出工程Ｓ６においては、図１５に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄容器２０の上清Ｅを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ６１）。
そして、図１６に示すように、シリンジ７０を用いて取出口２７から、最終的に洗浄容器２０内に残った細胞群Ｃ４を採取する（Ｓ６２）。
【００５４】
以上のように、本実施形態に係る遠心分離装置１によれば、弁６１および弁６２を閉として弁６３および弁６４を開とすることにより、消化容器１０から洗浄容器２０までの流路を形成することができる。また、弁６２および弁６４を閉として弁６１および弁６３を開とすることにより、洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０までの流路を形成することができる。さらに、弁６１および弁６４を閉として弁６２および弁６３を開とすることにより、洗浄容器２０から廃液バッグ５１までの流路を形成することができる。このように、各弁を開閉動作させることにより、流路を択一的に切り替えることができる。
【００５５】
このような遠心分離装置１において、消化容器１０に脂肪組織Ａと消化酵素液Ｂとの混合液を導入し、モータ４０を作動させてアームを回転させると、消化容器１０内の混合液が攪拌され、消化酵素液Ｂにより脂肪組織Ａが消化されて細胞懸濁液が生成される。生成された細胞懸濁液は、脂質Ｃ１と細胞群を含む懸濁液Ｃ２とに遠心分離され、遠心分離された懸濁液Ｃ２は、消化容器１０の底部近傍に開口する管路１２を介して、洗浄容器２０へと移動される。
【００５６】
洗浄容器２０に送られた懸濁液Ｃ２は、脂質や血漿等の上清Ｃ３と細胞群Ｃ４とに遠心分離される。遠心分離された上清Ｃ３は、ポンプ６３により、途中位置に開口する管路２２を介して洗浄容器２０から廃液バッグ５１に排出される。細胞群Ｃ４は、管路２１を介して洗浄容器２０内に導入された洗浄液Ｄによって再懸濁される。洗浄容器２０内において、遠心分離、上清の排出、洗浄液の供給を繰り返すことで、細胞群Ｃ４は洗浄され、含有されていた不純物が除去される。
【００５７】
このように、本実施形態に係る遠心分離装置１によれば、フィルタ等を用いることなく、細胞懸濁液を細胞群Ｃ４と上清Ｃ３とに分離して、分離した細胞群Ｃ４を洗浄することができ、細胞にダメージを与えることなく、脂肪組織Ａから高純度の細胞群Ｃ４を取り出すことができる。
【００５８】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る遠心分離装置および細胞分離方法について図１７から図１９を参照して説明する。
本実施形態に係る遠心分離装置２が第１の実施形態と異なる点は、洗浄液を供給または上清等を排出するポンプを１台で兼用した点である。以下、本実施形態の遠心分離装置２について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。なお、第１の実施形態と同じ構成要素については、図１と同一の符号を用いて説明する。
【００５９】
本実施形態に係る遠心分離装置２は、図１７に示されるように、相対回転可能に支持された軸体３１およびハウジング３２を有するロータリージョイント３０と、軸体３１を中心軸線回りに回転駆動するモータ４０と、モータ４０の回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアーム（図示略）と、該アームにより軸体３１の半径方向外方に接続された消化容器（第１の容器）１０および洗浄容器（第２の容器）２０と、洗浄液を貯留する洗浄液バッグ（洗浄液容器）５０と、廃液を収容する廃液バッグ（廃液容器）５１と、これらを接続する流路１３，１５，２３，２５，４１，４２，５３，５５，８７と、各流路に設けられた弁（流路切替手段）８１，８２，８３，８４，８５と、各部の動作を制御する制御部（図示略）とを主な構成要素として備えている。
【００６０】
流路４１には弁（第４の弁）８３が設けられており、流路４２には弁（第３の弁）８５および双方向に送液可能なポンプ８６が設けられている。流路４１のロータリージョイント３０と弁８３との間には分岐点８８が設けられ、流路４２の弁８５とポンプ８６との間には分岐点８９が設けられている。分岐点８８と分岐点８９との間には、流路４１と流路４２とをバイパスする流路（バイパス管路）８７が設けられており、該流路８７には弁（第５の弁）８４が設けられている。
【００６１】
流路４１と流路４２は、一旦合流した後に、流路５３と流路５５とに再度分岐する。流路５３は廃液バッグ５１に接続されており、その流路中には弁（第２の弁）８２が設けられている。流路５５は洗浄液バッグ５０に接続されており、その流路中には弁（第１の弁）８１が設けられている。
モータ４０、弁８１，８２，８３，８４，８５、およびポンプ８６は、図示しない制御部によりその動作が制御されるようになっている。
【００６２】
上記構成を有する遠心分離装置２において、制御部による各弁等の制御と、該制御により実行される細胞分離方法について、図１８および図１９に示すフローチャートに従って以下に説明する。
図２および図３に示されるように、遠心分離装置２を用いた細胞分離方法は、脂肪組織を脂肪（必要成分）とチュメッセント等（不要成分）とに遠心分離して脂肪を抽出する組織分離工程Ｓ１１０と、組織分離工程Ｓ１１０により抽出された脂肪に消化酵素を作用させて細胞懸濁液を生成する組織消化工程Ｓ１２０と、組織消化工程Ｓ１２０により生成された細胞懸濁液を脂質と細胞群とに遠心分離して細胞群を抽出する細胞分離工程Ｓ１３０と、細胞分離工程Ｓ１３０により抽出された細胞群を遠心分離して濃縮する細胞濃縮工程Ｓ１４０と、細胞濃縮工程Ｓ１４０により濃縮された細胞群を洗浄する細胞洗浄工程Ｓ１５０と、細胞洗浄工程Ｓ１５０により洗浄された細胞群を取り出す細胞取出工程Ｓ１６０とを主な工程として有している。
【００６３】
上記の工程において実行される詳細な動作について以下に説明する。
組織分離工程Ｓ１１０においては、まず、投入口１７から消化容器１０内に脂肪組織Ａが投入される（Ｓ１１１）。次に、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０に脂肪組織Ａと等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１１２）。
【００６４】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。すなわち、消化容器１０内に脂肪組織Ａを収容した状態で、消化容器１０の底部が半径方向外方に向かうように回転させられる。これにより、脂肪組織Ａの成分の比重によって、脂肪組織Ａは、消化容器１０の中で、脂肪Ａ１、チュメッセントＡ２、赤血球Ａ３の層に分離される（Ｓ１１３）。
【００６５】
次に、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて消化容器１０のチュメッセントＡ２、赤血球Ａ３の層を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１１４）。
【００６６】
組織消化工程Ｓ１２０においては、まず、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１２１）。
【００６７】
次に、シリンジにより、投入口１７から脂肪Ａ１を消化するための消化酵素液Ｂを注入する（Ｓ１２２）。この際、脂肪Ａ１への異物や雑菌等の混入を防止するため、シリンジの出口側に滅菌フィルタをつけて使用する。
【００６８】
次に、モータ４０を動作させて、例えば０Ｇから２０Ｇを１ｃｙｃｌｅ／Ｓ１ｅｃで２０分間繰り返すことで消化容器１０の内部を撹拌する（Ｓ１２３）。これにより、消化酵素液Ｂに含まれている消化酵素により脂肪Ａ１が分解され、細胞が脂肪Ａ１から分離されて細胞懸濁液が生成される。
