【課題】少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子をインビボにて哺乳動物細胞に投与することを含む、インビボにて哺乳動物細胞中でＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための方法及び組成物を提供する。
【解決手段】哺乳動物細胞の中のウイルスの発現を阻害する上で有用である、既知のＢ型肝炎ウイルス菌株及び既知のＣ型肝炎ウイルス菌株由来の保存されたコンセンサス配列。これらの配列は、ＨＢＶ及びＨＣＶの遺伝子をサイレンシングし、かくしてヒトにおけるＨＢＶ及びＨＣＶウイルス感染に対する治療上の有益性を提供するために有用である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が本明細書に参照により援用されている２００３年６月１２日出願の米国仮特許出願第６０／４７８，０７６号の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、翻訳後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）及び転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）を含む、２本鎖ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを介して、哺乳動物細胞内のＨＢＶ及び／又はＨＣＶの発現を変調させるべく、既知のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）菌株及び既知のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）菌株の保存された遺伝子配列を利用する方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＣ型肝炎（ＨＣＶ）は、世界中で推定２億人が感染している重大な公衆衛生問題である。米国における一年あたりの新規感染者数は２００１年で約２５，０００人と推定されている。この数は、献血者スクリーニングに起因して１９８０年代における年間推定２４０，０００人の新規症例に比べて減少してきた。それでも、推定３９０万人（１．８％）のアメリカ人がＨＣＶに感染してきており、そのうち２７０万人が慢性的に感染している。Ｃ型肝炎は、世界中の個体群の中で著しい遺伝子変異を示し、これはその突然変異頻度の高さ及び急速な進化の証拠である。ＨＣＶには基本的に６つの遺伝子型が存在し、１５の記録された亜型があり、世界中の異なる領域全体にわたりその有病率は変動する。これらの主要な遺伝子型の各々は、その生物学的効果が著しく異なっている可能性があるが（複製、突然変異率、肝臓損傷のタイプ及び重症度及び検出及び治療オプションの点で）、これらの差異はなお明確に理解されていない。
【０００４】
ＨＣＶに対するいかなるワクチンも現在のところ存在せず、リバビリン及びインターフェロンを含めて利用可能な薬物療法は、部分的にしか有効でない。感染者の７５〜８５％が慢性感染を発症することになると推定されており、慢性感染者の７０％は、肝細胞癌腫を含めた慢性肝臓病を発生するものと予想される。慢性ＨＣＶ関連肝臓病は、肝移植の主要な適応症である。
【０００５】
ヒトＢ型肝炎ワクチンは１９８２年以降利用可能になっているものの、世界中で３億５０００万人の人がＨＢＶに慢性感染しているものと推定されている。米国における年間の新規感染者数は１９８０年代の平均２６０，０００人から２００１年の約７８，０００人まで減少してきたが、６ヵ月を超える期間にわたりＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）陽性者として定義されたＢ型肝炎キャリヤは推定１２５万人存在している。このようなＨＢＶキャリヤは、肝硬変、肝代償不全及び肝細胞癌腫を発症する高いリスクを有している。大部分のキャリヤは、慢性Ｂ型肝炎から肝臓合併症を発症することはないが、１５％〜４０％の人は、その寿命中に重大な続発症を発症することになり、慢性肝臓病による死は、慢性感染者数の１５〜２５％で発生している。
【０００６】
合計すると世界中の肝臓病の全症例の７５％を占めると推定されているＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染、特に慢性感染を患う患者において有効な改良型の治療剤に対するニーズが存在している。同様に、ＨＣＶに対して有効である予防方法及び作用物質に対する極めて強いニーズも存在している。
【０００７】
核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッド、ヘテロ２本鎖及び修飾核酸）が、人間及び動物における疾病状態の予防及び／又は治療における療法の一部としてのそれらの使用を含め、有意でかつ多様な生物活性をもつ極めて価値ある作用物質として認識されるようになってきた。例えば、アンチセンス機序を通して作用するオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対しハイブリッド形成するように設計され、かくしてｍＲＮＡの活性を変調させる。治療剤としての核酸の利用に対するもう１つのアプローチは、例えばＤＮＡ標的からの転写の阻害といった所望の結果を生成するべく２本鎖ＤＮＡ標的に結合するように１本鎖オリゴマ（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）が設計される、３重鎖又は３本鎖形成を利用するものとして設計されている。治療剤としての核酸の利用に対するさらにもう１つのアプローチは、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ標的のターゲティングされた開裂といった所望の結果を生成しかくしてその発現を阻害するべくＲＮＡ又は２本鎖ＤＮＡ標的に結合するように、構造化ＲＮＡ又は修飾済みオリゴマーが設計される、リボザイムを利用するものとして設計されている。核酸は同様に、例えば、免疫応答を惹起する能力をもつタンパク質を発現する生体の組織又は細胞内にＤＮＡ分子を導入することによって、免疫化剤としても使用可能である。核酸を、アンチセンス、リボザイム又は３重鎖活性をもつＲＮＡをコードするように、あるいは生物学的機能をもつタンパク質を産生するように翻訳されるＲＮＡを産生するように、工学処理することもできる。
【０００８】
より最近では、１つの細胞又は生体内の標的遺伝子の領域に相補的なｄｓＲＮＡが標的遺伝子の発現を阻害する、ＲＮＡｉ又は２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）媒介遺伝子サイレンシングの現象が認識されてきている。（例えば１９９９年７月１日出願ファイア（Ｆｉｒｅ）らの特許文献１、及び特許文献２「２本鎖ＲＮＡによる遺伝子阻害（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）」、特許文献３「ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、パチュク（Ｐａｃｈｕｋ）及びサティシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）、及び２００２年１０月１８日出願の特許文献４参照）。少なくとも部分的に２本鎖であるｄｓＲＮＡを提供する組成物を利用するｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは、慢性ＨＢＶ及び／又はＨＣＶ感染という極めて困難な問題の場合を含め、ＨＢＶ及び／又はＨＣＶを含めたウイルス感染に対する極めて貴重な治療及び／又は予防的作用物質を提供するものと予想されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，５０６，５５９号明細書
【特許文献３】国際公開第００／６３３６４号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第６０／４１９，５３２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
出願人の発明は、ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子をインビボにて哺乳動物細胞に投与することを含む、インビボにて哺乳動物細胞中でＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための方法を提供している。該方法の好ましい実施形態においては、２つ以上の配列番号の配列由来のエフェクタ配列を同じ細胞に投与することができかつ／又は同じ配列番号の配列内の２つ以上のエフェクタ配列を同じ細胞に投与することができる。
【００１１】
出願人の方法はさらに、ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子をインビボにて哺乳動物細胞に投与することを含む、インビボにて哺乳動物細胞中でＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための方法を提供している。該方法のこの態様の好ましい実施形態においては、配列番号１１及び配列番号１２の両方に由来するエフェクタ分子を同じ細胞に投与することができ、かつ／又は、同じ配列番号内の２つ以上のエフェクタ分子を同じ細胞に投与することができる。
【００１２】
出願人の方法はさらに、ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の第１の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子、ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の第２の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を、インビボにて哺乳動物細胞に投与することを含む、インビボにて同じ哺乳動物細胞中でＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の両方の発現を阻害するための方法を提供している。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、配列番号１〜配列番号１０のうちの２つ以上のものに由来するエフェクタ分子を、同じ細胞に投与することができ、かつ／又は配列番号１１及び配列番号１２の両方由来のエフェクタ分子を同じ細胞に投与することができ、かつ／又は同じ配列番号内の２つ以上のエフェクタ分子と同じ細胞に投与することができる。
【００１３】
出願人の発明はさらに、ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を含む、インビボにて哺乳動物細胞中でＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物を提供している。該組成物の好ましい実施形態には、配列番号１〜配列番号１０のうちの２つ以上のもの由来のエフェクタ分子が組成物中に存在する場合及び／又は同じ配列番号内の２つ以上のエフェクタ分子が組成物内に存在する場合が含まれる。
【００１４】
出願人の発明はさらに、ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を含む前記インビボにて哺乳動物細胞中でＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物を提供している。該組成物の好ましい実施形態には、配列番号１１及び配列番号１２内のエフェクタ分子が該組成物中に存在する場合及び／又は同じ配列番号内の２つ以上のエフェクタ分子が該組成物内に存在しうる場合が含まれる。
【００１５】
出願人の発明はさらに、ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の第１の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の第２の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を含む、インビボにて単一の哺乳動物細胞中でＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列及びＣ型肝炎のポリヌクレオシド配列の両方の発現を阻害するための組成物を提供する。該組成物の好ましい実施形態には、配列番号１〜配列番号１０のうちの２つ以上に由来するエフェクタ分子が該組成物中に存在する場合、及び／又は配列番号１１〜配列番号１２の両方に由来するエフェクタ分子が組成物中に存在する場合、及び／又は同じ配列番号内の２つ以上のエフェクタ分子が組成物中に存在し得る場合が含まれる。
【００１６】
本発明の上述の方法及び組成物の特に好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチド配列はＲＮＡであり、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００１７】
さらに提供されているのは、哺乳動物細胞内でのＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列及び／又はＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物において、前記組成物が配列番号１〜配列番号１２、配列番号１〜配列番号１２の相補配列、及びこれらの配列の混合物内から選択された少なくとも１９個の隣接のヌクレオチド配列を含む組成物である。本発明のこの実施形態においては、「少なくとも１９個の隣接のヌクレオチド配列」は好ましくはＤＮＡであり、哺乳動物細胞は好ましくはヒトである。同様に提供されているのは、上述の組成物のいずれかを含む発現構築物及び前記発現構築物を含む哺乳動物細胞である。
【００１８】
本発明のもう１つの態様は、配列番号１４〜配列番号２６から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。本発明のもう１つの態様は、配列番号１４〜配列番号２６から選択された配列のヌクレオチド１−１９、１−２０、１−２１、２−２０、２−２１又は３−２１を含むポリヌクレオチド配列を提供している。本発明のもう１つの態様は、配列番号２７〜配列番号４４から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を提供している。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、ＵがＴに置換されている、配列番号２７内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を含む、哺乳動物細胞内のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物を提供している。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヘヤピンｅｉＲＮＡ配列の包含を示す、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの配置を例示するベクターを描いている。
【図２】図２は、表２中に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。
【図３】図３は、表３中に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。
【図４】図４は、表４中に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。
【図５】図５は、表５中に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。
【図６】図６は、表６中に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。
【図７】図７は、表７中に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。
【図８】図８は、表８中に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。
【図９】図９は、有効なＨＢＶ−ＡＹＷ ｓｈＲＮＡインサートを描いた図である。
【図１０】図１０は、表９中に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ノーザンブロット分析によるＨＢＶ ＲＮＡのダウンレギュレーションを示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、表１２中に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例２の実験１の中でさらに詳細に記述されている、（左から右へ）０、９及び２０ピコモルの同定されたｓｉＲＮＡでのＨＣＶＮＳ５Ａタンパク質のレベルを示すウェスタンブロットである。
【図１４】図１４は、実施例２の実験２でより詳細に記述されている通りの（左から右へ）０、９及び２０ピコモルの同定されたｓｉＲＮＡ及び０、３及び９ピコモルの「コア」正の対照ｓｉＲＮＡでのＨＣＶＮＳ５Ａタンパク質のレベルを示すウェスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、サイレンシングを受けた遺伝子と配列が相同である２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される、動物及び植物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング又は転写遺伝子サイレンシングのプロセスである。ＲＮＡ干渉は配列特異的に作用することから、薬物として使用されるＲＮＡｉ分子はその標的に対し特異的であるにちがいない。ウイルスゲノムは、環境内の変化に対する耐性に対処するように可変的である。ＨＢＶ及びＨＣＶがＲＮＡｉのための望ましいウイルス標的であるものの、これらのウイルスは、その可変性及び突然変異可能性及びその高い転写速度のため、あらゆる治療的及び／又は予防的アプローチにとっての難しい標的となっている。ＲＮＡｉを用いてウイルスゲノム複製をノックダウンするためには、ウイルスゲノム内の保存されたユニークな領域を同定する必要がある。それと同時に、遺伝子サイレンシングのために選ばれたあらゆる配列がヒトゲノムに存在しないことが、毒性を回避するために非常に重要である。
【００２２】
ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ） Ｂ型肝炎ウイルスは、ヘパドナウイルス族に属する。ＨＢＶゲノムは、約３２００塩基対の部分的に２本鎖の弛緩した環状ＤＮＡである。外被（プレ−Ｓ／Ｓ）、コア（プレコア／コア）、ポリメラーゼ及びＸタンパク質をコードする４つの部分的に重複する読取り枠が存在する。プレ−Ｓ／Ｓ読取り枠は、大型（Ｌ）、中型（Ｍ）及び小型（Ｓ）表面糖タンパク質をコードする。プレコア／コア読取り枠は、可溶性タンパク質へと修飾されるプレコアポリペプチド、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）及びＢ型肝炎コア抗原であるヌクレオカプシドタンパク質へと翻訳される。コアプロモータ及びプレコア領域内の突然変異は、ＨＢｅＡｇ産生を低減又は廃止させることが示されてきた。ポリメラーゼタンパク質は、逆転写酵素ならびにＤＮＡポリメラーゼとして機能する。Ｘタンパク質は強力な転写促進物質であり、肝癌誘発において１つの役割を果たす可能性がある。
【００２３】
ＨＢＶの複製サイクルは、肝細胞に対するビリオンの付着で始まる。肝細胞核の内部で、プラス鎖ＨＢＶＤＮＡの合成が完成され、ウイルスゲノムは共有結合により閉鎖された環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）へと転換させられる。これまで調査されてきた大部分の抗ウイルス剤はｃｃｃＤＮＡに対しほとんど又は全く効果が無く、このことは抗ウイルス療法の停止後の血清ＨＢＶＤＮＡの急送な再出現を説明している。慢性Ｂ型肝炎治療の目的は、ＨＢＶ複製及び／又はＨＢＶ抗原の発現の持続的抑圧及び肝臓病の回復を達成することにある。
【００２４】
ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）バージョン１３２．０においては、４５００を上回るＨＢＶ配列及び３４０のＨＢＶ完全ゲノム配列（３１７のヒト分離株、その他の霊長類からの２２の分離株及び１つのウッドチャックＨＢＶ分離株）が存在する。この可変性は、ＲＮＡｉといったような配列特異的薬学アプローチにとっては重大な課題である。ＲＮＡｉの利用分野に適した保存した配列を同定するためには、クラスタルＷ(ＣｌｕｓｔａｌＷ)の修飾済みバージョンを用いて全ての完成ゲノムの間の比較が実施された。２つの多重整列スキームが得られた。すなわち、第１のスキームは全３３９個のＨＢＶ完全ゲノム配列を包含し、第２のスキームは、全てのヒトＨＢＶ分離株に制限されていた。多重整列結果は、解析され、ＨＢＶゲノム中の各位置における配列保存についての評点を含んだ表が生成された。長さが１９ｎｔより長い、最長の配列保存領域を同定するためのスライドウインドウ検索が新規作成された。３つの主要な保存領域が同定され、ヒトＨＢＶ分離株であるジェンバンク受入れ番号ＡＦ０９０８４０にマッピングされた。保存されたＨＢＶ配列はヒトゲノム及びｃＤＮＡライブラリ（ヒト染色体データベース）の両方のジェンバンク配列に対してスクリーニングされた。同定された保存ウイルス配列が２１ｎｔ以上からユニークであることが発見された。ヒトの治療目的のためには、相同性ヒト配列が不注意にサイレンシングされないように保証することがＲＮＡｉのために保存ウイルス配列を選択することと同じ位重要である。
【００２５】
ヒトＣ型肝炎ウイルス ＨＣＶは、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）族及びヘパシウイルス属の小型（直径４０〜６０ナノメートル）外皮、１本鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムは、およそ１０，０００ヌクレオチドで、３つの主要な構造的（Ｃ、Ｅ１及びＥ２）及び多数の非構造的タンパク質（［ＮＳ］ＮＳ２〜ＮＳ５）を含め、１０個のポリペプチドに転写後に開裂される約３０００個のアミノ酸の単一ポリタンパク質をコードする。ＮＳタンパク質は、タンパク質プロセシング（プロテアーゼ）及びウイルス複製（ＲＮＡポリメラーゼ）に必要な酵素を包含する。ウイルスは急速に突然変異することから、外皮タンパク質の変化は、それが免疫系から巧みに逃げるのを助ける可能性がある。少なくとも６つの主要な遺伝子型及び９０を上回るＨＣＶ亜型が存在する。異なる遺伝子型は異なる地理的分布を有する。遺伝子型１ａ及び１ｂは、米国で最も一般的である（症例の約７５％）。遺伝子型２ａ及び２ｂ（約１５％）及び３（約７％）はさほど一般的ではない。
【００２６】
異なる遺伝子型に感染した患者の転帰又は疾病の重症度に差異はほとんどない。しかしながら、遺伝子型２及び３をもつ患者は、インターフェロン治療に応答する確率がさらに高い。肝臓内でウイルスは高い比率で複製し、顕著な配列不均一性を有する。慢性Ｃ型肝炎の主たる治療最終目的は、血液から検出可能なウイルスＲＮＡを無くすることにある。療法を完了してから６ヵ月後に血液中に検出可能なＣ型肝炎ウイルスＲＮＡが無くなることが、持続性応答として知られている。研究により、持続性応答が非常に有利な予後と同一視されること、そしてそれが治癒と等価であり得ることが示唆されている。持続性応答を達成しない患者において肝臓の瘢痕化（線維症）の進行を減速させるといったような、その他のよりわずかな治療上の利益も存在し得る。
【００２７】
ジェンバンクバージョン１３４．０では、２０，０００を上回るＨＣＶ配列そして９３のＨＣＶ完全ゲノム配列が存在する。全ての完全なゲノムの間の比較が、クラスタルＷの修飾バージョンを用いて実施された。多重整列結果は、解析され、ＨＣＶゲノム中の各位置における配列保存についての評点を含んだ表が得られた。長さが１９ｎｔより長い最長の配列保存領域を同定するためのスライドウインドウ検索が新規作成された。３つの主要な保存領域が同定され、ジェンバンクＲｅｆＳｅｑ（基準配列）受入れ番号ＮＣ−００４１０２にマッピングされた。（これはジェンバンク注釈付きＨＣＶ完全ゲノムである）。保存された配列はヒトゲノム及びｃＤＮＡライブラリ（ヒト染色体データベース）の両方のジェンバンク配列に対してスクリーニングされ、２１ｎｔ以上からユニークであるこれらの配列が同定された。
【００２８】
ヒト配列との非相同性
本発明に従ったサイレンシングのために、ターゲティングされた保存ウイルス配列が、天然に発生し、通常に機能する不可欠のあらゆるヒトポリヌクレオチド配列に対し実質的に相同でなく、かくして、ｄｓＲＮＡ分子が、本発明の方法において使用された場合に不可欠の天然に発生するいずれの哺乳動物ポリヌクレオチド配列にも不利な影響を及ぼさないようにすることが同様に重要である。このような天然に発生する機能的哺乳動物ポリヌクレオチド配列としては、所望のタンパク質をコードする哺乳動物配列ならびに非コーディング配列であるものの健康な哺乳動物の体内では不可欠な調節配列を提供する哺乳動物配列が含まれる。基本的に、本発明において有用であるＲＮＡ分子は、本発明の方法のいずれかが実施された後その機能が妨害されないように意図されているあらゆる哺乳動物ポリヌクレオチド配列と充分に配列が異なっていなければならない。ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列と正常な哺乳動物配列の間の不可欠な相同性欠如を画定するために、コンピュータアルゴリズムを使用することができる。
【００２９】
ＲＩＳＣ（ＲＮＡにより誘導されたサイレンシング複合体）との会合及びその活性化の能力をもつ隣接ｄｓＲＮＡ配列の長さは、一般に１９〜２７塩基対であると考えらえることから、同定された保存ＨＢＶ及びＨＣＶ配列は、ヒトゲノムライブラリそして（恐らくはさらに一層重要であるが）ヒトｃＤＮＡライブラリと比較された。ヒトｃＤＮＡライブラリは、ｍＲＮＡ内に現われる発現された配列を表わすことから、かかるｍＲＮＡ配列は、１つの細胞に提供された相同なｄｓＲＮＡ配列によるサイレンシングを特に受けやすくなる。
【００３０】
従って、保存されたＨＢＶ及びＨＣＶ配列は、ヒトゲノム及びｃＤＮＡ配列と比較された。ＨＢＶ又はＨＣＶ保存配列に対する非ヒトｃＤＮＡライブラリ整合は全く同定されなかった（ただし、ｃＤＮＡライブラリ内のＨＢＶ汚染として究極的に同定された整合がいくつか存在した）。ヒトゲノムライブラリ配列との比較により、２１ｎｔｓ以上のあらゆる配列の整合が全く無いこと、２０ヌクレオチドの整合が１つ、及び１９ヌクレオチドの整合が１つあることが明らかになった。これらの整合は、非コーディング領域内にあり、ｃＤＮＡライブラリ内には同族体が発見されなかったことからおそらくｍＲＮＡ内には出現しないと思われる。従って、これらが安全上のリスクであるとみなされる可能性は低いが、望ましい場合には排除可能である。
【００３１】
ＨＢＶ及びＨＣＶからの保存配列
ＨＢＶ保存領域１
ＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡ［Ａ（８９％）／Ｇ（１１％）］ＣＡ［Ｔ（７６％）／Ｃ（２４％）］［Ｃ（７８％）／Ａ（２０％）／Ｔ（２％）］［Ａ（７８％）／Ｇ（２１％）／Ｔ（１％）］ＣＡＴＣＡＧＧＡ［Ｔ（６５％）／ｃ（３５％）］ＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＣＧＧ［Ｇ（８８％）／ｔ（１２％）］ＧＴ［Ｔ（８９％）／Ｇ（１１％）］ＴＴＴＣＴ［Ｔ（９４％）／Ｃ（６％）］ＧＴＴＧＡＣＡＡ［Ｇ（６４％）／Ａ（３６％）］ＡＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡＣＣ［Ａ（５６％）／Ｇ（４３％）／Ｔ（１％）］ＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧＧ［Ｇ（９２％）／Ａ（５％）／Ｔ（３％）］Ａ［Ａ（４１％）／Ｇ（３０％）／Ｔ（１８％）／Ｃ（１１％）］［Ｃ（９０％）／Ｔ（１０％）］
ＨＢＶ保存領域２
ＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ［Ｇ（９９％）／Ａ（１％）］ＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴ
ＨＢＶ保存領域３
ＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴ［Ａ（４３％）／Ｇ（４３％）／Ｃ（１４％）］［Ｔ（５６％）／Ａ（３７％）／Ｃ（７％）］ＧＴ［Ａ（８７％）／Ｃ（１３％）］ＡＡＣＡ［Ａ（５７％）／Ｇ（４３％）］ＴＡ［Ｔ（５９％）／Ｃ（４１％）］［Ｃ（５９％）／Ａ（４１％）］ＴＧ［Ａ（９２％）／Ｃ（８％）］［Ａ（９３％）／Ｃ（７％）］ＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＧＴＴＧＣ［Ｔ（５４％）／Ｃ（４６％）］［Ｃ（９２％）／Ａ（８％）］ＧＧＣＡＡＣＧＧ［Ｃ（７４％）／Ｔ（２４％）］Ｃ［Ａ（５０％）／Ｔ（４３％）／ｃ（７％）］ＧＧ［Ｔ（８７％）／Ｃ（１３％）］ＣＴ［Ｇ（７０％）／Ｃ（１９％）／Ｔ（７％）／Ａ（４％）］ＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧ［Ｃ（４８％）／Ｔ（３８％）／Ａ（１４％）］ＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧ［Ｃ（８４％）／Ｔ（１６％）］［Ｃ（８４％）／Ｔ（１２％）／Ｇ（４％）］ＡＴ［Ａ（４７％）／Ｔ（２３％）／Ｇ（１７％）／Ｃ（１３％）］ＧＧＣＣＡＴＣ［Ａ（８３％）／Ｇ（１７％）］［Ｇ（９２％）／Ｃ（８％）］ＣＧＣＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴ［Ｇ（８４％）／Ｃ（１３％）／Ｔ（３％）］［Ｔ（９２％）／Ａ（４％）／Ｃ（３％）／Ｇ（１％）］Ｇ［Ｇ（７８％）／Ｔ（２２％）］ＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴ［Ａ（８８％）／Ｔ（９％）／Ｇ（１％）／Ｃ（１％）］ＧＣ［Ｃ（５７％）／Ａ（３５％）／Ｔ（６％）／Ｇ（２％）］ＧＣ［Ｔ（９２％）／Ｃ（７％）／Ｇ（１％）］ＴＧＴＴＴ［Ｔ（８８％）／Ｃ（１２％）］ＧＣＴＣＧＣＡＧＣ［Ｃ（６４％）／Ａ（３６％）］ＧＧＴＣＴＧＧ［Ａ（８７％）／Ｇ（１３％）］ＧＣ
ＨＢＶ保存領域４
［Ｃ（６２％）／Ｔ（３８％）］ＡＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴＴ［Ｇ（８８％）／Ａ（１２％）］ＧＧ［Ｇ（９２％）／Ａ（８％）］ＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣ［Ｃ（９２％）／Ａ（８％）］Ｃ［Ｔ（６５％）／Ｇ（３５％）］ＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴ［Ａ（６５％）／Ｔ（３５％）］ＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＣ［Ｇ（６２％）／Ｔ（３５％）／Ａ（３％）］ＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣ［Ｔ（９２％）／Ｃ（８％）］ＧＡＣＴＴ［Ｃ（９２％）／Ｔ（８％）］ＴＴＴＣＣＴＴＣ
ＨＢＶ保存領域５
［Ｃ（６９％）／ｄｅｌ（３１％）］［Ｇ（６９％）／ｄｅｌ（３１％）］Ａ［Ｇ（８５％）／Ｔ（１１％）／Ｃ（４％）］ＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧ［Ｃ（６１％）／Ａ（３９％）］Ｇ［Ａ（６２％）／Ｇ（３８％）］ＴＣＴＣＡＡＴＣＧ［Ｃ（８８％）／Ａ（１２％）］ＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴ［Ｃ（９２％）／Ｔ（８％）］ＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴ［Ｃ（８８％）／Ｔ（１２％）］ＡＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴ
ＨＢＶ保存領域６
ＴＴＧＧ［Ｃ（８４％）／ｔ（１６％）］［Ｃ（８４％）／ｔ（１２％）／ｇ（４％）］ＡＴ［Ａ（４７％）／ｔ（２３％）／ｇ（１７％）／ｃ（１３％）］ＧＧＣＣＡＴＣ［Ａ（８３％）／ｇ（１７％）］［Ｇ（９２％）／ｃ（８％）］ＣＧＣＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴ［Ｇ（８４％）／ｃ（１３％）／ｔ（３％）］［Ｔ（９２％）／ａ（４％）／ｃ（３％）／ｇ（１％）］Ｇ［Ｇ（７８％）／ｔ（２２％）］ＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴ［Ａ（８８％）／ｔ（９％）／ｇ（１％）／ｃ（１％）］ＧＣ［Ｃ（５７％）／ａ（３５％）／ｔ（６％）／ｇ（２％）］ＧＣ［Ｔ（９２％）／ｃ（７％）／ｇ（１％）］ＴＧＴＴＴ［Ｔ（８８％）／ｃ（１２％）］ＧＣＴＣＧＣＡＧＣ［Ｃ（６４％）／ａ（３６％）］ＧＧＴＣＴＧＧ［Ａ（８７％）／ｇ（１３％）］ＧＣ
ＨＢＶ保存領域７
ＣＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴ［Ｃ（８６％）／Ｔ（１０％）／Ａ（４％）］ＣＴ［Ｃ（６９％）／Ｔ（２５％）／Ａ（６％）］ＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＧＴ［Ｔ（７５％）／Ｃ（２５％）］ＴＡＣＧＴＣＣＣＧＴＣ［Ｇ（９３％）／Ａ（７％）］ＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣ［Ｃ（８６％）／Ｔ（７％）／Ａ（７％）］ＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＣ［Ｃ（５２％）／Ｇ（２５％）／Ｔ（１９％）／Ａ（４％）］
ＨＣＶ保存領域１
［Ａ（７４％）／Ｇ（１９％）／Ｔ（７％）］［Ｇ（８２％）／Ａ（１５％）／Ｔ（３％）］ＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴ［Ｃ（９２％）／Ｔ（７％）］ＧＴＧＣＡＧＣ［Ｃ（８９％）／Ｔ（１０％）］ＴＣＣＡＧＧ［Ａ（７６％）／Ｔ（１４％）／Ｃ（８％）／Ｇ（１％）］ＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣ［Ａ（９０％）／Ｇ（９％）］ＧＧＡ［Ｃ（７８％）／Ｔ（１６％）／Ａ（５％）］ＧＡＣＣＧＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴ［Ｇ（７８％）／Ｔ（１１％）／Ａ（１０％）］ＡＡＣＣＣＧＣＴＣ［Ａ（９４％）／Ｔ（５％）］ＡＴＧＣＣ［Ｔ（９０％）／Ｃ（９％）］ＧＧＡ［Ｇ（９１％）／Ｃ（４％）／Ａ（４％）］ＡＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣ［Ｇ（８５％）／Ａ（１４％）］ＡＧＡＣ［Ｔ（９４％）／Ｃ（５％）］ＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧ［Ｔ（９２％）／Ｃ（７％）］ＧＴＴＧＧＧＴ［Ｃ（９４％）／Ｔ（５％）］ＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡ［Ｃ（６２％）／Ｔ（３０％）／Ａ（８％）］ＣＡＴＧＡＧＣＡＣ［Ａ（５０％）／Ｇ（５０％）］［Ａ（９２％）／Ｃ（８％）］［Ａ（８９％）／Ｔ（１１％）］ＴＣＣ［Ｔ（９２％）／Ａ（５％）／Ｃ（３％）］ＡＡＡＣＣ［Ｔ（８４％）／Ｃ（１４％）／Ａ（２％）］ＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡ［Ｃ（８４％）／Ａ（１６％）］Ｇ［Ｔ（８４％）／Ａ（１６％）］ＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧ［Ｃ（７７％）／Ｔ（２３％）］ＣＧＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＧＴ［Ｃ（８１％）／Ｔ（１８％）／Ａ（１％）］ＡＡＧＴＴＣＣＣＧＧＧ［Ｃ（８９％）／Ｔ（１１％）］ＧＧ［Ｔ（８０％）／Ｃ（２０％）］ＧＧ［Ｔ（８０％）／Ｃ（１７％）／Ａ（３％）］ＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧ［Ｔ（９１％）／Ｃ（８％）／Ｇ（１％）］ＧＧＡＧＴ［Ｔ（８７％）／Ａ（１１％）／Ｃ（２％）］ＴＡＣ［Ｃ（７４％）／Ｔ（２０％）／Ｇ（６％）］ＴＧＴＴＧＣＣＧＣＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣ［Ｃ（８７％）／Ｔ（８％）／Ａ（４％）／Ｇ（１％）］［Ａ（９２％）／Ｃ（８％）］［Ｇ（９２％）／Ａ（５％）／Ｃ（２％）］［Ｇ（８７％）／Ａ（１２％）／Ｔ（１％）］ＴＴＧＧＧＴＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＣ［Ｔ（７８％）／Ｇ（１３％）／Ａ（７％）／Ｃ（２％）］ＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣ［Ｃ（９０％）／Ｇ（５％）／Ｔ（５％）］ＧＡ［Ｇ（９０％）／Ａ（１０％）］ＣＧＧＴＣ［Ｇ（７９％）／Ｃ（１２％）／Ａ（８％）／Ｔ（１％）］ＣＡ［Ａ（８６％）／Ｇ（１４％）］ＣＣ［Ｔ（８８％）／Ａ（６％）Ｃ（６％）］ＣＧ［Ｔ（８２％）／Ｃ（９％）Ａ（９％）］ＧＧ［Ａ（８７％）／Ｔ（８％）／Ｇ（３％）／Ｃ（２％）］ＡＧ
ＨＣＶ保存領域２
ＡＴＧＧＣ［Ｔ（７６％）／Ａ（１２％）／Ｃ（１０％）／Ｇ（２％）］ＴＧＧＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧ［Ｔ（８１％）／Ｃ（１９％）］Ｃ
配列番号書式中に提示された保存コンセンサス配列
以下の配列は、３７ＣＦＲ１．８２１に基づいて提供されたコードを用いてＷＩＰＯ規格ＳＴ．２５（１９９８）によって要求されている書式で提示されている。配列番号１〜配列番号１０はＨＢＶゲノム配列番号１１から誘導され、配列番号１２はＨＣＶゲノムから誘導される。
【００３２】
配列番号１ ＨＢＶ
ＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＡｒＣＡｙｈｄＣＡＴＣＡＧＧＡｙＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＣＧＧｋＧＴｋＴＴＴＣＴｙＧＴＴＧＡＣＡＡｒＡＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡＣＣｄＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧＧｄＡｎｙ
配列番号２ ＨＢＶ
ＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴｒＣＧＧＣＧＴＴＴＴＡＴＣＡＴ
配列番号３ ＨＢＶ
ＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴｖｈＧＴｍＡＡＣＡｒＴＡｙｍＴＧｍｍＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＧＴＴＧＣｙｍＧＧＣＡＡＣＧＧｙＣｈＧＧｙＣＴｎＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＧｈＴＧＧＧＧＣＴＴＧＧｙｂＡＴｎＧＧＣＣＡＴＣｒｓＣＧＣＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴｂｎＧｋＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴｎＧＣｎＧＣｂＴＧＴＴＴｙＧＣＴＣＧＣＡＧＣｍＧＧＴＣＴＧＧｒＧＣ
配列番号４ ＨＢＶ
ｙＡＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴＴｒＧＧｒＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣｍＣｋＴＡＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴｗＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＣｄＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣｙＧＡＣＴＴｙＴＴＴＣＣＴＴＣ
配列番号５ ＨＢＶ
ＣＧＡｂＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧｍＧｒＴＣＴＣＡＡＴＣＧｍＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴｙＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴｙＡＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴ
配列番号６ ＨＢＶ
ＡｂＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧｍＧｒＴＣＴＣＡＡＴＣＧｍＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴｙＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴｙＡＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴ
配列番号７ ＨＢＶ
ＣＡｂＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧｍＧｒＴＣＴＣＡＡＴＣＧｍＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴｙＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴｙＡＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴ
配列番号８ ＨＢＶ
ＧＡｂＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＧｍＧｒＴＣＴＣＡＡＴＣＧｍＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴｙＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴｙＡＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴ
配列番号９ ＨＢＶ
ＴＴＧＧｙｂＡＴｎＧＧＣＣＡＴＣｒｓＣＧＣＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴｂｎＧｋＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＴＣＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴｎＧＣｎＧＣｂＴＧＴＴＴｙＧＣＴＣＧＣＡＧＣｍＧＧＴＣＴＧＧｒＧＣ
配列番号１０ ＨＢＶ
ＣＴＧＣＣＡＡＣＴＧＧＡＴｈＣＴｈＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＧＴｙＴＡＣＧＴＣＣＣＧＴＣｒＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣｈＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＣｎ
配列番号１１ ＨＣＶ
ＤｄＡＴＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴｙＧＴＧＣＡＧＣｙＴＣＣＡＧＧｎＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣｒＧＧＡｈＧＡＣＣＧＧＧＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴｄＡＡＣＣＣＧＣＴＣｗＡＴＧＣＣｙＧＧＡｖＡＴＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣｒＡＧＡＣｙＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧｙＧＴＴＧＧＧＴｙＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡｈＣＡＴＧＡＧＣＡＣｒｍｗＴＣＣｈＡＡＡＣＣｈＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＡＡｍＧｗＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧｙＣＧＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＧＴｈＡＡＧＴＴＣＣＣＧＧＧｙＧＧｙＧＧｈＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧｂＧＧＡＧＴｈＴＡＣｂＴＧＴＴＧＣＣＧＣＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣｎｍｖｄＴＴＧＧＧＴＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＣｎＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣｂＧＡｒＣＧＧＴＣｎＣＡｒＣＣｈＣＧｈＧＧｎＡＧ
配列番号１２ ＨＣＶ
ＡＴＧＧＣｎＴＧＧＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧｙＣ
^＊２本鎖ＲＮＡ遺伝子サイレンシング／ＲＮＡｉ 「核酸組成物」又は「ヌクレオチド」組成物というのは、それ自体プリン（例えばアデニン）及びピリミジン（例えばチミン）から誘導された塩基と結合された、炭水化物（例えばペントース又はヘキソース）と１つ以上のリン酸分子が結合された任意の１つ以上の化合物を意味している。特に天然に発生する核酸分子としては、ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び宿主リボ核酸（ＲＮＡ）、ならびに後者のいくつかの異なる形態例えばメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が含まれる。同様に包含されているのは、異なるＲＮＡ分子と相補的な（ｃＤＮＡ）異なるＤＮＡ分子である。合成ＤＮＡ又は天然に発生するＤＮＡとのそのハイブリッド、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（ガンバリ（Ｇａｍｂａｒｉ）、最新薬学設計（Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ）２００１年１１月；７（１７）：１８３９−６２）も同様に使用することができる。
【００３３】
所望の核酸分子がＲＮＡである場合、本書で提供された配列内のＴ（チミン）はＵ（ウラシル）で置換される。例えば、配列番号１〜配列番号４４は、本書でＤＮＡ配列として開示されている。当業者にとっては、上述の配列番号のいずれかからの配列を含むＲＮＡエフェクタ分子が、Ｕで置換されたＴを有することになるということは明白であろう。
【００３４】
核酸は標準的には、２つ以上の共有結合された天然に発生する又は修飾されたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの配列を有する。修飾済み核酸には、例えば非天然塩基を伴うペプチド核酸及びヌクレオチドが含まれる。
【００３５】
「ｄｓＲＮＡ」というのは、２本鎖立体配座内にある２つ以上のヌクレオチドの１領域を含む核酸を意味する。本発明の保存ウイルス配列が、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング又はＲＮＡｉ機序を通して作用する当該技術分野において既知の又はその後開発された数多くの組成物のうちのいずれの中でも利用可能であるということが想定されている。さまざまな実施形態において、ｄｓＲＮＡは、例えば２０００年４月１９日出願国際公開第００／６３３６４号パンフレット又は１９９９年４月２１日出願米国特許出願公開第６０／１３０，３７７号明細書内で開示されているＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドといったようなリボヌクレオチド及びデオキシヌクレオチドの混合物から成るか又は全体的にリボヌクレオチドから成る。ｄｓＲＮＡは、分子の１つのセグメント内のヌクレオチドがその分子のもう１つのセグメント内のヌクレオチドと塩基対合するような形で自己相補性領域を伴う単一の分子であり得る。さまざまな実施形態においては、単一分子から成るｄｓＲＮＡは、完全にリボヌクレオチドから成るか又は、デオキシリボヌクレオチド領域に相補的であるリボヌクレオチド領域を含む。あるいはまた、ｄｓＲＮＡは、互いに対する相補性をもつ領域を有する２つの異なるストランドを含み得る。さまざまな実施形態において、両方のストランドは、完全にリボヌクレオチドから成るか、１本のストランドは完全にリボヌクレオチドから成り、１本のストランドは完全にデオキシリボヌクレオチドから成るか、あるいは、一方又は両方のストランドがリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む。望ましくは、相補性領域は、少なくとも７０、８０、９０、９５、９８又は１００％相補的である。望ましくは、２本鎖立体配座内に存在するｄｓＲＮＡの領域は、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、５０、７５、１００、２００、５００、１０００、２０００又は５０００ヌクレオチドを含むか又は、ｄｓＲＮＡで表わされているｃＤＮＡ内のヌクレオチドの全てを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１本鎖末端といったようないかなる１本鎖領域も含まず、あるいはｄｓＲＮＡはヘヤピンである。その他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは１つ以上の１本鎖領域又はオーバーハングを有する。望ましいＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、アンチセンス鎖又は領域である（例えば、標的核酸に対する少なくとも７０、８０、９０、９５、９８又は１００％の相補性をもつ）ＤＮＡ鎖又は領域及び、センス鎖又は領域である（例えば標的核酸に対し少なくとも７０、８０、９０、９５、９８又は１００％の同一性をもつ）ＲＮＡ鎖又は領域を含む。さまざまな実施形態において、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、本書で記述されているもの又は２０００年４月１９日出願国際公開第００／６３３６４号パンフレット又は１９９９年４月２１日出願米国特許出願公開第６０／１３０，３７７号明細書内で記述されているものといったような酵素又は化学的合成方法を用いてインビトロで作られる。その他の実施形態においては、インビトロで合成されたＤＮＡ鎖は、細胞内へのＤＮＡ鎖の形質転換の前、後又はそれと同時にインビボ又はインビトロでＲＮＡ鎖と複合体形成される。さらにその他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、センス及びアンチセンス領域を含む単一環状核酸であるか、そうでなければ、ｄｓＲＮＡは環状核酸及び第２の環状核酸又は線状核酸のいずれかを含む（例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット又は１９９９年４月２１日出願の米国特許出願公開第６０／１３０，３７７号明細書を参照のこと）。環状核酸の例としては、ヌクレオチドの遊離５’ホスホリル基がループバック式にもう１つのヌクレオチドの２’ヒドロキシル基に連結された状態となるラリアート構造が含まれる。
【００３６】
その他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、対応する２’位に水素又はヒドロキシル基が含まれている対応するｄｓＲＮＡに比べて、インビトロ又はインビボでｄｓＲＮＡの半減期を増大させる（メトキシ基などの）アルコキシ基又は（フッ素基といった）ハロゲンを糖内の２’位に含んでいる１つ以上の修飾済みヌクレオチドを含む。さらにもう１つの実施形態においてはｄｓＲＮＡは、天然に発生するホスホジエステル連結以外の隣接するヌクレオチドの間の１つ以上の連結を含む。かかる連結の例としては、ホスホラミド、ホスホロチオアート、及びホスホロジチオアート連結が含まれる。ｄｓＲＮＡは同様に、米国特許第６，６７３，６６１号明細書内で教示されているように化学的に修飾された核酸分子でもあり得る。その他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット又は１９９９年４月２１日出願の米国特許出願公開第６０／１３０，３７７号明細書により開示されているように１つ又は２つのキャップドストランドを含む。その他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、調節配列（例えば転写因子結合部位、プロモータ又はｍＲＮＡの５’又は３’未翻訳領域（ＵＴＲ）といったコーディング配列又は非コーディング配列を含む。さらに、ｄｓＲＮＡは、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット（例えば８〜２２ページ参照）内で開示されている少なくとも部分的にｄｓＲＮＡである分子のいずれか、ならびにその教示が本明細書に参照により援用されている２００２年７月３１日出願の米国仮特許出願第６０／３９９，９９８号明細書及び２００３年７月３１日出願のＰＣＴ米国特許第２００３／０２４０２８号明細書及び２００２年１０月１８日出願米国仮特許出願第６０／４１９，５３２号明細書及び２００３年１０月２０日出願ＰＣＴ米国特許第２００３／０３３４６６号明細書の中で記述されているｄｓＲＮＡ分子のいずれかであり得る。ｄｓＲＮＡのいずれも、２０００年４月１９日付国際公開第００／６３３６４号パンフレット（例えばｐ１６〜２２参照）の中で記述されているもののような標準的方法か又は本書で記述されている方法を用いてインビトロ又はインビボで発現可能である。
【００３７】
ｄｓＲＮＡ「ヘヤピン」構築物；逆方向反復配列を伴う１本鎖ＲＮＡはより効率よくｄｓＲＮＡヘヤピン構造を形成することから、一部の利用分野では、単分子ヘヤピンｄｓＲＮＡをコードする構築物が、２重鎖ｄｓＲＮＡ（すなわちセンス領域を伴う１つのＲＮＡ分子とアンチセンス領域を伴う別のＲＮＡ分子で構成されたｄｓＲＮＡ）をコードする構築物よりもさらに望ましい。このさらに高い効率は、一部には、２本鎖ｄｓＲＮＡを生成する収束プロモータを含むベクター内で生じる転写干渉の出現に起因するものである。転写干渉は結果として各ＲＮＡ鎖の不完全な合成をもたらし、かくして、互いに塩基対合して２重鎖を形成しうる完全センス及びアンチセンス鎖の数を低減させる。望まれる場合、（ｉ）１つのベクターがセンスＲＮＡをコードし第２のベクターがアンチセンスＲＮＡをコードする２ベクター系、（ｉｉ）個々のストランドが同じプラスミドによって、ただし別々のシストロンの使用を通してコードされている２シストロンベクター、又は（ｉｉｉ）ヘヤピンｄｓＲＮＡすなわちセンス及びアンチセンス配列が同じＲＮＡ分子内でコードされているＲＮＡをコードする単一プロモータベクタの使用を通して、転写干渉を克服することができる。ヘヤピン発現ベクターは、２重鎖ベクターに比べていくつかの利点を有する。例えば、２重鎖ＲＮＡをコードするベクターにおいては、ＲＮＡ鎖は転写の直後にその相補的対応物を見い出し、それと塩基対合することが必要である。このハイブリッド形成が起こらない場合、個々のＲＮＡ鎖は、転写鋳型から離れて拡散し、アンチセンス鎖に比べたセンス鎖の局所的集中は減少する。この効果は、細胞あたりの鋳型のレベルがさらに低いことに起因してインビトロで転写されたＲＮＡに比べ細胞内で転写されるＲＮＡについてさらに大きいものである。その上、ＲＮＡは、最近傍則によって折重なり、その結果、同時転写により折畳まれる（すなわち転写されるにつれて折畳まれる）ＲＮＡ分子をもたらす。従って、完成したＲＮＡ転写物の何パーセントかは、これらの分子内の分子内塩基対合のため、相補的な第２のＲＮＡとの塩基対合には利用不可能である。かかる利用不能な分子の百分率は、それらの転写後の時間と共に増加する。これらの分子は、すでに安定した形で折畳まれた構造であることから、決して２重鎖を形成し得ない。ヘヤピンＲＮＡ内では、ＲＮＡ配列は、つねにその相補的ＲＮＡと物理的に近いところにある。ＲＮＡ構造は静的でないことから、ＲＮＡが過渡的に展開するにつれてその相補的配列は直ちに利用可能であり、非常に近いことから塩基対合に参加できる。ひとたび形成された時点で、ヘヤピン構造は、もとのヘヤピン構造に比べさらに安定した状態となるものと予測されている。特に望ましいのは、例えば、２００２年７月３１日出願の米国特許出願公開第６０／３９９，９９８Ｐ号明細書及び２００３年７月３１日出願のＰＣＴ米国特許第２００３／０２４０２８号明細書「２本鎖ＲＮＡ構造及び構築物、及びその生成及び使用方法（Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ）」内で教示されているような、ｄｓＲＮＡヘヤピンを形成するべくＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより拡張され得る部分的ヘヤピンである「強制」ヘヤピン構築物；ならびに２００２年１０月１８日出願の米国特許出願公開第６０／４１９，５３２号明細書及び２００３年１０月２０日出願のＰＣＴ米国特許第２００３／０３３４６６号明細書「２本鎖ＲＮＡ構造及び構築物、及びその生成及び使用方法（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ， ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ）」内で教示されているようなマルチエピトープ構築物及びミス対合領域を伴うヘヤピンである「乳房」構造のヘヤピンである。
