遺伝子分析方法
【課題】サンプルＤＮＡの長さや配列に制限されることなく、遺伝子分析を行うことができる遺伝子分析方法を提供する。
【解決手段】標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡの特異的な配列に対して相補的な配列を持つプローブＤＮＡにおもりとなる物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを混合して、得られた混合液を所定の値で加熱し、室温に戻す過程で前記第１のサンプルＤＮＡと前記コンジュゲートＤＮＡを結合させて複合体を形成させ、得られた複合体と複合体を形成しないものを電気泳動で分子量の差により分離する。
【解決手段】標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡと、前記第１のサンプルＤＮＡの特異的な配列に対して相補的な配列を持つプローブＤＮＡにおもりとなる物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを混合して、得られた混合液を所定の値で加熱し、室温に戻す過程で前記第１のサンプルＤＮＡと前記コンジュゲートＤＮＡを結合させて複合体を形成させ、得られた複合体と複合体を形成しないものを電気泳動で分子量の差により分離する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある特定の遺伝子を検出する遺伝子分析方法に関し、特にプローブＤＮＡとの親和性の差によりある特定遺伝子の検出を行う技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡのＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；一塩基多型と呼ばれる。）が注目されている。このＳＮＰは、ヒトや動物に普遍に見られるが、同じ種でも個体によりＳＮＰが異なる。すなわちＳＮＰの違いを調べることにより、各個人の疾患に対する罹患率や薬剤に対する効果や感受性を予測し、個人に合わせた医療やヒトや動物の親子関係の特定できる可能性が考えらてれている。
【０００３】
ＳＮＰや一部の塩基配列が異なるＤＮＡを調べる方法として、アフィニティキャピラリー電気泳動法を利用した遺伝子診断方法がある。この方法は、まず目的配列に相補的なプローブＤＮＡに高分子化合物を結合させたコンジュゲートＤＮＡを作製する。このコンジュゲートＤＮＡは、高分子化合物のため、キャピラリー内で移動し難くなる性質を持つ。このコンジュゲートＤＮＡを電気浸透流が起きないようにコーティングされたキャピラリー管に充填し、陰極側から一本鎖のサンプルＤＮＡを注入して電圧を印加する。その際に、コンジュゲートＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡは、充填したコンジュゲートＤＮＡとの親和性が高いので泳動が妨げられる。このときＳＮＰをもったサンプルＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡとでコンジュゲートＤＮＡとのハイブリダイゼーションにおける親和性の差を電気泳動の移動度で比較することにより、ＳＮＰを持つＤＮＡを明瞭に識別出来る（例えば非特許文献１を参照。）。
【０００４】
この技術はＳＮＰに限らず、発現解析や遺伝子診断など、特定の遺伝子の有無を調べるときなど幅広い分野に応用できる。
【非特許文献１】Detection of single-base mutation by affinity capillary electrophoresis using a DNA-polyacrylamide conjugate; Kae Sato, Akira Inoue, Kazuo Hosokawa, Mizuo Maeda; Electrophoresis 2005, (26) 3076-3080
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記従来の構成では、目的の遺伝子の判別方法は、密閉流路内で電気泳動を行い、一本鎖ＤＮＡとプローブＤＮＡとの親和性の差により判断していた。しかし、一本鎖ＤＮＡは構造的に不安定であり、サンプルＤＮＡが高次構造（ヘアピンループ構造）を形成するような配列を持った場合や長鎖の場合では、高次構造の形成により、密閉流路内のプローブＤＮＡと結合することができず、目的の遺伝子の有無を正確に判別できないという課題を有していた。
【０００６】
本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、サンプルＤＮＡの長さや配列に制限されることなく、遺伝子分析を行うことができる遺伝子分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記従来の課題を解決するために、本発明の遺伝子分析方法は、標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡを含む二本鎖ＤＮＡと標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡのＤＮＡ配列とは異なる配列を持つ第２のサンプルＤＮＡとを含む二本鎖ＤＮＡの両方もしくは、どちらか一方を含むＰＣＲ産物を作製する調整ステップと、前記第１のサンプルＤＮＡの特異的な配列に対して相補的な配列を持つプローブＤＮＡにその電気泳動速度を遅らせる物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを作製するコンジュゲートＤＮＡ作製ステップと、前記ＰＣＲ産物のモル数よりも多く前記コンジュゲートＤＮＡを加えた混合液を作製する混合ステップと、前記混合液を所定の値で加熱する加熱ステップと、加熱した前記混合液を室温に戻す過程で前記ＰＣＲ産物の第１のサンプルＤＮＡと前記コンジュゲートＤＮＡを結合させて複合体を形成する複合体形成ステップと、前記混合液を電気泳動させることにより前記第１のサンプルＤＮＡあるいは第２のサンプルＤＮＡの標識剤を測定する測定ステップとを含むことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００８】
