遺伝子導入剤組成物
【課題】非ウイルスベクター及びウイルスベクターの欠点を解決し、両者の利点を兼備する、遺伝子導入活性に著しく優れた遺伝子導入剤組成物を提供する。
【解決手段】カチオン性ポリマー、核酸、及びアデノウイルスの少なくとも一部を含む遺伝子導入剤組成物。該カチオン性ポリマーは、カチオン性ポリマー鎖を４本以上有するスター型カチオン性ポリマーであることが好ましく、特に、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としてのカチオン性ポリマー鎖が結合したものであることが好ましい。
【解決手段】カチオン性ポリマー、核酸、及びアデノウイルスの少なくとも一部を含む遺伝子導入剤組成物。該カチオン性ポリマーは、カチオン性ポリマー鎖を４本以上有するスター型カチオン性ポリマーであることが好ましく、特に、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としてのカチオン性ポリマー鎖が結合したものであることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤として、カチオン性ポリマーとアデノウイルスとを併用した新規遺伝子導入剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。
【０００３】
遺伝子導入技術には大きく分けてウイルスベクターと非ウイルスベクターとの２つが存在する。
ウイルスベクターによる遺伝子導入は、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、センダイウイルス、レトロウイルスなどを改変（野生型ウイルスを無毒化し、目的の核酸を挿入して作成）し、細胞へ作用させることで外来遺伝子を細胞へ導入する技術であり、当業者の間で広く行われている。
非ウイルスベクターは高分子ポリマーやカチオン性脂質と核酸で形成させた複合体を細胞へ取り込ませる食作用を利用したものが多く、他にはエレクトロポレーションや金コロイド銃など機械的に細胞膜を突き破って核酸を挿入する技術もある。
【０００４】
非ウイルスベクターに関して、本発明者らは、ベンゼン環から放射状にポリマー鎖が伸延するスター型ポリマーによる遺伝子導入技術を開発し、多くの提案を行ってきた（例えば、特許文献１，２）。該スター型ポリマーベクターはベンゼン環に結合する直鎖状ポリマー鎖の本数に依存して遺伝子導入活性が向上し、最大で６本のポリマー鎖を有するスター型ポリマーが最も遺伝子導入活性の高いものとなる。
【０００５】
また、同じモノマーの重合物であっても、該スター型ポリマーには、例えば、高ＣＡ比（ベクターの陽電荷数とＤＮＡの陰電荷数の比）でも細胞毒性を発現することなく遺伝子導入が可能である；スター型ポリマーに核酸を複合化させてなる核酸複合体の粒子径が大きくても（即ち、通常、粒子径が小さいほど細胞膜の透過に有利とされているが、スター型ポリマーは２００μｍ〜３００μｍ、直鎖状ポリマーでは１００μｍほどであり、粒子径の面ではスター型ポリマーは不利であると考えられるが）、細胞膜透過性が高い；などといった、直鎖状ポリマーにはない特長を有する。
【０００６】
しかし、ウイルスベクターと比較して、高分子ベクターやカチオン性脂質のベクター等の非ウイルスベクターは、遺伝子導入活性が低いという欠点があった。
特に、造血幹細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの幹細胞や神経細胞、心筋細胞など食作用の少ない細胞へはほとんど導入ができなかった。
このため、従来、生体（動物）での使用例もウイルスベクターによる研究が主流で、高分子ベクターによる生体内使用は報告がほとんどなされていないのが実状である。これは、株化細胞（試験管での実験用に、容易に培養が可能で継代による細胞の性質の変化がないように処理された細胞）には高分子ベクターも適用が可能であるものの、Ｐｒｉａｍｒｙ細胞（動物の臓器などから採取された直後の細胞）にはほとんど遺伝子導入ができないことによる。
【０００７】
これに対して、ウイルスベクターは、その強い感染力を利用して核酸を種々の細胞へ導入できる利点がある一方で、次のような欠点がある。
（１） 新種のウイルスを作成してしまう危険性（例えば、(1)一般にウイルスベクターの作成の前に組換え遺伝子を作成するが、この組換え遺伝子の作成の際に目的遺伝子に突然変異が入ってしまうことやＥ１領域の消化が十分でなく自己増殖能が残ってしまうなどの危険性や、(2)ウイルスベクターの継代中、ウイルス遺伝子の複製過程でパッケージング細胞のＤＮＡとの相同組換えによってＥ１領域を取得し、自己増殖能を獲得したウイルスが産生してしまう可能性など）や研究者自身が感染する危険性がある。
（２） −７０℃以下の温度で保存しても経時性に力価（タイター）が低下してしまうので、高力価とするために使用前に力価の確認試験や再調製や精製の工程が必要であり、感染力の強いウイルスベクターの調製には多大な時間や労力コストを必要とする。
（３） ウイルス自体にサイズがあるので、物理的に内部へ挿入できる核酸のサイズに限界があり、大きなＤＮＡなどは挿入できない。
（４） ウイルスベクターは細胞膜表面の受容体（例えばＣＡＲ（コサッキー・アデノウイルス・レセプター））を介して侵入するため、受容体を持っていない細胞へは使用できない。
（５） 組換え遺伝子実験として承認申請などが必要なケースが多く、企画から実験を行うまでに多大な時間や専用の施設が必要になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００７−７０５７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上述のような非ウイルスベクター及びウイルスベクターの欠点を解決し、両者の利点を兼備する、遺伝子導入活性に著しく優れた遺伝子導入剤組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、非ウイルスベクターであるカチオン性ポリマーベクターとウイルスベクターとしてアデノウイルスを併用することにより、ウイルスベクターの欠点を解消ないしは軽減した上で、遺伝子導入活性が飛躍的に向上し、カチオン性ポリマーベクター及びアデノウイルスベクターのそれぞれ単独では達成し得ない高い遺伝子導入活性を示すと共に、カチオン性ポリマーベクターのみでは遺伝子導入が不可能又は困難であった幹細胞やプライマリーセル（生体組織から分離した直後の細胞）にも遺伝子導入が可能な、優れた遺伝子導入剤組成物を実現することができることを見出した。
【００１１】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものであり、以下を要旨とする。
【００１２】
［１］ カチオン性ポリマー、核酸、及びアデノウイルスの少なくとも一部を含むことを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１３】
［２］ ［１］において、前記カチオン性ポリマーは、カチオン性ビニル系モノマーを主体とするポリマー鎖（以下、「カチオン性ポリマー鎖」と称す。）を有することを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１４】
［３］ ［２］において、前記カチオン性ポリマーは、前記カチオン性ポリマー鎖を４本以上有するスター型カチオン性ポリマーであることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１５】
［４］ ［３］において、前記カチオン性ポリマーは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としての前記カチオン性ポリマー鎖が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１６】
［５］ ［１］ないし［４］のいずれかにおいて、前記アデノウイルスは、失活した個体を含むことを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１７】
［６］ ［１］ないし［５］のいずれかにおいて、前記カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算して、アデノウイルス１０×１０１２ＴＣＩＤ５０以下を混合してなることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１８】
［７］ ［１］ないし［６］のいずれかにおいて、前記カチオン性ポリマーと核酸とを複合化させてなる核酸複合体に更にアデノウイルスの少なくとも一部を混合してなることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１９】
［８］ カチオン性ポリマーとアデノウイルスの少なくとも一部とを併用することを特徴とする遺伝子導入方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、カチオン性ポリマーと共にアデノウイルスを併用することにより、ウイルスベクターであるアデノウイルスの前述の欠点を解消ないしは軽減した上で、遺伝子導入活性を飛躍的に高め、カチオン性ポリマーベクター及びアデノウイルスベクターのそれぞれ単独では達成し得ない高い遺伝子導入活性を得ると共に、カチオン性ポリマーベクターのみでは遺伝子導入が不可能又は困難であった幹細胞やプライマリーセル（生体組織から分離した直後の細胞）にも遺伝子を導入することが可能となる。
【００２１】
本発明のカチオン性ポリマーとアデノウイルスを併用することにより奏される上記効果の作用機構の詳細は明らかではないが、以下の（１）〜（５）が考えられ、これらが相乗的に作用して、高い遺伝子導入活性が得られるものと推測される。
【００２２】
（１） アデノウイルスは細胞膜表面に存在するレセプター（受容体）を介して細胞内へ侵入する（一部の例えばセイダイウイルスは膜融合性に侵入する）。この侵入ルートはエンドサイトーシスと呼ばれる細胞の食作用とは異なり（ピノサイトーシス（飲作用）と呼ばれる）、細胞にとって有用成分として取り込まれている可能性が高く、細胞内で速やかに小胞体から脱出して細胞質内へ拡散している可能性がある。一方、異物として食作用（エンドサイトーシス）で取り込まれた非ウイルスベクターによる核酸複合体は、小胞体中で分解するものが多く、運搬効率が悪いとされている。
本発明では、アデノウイルスが（残骸であっても）カチオン性ポリマーと核酸との複合体のエンドソーム脱出を助けている。
（２） カチオン性ポリマーベクターの核酸複合体の表面にアデノウイルス（残骸であっても）が吸着し、該核酸複合体が受容体を介して細胞へ侵入できるようになっている、及び／又は、アデノウイルス単体が受容体を介して細胞内へ侵入する際に、カチオン性ポリマーベクターの核酸複合体が便乗して細胞内へ取り込まれている。
（３） エンドソームからの脱出にアデノウイルスが機能している。
（４） アデノウイルス由来のタンパク中にカチオン性ポリマーベクターが運搬した核酸の転写を促進する成分が存在する。
（５） アデノウイルスへの感染によって細胞増殖が促進され、カチオン性ポリマーベクターが核内へ進入できる唯一のタイミングである二核細胞期にある細胞数が増えている。
【００２３】
本発明においては、アデノウイルスを、通常のウイルスベクターで遺伝子導入する時のような活量で使用する必要はなく、当業者に周知のアデノウイルスによる遺伝子導入実験プロトコールで推奨されている力価１０９
ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（ＴＣＩＤ５０は統計学的５０％細胞変性終末点）以上である必要はなく、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ程度の極く低活量で十分にアデノウイルス併用による上記効果を得ることができる。即ち、実質的にアデノウイルスが機能しないような低濃度での使用で遺伝子導入活性の向上効果が得られ、また、減菌ないし失活させたアデノウイルス（残骸）やアデノウイルスの分解断片でも効果を得ることができると考えられ、このように、極少量のアデノウイルスや減菌ないしは失活したアデノウイルス、アデノウイルスの分解断片でも有効であることから、ウイルスベクターの欠点である要事再調製、力価確認、精製などの労力が必要であるという問題や、感染の危険性の問題は、解消ないしは軽減される。また、導入目的の遺伝子はカチオン性ポリマーベクターの核酸複合体に搭載することから、導入しようとする核酸のサイズに制約を受けることはない。
【００２４】