【００３８】
「短ｄｓＲＮＡ」というのは、２本鎖立体配座にある約５０、４５、４０、３５、３０、２７、２５、２３、２１、２０又は１９個の隣接ヌクレオチドという長さをもつｄｓＲＮＡを意味している。望ましくは、短ｄｓＲＮＡは、長さが少なくとも１９個の塩基対である。望ましい実施形態においては、２本鎖領域の長さは、１９〜５０、１９〜４０、１９〜３０、１９〜２５、２０〜２５、２１〜２３、２５〜３０又は３０〜４０の隣接塩基対である。一部の実施形態においては、短ｄｓＲＮＡは、長さが３０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、４００〜５００、５００〜７００、７００〜１０００、１０００〜２０００又は２０００〜５０００個のヌクレオチドであり、３８以上〜６０個以下の隣接塩基対の長さをもつ２本鎖領域を有する。一実施形態においては、短ｄｓＲＮＡは完全に２本鎖である。一部の実施形態では、短ｄｓＲＮＡは、長さが１１〜３０ヌクレオチドであり、全ｄｓＲＮＡは、２本鎖である。その他の実施形態では、短ｄｓＲＮＡは、１つ又は２つの１本鎖領域を有する。特定の実施形態においては、短ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ媒介型ストレス応答経路内でＰＫＲ又はもう１つのタンパク質に結合する。望ましくは、短ｄｓＲＮＡは、少なくとも２０、４０、６０、８０、９０又は１００％だけＰＫＲの２量体化及び活性化を阻害する。一部の望ましい実施形態においては、短ｄｓＲＮＡは、少なくとも２０、４０、６０、８０、９０又は１００％だけｄｓＲＮＡ媒介型ストレス応答経路のＰＫＲ又はもう１つの構成要素に対する長ｄｓＲＮＡの結合を阻害する。ＲＮＡ媒介型毒性を回避するためその他のｄｓＲＮＡと併せた短ｄｓＲＮＡの利用に関しては、２００３年４月２８日出願の米国特許出願公開第１０／４２５，００６号号明細書「毒性を誘発することのない遺伝子サイレンシング方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ）」、パチャック（Ｐａｃｈｕｋ）の教示も参照のこと。
【００３９】
「少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列」というのは、出発部位が少なくとも１９個の塩基対のポリヌクレオチドを産生する能力をもつかぎり、開示された配列の１つの内部のいずれのヌクレオチドにおいてもヌクレオチド配列が開始できることを意味している。例えば、１つの少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１からヌクレオチド１９まで、ヌクレオチド２からヌクレオチド２０まで、ヌクレオチド３からヌクレオチド２１まで等々を含んで１９量体を産生することができる。かくして、２０量体は、ヌクレオチド１からヌクレオチド２０まで、ヌクレオチド２からヌクレオチド２１まで、ヌクレオチド３からヌクレオチド２２まで等々を含むことができる。２０隣接ヌクレオチドを超える類似の配列も想定されている。
【００４０】
「発現ベクター」というのは、例えば、興味ある下流遺伝子またはコーデキング領域（例えば、タンパク質をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント、あるいはいずれかの興味あるＲＮＡ、例えばそれらは、コーディング領域の外側にある配列、アンチセンスＲＮＡコーディング領域、ｄｓＲＮＡコーディング領域、またはコーディング領域の外側にあるＲＮＡ配列に作動可能に連結されていてもよい）に作動可能に連結されている少なくとも１つのプロモータを含む構築物といった、ＲＮＡを転写するように設計されたあらゆる２本鎖ＤＮＡ又は２本鎖ＲＮＡを意味する。レシピエント細胞内への発現ベクターのトランスフェクション又は形質転換は、発現ベクターによってコードされるＲＮＡ又はタンパク質を細胞が発現できるようにする。発現ベクターは、例えばバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス又はヘルペスウイルスに由来する、遺伝子工学処理されたプラスミド、ウイルス又は人工染色体であり得る。
【００４１】
「発現構築物」というのは、ＲＮＡ、（例えば１つのタンパク質をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡフラグメント、又は問題のあるゆるＲＮＡといった）例えば問題の下流遺伝子又はコーディング領域に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモータを含む構築物といったような、ＲＮＡを転写するように設計されたあらゆる２本鎖ＤＮＡ又は２本鎖ＲＮＡを意味する。レシピエント細胞内への発現構築物のトランスフェクション又は形質転換は、発現構築物によってコードされるＲＮＡ又はタンパク質を細胞が発現できるようにする。発現構築物は、例えばバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス又はヘルペスウイルスに由来する、遺伝子工学処理されたプラスミド、ウイルス又は人工染色体であり得る。発現構築物は、生きた細胞中で複製可能でなくてはならないが、合成により作ることもできる。
【００４２】
「作動可能に連結された」という語は、核酸分子及び１つ以上の調節配列（例えばプロモータ）が、調節配列に適切な分子が結合させられた時点で、核酸分子の産物（すなわちポリペプチド）の発現及び／又は分泌を可能にするか又はｍＲＮＡの転写を可能にするような形で結びつけられていることを意味する。
【００４３】
「プロモータ」というのは、共有結合により連結された核酸分子の転写を導くのに充分な核酸配列を意味する。同様にこの定義内に含まれるのは、プロモータ依存型遺伝子発現を細胞型特異的、組織型特異的又は時間特異的な形で制御可能なものにするのに充分であるか又は外部シグナル又は作用物質により誘発可能である転写制御要素（例えばエンハンサ）である。当業者にとって周知であるこのような要素は、遺伝子の５’又は３’領域内又はイントロン内に見い出すことができる。望ましくは、プロモータは、例えば、核酸配列の発現を可能にするような形で例えばｃＤＮＡ又は遺伝子といった核酸配列に作動可能に連結される。
【００４４】
本発明に従ったＲＮＡ分子は、例えばプロメガプロトコル及び利用分野案内（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ）（第３版、１９９６）、ドイル（Ｄｏｙｌｅ）編、ＩＳＢＮ Ｎｏ．１５７といったテキストにより記述された従来の方法に従ってバクテリオファージＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて従来の酵素合成方法によりインビトロで作られた、ＲＮＡ分子又は部分的に２本鎖であるＲＮＡ配列又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドとしての組成物の形で、哺乳動物又は哺乳動物細胞内に存在する細胞外病原体まで送達可能である。あるいはまたこれらの分子はインビトロで化学的合成方法により作ることができる〔例えばＱ．シュー（Ｘｕ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、２４（１８）：３６４３−４（１９９６年９月）；Ｎ．ナリシュキン（Ｎａｒｙｓｈｋｉｎ）ら、生物有機化学（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ）、２２（９）：６９１−８（１９９６年９月）；Ｊ．Ａ．グラスビー（Ｇｒａｓｂｙ）ら、核酸研究、２１（１９）：４４４４−５０（１９９３年９月）；Ｃ．シェ（Ｃｈａｉｘ）ら、核酸研究、１７：７３８１−９３（１９８９年）；Ｓ．Ｈ．シュー（Ｃｈｏｕ）ら、生物化学（Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２８（６）：２４２２−３５（１９８９年３月）；０．オダール（Ｏｄａｌ）ら、核酸シンポジウム叢書（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．）、２１：１０５−６（１９８９）；Ｎ．Ａ．ナリシュキンら、生物有機化学、２２（９）：６９１−８（１９９６年９月）；Ｓ．サン（Ｓｕｎ）ら、ＲＮＡ、３（１１）：１３５２−１３６３（１９９７年１１月）；Ｘ．チャン(Ｚｈａｎｇ)ら、核酸研究、２５（２０）：３９８０−３（１９９７年１０月）；Ｓ．Ｍ．グルバズノフ（Ｇｒｖａｚｎｏｖ）ら、核酸研究、２−６（１８）：４１６０−７（１９９８年９月）；Ｍ．カドクラ（Ｋａｄｏｋｕｒａ）ら、核酸シンポジウム叢書、３７：７７−８（１９９７）；Ａ．デビソン（Ｄａｖｉｓｏｎ）ら、生物医学ペプチド、タンパク質及び核酸（Ｂｉｏｒｎｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）、２（ｌ）：１−６（１９９６年）；及びＡ．Ｖ．マドラコフスカイア（Ｍｕｄｒａｋｏｖｓｋａｉａ）ら、生物有機化学、１７（６）：８１９−２２（１９９１年６月）を参照のこと〕。
【００４５】
さらに別法として、本発明のＲＮＡ分子は、組換え型微生物、例えば細菌及び酵母中、又は組換え型宿主細胞中例えば哺乳動物細胞中で作り、従来の技術によりその培養から単離することができる。例えば、これらの技術を詳述する実験室マニュアルの模範であるサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング、実験室マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）、第２版；コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８９年中で記述されている技術、及び本明細書に参照により援用されている米国特許第５，８２４，５３８号明細書；同第５，８７７，１５９号明細書及び同第５，６４３，７７１号明細書に記述された技術を参照のこと。
【００４６】
インビトロで調製されるか又は合成されるこのようなＲＮＡ分子は、哺乳動物細胞に直接、又はインビトロで作られるにつれて哺乳動物に対し送達され得る。上述の参考文献は、当業者に対し、本書で提供されている教示をかんがみて、以下の特定の実施形態のいずれかを産生するのに必要な技術を提供する。従って、１つの実施形態においては、組成物の「作用物質」は２重鎖（すなわち２本のストランドで構成されている）、つまり、完全又は部分的のいずれかの２本鎖ＲＮＡである。
【００４７】
もう１つの実施形態においては、作用物質は、１本鎖ＲＮＡセンス鎖である。もう１つの実施形態においては、組成物の作用物質は、１本鎖ＲＮＡアンチセンス鎖である。
【００４８】
好ましくは、１本鎖ＲＮＡセンス又はアンチセンス鎖は一方又は両方の末端でヘヤピンを形成する。望ましくは、１本鎖ＲＮＡセンス又はアンチセンス鎖は、末端間のある中間部分でヘヤピンを形成する。このような１本鎖ＲＮＡセンス又はアンチセンス鎖は同様に、折り返えされてインビトロ又はインビボで部分的に２本鎖となるように設計されていてもよい。組成物中で使用される有効な作用物質としての現存のＲＮＡ分子のもう１つの実施形態は、任意には、非塩基対合型ポリヌクレオチド配列によって分離されているセンスポリヌクレオチド配列及びアンチセンスポリヌクレオチド配列の両方を含む１本鎖ＲＮＡ配列である。好ましくは、この１本鎖ＲＮＡ配列は、ひとたび細胞内に入った時点で又はその合成中にインビトロで２本鎖となる能力をもつ。
【００４９】
本発明のさらにもう１つの実施形態は、上述の通りＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドである。
【００５０】
合成ＲＮＡ分子のさらにもう１つの実施形態は、ロッド構造を任意に形成する環状ＲＮＡ分子〔例えばＫ−Ｓ．ワン（Ｗａｎｇ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２３：５０８−５１４（１９８６）参照〕であるか又は部分的に２本鎖となっており、全て本明細書に参照により援用されているＳ．ワング（Ｓ．Ｗａｎｇ）ら、核酸研究、２２（１２）：２３２６−３３（１９９４年６月）；Ｙ．マツモト（Ｙ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）ら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８７（１９）：７６２８−３２（１９９０年１０月）；Ｅ．フォード（Ｆｏｒｄ）及びＭ．アーレス（Ａｒｅｓ）、米国科学アカデミー紀要９１（８）：３１１７−２１（１９９４年４月）；Ｍ．ツアグリス（Ｔｓａｇｒｉｓ）ら、核酸研究、１９ ７）：１６０５−１２（１９９１年４月）；Ｓ．ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら、核酸研究、２４（２１）：４１５２−７（１９９６年１１月）；Ｚ．パスマン（Ｐａｓｍａｎ）ら、ＲＮＡ、２（６）：６０３−１０（１９９６年６月）；Ｐ．Ｇ．ザフィロポラス（Ｚａｐｈｉｒｏｐｏｕｌｏｓ）、米国科学アカデミー紀要、９３（１３）：６５３６−４１（１９９６年６月）；Ｄ．ボードリー（Ｂｅａｕｄｒｙ）ら、核酸研究、２３（１５）：３０６４−６（１９９５年８月）に記述されている技術に従って調製可能である。さらにもう１つの作用物質は、別々のストランド上で存在するか又は同じストランド上に散在するＲＮＡ及びＤＮＡから成る２本鎖分子である。
【００５１】
あるいはまた、ＲＮＡ分子はインビボで形成され得、従って哺乳動物細胞又は哺乳動物に対する作用物質の送達後インビボでこのような部分的に２本鎖であるＲＮＡ分子を生成する「送達作用物質」によって送達され得る。かくして、本発明の組成物を形成する作用物質は、１つの実施形態において、上述のＲＮＡ分子の１つを「コードする」２本鎖ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ作用物質は、２本鎖ＲＮＡとなるべく細胞内で転写されるヌクレオチド配列を提供する。もう１つの実施形態においては、ＤＮＡ配列は、任意には一方又は両方の末端でヘヤピンを形成するか又は折り返えされて部分的に２本鎖となる上述の１本鎖ＲＮＡセンス又はアンチセンス鎖へと細胞の内部で転写されるデオキシリボヌクレオチド配列を提供する。組成物の送達作用物質であるＤＮＡ分子は、任意には非塩基対合型ポリヌクレオチドによって分離されているセンスポリヌクレオチド配列及びアンチポリヌクレオチド配列の両方を含み２本鎖となる能力をもつ１本鎖ＲＮＡ配列を提供することができる。あるいはまた送達作用物質であるＤＮＡ分子は、任意にはインビボでロッド構造又は部分２本鎖を形成する上述の環状ＲＮＡ分子の転写を提供する。ＤＮＡ分子は同様に、上述のとおりのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド又は１つのＲＮＡ鎖及び１つのＤＮＡ鎖を含む２重鎖のインビボにて産生を提供することもできる。これらのさまざまなＤＮＡ分子は、上述のサンブルック又は前述のプロメガの参考文献中で記述されているものといったような従来の技術を利用することによって設計することができる。
【００５２】
上述のＲＮＡ分子のいずれかの哺乳動物細胞中での形成を可能にする本発明の後者の送達作用物質は、ＤＮＡ１本鎖又は２本鎖プラスミド又はベクターであり得る。インビトロ又はインビボで本書で記述されているようにＲＮＡを産生するように設計された発現ベクターは、ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｐｏｌＩ、ＲＮＡｐｏｌＩＩ及びＲＮＡｐｏ１ＩＩＩ及びウイルスポリメラーゼを含めたあらゆるＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７及びＳｐ６といったようなバクテリオファージポリメラーゼの制御下にある配列を含むことができる。これらのベクターは、本発明に従って細胞内で所望のＲＮＡ分子を転写するために使用することができる。ベクターは望ましくは、内因性ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ（例えばヒトミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ；その場合、かかるベクターは対応するヒトミトコンドリアプロモータを利用することができる）を利用するように設計可能である。ミトコンドリアポリメラーゼは、インビボで、キャップド（キャッピング酵素の発現を通したもの）又はアンキャップドメッセージを生成するために使用可能である。ＲＮＡｐｏｌＩ、ＲＮＡｐｏｌＩＩ及びＲＮＡｐｏｌＩＩＩ転写物、も同様にインビボで生成可能である。このようなＲＮＡは、キャッピングされていてもいなくてもよく、望まれる場合、ワクシニアキャッピング酵素又はアルファウイルスキャッピング酵素といったようなキャッピング酵素の使用を含めたさまざまな手段により細胞質キャッピングが達成可能である。しかしながら、全てのｐｏｌＩＩ転写物がキャッピングされる。ＤＮＡベクターは、プロモータの１つ又は多数のプロモータの組合せ（ミトコンドリア、ＲＮＡｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、又はｐｏｌＩＩＩ、又はウイルス、細菌又はバクテリオファージプロモータならびに同族体ポリメラーゼ）を含有するように設計される。好ましくは、プロモータがＲＮＡｐｏｌＩＩである場合、ＲＮＡ分子をコードする配列は約３００ｎｔｓより大きい読取り枠を有し、核内のナンセンス媒介型分解を防ぐように設計の法則に従わなくてはならない。かかるプラスミド又はベクターは、細菌、ウイルス又はファージ由来のプラスミド配列を含むことができる。
【００５３】
かかるベクターは、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメントおよびウイルス、そしてそれらの組み合わせに由来するベクターを包含し、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメント、コスミドおよびファージミドに由来するものを包含する。
【００５４】
かくして、１つのベクター例は、１本鎖又は２本鎖ファージベクターである。もう１つのベクター例は、１本鎖又は２本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベクターである。かかるベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡを細胞内に導入するための周知の技術により、ポリヌクレオチド好ましくはＤＮＡとして細胞内に導入され得る。ファージ及びウイルスベクターの場合、ベクターは、感染及び形質導入のための周知の技術によりパッケージング又は包膜されたウイルスとして細胞内にあってもよく好ましくはこのように細胞内に導入される。ウイルスベクターは、複製応答性ベクターであっても複製欠損性ベクターであってもよい。後者の場合、ウイルス伝播は一般に、相補する宿主細胞内でのみ発生する。
【００５５】
もう１つの実施形態においては、送達作用物質は、２つ以上のＤＮＡ又はＲＮＡプラスミド又はベクターを含む。１例としては、第１のＤＮＡプラスミドは、上述のような１本鎖ＲＮＡセンスポリヌクレオチド配列を提供でき、第２のＤＮＡプラスミドは上述のように、１本鎖ＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド配列を提供でき、ここで、センス及びアンチセンスＲＮＡ配列は塩基対合し２本鎖となる能力をもつ。このようなプラスミドは、例えばタンパク質の組換え型発現のためにプラスミド及びベクターを構築するのに用いられる周知の配列といったような例えば細菌配列といったその他の従来のプラスミド配列を含むことができる。ただし、タンパク質発現を可能にする配列例えばコザック（Ｋｏｚａｋ）領域などをこれらのプラスミド構造内に含み入れないことが望ましい。
【００５６】
本発明のｄｓＲＮＡを産生するように設計されたベクターは、望ましくは、標的配列に相補的で相同な一定数の異なるｄｓＲＮＡを含め、２つ以上を生成するように設計され得る。このアプローチは、単一のベクターが、単一の転写単位由来の単一のｄｓＲＮＡ分子ではなく数多くの独立して作動的なｄｓＲＮＡを産生することができ、かつ多数の異なるｄｓＲＮＡを産生することにより最適な有効性を自己選択することが可能であるという点で、望ましいものである。無作為の及び／又は予め定められたスプライス部位を作り出すための開裂用の配列ならびに自己触媒配列を含め多様な手段を利用してこれを達成することが可能である。
【００５７】
哺乳動物細胞内での上述の所望のＲＮＡ分子の形成のために必要な情報を提供するためのその他の送達作用物質としては、本発明の所要ＲＮＡ分子のために必要な配列を含むように設計されている生きた、弱毒化された又は死んだ、不活性組換え型細菌が含まれる。このような組換え型細菌細胞、真菌細胞などは、本明細書に参照により援用されている米国特許第５，８２４，５３８号明細書；同第５，８７７，１５９号明細書；及び同第５，６４３，７７１号明細書の中で記述されているような従来の技術を用いることによって調製可能である。これらの送達作用物質を調製する上で有用である微生物としては、制限的な意味なくエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の多様な種を含めた上述の参考文献中に列挙されたものがある。
【００５８】
哺乳動物細胞内での所望の上述のＲＮＡ分子の形成のために必要な情報を提供するためのさらなるその他の送達作用物質としては、生きた、弱毒化した又は死んだ不活性ウイルス、特に、上述の所要ＲＮＡポリヌクレオチド配列を担持する組換え型ウイルスがある。かかるウイルスは、遺伝子療法などのために細胞に遺伝子を送達するのに現在使用されている組換え型ウイルスと類似の要領で設計され得るが、好ましくは、タンパク質又はタンパク質の機能的フラグメントを発現する能力を有していない。インビボで哺乳動物細胞に対し所要ＲＮＡ分子を提供するために操作可能である有用なウイルス又はウイルス配列としては、制限的意味なくアルファウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、バキュロウイルス、デルタウイルス、ポックスウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）、ポリオウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、プラス及びマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ウイロイド、ウィルソイド又はそれらの一部分がある。これらのさまざまなウイルス送達作用物質は、本発明の教示と共になかでもＭ．ディ・ノコラ（Ｄｉ Ｎｏｃｏｌａ）ら、癌の遺伝子治療（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、５（６）：３５０−６（１９９８年）の中に記述されているような従来の技術を適用することによって設計可能である。
【００５９】
「インビボ」という語は、単細胞又は多細胞生体内で組織培養系を含め、細胞ＤＮＡ又はＲＮＡ複製機序が無傷であるあらゆる系を包含するように意図されている。
【００６０】
「多重セキトープ（ｓｅｑｕｉｔｏｐｅ）ｄｓＲＮＡ」又は「マルチセキトープｄｓＲＮＡ」というのは、多重標的核酸から誘導されたセグメントを有するか又は、同じ標的核酸由来の非隣接セグメントを有するＲＮＡ分子を意味する。例えば、多重セキトープｄｓＲＮＡは、（ｉ）単一の生体の多数の遺伝子を表わす配列；（ｉｉ）多様な異なる生体からの１つ以上の遺伝子を表わす配列；及び／又は（ｉｉｉ）特定の遺伝子の異なる領域を表わす配列（例えばプロモータからの１つ以上の配列及びｍＲＮＡからの１つ以上の配列）に由来するセグメントを有し得る。望ましくは、各々のセグメントは、標的核酸の対応する領域に対し実質的な配列同一性を有する。さまざまな望ましい実施形態において、標的核酸に対する実質的な配列同一性をもつセグメントの長さは、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、３０、４０、５０、１００、２００、５００、７５０以上の塩基対である。望ましい実施形態においては、多重エピトープｄｓＲＮＡは、少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０以上の標的遺伝子の発現を少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、９５又は１００％だけ阻害する。一部の実施形態においては、多重エピトープｄｓＲＮＡは、セグメントの天然に発生する５’→３’順序であっても又はそうでなくてもよい同じ標的遺伝子からの非隣接セグメントを有しており、ｄｓＲＮＡは、セグメントのうちの１つのみを有するｄｓＲＮＡに比べて少なくとも５０、１００、２００、５００又は１０００％多く、核酸の発現を阻害する。
【００６１】
「セキトープ」というのは、通常は１９〜２７の塩基対の間の隣接配列である、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘発されたサイレンシング複合体）と会合しこれを活性化できる２本鎖ポリリボヌクレオチドの隣接配列を意味する。ここで同定された保存ＨＢＶ及び／又はＨＣＶヌクレオチド配列の１つ以上のものの中からの少なくとも１つのセキトープを含む配列は、本書で教示されているように、ｄｓＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシングのために利用することができる。
【００６２】
多重−エピトープｄｓＲＮＡ ２００２年１０月１８日出願米国特許出願公開第６０／４１９，５３２号明細書及び２００３年１０月２０日出願ＰＣＴ米国特許第２００３／０３３４６６号明細書内で教示されている通りの多重−エピトープ又はマルチセキトープ２本鎖ＲＮＡアプローチの利点は、本発明の保存ＨＢＶ及び／又はＨＣＶ配列の利用に応用可能である。ｄｓＲＮＡの特定の種は同時に数多くの標的遺伝子（例えば多数の病原体由来の遺伝子、単一の病原体由来の多数の遺伝子又は配列、又は多数の疾病と結びつけられる遺伝子）をサイレンシングできることから、同じ対象の体内の多くの異なる適応症のため又は１つの対象の体内の適応症サブセット及びもう１個の対象におけるもう１つの適応症サブセットのために、多重エピトープｄｓＲＮＡを使用することができる。かかる利用分野のためには、ｄｓＲＮＡストレス応答を引き起こすことなく、長いｄｓＲＮＡ分子（例えば多重遺伝子からの配列を伴うｄｓＲＮＡ分子）を発現する能力がきわめて望ましい。例えば、かかる配列の合計長が選択されたプラスミドの最大容量（例えば長さ２０キロベース）以内となるように各々例えば１９−２１ヌクレオチドといった短かいもの、望ましくは１００〜６００ヌクレオチド又容易に１、２、３、４、５キロベースまで、あるいはそれ以上の一連の配列を利用することによって、このような単一の薬学組成物が、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶなどといった多数の病原体及び／又は毒素に対する保護を比較的低いコスト及び低い毒性で提供することができる。
【００６３】
ＨＢＶ及び／又はＨＣＶといったようなきわめて可変的又は急速に突然変異する病原体の多数の菌株及び／又は変異体由来の１つ以上の遺伝子から誘導された多数のエピトープの使用も又、非常に有利であり得る。例えば、ＨＢＶ及び／又はＨＣＶのさまざまな菌株／変異体のための汎用性のある治療又はワクチンとして、ＨＢＶ及び／又はＨＣＶの多数の菌株及び／又は変異体を認識しかつターゲティングするまれに見るｄｓＲＮＡ種を使用することができる。
【００６４】
ＨＢＶ及び／又はＨＣＶといったような特定の病原体の多数の遺伝子をサイレンシングする能力は、この場合ＨＢＶ及び／又はＨＣＶの「エスケープ突然変異体」の選択を妨げる。これとは対照的に、１つの遺伝子又はタンパク質のみをターゲティングする標準的な小分子治療又はワクチン療法は、標的遺伝子又はタンパク質中に持続的突然変異を有する病原体の選択を結果としてもたらし、かくして、該病原体はその療法に対する耐性をもつことになる。本発明の多重エピトープアプローチを用いて病原体の広範な領域及び／又は病原体の多数の遺伝子又は配列を同時にターゲティングすることによって、かかる「エスケープ突然変異」の出現は有効に排除される。
【００６５】
例えば、生存能力をもつエスケープ突然変異を生成するウイルスの能力を減少させる目的で単一のｄｓＲＮＡ構築物、複数の構築物の混和物の形でか又は患者に対するかかる構築物の同時投与を通して、ＨＣＶ１１及び配列番号１２の両方からの配列すなわちＨＣＶ配列１１からの１つ以上の配列ならびにＨＣＶ配列１２からの１つ以上の配列の混合物を包含することが特に有効であるとみなされている。類似の要領で、一部のケースでは、本発明の保存されたＨＣＶ配列のうちの１つ以上のものと組合わせて、保存されたＨＢＶ配列の混合物を提供することが有利であると思われる。
【００６６】