サンプルＤＮＡの長さや配列に制限されることなく、遺伝子分析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明の遺伝子解析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
（実施の形態１）
図１を用いて本発明による目的の遺伝子のコンジュゲートＤＮＡを用いて測定する方法を説明する。
【００１０】
＜ＰＣＲ産物の作製＞
まず本発明の実施の形態１におけるＰＣＲ産物を作製する調整ステップの詳細を説明する。本実施の形態１で解析するＰＣＲ産物は、植物、動物、または人の細胞や血液等から入手したＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法によって増幅する。
【００１１】
ＰＣＲ産物は第１のサンプルＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡと第２のサンプルＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡの両方もしくはどちらか一方からなる。本実施例ではフォワード側かリバース側のどちらか一方のプライマーの５’末端に標識剤を修飾したものを使用する。どちらのプライマーに標識をつけても構わないが、本発明では標識剤がついた配列をサンプルＤＮＡとする。
【００１２】
増幅断片の長さは１０００ｂｐ以下である。１０００ｂｐ以上の長さの一本鎖ＤＮＡは、相補鎖と再結合する結合強度が強く二本鎖ＤＮＡに戻りやすいことや、コンジュゲートＤＮＡと結合した第１のサンプルＤＮＡと結合しない第２のサンプルＤＮＡの移動度の差が少ないことが考えられ、充分な分離が得られないことが考えられ、好ましくない。
【００１３】
＜コンジュゲートＤＮＡの調整＞
次にコンジュゲートＤＮＡ２５２の作製について詳細に説明する。第１のサンプルＤＮＡと相補的な配列を持つプローブＤＮＡ２５０とポリマー２５１を結合させることにより作製できたものをコンジュゲートＤＮＡ２５２とする。ここで、ポリマー２５１は電気泳動時のサンプルＤＮＡの速度に対して何らかの影響を与える物質で構成されるものであり、電荷を持たない高分子物質やたんぱく質等が挙げられる。例えば一般的に使用される高分子物質として、ポリエチレングリコールがあり、その分子量は数百から数千である。
【００１４】
分子量が数百より小さくなると、コンジュゲートＤＮＡに結合したサンプルＤＮＡと結合しない第２のサンプルＤＮＡとの電気泳動速度差が少なくなり、両者の分離が出来ないので好ましくない。一方、分子量が数千より大きくなると、コンジュゲートＤＮＡに結合したサンプルＤＮＡは電気泳動により移動できないため好ましくない。
【００１５】
また、プローブＤＮＡ２５０は、第１のサンプルＤＮＡ２１０の標識剤２０３が結合した配列の中の特異的な配列に対して相補的な配列を設定する。その長さは２０塩基以上（Ｔｍ値が４０度以上）１００塩基以下にする。プローブＤＮＡ２５０が上述した長さより短い場合、第１のサンプルＤＮＡ２１０との結合力が弱すぎて、電気泳動の移動中に第１のサンプルＤＮＡ２１０とコンジュゲートＤＮＡ２５２の結合が離れる可能性があり、好ましくない。一方、プローブＤＮＡ２５０が１００塩基より長い場合は、合成オリゴを作製することが困難なことや、コンジュゲートＤＮＡ２５２が非特異的な結合をする可能性があること、また、プローブＤＮＡ２５０が高次構造を形成してしまうので好ましくない。
【００１６】
＜ＰＣＲ産物とコンジュゲートＤＮＡの混合液の調整＞
ＰＣＲ産物とコンジュゲートＤＮＡ２５２を混合し、ハイブリダイズさせる際の条件について説明する。ゲル電気泳動やプライマーの濃度から、ＰＣＲ産物の濃度を算出し、その値に対して５倍以上の濃度になるようにコンジュゲートＤＮＡ２５２を加える。コンジュゲートＤＮＡ２５２の濃度はＰＣＲ産物の濃度に対して５〜６００倍とするのが適当である。５倍以下だと第１のサンプルＤＮＡ２１０が結合するための十分な量ではなく、６００倍以上だと高濃度のコンジュゲートＤＮＡ２５２を必要とし、コストの面でロスが大きい。
【００１７】
これらの調整する時の緩衝液１１はハイブリダイズさせる際に適当な緩衝液であれば、何でもよい。しかし、調整後はキャピラリー電気泳動を行うので、多量の塩が混入したＳＳＣは好ましくない。そして、この緩衝液１１には第１のサンプルＤＮＡ２１０とコンジュゲートＤＮＡ２５２の結合力を高めるため、２価の陽イオンを加えるとよい。具体的にはマグネシウムが挙げられる。
【００１８】
以下に混合液を構成する物質の概略を記す。
【００１９】
＜混合液２３０の概略＞
（１）ＰＣＲ産物
（２）コンジュゲートＤＮＡ２５２（ＰＣＲ産物の濃度に対して５〜６００倍）
（３）緩衝液１１（高塩濃度のものでなければ何でも良い）
（４）２価の陽イオン（例えばマグネシウムイオン）
＜ＰＣＲ産物の熱変性＞
図１を用いて本発明のサンプルＤＮＡの調整方法と測定方法を説明する。上記の第１のサンプルＤＮＡと第２のサンプルＤＮＡの両方もしくはどちらか一方のＰＣＲ産物を含む混合液２３０を９５℃で熱し、ＰＣＲ産物を一本鎖の状態に解離する（図１ａでは第１のサンプルＤＮＡを例に示す。）。
【００２０】
加熱後、混合液２３０を室温までゆっくりと冷却する。一本鎖ＤＮＡは水素結合で引き寄せられる配列（相補的な配列）で二本鎖を形成しようとするが、その時、コンジュゲートＤＮＡ２５２はサンプルＤＮＡに比べて相対的に過剰に存在しているので、第１のサンプルＤＮＡ２１０は優先的にコンジュゲートＤＮＡ２５２と結合し、複合体２３１を形成する（図１ｂ）。また、このときサンプルＤＮＡが第２のサンプルＤＮＡである場合、相補的な配列ではないのでコンジュゲートＤＮＡ２５２に結合しない（図２）。
【００２１】
その後、密閉流路１３０内で電気泳動する様子を図１ｃに示した。密閉流路１３０の中に充填された充填剤１２によってそれぞれのサンプルＤＮＡは分子篩効果により、分子量の違いで分離される。コンジュゲートＤＮＡ２５２に結合していない第２のサンプルＤＮＡ２１１は流れやすく、第１のサンプルＤＮＡとコンジュゲートＤＮＡ２５２からなる複合体２３１はコンジュゲートＤＮＡ２５２のポリマー２５１のおもりの効果により流れにくく、第２のサンプルＤＮＡ２１１に比べて遅く検出される。例えば、第１のサンプルＤＮＡ２１０がコンジュゲートＤＮＡ２５２とハイブリダイズした後、ヘアピンループ構造を形成した場合では、複合体２３１は図１ｃに示す構造になる。
【００２２】