このようなことから、本発明によれば、非ウイルスベクターであるカチオン性ポリマーベクターと、ウイルスベクターであるアデノウイルスを併用することにより、ウイルスベクターの欠点を解消ないしは軽減した上で、カチオン性ポリマーベクター及びアデノウイルスベクターのそれぞれ単独では達成し得ない高い遺伝子導入活性を示すと共に、多種多様な細胞に高い遺伝子導入効率で遺伝子導入が可能な、優れた遺伝子導入剤組成物が提供される。
【００２５】
本発明において、カチオン性ポリマーは、カチオン性ビニル系モノマーを主体とするポリマー鎖を有するものであり、特に、このようなカチオン性ポリマーは、前記カチオン性ポリマー鎖を４本以上有するスター型カチオン性ポリマー、とりわけ、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としてのカチオン性ポリマー鎖が結合したものが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アデノウイルス／６分岐スター型カチオン性ポリマー核酸複合体のＦＳＨｆｂへの遺伝子導入活性を示すグラフである。
【図２】アデノウイルス／６分岐スター型カチオン性ポリマー核酸複合体のＨｅｌａ細胞への遺伝子導入活性を示すグラフである。
【図３】アデノウイルス単体、アデノウイルス／直鎖型カチオン性ポリマー核酸複合体、及びアデノウイルス／６分岐スター型カチオン性ポリマー核酸複合体のＦＳＨｆｂへの遺伝子導入活性を示すグラフである。
【図４】精製アデノウイルス又は未精製アデノウイルスを用いたアデノウイルス／６分岐スター型カチオン性ポリマー核酸複合体のＦＳＨｆｂへの遺伝子導入活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２８】
［遺伝子導入剤組成物］
本発明の遺伝子導入剤組成物は、カチオン性ポリマー、核酸、及びアデノウイルスの少なくとも一部を含むことを特徴とし、通常、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体に対してアデノウイルスが吸着したものの水分散液として提供される。
【００２９】
＜カチオン性ポリマー＞
本発明で用いるカチオン性ポリマーは、カチオン性ビニル系モノマーを主体とするポリマー鎖（以下、「カチオン性ポリマー鎖」と称す。）を有するものであり、ここで「カチオン性ビニル系モノマーを主体とする」とは、カチオン性ポリマー鎖を構成するビニル系モノマー由来の構成単位の５０モル％以上、特に８０〜１００モル％がカチオン性ビニル系モノマー由来の構成単位であることをさす。
【００３０】
カチオン性ビニル系モノマーとしては、特に制限はないが、カチオン性ポリマーの合成のし易さの面から、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレン或いはこれらの誘導体が好ましく用いられる。これらのカチオン性ビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３１】
本発明に係るカチオン性ポリマー鎖には、カチオン性ビニル系モノマー以外のビニル系モノマー由来の構成単位が含まれていてもよく、カチオン性ビニル系モノマー以外のビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのビニル系モノマーが挙げられる。これらのその他のビニル系モノマーも１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよいが、これらのその他のビニル系モノマーは、カチオン性ポリマー鎖を構成するビニル系モノマー由来の構成単位の５０モル％以上、特に８０〜１００モル％がカチオン性ビニル系モノマー由来の構成単位となるように用いる必要がある。
これらのその他のビニル系モノマーを用いる場合、カチオン性ポリマー鎖はブロックコポリマー鎖であっても、ランダムコポリマー鎖であってもよい。
【００３２】
本発明で用いるカチオン性ポリマーは、直鎖状のカチオン性ポリマー鎖を１本のみ有する直鎖型カチオン性ポリマーであってもよいが、遺伝子導入活性に優れることから、カチオン性ポリマー鎖を複数本、好ましくは４本以上有するものが好ましく、特に、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としての前記カチオン性ポリマー鎖が結合したスター型カチオン性ポリマーが好ましい。
【００３３】
このようなスター型カチオン性ポリマーの製造方法には特に制限はないが、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターと、カチオン性ビニル系モノマーとを含む溶液に対し、光照射を行って製造する方法が好ましい。
【００３４】
ここで、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３５】
前記イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３６】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００３７】
イニファターとカチオン性ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター、及びカチオン性ビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、カチオン性ビニル系モノマーの重合鎖が結合した反応生成物を生成させる。
【００３８】
このカチオン性ビニル系モノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００３９】
光の照射条件は、波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４０】
この光照射により、反応液中にイニファターに対しカチオン性ビニル系モノマーの重合鎖よりなる分岐鎖が結合した分岐型カチオン性ポリマーが生成するので、必要に応じ精製して用いる。
【００４１】
その他のビニル系モノマーを用いる場合は、上記の原料溶液中にカチオン性ビニル系モノマーと共に他のビニル系モノマーを存在させておくことによりランダムコポリマーのカチオン性ポリマー鎖を形成することができる。また、カチオン性ビニル系モノマーの光重合と、他のビニル系モノマーの光重合との２段階重合を行うことにより、ブロックコポリマーのカチオン性ポリマー鎖を形成することができる。
得られるカチオン性ポリマーの分子量を高めるために、後掲の実施例１のように、カチオン性ビニル系モノマーのみを用いて２段階以上の光重合を行って、高分子量のカチオン性ポリマーを製造することもできる。
【００４２】
このようにして得られる、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としてのカチオン性ポリマー鎖が結合したスター型カチオン性ポリマーの、カチオン性ポリマー鎖１本当たりの分子量としては、１，５００〜１５０，０００程度、特に３，０００〜１００，０００程度が好ましい。また、スター型カチオン性ポリマーの分子量は、カチオン性ポリマー鎖の鎖数にもよるが、１０，０００〜１０，０００，０００程度、特に１００，０００〜６００，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、照射時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きいスター型カチオン性ポリマーを得ることができる。上述の如く、この光の照射を２段以上の複数段に分けて行うことにより合計の照射時間を長くして分子量の大きいスター型カチオン性ポリマーとすることもできる。
【００４３】
スター型カチオン性ポリマーの分子量は大きいほど遺伝子導入活性が高くなるため好ましいが、過度に分子量の大きいものは細胞毒性を惹起する可能性もあるので遺伝子導入を行う目的に応じて適宜選択すれば良い。即ち、アデノウイルスを用いないカチオン性ポリマーのみの遺伝子導入剤では、過度に分子量が大きいと、生体内において異物として認識されるおそれがあるが、本発明の遺伝子導入剤組成物では、アデノウイルスを含むことにより、このような問題はないものの、代謝分解や排泄性の観点から、上記した分子量範囲が好ましいと考えられる。
【００４４】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００４５】
光重合により得られたカチオン性ポリマーから、高分子量のものを選択して用いるために、サイズ排除カラムなどを用いて分子量分画を行うこともできる。
【００４６】
本発明の遺伝子導入剤組成物において、カチオン性ポリマーの含有量（濃度）は０．０１μｇ／μＬ〜０．５μｇ／μＬ程度であることが好ましい。カチオン性ポリマーの濃度が低過ぎると、
(1) カチオン性ポリマーと核酸とのイオン結合が不十分で核酸複合体が形成されない、及び／又は、核酸複合体中の核酸の凝集が不十分で酵素反応から保護できない。
(2) 核酸複合体表面のζ電位（ゼーター電位）が低く、細胞膜への吸着性が低くなってしまったり核酸複合体へのアデノウイルスの吸着が起こらなくなったりしてしまう。
などの不具合が考えられ、好ましくない。逆にカチオン性ポリマーの濃度が高過ぎると細胞毒性を惹起する可能性があるので好ましくはない。
【００４７】
＜アデノウイルス＞
本発明においては、遺伝子導入剤組成物中にカチオン性ポリマーと共にアデノウイルスを含むことを特徴とする。
【００４８】
アデノウイルスは、失活していない状態であってもよく、減菌した個体、失活させた個体（残骸）であってもよく、また、これらの一部であってもよい。失活していないアデノウイルスの場合、核酸を複合化したもの（遺伝子を導入したもの）であってもよく、核酸を複合化していないものであってもよい。ただし、ウイルスの組換え遺伝子ゲノムはＥ１領域を含まず自己増殖性のないものが好ましい。
【００４９】
核酸を複合化した遺伝子導入アデノウイルスの場合、その核酸は、本発明の遺伝子導入剤組成物が導入目的とする核酸と同一のものであってもよく、異なるものであってもよい。即ち、本発明の目的は、カチオン性ポリマーによる核酸複合体中の遺伝子を導入することであり、アデノウイルス中の遺伝子に関しては特に制限はない。また、本発明の遺伝子導入剤組成物で使用するアデノウイルスの力価は、通常のアデノウイルスベクターによる遺伝子導入で使用されている力価よりも低いため、アデノウイルスに導入された遺伝子が細胞に導入されることは殆どないと考えられる。
【００５０】
本発明の遺伝子導入剤組成物では、遺伝子導入剤としてカチオン性ポリマーとアデノウイルスとを併用するため、ウイルスベクターとしてアデノウイルスを用いる場合に比べて、アデノウイルスの使用量はごく少量で足り、また、失活して残骸となったアデノウイルスの一部であっても有効であることから、従来のウイルスベクター由来の危険性を解消ないし大幅に軽減することができる。
【００５１】
本発明の遺伝子導入剤組成物中のアデノウイルスの含有量は、少ないとアデノウイルスを用いたことによる本発明の効果を十分に得ることができないが、多過ぎるとアデノウイルス由来の細胞毒性が発現されてしまうことにより、かえって遺伝子導入活性が低下する。
このため、本発明の遺伝子導入剤組成物のアデノウイルスの含有量は、カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算して、アデノウイルス１０×１０１２ＴＣＩＤ５０以下、特に１０×１０１０ＴＣＩＤ５０以下、例えば１×１０７ＴＣＩＤ５０〜１×１０１０ＴＣＩＤ５０とすることが好ましい。
【００５２】
即ち、アデノウイルスのタイター（力価）は、(1)プラーク形成法、(2)ＴＣＩＤ５０法、(3)ＤＮＡ法、など当業者に周知の方法で測定され、「ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（ケルバー式による統計学的５０％細胞変性終末点）」又は「ＰＦＵ（Ｐｌａｑｕ Ｆｏｒｍｉｎ Ｕｎｉｔ）」という単位で表現される。本発明では、このような単位で表されるタイターのアデノウイルス含有液の必要量を、カチオン性ポリマーと核酸の複合体を含む液に添加混合して遺伝子導入剤組成物を調製する。従って、カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算したアデノウイルスの使用量は下記式で算出される。
アデノウイルス使用量（ＴＣＩＤ５０）＝Ａ×Ｍ／Ｋ
Ａ：用いたアデノウイルス含有液のタイター（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）
Ｋ：カチオン性ポリマー／核酸複合体を含む液中のカチオン性ポリマー量（ｇ）