類似の要領で、単一のｄｓＲＮＡ構築物、複数の構築物の混和物の形でか又は患者に対するかかる構築物の同時投与を通して、ＨＢＶ配列番号１、配列番号２及び配列番号３のうちの２つ以上のものからの配列を使用することが望ましい可能性がある。配列番号１、配列番号２及び配列番号３はＨＢＶ表面抗原遺伝子に対しマッピングする。ＨＢＶｍＲＮＡがオーバーラップしていることから、表面Ａｇ（ｓＡｇ）ｍＲＮＡ、プレコア、コア及びポリメラーゼｍＲＮＡといったｍＲＮＡは、これらの配列のうちの１つ以上のものによりターゲティングされることになる。しかしながら、ｓＡｇｍＲＮＡが最も豊富であることから、遺伝子サイレンシング機序が飽和状態にある場合に、これらのｍＲＮＡがターゲティングされることになる確率はさらに高くなる。しかしながら、全ての列挙されたｍＲＮＡがターゲティングされることになる可能性もある。表面Ａｇの低減が次のいくつかの理由から望まれる。すなわち、ａ）感染性ビリオンの組立てのために表面Ａｇが必要とされる；ｂ）感染中の表面Ａｇの過剰発現が、慢性感染中に起こる免疫アネルギーに寄与すると考えられている；及びｃ）（ウイルスの不在下でさえ、すなわち宿主ゲノム内に組込まれたｓＡｇ配列に由来して）感染した個体の肝臓内のｓＡｇの発現が肝炎を誘発する。従って、ｓＡｇの削減がウイルス力価を減少させ、免疫アネルギーを克服し肝炎を低減させ／予防する確率が高い。
【００６７】
ＨＢＶ配列番号４は、プレコア及びコアのユニーク領域にマッピングし、これらのｍＲＮＡを特異的にターゲティングすることになる。機能的なビリオンを作るには、コアタンパク質が必要とされ、従って、このｍＲＮＡのダウンレギュレーションがウイルス力価を減少させるものと予測されている。表面、ポリメラーゼ又はＸｍＲＮＡについてのこれらのエフェクタＲＮＡの競合は全くあってはならない。
【００６８】
ＨＢＶ配列５〜配列８がポリメラーゼ遺伝子にマッピングする。エフェクタＲＮＡは、プレコア／コア及びポリメラーゼ転写物のみをターゲティングするものと予測されている。ｓＡｇ又はＸｍＲＮＡとの競合は全くあってはならない。ウイルスゲノムの合成のためにはポリメラーゼが必要とされ、従って、ポリメラーゼが減少した場合、ウイルス粒子力価は減少するものと予想される。
【００６９】
ＨＢＶ配列９はＸ遺伝子にマッピングする。全てのｍＲＮＡの末端冗長性のため、これらのエフェクタＲＮＡは、全てのウイルスｍＲＮＡをターゲティングする潜在性を有する。Ｘタンパク質は、数多くの割当てられた（証明されていない）機能を有する。しかしながら、Ｘ遺伝子は、往々にして活性肝炎を患う個体の体内の組込まれたＨＢＶ配列の中に発見され、Ｘ遺伝子発現のダウンレギュレーションが疾病を改善するものと予測されている。
【００７０】
一般的に、使用される異なる同定された配列由来の配列が多くなればなるほど（例えば、配列番号１、配列番号２及び／又は配列番号３由来、そしてこれに加えて配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０由来のからの配列）、生存可能なエスケープ突然変異をウイルスが生成できる確率は低くなる。同様に、ターゲティングされうるｍＲＮＡが異なれば異なるほど、ウイルス力価の低下及び疾病の改善はより有意なものとなる。
【００７１】
マルチエピトープ構築物、構築物混和物又は異なるｄｓＲＮＡ構築物の同時投与のための望ましい組合せには、以下のものが含まれる。配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号４由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号５由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号６由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号７由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号４及び配列番号５由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号４及び配列番号６由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号４及び配列番号７由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号４及び配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号４及び配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号４及び配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号５及び配列番号６由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号５及び配列番号７由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号５及び配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号５及び配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号５及び配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号６及び配列番号７由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号６及び配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号６及び配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号６及び配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号７及び配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号７及び配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号７及び配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号８及び配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号８及び配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２又は配列番号３由来の配列プラス配列番号９及び配列番号１０由来の配列；配列番号４及び配列番号５由来の配列；配列番号４及び配列番号６由来の配列；配列番号４及び配列番号７由来の配列；配列番号４及び配列番号８由来の配列；配列番号４及び配列番号９由来の配列；配列番号４及び配列番号１０由来の配列；配列番号５及び配列番号６由来の配列；配列番号５及び配列番号７由来の配列；配列番号５及び配列番号８由来の配列；配列番号５及び配列番号９由来の配列；配列番号５及び配列番号１０由来の配列；配列番号６及び配列番号７由来の配列；配列番号６及び配列番号８由来の配列；配列番号６及び配列番号９由来の配列；配列番号６及び配列番号１０由来の配列；配列番号７及び配列番号８由来の配列；配列番号７及び配列番号９由来の配列；配列番号７及び配列番号１０由来の配列；配列番号８及び配列番号９由来の配列；配列番号８及び配列番号１０由来の配列；配列番号９及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５；及び配列番号６由来の配列；配列番号４、配列番号５；及び配列番号７由来の配列；配列番号４、配列番号５；及び配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号５；及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号６；及び配列番号７由来の配列；配列番号４、配列番号６；及び配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号６；及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号６；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号７；及び配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号７；及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号７；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号８；及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号８；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号９；及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６；及び配列番号７由来の配列；配列番号５、配列番号６；及び配列番号８由来の配列；配列番号５、配列番号６；及び配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号６；及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号７；及び配列番号８由来の配列；配列番号５、配列番号７；及び配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号７；及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号８；及び配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号８；及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号９；及び配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号７；及び配列番号８由来の配列；配列番号６、配列番号７；及び配列番号９由来の配列；配列番号６、配列番号７；及び配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号８；及び配列番号９由来の配列；配列番号６、配列番号８；及び配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号９；及び配列番号１０由来の配列；配列番号７、配列番号８；及び配列番号９由来の配列；配列番号７、配列番号８；及び配列番号１０由来の配列；配列番号７、配列番号９；及び配列番号１０由来の配列；配列番号８、配列番号９；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号６；及び配列番号７由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号６；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号７；及び配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号７；及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号７；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号８；及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号８；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号９；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号６；配列番号７；及び配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号６；配列番号７；及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号６；配列番号７；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号７；配列番号８；及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号７；配列番号８；及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号７；配列番号９；及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６；配列番号８；及び配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号６；配列番号８；及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６；配列番号９；及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号７；配列番号８；及び配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号７；配列番号８；及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号７；配列番号９；及び配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９由来の配列；配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び 配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列；ならびに配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０由来の配列。
【００７２】
もう１つの実施形態においては、上述の配列（例えば配列番号１〜配列番号１２）のいずれかの中からのセキトープ及びそれより長い配列の組合せを、単一のｄｓＲＮＡ構築物、複数の構築物の混和物の形か又は患者に対するかかる構築物の同時投与を通して、利用することができる。
【００７３】
本書の他の箇所で論述されている通り、本発明の特に好ましい実施形態は、本発明のｄｓＲＮＡ、特に上述の多数の異なる配列の内因的送達を達成するために、ｄｓＲＮＡ発現構築物又はベクターを利用する。これらのｄｓＲＮＡは、例えば、プラスミドといったような発現構築物の同じシストロン上、発現構築物の異なるシストロン上、又は異なる発現構築物又はプラスミド例えばウイルスベクターを含む１つ以上のプラスミド及び／又は１つ以上のベクター上で提供され得る。かかる多数の異なる配列は、外因的に、１つ以上のｄｓＲＮＡ構造、２重鎖及び／又はヘヤピンの任意の異なる混合物の形で及び／又は１つ以上の内因的に発現されたｄｓＲＮＡ構造と組合わせた形で、提供することもできる。
【００７４】
核酸の望ましい投与方法 本発明のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ構築物は、いかなるトランスフェクション促進剤もなく薬学的ビヒクル内で処方された「裸の」ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡとして、宿主細胞／組織／生体に対し投与可能である。ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ送達の当業者にとっては既知のものであるこのようなポリヌクレオチドトランスフェクション促進用作用物質などを用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡ送達の当業者にとって既知の通りに、より効率の良い送達を達成することができる。以下のものが作用物質の例である；ブピバカインといった局所麻酔薬を含むカチオン両親媒性物質、カチオン脂質、リポソーム又は脂質粒子、ポリカチオン例えばポリリジン、分枝３次元ポリカチオン例えばデンドリマー、炭水化物、洗浄剤又は塩化ベンズアルコニウムなどのベンジルアンモニウム界面活性剤を含む界面活性剤。本発明において有用であるかかる促進用作用物質又は補助作用物質の排他的でない例は、その教示が本明細書に参照により援用されている米国特許第５，５９３，９７２号明細書；同第５，７０３，０５５号明細書；同第５，７３９，１１８号明細書；同第５，８３７，５３３号明細書；同第５，９６２，４８２号明細書；同第６，１２７，１７０号明細書；同第６，３７９，９６５号明細書；及び同第６，４８２，８０４号明細書及びＰＣＴ米国特許第９８／２２８４１号明細書の中で記述されている。米国特許第５，８２４，５３８号明細書；同第５，６４３，７７１号明細書；及び同第５，８７７，１５９号明細書（本明細書に参照により援用）は、本発明のｄｓＲＮＡコーディング組成物を含む細菌又はトランスフェクションを受けたドナー細胞などのポリヌクレオチド組成物以外の組成物の送達を教示している。
【００７５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターは、米国特許第４，８９７，３５５号明細書（１９８７年１０月２９日出願エプスタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）ら）、米国特許第５，２６４，６１８号明細書（１９９１年４月１６日出願、フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら）又は米国特許第５，４５９，１２７号明細書（１９９３年９月１６日出願、フェルグナーら）の中で開示されている組成物といったような１つ以上のカチオン脂質又はカチオン両親媒性物質と複合体形成する。その他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現ベクターを、カチオン脂質を含み任意には中性脂質といったようなもう１つの成分を含むリポソーム／リポソーム性組成物と複合体形成させることができる（例えば米国特許第５，２７９，８３３号明細書（ローズ（Ｒｏｓｅ））、米国特許第５，２８３，１８５号明細書（エパンド（Ｅｐａｎｄ））及び米国特許第５，９３２，２４１号明細書を参照のこと）。
【００７６】
肝細胞へのターゲット送達用のものを含めた、薬学的利用分野のための本発明のオリゴヌクレオチド組成物の送達用の特に望ましい方法及び組成物が、その教示が本明細書に参照により援用されている２００３年５月６日出願のＰＣＴ米国特許第０３／１４２８８号明細書中で記述されている。
【００７７】
研究及びその他の非治療目的用の細胞の形質転換／トランスフェクションは、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介型トランスフェクション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈降、ウイルス又はレトロウイルス送達、電気穿孔法又はバイオリスティック形質転換を含めた（ただしこれらに制限されるわけではない）さまざまな手段を通して発生させることができる。ＲＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター（ＤＮＡ）は、裸のＲＮＡ又はＤＮＡ又は局部麻酔薬複合体化ＲＮＡ又はＤＮＡでありうる（米国特許第６，２１７，９００号明細書及び同第６，３８３，５１２号明細書、「胞状複合体及びその作製及び使用方法（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ）」、パチャク（Ｐａｃｈｕｋ）ら、前掲書）を参照のこと）。
【００７８】
薬学的利用分野のための本発明のｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現構築物用のもう１つの望ましい送達技術は、インサート・テラプティクス（Ｉｎｓｅｒｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州パサディナ（Ｐａｓａｄｅｎａ））、から入手可能なシクロデキストリン含有ポリカチオンに基づくセルフアッセンブリー型サイクロサート（Ｃｙｃｌｏｓｅｒｔ）（商標）２成分核酸送達系である（バイオコンジュゲート化学（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ）２００３年５月−６月；１４（３）：６７２−８；ポピラルスキー（Ｐｏｐｉｅｌａｒｓｋｉ）ら；「遺伝子送達に対する炭水化物含有ポリカチオンの構造的効果、３．シクロデキストリンタイプ及び機能化（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． ３． Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）」ならびにバイオコンジュゲート化学、２００３年１月−２月；１４（１）：２４７−５４及び２５５−６１参照）。第１の成分は、ＤＮＡと混合した時点で核酸のリン酸塩「主鎖」に結合し、ＤＮＡを縮合させ、血清中のヌクレアーゼ分解からＤＮＡを保護する均質のコロイドナノ粒子へとセルフアッセンブリーする、線状シクロデキストリン含有ポリカチオン重合体である。第２の成分は、シクロデキストリン重合体と組合せた時点で表面シクロデキストリンと包接複合体を形成し凝集を防ぎ、安定性を増強し全身的投与を可能にする末端アダマンチン−ＰＥＧ分子を伴う表面変性剤である。さらに、細胞表面受容体に対するターゲティングリガンドを変性剤に付着させて問題の標的細胞に直接ターゲティングされたＤＮＡの送達を提供することもできる。肝細胞は、ＨＢＶ及びＨＣＶ感染に敏感であることから、肝臓細胞に対する本発明のｄｓＲＮＡ発現構築物の送達をターゲティングするためにこの方法を利用することは、特に有利であると考えられている。例えば、哺乳動物肝細胞上のアシアロ糖タンパク受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）は、ガラクトシル化重合体といったようなガラクトシル化又はラクトシル化残基と共に合成リガンドを使用することによってターゲティングされ得る。
【００７９】
一般に、本発明のｄｓＲＮＡ構築物の選択的送達のための肝細胞に対するターゲティングが好ましい。肝細胞へのターゲティングは、肝細胞特異的受容体のためのリガンドに対するカップリングによって達成され得る。例えば、アシアロ−オロソムコイド、（ポリ）Ｌ−リジン−アシアロ−オロムコイド、又は肝臓アシアロ糖タンパク受容体のその他のあらゆるリガンドがある（スピエス(Ｓｐｉｅｓｓ)、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２９（４３）：１０００９−１００１８、１９９０；ウー（Ｗｕ）ら、生物化学ジャーナル（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６７（１８）：１２４３６−１２４３９、１９９２；ウーら、生物学的療法（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ）３：８７−９５、１９９１）。同様にして、肝細胞特異的受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体に抱合させることによって、オリゴヌクレオチドを肝細胞にターゲティングさせることができる。オリゴヌクレオチドは同様に、以下で記述されている通り、特異的ベクターを用いて肝細胞にターゲティングさせることもできる。
【００８０】
本発明のｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現構築物の送達のための特に好ましい組成物は、肝細胞のＡＳＧ受容体に対するターゲティングのためのリガンドとしてトリラクトシルスペルミンを包含し得る２００３年５月６日出願のＰＣＴ米国特許第０３／１４２８８号明細書中で記述されている通りの多機能性組成物である。本発明のオリゴヌクレオチドとのトリラクトシルコレステリルスペルミン共複合体は、インビボで肝細胞をトランスフェクトするべく記述された通りに調製し使用することができる。
【００８１】
本発明のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、標的肝細胞に対し外因的に提供されうる。あるいはまた、ｄｓＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を含む核酸分子の転写によって、標的細胞内でｄｓＲＮＡを産生することもできる。この方法においては、核酸分子は、複製しない線状又は環状ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含まれているか、又は自己複製プラスミド又はウイルスベクター内に含まれているか、又は宿主ゲノム内に組込まれている。肝細胞をトランスフェクトできるあらゆるベクターを本発明の方法の中で使用することができる。好ましいベクターは、複製欠損肝炎ウイルス（例えばＨＢＶ及びＨＣＶ）、レトロウイルス（例えば、国際公開第８９／０７１３６号パンフレット；ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、ニューイングランド医学ジャーナル（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．）３２３（９）：５７０−５７８、１９９０年を参照のこと）、アデノウイルス（例えば、モーシー（Ｍｏｒｓｅｙ）ら、細胞生化学ジャーナル（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）、増補１７Ｅ、１９９３年；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、マリー（Ｍｕｒｒａｙ）編、分子生物学方法：遺伝子トランスファと発現プロトコル（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、第７巻、ニュージャージ州クリフトン（Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）：ザ・ヒューマン・プレス（ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９９１年：１０９−１２８を参照のこと）、アデノ関連ウイルス（コーチン（Ｋｏｔｉｎ）ら、米国科学アカデミー紀要、８７：２２１１−２２１５、１９９０年）、複製欠損型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；リュー（Ｌｕ）ら、要約、６６頁、遺伝子療法会議の抄録（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、９月、２２−２６、１９９２年、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）から誘導されたものを含めたウイルスベクター及びこれらのベクターのあらゆる修飾バージョンである。発現ベクターを構築するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、分子クローニング：実験室マニュアル、サンブルックら編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年を参照のこと）。
【００８２】
例えば相同的組換え（グラハムら、総合ウイルス学ジャーナル（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）３６：５９−７２、１９７７年）又はその他の適切な方法(分子クローニング：実験室マニュアル、サンブルックら編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年）によって当業者にとって既知の方法を用いて本発明のベクター内に適切な調節配列を挿入することができる。
【００８３】
プロモータ 標準的には（ただし不変的にではなく）ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドをコードする核酸配列に対し５’のところで作動可能に連結されるような形で、プロモータをベクター内に挿入する。本発明内では、真核細胞内での転写の開始を導く能力をもつあらゆるプロモータを使用することができる。例えば、サイトメガロウイルス（デベルナルディ（ＤｅＢｅｒｎａｒｄｉ）ら、米国科学アカデミー紀要８８：９２５７−９２６１、１９９１年、及び同書中の参考文献）、マウスのメタロチオニンＩ遺伝子（ハマー（Ｈａｍｍｅｒ）ら、分子及び応用遺伝学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．）１：２７３−２８８、１９８２年）、ＨＳＶチミジンキナーゼ（マックナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）、セル（Ｃｅｌｌ）３１：３５５−３６５、１９８２年）、及びＳＶ４０の初期（ベノア（Ｂｅｎｏｉｓｔ）ら、ネイチャー、２９０：３０４−３１０、１９８１年）プロモータといったような非組織特異的プロモータを使用することができる。ウイルス配列についての本発明のＨＢＶ及びＨＣＶｄｓＲＮＡの特異性のため、非組織特異的プロモータによって導かれる非肝臓細胞内のＨＢＶ及び／又はＨＣＶｄｓＲＮＡの発現が非肝臓細胞に対し無害であるはずであることから、非組織特異的プロモータを本発明内で使用することができる。しかしながら、本発明において使用するための好ましいプロモータは、肝細胞特異的プロモータであり、それを使用することによってＲＮＡが主として肝細胞内で発現されることが保証される。好ましい肝細胞特異的プロモータには、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、アルファ−１−抗トリプシン、レチノール結合タンパク質、及びアシアロ糖タンパク受容体プロモータが含まれるがこれらに制限されるわけではない。本発明では、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス（Ｉ型及びＩＩ型）、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ及びＣ型）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ；ファン（Ｆａｎｇ）ら、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）１０：７８１−７８７、１９８９年）由来のものといったようなウイルスプロモータ及びエンハンサを使用することもできる。