図７に、従来の技術でのサンプルＤＮＡ調整方法と測定方法を示す。従来の方法では９５℃でサンプルＤＮＡを熱変性した後（図７ａ）、４℃まで急冷することにより一本鎖の状態に変性させ（図７ｂ）、密閉流路内で電気泳動を行っている（図７ｃ）。第１のサンプルＤＮＡ２１０は密閉流路に充填されているコンジュゲートＤＮＡ２５２と結合と解離を繰り返しながら、密閉流路内を移動していく。しかし、第１のサンプルＤＮＡ２１０がヘアピンループ構造を形成してしまった場合は、第１のサンプルＤＮＡ２１０はコンジュゲートＤＮＡ２５２と結合することができず（図７ｃ）、第１のサンプルＤＮＡ２１０はコンジュゲートＤＮＡ２５２に結合しない第２のサンプルＤＮＡ２１１との間で移動度に差を持たせることができない。
【００２３】
＜充填剤の作製＞
密閉流路に充填する充填剤１２は高分子化合物なら何でもよく、例えばポリアクリルアミドやポリエチレングリコールなどの重合体や多糖やタンパク質等が適している。これらの充填剤を密閉流路に充填できる粘度範囲（１ｃｐ〜３５０ｃｐ）で調整し、充填剤として用いる。
【００２４】
＜緩衝液の調整＞
緩衝能が高く、導電性のある溶液なら何でもよいが、５０ｍＭ以上の塩濃度は電気泳動の結果に悪影響を与えるため、ＳＳＣに代表されるような高塩濃度のハイブリバッファは適さない。
【００２５】
＜測定ステップ＞
続いて、キャピラリー電気泳動装置での測定方法について説明する。図３に装置の構成を示す。正電極１３３を配置した第１容器１３１と負電極１３４を配置した第２容器１３２との間を、密閉流路１３０で連絡している。前記密閉流路１３０はコーティングされた内径５０〜１００μｍのキャピラリー管やマイクロプレート上に微細加工で溝を掘った流路である。検出系はスリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３でレーザー１５１から照射される６３０ｎｍの励起光をカットして励起光を取り除き、蛍光色素から発生した６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出してプリアンプ１５５で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む仕様になっている。
【００２６】
図４にキャピラリー管内部を示す。充填剤１２を充填した密閉流路１３０の一端に調整した混合液２３０を注入する。そして、密閉流路１３０の両端を緩衝液１１で満たす。２５ｃｍのキャピラリー管を使用した場合、６ｋＶの電圧を印加し、およそ３〜１６μＡの電流を流して複合体の電気泳動を行う。
【００２７】
ＰＣＲ産物の５‘末端に標識された標識剤２０３にレーザー１５１を照射し、特定波長をフォトマルチプライヤー１５４で検出する。電気泳動においては、混合液２３０のうち、図５に示すようにまず余剰のプライマーに標識された標識剤２０３のピークが検出される。その次にコンジュゲートＤＮＡ２５２に結合しない、第２のサンプルＤＮＡ２１１が検出され、コンジュゲートＤＮＡ２５２に結合した第１のサンプルＤＮＡ２１０の複合体２３１が検出される。
【００２８】
以下、具体的な条件や試料を示して本発明の実施の形態をより詳細に説明するが、本発明はこれに記載したＰＣＲ産物や調整条件その他に限定されるものではない。
【００２９】
〔菌体からのＤＮＡ抽出〕
ＬＢ培地で培養した大腸菌５コロニーを滅菌水に懸濁し、９５℃で１０分間加熱後、１３０００ｇで５分間遠心し、上清をゲノムＤＮＡとして回収した。
【００３０】
〔ＰＣＲ産物の調整〕
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型は大腸菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いた。フォワード側のプライマーは標識剤としてＣｙ５で標識した、５‘−（Ｃｙ５）−ＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＣ−３'（フォワードプライマー、配列表２）を、リバース側のプライマーは５‘−ＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣ−３’（リバースプライマー、配列表３）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるように加えた。反応サイクルは以下のとおりである。９５℃―１０分、（９５℃―３０秒、５０℃―３０秒、７２℃―１分）３０サイクル。これにより３４６ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。
【００３１】
〔緩衝液の調整〕
Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．４）を終濃度５０ｍＭで使用した。
【００３２】
〔コンジュゲートＤＮＡの作製〕
第１のサンプルＤＮＡ２１０に相補的な配列を持つアミノ化ＤＮＡを２ｍＭになるように水またはＴＥ（ｐＨ７）を加えて、調整した。アミノ化ＤＮＡの配列は５‘−(ＮＨ2)−ＣＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴ−３’（配列表１）である。分子量５，０００のＮＨＳ−ＰＥＧにＤＭＳＯを４４５ｕｌ加え、撹拌した。溶かしたＰＥＧ−ＮＨＳにアミノ化ＤＮＡを５０ｕｌと１Ｍの炭酸水素ナトリウムを５ｕｌ加え、２０℃で３時間振とう後、分子量３５００を分画する透析膜を用いて、一晩透析した後、乾燥した。コンジュゲートＤＮＡは１００ｕＭになるよう緩衝液で溶かした。
【００３３】
〔コンジュゲートＤＮＡとサンプルＤＮＡのハイブリダイゼーション工程〕
混合液を以下の要領で調整し、複合体２３１を作製した。
【００３４】
＜混合液２３０＞
ＰＣＲ産物 ２ｕｌ
１００ｕＭ コンジュゲートＤＮＡ ２ｕｌ
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ １０ｕｌ
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｕｌ
Ｈ2Ｏ ５ｕｌ
↓
９５℃ ５分間
↓
室温（複合体２３１の調整）
[キャピラリー電気泳動装置によるＳＮＰ測定]
前述した図３に示すキャピラリー電気泳動装置にてＳＮＰの測定を行った。前記密閉流路１３０はコーティングされた内径１００ｕｍのキャピラリー管（大塚電子製）を使用した。そして、キャピラリー電気泳動を行うための動作シーケンスを以下に記す。
【００３５】