Ｍ：カチオン性ポリマー／核酸複合体を含む液に混合したアデノウイルス含有液量（ｍＬ）
【００５３】
本発明では、上記式で算出されるアデノウイルス使用量が上記上限値以下となるように用いることが好ましい。
【００５４】
なお、失活させたアデノウイルス（残骸）を用いる場合、タイターが測定されないため、上記のＴＣＩＤ５０単位で表されるアデノウイルス使用量の下限はほぼゼロとなる。
【００５５】
＜核酸＞
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００５６】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００５７】
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【００５８】
本発明で用いる核酸の好ましい例としては、次のようなものが挙げられる。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００５９】
また、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００６０】
また、アンチセンスによるリプレッシングの他に、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。
【００６１】
＜遺伝子導入剤組成物の調製方法＞
本発明の遺伝子導入剤組成物を製造するには、まず、カチオン性ポリマーと核酸とを複合化させて核酸複合体とし、ここへアデノウイルスを添加して混合することが好ましい。
【００６２】
カチオン性ポリマーと核酸とを複合させるには、カチオン性ポリマーの濃度０．１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し混合すればよい。核酸に対してカチオン性ポリマーを過剰量添加し、核酸に対してカチオン性ポリマーを飽和状態にしてカチオン性ポリマーと核酸とを複合化することが好ましい。
【００６３】
なお、カチオン性ポリマーと核酸との複合体の粒子径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒子径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒子径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６４】
このようにして核酸複合体を形成させた後、アデノウイルス含有液を添加して混合することにより本発明の遺伝子導入剤組成物を調製する。添加されたアデノウイルスは、核酸複合体に吸着するものと考えられる。アデノウイルスが吸着した核酸複合体は、水等の液中で安定な分散状態を維持する。
【００６５】
［遺伝子導入方法］
遺伝子導入剤としてカチオン性ポリマーとアデノウイルスを用いる本発明の遺伝子導入方法では、上述のようにして調製された遺伝子導入剤組成物と細胞とを血清存在下で接触させることにより細胞に遺伝子を導入する。核酸複合体と細胞とを血清存在下で接触させることにより、細胞に負担をかけることなく核酸を細胞に移行させることができる。
【００６６】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６７】
本発明の遺伝子導入剤組成物は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００６８】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６９】
この遺伝子導入剤組成物を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００７０】
また、この遺伝子導入剤組成物を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸を含有する遺伝子導入剤組成物を含むものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００７１】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００７２】
この遺伝子導入剤組成物は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該遺伝子導入剤組成物に含有水される核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００７３】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００７４】
以下において、カチオン性ポリマーの製造及び評価には、以下に記載する装置類を用いた。
【００７５】
＜光源＞
朝日分光社製３００ＷキセノンランプＭＡＸ−３０１（アルカリガラスセルを使用することでフィルター機能を得、波長３３０〜４００ｎｍの混合光を照射することに相当する）
＜照射強度計＞
ウシオ電機社製積算光度計ＵＩＴ−１５０に受光センサーＵＶＤ−４０５を装着して使用
＜ＧＰＣ＞
移動相：ＤＭＦ＋３０ｍＭ ＬｉＢｒ （関東化学社製）
装置：島津製作所社製ＬＣ−１０Ａｖｐ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製Ａｓａｈｉｐａｃｋ ＧＦ−７１０ＨＱとＡｓａｈｉｐａｃｋ ＧＦ−５１０ＨＱを連結
検量線：Ｓｈｏｄｅｘ社製ＰＥＧ標準品ＴＳＫシリーズ
＜ＮＭＲ＞
Ｖａｒｉａｎ社製Ｇｅｍｉｎｉ−３００
＜反応容器＞
アルカリガラス製３ｍｍ厚直方体ガラスセル
＜凍結乾燥設備＞
ＥＹＥＬＡ社製ＦＵＤ−２２００とＵＬＶＡＣ社製真空ポンプＧＣＤ−１３６Ｘ
＜分子量分画＞
装置：島津製作所社製ＬＣ−１０Ａｖｐ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製ＧＰＣＫ−２００５＋ＧＰＣ Ｋ−２００４
移動相：クロロホルム＋３０ｍＭ トリエチルアミン
【００７６】
合成用の試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ社製又は関東化学社製の特級試薬を再結晶又は減圧蒸留で精製して使用した。
アデノウイルスは、市販の組換えアデノウイルス作製キットを使用した。完全長ＤＮＡ（ＬａｃＺをコード）を挿入してプラスミドを作成し、２９３細胞へプラスミドを導入して作製し（以下「Ａｄウイルス」又は「Ａｄｖ」と記す。）。
また、導入用の核酸には市販のホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡを使用した。
【００７７】
［実施例１］
｛６分岐スター型カチオン性ポリマーの合成｝
（１） ６分岐イニファターの合成
イニファターとしての１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００７８】
１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３０．０ｇをエタノール３００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過回収し、３Ｌのメタノールへ投入して１０分間攪拌して濾過した。この操作を計４回繰り返した。沈殿物をクロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１２時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。
【００７９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ１）：δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｍ，３６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３），δ３．７１−３．７３ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−），δ３．９９−４．０１ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，１２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２）
【００８０】
【化１】
【００８１】
（２） ６分岐スター型カチオン性ポリマーの合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートをモノマーとして用い、上記１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンよりなる６分岐スター型カチオン性ポリマーの合成を以下の２段重合で行った。
【００８２】
暗室で１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを混合して全量をクロロホルムで５０ｍＬとした。終濃度は１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが５ｍＭ（光解裂官能基として）、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが１．０Ｍとした。これを反応容器へ移し、高純度窒素ガスを１０分間パージ（流量：２Ｌ／分）した。反応容器を密栓して激しく攪拌しながら光照射した。照射強度は２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。６０分照射後に溶液をエバポレーターで濃縮後、ｎ−ヘキサン／エーテル＝５０／５０（Ｖ／Ｖ）で再沈殿した（１段目重合）。
ここへ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート７．９ｇを加えて溶解し、クロロホルムで全量を５０ｍＬとし、上記と同じ操作を行った（２段目重合）。
上記再沈殿を６回繰り返し、室温で１時間真空乾燥後、ベンゼンへ溶解して４８時間凍結乾燥して精製した。
【００８３】
ＧＰＣ：Ｍｎ＝２５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４０）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ１）：δ０．８−１．２ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ３，ｍ／ｒ＝１／２），δ１．６−２．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），δ２．５−２．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ４．０−４．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ２）。
【００８４】
【化２】
【００８５】
（３） ６分岐スター型カチオン性ポリマーの分子量分画処理
上記（２）で合成した、Ｍｎ＝２５，０００の６分岐スター型カチオン性ポリマーをサイズ排除カラムにて分画した。
分画後は、上記と同様の手法で精製し、凍結乾燥して、Ｍｎ＝１５０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１）の超高分子量単分散分画を得た。
【００８６】
｛遺伝子導入実験｝
細胞には株化細胞であるヒト子宮頚部ガン由来のＨｅｌａ細胞とヤギ胎児由来の心筋線維芽細胞の初代細胞（以下「ＦＳＨｆｂ」と記す。）を使用した。
細胞は細胞数を４万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【００８７】
上記（３）で得た６分岐スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝１５０，０００）中の単位重量あたりの陽電荷数は、該６分岐スター型カチオン性ポリマーを構成するモノマー単位（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の分子量１５６から計算して求めた。一方、ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列ＭＡＰによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