【００８４】
ｄｓＲＮＡ発現ベクターは、ＨＣＭＶ、ＳＣＭＶ、ＭＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ２ａ、ＴＫ及びその他のＨＳＶプロモータ例えばＩＣＰ６、ＩＣＰ４及びＩＣＰ０プロモータを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのためのプロモータ、ＨＢＶプレゲノムプロモータ、Ｕ６及びｔＲＮＡプロモータを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）ＲＮＡ ｐｏｌＩＩＩプロモータ、ミトコンドリア軽鎖及び重鎖プロモータを含み得る。望ましくは、ｄｓＲＮＡ発現ベクターは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ、例えばヒトＣＭＶ、前初期プロモータ（ＨＣＭＶ−ＩＥ）又はサルＣＭＶ（ＳＣＭＶ）プロモータ、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ又は少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータを含む。プロモータは同様に、Ｔ７プロモータであり得、この場合、細胞はさらにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む。あるいはまた、プロモータはＳＰ６プロモータであり得、その場合、細胞はさらにＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを含む。プロモータは同様に、１つの収束性Ｔ７プロモータ及び１つの収束性ＳＰ６ＲＮＡプロモータでもあり得る。細胞は、Ｔ７ポリメラーゼ又はＳＰ６ポリメラーゼ発現プラスミドでそれぞれに細胞を形質転換することによってＴ７又はＳＰ６ポリメラーゼを含むようにすることもできる。一部の実施形態では、Ｔ７プロモータ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータは、短かいｄｓＲＮＡ（例えば長さが２００、１５０、１００、７５、５０又は２５塩基対未満であるｄｓＲＮＡ）をコードする核酸に作動可能に連結されている。その他の実施形態では、プロモータは、ベクター内の核酸の細胞質転写を可能にするミトコンドリアプロモータである（例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット及び２００１年１月９日出願のＰＣＴ米国特許第２００２／００５４３号明細書内に記述されているミトコンドリアプロモータを参照のこと）。あるいはまた、プロモータは、ｌａｃ（クロニン（Ｃｒｏｎｉｎ）ら、遺伝子と開発（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）１５：１５０６−１５１７、２００１年）、ａｒａ（クレブニコフ（Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖ）ら、細菌学ジャーナル（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）、２０００年１２月；１８２（２４）：７０２９−３４）、ｅｃｄｙｓｏｎｅ（レオジーン（Ｒｈｅｏｇｅｎｅ）ウェブサイト）、ＲＵ４８（メフェプリストン）（コルチコステロイドアンタゴニスト）（ワン（Ｗａｎｇ）ＸＪ、リーファ（Ｌｉｅｆｅｒ）ＫＭ、ツァイ（Ｔｓａｉ）Ｓ、オマリー（Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ）ＢＷ、ループ（Ｒｏｏｐ）ＤＲ、米国科学アカデミー紀要１９９９年７月２０日；９６（１５）：８４８３−８）、又はｔｅｔプロモータ（レンドル（Ｒｅｎｄａｌ）ら、ヒト遺伝子療法（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）２００２年；１３（２）：３３５−４２及びラルナルチナ（Ｌａｒｎａｒｔｉｎａ）ら、ヒト遺伝子療法２００２年；１３（２）：１９９−２１０）といったプロモータ又は、又は２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット中で開示されたプロモータといったような誘発性プロモータである。同様に本発明の方法及び組成物において有用であるのは、２００３年４月２２日出願の米国特許出願公開第６０／４６４，４３４号明細書内で教示されている構造性及びキメラプロモータである。本発明の方法及び組成物において特に望ましいものとみなされるパチャック（Ｐａｃｈｕｋ）Ｃ．及びサティスチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）Ｃ．、「多区画真核生物発現系（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ｅｕｒｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、２００３年８月２２日出願の米国仮特許出願第６０／４９７，３０４号明細書の中で教示されているプロモータ系も参照のこと。
【００８５】
本発明のｄｓＲＮＡ発現構築物において有用である肝臓特異的プロモータには、アルブミンプロモータ、アルファ−フェトプロテインプロモータ（特に肝癌細胞内の）、アルファ−１−抗トリプシンプロモータ、Ｂ型肝炎プロモータ例えば、コア、ｅ−抗原、ポリメラーゼ及びＸタンパク質を含めた抗原遺伝子のためのプロモータを含めたＢ型肝炎プロモータが含まれる。
【００８６】
Ｔ７プロモータ／Ｔ７ポリメラーゼ発現系 本発明の望ましい方法では、脊椎動物細胞（例えば哺乳動物細胞）内のｄｓＲＮＡ（例えば長又は短ｄｓＲＮＡ分子）の細胞質発現を達成するために、Ｔ７ｄｓＲＮＡ発現系が利用される。Ｔ７発現系は、望ましいｄｓＲＮＡを発現するためＴ７プロモータを利用する。転写は、第２のプラスミド又は同じプラスミド上に提供され得るＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって駆動される。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７Ｐｏｌ）は、その応答性プロモータ配列を特異的に認識し高い転写酵素活性を示すことのできるＴ７遺伝子１の産物である。プロモータ配列を含むバクテリオファージの異なる領域についての詳細な情報を伴うＴ７ゲノムの完全な配列はダン及びスタジア（Ｄｕｎｎ ＆ Ｓｔｕｄｉｅｒ）、１９８３年、分子生物学ジャーナル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１６６（４）、４７７−５３５の中で開示されている（ＮＣＢＩ「ゲノム」データベース、受入れ番号第ＮＣ００１６０４号も同じく参照のこと）。プロモータに対するストリンジェントな特異性を示すバクテリオファージＴ７のポリメラーゼ以外のその他のいかなるＲＮＡポリメラーゼもＴ７プロモータを、利用することはできない（チェンバレン（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ）ら、１９７０、ネイチャー２２８：２２７−２３１）。例えばｄｓＲＮＡを発現するためにＴ７発現系を利用する場合、収束性Ｔ７プロモータの制御下でセンス及びアンチセンス鎖の両方を発現する第１のプラスミド構築物及びＲＳＶプロモータの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する第２のプラスミド構築物を使用することができる。ｄｓＲＮＡ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼは両方共、特に、少なくとも部分的に２本鎖の領域を伴うステムループ又はヘヤピン構造をストランドがとることができるようにする自己相補性の逆方向反復又は領域を伴う単一のＲＮＡ鎖からｄｓＲＮＡが形成されている場合に、単一の２シストロンプラスミド構築物から有利にも発現され得ると思われる。セルフアッセンブリーしてｄｓＲＮＡを形成する個々のセンス及びアンチセンス鎖は、例えば転写されるべき選択された配列の相補鎖の５’及び３’末端にそれぞれに配置されたバクテリオファージＴ７プロモータといったような収束性プロモータを用いて、単一プラスミド構築物により合成され得る。例えば、Ｔ７ｄｓＲＮＡ発現系に関する国際公開第００６３３６４号パンフレットならびに２００２年７月３１日出願米国特許出願公開第６０／３９９，９９８Ｐ号明細書及び２００２年１０月１８日出願米国特許出願公開第６０／４１９，５３２号明細書の教示も参照のこと。
【００８７】
本発明の治療用組成物 本発明のｄｓＲＮＡ及びそれらをコードする核酸配列を含む組換え型ベクター、ＨＣＶ及び／又はＨＢＶ感染を予防又は治療するための治療用組成物中で使用することができる。本発明の治療用組成物は、単独で又はその他の抗ウイルス剤を含めた１つ以上の材料との混和物の形で又は化学的組合せの形で使用することができる。現在、ラミブジン、アデフォビル・ジピヴィキシル及びインターフェロンアルファは、ＨＢＶの治療用として承認されており、本発明の組成物をこれらの薬物及びエムトリシタビン（ＦＴＣ）及びエンテカビルを含めたＨＢＶに対して活性であるその他の薬物と組合わせて使用することが可能であると見込まれている。ＨＢＶ及び／又はＨＣＶに対するｄｓＲＮＡは新規の機序（ｄｓＲＮＡ媒介型遺伝子サイレンシング／ＲＮＡｉ）を通して作用することから、本発明の作用物質とその他の抗ウイルス薬の組合せ療法は、例えば長期のラミブジン療法に伴う重要な問題であるラミブジン耐性の発生といった薬物耐性の発生を実質的に低減させながら、療法の効能を著しく増大させるものと予想されている。現在、インターフェロン及びリバビリンは、ＨＣＶ治療用として免許を受けており、ＨＢＶに関しては、本発明の組成物をこれらの薬物及びＨＣＶに対し活性であるその他の薬物と組合わせて使用できると見込まれている。かかる多数の作用物質を用いた療法が関与する特定の投薬計画は、臨床医学の当業者による日常的な実験を通して決定することができる。
【００８８】
処方には望ましくは、オリゴヌクレオチド又は組換え型ベクターの生物学的安定性を増大する材料又は肝細胞内に選択的に浸透する治療的組成物の能力を増大させる材料が含まれる。本発明の治療的組成物は、投与様式及び経路ならびに標準的な薬学的実践方法に基づいて選択される薬学的に受容可能な担体（例えば生理食塩水）中で投与され得る。当業者であれば、オリゴヌクレオチド又は遺伝子構築物を含む薬学組成物を容易に処方することができる。一部のケースでは、等張処方が使用される。一般的には、等張性のための添加物には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが含まれる可能性がある。一部のケースでは、リン酸緩衝生理食塩水といったような等張溶液が好ましい。安定化剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。一部の実施形態においては、処方に対して血管収縮剤が加えられる。本発明に従った薬学調製物は、無菌で発熱物質を含まない状態で提供される。薬学的処方内で使用するための適切な薬学的担体ならびに薬学的必需品については、この分野での標準的参考文献であるレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：調剤の科学と実践（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）（旧レミントンの調剤学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））、マーク出版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）株式会社及びＵＳＰ／ＮＦ中で記述されている。
【００８９】
投与経路としては、筋内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内及び経口ならびに経皮又は吸入又は座薬が含まれるがこれらに制限されるわけではない。好ましい投与経路としては、静脈内、筋内、経口、腹腔内、皮内、動脈内及び皮下注射が含まれる。ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ発現構築物は、従来の注射器、無針注射装置又は「マイクロプロジェクタイルボンバード遺伝子銃」を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）手段によって投与することができる。あるいはまた、個体から取り出される細胞内にさまざまな手段によってｄｓＲＮＡ及び／又はｄｓＲＮＡ発現構築物を導入することができる。かかる手段としては、例えば、エクスビボトランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション及びマイクロプロジェクタイルボンバードが含まれる。遺伝子構築物が細胞によって取り上げられた後、これらの細胞は個体に再移植される。中に遺伝子構築物を取込んでいるそうでなければ免疫原性でない細胞を、宿主細胞がもともと他の個体から取られたものである場合でさえ、その個体内に移植することが可能である。
【００９０】
ＨＢＶ感染個体内では、本発明のｄｓＲＮＡ組成物がウイルスに対する免疫性をブーストするように設計された治療用ワクチン接種プロトコルと併用した予備治療として有用であり得ると見込まれている。本発明のｄｓＲＮＡ組成物が、例えば消防士、救急隊員及び医療従事者などの職業上の又はその他の曝露可能性のためにＨＢＶ及び／又はＨＣＶに対する曝露リスクの高い個体に対する定期的投与計画の中で予防のために有用でありうるということも見込まれている。かかる有効な予防的投与計画としては、臨床医学の当業者により日常的実験を通して判定され得る通り、例えば１週間、２週間、１ヶ月、２ヵ月に１回、３ヶ月毎、４ヶ月毎、半年毎又は一年に１回の割合での本発明のＨＢＶ及び／又はＨＣＶｄｓＲＮＡを提供する組成物の投与が含まれる可能性がある。数週から数カ月の範囲内にあると予想される比較的長い時間全体にわたり本発明のｄｓＲＮＡを発現する、プラスミド又はウイルスベクターといったようなｄｓＲＮＡ発現ベクターの能力は、この利用分野及びその他の利用分野にとって有利なものであるとみなされている。
【００９１】
ｄｓＲＮＡの投薬量 １つの動物に対するｄｓＲＮＡ（例えば毒性を阻害するための短かいｄｓＲＮＡ又は１つの遺伝子をサイレンシングするための短かい又は長いｄｓＲＮＡ）の投与のためには、（好適度の増加順で）９０〜１５０ポンドの人又は動物に対して標準的に１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、５００μｇ〜１ｍｇ、又は５μｇ〜５００μｇのｄｓＲＮＡが投与される。１つの動物に対するｄｓＲＮＡ（例えば毒性を阻害するための短かいｄｓＲＮＡ又は１つの遺伝子をサイレンシングするための短かい又は長いｄｓＲＮＡ）をコードするベクターの投与のためには、（好適度の増加順で）９０〜１５０ポンドの人／動物に対して、標準的に１００ｍｇ〜３００ｍｇ、１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、５００μｇ〜１ｍｇ又５０μｇ〜５００μｇのｄｓＲＮＡ発現ベクター又は構築物が投与される。該用量は、動物の体重に基づいて調整され得る。一部の実施形態では、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は約２〜２．５ｍｇ／ｋｇが投与される。臨床医療の当業者による日常的実験を通して判定される通り、その他の用量を使用することもできる。
【００９２】
無傷の動物における投与のためには、１０ｎｇ〜５０μｇ、５０ｎｇ〜１００ｎｇ又は１００ｎｇ〜５μｇのｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが使用される。望ましい実施形態においては、動物に対し約１０μｇのＤＮＡ又は５μｇのｄｓＲＮＡが投与される。本発明の方法に関しては、細胞又は動物に対するｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの投与を特定の投与様式、投薬量又は投薬頻度に制限するようには意図されていない。本発明は、遺伝子発現を阻害し、疾病を予防するか又は疾病を治療するのに適した用量を提供するのに充分な全ての投与様式を考慮するものである。
【００９３】
望ましい場合には、そうでなければ細胞毒性を誘発するものと予想され得るｄｓＲＮＡ（例えば長い方のｄｓＲＮＡ）の外因的送達の前、間又は後に、短かいｄｓＲＮＡが送達される。２００３年４月２８日出願米国特許出願公開第１０／４２５，００６号明細書「毒性の誘発の無い遺伝子サイレンシング方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ）」の教示を参照のこと。
【００９４】
出願人らは、本開示内に引用された全ての参考文献の全内容を特定的に包含させている。さらに、量、濃度又はその他の値又はパラメータが１つの範囲、好ましい範囲又は上部好適値と下部好適値のリストとして示されている場合には、これは、範囲が別に開示されているか否かとは無関係に、任意の上部範囲限界値又は好適値及び任意の下部範囲限界値又は好適値の任意の対から成る全ての範囲を特定的に開示するものとして理解されるべきである。数値範囲が本書で列挙されている場合、相反する記述のないかぎり、該範囲はその終点及びその範囲内の全ての整数及び分数を包含するものとして意図される。１つの値範囲が定義されている場合であっても、本発明の範囲を列挙された特定の値に制限することは意図されていない。
【００９５】
以下の実施例は、単に例示として示されるものである。本開示内に言及されている全ての参考文献は、その全体が特定的に本明細書に参照により援用されている。
【００９６】
実施例１
複製応答能ある細胞培養モデルにおけるＨＢＶ複製及び発現のサイレンシング
細胞培養モデルの簡単な説明：Ｈｕｈ７細胞系列といったようなヒト肝臓由来の細胞系列を、ウイルスＲＮＡの全てを転写し感染ウイルスを産生する能力をもつ末端冗長性ウイルスゲノムから成るＨＢＶの感染性分子クローンでトランスフェクトする［１−３］。これらの研究中で用いられるレプリコンは、ジェンバンク受入れ番号Ｖ０１４６０の中に見られるウイルス配列から誘導される。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからの感染性のＨＢＶプラスミドの転写が、ＨＢＶ複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた。これらの事象には、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写されたプレゲノムＲＮＡのコア粒子内へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写及び、ビリオン及びＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）粒子の組立て及びトランスフェクションを受けた細胞の培地内への分泌が含まれる。このトランスフェクションモデルは、感染を受けた肝細胞内部のＨＢＶ複製の大部分の局面を再現し、従って、ＨＢＶ発現及び複製のサイレンシングを調べるのに用いる優れた細胞培養モデルである。
【００９７】
このモデルを用いて、ＨＢＶの感染性分子クローン及びさまざまなｅｉＲＮＡ構築物と細胞を同時トランスフェクトした。その後、以下で記述する通りにＨＢＶ発現及び複製の損失について、細胞を監視した。この実験において使用したコード済みＲＮＡ及びベクターについての詳細は、この実施例の最後に提供されている。
【００９８】
実験１：
以下に記すのは、ジェンバンク受入れ番号Ｖ０１４６０から誘導された配列をコードするｅｉＲＮＡベクターを用いて実施された実験の一実施例である。これらの記述されているｅｉＲＮＡベクター内のＨＢＶ配列は、同様にｓｉＲＮＡとしての活性も示す、本書の他の箇所で記述された通りに同定されたきわめて保存度の高い配列であった（パシャクＣ．、「ＲＮＡｉ標的及びエフェクタ分子の評価のための方法及び構築物（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡｉ ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、２００４年２月２５日出願ＰＣＴ米国特許第２００４／００５０６５号明細書を参照のこと）。この実験のために使用される特定のｅｉＲＮＡ主鎖ベクターは、コードされたＲＮＡの発現を駆動するべくＵ６プロモータを含む独自に開発したベクターであった。各ベクターは、１つの短かいヘヤピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のみをコードした。ｓｈＲＮＡコーディング配列の後には、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ終端配列が続いていた。Ｕ６プロモータ、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ終端シグナル及びコードされたｓｈＲＮＡの配列は全て、該実施例の終りに示されている。Ｕ６プロモータ及びＲＮＡｐｏｌＩＩＩ終端シグナルを含む類のベクターは、プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）製の「ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ＋２クローニング系」ベクターなどのように商業的に入手可能である。当業者であれば、本書で示されている情報に従ってこれらを作り上げることもできる。その他の発現及びプロモータ系特にＵ６でないＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモータ例えばＨ１プロモータ又は７ＳＫプロモータを伴うベクターを用いて類似の結果を得ることもできるであろうと予想されている。
【００９９】
実験手順：トランスフェクション
ＲＰＭＩ−１６４０培地の中で培養されたＨｕｈ７細胞を３×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェル平板内に播種した。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従ってリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）（インビトロェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌ））を用いた細胞播種の翌日に行なった。この実験においては、細胞を５００ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミドａｙｗ亜型（「ｐＨＢＶ２」）（ジェンバンク受入れ番号Ｖ０１４６０）及び５００ｎｇ、３００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ又は１０ｎｇのｅｉＲＮＡ構築物でのトランスフェクションに付した。トランスフェクション中の合計ＤＮＡを２．５μｇにした量で不活性プラスミドＤＮＡ、ｐＧＬ３−ベーシック（Ｂａｓｉｃ）（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を含み入れることにより、ＤＮＡを１日のトランスフェクションにつき２．５μｇで一定に保持した。例えば、５００ｎｇのＨＢＶＤＮＡ及び５００ｎｇのｅｉＲＮＡ構築物を受容するトランスフェクションにおいては、トランスフェクションに対し１．５μｇのｐＧＬ３を添加した。トランスフェクションに先立って、培地を細胞から除去し、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標）（インビトロジェンライフテクノロジー（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド）で洗浄した。次に、各々の細胞ウェルに８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標）を添加しその後トランスフェクション混合物を添加した。トランスフェクションから１７〜１９時間後に、トランスフェクション混合物及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標）を細胞から除去し、１ウェルあたり２ｍＬの培地と交換した。トランスフェクションから３、６及び１０日後に、細胞から培地を除去し−７０℃で保管した。３日目及び６日目に２ｍＬの新鮮な培地で培地を交換した。全てのトランスフェクションはデュプリケートで実施した。２セットの対照トランスフェクションすなわち、ＨＢＶＤＮＡ単独（５００ｎｇのＨＢＶＤＮＡプラス２μｇのｐＧＬ３）及び対照ｅｉＲＮＡ構築物を伴うＨＢＶＤＮＡ（５００ｎｇのＨＢＶＤＮＡ、１μｇの対照ｅｉＲＮＡ構築物及び１．０μｇのｐＧＬ３ＤＮＡ）、も同様に実施した。
【０１００】
ＨＢＶ発現の喪失について細胞を監視
トランスフェクションに続いてＨＢｓＡｇ分泌を測定することによりＨＢＶ発現及び複製の喪失又は減少について細胞を監視した。トランスフェクションから３日、６日及び１０日後に、トランスフェクションを受けた細胞の培地（及び培地対照）を検定することにより、細胞を監視した。アボット研究所（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（イリノイ州アボットパーク（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＩＩ））から商業的に入手可能であるアラスザイム（Ａｕｓｚｙｍｅ）(登録商標）ＥＬＩＳＡを用いて、メーカーの指示事項に従って表面Ａｇ（ｓＡｇ）を検出した。表面Ａｇがウイルス複製によってのみならず、インビボでの感染中に産生されたＨＢＶｃｃｃＤＮＡから及びトランスフェクションを受けた感染性ＨＢＶクローン内での表面ＡｇシストロンのＲＮＡポリメラーゼＩＩで開始された転写を用いても会合させられることから、ｓＡｇを測定した。表面Ａｇ合成は、ＨＢＶ複製の不在下での有害な効果を伴って続行し得ることから、ウイルス複製のみならずｓＡｇの複製非依存性合成をもダウンレギュレートすることが重要である。
【０１０１】
結果：
この実施例の終りで記述されているＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡ構築物でのトランスフェクションを受けた細胞は、全て、対照に比べｓＡｇレベルの減少を誘発した。表２−８にみられるデータに対応する添付図２−８にレベル阻害が示されている。７８８〜８０８及び８０７〜８２７として同定された配列が、５００ｎｇの用量でそれぞれ３０％及び５０％だけ表面Ａｇレベルを低下させたにすぎないという点に留意されたい。これらは、ｓＡｇｍＲＮＡをターゲティングしない２つだけのｅｉＲＮＡである；代りにこれらは３．１ＫｂのＨＢＶｍＲＮＡをターゲティングし、従ってｓＡｇレベルを間接的に減少させる。これらその他のＨＢＶ ＲＮＡがターゲティングされた場合に観察された３０％〜５０％のｓＡｇ減少は、これらのｅｉＲＮＡ構築物に効能があることを強く示すものとみなされる。
【０１０２】
この実験において使用されるＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡ
ｅｉＲＮＡベクターは、表１で列挙されているＨＢＶ配列をコードする。ジェンバンク受入れ番号Ｖ０１４６０について配列がそれらの地図座標と共に示されている。表の最も右側には、これらの配列が内部でマッピングする配列番号がある。コードされたＲＮＡの配列は５’ＧＧＴＣＧＡＣ（それ自体は重要でないものの使用された特定のベクターのポリリンカー配列から誘導されている配列）とそれに続く第１のセンス又はアンチセンスＨＢＶ配列とそれに続くループ配列（表１中下線あり）とそれに続く、第１のＨＢＶ配列に対する相補配列である第２のＨＢＶ配列である。ループ構造が固定された配列又は長さである必要はなく、我々は複数のループ配列を使用し、ｅｉＲＮＡ構築物の機能にはいかなる有意な影響もなかったという点に留意されたい。第２のＨＢＶ配列には、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩのための終結シグナルとして機能する例えば１、２、３又はそれ以上のＴといった一連のＴ残基が後続している。
【表１】