【００６９】
細胞分離工程Ｓ１３０においては、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。これにより、消化容器１０内の細胞懸濁液の成分の比重によって、細胞懸濁液は、消化容器１０の中で、不要物である脂質Ｃ１と必要物である細胞群を含む懸濁液Ｃ２の層に分離される（Ｓ１３１）。
【００７０】
次に、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄容器２０の洗浄液Ｄを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１３２）。
【００７１】
次に、弁８１閉、弁８２閉、弁８３開、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて消化容器１０内の懸濁液Ｃ２を洗浄容器２０に移動させる（Ｓ１３３）。
【００７２】
細胞濃縮工程Ｓ１４０においては、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて消化容器１０の脂質Ｃ１を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１４１）。
【００７３】
次に、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に懸濁液Ｃ２と等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１４２）。
【００７４】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。これにより、懸濁液Ｃ２は、懸濁液Ｃ２内の成分の比重によって、洗浄容器２０の中で、上清Ｃ３とペレット状の細胞群Ｃ４とに分離される（Ｓ１４３）。
【００７５】
細胞洗浄工程Ｓ１５０においては、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄容器２０の上清Ｃ３を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１５１）。
【００７６】
次に、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて消化容器１０内の洗浄液Ｄを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１５２）。
【００７７】
次に、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０に洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１５３）。
【００７８】
次に、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に洗浄容器２０と等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１５４）。これにより、細胞群Ｃ４内に含まれている不要成分が洗浄液Ｄ内に解放して放出される。
【００７９】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う（Ｓ１５５）。これにより、洗浄容器２０内の細胞群Ｃ４と洗浄液Ｄとの混合液が、上清Ｅと細胞群Ｃ４とに遠心分離される。
そして、上記の細胞洗浄工程Ｓ１５を最初から２回繰り返す（Ｓ１５６）。このようにすることで、細胞群に含まれる不要成分をさらに低減することができる。
【００８０】
細胞取出工程Ｓ１６０においては、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄容器２０の上清Ｅを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１６１）。
そして、シリンジを用いて取出口２７から、最終的に洗浄容器２０内に残った細胞群Ｃ４を採取する（Ｓ１６２）。
【００８１】
以上のように、本実施形態に係る遠心分離装置２によれば、弁８１、弁８２、および弁８４を閉として弁８５および弁８３を開とすることにより、消化容器１０から洗浄容器２０までの流路を形成することができる。また、弁８２、弁８３、および第５を閉として弁８１および弁８５を開とすることにより、洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０までの流路を形成することができる。また、弁８１、弁８３、および弁８４を閉として弁８２および弁８５を開とすることにより、洗浄容器２０から廃液バッグ５１までの流路を形成することができる。さらに、弁８２、弁８５、および第４を閉として弁８１および弁８４を開とすることにより、洗浄液バッグ５０から消化容器１０までの流路を形成することができる。このように、各弁を開閉動作させることにより、流路を択一的に切り替えることができる。
【００８２】
このような遠心分離装置２においては、ポンプ１台で、消化容器１０から洗浄容器２０までの懸濁液Ｃ２の送液と、洗浄液バッグ５０から消化容器１０への洗浄液Ｄの供給と、洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０への洗浄液Ｄの供給とを行うことができる。これにより、装置構成を簡略化して、装置を小型化するとともに、装置の製造コストを低減することができる。
なお、本実施形態の構成を示す図１７において、ポンプ８６と弁８３の位置を入れ替えることとしてもよい。
【００８３】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、消化容器１０および洗浄容器２０内に、底部近傍と途中位置とに開口する管路をそれぞれ独立して設けることとして説明したが、各容器内において深さ方向に移動可能な管路を１本ずつ設けることとしてもよい。
【００８４】
また、消化容器１０と洗浄容器２０をそれぞれ１つずつ設けた例を説明したが、一方または両方の容器が２つ以上あってもよい。なお、この場合には、遠心回転した際のバランスを考慮して、各容器を周方向に等間隔をあけて配置することが望ましい。
また、消化容器１０および洗浄容器２０に対して、洗浄液等を供給する供給手段および上清を吸引する吸引手段として同一のポンプを兼用して用いることとして説明したが、それぞれの手段について専用のポンプを設けることしてもよい。
【符号の説明】
【００８５】
Ａ 脂肪組織
Ａ１ 脂肪
Ａ２ チュメッセント
Ａ３ 赤血球
Ｂ 消化酵素液
Ｃ１ 脂質
Ｃ２ 懸濁液
Ｃ３ 上清
Ｃ４ 細胞群
Ｄ 洗浄液
１，２ 遠心分離装置
１０ 消化容器
１１，１２，２１，２２ 管路
１３，１５，２３，２５，４１，４２，５３，５５ 流路
２０ 洗浄容器
３０ ロータリージョイント
３１ 軸体
３２ ハウジング
４０ モータ
４５，４６，８６ ポンプ
５０ 洗浄液バッグ
５１ 廃液バッグ
６１，６２，６３，６４，８１，８２，８３，８４，８５ 弁
Ｓ１ 組織分離工程
Ｓ２ 組織消化工程
Ｓ３ 細胞分離工程
Ｓ４ 細胞濃縮工程
Ｓ５ 細胞洗浄工程
Ｓ６ 細胞取出工程