この６分岐スター型カチオン性ポリマーを生理食塩水へ溶解して濃度を０．２６μｇ／μＬへ調整した。ＤＮＡはＴＥ緩衝溶液中へ溶解して濃度を０．３３μｇ／μＬに調整した。６分岐スター型カチオン性ポリマー溶液６０μＬとＤＮＡ溶液９０μＬを混合して３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の１０倍となるように（ＣＡ比＝１０）調整したことになる。
【００８８】
この１５０μＬ溶液（６分岐スター型カチオン性ポリマー含有量は約１６μｇ）に、１／２０濃度に希釈したＡｄウイルス溶液（６×１０６
ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を０μＬ（添加せず），１０μＬ，２０μＬ，４０μＬ，６０μＬ又は８０μＬ混合してからＯＰＴＩ−ＭＥＭ培養液１００μＬへ加えて混合し、３０分間インキュベートしてからそれぞれ培養細胞へ加えた（いずれのＷｅｌｌにも０．５μｇのＤＮＡが投与されるように添加量を調整した）。
各Ａｄウイルス溶液添加量におけるカチオン性ポリマー１ｇあたりに換算したＡｄウイルス添加量は以下の通りである。
添加量０μＬ＝０ ＴＣＩＤ５０
添加量１０μＬ＝３．８×１０９ ＴＣＩＤ５０
添加量２０μＬ＝７．５×１０９ ＴＣＩＤ５０
添加量４０μＬ＝１．５×１０１０ ＴＣＩＤ５０
添加量６０μＬ＝２．３×１０１０ ＴＣＩＤ５０
添加量８０μＬ＝３．０×１０１０ ＴＣＩＤ５０
【００８９】
３時間の培養の後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄した後に完全培地を加えてさらに４８時間培養を行った。４８時間後にルシフェラーゼアッセイキットにより遺伝子導入活性の評価を行った。補正（規格化）は総タンパク濃度で行い、総タンパク定量はＢｉｏ Ｒａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
ＦＳＨｆｂへの導入結果を図１に示す。Ｈｅｌａ細胞への導入結果を図２に示す。
【００９０】
［実施例２］
｛直鎖型カチオン性ポリマーの合成｝
実施例１において、１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンの代りにクロロメチルベンゼンを用い、カチオン性ポリマー鎖を１本のみ有する直鎖型カチオン性ポリマーを合成した。
【００９１】
即ち、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（１０．３ｇ，４６ｍｍｏｌ）を含むエタノール溶液５０ｍＬ中にクロロメチルベンゼン（４．８ｇ，３８ｍｍｏｌ）を含むエタノール溶液１０ｍＬを窒素雰囲気下０℃で滴下し、反応溶液を室温で２３時間撹拌した後、１５０ｍＬの水を加え、ジエチルエーテルで抽出した（２００ｍＬ×３回）。有機層を水洗いし（１００ｍＬ×３回）、硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレータを用いて減圧下で溶媒を留去し、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチルベンゼンを得た（無色液体，収量１７．６ｇ（収率９３％））。
【００９２】
１Ｈ−ＮＭＲ：δ７．４０７〜７．２７１ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ，Ａｒ−Ｈ）δ４．５４０ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｓ）、δ４．０８２〜４．０１２ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ３．７６３ｐｐｍ〜３．６９２ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ１．３１１〜１．２５２ｐｐｍ（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３）
【００９３】
次に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（３．９ｇ，２４．９６ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチルジチオカルバミルメチルベンゼン（２３．９４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）の混合物をメタノールで希釈し、全量２０ｍＬの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することでカチオン性ポリマーを析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去し、カチオン性ポリマーを水に溶解し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、ＧＰＣにて得られたカチオン性ポリマーの分子量を測定したところ、Ｍｎ＝約２５，０００であった。
【００９４】
１Ｈ−ＮＭＲ：δ７．８〜７．４ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ）、δ３．４３〜３．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．４〜２．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ２）、δ２．２〜２．１ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，−Ｎ−ＣＨ３）、δ１．８〜１．５ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）
【００９５】
｛遺伝子導入実験｝
細胞にはヤギ胎児由来の心筋線維芽細胞の初代細胞（ＦＳＨｆｂ）を使用した。
細胞は細胞数を４万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
上記で得た直鎖型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５，０００）中の単位重量あたりの陽電荷数は、該直鎖型カチオン性ポリマーを構成するモノマー単位（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の分子量１５６から計算して求めた。一方、ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列ＭＡＰによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
この直鎖型カチオン性ポリマーをＤＮＡと１５０μＬのＴＥ緩衝溶液中で混合して３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の１０倍となるように（ＣＡ比＝１０）調整した（直鎖型カチオン性ポリマーを１５．８μｇ、ＤＮＡを３．０μｇ）。
この１５０μＬ溶液に、１／２０濃度に希釈したＡｄウイルス溶液（６×１０６
ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を６０μＬ（直鎖型カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算したＡｄウイルス混合量は２．３×１０１０ ＴＣＩＤ５０）混合してからＯＰＴＩ−ＭＥＭ培養液１００μＬへ加えて混合し、３０分間インキュベートしてから培養細胞へ加えた（いずれのＷｅｌｌにも０．５μｇのＤＮＡが投与されるように添加量を調整した）。３時間の培養の後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄した後に完全培地を加えてさらに４８時間培養を行った。４８時間後にルシフェラーゼアッセイキットにより遺伝子導入活性の評価を行った。補正は総タンパク濃度で行い、総タンパク定量はＢｉｏ Ｒａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
ＦＳＨｆｂへの導入結果を図３に示す。
【００９６】
［実施例３］
直鎖型カチオン性ポリマーの代りに、実施例１の（２）で得た６分岐スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５，０００）を用いたこと以外は、実施例２と同様にして遺伝子導入実験を行い、結果を図３に示した。
【００９７】
［比較例１］
核酸複合体を用いず、Ａｄウイルスのみを用い、Ａｄウイルス溶液（６×１０６
ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を６０μＬをＯＰＴＩ−ＭＥＭ培養液１００μＬへ加えて混合し、３０分間インキュベートしてから培養細胞へ加えたこと以外は、実施例２と同様にして遺伝子導入実験を行い、結果を図３に示した。
【００９８】
［Ａｄウイルスのタイターに関する検討］
市販のキットで作製したＡｄウイルスを未精製又は精製の状態で濃度を１／２０濃度に希釈して使用した。精製は以下のようにして行なった。
２２５ｍｍ２フラスコで２９３細胞培養し、６×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＡｄウイルス液３００μＬと５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地５ｍＬを加えて３７℃で４日間培養した。培養溶液を３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、沈殿を超音波処理で粉砕し１０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。このウイルス原液を４．０Ｍの塩化セシウム溶液と２．２Ｍの塩化セシウム溶液の密度勾配遠心法により分離し、両セシウム溶液の中間に配置されたウイルスバンドを採取し、ＰＢＳ溶液で透析して塩化セシウムを除去して精製ウイルス溶液を得た。力価は３×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬとなった。さらに未精製品を１／８０，１／１６０，１／３２０，１／６４０，又は１／１２８０濃度に希釈することで力価を下げて遺伝子導入活性を比較評価する実験を行った。
【００９９】
細胞にはヤギ胎児由来の心筋線維芽細胞の初代細胞（ＦＳＨｆｂ）を使用した。
細胞は細胞数を４万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
実施例１の上記（２）で得た６分岐スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５，０００）中の単位重量あたりの陽電荷数は、該６分岐スター型カチオン性ポリマーを構成するモノマー単位（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の分子量１５６から計算して求めた。一方、ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列ＭＡＰによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
この６分岐スター型カチオン性ポリマーをＤＮＡと１５０μＬのＴＥ緩衝溶液中で混合して３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の１５倍となるように（ＣＡ比＝１５）調整した。
この１５０μＬ溶液に、上記希釈したＡｄウイルス溶液をそれぞれ６０μＬ混合してからＯＰＴＩ−ＭＥＭ培養液１００μＬへ加えて混合し、３０分間インキュベートしてから培養細胞へ加えた（各Ｗｅｌｌに０．５μｇのＤＮＡを投与した）。３時間の培養の後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄した後に完全培地を加えてさらに４８時間培養を行った。４８時間後にルシフェラーゼアッセイキットにより遺伝子導入活性の評価を行った。補正（規格化）は総タンパク濃度で行い、総タンパク定量はＢｉｏ Ｒａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
ＦＳＨｆｂへの導入結果を図４に示す。
【０１００】
なお、各Ａｄウイルス溶液の６分岐スター型カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算した混合量は以下の通りである。
精製品１／２０倍希釈：６．３×１０１２ＴＣＩＤ５０
未精製品１／２０倍希釈：７．６×１０８ＴＣＩＤ５０
未精製品１／８０倍希釈：１．９×１０８ＴＣＩＤ５０
未精製品１／１６０倍希釈：９．５×１０７ＴＣＩＤ５０