【０１０３】

転写されたＲＮＡ構造のダイヤグラムは、図９に示されている。
【０１０４】
配列番号１３は、Ｕ６プロモータのヌクレオチド配列である。ＲＮＡｐｏｌＩＩＩターミネータのヌクレオチド配列：５’−ＴＴＴＴＴ−３’。
【０１０５】
表とグラフ
以上で記述され、表２−８中のデータに対応する図２−８の中でプロットされているとおりに、ＨＢｓＡｇを測定した。ｅｉＲＮＡ構築物の量は、ｅｉＲＮＡ構築物の名前のカッコ内に示され、μｇ単位の量である。例えば２７９１（０．５）は、トランスフェクションにおいて、０．５μｇ又は５００ｎｇのｅｉＲＮＡ構築物２７９１−２８１１（表１参照）が使用されたことを意味している。対照に比べた阻害パーセントも同様に下表に示されており、これは、１０日目の測定に特定的なものである。１２９９が５００ｎｇで評価されたこの実施例中の４番目のデータセットが、１０日目で評価が実施されなかったために３日目及び６日目という２つの時点のみを有することに留意されたい。この実験についての阻害パーセントは、６日目のデータについて示された。データは、ｓＡｇを測定するのに使用されたアウスザイムＥＬＩＳＡ検定キットのメーカーが記述した通りに収集した粗ＯＤデータとして示されている。示されていないのは２７９１−２８１１についての５０ｎｇデータ及び１９０７−１９２７についての１０ｎｇデータである。これらの用量は各々、対照に比べて約５０％だけＨＢｓＡｇ発現を阻害した。
【表２】


【表３】


【表４】


【表５】


【表６】


【表７】


【表８】

【０１０６】

実験２：
背景：２つのｅｉＲＮＡ構築物を付加した相加効果を評価するために同じ細胞培養モデルを使用した。この実験においては、２７９１−２８１１及び２９１９−２９３９を評価した。これらを１０ｎｇ及び２５ｎｇという２つの用量で別々に、そして１０ｎｇ（５ｎｇの２７９１−２８１１プラス５ｎｇの２９１９−２９３９）及び２５ｎｇ（１２．５ｎｇの２７９１−２８１１プラス１２．５ｎｇの２９１９−２９３９）で組合わせた形で評価した。例えば、２５ｎｇの２７９１−２８１１で見られた阻害の半分プラス２５ｎｇの２９１９−２９３９で見られた阻害の半分が２５ｎｇの組合せ用量で見られた阻害にほぼ等しい場合、相加効果が観察される。このことは、２５ｎｇ用量での単一のｅｉＲＮＡ構築物の使用に比べて阻害を増してはいないかもしれないが、２つ以上のｅｉＲＮＡ配列の使用は、ウイルスエスケープ突然変異の生成を防止する上できわめて重要であることから、重要である。
【０１０７】
実験手順：トランスフェクション
Ｈｕｈ７細胞を３×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェル平板内に播種した。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従ってリポフェクタミン（商標）（インビトロェン））を用いた細胞播種の翌日に行なった。この実験においては、細胞を５００ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミドａｙｗ亜型（ジェンバンク受入れ番号Ｖ０１４６０）及び２５ｎｇ又は１０ｎｇの２つの別々のｅｉＲＮＡ構築物又は合計２５ｎｇ又は１０ｎｇでのこれらの２つのｅｉＲＮＡ構築物の組合せでのトランスフェクションに付した。トランスフェクション中の合計ＤＮＡを２．５μｇにした量で不活性プラスミドＤＮＡ、ｐＧＬ３を含み入れることにより、ＤＮＡを１日のトランスフェクションにつき２．５μｇで一定に保持した。例えば、５００ｎｇのＨＢＶＤＮＡ及び１０ｎｇのｅｉＲＮＡ構築物を受けるトランスフェクションにおいては、次にトランスフェクションに対し１．９９μｇのｐＬＵＣを添加した。トランスフェクションに先立って、培地を細胞から除去し、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標）（インビトロジェンライフテクノロジー）で洗浄した。次に、各々の細胞ウェルに８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標）を添加しその後トランスフェクション混合物を添加した。トランスフェクションから１７〜１９時間後に、トランスフェクション混合物及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標）を細胞から除去し、１ウェルあたり２ｍＬの培地と交換した。トランスフェクションから４、８及び１１日後に、細胞から培地を除去し−７０℃で保管した。４日目及び８日目に２ｍＬの新鮮な培地で培地を交換した。全てのトランスフェクションはデュプリケートで実施した。２セットの対照トランスフェクションすなわち、ＨＢＶＤＮＡ単独（５００ｎｇのＨＢＶＤＮＡプラス２μｇのｐＧＬ３）及び対照ｅｉＲＮＡ構築物を伴うＨＢＶＤＮＡ（５００ｎｇのＨＢＶＤＮＡ、５００ｎｇの対照ｅｉＲＮＡ構築物及び１．５μｇのｐＧＬ３ＤＮＡ）、も同様に実施した。
【０１０８】
結果：
結果は、表９及び図１０に見られる対応するグラフに示されている。２７９１−２８１１及び２９１９−２９３９を組合わせることで、２７９１−２８１１又は２９１９−２９３９単独の投与に少なくとも等しい効果が示された。同じ及び／又は異なるＨＢＶ遺伝子からの異なるＨＢＶ配列に導かれた２つ以上のｄｓＲＮＡを組合わせることによって、類似の利点が見られることになると予想されている。
【表９】

【０１０９】

実験３及び４
マウスモデルにおけるＨＢＶのサイレンシング
要約：確認実験１の中で記述されているｅｉＲＮＡベクターのうちの２つを、マウスモデル内でＨＢＶレプリコンをサイレンシングするそれらの能力について査定した。これらのベクターは、２７９１−２８１１及び１９０７−１９２７ベクターであった。両方のベクター共、マウスモデル内で、それらが細胞培養モデル内でサイレンシングしたのと同じ程度でＨＢＶをサイレンシングすることがわかった。その他の療法によりマウス体内でこのＨＢＶレプリコンをサイレンシングする能力は、ヒトでの効能の予測判断材料であることが実証されてきた［４］。
【０１１０】
動物モデル背景：
チンパンジーは、ヒトＨＢＶ感染力を研究すべき唯一の動物モデルである。しかしながらＨＢＶ発現及び複製が発生するマウスモデルも利用可能である。このモデルは、ウイルス複製に対してのみならず抗原のＲＴ非依存性発現に対してもターゲティングされた抗−ＨＢＶ治療剤の評価にとって価値のないものであった。このモデルでは、複製応答能あるＨＢＶはエピソームＨＢＶＤＮＡから過渡的に発現されている。このモデルは、流体力学的送達によりマウスの肝臓内に複製応答能あるＨＢＶＤＮＡを導入することによって作り出される［１］。
【０１１１】
以下の実験の目的は、細胞培養とマウスモデルの間にＨＢＶ配列に関連する効率の差が存在すると予想されなかった場合でも、マウスモデル内での効能について実験１で評価されたＨＢＶ特異的配列をコードするベクターのうちの２つをテストすることにあった。この実験では、エフェクタＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡ発現ベクターとともに複製応答能あるＨＢＶａｙｗプラスミド（実施例１、確認実験１）を同時送達するための１つの方法として流体力学的送達が利用された。流体力学的送達は、それが肝臓に対する核酸の効率の良い送達を結果としてもたらすため、これらの第１の研究にとって理想的である［５］。
【０１１２】
実験
流体力学的送達研究：実験３
全ての動物に７．５μｇの感染性ＨＢＶａｙｗプラスミド（確認実施例１に記述）を流体力学的に注入した。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからのＨＢＶａｙｗの転写が、ＨＢＶ複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた［１］。これらの事象には、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、コア粒子内への転写されたプレゲノムＲＮＡのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、及びビリオン及びＨＢｓＡｇ粒子の組立て及び注射された動物の血清内への分泌が含まれる。実験動物には、１０μｇの２７９１−２８１１を同時注射した。対照動物の第２グループには１０μｇの無関係のｅｉＲＮＡ構築物を注射した。同様に、全ての動物に２．５μｇのＧＦＰレポータプラスミドを同時注射した（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌ））。注射を受けたマウスの肝臓中のＧＦＰｍＲＮＡの発現は、マウスモデルのトランスフェクション効率に対抗して結果を正規化するための対照として役立った。動物に注射した全ＤＮＡ量は、不活性フィラーＤＮＡであるｐＧＬ３（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を含み入れることによってつねに２０μｇに保った。全てのＤＮＡは、ヤング（Ｙａｎｇ）ら［１］の中で記述された方法に従って処方し注射した。１グループあたりの動物数は５匹であった。動物１匹あたりの注射されたＤＮＡ及びその量は、表１０に示されている。
【表１０】

【０１１３】

分析の時点は、流体力学的送達の後のマウス体内のＨＢＶａｙｗプラスミド複製の動物を詳述するチサリ（Ｃｈｉｓａｒｉ）博士の研究所が公開している結果に基づいて選択した［１］。注射後１、２、３及び４日目にＨＢｓＡｇの存在について血清を検定した。ＨＢＶ複製の細胞培養モデルについて記述された通りに、検定を実施した。肝臓試料内のＨＢＶＲＮＡの存在を、チサリ博士の研究所で開発され［１］従来の技術を用いて内因性ＧＡＰＤＨＲＮＡレベル及びＧＦＰｍＲＮＡレベルに正規化された手順を用いる注射後２日目のノーザンブロット分析又は標準的技術を用いるｓＡｇコーディング配列を含有するＨＢＶＲＮＡについての定量的ＲＴ−ＰＣＲ検定により確認した。ＲＴ−ＰＣＲはノーザンブロット分析よりもさらに定量的であり、ノーザンブロット分析よりも広い動的ウインドウを有している。
【０１１４】
ノーザンブロット分析によるＨＢＶ ＲＮＡ及びＨＢｓＡｇの両方のダウンレギュレーションは、２７９１−２８１１の注射を受けたマウスにおいて見られた。図１１参照。同じく図示されていないが、定量的ＲＴ−ＰＣＲは、対照マウスの肝臓内の８６７のＨＢＶ ＲＮＡ分子の存在及び２７９１−２８１１で処理されたマウスにおける５７のＨＢＶ ＲＮＡ分子の存在つまり１５倍のダウンレギュレーションを実証した。
【表１１】


【表１２】

【０１１５】

流体力学的送達研究：実験４
この実験は、２つのｅｉＲＮＡ構築物つまり２７９１−２８１１及び１９０７−１９２７が評価されたという点を除いて、実施例１の実験３と同様であった。この実験では、本書ですでに記述された検定を用いて１日目及び４日目にＨＢｓＡｇを測定した。
【表１３】

【０１１６】

実施例２
ＲＮＡｉの治療的開発のためのＣ型肝炎配列
実験１
簡単な導入：
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非Ａ非Ｂ型輸血関連肝炎の主たる原因であり、世界中で２億人を超える肝炎症例を数えている。ＨＣＶゲノムは高度の配列可変性を有する。５０を超える亜型を含む６つの主要な遺伝子型が存在し、擬種に代表される著しい異種性が患者間で見い出されている。組換え型ポリメラーゼ又は細胞ベースのサブゲノムレプリコン系を用いることによって、ＨＣＶ複製を理解する上で大幅な進歩が見られた。レプリコン細胞系を用いることにより、ＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡは、ＨＣＶタンパク質発現及びＲＮＡ複製を抑圧できることが実証されてきた。５’ＮＴＲ及び構造的及び非構造的の両方の遺伝子の配列がうまくターゲティングされてきた。３’ＮＴＲ配列は、その非常に高度に保存された性質のため、ｓｉＲＮＡをベースとする療法のためのきわめて魅力ある標的となっている。しかしながら、３’ＮＴＲを使用することの実現可能性を調べるために、いかなる研究もなされていない。ここでは、サブゲノムレプリコン系内でＨＣＶタンパク質での発現を阻害できる複数のｓｉＲＮＡの設計及び試験について報告する。外因的に合成されたＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡをＨＣＶレプリコン細胞系列内に以下で記述される通りにトランスフェクトした。
【０１１７】
細胞培養と培地
ヘパトーマＨｕｈ７細胞内のＨＣＶレプリコンを、１０％のウシ胎児血清（インビトロジェン）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％の非必須アミノ酸及び０．５ｍｇ／ｍＬのジェネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）を含有するダルベッコ修正イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）（インビトロジェン）内で培養した。細胞を、分裂に先立ち７５％の集密度まで成長させた。
【０１１８】
ウェスタンブロット分析：
レプリコン細胞由来の合計細胞溶解物を１×ＬＤＳ緩衝液（インビトロジェン）中でレプリコン細胞から収集した。１０％のトリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン）上で電気泳動の前にベータ−メルカプトエタノールの存在下で５分間９０℃で溶解物を加熱した。タンパク質をＰＶＤＦ（インビトロジェン）膜に移した。トランスファの後、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を含有するＰＢＳで１回膜を洗浄し、５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ内で１時間遮断した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでの洗浄後、膜を室温で１時間、１：１５００の希釈度で一次α−ＮＳ５Ａ抗体（チェン・リウ（Ｃｈｅｎ Ｌｉｕ）博士より寄贈）と共にインキュベートした。１：５０００で希釈したＨＲＰ抱合α−マウスＩｇＧ二次抗体（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でのインキュベーションに先立ち、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中でブロットを洗浄した。二次抗体インキュベーションの後、ブロットを再度洗浄し、メーカーのプロトコルに従ってＥＣＬ（アマーシャム）で処理した。
【０１１９】
ノーザンブロット：
Ｒｎｅａｓｙ(登録商標）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて、全細胞ＲＮＡを抽出した。グオ（Ｇｕｏ）ら、のプロトコルに従ってノーザンブロット分析を行なった。簡単に言うと、５μｇの全ＲＮＡを、２．２Ｍのホルムアルデヒドを含有する１．０％のアガロースゲルを通して電気泳動させ、ナイロン膜に移し、ＵＶ架橋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によって固定化した。５８℃で１６時間、５０％の脱イオンホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５０ｍＭのクエン酸ナトリウム）、デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）の溶液、０．０２Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．２％のドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）、１００μｇのせん断変性サケ精子ＤＮＡ／ｍｌ及び１００μｇの酵母ＲＮＡ／ｍｌを含有する溶液中のα−［^３２Ｐ］ＣＴＰ−標識されたネオマイシンＲＮＡを用いて、ハイブリダイゼーションを実施した。室温で３０分間２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で一度そして６８℃で３０分間０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２度、膜を洗浄した。膜をＸ線フィルムに暴露した。
【０１２０】
レプリコン細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクション：
レプリコン細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションのためには、ユーザーマニュアルに従って、リポフェクタミン(登録商標）２０００試薬（インビトロジェン）を使用した。簡単に言うと、０．５ｍＬのＤＭＥＭ中の２×１０^４個の細胞を、トランスフェクションの前日に２４ウェル平板内に播種した。指示された量のｓｉＲＮＡを５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で希釈し、希釈したリポフェクタミン(登録商標）２０００試薬（５０μＬのオプチメム（Ｏｐｔｉｍｅｍ）中１μＬ）と混合した。混合物を室温で２０分間インキュベートしてから、細胞単層上に適用した。トランスフェクションの４８〜７２時間後に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１００μＬのＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解させた。
【表１４】

【０１２１】

サイレンサーｓｉＲＮＡ構築キット、カタログ番号１６２０（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）Ｉｎｃ、テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．））を用いて、３’ＵＴＲをターゲティングする表１４で同定されたＨＣＶ配列；ＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡ＃１２（正の対照）；同定されたＨＣＶコアｓｉＲＮＡ（正の対照）；及び同定されたラミンｓｉＲＮＡ（負の対照）を含むいくつかのｓｉＲＮＡを合成した。ＩＤＴ（アイオワ州コーラルビル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ））によりＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１２２】
対照ｓｉＲＮＡ：
１． ＨＣＶコア（正の対照）：配列番号４５
２． ＨＣＶＮＳ５Ｂをターゲティングする表１４に示された＃１２、同様に正の対照
３． ラミン配列（負の対照）：配列番号４６。
【０１２３】
対照として次の３つのｓｉＲＮＡを使用した。負の対照として、細胞遺伝子ラミン（Ｌａｍｉｎ）をターゲティングするｓｉＲＮＡ；正の対照として、ＨＣＶコア配列をターゲティングするｓｉＲＮＡ；正の対照としてＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡ。各ｓｉＲＮＡの２つの濃度（９及び２０ピコモル）を使用し、結果を、無ｓｉＲＮＡのトランスフェクションと比較した。
【０１２４】
従って、図１３のウェスタンブロットは、０、９及び２０ピコモルの同定されたｓｉＲＮＡを表わしている。ｓｉＲＮＡ＃２２、３２、４２、６２及び７２は、ＨＣＶＮＳ５Ａタンパク質発現を抑制する上で著しく活性であった。推定上、コアについての正の対照ｓｉＲＮＡで以前に得られた結果に基づいて、ＨＣＶＲＮＡレベルも減少させられる。いくつかのｓｉＲＮＡはテストされた濃度で最小の効果を有しており、より高い濃度で評価すべきである。これには＃１２（ＮＳ５Ｂをターゲティングする）、＃１０２、＃５２及び＃８２が含まれている。
【０１２５】
実験２
トランスフェクションのために下表１５に記されている配列（及びその相補配列）を含むｓｉＲＮＡＲ１−Ｒ８が使用されたという点を除いて、ＲＮＡｉの治療的開発のためのＣ型肝炎−配列の実験１で記述された通りに、実験２を実施した。ここで実施されたウェスタンブロット検定は実施例２、実験１に記述されている通りであった。正の対照として使用された対照ＨＣＶコアｓｉＲＮＡは、前出のＨＣＶ実験１内で記述されたｓｉＲＮＡである。全てのｓｉＲＮＡは、０、３、９ピコモルのレベルでトランスフェクションを受けた対照「コア」ｓｉＲＮＡを除き、濃度０、９及び２０ピコモルの濃度でトランスフェクションを受けた。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８は全て、図１４のウェスタンブロット内で見られたように、ＨＣＶの有意な阻害を示した。
【表１５】