＜動作シーケンス＞
緩衝液１１を６０秒注入
↓
緩衝液１１を含む充填剤１２を９０秒注入
↓
混合液２３０を３秒注入
↓
６ｋＶの電圧を両電極１３３、１３４間に印加
詳細を以下に記す。緩衝液１１を含む充填剤１２を充たした密閉流路１３０に、図４に示すように混合液２３０を注入する。そして、この後、両電極１３３、１３４間に可変電源部１３５により６ｋＶの電圧を印加して、密閉流路１３０内の混合液２３０を電気泳動させ、該混合液２３０中の複合体２３１と第２のサンプルＤＮＡ２１１を分子量の差により（おもりに引っ張られる抵抗分の差により）分離した。なお、検出部１５０において、前述したように、プライマーに標識剤２０３を標識して、該標識剤２０３から発せられる蛍光だけを検出するようにしておけば、前記第１のサンプルＤＮＡ２１０と前記第２のサンプルＤＮＡ２１１の相補鎖の検出を阻止できる。
【００３６】
検出部では、スリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３で前記レーザー１５１から照射される６３０ｎｍの励起光をカットして励起光を取り除き、標識剤２０３としてＣｙ５の６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出してプリアンプ１５５で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む。
【００３７】
図５に、第１のサンプルＤＮＡ２１０に相補的な配列を持つコンジュゲートＤＮＡ２５２を用いてキャピラリー電気泳動装置で測定した結果を示す。フォワード側のプライマーが検出された後、第２のサンプルＤＮＡ２１１、そして複合体２３１の順番でピークを検出した。以上の結果からわかるように、残存するプライマーが検出された後は、第２のサンプルＤＮＡ２１１が時間的に速く検出され、その後、移動速度の遅い第１のサンプルＤＮＡ２１０からなる複合体２３１が検出されていることから、目的の遺伝子（第１のサンプルＤＮＡ２１０）とそれ以外の遺伝子が混入していることがわかった。もし、目的の遺伝子のみが存在していたら、複合体２３１のみのピークが検出され、逆に目的の遺伝子が存在していなかったら、第２のサンプルＤＮＡ２１１のピークのみが検出されることになる。
【００３８】
以上、説明したように、本発明による遺伝子分析方法を用いて特定遺伝子の検出を行えば、ＤＮＡの長さに関わらず、精度よく遺伝子検出を行うことができる。
【００３９】
〔効果的な例の高次構造〕
図６に本実施例で特に効果的である配列の一例を示した。このＰＣＲの増幅産物の長さは６０ｂｐで、従来例でも測定できていた長さである。しかし、図６に示す配列のヘアピンループ構造の有無をオリゴ解析ソフトで調べると、コンジュゲートＤＮＡに結合する領域２１６（太線）の大部分がヘアピンループ構造の形成によって、ふさがれている状態にある。このような場合に、本発明の手法は特に有効である。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明にかかる遺伝子分析方法は、構造的に不安定で高次構造を形成するサンプルＤＮＡのプローブＤＮＡとの相互作用を見る分析方法において、サンプルＤＮＡの配列や長さに関係なく、測定できる手法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の実施の形態１における混合ステップの図
【図２】コンジュゲートＤＮＡのサンプルＤＮＡに対する選択性を表す図
【図３】キャピラリー電気泳動装置の構成を示す図
【図４】キャピラリー電気泳動装置でのキャピラリー管内を示す図
【図５】本実施の形態１の方法を適用して測定した時に検出される波形を示したグラフ
【図６】高次構造を形成した第１のサンプルＤＮＡの例を示した図
【図７】従来技術における遺伝子分析方法でのサンプルＤＮＡ調整方法を示す図
【符号の説明】
【００４２】
１１ 緩衝液
１２ 充填剤
１３０ 密閉流路
１３１ 第１の容器
１３２ 第２の容器
１３３ 正電極
１３４ 負電極
１３５ 可変電源部
１４０ 制御部
１５０ 検出部
１５１ レーザー
１５２ スリット
１５３ フィルター
１５４ フォトマルチプライヤー
１５５ プリアンプ
１５６ Ａ／Ｄコンバータ
２０３ 標識剤
２１０ 第１のサンプルＤＮＡ
２１１ 第２のサンプルＤＮＡ
２１２ 第１のサンプルＤＮＡの相補鎖
２１６ 第１のサンプルＤＮＡ中のコンジュゲートＤＮＡの結合領域
２５０ プローブＤＮＡ
２５１ ポリマー
２５２ コンジュゲートＤＮＡ
２３０ 第１のサンプルＤＮＡと第２のサンプルＤＮＡの両方もしくはどちらか一方を含むＰＣＲ産物とコンジュゲートＤＮＡを混ぜた混合液
２３１ 第１のサンプルＤＮＡと結合したコンジュゲートＤＮＡの複合体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある特定の遺伝子を検出する遺伝子分析方法に関し、特にプローブＤＮＡとの親和性の差によりある特定遺伝子の検出を行う技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡのＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；一塩基多型と呼ばれる。）が注目されている。このＳＮＰは、ヒトや動物に普遍に見られるが、同じ種でも個体によりＳＮＰが異なる。すなわちＳＮＰの違いを調べることにより、各個人の疾患に対する罹患率や薬剤に対する効果や感受性を予測し、個人に合わせた医療やヒトや動物の親子関係の特定できる可能性が考えらてれている。
【０００３】
ＳＮＰや一部の塩基配列が異なるＤＮＡを調べる方法として、アフィニティキャピラリー電気泳動法を利用した遺伝子診断方法がある。この方法は、まず目的配列に相補的なプローブＤＮＡに高分子化合物を結合させたコンジュゲートＤＮＡを作製する。このコンジュゲートＤＮＡは、高分子化合物のため、キャピラリー内で移動し難くなる性質を持つ。このコンジュゲートＤＮＡを電気浸透流が起きないようにコーティングされたキャピラリー管に充填し、陰極側から一本鎖のサンプルＤＮＡを注入して電圧を印加する。その際に、コンジュゲートＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡは、充填したコンジュゲートＤＮＡとの親和性が高いので泳動が妨げられる。このときＳＮＰをもったサンプルＤＮＡと完全に相補的な配列を持ったサンプルＤＮＡとでコンジュゲートＤＮＡとのハイブリダイゼーションにおける親和性の差を電気泳動の移動度で比較することにより、ＳＮＰを持つＤＮＡを明瞭に識別出来る（例えば非特許文献１を参照。）。