未精製品１／３２０倍希釈：４．８×１０７ＴＣＩＤ５０
未精製品１／６４０倍希釈：２．４×１０７ＴＣＩＤ５０
未精製品１／１２８０倍希釈：１．２×１０７ＴＣＩＤ５０
【０１０１】
［考察］
図１〜４より次のことが分かる。
【０１０２】
図１より、核酸複合体へＡｄウイルスを混合することで初めてカチオン性ポリマーベクターによるＦＳＨｆｂへの遺伝子導入が可能となったことが分かる。ただしＡｄウイルス混合の効果は濃度依存性に向上する傾向ではなく、むしろ混合量が少ない方で顕著な効果が得られていることと、Ａｄウイルスへ挿入したＤＮＡはＬａｃＺをコードする遺伝子であり、このホタルルシフェラーゼの活性とは無関係であることより、Ａｄウイルスへ挿入されたＤＮＡの導入との相乗効果ではないことが確認された。
【０１０３】
図２より、株化されたＨｅｌａ細胞ではＡｄウイルスを混合しなくとも６分岐スター型ポリマー単体でも遺伝子導入が可能であることが分かる。これは本発明者らが報告してきた公知事実である。一方、Ａｄウイルスを混合することでＨｅｌａ細胞でも遺伝子導入活性が向上し、株化細胞への導入でも本発明は有効であることが分かる。
【０１０４】
図３より、Ａｄウイルスを混合しなければＦＳＨｆｂでは導入活性が得られないカチオン性ポリマーベクターの構造において、直鎖型と６分岐スター型とで遺伝子導入活性に差異が認められ、同じ分子量であれば分岐構造が有利であることが示唆された。
また、図１と図３との結果から、同じ６分岐スター型構造でも、分子量が高い方が高い遺伝子導入活性を得られる可能性が高いことが分かる。
また、Ａｄウイルス単体での活性の評価ではホタルルシフェラーゼの活性は認められず、今回の実施例で使用したＡｄウイルスへ挿入したＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）が非特異的にホタルルシフェラーゼ活性評価反応に寄与していないことも示された。
【０１０５】
図４より、Ａｄウイルスは未精製でも核酸複合体へ混合すれば効果が得られることが分かる。通常は精製処理を行って高タイターとして細胞への遺伝子導入に使用される事実からすれば、未精製品で高活性が発現されることは画期的である。未精製品を希釈して１／１６０の濃度としたもので活性が発現されていることから、Ａｄウイルスは核酸複合体へ微量に混合されている状態で効果を発現していることが分かり、細胞へ何らかの作用を印加し、核酸複合体自体の遺伝子導入活性を助長している可能性があることが推測される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤として、カチオン性ポリマーとアデノウイルスとを併用した新規遺伝子導入剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。
【０００３】
遺伝子導入技術には大きく分けてウイルスベクターと非ウイルスベクターとの２つが存在する。
ウイルスベクターによる遺伝子導入は、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、センダイウイルス、レトロウイルスなどを改変（野生型ウイルスを無毒化し、目的の核酸を挿入して作成）し、細胞へ作用させることで外来遺伝子を細胞へ導入する技術であり、当業者の間で広く行われている。
非ウイルスベクターは高分子ポリマーやカチオン性脂質と核酸で形成させた複合体を細胞へ取り込ませる食作用を利用したものが多く、他にはエレクトロポレーションや金コロイド銃など機械的に細胞膜を突き破って核酸を挿入する技術もある。
【０００４】
非ウイルスベクターに関して、本発明者らは、ベンゼン環から放射状にポリマー鎖が伸延するスター型ポリマーによる遺伝子導入技術を開発し、多くの提案を行ってきた（例えば、特許文献１，２）。該スター型ポリマーベクターはベンゼン環に結合する直鎖状ポリマー鎖の本数に依存して遺伝子導入活性が向上し、最大で６本のポリマー鎖を有するスター型ポリマーが最も遺伝子導入活性の高いものとなる。
【０００５】
また、同じモノマーの重合物であっても、該スター型ポリマーには、例えば、高ＣＡ比（ベクターの陽電荷数とＤＮＡの陰電荷数の比）でも細胞毒性を発現することなく遺伝子導入が可能である；スター型ポリマーに核酸を複合化させてなる核酸複合体の粒子径が大きくても（即ち、通常、粒子径が小さいほど細胞膜の透過に有利とされているが、スター型ポリマーは２００μｍ〜３００μｍ、直鎖状ポリマーでは１００μｍほどであり、粒子径の面ではスター型ポリマーは不利であると考えられるが）、細胞膜透過性が高い；などといった、直鎖状ポリマーにはない特長を有する。
【０００６】
しかし、ウイルスベクターと比較して、高分子ベクターやカチオン性脂質のベクター等の非ウイルスベクターは、遺伝子導入活性が低いという欠点があった。
特に、造血幹細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの幹細胞や神経細胞、心筋細胞など食作用の少ない細胞へはほとんど導入ができなかった。
このため、従来、生体（動物）での使用例もウイルスベクターによる研究が主流で、高分子ベクターによる生体内使用は報告がほとんどなされていないのが実状である。これは、株化細胞（試験管での実験用に、容易に培養が可能で継代による細胞の性質の変化がないように処理された細胞）には高分子ベクターも適用が可能であるものの、Ｐｒｉａｍｒｙ細胞（動物の臓器などから採取された直後の細胞）にはほとんど遺伝子導入ができないことによる。
【０００７】
これに対して、ウイルスベクターは、その強い感染力を利用して核酸を種々の細胞へ導入できる利点がある一方で、次のような欠点がある。
（１） 新種のウイルスを作成してしまう危険性（例えば、(1)一般にウイルスベクターの作成の前に組換え遺伝子を作成するが、この組換え遺伝子の作成の際に目的遺伝子に突然変異が入ってしまうことやＥ１領域の消化が十分でなく自己増殖能が残ってしまうなどの危険性や、(2)ウイルスベクターの継代中、ウイルス遺伝子の複製過程でパッケージング細胞のＤＮＡとの相同組換えによってＥ１領域を取得し、自己増殖能を獲得したウイルスが産生してしまう可能性など）や研究者自身が感染する危険性がある。
（２） −７０℃以下の温度で保存しても経時性に力価（タイター）が低下してしまうので、高力価とするために使用前に力価の確認試験や再調製や精製の工程が必要であり、感染力の強いウイルスベクターの調製には多大な時間や労力コストを必要とする。
（３） ウイルス自体にサイズがあるので、物理的に内部へ挿入できる核酸のサイズに限界があり、大きなＤＮＡなどは挿入できない。
（４） ウイルスベクターは細胞膜表面の受容体（例えばＣＡＲ（コサッキー・アデノウイルス・レセプター））を介して侵入するため、受容体を持っていない細胞へは使用できない。
（５） 組換え遺伝子実験として承認申請などが必要なケースが多く、企画から実験を行うまでに多大な時間や専用の施設が必要になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００７−７０５７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上述のような非ウイルスベクター及びウイルスベクターの欠点を解決し、両者の利点を兼備する、遺伝子導入活性に著しく優れた遺伝子導入剤組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、非ウイルスベクターであるカチオン性ポリマーベクターとウイルスベクターとしてアデノウイルスを併用することにより、ウイルスベクターの欠点を解消ないしは軽減した上で、遺伝子導入活性が飛躍的に向上し、カチオン性ポリマーベクター及びアデノウイルスベクターのそれぞれ単独では達成し得ない高い遺伝子導入活性を示すと共に、カチオン性ポリマーベクターのみでは遺伝子導入が不可能又は困難であった幹細胞やプライマリーセル（生体組織から分離した直後の細胞）にも遺伝子導入が可能な、優れた遺伝子導入剤組成物を実現することができることを見出した。
【００１１】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものであり、以下を要旨とする。
【００１２】
［１］ カチオン性ポリマー、核酸、及びアデノウイルスの少なくとも一部を含むことを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１３】
［２］ ［１］において、前記カチオン性ポリマーは、カチオン性ビニル系モノマーを主体とするポリマー鎖（以下、「カチオン性ポリマー鎖」と称す。）を有することを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１４】
［３］ ［２］において、前記カチオン性ポリマーは、前記カチオン性ポリマー鎖を４本以上有するスター型カチオン性ポリマーであることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１５】
［４］ ［３］において、前記カチオン性ポリマーは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としての前記カチオン性ポリマー鎖が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１６】
［５］ ［１］ないし［４］のいずれかにおいて、前記アデノウイルスは、失活した個体を含むことを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１７】
［６］ ［１］ないし［５］のいずれかにおいて、前記カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算して、アデノウイルス１０×１０１２ＴＣＩＤ５０以下を混合してなることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１８】
［７］ ［１］ないし［６］のいずれかにおいて、前記カチオン性ポリマーと核酸とを複合化させてなる核酸複合体に更にアデノウイルスの少なくとも一部を混合してなることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【００１９】
［８］ カチオン性ポリマーとアデノウイルスの少なくとも一部とを併用することを特徴とする遺伝子導入方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、カチオン性ポリマーと共にアデノウイルスを併用することにより、ウイルスベクターであるアデノウイルスの前述の欠点を解消ないしは軽減した上で、遺伝子導入活性を飛躍的に高め、カチオン性ポリマーベクター及びアデノウイルスベクターのそれぞれ単独では達成し得ない高い遺伝子導入活性を得ると共に、カチオン性ポリマーベクターのみでは遺伝子導入が不可能又は困難であった幹細胞やプライマリーセル（生体組織から分離した直後の細胞）にも遺伝子を導入することが可能となる。
【００２１】
本発明のカチオン性ポリマーとアデノウイルスを併用することにより奏される上記効果の作用機構の詳細は明らかではないが、以下の（１）〜（５）が考えられ、これらが相乗的に作用して、高い遺伝子導入活性が得られるものと推測される。
【００２２】
（１） アデノウイルスは細胞膜表面に存在するレセプター（受容体）を介して細胞内へ侵入する（一部の例えばセイダイウイルスは膜融合性に侵入する）。この侵入ルートはエンドサイトーシスと呼ばれる細胞の食作用とは異なり（ピノサイトーシス（飲作用）と呼ばれる）、細胞にとって有用成分として取り込まれている可能性が高く、細胞内で速やかに小胞体から脱出して細胞質内へ拡散している可能性がある。一方、異物として食作用（エンドサイトーシス）で取り込まれた非ウイルスベクターによる核酸複合体は、小胞体中で分解するものが多く、運搬効率が悪いとされている。
本発明では、アデノウイルスが（残骸であっても）カチオン性ポリマーと核酸との複合体のエンドソーム脱出を助けている。
（２） カチオン性ポリマーベクターの核酸複合体の表面にアデノウイルス（残骸であっても）が吸着し、該核酸複合体が受容体を介して細胞へ侵入できるようになっている、及び／又は、アデノウイルス単体が受容体を介して細胞内へ侵入する際に、カチオン性ポリマーベクターの核酸複合体が便乗して細胞内へ取り込まれている。
（３） エンドソームからの脱出にアデノウイルスが機能している。
（４） アデノウイルス由来のタンパク中にカチオン性ポリマーベクターが運搬した核酸の転写を促進する成分が存在する。
（５） アデノウイルスへの感染によって細胞増殖が促進され、カチオン性ポリマーベクターが核内へ進入できる唯一のタイミングである二核細胞期にある細胞数が増えている。