【０１２６】

評価された全てのｓｉＲＮＡは、ＨＣＶゲノムの３’ＵＴＲに対しマッピングし、ＨＣＶ遺伝子型及び擬種の間で保存される。配列番号２７は、時として「Ｘ」領域と呼ばれるＨＣＶ３’ＵＴＲのこの１０１ｎｔ配列を表わす。
【０１２７】
実施例３
複製応答能ある細胞培養モデルにおけるＨＢＶの複製及び発現のサイレンシング
細胞培養モデルの簡単な説明
Ｈｕｈ７細胞系列といったようなヒト肝臓由来の細胞系列を、ウイルスＲＮＡの全てを転写し感染ウイルスを産生する能力をもつ末端冗長性ウイルスゲノムから成るＨＢＶの感染性分子クローンでトランスフェクトする［１−３］。これらの研究中で用いられるレプリコンは、ジェンバンク受入れ番号Ｖ０１４６０及びＪ０２２０３の中に見られるウイルス配列から誘導される。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからの感染性のＨＢＶプラスミドの転写が、ＨＢＶ複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた。これらの事象には、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写されたプレゲノムＲＮＡのコア粒子内へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写及び、ビリオン及びＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）粒子の組立て及びトランスフェクションを受けた細胞の培地内への分泌が含まれる。このトランスフェクションモデルは、感染を受けた肝細胞内部のＨＢＶ複製の大部分の局面を再現し、従って、ＨＢＶ発現及び複製のサイレンシングを調べるのに用いる優れた細胞培養モデルである。
【０１２８】
このモデルにおいて、ＨＢＶの感染性分子クローン及び評価すべき個々のエフェクタＲＮＡ構築物と細胞を同時トランスフェクトする。その後、以下で記述する通りにＨＢＶ発現及び複製の損失について、細胞を監視する。
【０１２９】
以下に記すのは、配列番号１及び配列番号５から誘導された配列をコードするｅｉＲＮＡベクターを用いた実験の一例である。この実験のための特定のｅｉＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼベースのものであり（Ｔ７ｄｓＲＮＡ発現系に関する国際公開第００６３３６４号パンフレットならびに２００２年７月３１日出願の米国特許出願公開第６０／３９９，９９８Ｐ号明細書及び２００２年１０月１８日出願の米国特許出願公開第６０／４１９，５３２号明細書の教示を参照のこと）、ヘヤピンＲＮＡ構造（特に望ましいのは、例えば２００２年７月３１日出願の米国特許出願公開第６０／３９９，９９８Ｐ号明細書及び２００３年７月３１日出願のＰＣＴ米国特許第２００３／０２４０２８号明細書中で教示されている通りのｄｓＲＮＡヘヤピンを形成するためＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより拡張される能力をもつ部分的ヘヤピンである「強制」ヘヤピン構築物、ならびにミス対合した領域を伴うヘヤピンである「乳房様」構造化ヘヤピン（例えばマルチヘヤピン長ｄｓＲＮＡベクター及びマルチ短ヘヤピン構造）及び２００２年１０月１８日出願の米国特許出願公開第６０／４１９，５３２号明細書及び２００３年１０月２０日出願のＰＣＴ米国特許第２００３／０３３４６６号明細書中で教示されているマルチエピトープ構築物である）をコードする。例えば前述のとおりのその他の発現及びプロモータ系及び／又は代替的ｄｓＲＮＡ構造（すなわち２重鎖）をコードするベクターを用いても類似の結果が得られることになると予想される。
【０１３０】
実験手順：トランスフェクション
トランスフェクションの時点で８０〜９０％の集密度となるように６ウェル平板内にＨｕｈ７細胞を播種する。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン（商標）（インビトロジェン）を用いて実施される。この実験においては、５０ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド（以下のプラスミドの説明）、配列番号１（以下で記述）から誘導された配列から成るヘヤピンＲＮＡをコードする６００ｎｇのｅｉＲＮＡベクター及び配列番号５（以下で記述）に由来する配列から構成されるヘヤピンＲＮＡをコードする６００ｎｇのｅｉＲＮＡベクターを用いて細胞をトランスフェクトする。５０ｎｇのＨＢＶプラスミド及び１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドで対照細胞をトランスフェクトする。不活性フィラーＤＮＡ、ｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を全てのトランスフェクションに付加してトランスフェクションあたりの全ＤＮＡを２．５μｇＤＮＡにする。
【０１３１】
ＨＢＶ発現の喪失について細胞を監視
トランスフェクションの後、ＨＢｓＡｇ分泌及びＤＮＡ含有ウイルス粒子分泌を測定することにより、ＨＢＶ発現及び複製の喪失又は減少について細胞を監視する。ｄｓＲＮＡの投与後２日目に始めてその後隔日で３週間、トランスフェクションを受けた細胞の培地を検定することによって細胞を監視する。アボット研究所（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（イリノイ州アボットパーク（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ））から商業的に入手可能であるアウスザイムＥＬＩＳＡを用いてＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出する。ＨＢｓＡｇは、ウイルス複製のみならずトランスフェクションを受けた感染性ＨＢＶクローン内での表面抗原シストロンのＲＮＡポリメラーゼＩＩで開始された転写とも結びつけられることから、ＨＢｓＡｇを測定する。ＨＢｓＡｇ合成はＨＢＶ複製の不在下でも続行し得ることから、ウイルス複製のみならず、ＨＢｓＡｇの複製非依存性合成をもダウンレギュレートすることが重要である。包膜されたＨＢＶゲノムＤＮＡを含有するビリオン粒子の分泌も測定する。包膜ＤＮＡを含有するビリオン粒子の喪失は、ＨＢＶ複製の喪失を表わす。ビリオン分泌の分析には、裸の未成熟コア粒子と外被感染性ＨＢＶビリオンの間を弁別する技術が関与する［６］。簡単に言うと、培養した細胞の培地由来のペレット化されたウイルス粒子をプロティナーゼＫ消化に付してコアタンパク質を分解させる。プロティナーゼＫの不活性化の後、試料をＲＱ１ＤＮアーゼ（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）と共にインキュベートして、コア粒子から遊離されたＤＮＡを分解させる。ＳＤＳの存在下でプロティナーゼＫを用いて試料を再消化させて、ＤＮアーゼを不活性化しかつ感染性外被ビリオン粒子を分断させかつ分解させる。その後フェノール／クロロホルム抽出によりＤＮＡを精製し、エタノールで沈降させる。ＨＢＶ特異的ＤＮＡをゲル電気泳動とそれに続くサザンブロット分析で検出する。
【０１３２】
結果は、望ましくは、ＨＢＶプラスミド及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドのみでのトランスフェクションを受けた細胞と比べたＨＢＶプラスミド、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド及びｅｉＲＮＡ構築物でのトランスフェクションを受けた細胞の培地中でのＨＢｓＡｇとウイルス粒子の分泌の両方における７０〜９５％の減少を示すことになる。
【０１３３】
実験で使用されるベクター
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列
配列番号４７は、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）といったような哺乳動物の発現ベクター内にクローニングされるＴ７のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を表わす。クローニングは、当業者によって容易に行なうことができる。当業者であれば、コザック配列を伴うリーダー配列がＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子から直ぐ上流側でクローニングされる必要があるということにも気づくことだろう。
【０１３４】
配列番号１から誘導されたＲＮＡヘヤピンをコードするｅｉＲＮＡベクター
該ベクターは、上述の通りＴ７ベースである。インサートは、ジェンバンク受入れ番号＃ＳＶ０１４６０及びＪ０２２０３の座標３００４−２９５０（約５５ｂｐ）からマッピングする配列から成る単分子ヘヤピンをコードする。ヘヤピンの１つの領域は、該配列のセンスバージョンをコードし、ヘヤピンの第２の領域はこの配列のアンチセンスバージョンをコードする。ヘヤピンは、当業者によって容易に設計され作製され得る。
【０１３５】
配列番号５から誘導されたＲＮＡヘヤピンをコードするｅｉＲＮＡベクター
該ベクターは、上述の通りＴ７ベースである。インサートは、ジェンバンク受入れ番号＃ＳＶ０１４６０及びＪ０２２０３の座標７３０−７８６からマッピングする配列から成る単分子ヘヤピンをコードする。該ヘヤピンは、配列番号１からの配列をコードするヘヤピンについて記述されたとおりに設計される。
【０１３６】
実験１
マウスモデルについての論理的根拠
チンパンジーは、ヒトＨＢＶ感染性を研究すべき唯一の動物モデルである。しかしながら、ヒトＨＢＶの発現及び複製が起こるマウスモデルも利用可能である。これらのモデルは、抗ＨＢＶ治療剤の評価用としては非常に貴重なものであり、ヒトにおけるこれらの作用物質の効能の予測判断材料であることが示されてきた［４］。これらのモデルのうちの最初のものは、内部でＨＢＶゲノム又は選択されたＨＢＶ遺伝子が発現されるトランスジェニックマウスモデルである［７、８］。該マウスゲノム内にＨＢＶが組込まれることから、これらの動物は、ウイルス複製についてのみならず抗原のＲＴ非依存性発現についてもモデルとして役立つ。内部でエピソームＨＢＶＤＮＡから過渡的に複製応答能あるＨＢＶが発現される類似のモデルが存在する。このモデルは、複製応答能あるＨＢＶＤＮＡを流体力学的送達によってマウスの肝臓内に導入することによって作り上げられる［１］。トランスジェニック動物とは異なり、これらのマウスはＨＢＶ抗原に対し免疫寛容性がなく、ＨＢＶのトランスフェクションを受けた肝細胞の免疫媒介型寛容性を研究することができる。
【０１３７】
それぞれウッドチャック肝炎（ＷＨＢＶ）及びアヒル肝炎（ＤＨＢＶ）の研究のためのウッドチャック及びアヒルモデルが存在するものの、我々は、いくつかの理由のため、これらのモデルを使用しないことを選択した。すなわち、１）これらのモデルでは、ヒトＨＢＶを研究できない。我々はヒトＨＢＶの発現をダウンレギュレートすることに究極的な関心があることから、これらのモデルを使用した場合、或る時点で、ヒトＨＢＶに特異的なＲＮＡ及び／又はベクターの再設計及び評価が必要になるだろう。２）マウスは同系であり、従って、系内部での遺伝子変数に起因するノイズは発生しない。３）ヒトＨＢＶとは異なり、そのそれぞれの動物モデルと並行して研究できる認証されたＷＨＢＶ／ＤＨＢＶ細胞培養モデルは全く存在しない。
【０１３８】
以下で記述する実験は、さまざまなエフェクタｄｓＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）発現ベクターと共に複製応答能あるＨＢＶａｙｗプラスミドを同時送達する方法として流体力学的送達を利用している。流体力学的送達は、それが肝臓に対する核酸の効果的な送達を結果としてもたらすことから、この実験にとって理想的である［５］。ｄｓＲＮＡエフェクタプラスミド及び複製応答能あるＨＢＶプラスミドの同一処方内への組合せは、両方のプラスミドが同じ細胞により取上げられる確率を増大させる。発現されたエフェクタｄｓＲＮＡは、複製するＨＢＶプラスミドを担持する細胞の大部分の中に存在することから、観察された結果は、送達効率の差異ではなくむしろエフェクタプラスミドの性能のせいとすることができる。この実験はただ単に、特定のｅｉＲＮＡが、感染した肝臓の中で効能を示すということだけを実証している。この実施例では処方及び送達は扱われていない。ｅｉＲＮＡベクターの処方、投薬及び送達は、トランスジェニックマウスが使用される実施例の中で有効化される。
【０１３９】
実験手順：
対照Ｂ１０．Ｄ２マウスに対し、ウイルスＲＮＡの全てを転写し感染性ウイルスを産生する能力をもつ末端冗長性ウイルスゲノムから成るＨＢＶ（ａｙｗ亜型）の感染性分子クローンを流体力学的に注射する［１、２、３］。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからのＨＢＶａｙｗプラスミドの転写が、ＨＢＶ複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた［１］。これらの事象には、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、コア粒子内への転写されたプレゲノムＲＮＡのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写及び、ビリオン及びＨＢｓＡｇ粒子の組立て及び注射された動物の血清内への分泌が含まれる。動物には、ＨＢＶレプリコンプラスミドの４つの用量（１μｇ、３μｇ、５μｇ及び１０μｇ）を注射する。これらの用量が選択されたのは、それらが流体力学的送達の後レポータプラスミドの検出可能な発現を惹起する能力をもつ非飽和用量を表わすからである。動物には、各グループ内の動物が合計ＤＮＡ用量が２０μｇとなるように特定のエフェクタ構築物を１０〜１９μｇ用量受けるような形で、エフェクタｄｓＤＮＡ発現ベクター（ｅｉＲＮＡ）の同時注射を行なう。例えば、ＨＢＶレプリコンを３μｇ用量受けるマウスにおいては、合計２０μｇのＤＮＡが注射されるように、１７μｇの選択されたｅｉＲＮＡベクターを注射する。従って、この用量は、使用されたＨＢＶプラスミドの用量に左右される。対照動物は、ＨＢＶレプリコンの注射を受けるがｅｉＲＮＡベクターの注射は受けない。その代り、対照動物には、処方中の合計ＤＮＡ量が２０μｇとなるような形で不活性フィラーＤＮＡ、ｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ、ＷＩ、マディソン）を同時注射する。この研究におけるｅｉＲＮＡベクターは、Ｕ６ベースの発現プラスミド、例えばアンビオン株式会社（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）米国テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ））である。これらのベクターは、配列番号１及び配列番号４から誘導された短かいヘヤピンＲＮＡをコードする。これらのベクターによりコードされる精確な配列が以下で記述されている。ベクターは等量（重量で）で同時注射される。本書の他の箇所で記述されているとおりのその他の発現及びプロモータ系及び／又は代替的構造（すなわち２重鎖）をコードするベクターを用いても類似の結果が得られることになると予想される。
【０１４０】
配列番号１由来の配列をコードするＵ６ベースのｅｉＲＮＡベクターについての説明：ベクターは、受入れ番号Ｖ０１４６０及びＪ０２２０３の座標２９０５−２９２９に対しマッピングする配列を含むヘヤピンをコードする（すなわち、ヘヤピンはＴＴＣＡＡＡＡＧＡのループ構造により分離された、この配列のセンス及びアンチセンスバージョンを含有する）。Ｕ６ベースのベクター配列の説明は、リー（Ｌｅｅ）ら、で見ることができる［９］。この実験において使用される第２のｅｉＲＮＡベクターは、配列番号４から誘導されたヘヤピンをコードし、受入れ番号Ｖ０１４６０及びＪ０２２０３の座標１２１５−１２３９に対しマッピングする配列をコードする。
【０１４１】
注射後１日目に注射を受けた動物から肝臓試料を取出、ＨＢＶＲＮＡの存在について分析する。この時点は、流体力学的送達の後のマウス体内でのＨＢＶａｙｗプラスミド複製の動態を詳述するチサリ博士の研究所からの公表された結果に基づいて選択されており、ピークＲＮＡ発現は流体力学的送達の翌日に肝臓内で起こるということを実証している［１］。肝臓試料中のＨＢＶＲＮＡの存在を、ノーザンブロット分析によって確認する。肝臓組織を、ＨＢＶＲＮＡ発現のダウンレギュレーションについて評価することになる。さらに、ＨＢＶｓＡｇ及びＤＮＡ含有ウイルス粒子の測定のため４日目のマウスから血清を収集することになる。検定は、細胞培養レプリコン実験（実施例３）について記述された通り及びヤン（Ｙａｎｇ）ら、にある通りとなる［１］。各々のベクター及び対照グループは、各々１つの収集時点に対応する２つの動物セットから成る。各セットには５匹の動物がいる。
【０１４２】
結果：
ＨＢＶレプリコン及びｅｉＲＮＡ構築物を注射したマウスは、対照動物に比べてＨＢＶ特異的ＲＮＡ及びＨＢｓＡｇ及びＨＢＶウイルス粒子が減少しているはずである。個々の動物において、減少は約７０％〜ほぼ１００％の範囲となる。
【０１４３】
実験２
トランスジェニックマウス研究：背景
我々は、チサリ博士の研究所で開発されたＨＢＶトランスジェニックマウスモデルを使用する予定である［８］。これらのマウスは、かなりの量のＨＢＶＤＮＡを複製し、ヒトの効能の予測判断材料である抗ウイルススクリーンとしてのその有用性を実証した［４］。これらの動物は、同様に、それらが抗原のＨＢＶ−成分媒介型発現のためのモデルでありかくしてウイルス複製のみならず抗原のＲＴ非依存性発現についてもモデルとして役立ち得るという点で、理想的である。我々はウイルス複製のみならず、成分媒介型抗原発現をもターゲティングすることに関心があることから、これは重要である。
【０１４４】
これらの実験は、エフェクタプラスミドが、臨床的に関連ある核酸送達方法を用いて動物に投与されるという点において、流体力学的送達実験と異なっている。このモデルにおける有効性は、マウス肝細胞に対するエフェクタプラスミドの効率の良い送達を実証する。
【０１４５】
実験
参考文献［８］に記述されているマウスに、流体力学的送達例に記述されているｅｉＲＮＡベクターを含有する処方を静脈内注射することになる。これらは、配列番号１及び配列番号４から誘導された配列を含有するヘヤピンをコードするＵ６ベースのｅｉＲＮＡベクターである。
【０１４６】
注射すべきＤＮＡの処方
ＤＮＡを、２００３年５月６日出願のＰＣＴ米国特許第０３／１４２８８号明細書、「核酸送達方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）」サティシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）の中で記述されている通りに、トリラクトシルスペルミン及びコレステリルスペルミンを用いて処方する。簡単に言うと、全て１．２の電荷比（正対負の電荷）を用いて、３つの処方を作製する。ただし、０．８〜１．２の間の電荷をもつ処方が全て効能を示すものと予想されている、ということを指摘しておくべきである。各プラスミドについてのＤＮＡ出発原液は、４ｍｇ／ｍｌである。２つのプラスミド原液を、各プラスミドが２ｍｇ／ｍｌとなるように等量で混合する。このプラスミド混合物を最終処方のために使用する。処方は、ＰＣＴ米国特許第０３／１４２８８号明細書（前出）に記述されている通りである。すなわち処方Ａ）３５％のトリラクトシルスペルミン、６５％のコレステリルスペルミン、処方Ｂ）５０％のトリラクトシルスペルミン、５０％のコレステリルスペルミン及び処方Ｃ）８０％のトリラクトシルスペルミン、２０％のコレステリルスペルミン。結果としての処方は全て、現在１ｍｇ／ｍｌで各プラスミドを含有する。
【０１４７】
マウスには、１００μｌで処方されたＤＮＡを静脈内注射する。１つのマウスグループは処方Ａを受け、第２グループは処方Ｂを受け、第３グループは処方Ｃを受ける。３つの対照マウスグループに、対照ＤＮＡ、ｐＧＬ３ベーシック（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を含有する処方つまり処方Ｄ、Ｅ及びＦを類似の要領で注射する。注射は、連続４日間一日一回実施する。１〜３日だけの注射で有効であるが、より堅調な効能は４日注射プロトコルで見られる。
【０１４８】
投与の後、１回目の注射から５日及び９日目に、ウイルス粒子を含有するＨＢｓＡｇ及びＤＮＡ含有ウイルス粒子のＨＢＶＲＮＡ及び血清レベルを定量化することになる。全ての分析は、流体力学的送達研究について記述された通りとなる。
【０１４９】
結果：
ＨＢＶ特異的ＲＮＡレベル、ＨＢｓＡｇ及びウイルス含有ＤＮＡ粒子は、処方Ａ、Ｂ及びＣグループにおいて対照に比べ減少しているはずである。
【０１５０】
実施例４
複製応答能ある細胞培養モデルにおけるＨＢＶ複製及び発現のサイレンシング
細胞培養モデルの簡単な説明：
Ｈｕｈ７細胞系列といったようなヒト肝臓由来の細胞系列を、ウイルスＲＮＡの全てを転写し感染ウイルスを産生する能力をもつ末端冗長性ウイルスゲノムから成るＨＢＶの感染性分子クローンでトランスフェクトする［１−３］。これらの研究中で用いられるレプリコンは、ジェンバンク受入れ番号ＡＦ０９０８４０の中に見られるウイルス配列から誘導される。肝細胞内への内在化及び核局在化の後、複数のウイルスプロモータからの感染性のＨＢＶプラスミドの転写が、ＨＢＶ複製を映し出す事象カスケードを開始させることが示されてきた。これらの事象には、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写されたプレゲノムＲＮＡのコア粒子内へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写及び、ビリオン及びＨＢｓＡｇ粒子の組立て及びトランスフェクションを受けた細胞の培地内への分泌が含まれる。このトランスフェクションモデルは、感染を受けた肝細胞内部のＨＢＶ複製の大部分の局面を再現し、従って、ＨＢＶ発現及び複製のサイレンシングを調べるのに用いる優れた細胞培養モデルである。
【０１５１】
このモデルにおいては、ＨＢＶの感染性分子クローン及びさまざまなｅｉＲＮＡ構築物と細胞を同時トランスフェクトした。その後、以下で記述する通りにＨＢＶ発現及び複製の損失について、細胞を監視した。
【０１５２】
以下に記すのは配列番号１及び配列番号２の両方から誘導された配列をコードするｅｉＲＮＡベクターを用いて実施された実験の一実施例である。この実験に用いられる特定のｅｉＲＮＡベクターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼベースのものであり、約６５０ｂｐの２重鎖ＲＮＡをコードする（例えば２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレットを参照のこと）。本書の他の箇所で記述されているようなその他の発現及びプロモータ系及び／又は代替的構造（すなわち２重鎖）をコードするベクターを用いても類似の結果が得られることになると予想される。
【０１５３】
実験手順：トランスフェクション
トランスフェクションの時点で８０〜９０％の集密度となるように６ウェル平板内にＨｕｈ７細胞を播種した。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン（商標）（インビトロジェン）を用いて実施された。この実験においては、Ａ）５０ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミドａｄｗ亜型、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド（実施例３中のプラスミドの説明）及び１．５μｇのＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡベクター（以下で記述）；Ｂ）５０ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド及び１．５μｇの無関係のｄｓＲＮＡ発現ベクター；Ｃ）１２５ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド及び１．４μｇのＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡベクター；及びＤ）１２５ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド及び１．４μｇの無関係のｄｓＲＮＡ発現ベクターで細胞をトランスフェクトした。全てのトランスフェクションはデュプリケートで実施した。この実験では、トランスフェクションＢ及びＤは対照として役立った。トランスフェクションから４日後に、トランスフェクションした細胞から培地を取出し、ＨＢｓＡｇの存在について検定した（以下参照）。背景対照として、トランスフェクションを受けていない細胞からの培地も検定した。
【０１５４】
ＨＢＶ発現の喪失について細胞を監視
トランスフェクションの後、ＨＢｓＡｇ分泌を測定することにより、ＨＢＶ発現及び複製の喪失又は減少について細胞を監視した。ｄｓＲＮＡの投与後４日目に、トランスフェクションを受けた細胞の培地（及び培地対照）を検定することによって細胞を監視した。アボット研究所（イリノイ州、アボットパーク）から商業的に入手可能であるアウスザイムＥＬＩＳＡを用いてＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出した。ＨＢｓＡｇはウイルス複製のみならずトランスフェクションを受けた感染性ＨＢＶクローン内での表面ＡｇシストロンのＲＮＡポリメラーゼＩＩで開始された転写とも結びつけられることから、これを測定した。ＨＢｓＡｇ合成はＨＢＶ複製の不在下でも続行し得ることから、ウイルス複製のみならず、ＨＢｓＡｇの複製非依存性合成をもダウンレギュレートすることが重要である。
【０１５５】
結果：
ＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡ構築物でのトランスフェクションを受けた細胞は、対照トランスフェクションに比べ、４日の時点でＨＢｓＡｇの８２−９３％の減少を示した。
【０１５６】
この実験において用いられたＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡ
ｅｉＲＮＡベクターは、ジェンバンク受入れ番号ＡＦ０９０８４０の座標２０２７−２６７４に対しマッピングするｄｓＲＮＡをコードする。従って、該配列は、配列番号１及び配列番号２の両方から誘導された配列を含む。より特定的には、該配列は、配列番号２の全て及び配列番号１から誘導された１３４ｂｐを含む。
【０１５７】
実施例５
細胞培地レプリコンモデル内のＨＣＶのダウンレギュレーション
簡単な説明
この実験においては、機能的ＨＣＶレプリコンを発現する細胞系列が作製される。該細胞系列の作製は、ローマン（Ｌｏｈｍａｎｎ）ら、に詳述されている通りである［１０］。この実施形態においては、Ｈｕｈ７細胞を親細胞系列として使用するが、理論的には、任意のヒト肝細胞由来の細胞系列を使用することができる。その後、細胞をＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡベクターでトランスフェクトする。ＨＣＶ特異的ＲＮＡの存在をｅｉＲＮＡのトランスフェクションから３〜７日目にローマンら［１０］に記述されている通りノーザンブロット分析により確認する。
【０１５８】
実験手順：トランスフェクション