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遠心分離装置および細胞分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、脂肪組織等の生体組織から細胞を分離する方法として、成分の密度差を利用して重力により層分離を行う方法や、フィルタを用いた分離方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２４８０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、重力による層分離を行う方法では、分離処理に長時間を要するという不都合がある。また、フィルタを用いた分離方法では、細胞がフィルタを通過する際に、フィルタのせん断力により、細胞にダメージを与えてしまうという不都合がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞へのダメージを抑制しつつ、短時間で細胞分離を行うことができる遠心分離装置および細胞分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明の第１の態様は、回転軸を有するモータと、該モータの回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアームと、該アームに周方向に等間隔をあけて半径方向に直交する軸線回りに揺動可能に支持された第１の容器および第２の容器と、該第１の容器および該第２の容器内の底部近傍に両端を開口させた第１の管路と、洗浄液を貯留する洗浄液容器と、該洗浄液容器と前記第１の管路の途中位置とに接続される第２の管路と、前記第１の管路における前記途中位置と前記第２の容器との間に設けられた第１のポンプと、前記第１の容器から前記第２の容器までの流路と前記洗浄液容器から前記第２の容器までの流路とを切り替え可能な流路切替手段と、前記第２の容器の深さ方向の途中位置に一端を開口させた第３の管路と、該第３の管路から流体を吸引する吸引手段とを備える遠心分離装置である。
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、第１の容器に脂肪組織と消化酵素液との混合液を導入してモータの作動によりアームを回転させると、該アームに支持された２つの容器が半径方向に直交する軸線回りに揺動させられる。これにより、第１の容器内の混合液が攪拌され、消化酵素液内の消化酵素により脂肪組織が消化されて細胞懸濁液が生成される。細胞懸濁液は、脂肪組織よりも比重が重いので、遠心分離または静置により下層に沈降する。そこで、流路切替手段によって第１の容器から第２の容器までの流路を選択し、第１のポンプを駆動すると、第１の容器の底部近傍に開口する第１の管路を介して、細胞懸濁液が第２の容器へと移動される。
【０００８】
そして、モータを作動させて第２の容器内の細胞懸濁液を遠心分離すると、第２の容器の底部最下層には比重の大きな細胞群が集められ、その上層には脂質や血漿等の上清が集められる。遠心分離された上清は、吸引手段により途中位置に開口する第３の管路を介して第２の容器の外部に排出される。そして、流路切替手段によって洗浄液容器から第２の容器までの流路に切り替えて、第１のポンプを駆動すると、洗浄液容器内の洗浄液が第２の管路および第１の管路を介して第２の容器内に導入され、細胞群が洗浄液によって再懸濁される。このように、遠心分離、上清の排出、洗浄液の供給を繰り返すことで、細胞群を洗浄して、含有されている不純物を除去することができる。
【０００９】
以上のように、本発明によれば、フィルタ等を用いることなく、細胞懸濁液を細胞群と上清とに分離して、分離した細胞群を洗浄することができ、細胞にダメージを与えることなく、脂肪組織から高純度の細胞群を取り出すことができる。
【００１０】
上記態様において、廃液を収容する廃液容器と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第１の容器との間と前記廃液容器とに接続される第４の管路とを備え、前記第３の管路の他端が、前記第１のポンプと前記第２の容器との間において前記第１の管路に接続され、前記流路切替手段は、さらに、前記第２の容器から前記廃液容器までの流路にも切り替え可能であることとしてもよい。
【００１１】
このようにすることで、吸引手段として第１のポンプを用いることができ、流路切替手段により第２の容器から廃液容器までの流路に切り替えた状態で第１のポンプを駆動させることにより、第３の管路を介して第２の容器の途中位置から上清等の不要な流体を吸引することができる。
【００１２】
上記態様において、前記第３の管路との接続部と前記第２の容器との間における前記第１の管路が、前記第２の容器内への給液方向のみに流体を流通させ、前記第３の管路が、前記第２の容器内からの排液方向のみに流体を流通させることとしてもよい。
【００１３】
このようにすることで、第１のポンプの送液方向を切り替えて駆動させることにより、第１の管路を介して第２の容器の底部近傍から洗浄液を供給できるとともに、第３の管路を介して第２の容器の途中位置から上清を吸引することができる。
【００１４】
上記態様において、前記第１の管路における前記途中位置と前記第１の容器との間に第２のポンプを備えることとしてもよい。
このようにすることで、第２のポンプを駆動させることにより、洗浄液容器から第２の管路および第１の管路を介して、第１の容器に洗浄液を供給することができる。これにより、第１の容器と第２の容器の重量を等しくして、第２の容器内に移動させた細胞懸濁液を遠心分離する際のバランスを保つことができる。
【００１５】
上記態様において、前記第１の管路が、前記第１の容器内の途中位置に開口し前記第１の容器内への給液方向のみに流体を流通させる給液管路と、前記第１の容器内の底部近傍に開口し前記第１の容器内からの排液方向のみに流体を流通させる排液管路とに分岐することとしてもよい。
【００１６】
このようにすることで、第２のポンプの送液方向を切り替えて駆動させることにより、給液管路を介して第１の容器の途中位置から洗浄液を供給できるとともに、排液管路を介して第１の容器内の底部近傍から流体を吸引することができる。
【００１７】
上記態様において、前記流路切替手段が、前記第２の管路に設けられた第１の弁と、前記第４の管路に設けられた第２の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第２の容器との間に設けられた第３の弁と、前記第１の管路における前記第２のポンプと前記第１の容器との間に設けられた第４の弁とを有することとしてもよい。
【００１８】
このようにすることで、第１の弁および第２の弁を閉として第３の弁および第４の弁を開とすることにより、第１の容器から第２の容器までの流路を形成することができる。また、第２の弁および第４の弁を閉として第１の弁および第３の弁を開とすることにより、洗浄液容器から第２の容器までの流路を形成することができる。さらに、第１の弁および第４の弁を閉として第２の弁および第３の弁を開とすることにより、第２の容器から廃液容器までの流路を形成することができる。このように、各弁を開閉動作させることにより、流路を択一的に切り替えることができる。
【００１９】
上記態様において、前記流路切替手段が、前記第２の管路に設けられた第１の弁と、前記第４の管路に設けられた第２の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第２の容器との間に設けられた第３の弁と、前記第１の管路における前記第２の管路と前記第１の容器との間に設けられた第４の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第３の弁との間と前記第４の弁と前記第１の容器との間とを接続するバイパス管路と、該バイパス管路に設けられた第５の弁とを有することとしてもよい。
【００２０】
このようにすることで、第１の弁、第２の弁、および第５の弁を閉として第３の弁および第４の弁を開とすることにより、第１の容器から第２の容器までの流路を形成することができる。また、第２の弁、第４の弁、および第５を閉として第１の弁および第３の弁を開とすることにより、洗浄液容器から第２の容器までの流路を形成することができる。また、第１の弁、第４の弁、および第５の弁を閉として第２の弁および第３の弁を開とすることにより、第２の容器から廃液容器までの流路を形成することができる。さらに、第２の弁、第３の弁、および第４を閉として第１の弁および第５の弁を開とすることにより、洗浄液容器から第１の容器までの流路を形成することができる。このように、各弁を開閉動作させることにより、流路を択一的に切り替えることができる。