【０００４】
この技術はＳＮＰに限らず、発現解析や遺伝子診断など、特定の遺伝子の有無を調べるときなど幅広い分野に応用できる。
【非特許文献１】Detection of single-base mutation by affinity capillary electrophoresis using a DNA-polyacrylamide conjugate; Kae Sato, Akira Inoue, Kazuo Hosokawa, Mizuo Maeda; Electrophoresis 2005, (26) 3076-3080
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記従来の構成では、目的の遺伝子の判別方法は、密閉流路内で電気泳動を行い、一本鎖ＤＮＡとプローブＤＮＡとの親和性の差により判断していた。しかし、一本鎖ＤＮＡは構造的に不安定であり、サンプルＤＮＡが高次構造（ヘアピンループ構造）を形成するような配列を持った場合や長鎖の場合では、高次構造の形成により、密閉流路内のプローブＤＮＡと結合することができず、目的の遺伝子の有無を正確に判別できないという課題を有していた。
【０００６】
本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、サンプルＤＮＡの長さや配列に制限されることなく、遺伝子分析を行うことができる遺伝子分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記従来の課題を解決するために、本発明の遺伝子分析方法は、標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡを含む二本鎖ＤＮＡと標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡのＤＮＡ配列とは異なる配列を持つ第２のサンプルＤＮＡとを含む二本鎖ＤＮＡの両方もしくは、どちらか一方を含むＰＣＲ産物を作製する調整ステップと、前記第１のサンプルＤＮＡの特異的な配列に対して相補的な配列を持つプローブＤＮＡにその電気泳動速度を遅らせる物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを作製するコンジュゲートＤＮＡ作製ステップと、前記ＰＣＲ産物のモル数よりも多く前記コンジュゲートＤＮＡを加えた混合液を作製する混合ステップと、前記混合液を所定の値で加熱する加熱ステップと、加熱した前記混合液を室温に戻す過程で前記ＰＣＲ産物の第１のサンプルＤＮＡと前記コンジュゲートＤＮＡを結合させて複合体を形成する複合体形成ステップと、前記混合液を電気泳動させることにより前記第１のサンプルＤＮＡあるいは第２のサンプルＤＮＡの標識剤を測定する測定ステップとを含むことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００８】
サンプルＤＮＡの長さや配列に制限されることなく、遺伝子分析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明の遺伝子解析方法の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
（実施の形態１）
図１を用いて本発明による目的の遺伝子のコンジュゲートＤＮＡを用いて測定する方法を説明する。
【００１０】
＜ＰＣＲ産物の作製＞
まず本発明の実施の形態１におけるＰＣＲ産物を作製する調整ステップの詳細を説明する。本実施の形態１で解析するＰＣＲ産物は、植物、動物、または人の細胞や血液等から入手したＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法によって増幅する。
【００１１】
ＰＣＲ産物は第１のサンプルＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡと第２のサンプルＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡの両方もしくはどちらか一方からなる。本実施例ではフォワード側かリバース側のどちらか一方のプライマーの５’末端に標識剤を修飾したものを使用する。どちらのプライマーに標識をつけても構わないが、本発明では標識剤がついた配列をサンプルＤＮＡとする。
【００１２】
増幅断片の長さは１０００ｂｐ以下である。１０００ｂｐ以上の長さの一本鎖ＤＮＡは、相補鎖と再結合する結合強度が強く二本鎖ＤＮＡに戻りやすいことや、コンジュゲートＤＮＡと結合した第１のサンプルＤＮＡと結合しない第２のサンプルＤＮＡの移動度の差が少ないことが考えられ、充分な分離が得られないことが考えられ、好ましくない。
【００１３】
＜コンジュゲートＤＮＡの調整＞
次にコンジュゲートＤＮＡ２５２の作製について詳細に説明する。第１のサンプルＤＮＡと相補的な配列を持つプローブＤＮＡ２５０とポリマー２５１を結合させることにより作製できたものをコンジュゲートＤＮＡ２５２とする。ここで、ポリマー２５１は電気泳動時のサンプルＤＮＡの速度に対して何らかの影響を与える物質で構成されるものであり、電荷を持たない高分子物質やたんぱく質等が挙げられる。例えば一般的に使用される高分子物質として、ポリエチレングリコールがあり、その分子量は数百から数千である。
【００１４】
分子量が数百より小さくなると、コンジュゲートＤＮＡに結合したサンプルＤＮＡと結合しない第２のサンプルＤＮＡとの電気泳動速度差が少なくなり、両者の分離が出来ないので好ましくない。一方、分子量が数千より大きくなると、コンジュゲートＤＮＡに結合したサンプルＤＮＡは電気泳動により移動できないため好ましくない。
【００１５】
また、プローブＤＮＡ２５０は、第１のサンプルＤＮＡ２１０の標識剤２０３が結合した配列の中の特異的な配列に対して相補的な配列を設定する。その長さは２０塩基以上（Ｔｍ値が４０度以上）１００塩基以下にする。プローブＤＮＡ２５０が上述した長さより短い場合、第１のサンプルＤＮＡ２１０との結合力が弱すぎて、電気泳動の移動中に第１のサンプルＤＮＡ２１０とコンジュゲートＤＮＡ２５２の結合が離れる可能性があり、好ましくない。一方、プローブＤＮＡ２５０が１００塩基より長い場合は、合成オリゴを作製することが困難なことや、コンジュゲートＤＮＡ２５２が非特異的な結合をする可能性があること、また、プローブＤＮＡ２５０が高次構造を形成してしまうので好ましくない。