【００２３】
本発明においては、アデノウイルスを、通常のウイルスベクターで遺伝子導入する時のような活量で使用する必要はなく、当業者に周知のアデノウイルスによる遺伝子導入実験プロトコールで推奨されている力価１０９
ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（ＴＣＩＤ５０は統計学的５０％細胞変性終末点）以上である必要はなく、１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ程度の極く低活量で十分にアデノウイルス併用による上記効果を得ることができる。即ち、実質的にアデノウイルスが機能しないような低濃度での使用で遺伝子導入活性の向上効果が得られ、また、減菌ないし失活させたアデノウイルス（残骸）やアデノウイルスの分解断片でも効果を得ることができると考えられ、このように、極少量のアデノウイルスや減菌ないしは失活したアデノウイルス、アデノウイルスの分解断片でも有効であることから、ウイルスベクターの欠点である要事再調製、力価確認、精製などの労力が必要であるという問題や、感染の危険性の問題は、解消ないしは軽減される。また、導入目的の遺伝子はカチオン性ポリマーベクターの核酸複合体に搭載することから、導入しようとする核酸のサイズに制約を受けることはない。
【００２４】
このようなことから、本発明によれば、非ウイルスベクターであるカチオン性ポリマーベクターと、ウイルスベクターであるアデノウイルスを併用することにより、ウイルスベクターの欠点を解消ないしは軽減した上で、カチオン性ポリマーベクター及びアデノウイルスベクターのそれぞれ単独では達成し得ない高い遺伝子導入活性を示すと共に、多種多様な細胞に高い遺伝子導入効率で遺伝子導入が可能な、優れた遺伝子導入剤組成物が提供される。
【００２５】
本発明において、カチオン性ポリマーは、カチオン性ビニル系モノマーを主体とするポリマー鎖を有するものであり、特に、このようなカチオン性ポリマーは、前記カチオン性ポリマー鎖を４本以上有するスター型カチオン性ポリマー、とりわけ、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としてのカチオン性ポリマー鎖が結合したものが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アデノウイルス／６分岐スター型カチオン性ポリマー核酸複合体のＦＳＨｆｂへの遺伝子導入活性を示すグラフである。
【図２】アデノウイルス／６分岐スター型カチオン性ポリマー核酸複合体のＨｅｌａ細胞への遺伝子導入活性を示すグラフである。
【図３】アデノウイルス単体、アデノウイルス／直鎖型カチオン性ポリマー核酸複合体、及びアデノウイルス／６分岐スター型カチオン性ポリマー核酸複合体のＦＳＨｆｂへの遺伝子導入活性を示すグラフである。
【図４】精製アデノウイルス又は未精製アデノウイルスを用いたアデノウイルス／６分岐スター型カチオン性ポリマー核酸複合体のＦＳＨｆｂへの遺伝子導入活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２８】
［遺伝子導入剤組成物］
本発明の遺伝子導入剤組成物は、カチオン性ポリマー、核酸、及びアデノウイルスの少なくとも一部を含むことを特徴とし、通常、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体に対してアデノウイルスが吸着したものの水分散液として提供される。
【００２９】
＜カチオン性ポリマー＞
本発明で用いるカチオン性ポリマーは、カチオン性ビニル系モノマーを主体とするポリマー鎖（以下、「カチオン性ポリマー鎖」と称す。）を有するものであり、ここで「カチオン性ビニル系モノマーを主体とする」とは、カチオン性ポリマー鎖を構成するビニル系モノマー由来の構成単位の５０モル％以上、特に８０〜１００モル％がカチオン性ビニル系モノマー由来の構成単位であることをさす。
【００３０】
カチオン性ビニル系モノマーとしては、特に制限はないが、カチオン性ポリマーの合成のし易さの面から、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレン或いはこれらの誘導体が好ましく用いられる。これらのカチオン性ビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３１】
本発明に係るカチオン性ポリマー鎖には、カチオン性ビニル系モノマー以外のビニル系モノマー由来の構成単位が含まれていてもよく、カチオン性ビニル系モノマー以外のビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのビニル系モノマーが挙げられる。これらのその他のビニル系モノマーも１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよいが、これらのその他のビニル系モノマーは、カチオン性ポリマー鎖を構成するビニル系モノマー由来の構成単位の５０モル％以上、特に８０〜１００モル％がカチオン性ビニル系モノマー由来の構成単位となるように用いる必要がある。
これらのその他のビニル系モノマーを用いる場合、カチオン性ポリマー鎖はブロックコポリマー鎖であっても、ランダムコポリマー鎖であってもよい。
【００３２】
本発明で用いるカチオン性ポリマーは、直鎖状のカチオン性ポリマー鎖を１本のみ有する直鎖型カチオン性ポリマーであってもよいが、遺伝子導入活性に優れることから、カチオン性ポリマー鎖を複数本、好ましくは４本以上有するものが好ましく、特に、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としての前記カチオン性ポリマー鎖が結合したスター型カチオン性ポリマーが好ましい。
【００３３】
このようなスター型カチオン性ポリマーの製造方法には特に制限はないが、少なくとも、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物からなるイニファターと、カチオン性ビニル系モノマーとを含む溶液に対し、光照射を行って製造する方法が好ましい。
【００３４】
ここで、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３５】
前記イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３６】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００３７】
イニファターとカチオン性ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター、及びカチオン性ビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、カチオン性ビニル系モノマーの重合鎖が結合した反応生成物を生成させる。
【００３８】
このカチオン性ビニル系モノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５〜２．５Ｍが好適である。イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００３９】
光の照射条件は、波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４０】
この光照射により、反応液中にイニファターに対しカチオン性ビニル系モノマーの重合鎖よりなる分岐鎖が結合した分岐型カチオン性ポリマーが生成するので、必要に応じ精製して用いる。
【００４１】
その他のビニル系モノマーを用いる場合は、上記の原料溶液中にカチオン性ビニル系モノマーと共に他のビニル系モノマーを存在させておくことによりランダムコポリマーのカチオン性ポリマー鎖を形成することができる。また、カチオン性ビニル系モノマーの光重合と、他のビニル系モノマーの光重合との２段階重合を行うことにより、ブロックコポリマーのカチオン性ポリマー鎖を形成することができる。
得られるカチオン性ポリマーの分子量を高めるために、後掲の実施例１のように、カチオン性ビニル系モノマーのみを用いて２段階以上の光重合を行って、高分子量のカチオン性ポリマーを製造することもできる。
【００４２】
このようにして得られる、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としてのカチオン性ポリマー鎖が結合したスター型カチオン性ポリマーの、カチオン性ポリマー鎖１本当たりの分子量としては、１，５００〜１５０，０００程度、特に３，０００〜１００，０００程度が好ましい。また、スター型カチオン性ポリマーの分子量は、カチオン性ポリマー鎖の鎖数にもよるが、１０，０００〜１０，０００，０００程度、特に１００，０００〜６００，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、照射時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きいスター型カチオン性ポリマーを得ることができる。上述の如く、この光の照射を２段以上の複数段に分けて行うことにより合計の照射時間を長くして分子量の大きいスター型カチオン性ポリマーとすることもできる。
【００４３】
スター型カチオン性ポリマーの分子量は大きいほど遺伝子導入活性が高くなるため好ましいが、過度に分子量の大きいものは細胞毒性を惹起する可能性もあるので遺伝子導入を行う目的に応じて適宜選択すれば良い。即ち、アデノウイルスを用いないカチオン性ポリマーのみの遺伝子導入剤では、過度に分子量が大きいと、生体内において異物として認識されるおそれがあるが、本発明の遺伝子導入剤組成物では、アデノウイルスを含むことにより、このような問題はないものの、代謝分解や排泄性の観点から、上記した分子量範囲が好ましいと考えられる。
【００４４】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００４５】
光重合により得られたカチオン性ポリマーから、高分子量のものを選択して用いるために、サイズ排除カラムなどを用いて分子量分画を行うこともできる。
【００４６】
本発明の遺伝子導入剤組成物において、カチオン性ポリマーの含有量（濃度）は０．０１μｇ／μＬ〜０．５μｇ／μＬ程度であることが好ましい。カチオン性ポリマーの濃度が低過ぎると、
(1) カチオン性ポリマーと核酸とのイオン結合が不十分で核酸複合体が形成されない、及び／又は、核酸複合体中の核酸の凝集が不十分で酵素反応から保護できない。
(2) 核酸複合体表面のζ電位（ゼーター電位）が低く、細胞膜への吸着性が低くなってしまったり核酸複合体へのアデノウイルスの吸着が起こらなくなったりしてしまう。
などの不具合が考えられ、好ましくない。逆にカチオン性ポリマーの濃度が高過ぎると細胞毒性を惹起する可能性があるので好ましくはない。
【００４７】
＜アデノウイルス＞
本発明においては、遺伝子導入剤組成物中にカチオン性ポリマーと共にアデノウイルスを含むことを特徴とする。
【００４８】
アデノウイルスは、失活していない状態であってもよく、減菌した個体、失活させた個体（残骸）であってもよく、また、これらの一部であってもよい。失活していないアデノウイルスの場合、核酸を複合化したもの（遺伝子を導入したもの）であってもよく、核酸を複合化していないものであってもよい。ただし、ウイルスの組換え遺伝子ゲノムはＥ１領域を含まず自己増殖性のないものが好ましい。
【００４９】
核酸を複合化した遺伝子導入アデノウイルスの場合、その核酸は、本発明の遺伝子導入剤組成物が導入目的とする核酸と同一のものであってもよく、異なるものであってもよい。即ち、本発明の目的は、カチオン性ポリマーによる核酸複合体中の遺伝子を導入することであり、アデノウイルス中の遺伝子に関しては特に制限はない。また、本発明の遺伝子導入剤組成物で使用するアデノウイルスの力価は、通常のアデノウイルスベクターによる遺伝子導入で使用されている力価よりも低いため、アデノウイルスに導入された遺伝子が細胞に導入されることは殆どないと考えられる。
【００５０】
本発明の遺伝子導入剤組成物では、遺伝子導入剤としてカチオン性ポリマーとアデノウイルスとを併用するため、ウイルスベクターとしてアデノウイルスを用いる場合に比べて、アデノウイルスの使用量はごく少量で足り、また、失活して残骸となったアデノウイルスの一部であっても有効であることから、従来のウイルスベクター由来の危険性を解消ないし大幅に軽減することができる。
【００５１】