【００２１】
本発明の第２の態様は、生体組織を必要成分と不要成分とに遠心分離して該必要成分を抽出する組織分離工程と、該組織分離工程により抽出された必要成分に消化酵素を作用させて細胞懸濁液を生成する組織消化工程と、該組織消化工程により生成された細胞懸濁液を上清と細胞群とに遠心分離して該細胞群を抽出する細胞分離工程と、該細胞分離工程により抽出された細胞群を遠心分離して濃縮する細胞濃縮工程と、該細胞濃縮工程により濃縮された細胞群を洗浄する細胞洗浄工程とを有する細胞分離方法である。
【００２２】
本発明の第２の態様によれば、組織分離工程により、脂肪組織等の生体組織を細胞群等の必要成分とチュメッセント等の不要成分とに遠心分離して、該必要成分を抽出することで、生体組織から不要成分を除去して、必要成分の純度を高めることができる。そして、組織消化工程により必要成分に消化酵素を作用させることで、消化酵素液により生体組織を消化させて、細胞懸濁液を生成することができる。そして、細胞分離工程により細胞懸濁液を脂質等の上清と細胞群とに遠心分離することで、細胞懸濁液から細胞群を抽出することができる。そして、細胞濃縮工程により細胞群を遠心分離して濃縮するとともに、細胞洗浄工程により細胞群を洗浄することで、細胞群に含まれている不要成分を低減して、高純度の細胞群を取り出すことができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、細胞へのダメージを抑制しつつ、短時間で細胞分離を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る遠心分離容器の概略構成図である。
【図２】図１の遠心分離容器を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【図３】図１の遠心分離容器を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【図４】図２の組織分離工程の状態を説明する図である。
【図５】図２の組織分離工程の状態を説明する図である。
【図６】図２の組織消化工程の状態を説明する図である。
【図７】図２の細胞分離工程の状態を説明する図である。
【図８】図２の細胞分離工程の状態を説明する図である。
【図９】図２の細胞濃縮工程の状態を説明する図である。
【図１０】図２の細胞濃縮工程の状態を説明する図である。
【図１１】図３の細胞洗浄工程の状態を説明する図である。
【図１２】図３の細胞洗浄工程の状態を説明する図である。
【図１３】図３の細胞洗浄工程の状態を説明する図である。
【図１４】図３の細胞洗浄工程の状態を説明する図である。
【図１５】図３の細胞取出工程の状態を説明する図である。
【図１６】図３の細胞取出工程の状態を説明する図である。
【図１７】本発明の第２の実施形態に係る遠心分離容器の概略構成図である。
【図１８】図１７の遠心分離容器を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【図１９】図１７の遠心分離容器を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態に係る遠心分離装置および細胞分離方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る遠心分離装置１は、例えば脂肪組織等の生体組織を成分毎に分離する装置であって、図１に示されるように、相対回転可能に支持された軸体３１およびハウジング３２を有するロータリージョイント３０と、軸体３１を中心軸線回りに回転駆動するモータ４０と、モータ４０の回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアーム（図示略）と、該アームにより軸体３１の半径方向外方に接続された消化容器（第１の容器）１０および洗浄容器（第２の容器）２０と、洗浄液を貯留する洗浄液バッグ（洗浄液容器）５０と、廃液を収容する廃液バッグ（廃液容器）５１と、これらを接続する流路１３，１５，２３，２５，４１，４２，５３，５５と、各流路に設けられた弁（流路切替手段）６１，６２，６３，６４と、各部の動作を制御する制御部（図示略）とを主な構成要素として備えている。
【００２６】
消化容器１０および洗浄容器２０は、周方向に等間隔をあけて配置され、アームにより、半径方向に直交する軸線回りに揺動可能に支持されている。したがって、モータ４０を作動させてアームをモータ４０の中心軸線回りに回転させると、消化容器１０および洗浄容器２０は、底部が半径方向外方に向かうように回転させられる。これにより、消化容器１０および洗浄容器２０は、内部に細胞懸濁液等を収容して回転させることで、細胞懸濁液に含まれている成分の比重の差によって、細胞懸濁液を細胞群と上清とに遠心分離するようになっている。
【００２７】
消化容器１０は、円筒状に形成され、一端が開口し他端がテーパ状に漸次先細になって閉塞された形状を有している。消化容器１０は、開口部を閉塞する蓋体１８を有している。蓋体１８には、脂肪組織Ａおよび消化酵素液Ｂを投入するための投入口１７が設けられている。消化容器１０の内部には、蓋体１８の略中央から消化容器１０の軸線に沿って延びた管路１１，１２が設けられている。管路１１は消化容器１０の途中位置に開口しており、管路１２は消化容器１０の底部近傍に開口している。
【００２８】
管路１１には流路１５が、管路１２には流路１３がそれぞれ接続されている。流路１３と流路１５とは合流してロータリージョイント３０の軸体３１に接続されている。流路１３，１５にはそれぞれ逆止弁１４，１６が設けられており、流路１３は消化容器１０からの排液方向のみに、流路１５は消化容器１０への給液方向のみに流体を流通させるようになっている。
【００２９】
洗浄容器２０は、消化容器１０と同様に、円筒状に形成され、一端が開口し他端がテーパ状に漸次先細になって閉塞された形状を有している。洗浄容器２０は、開口部を閉塞する蓋体２８を有している。蓋体２８には、最終的な生成物である細胞群を取り出すための取出口２７が設けられている。洗浄容器２０の内部には、蓋体２８の略中央から洗浄容器２０の軸線に沿って延びた管路２１，２２が設けられている。管路２２は洗浄容器２０の途中位置に開口しており、管路２１は洗浄容器２０の底部近傍に開口している。
【００３０】
管路２１には流路２５が、管路２２には流路２３がそれぞれ接続されている。流路２３と流路２５とは合流してロータリージョイント３０の軸体３１に接続されている。流路２３，２５にはそれぞれ逆止弁２４，２６が設けられており、流路２３は洗浄容器２０からの排液方向のみに、流路２５は洗浄容器２０への給液方向のみに流体を流通させるようになっている。
【００３１】
ロータリージョイント３０は、円筒形状の軸体３１と、軸体３１の外側に同心円に配置された円筒形状のハウジング３２と、軸体３１およびハウジング３２を中心軸線回りに相対回転可能に支持する回転軸受３３とを備えている。軸体３１の内部には流路３４，３５が形成されており、これら流路３４，３５は軸体３１およびハウジング３２に開口している。
【００３２】
流路１３および流路１５は、合流して軸体３１に接続されており、軸体３１の内部に形成された流路３４を介して、流路４２に接続されている。流路２３および流路２５は、合流して軸体３１に接続されており、軸体３１の内部に形成された流路３５を介して、流路４１に接続されている。
【００３３】