【００１６】
＜ＰＣＲ産物とコンジュゲートＤＮＡの混合液の調整＞
ＰＣＲ産物とコンジュゲートＤＮＡ２５２を混合し、ハイブリダイズさせる際の条件について説明する。ゲル電気泳動やプライマーの濃度から、ＰＣＲ産物の濃度を算出し、その値に対して５倍以上の濃度になるようにコンジュゲートＤＮＡ２５２を加える。コンジュゲートＤＮＡ２５２の濃度はＰＣＲ産物の濃度に対して５〜６００倍とするのが適当である。５倍以下だと第１のサンプルＤＮＡ２１０が結合するための十分な量ではなく、６００倍以上だと高濃度のコンジュゲートＤＮＡ２５２を必要とし、コストの面でロスが大きい。
【００１７】
これらの調整する時の緩衝液１１はハイブリダイズさせる際に適当な緩衝液であれば、何でもよい。しかし、調整後はキャピラリー電気泳動を行うので、多量の塩が混入したＳＳＣは好ましくない。そして、この緩衝液１１には第１のサンプルＤＮＡ２１０とコンジュゲートＤＮＡ２５２の結合力を高めるため、２価の陽イオンを加えるとよい。具体的にはマグネシウムが挙げられる。
【００１８】
以下に混合液を構成する物質の概略を記す。
【００１９】
＜混合液２３０の概略＞
（１）ＰＣＲ産物
（２）コンジュゲートＤＮＡ２５２（ＰＣＲ産物の濃度に対して５〜６００倍）
（３）緩衝液１１（高塩濃度のものでなければ何でも良い）
（４）２価の陽イオン（例えばマグネシウムイオン）
＜ＰＣＲ産物の熱変性＞
図１を用いて本発明のサンプルＤＮＡの調整方法と測定方法を説明する。上記の第１のサンプルＤＮＡと第２のサンプルＤＮＡの両方もしくはどちらか一方のＰＣＲ産物を含む混合液２３０を９５℃で熱し、ＰＣＲ産物を一本鎖の状態に解離する（図１ａでは第１のサンプルＤＮＡを例に示す。）。
【００２０】
加熱後、混合液２３０を室温までゆっくりと冷却する。一本鎖ＤＮＡは水素結合で引き寄せられる配列（相補的な配列）で二本鎖を形成しようとするが、その時、コンジュゲートＤＮＡ２５２はサンプルＤＮＡに比べて相対的に過剰に存在しているので、第１のサンプルＤＮＡ２１０は優先的にコンジュゲートＤＮＡ２５２と結合し、複合体２３１を形成する（図１ｂ）。また、このときサンプルＤＮＡが第２のサンプルＤＮＡである場合、相補的な配列ではないのでコンジュゲートＤＮＡ２５２に結合しない（図２）。
【００２１】
その後、密閉流路１３０内で電気泳動する様子を図１ｃに示した。密閉流路１３０の中に充填された充填剤１２によってそれぞれのサンプルＤＮＡは分子篩効果により、分子量の違いで分離される。コンジュゲートＤＮＡ２５２に結合していない第２のサンプルＤＮＡ２１１は流れやすく、第１のサンプルＤＮＡとコンジュゲートＤＮＡ２５２からなる複合体２３１はコンジュゲートＤＮＡ２５２のポリマー２５１のおもりの効果により流れにくく、第２のサンプルＤＮＡ２１１に比べて遅く検出される。例えば、第１のサンプルＤＮＡ２１０がコンジュゲートＤＮＡ２５２とハイブリダイズした後、ヘアピンループ構造を形成した場合では、複合体２３１は図１ｃに示す構造になる。
【００２２】
図７に、従来の技術でのサンプルＤＮＡ調整方法と測定方法を示す。従来の方法では９５℃でサンプルＤＮＡを熱変性した後（図７ａ）、４℃まで急冷することにより一本鎖の状態に変性させ（図７ｂ）、密閉流路内で電気泳動を行っている（図７ｃ）。第１のサンプルＤＮＡ２１０は密閉流路に充填されているコンジュゲートＤＮＡ２５２と結合と解離を繰り返しながら、密閉流路内を移動していく。しかし、第１のサンプルＤＮＡ２１０がヘアピンループ構造を形成してしまった場合は、第１のサンプルＤＮＡ２１０はコンジュゲートＤＮＡ２５２と結合することができず（図７ｃ）、第１のサンプルＤＮＡ２１０はコンジュゲートＤＮＡ２５２に結合しない第２のサンプルＤＮＡ２１１との間で移動度に差を持たせることができない。
【００２３】
＜充填剤の作製＞
密閉流路に充填する充填剤１２は高分子化合物なら何でもよく、例えばポリアクリルアミドやポリエチレングリコールなどの重合体や多糖やタンパク質等が適している。これらの充填剤を密閉流路に充填できる粘度範囲（１ｃｐ〜３５０ｃｐ）で調整し、充填剤として用いる。
【００２４】
＜緩衝液の調整＞
緩衝能が高く、導電性のある溶液なら何でもよいが、５０ｍＭ以上の塩濃度は電気泳動の結果に悪影響を与えるため、ＳＳＣに代表されるような高塩濃度のハイブリバッファは適さない。
【００２５】
＜測定ステップ＞
続いて、キャピラリー電気泳動装置での測定方法について説明する。図３に装置の構成を示す。正電極１３３を配置した第１容器１３１と負電極１３４を配置した第２容器１３２との間を、密閉流路１３０で連絡している。前記密閉流路１３０はコーティングされた内径５０〜１００μｍのキャピラリー管やマイクロプレート上に微細加工で溝を掘った流路である。検出系はスリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３でレーザー１５１から照射される６３０ｎｍの励起光をカットして励起光を取り除き、蛍光色素から発生した６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出してプリアンプ１５５で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む仕様になっている。
【００２６】
図４にキャピラリー管内部を示す。充填剤１２を充填した密閉流路１３０の一端に調整した混合液２３０を注入する。そして、密閉流路１３０の両端を緩衝液１１で満たす。２５ｃｍのキャピラリー管を使用した場合、６ｋＶの電圧を印加し、およそ３〜１６μＡの電流を流して複合体の電気泳動を行う。
【００２７】
ＰＣＲ産物の５‘末端に標識された標識剤２０３にレーザー１５１を照射し、特定波長をフォトマルチプライヤー１５４で検出する。電気泳動においては、混合液２３０のうち、図５に示すようにまず余剰のプライマーに標識された標識剤２０３のピークが検出される。その次にコンジュゲートＤＮＡ２５２に結合しない、第２のサンプルＤＮＡ２１１が検出され、コンジュゲートＤＮＡ２５２に結合した第１のサンプルＤＮＡ２１０の複合体２３１が検出される。
【００２８】
以下、具体的な条件や試料を示して本発明の実施の形態をより詳細に説明するが、本発明はこれに記載したＰＣＲ産物や調整条件その他に限定されるものではない。