本発明の遺伝子導入剤組成物中のアデノウイルスの含有量は、少ないとアデノウイルスを用いたことによる本発明の効果を十分に得ることができないが、多過ぎるとアデノウイルス由来の細胞毒性が発現されてしまうことにより、かえって遺伝子導入活性が低下する。
このため、本発明の遺伝子導入剤組成物のアデノウイルスの含有量は、カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算して、アデノウイルス１０×１０１２ＴＣＩＤ５０以下、特に１０×１０１０ＴＣＩＤ５０以下、例えば１×１０７ＴＣＩＤ５０〜１×１０１０ＴＣＩＤ５０とすることが好ましい。
【００５２】
即ち、アデノウイルスのタイター（力価）は、(1)プラーク形成法、(2)ＴＣＩＤ５０法、(3)ＤＮＡ法、など当業者に周知の方法で測定され、「ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（ケルバー式による統計学的５０％細胞変性終末点）」又は「ＰＦＵ（Ｐｌａｑｕ Ｆｏｒｍｉｎ Ｕｎｉｔ）」という単位で表現される。本発明では、このような単位で表されるタイターのアデノウイルス含有液の必要量を、カチオン性ポリマーと核酸の複合体を含む液に添加混合して遺伝子導入剤組成物を調製する。従って、カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算したアデノウイルスの使用量は下記式で算出される。
アデノウイルス使用量（ＴＣＩＤ５０）＝Ａ×Ｍ／Ｋ
Ａ：用いたアデノウイルス含有液のタイター（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）
Ｋ：カチオン性ポリマー／核酸複合体を含む液中のカチオン性ポリマー量（ｇ）
Ｍ：カチオン性ポリマー／核酸複合体を含む液に混合したアデノウイルス含有液量（ｍＬ）
【００５３】
本発明では、上記式で算出されるアデノウイルス使用量が上記上限値以下となるように用いることが好ましい。
【００５４】
なお、失活させたアデノウイルス（残骸）を用いる場合、タイターが測定されないため、上記のＴＣＩＤ５０単位で表されるアデノウイルス使用量の下限はほぼゼロとなる。
【００５５】
＜核酸＞
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００５６】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００５７】
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【００５８】
本発明で用いる核酸の好ましい例としては、次のようなものが挙げられる。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００５９】
また、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００６０】
また、アンチセンスによるリプレッシングの他に、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。
【００６１】
＜遺伝子導入剤組成物の調製方法＞
本発明の遺伝子導入剤組成物を製造するには、まず、カチオン性ポリマーと核酸とを複合化させて核酸複合体とし、ここへアデノウイルスを添加して混合することが好ましい。
【００６２】
カチオン性ポリマーと核酸とを複合させるには、カチオン性ポリマーの濃度０．１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し混合すればよい。核酸に対してカチオン性ポリマーを過剰量添加し、核酸に対してカチオン性ポリマーを飽和状態にしてカチオン性ポリマーと核酸とを複合化することが好ましい。
【００６３】
なお、カチオン性ポリマーと核酸との複合体の粒子径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒子径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒子径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６４】
このようにして核酸複合体を形成させた後、アデノウイルス含有液を添加して混合することにより本発明の遺伝子導入剤組成物を調製する。添加されたアデノウイルスは、核酸複合体に吸着するものと考えられる。アデノウイルスが吸着した核酸複合体は、水等の液中で安定な分散状態を維持する。
【００６５】
［遺伝子導入方法］
遺伝子導入剤としてカチオン性ポリマーとアデノウイルスを用いる本発明の遺伝子導入方法では、上述のようにして調製された遺伝子導入剤組成物と細胞とを血清存在下で接触させることにより細胞に遺伝子を導入する。核酸複合体と細胞とを血清存在下で接触させることにより、細胞に負担をかけることなく核酸を細胞に移行させることができる。
【００６６】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６７】
本発明の遺伝子導入剤組成物は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００６８】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６９】
この遺伝子導入剤組成物を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００７０】
また、この遺伝子導入剤組成物を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸を含有する遺伝子導入剤組成物を含むものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００７１】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００７２】
この遺伝子導入剤組成物は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該遺伝子導入剤組成物に含有水される核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００７３】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００７４】
以下において、カチオン性ポリマーの製造及び評価には、以下に記載する装置類を用いた。
【００７５】
＜光源＞
朝日分光社製３００ＷキセノンランプＭＡＸ−３０１（アルカリガラスセルを使用することでフィルター機能を得、波長３３０〜４００ｎｍの混合光を照射することに相当する）
＜照射強度計＞
ウシオ電機社製積算光度計ＵＩＴ−１５０に受光センサーＵＶＤ−４０５を装着して使用
＜ＧＰＣ＞
移動相：ＤＭＦ＋３０ｍＭ ＬｉＢｒ （関東化学社製）
装置：島津製作所社製ＬＣ−１０Ａｖｐ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製Ａｓａｈｉｐａｃｋ ＧＦ−７１０ＨＱとＡｓａｈｉｐａｃｋ ＧＦ−５１０ＨＱを連結
検量線：Ｓｈｏｄｅｘ社製ＰＥＧ標準品ＴＳＫシリーズ
＜ＮＭＲ＞
Ｖａｒｉａｎ社製Ｇｅｍｉｎｉ−３００
＜反応容器＞
アルカリガラス製３ｍｍ厚直方体ガラスセル
＜凍結乾燥設備＞
ＥＹＥＬＡ社製ＦＵＤ−２２００とＵＬＶＡＣ社製真空ポンプＧＣＤ−１３６Ｘ
＜分子量分画＞
装置：島津製作所社製ＬＣ−１０Ａｖｐ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ社製ＧＰＣＫ−２００５＋ＧＰＣ Ｋ−２００４
移動相：クロロホルム＋３０ｍＭ トリエチルアミン
【００７６】
合成用の試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ社製又は関東化学社製の特級試薬を再結晶又は減圧蒸留で精製して使用した。
アデノウイルスは、市販の組換えアデノウイルス作製キットを使用した。完全長ＤＮＡ（ＬａｃＺをコード）を挿入してプラスミドを作成し、２９３細胞へプラスミドを導入して作製し（以下「Ａｄウイルス」又は「Ａｄｖ」と記す。）。
また、導入用の核酸には市販のホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡを使用した。
【００７７】
［実施例１］
｛６分岐スター型カチオン性ポリマーの合成｝
（１） ６分岐イニファターの合成
イニファターとしての１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００７８】
１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３０．０ｇをエタノール３００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過回収し、３Ｌのメタノールへ投入して１０分間攪拌して濾過した。この操作を計４回繰り返した。沈殿物をクロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫内で１２時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。
【００７９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ１）：δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｍ，３６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３），δ３．７１−３．７３ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−），δ３．９９−４．０１ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，１２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２）
【００８０】
【化１】
【００８１】
（２） ６分岐スター型カチオン性ポリマーの合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートをモノマーとして用い、上記１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンよりなる６分岐スター型カチオン性ポリマーの合成を以下の２段重合で行った。
【００８２】
暗室で１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを混合して全量をクロロホルムで５０ｍＬとした。終濃度は１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが５ｍＭ（光解裂官能基として）、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートが１．０Ｍとした。これを反応容器へ移し、高純度窒素ガスを１０分間パージ（流量：２Ｌ／分）した。反応容器を密栓して激しく攪拌しながら光照射した。照射強度は２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。６０分照射後に溶液をエバポレーターで濃縮後、ｎ−ヘキサン／エーテル＝５０／５０（Ｖ／Ｖ）で再沈殿した（１段目重合）。
ここへ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート７．９ｇを加えて溶解し、クロロホルムで全量を５０ｍＬとし、上記と同じ操作を行った（２段目重合）。
上記再沈殿を６回繰り返し、室温で１時間真空乾燥後、ベンゼンへ溶解して４８時間凍結乾燥して精製した。
【００８３】
ＧＰＣ：Ｍｎ＝２５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４０）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ１）：δ０．８−１．２ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ３，ｍ／ｒ＝１／２），δ１．６−２．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３−），δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），δ２．５−２．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ４．０−４．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ２）。