流路４１には弁（第３の弁）６３およびポンプ（第１のポンプ）４５が設けられており、流路４２には弁（第４の弁）６４およびポンプ（第２のポンプ）４６が設けられている。ポンプ４５，４６は、双方向に送液ができるようになっている。流路４１と流路４２は、一旦合流した後に、流路５３と流路５５とに再度分岐する。
【００３４】
流路５３は廃液バッグ５１に接続されており、その流路中には弁（第２の弁）６２が設けられている。流路５５は洗浄液バッグ５０に接続されており、その流路中には弁（第１の弁）６１が設けられている。
モータ４０、弁６１，６２，６３，６４、およびポンプ４５，４６は、図示しない制御部によりその動作が制御されるようになっている。
【００３５】
上記構成を有する遠心分離装置１において、制御部による各弁等の制御と、該制御により実行される細胞分離方法について、図２および図３に示すフローチャートに従って以下に説明する。
図２および図３に示されるように、本実施形態の遠心分離装置１を用いた細胞分離方法は、脂肪組織を脂肪（必要成分）とチュメッセント等（不要成分）とに遠心分離して脂肪を抽出する組織分離工程Ｓ１と、組織分離工程Ｓ１により抽出された脂肪に消化酵素を作用させて細胞懸濁液を生成する組織消化工程Ｓ２と、組織消化工程Ｓ２により生成された細胞懸濁液を脂質と細胞群とに遠心分離して細胞群を抽出する細胞分離工程Ｓ３と、細胞分離工程Ｓ３により抽出された細胞群を遠心分離して濃縮する細胞濃縮工程Ｓ４と、細胞濃縮工程Ｓ４により濃縮された細胞群を洗浄する細胞洗浄工程Ｓ５と、細胞洗浄工程Ｓ５により洗浄された細胞群を取り出す細胞取出工程Ｓ６とを主な工程として有している。
【００３６】
上記の工程において実行される詳細な動作について以下に説明する。
組織分離工程Ｓ１においては、図４に示すように、まず、投入口１７から消化容器１０内に脂肪組織Ａが投入される（Ｓ１１）。次に、弁６１開、弁６２閉、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０に、脂肪組織Ａと等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１２）。これにより、消化容器１０と洗浄容器２０の重量を等しくして、消化容器１０内の脂肪組織Ａを遠心分離する際のバランスを保つことができる。
【００３７】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。すなわち、消化容器１０内に脂肪組織Ａを収容した状態で、消化容器１０の底部が半径方向外方に向かうように回転させる。これにより、図５に示すように、脂肪組織Ａの成分の比重によって、脂肪組織Ａは、消化容器１０の中で、脂肪Ａ１、チュメッセントＡ２、赤血球Ａ３の層に分離される（Ｓ１３）。
【００３８】
次に、図５に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて消化容器１０のチュメッセントＡ２、赤血球Ａ３の層を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１４）。
このようにすることで、脂肪採取時に注入されるチュメッセントＡ２や脂肪組織Ａに含まれている赤血球Ａ３等の不要成分を除去することができ、必要成分である脂肪Ａ１を効率的に分離することができる。
【００３９】
組織消化工程Ｓ２においては、図６に示すように、まず、弁６１開、弁６２閉、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に洗浄液Ｄを供給する（Ｓ２１）。
【００４０】
次に、図６に示すように、シリンジ７０により、投入口１７から脂肪Ａ１を消化するための消化酵素液Ｂを注入する（Ｓ２２）。この際、脂肪Ａ１への異物や雑菌等の混入を防止するため、シリンジ７０の出口側に滅菌フィルタ７１をつけて使用する。
【００４１】
次に、モータ４０を動作させて、例えば０Ｇから２０Ｇを１ｃｙｃｌｅ／ｓｅｃで２０分間繰り返すことで、消化容器１０が揺動させられて、消化容器１０の内部が撹拌される（Ｓ２３）。これにより、消化酵素液Ｂに含まれている消化酵素により脂肪Ａ１が分解され、細胞が脂肪Ａ１から分離されて細胞懸濁液が生成される。
【００４２】
細胞分離工程Ｓ３においては、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。これにより、図７に示すように、消化容器１０内の細胞懸濁液の成分の比重によって、細胞懸濁液は、消化容器１０の中で、不要物である脂質Ｃ１と必要物である細胞群を含む懸濁液Ｃ２の層に分離される（Ｓ３１）。
【００４３】
次に、図７に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄容器２０の洗浄液Ｄを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ３２）。
【００４４】
次に、図８に示すように、弁６１閉、弁６２閉、弁６３開、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４５およびポンプ４６を動作させて消化容器１０内の懸濁液Ｃ２を洗浄容器２０に移動させる（Ｓ３３）。
【００４５】
細胞濃縮工程Ｓ４においては、図９に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて消化容器１０の脂質Ｃ１を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ４１）。
【００４６】
次に、図１０に示すように、弁６１開、弁６２閉、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に懸濁液Ｃ２と等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ４２）。これにより、消化容器１０と洗浄容器２０の重量を等しくして、洗浄容器２０内の懸濁液Ｃ２を遠心分離する際のバランスを保つことができる。
【００４７】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。これにより、図１０に示すように、懸濁液Ｃ２は、懸濁液Ｃ２内の成分の比重によって、洗浄容器２０の中で、上清Ｃ３とペレット状の細胞群Ｃ４とに分離される（Ｓ４３）。
【００４８】
細胞洗浄工程Ｓ５においては、図１１に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄容器２０の上清Ｃ３を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ５１）。
【００４９】
次に、図１２に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて消化容器１０内の洗浄液Ｄを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ５２）。
【００５０】
次に、図１３に示すように、弁６１開、弁６２閉、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０に洗浄液Ｄを供給する（Ｓ５３）。このようにすることで、細胞群Ｃ４が遠心力によりペレット状に凝集してしまった場合にも、洗浄液Ｄの流動エネルギによって細胞群Ｃ４を攪拌し、ペレット状の細胞群Ｃ４が解れて分散させられる。これにより、細胞群Ｃ４内に含まれている不要成分を洗浄液Ｄ内に解放して放出させることができる。
【００５１】
次に、図１４に示すように、弁６１開、弁６２閉、弁６３閉、弁６４開となるように各弁を制御して、ポンプ４６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に洗浄容器２０と等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ５４）。これにより、遠心分離の際のバランスが保たれる。