【００２９】
〔菌体からのＤＮＡ抽出〕
ＬＢ培地で培養した大腸菌５コロニーを滅菌水に懸濁し、９５℃で１０分間加熱後、１３０００ｇで５分間遠心し、上清をゲノムＤＮＡとして回収した。
【００３０】
〔ＰＣＲ産物の調整〕
ＰＣＲの増幅はＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて増幅した。鋳型は大腸菌から抽出したゲノムＤＮＡを用いた。フォワード側のプライマーは標識剤としてＣｙ５で標識した、５‘−（Ｃｙ５）−ＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＣ−３'（フォワードプライマー、配列表２）を、リバース側のプライマーは５‘−ＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣ−３’（リバースプライマー、配列表３）を、それぞれ終濃度５００ｎＭになるように加えた。反応サイクルは以下のとおりである。９５℃―１０分、（９５℃―３０秒、５０℃―３０秒、７２℃―１分）３０サイクル。これにより３４６ｂｐのＰＣＲ産物を作製した。
【００３１】
〔緩衝液の調整〕
Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ７．４）を終濃度５０ｍＭで使用した。
【００３２】
〔コンジュゲートＤＮＡの作製〕
第１のサンプルＤＮＡ２１０に相補的な配列を持つアミノ化ＤＮＡを２ｍＭになるように水またはＴＥ（ｐＨ７）を加えて、調整した。アミノ化ＤＮＡの配列は５‘−(ＮＨ2)−ＣＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴ−３’（配列表１）である。分子量５，０００のＮＨＳ−ＰＥＧにＤＭＳＯを４４５ｕｌ加え、撹拌した。溶かしたＰＥＧ−ＮＨＳにアミノ化ＤＮＡを５０ｕｌと１Ｍの炭酸水素ナトリウムを５ｕｌ加え、２０℃で３時間振とう後、分子量３５００を分画する透析膜を用いて、一晩透析した後、乾燥した。コンジュゲートＤＮＡは１００ｕＭになるよう緩衝液で溶かした。
【００３３】
〔コンジュゲートＤＮＡとサンプルＤＮＡのハイブリダイゼーション工程〕
混合液を以下の要領で調整し、複合体２３１を作製した。
【００３４】
＜混合液２３０＞
ＰＣＲ産物 ２ｕｌ
１００ｕＭ コンジュゲートＤＮＡ ２ｕｌ
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ １０ｕｌ
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｕｌ
Ｈ2Ｏ ５ｕｌ
↓
９５℃ ５分間
↓
室温（複合体２３１の調整）
[キャピラリー電気泳動装置によるＳＮＰ測定]
前述した図３に示すキャピラリー電気泳動装置にてＳＮＰの測定を行った。前記密閉流路１３０はコーティングされた内径１００ｕｍのキャピラリー管（大塚電子製）を使用した。そして、キャピラリー電気泳動を行うための動作シーケンスを以下に記す。
【００３５】
＜動作シーケンス＞
緩衝液１１を６０秒注入
↓
緩衝液１１を含む充填剤１２を９０秒注入
↓
混合液２３０を３秒注入
↓
６ｋＶの電圧を両電極１３３、１３４間に印加
詳細を以下に記す。緩衝液１１を含む充填剤１２を充たした密閉流路１３０に、図４に示すように混合液２３０を注入する。そして、この後、両電極１３３、１３４間に可変電源部１３５により６ｋＶの電圧を印加して、密閉流路１３０内の混合液２３０を電気泳動させ、該混合液２３０中の複合体２３１と第２のサンプルＤＮＡ２１１を分子量の差により（おもりに引っ張られる抵抗分の差により）分離した。なお、検出部１５０において、前述したように、プライマーに標識剤２０３を標識して、該標識剤２０３から発せられる蛍光だけを検出するようにしておけば、前記第１のサンプルＤＮＡ２１０と前記第２のサンプルＤＮＡ２１１の相補鎖の検出を阻止できる。
【００３６】
検出部では、スリット１５２で光量制御を行い、フィルター１５３で前記レーザー１５１から照射される６３０ｎｍの励起光をカットして励起光を取り除き、標識剤２０３としてＣｙ５の６６０ｎｍの蛍光をフォトマルチプライヤー１５４で検出してプリアンプ１５５で増幅し、Ａ／Ｄコンバータ１５６で信号をデジタル変換して制御部１４０に取り込む。
【００３７】
図５に、第１のサンプルＤＮＡ２１０に相補的な配列を持つコンジュゲートＤＮＡ２５２を用いてキャピラリー電気泳動装置で測定した結果を示す。フォワード側のプライマーが検出された後、第２のサンプルＤＮＡ２１１、そして複合体２３１の順番でピークを検出した。以上の結果からわかるように、残存するプライマーが検出された後は、第２のサンプルＤＮＡ２１１が時間的に速く検出され、その後、移動速度の遅い第１のサンプルＤＮＡ２１０からなる複合体２３１が検出されていることから、目的の遺伝子（第１のサンプルＤＮＡ２１０）とそれ以外の遺伝子が混入していることがわかった。もし、目的の遺伝子のみが存在していたら、複合体２３１のみのピークが検出され、逆に目的の遺伝子が存在していなかったら、第２のサンプルＤＮＡ２１１のピークのみが検出されることになる。
【００３８】
以上、説明したように、本発明による遺伝子分析方法を用いて特定遺伝子の検出を行えば、ＤＮＡの長さに関わらず、精度よく遺伝子検出を行うことができる。
【００３９】
〔効果的な例の高次構造〕
図６に本実施例で特に効果的である配列の一例を示した。このＰＣＲの増幅産物の長さは６０ｂｐで、従来例でも測定できていた長さである。しかし、図６に示す配列のヘアピンループ構造の有無をオリゴ解析ソフトで調べると、コンジュゲートＤＮＡに結合する領域２１６（太線）の大部分がヘアピンループ構造の形成によって、ふさがれている状態にある。このような場合に、本発明の手法は特に有効である。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明にかかる遺伝子分析方法は、構造的に不安定で高次構造を形成するサンプルＤＮＡのプローブＤＮＡとの相互作用を見る分析方法において、サンプルＤＮＡの配列や長さに関係なく、測定できる手法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の実施の形態１における混合ステップの図
【図２】コンジュゲートＤＮＡのサンプルＤＮＡに対する選択性を表す図
【図３】キャピラリー電気泳動装置の構成を示す図