トランスフェクションの時点で８０〜９０％の集密度となるように６ウェル平板内にＨＣＶレプリコンを発現するＨｃｈ７細胞を播種する。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン（商標）（インビトロジェン）を用いて実施される。この実験においては、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド（実施例３に記述されたプラスミド）及び１．５μｇの配列番号１１から誘導された配列から成るヘヤピンＲＮＡをコードするＴ７ベースのｅｉＲＮＡベクター（実施例の終りに記述されているベクター）で細胞をトランスフェクトする。対照細胞は、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド及び１．５μｇの実施例３で記述されたＨＢＶ特異的（配列番号１特異的）でＴ７ベースのｅｉＲＮＡベクターでトランスフェクトする。トランスフェクションを受けていないレプリコン発現ＨｕＨ７細胞を第２の対照として含み入れる。１つの混合物につき１０回のトランスフェクションを実施してその結果合計２０回のトランスフェクション（１混合物あたり１０回）がもたらされ得るような形で、各々のトランスフェクション混合物を作る。３、４、５、６及び７日目に、各トランスフェクションにつき２つの細胞のウェルを溶解させ、標準的技術を用いてＲＮＡを抽出する。試料を、ローマンら［１０］に記述されている通りにＨＣＶ特異的ＲＮＡの存在についてノーザンブロット分析により同時に分析する。
【０１５９】
結果
ＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡベクターでのトランスフェクションを受けた細胞は、分析された全ての時点で対照細胞に比べて減少したＨＣＶ特異的ＲＮＡレベルを示すことになる。
【０１６０】
ＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡベクター
ｅｉＲＮＡベクターはＴ７ベースであり、ヘヤピンＲＮＡをコードする。該ヘヤピンの一方の側は配列番号４８を含む。
【０１６１】
この配列の後には９Ｔのループ構造が続いている。該ヘヤピンの第２の側は、該ヘヤピンの第１の側に相補的な配列を含んでいる。当業者であれば、ヘヤピン構築物を容易に設計し構築することができる。註：その他のプロモータによって駆動されその他のタイプのＲＮＡ構造をコードするその他のタイプのｅｉＲＮＡも類似の効果を有することになると見込まれている。
【０１６２】
実施例６
ＨＢＶ／ＨＣＶ同時感染の治療
簡単な説明
この実施例では、ＨＢＶ及びＨＣＶレプリコンの両方を複製する細胞が、ＨＢＶ及びＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡの両方をコードするｅｉＲＮＡベクターでのトランスフェクションを受ける。
【０１６３】
実験プロトコル
ＨＢＶ及びＨＣＶレプリコンの両方を含む細胞系列の作製
ＨｕＨ７細胞をまず処理して機能的ＨＣＶレプリコンを発現させる。細胞系列の作製はローマンら、［１０］で詳述されている通りである。細胞系列の確立の後、細胞を実施例３及び以下の「細胞のトランスフェクション」の節で記述されている通りに感染性ＨＢＶレプリコンプラスミドでトランスフェクトさせる。この実施例においては、ジェンバンク受入れ番号Ｖ０１４６０及びＪ０２２０３に見られるウイルス配列からレプリコンを誘導する。理論的には、まずはＨＢＶレプリコンを安定した形で発現する細胞系列をまず作り上げ、次にこの細胞系列を用いて同じくＨＣＶレプリコンを発現する細胞系列を作り上げることも同様に可能である。同様に、ＨＢＶ及びＨＣＶレプリコンの両方で同時に細胞をトランスフェクトし、ＨＢＶ及びＨＣＶレプリコンの両方を複製している細胞を選択し増殖させることも可能である。
【０１６４】
細胞のトランスフェクション
この実施例では、ＨＢＶ及びＨＣＶｅｉＲＮＡが同じベクター内の別々のシストロンによってコードされる。ただし、ｅｉＲＮＡが同じシストロン内にコードされるか又は別々のベクターによって提供される場合でも、類似の結果が予想される。この実施例では、各々のシストロンからの転写はＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって駆動される。各プロモータの後にはヘヤピンｅｉＲＮＡが続いており、このヘヤピンｅｉＲＮＡ自体にはＴ７ターミネータが後続している（図１）。この実施例中のシストロンは、収束性であるが、発散性シストロンを使用することも可能である。同様に、これらのＲＮＡを産生するためにその他の発現系（ウイルス系を含む）を使用することもでき、さらに又例えば本書の他の箇所で記述されている通り著しく効能に影響を及ぼすことなくこれらのＲＮＡの発現を駆動するべくその他のプロモータを使用することも可能である、ということも指摘しておくべきである。適切な発現系及びプロモータの選択は、当業者の技能範囲内に入る。同じく、例えば本書の他の箇所で記述されているような、及びこの分野の文献中に記述されているようなその他のｅｉＲＮＡ構造を発現することもできる。この実施例では、ＨＢＶｅｉＲＮＡベクターは配列番号１から誘導された配列をコードし、ＨＣＶｅｉＲＮＡベクターは配列番号１１から誘導された配列をコードする。ベクターインサートの記述は、この実施例の最後に見られる。
【０１６５】
トランスフェクションの時点で８０〜９０％の集密度となるように６ウェル平板内にＨｕｈ７細胞を播種する。全てのトランスフェクションは、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン（商標）（インビトロジェン）を用いて実施される。この実験においては、５０ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド（プラスミドの説明は実施例３にある）、配列番号１（以下及び実施例３で記述）から誘導された配列から成るヘヤピンＲＮＡをコードする６００ｎｇのｅｉＲＮＡベクター及び配列番号１１（以下で記述）から誘導された配列から成るヘヤピンＲＮＡをコードする６００ｎｇのｅｉＲＮＡベクターを用いて細胞をトランスフェクトする。必要な場合には５０ｎｇのＨＢＶプラスミド及び１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドで対照細胞をトランスフェクトする。必要な場合には、不活性フィラーＤＮＡ、ｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を全てのトランスフェクションに付加してトランスフェクションあたりの全ＤＮＡを２．５μｇＤＮＡにする。１混合物につき１０回のトランスフェクションを実施し結果として合計２０回のトランスフェクション（１混合物につき１０回）がもたらされ得るような形で、各トランスフェクション混合物を作る。
【０１６６】
分析
トランスフェクションの後、ＨＢｓＡｇ分泌及びＤＮＡ含有ウイルス粒子分泌を測定することにより、ＨＢＶ発現及び複製の喪失又は減少について細胞を監視する。ｄｓＲＮＡの投与後２日目に始めてその後隔日で３週間、トランスフェクションを受けた細胞の培地を検定することによって細胞を監視する。アボット研究所（イリノイ州アボットパーク）から商業的に入手可能なアウスザイムＥＬＩＳＡを用いてＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出する。ＨＢｓＡｇは、ウイルス複製のみならずトランスフェクションを受けた感染性ＨＢＶクローン内での表面ＡｇシストロンのＲＮＡポリメラーゼＩＩで開始された転写とも結びつけられることから、ＨＢｓＡｇを測定する。ＨＢｓＡｇ合成はＨＢＶ複製の不在下でも続行し得ることから、ウイルス複製のみならず、ＨＢｓＡｇの複製非依存性合成をもダウンレギュレートすることが重要である。包膜されたＨＢＶゲノムＤＮＡを含有するビリオン粒子の分泌も測定する。包膜ＤＮＡを含有するビリオン粒子の喪失は、ＨＢＶ複製の喪失を表わす。ビリオン分泌の分析には、裸の未成熟コア粒子と外被感染性ＨＢＶビリオンの間を弁別する技術が関与する［６］。簡単に言うと、培養した細胞の培地由来のペレット化されたウイルス粒子をプロティナーゼＫ消化に付してコアタンパク質を分解させる。プロティナーゼＫの不活性化の後、試料をＲＱ１ＤＮアーゼ（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）と共にインキュベートして、コア粒子から遊離されたＤＮＡを分解させる。ＳＤＳの存在下でプロティナーゼＫで再び試料を消化させて、ＤＮアーゼを不活性化しかつ感染性外被ビリオン粒子を分断させかつ分解させる。その後フェノール／クロロホルム抽出によりＤＮＡを精製し、沈降させる。ＨＢＶ特異的ＤＮＡをゲル電気泳動とそれに続くサザンブロット分析で検出する。
【０１６７】
３、４、５、６及び７日目に各トランスフェクション（実験及び対照）につき２つの細胞ウェルを溶解させ、標準的技術を用いてＲＮＡを抽出する。同様にローマンら［１０］に記述されているように、ＨＣＶ特異的ＲＮＡの存在について、ノーザンブロット分析により試料を分析する。
【０１６８】
結果
ＨＢＶ−ＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡベクターでのトランスフェクションを受けた細胞は、分析された全ての時点で対照細胞に比べＨＣＶ特異的ＲＮＡレベルの減少を示すことになる。さらに、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶウイルス粒子のレベルも同様に、対照トランスフェクションに比べ減少することになる。
【０１６９】
ＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡ配列
ｅｉＲＮＡベクターはＴ７ベースのものであり、ヘヤピンＲＮＡをコードする。該ヘヤピンの一方の側は配列番号４８を含む。
【０１７０】
この配列の後には９Ｔのループ構造が続いている。該ヘヤピンの第２の側は、該ヘヤピンの第１の側に相補的な配列を含んでいる。当業者であれば、ヘヤピン構築物を容易に設計し構築することができる。註：様々なヘヤピン構造を含め、その他のプロモータによって駆動されその他のタイプのＲＮＡ構造をコードするその他のタイプのｅｉＲＮＡベクターも類似の効果を有することになると見込まれている。特に望ましいのは、例えば２００２年７月３１日出願の米国特許出願公開第６０／３９９，９９８Ｐ号明細書及び２００３年７月３１日出願のＰＣＴ米国特許第２００３／０２４０２８号明細書中で教示されている通りのｄｓＲＮＡヘヤピンを形成するためＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより拡張される能力をもつ部分的ヘヤピンである「強制」ヘヤピン構築物、ならびにミス対合した領域を伴うヘヤピンである「乳房様」構造化ヘヤピン（例えばマルチヘヤピン長ｄｓＲＮＡベクター及びマルチ短ヘヤピン構造）及び２００２年１０月１８日出願の米国特許出願公開第６０／４１９，５３２号明細書及び２００３年１０月２０日出願のＰＣＴ米国特許第２００３／０３３４６６号明細書中で教示されているマルチエピトープ構築物並びに当業者にとって既知のその他のｄｓＲＮＡ構造である。
【０１７１】
ＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡ−配列番号１
ベクターは上述のとおりのＴ７ベースのものである。インサートは、ジェンバンク受入れ番号Ｖ０１４６０及びＪ０２２０３の座標３００４−２９５０（約５５ｂｐ）からマッピングする配列から成る単分子ヘヤピンをコードする。該ヘヤピンの１つの領域は、配列のセンスバージョンをコードし、該ヘヤピンの第２の領域は、この配列のアンチセンスバージョンをコードする。ヘヤピンは当業者により容易に設計、作製され得る。
【０１７２】
［参考文献］
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５．リュー（Ｌｉｕ）Ｆ．、Ｙ．ソン（Ｓｏｎｇ）及びＤ．リュー（Ｌｉｕ）、プラスミドＤＮＡの全身投与による動物の体内の流体力学ベースのトランスフェクション（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）、１９９９年、６（７）：ｐ．１２５８−６６
６．ディレニー（Ｄｅｌａｎｅｙ）Ｗ．Ｅ．ｔ及びＨ．Ｃ．アイソム（Ｉｓｏｍ）、Ｂ型肝炎ウイルス組換え型バキュロウイルスにより媒介されるヒトＨｅｐＧ２細胞中のＢ型肝炎ウイルス複製（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、１９９８年、２８（４）：ｐ．１１３４−４６
７．チサリ（Ｃｈｉｓａｒ）Ｆ．Ｖ．ら、慢性Ｂ型肝炎表面抗原担体状態のトランスジェニックマウスモデル（Ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｃａｒｒｉｅｒ ｓｔａｔｅ）、サイエンス、１９８５年、２３０（４７３０）：ｐ．１１５７−６０
８．グイドッティ Ｌ．Ｇ．ら、トランスジェニックマウス体内の高レベルＢ型肝炎ウイルス複製（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）、ウイルス学ジャーナル（Ｊ Ｖｉｒｏｌ）、１９９５年、６９（１０）：ｐ．６１５８−６９
９．リー（Ｌｅｅ）ＮＳ、ドージマ（Ｄｏｈｊｉｍａ）Ｔ．、バウアー（Ｂａｕｅｒ）Ｇ．、リー（Ｌｉ）Ｈ．リー（Ｌｉ）Ｍ．Ｊ．、イーサニ（Ｅｈｓａｎｉ）Ａ．、サルバテーラ（Ｓａｌｖａｔｅｒｒａ）Ｐ．及びロッシ（Ｒｏｓｓｉ）Ｊ．、ヒト細胞内のＨＩＶ−１ｒｅｖ転写物に対してターゲティングされた小型干渉ＲＮＡの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ−１ ｒｅｖ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００２年、ｐ．５００−５０５
１０．ローマン（Ｌｏｈｍａｎｎ）Ｖ．、コーナー（Ｋｏｒｎｅｒ）Ｆ．、コッホ（Ｋｏｃｈ）Ｊ．−Ｏ．、ヘリアン（Ｈｅｒｉａｎ）Ｕ．、テイルマン（Ｔｈｅｉｌｍａｎｎ）Ｌ．及びバルテンシュレーガー（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ）Ｒ．、ヘパトーマ細胞系列におけるサブゲノムＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの複製（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＲＮＡｓ ｉｎ ａ Ｈｅｐａｔｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ）、サイエンス、１９９９年、２８５：１１０−１１３
【配列表フリーテキスト】
【０１７３】
配列の簡単な説明
配列番号１〜配列番号１０はＢ型肝炎ゲノムの保存された領域を表わす。
【０１７４】
配列番号１１及び配列番号１２は、Ｃ型肝炎ゲノムの保存された領域を表わす。
【０１７５】
配列番号１３は、ヒトＵ６プロモータのヌクレオチド配列を表わす。
【０１７６】
配列番号１４及び配列番号１５は、配列番号５内にＨＢＶ配列マッピングを有するｅｉＲＮＡを表わす。
【０１７７】
配列番号１６及び配列番号１７は、配列番号４内にＨＢＶ配列マッピングを有するｅｉＲＮＡを表わす。
【０１７８】
配列番号１８は、配列番号１０内にＨＢＶ配列マッピングを有するｅｉＲＮＡを表わす。
【０１７９】
配列番号１９〜配列番号２２は、配列番号３内にＨＢＶ配列マッピングを有するｅｉＲＮＡを表わす。
【０１８０】
配列番号２３及び配列番号２４は、配列番号２内にＨＢＶ配列マッピングを有するｅｉＲＮＡを表わす。
【０１８１】
配列番号２５及び配列番号２６は、配列番号１内にＨＢＶ配列マッピングを有するｅｉＲＮＡを表わす。
【０１８２】
配列番号２７は、ＨＣＶ３’ＵＴＲの「Ｘ」領域を表わす。
【０１８３】
配列番号２８〜配列番号３６は、ＨＣＶ３’ＵＴＲに対するｓｉＲＮＡマッピングを表わす。
【０１８４】
配列番号３７〜配列番号４４は、ＨＣＶ３’ＵＴＲの「Ｘ」領域に対するｓｉＲＮＡマッピングを表わす。
【０１８５】
配列番号４５は、ＨＣＶコアに対するｓｉＲＮＡマッピングを表わす。
【０１８６】
配列番号４６は、ラミンに対するｓｉＲＮＡマッピングを表わす。
【０１８７】
配列番号４７は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を表わす。
【０１８８】
配列番号４８は、ヘヤピンＲＮＡをコードするＴ７−ベースのｅｉＲＮＡベクターを表わす。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子をインビボにて哺乳動物細胞に投与することを含む、インビボにて哺乳動物細胞中でＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための方法。
【請求項２】
配列番号１〜配列番号１０のうちの２つ以上の中から少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含むエフェクタ分子が同じ細胞に投与されることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与が、ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子の前記哺乳動物細胞での産生を可能にする能力をもつ発現構築物を含む１つ以上の発現ベクターを提供することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の発現ベクターがさらに、Ｔ７ポリメラーゼプロモータ、ＳＰ６ポリメラーゼプロモータ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータから選択されたプロモータを含み、前記プロモータが前記少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子をインビボにて哺乳動物細胞に投与することを含む、インビボにて哺乳動物細胞中でＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための方法。
【請求項６】
配列番号１１及び配列番号１２のうちの２つ以上の中から少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含むエフェクタ分子が同じ細胞に投与されることをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記投与が、ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子の前記哺乳動物細胞での産生を可能にする能力をもつ発現構築物を含む１つ以上の発現ベクターを提供することによって達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の発現ベクターがさらに、Ｔ７ポリメラーゼプロモータ、ＳＰ６ポリメラーゼプロモータ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータから選択されたプロモータを含み、前記プロモータが前記少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の第１の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子及び、ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の第２の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を、インビボにて哺乳動物細胞に投与することを含む、同じインビボにて哺乳動物細胞中でＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の両方の発現を阻害するための方法。
【請求項１０】
配列番号１〜配列番号１２のうちの３つ以上の中から少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含むエフェクタ分子が前記同じ細胞に投与されることをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与が、ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の第１の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子及び、ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の第２の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子の、前記哺乳動物細胞での産生を可能にする能力をもつ発現構築物を含む１つ以上の発現ベクターを提供することによって達成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の発現ベクターがさらに、Ｔ７ポリメラーゼプロモータ、ＳＰ６ポリメラーゼプロモータ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータから選択された第１のプロモータ（前記第１のプロモータは前記第１の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている）及び、Ｔ７ポリメラーゼプロモータ、ＳＰ６ポリメラーゼプロモータ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータの中から選択された第２のプロモータ（前記第２のプロモータは前記第２の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１、５又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を含む、インビボにて哺乳動物細胞中でＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物。
【請求項１５】
配列番号１〜配列番号１０のうちの２つ以上の中から少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含むエフェクタ分子が前記組成物中に存在していることをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を含む、インビボにて哺乳動物細胞中でＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物。
【請求項１７】
配列番号１１〜配列番号１２のうちの２つ以上の中から少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含むエフェクタ分子が存在していることをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＵがＴに置換されている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０から成る群から選択された配列内の第１の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子及び、ＵがＴに置換されている、配列番号１１及び配列番号１２から成る群から選択された配列内の第２の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を含む、単一の哺乳動物細胞中、インビボにてＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の両方の発現を阻害するための組成物。
【請求項１９】
配列番号１〜配列番号１２のうちの３つ以上の配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含むエフェクタ分子が前記組成物中に存在していることをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１４、１６又は１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
ａ）配列番号１、
ｂ）配列番号２、
ｃ）配列番号３、
ｄ）配列番号４、
ｅ）配列番号５、
ｆ）配列番号６、
ｇ）配列番号７、
ｈ）配列番号８、
ｉ）配列番号９、
ｊ）配列番号１０、
ｋ）（ａ）〜（ｊ）の相補配列、及び
ｌ）（ａ）〜（ｋ）の混合物、
から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む、哺乳動物細胞内のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物。
【請求項２２】
ａ）配列番号１１、
ｂ）配列番号１２、
ｃ）（ａ）又は（ｂ）の相補配列、及び
ｄ）（ａ）〜（ｃ）の混合物、
から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む、哺乳動物細胞内のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物。
【請求項２３】
ａ）配列番号１、
ｂ）配列番号２、
ｃ）配列番号３、
ｄ）配列番号４、
ｅ）配列番号５、
ｆ）配列番号６、
ｇ）配列番号７、
ｈ）配列番号８、
ｉ）配列番号９、
ｊ）配列番号１０、
ｋ）配列番号１１、
ｌ）配列番号１２、
ｍ）（ａ）〜（ｌ）の配列の相補配列、及び
ｎ）（ａ）〜（ｍ）の混合物、
から成る群から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む、同じ哺乳動物細胞内のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物であって、群（ａ）〜（ｊ）からの少なくとも１つと群（ｋ）及び（ｌ）からの１つを含む組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも１９個の隣接のヌクレオチド配列がＤＮＡを含み、前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２１、２２又は２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１９個の隣接のヌクレオチド配列がＲＮＡを含み、前記哺乳動物細胞がヒト細胞であり、さらにＵがＴに置換されている、請求項２１、２２又は２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
配列番号１４〜配列番号２６から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項２７】
配列番号１４〜配列番号２６から選択された配列のヌクレオチド１〜１９、１〜２０、１〜２１、２〜２０、２〜２１又は３〜２１を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項２８】
配列番号２７〜配列番号４４から選択された配列内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列。
【請求項２９】
ＵがＴに置換されている、配列番号２７内の少なくとも１９個の隣接塩基対のヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡエフェクタ分子を含む、哺乳動物細胞内のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するための組成物。
【請求項３０】
請求項１４、１６、１８、２１、２２、２３又は２９のいずれか一項に記載の組成物を含む発現構築物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の発現構築物を含む哺乳動物細胞。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【公開番号】特開２０１１−２２４０１３（Ｐ２０１１−２２４０１３Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１４８４６１（Ｐ２０１１−１４８４６１）
【出願日】平成２３年７月４日（２０１１．７．４）
【分割の表示】特願２００６−５３３８１０（Ｐ２００６−５３３８１０）の分割
【原出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０５３６９１５８）アルナイラム　ファーマシューティカルズ，　インコーポレイテッド (51)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】