【００５２】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う（Ｓ５５）。これにより、洗浄容器２０内の細胞群Ｃ４と洗浄液Ｄとの混合液が、上清Ｅと細胞群Ｃ４とに遠心分離される。
そして、上記の細胞洗浄工程Ｓ５を最初から２回繰り返す（Ｓ５６）。このようにすることで、細胞群に含まれる不要成分をさらに低減することができる。
【００５３】
細胞取出工程Ｓ６においては、図１５に示すように、弁６１閉、弁６２開、弁６３開、弁６４閉となるように各弁を制御して、ポンプ４５を動作させて洗浄容器２０の上清Ｅを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ６１）。
そして、図１６に示すように、シリンジ７０を用いて取出口２７から、最終的に洗浄容器２０内に残った細胞群Ｃ４を採取する（Ｓ６２）。
【００５４】
以上のように、本実施形態に係る遠心分離装置１によれば、弁６１および弁６２を閉として弁６３および弁６４を開とすることにより、消化容器１０から洗浄容器２０までの流路を形成することができる。また、弁６２および弁６４を閉として弁６１および弁６３を開とすることにより、洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０までの流路を形成することができる。さらに、弁６１および弁６４を閉として弁６２および弁６３を開とすることにより、洗浄容器２０から廃液バッグ５１までの流路を形成することができる。このように、各弁を開閉動作させることにより、流路を択一的に切り替えることができる。
【００５５】
このような遠心分離装置１において、消化容器１０に脂肪組織Ａと消化酵素液Ｂとの混合液を導入し、モータ４０を作動させてアームを回転させると、消化容器１０内の混合液が攪拌され、消化酵素液Ｂにより脂肪組織Ａが消化されて細胞懸濁液が生成される。生成された細胞懸濁液は、脂質Ｃ１と細胞群を含む懸濁液Ｃ２とに遠心分離され、遠心分離された懸濁液Ｃ２は、消化容器１０の底部近傍に開口する管路１２を介して、洗浄容器２０へと移動される。
【００５６】
洗浄容器２０に送られた懸濁液Ｃ２は、脂質や血漿等の上清Ｃ３と細胞群Ｃ４とに遠心分離される。遠心分離された上清Ｃ３は、ポンプ６３により、途中位置に開口する管路２２を介して洗浄容器２０から廃液バッグ５１に排出される。細胞群Ｃ４は、管路２１を介して洗浄容器２０内に導入された洗浄液Ｄによって再懸濁される。洗浄容器２０内において、遠心分離、上清の排出、洗浄液の供給を繰り返すことで、細胞群Ｃ４は洗浄され、含有されていた不純物が除去される。
【００５７】
このように、本実施形態に係る遠心分離装置１によれば、フィルタ等を用いることなく、細胞懸濁液を細胞群Ｃ４と上清Ｃ３とに分離して、分離した細胞群Ｃ４を洗浄することができ、細胞にダメージを与えることなく、脂肪組織Ａから高純度の細胞群Ｃ４を取り出すことができる。
【００５８】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る遠心分離装置および細胞分離方法について図１７から図１９を参照して説明する。
本実施形態に係る遠心分離装置２が第１の実施形態と異なる点は、洗浄液を供給または上清等を排出するポンプを１台で兼用した点である。以下、本実施形態の遠心分離装置２について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。なお、第１の実施形態と同じ構成要素については、図１と同一の符号を用いて説明する。
【００５９】
本実施形態に係る遠心分離装置２は、図１７に示されるように、相対回転可能に支持された軸体３１およびハウジング３２を有するロータリージョイント３０と、軸体３１を中心軸線回りに回転駆動するモータ４０と、モータ４０の回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアーム（図示略）と、該アームにより軸体３１の半径方向外方に接続された消化容器（第１の容器）１０および洗浄容器（第２の容器）２０と、洗浄液を貯留する洗浄液バッグ（洗浄液容器）５０と、廃液を収容する廃液バッグ（廃液容器）５１と、これらを接続する流路１３，１５，２３，２５，４１，４２，５３，５５，８７と、各流路に設けられた弁（流路切替手段）８１，８２，８３，８４，８５と、各部の動作を制御する制御部（図示略）とを主な構成要素として備えている。
【００６０】
流路４１には弁（第４の弁）８３が設けられており、流路４２には弁（第３の弁）８５および双方向に送液可能なポンプ８６が設けられている。流路４１のロータリージョイント３０と弁８３との間には分岐点８８が設けられ、流路４２の弁８５とポンプ８６との間には分岐点８９が設けられている。分岐点８８と分岐点８９との間には、流路４１と流路４２とをバイパスする流路（バイパス管路）８７が設けられており、該流路８７には弁（第５の弁）８４が設けられている。
【００６１】
流路４１と流路４２は、一旦合流した後に、流路５３と流路５５とに再度分岐する。流路５３は廃液バッグ５１に接続されており、その流路中には弁（第２の弁）８２が設けられている。流路５５は洗浄液バッグ５０に接続されており、その流路中には弁（第１の弁）８１が設けられている。
モータ４０、弁８１，８２，８３，８４，８５、およびポンプ８６は、図示しない制御部によりその動作が制御されるようになっている。
【００６２】
上記構成を有する遠心分離装置２において、制御部による各弁等の制御と、該制御により実行される細胞分離方法について、図１８および図１９に示すフローチャートに従って以下に説明する。
図２および図３に示されるように、遠心分離装置２を用いた細胞分離方法は、脂肪組織を脂肪（必要成分）とチュメッセント等（不要成分）とに遠心分離して脂肪を抽出する組織分離工程Ｓ１１０と、組織分離工程Ｓ１１０により抽出された脂肪に消化酵素を作用させて細胞懸濁液を生成する組織消化工程Ｓ１２０と、組織消化工程Ｓ１２０により生成された細胞懸濁液を脂質と細胞群とに遠心分離して細胞群を抽出する細胞分離工程Ｓ１３０と、細胞分離工程Ｓ１３０により抽出された細胞群を遠心分離して濃縮する細胞濃縮工程Ｓ１４０と、細胞濃縮工程Ｓ１４０により濃縮された細胞群を洗浄する細胞洗浄工程Ｓ１５０と、細胞洗浄工程Ｓ１５０により洗浄された細胞群を取り出す細胞取出工程Ｓ１６０とを主な工程として有している。
【００６３】
上記の工程において実行される詳細な動作について以下に説明する。
組織分離工程Ｓ１１０においては、まず、投入口１７から消化容器１０内に脂肪組織Ａが投入される（Ｓ１１１）。次に、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０に脂肪組織Ａと等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１１２）。
【００６４】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。すなわち、消化容器１０内に脂肪組織Ａを収容した状態で、消化容器１０の底部が半径方向外方に向かうように回転させられる。これにより、脂肪組織Ａの成分の比重によって、脂肪組織Ａは、消化容器１０の中で、脂肪Ａ１、チュメッセントＡ２、赤血球Ａ３の層に分離される（Ｓ１１３）。
【００６５】
次に、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて消化容器１０のチュメッセントＡ２、赤血球Ａ３の層を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１１４）。
【００６６】
組織消化工程Ｓ１２０においては、まず、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１２１）。