【図４】キャピラリー電気泳動装置でのキャピラリー管内を示す図
【図５】本実施の形態１の方法を適用して測定した時に検出される波形を示したグラフ
【図６】高次構造を形成した第１のサンプルＤＮＡの例を示した図
【図７】従来技術における遺伝子分析方法でのサンプルＤＮＡ調整方法を示す図
【符号の説明】
【００４２】
１１ 緩衝液
１２ 充填剤
１３０ 密閉流路
１３１ 第１の容器
１３２ 第２の容器
１３３ 正電極
１３４ 負電極
１３５ 可変電源部
１４０ 制御部
１５０ 検出部
１５１ レーザー
１５２ スリット
１５３ フィルター
１５４ フォトマルチプライヤー
１５５ プリアンプ
１５６ Ａ／Ｄコンバータ
２０３ 標識剤
２１０ 第１のサンプルＤＮＡ
２１１ 第２のサンプルＤＮＡ
２１２ 第１のサンプルＤＮＡの相補鎖
２１６ 第１のサンプルＤＮＡ中のコンジュゲートＤＮＡの結合領域
２５０ プローブＤＮＡ
２５１ ポリマー
２５２ コンジュゲートＤＮＡ
２３０ 第１のサンプルＤＮＡと第２のサンプルＤＮＡの両方もしくはどちらか一方を含むＰＣＲ産物とコンジュゲートＤＮＡを混ぜた混合液
２３１ 第１のサンプルＤＮＡと結合したコンジュゲートＤＮＡの複合体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡを含む二本鎖ＤＮＡと標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡのＤＮＡ配列とは異なる配列を持つ第２のサンプルＤＮＡとを含む二本鎖ＤＮＡの両方もしくは、どちらか一方を含むＰＣＲ産物を作製する調整ステップと、
前記第１のサンプルＤＮＡの特異的な配列に対して相補的な配列を持つプローブＤＮＡにその電気泳動速度を遅らせる物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを作製するコンジュゲートＤＮＡ作製ステップと、
前記ＰＣＲ産物のモル数よりも多く前記コンジュゲートＤＮＡを加えた混合液を作製する混合ステップと、
前記混合液を所定の値で加熱する加熱ステップと、
加熱した前記混合液を室温に戻す過程で前記ＰＣＲ産物の第１のサンプルＤＮＡと前記コンジュゲートＤＮＡを結合させて複合体を形成する複合体形成ステップと、
前記混合液を電気泳動させることにより前記第１のサンプルＤＮＡあるいは第２のサンプルＤＮＡの標識剤を測定する測定ステップとを含む遺伝子分析方法。
【請求項２】
前記プローブＤＮＡは、２０塩基以上１００塩基以下である請求項１に記載の遺伝子分析方法。
【請求項３】
前記コンジュゲートＤＮＡのモル量は、前記ＰＣＲ産物に対して５倍以上である請求項１に記載の遺伝子分析方法。
【請求項４】
前記測定ステップは、
高分子化合物からなるポリマーを密閉流路に充填する充填ステップと、
前記複合体形成ステップで得られた混合液を前記密閉流路に注入する注入ステップと、
前記密閉流路中の前記混合液を電気泳動させる分離ステップと、
前記密閉流路上に備えた検出部によって前記第１のサンプルＤＮＡの標識剤もしくは前記第２のサンプルＤＮＡの標識剤の少なくとも一つを検知する検知ステップとを含む請求項１に記載の遺伝子分析方法。
【請求項５】
前記電気泳動速度を遅らせる物質は、非電気泳動物質である請求項１に記載の遺伝子分析方法。
【請求項６】
前記非電気泳動物質は、高分子化合物である請求項５に記載の遺伝子分析方法。
【請求項７】
前記非電気泳動物質の分子量は、数百から数千である請求項５に記載の遺伝子分析方法。
【請求項１】
標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡを含む二本鎖ＤＮＡと標識剤により修飾された第１のサンプルＤＮＡのＤＮＡ配列とは異なる配列を持つ第２のサンプルＤＮＡとを含む二本鎖ＤＮＡの両方もしくは、どちらか一方を含むＰＣＲ産物を作製する調整ステップと、
前記第１のサンプルＤＮＡの特異的な配列に対して相補的な配列を持つプローブＤＮＡにその電気泳動速度を遅らせる物質を結合したコンジュゲートＤＮＡを作製するコンジュゲートＤＮＡ作製ステップと、
前記ＰＣＲ産物のモル数よりも多く前記コンジュゲートＤＮＡを加えた混合液を作製する混合ステップと、
前記混合液を所定の値で加熱する加熱ステップと、
加熱した前記混合液を室温に戻す過程で前記ＰＣＲ産物の第１のサンプルＤＮＡと前記コンジュゲートＤＮＡを結合させて複合体を形成する複合体形成ステップと、
前記混合液を電気泳動させることにより前記第１のサンプルＤＮＡあるいは第２のサンプルＤＮＡの標識剤を測定する測定ステップとを含む遺伝子分析方法。
【請求項２】
前記プローブＤＮＡは、２０塩基以上１００塩基以下である請求項１に記載の遺伝子分析方法。
【請求項３】
前記コンジュゲートＤＮＡのモル量は、前記ＰＣＲ産物に対して５倍以上である請求項１に記載の遺伝子分析方法。
【請求項４】
前記測定ステップは、
高分子化合物からなるポリマーを密閉流路に充填する充填ステップと、
前記複合体形成ステップで得られた混合液を前記密閉流路に注入する注入ステップと、
前記密閉流路中の前記混合液を電気泳動させる分離ステップと、
前記密閉流路上に備えた検出部によって前記第１のサンプルＤＮＡの標識剤もしくは前記第２のサンプルＤＮＡの標識剤の少なくとも一つを検知する検知ステップとを含む請求項１に記載の遺伝子分析方法。
【請求項５】
前記電気泳動速度を遅らせる物質は、非電気泳動物質である請求項１に記載の遺伝子分析方法。
【請求項６】
前記非電気泳動物質は、高分子化合物である請求項５に記載の遺伝子分析方法。
【請求項７】
前記非電気泳動物質の分子量は、数百から数千である請求項５に記載の遺伝子分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−２４７２１４（Ｐ２００９−２４７２１４Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９４６８３（Ｐ２００８−９４６８３）
【出願日】平成２０年４月１日（２００８．４．１）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月１日（２００８．４．１）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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