【００６７】
次に、シリンジにより、投入口１７から脂肪Ａ１を消化するための消化酵素液Ｂを注入する（Ｓ１２２）。この際、脂肪Ａ１への異物や雑菌等の混入を防止するため、シリンジの出口側に滅菌フィルタをつけて使用する。
【００６８】
次に、モータ４０を動作させて、例えば０Ｇから２０Ｇを１ｃｙｃｌｅ／Ｓ１ｅｃで２０分間繰り返すことで消化容器１０の内部を撹拌する（Ｓ１２３）。これにより、消化酵素液Ｂに含まれている消化酵素により脂肪Ａ１が分解され、細胞が脂肪Ａ１から分離されて細胞懸濁液が生成される。
【００６９】
細胞分離工程Ｓ１３０においては、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。これにより、消化容器１０内の細胞懸濁液の成分の比重によって、細胞懸濁液は、消化容器１０の中で、不要物である脂質Ｃ１と必要物である細胞群を含む懸濁液Ｃ２の層に分離される（Ｓ１３１）。
【００７０】
次に、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄容器２０の洗浄液Ｄを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１３２）。
【００７１】
次に、弁８１閉、弁８２閉、弁８３開、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて消化容器１０内の懸濁液Ｃ２を洗浄容器２０に移動させる（Ｓ１３３）。
【００７２】
細胞濃縮工程Ｓ１４０においては、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて消化容器１０の脂質Ｃ１を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１４１）。
【００７３】
次に、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に懸濁液Ｃ２と等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１４２）。
【００７４】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う。これにより、懸濁液Ｃ２は、懸濁液Ｃ２内の成分の比重によって、洗浄容器２０の中で、上清Ｃ３とペレット状の細胞群Ｃ４とに分離される（Ｓ１４３）。
【００７５】
細胞洗浄工程Ｓ１５０においては、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄容器２０の上清Ｃ３を廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１５１）。
【００７６】
次に、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて消化容器１０内の洗浄液Ｄを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１５２）。
【００７７】
次に、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０に洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１５３）。
【００７８】
次に、弁８１開、弁８２閉、弁８３閉、弁８４閉、弁８５開となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄液バッグ５０から消化容器１０に洗浄容器２０と等量の洗浄液Ｄを供給する（Ｓ１５４）。これにより、細胞群Ｃ４内に含まれている不要成分が洗浄液Ｄ内に解放して放出される。
【００７９】
次に、モータ４０を動作させて、例えば４００Ｇ、５分の条件で遠心分離を行う（Ｓ１５５）。これにより、洗浄容器２０内の細胞群Ｃ４と洗浄液Ｄとの混合液が、上清Ｅと細胞群Ｃ４とに遠心分離される。
そして、上記の細胞洗浄工程Ｓ１５を最初から２回繰り返す（Ｓ１５６）。このようにすることで、細胞群に含まれる不要成分をさらに低減することができる。
【００８０】
細胞取出工程Ｓ１６０においては、弁８１閉、弁８２開、弁８３閉、弁８４開、弁８５閉となるように各弁を制御して、ポンプ８６を動作させて洗浄容器２０の上清Ｅを廃液バッグ５１に排液する（Ｓ１６１）。
そして、シリンジを用いて取出口２７から、最終的に洗浄容器２０内に残った細胞群Ｃ４を採取する（Ｓ１６２）。
【００８１】
以上のように、本実施形態に係る遠心分離装置２によれば、弁８１、弁８２、および弁８４を閉として弁８５および弁８３を開とすることにより、消化容器１０から洗浄容器２０までの流路を形成することができる。また、弁８２、弁８３、および第５を閉として弁８１および弁８５を開とすることにより、洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０までの流路を形成することができる。また、弁８１、弁８３、および弁８４を閉として弁８２および弁８５を開とすることにより、洗浄容器２０から廃液バッグ５１までの流路を形成することができる。さらに、弁８２、弁８５、および第４を閉として弁８１および弁８４を開とすることにより、洗浄液バッグ５０から消化容器１０までの流路を形成することができる。このように、各弁を開閉動作させることにより、流路を択一的に切り替えることができる。
【００８２】
このような遠心分離装置２においては、ポンプ１台で、消化容器１０から洗浄容器２０までの懸濁液Ｃ２の送液と、洗浄液バッグ５０から消化容器１０への洗浄液Ｄの供給と、洗浄液バッグ５０から洗浄容器２０への洗浄液Ｄの供給とを行うことができる。これにより、装置構成を簡略化して、装置を小型化するとともに、装置の製造コストを低減することができる。
なお、本実施形態の構成を示す図１７において、ポンプ８６と弁８３の位置を入れ替えることとしてもよい。
【００８３】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、消化容器１０および洗浄容器２０内に、底部近傍と途中位置とに開口する管路をそれぞれ独立して設けることとして説明したが、各容器内において深さ方向に移動可能な管路を１本ずつ設けることとしてもよい。
【００８４】
また、消化容器１０と洗浄容器２０をそれぞれ１つずつ設けた例を説明したが、一方または両方の容器が２つ以上あってもよい。なお、この場合には、遠心回転した際のバランスを考慮して、各容器を周方向に等間隔をあけて配置することが望ましい。
また、消化容器１０および洗浄容器２０に対して、洗浄液等を供給する供給手段および上清を吸引する吸引手段として同一のポンプを兼用して用いることとして説明したが、それぞれの手段について専用のポンプを設けることしてもよい。
【符号の説明】
【００８５】
Ａ 脂肪組織
Ａ１ 脂肪
Ａ２ チュメッセント
Ａ３ 赤血球
Ｂ 消化酵素液
Ｃ１ 脂質
Ｃ２ 懸濁液
Ｃ３ 上清
Ｃ４ 細胞群
Ｄ 洗浄液
１，２ 遠心分離装置
１０ 消化容器
１１，１２，２１，２２ 管路
１３，１５，２３，２５，４１，４２，５３，５５ 流路
２０ 洗浄容器
３０ ロータリージョイント
３１ 軸体
３２ ハウジング
４０ モータ
４５，４６，８６ ポンプ
５０ 洗浄液バッグ
５１ 廃液バッグ
６１，６２，６３，６４，８１，８２，８３，８４，８５ 弁
Ｓ１ 組織分離工程
Ｓ２ 組織消化工程
Ｓ３ 細胞分離工程
Ｓ４ 細胞濃縮工程
Ｓ５ 細胞洗浄工程
Ｓ６ 細胞取出工程
【特許請求の範囲】
【請求項１】
回転軸を有するモータと、
該モータの回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアームと、
該アームに周方向に等間隔をあけて半径方向に直交する軸線回りに揺動可能に支持された第１の容器および第２の容器と、
該第１の容器および該第２の容器内の底部近傍に両端を開口させた第１の管路と、
洗浄液を貯留する洗浄液容器と、
該洗浄液容器と前記第１の管路の途中位置とに接続される第２の管路と、
前記第１の管路における前記途中位置と前記第２の容器との間に設けられた第１のポンプと、
前記第１の容器から前記第２の容器までの流路と前記洗浄液容器から前記第２の容器までの流路とを切り替え可能な流路切替手段と、
前記第２の容器の深さ方向の途中位置に一端を開口させた第３の管路と、
該第３の管路から流体を吸引する吸引手段とを備える遠心分離装置。
【請求項２】
廃液を収容する廃液容器と、
前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第１の容器との間と前記廃液容器とに接続される第４の管路とを備え、
前記第３の管路の他端が、前記第１のポンプと前記第２の容器との間において前記第１の管路に接続され、
前記流路切替手段は、さらに、前記第２の容器から前記廃液容器までの流路にも切り替え可能である請求項１に記載の遠心分離装置。
【請求項３】
前記第３の管路との接続部と前記第２の容器との間における前記第１の管路が、前記第２の容器内への給液方向のみに流体を流通させ、
前記第３の管路が、前記第２の容器内からの排液方向のみに流体を流通させる請求項２に記載の遠心分離装置。
【請求項４】
前記第１の管路における前記途中位置と前記第１の容器との間に第２のポンプを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の遠心分離装置。
【請求項５】
前記第１の管路が、
前記第１の容器内の途中位置に開口し前記第１の容器内への給液方向のみに流体を流通させる給液管路と、
前記第１の容器内の底部近傍に開口し前記第１の容器内からの排液方向のみに流体を流通させる排液管路とに分岐する請求項４に記載の遠心分離装置。
【請求項６】
前記流路切替手段が、
前記第２の管路に設けられた第１の弁と、前記第４の管路に設けられた第２の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第２の容器との間に設けられた第３の弁と、前記第１の管路における前記第２のポンプと前記第１の容器との間に設けられた第４の弁とを有する請求項５に記載の遠心分離装置。
【請求項７】
前記流路切替手段が、
前記第２の管路に設けられた第１の弁と、前記第４の管路に設けられた第２の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第２の容器との間に設けられた第３の弁と、前記第１の管路における前記第２の管路と前記第１の容器との間に設けられた第４の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第３の弁との間と前記第４の弁と前記第１の容器との間とを接続するバイパス管路と、該バイパス管路に設けられた第５の弁とを有する請求項３に記載の遠心分離装置。
【請求項８】
生体組織を必要成分と不要成分とに遠心分離して該必要成分を抽出する組織分離工程と、
該組織分離工程により抽出された必要成分に消化酵素を作用させて細胞懸濁液を生成する組織消化工程と、
該組織消化工程により生成された細胞懸濁液を上清と細胞群とに遠心分離して該細胞群を抽出する細胞分離工程と、
該細胞分離工程により抽出された細胞群を遠心分離して濃縮する細胞濃縮工程と、
該細胞濃縮工程により濃縮された細胞群を洗浄する細胞洗浄工程とを有する細胞分離方法。
【請求項１】
回転軸を有するモータと、
該モータの回転軸に固定され該回転軸から半径方向外方に延びるアームと、
該アームに周方向に等間隔をあけて半径方向に直交する軸線回りに揺動可能に支持された第１の容器および第２の容器と、
該第１の容器および該第２の容器内の底部近傍に両端を開口させた第１の管路と、
洗浄液を貯留する洗浄液容器と、
該洗浄液容器と前記第１の管路の途中位置とに接続される第２の管路と、
前記第１の管路における前記途中位置と前記第２の容器との間に設けられた第１のポンプと、
前記第１の容器から前記第２の容器までの流路と前記洗浄液容器から前記第２の容器までの流路とを切り替え可能な流路切替手段と、
前記第２の容器の深さ方向の途中位置に一端を開口させた第３の管路と、
該第３の管路から流体を吸引する吸引手段とを備える遠心分離装置。
【請求項２】
廃液を収容する廃液容器と、
前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第１の容器との間と前記廃液容器とに接続される第４の管路とを備え、
前記第３の管路の他端が、前記第１のポンプと前記第２の容器との間において前記第１の管路に接続され、
前記流路切替手段は、さらに、前記第２の容器から前記廃液容器までの流路にも切り替え可能である請求項１に記載の遠心分離装置。
【請求項３】
前記第３の管路との接続部と前記第２の容器との間における前記第１の管路が、前記第２の容器内への給液方向のみに流体を流通させ、
前記第３の管路が、前記第２の容器内からの排液方向のみに流体を流通させる請求項２に記載の遠心分離装置。
【請求項４】
前記第１の管路における前記途中位置と前記第１の容器との間に第２のポンプを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の遠心分離装置。
【請求項５】
前記第１の管路が、
前記第１の容器内の途中位置に開口し前記第１の容器内への給液方向のみに流体を流通させる給液管路と、
前記第１の容器内の底部近傍に開口し前記第１の容器内からの排液方向のみに流体を流通させる排液管路とに分岐する請求項４に記載の遠心分離装置。
【請求項６】
前記流路切替手段が、
前記第２の管路に設けられた第１の弁と、前記第４の管路に設けられた第２の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第２の容器との間に設けられた第３の弁と、前記第１の管路における前記第２のポンプと前記第１の容器との間に設けられた第４の弁とを有する請求項５に記載の遠心分離装置。
【請求項７】
前記流路切替手段が、
前記第２の管路に設けられた第１の弁と、前記第４の管路に設けられた第２の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第２の容器との間に設けられた第３の弁と、前記第１の管路における前記第２の管路と前記第１の容器との間に設けられた第４の弁と、前記第１の管路における前記第１のポンプと前記第３の弁との間と前記第４の弁と前記第１の容器との間とを接続するバイパス管路と、該バイパス管路に設けられた第５の弁とを有する請求項３に記載の遠心分離装置。
【請求項８】
生体組織を必要成分と不要成分とに遠心分離して該必要成分を抽出する組織分離工程と、
該組織分離工程により抽出された必要成分に消化酵素を作用させて細胞懸濁液を生成する組織消化工程と、
該組織消化工程により生成された細胞懸濁液を上清と細胞群とに遠心分離して該細胞群を抽出する細胞分離工程と、
該細胞分離工程により抽出された細胞群を遠心分離して濃縮する細胞濃縮工程と、
該細胞濃縮工程により濃縮された細胞群を洗浄する細胞洗浄工程とを有する細胞分離方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１０−２１４２５１（Ｐ２０１０−２１４２５１Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６１５９４（Ｐ２００９−６１５９４）
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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