【００８４】
【化２】
【００８５】
（３） ６分岐スター型カチオン性ポリマーの分子量分画処理
上記（２）で合成した、Ｍｎ＝２５，０００の６分岐スター型カチオン性ポリマーをサイズ排除カラムにて分画した。
分画後は、上記と同様の手法で精製し、凍結乾燥して、Ｍｎ＝１５０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１）の超高分子量単分散分画を得た。
【００８６】
｛遺伝子導入実験｝
細胞には株化細胞であるヒト子宮頚部ガン由来のＨｅｌａ細胞とヤギ胎児由来の心筋線維芽細胞の初代細胞（以下「ＦＳＨｆｂ」と記す。）を使用した。
細胞は細胞数を４万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【００８７】
上記（３）で得た６分岐スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝１５０，０００）中の単位重量あたりの陽電荷数は、該６分岐スター型カチオン性ポリマーを構成するモノマー単位（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の分子量１５６から計算して求めた。一方、ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列ＭＡＰによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
この６分岐スター型カチオン性ポリマーを生理食塩水へ溶解して濃度を０．２６μｇ／μＬへ調整した。ＤＮＡはＴＥ緩衝溶液中へ溶解して濃度を０．３３μｇ／μＬに調整した。６分岐スター型カチオン性ポリマー溶液６０μＬとＤＮＡ溶液９０μＬを混合して３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の１０倍となるように（ＣＡ比＝１０）調整したことになる。
【００８８】
この１５０μＬ溶液（６分岐スター型カチオン性ポリマー含有量は約１６μｇ）に、１／２０濃度に希釈したＡｄウイルス溶液（６×１０６
ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を０μＬ（添加せず），１０μＬ，２０μＬ，４０μＬ，６０μＬ又は８０μＬ混合してからＯＰＴＩ−ＭＥＭ培養液１００μＬへ加えて混合し、３０分間インキュベートしてからそれぞれ培養細胞へ加えた（いずれのＷｅｌｌにも０．５μｇのＤＮＡが投与されるように添加量を調整した）。
各Ａｄウイルス溶液添加量におけるカチオン性ポリマー１ｇあたりに換算したＡｄウイルス添加量は以下の通りである。
添加量０μＬ＝０ ＴＣＩＤ５０
添加量１０μＬ＝３．８×１０９ ＴＣＩＤ５０
添加量２０μＬ＝７．５×１０９ ＴＣＩＤ５０
添加量４０μＬ＝１．５×１０１０ ＴＣＩＤ５０
添加量６０μＬ＝２．３×１０１０ ＴＣＩＤ５０
添加量８０μＬ＝３．０×１０１０ ＴＣＩＤ５０
【００８９】
３時間の培養の後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄した後に完全培地を加えてさらに４８時間培養を行った。４８時間後にルシフェラーゼアッセイキットにより遺伝子導入活性の評価を行った。補正（規格化）は総タンパク濃度で行い、総タンパク定量はＢｉｏ Ｒａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
ＦＳＨｆｂへの導入結果を図１に示す。Ｈｅｌａ細胞への導入結果を図２に示す。
【００９０】
［実施例２］
｛直鎖型カチオン性ポリマーの合成｝
実施例１において、１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンの代りにクロロメチルベンゼンを用い、カチオン性ポリマー鎖を１本のみ有する直鎖型カチオン性ポリマーを合成した。
【００９１】
即ち、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（１０．３ｇ，４６ｍｍｏｌ）を含むエタノール溶液５０ｍＬ中にクロロメチルベンゼン（４．８ｇ，３８ｍｍｏｌ）を含むエタノール溶液１０ｍＬを窒素雰囲気下０℃で滴下し、反応溶液を室温で２３時間撹拌した後、１５０ｍＬの水を加え、ジエチルエーテルで抽出した（２００ｍＬ×３回）。有機層を水洗いし（１００ｍＬ×３回）、硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレータを用いて減圧下で溶媒を留去し、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチルベンゼンを得た（無色液体，収量１７．６ｇ（収率９３％））。
【００９２】
１Ｈ−ＮＭＲ：δ７．４０７〜７．２７１ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ，Ａｒ−Ｈ）δ４．５４０ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｓ）、δ４．０８２〜４．０１２ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ３．７６３ｐｐｍ〜３．６９２ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ１．３１１〜１．２５２ｐｐｍ（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３）
【００９３】
次に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（３．９ｇ，２４．９６ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチルジチオカルバミルメチルベンゼン（２３．９４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）の混合物をメタノールで希釈し、全量２０ｍＬの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することでカチオン性ポリマーを析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去し、カチオン性ポリマーを水に溶解し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、ＧＰＣにて得られたカチオン性ポリマーの分子量を測定したところ、Ｍｎ＝約２５，０００であった。
【００９４】
１Ｈ−ＮＭＲ：δ７．８〜７．４ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ）、δ３．４３〜３．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．４〜２．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ２）、δ２．２〜２．１ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，−Ｎ−ＣＨ３）、δ１．８〜１．５ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）
【００９５】
｛遺伝子導入実験｝
細胞にはヤギ胎児由来の心筋線維芽細胞の初代細胞（ＦＳＨｆｂ）を使用した。
細胞は細胞数を４万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
上記で得た直鎖型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５，０００）中の単位重量あたりの陽電荷数は、該直鎖型カチオン性ポリマーを構成するモノマー単位（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の分子量１５６から計算して求めた。一方、ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列ＭＡＰによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
この直鎖型カチオン性ポリマーをＤＮＡと１５０μＬのＴＥ緩衝溶液中で混合して３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の１０倍となるように（ＣＡ比＝１０）調整した（直鎖型カチオン性ポリマーを１５．８μｇ、ＤＮＡを３．０μｇ）。
この１５０μＬ溶液に、１／２０濃度に希釈したＡｄウイルス溶液（６×１０６
ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を６０μＬ（直鎖型カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算したＡｄウイルス混合量は２．３×１０１０ ＴＣＩＤ５０）混合してからＯＰＴＩ−ＭＥＭ培養液１００μＬへ加えて混合し、３０分間インキュベートしてから培養細胞へ加えた（いずれのＷｅｌｌにも０．５μｇのＤＮＡが投与されるように添加量を調整した）。３時間の培養の後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄した後に完全培地を加えてさらに４８時間培養を行った。４８時間後にルシフェラーゼアッセイキットにより遺伝子導入活性の評価を行った。補正は総タンパク濃度で行い、総タンパク定量はＢｉｏ Ｒａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
ＦＳＨｆｂへの導入結果を図３に示す。
【００９６】
［実施例３］
直鎖型カチオン性ポリマーの代りに、実施例１の（２）で得た６分岐スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５，０００）を用いたこと以外は、実施例２と同様にして遺伝子導入実験を行い、結果を図３に示した。
【００９７】
［比較例１］
核酸複合体を用いず、Ａｄウイルスのみを用い、Ａｄウイルス溶液（６×１０６
ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を６０μＬをＯＰＴＩ−ＭＥＭ培養液１００μＬへ加えて混合し、３０分間インキュベートしてから培養細胞へ加えたこと以外は、実施例２と同様にして遺伝子導入実験を行い、結果を図３に示した。
【００９８】
［Ａｄウイルスのタイターに関する検討］
市販のキットで作製したＡｄウイルスを未精製又は精製の状態で濃度を１／２０濃度に希釈して使用した。精製は以下のようにして行なった。
２２５ｍｍ２フラスコで２９３細胞培養し、６×１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＡｄウイルス液３００μＬと５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地５ｍＬを加えて３７℃で４日間培養した。培養溶液を３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、沈殿を超音波処理で粉砕し１０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。このウイルス原液を４．０Ｍの塩化セシウム溶液と２．２Ｍの塩化セシウム溶液の密度勾配遠心法により分離し、両セシウム溶液の中間に配置されたウイルスバンドを採取し、ＰＢＳ溶液で透析して塩化セシウムを除去して精製ウイルス溶液を得た。力価は３×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍＬとなった。さらに未精製品を１／８０，１／１６０，１／３２０，１／６４０，又は１／１２８０濃度に希釈することで力価を下げて遺伝子導入活性を比較評価する実験を行った。
【００９９】
細胞にはヤギ胎児由来の心筋線維芽細胞の初代細胞（ＦＳＨｆｂ）を使用した。
細胞は細胞数を４万個／ｍＬに調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
実施例１の上記（２）で得た６分岐スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５，０００）中の単位重量あたりの陽電荷数は、該６分岐スター型カチオン性ポリマーを構成するモノマー単位（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の分子量１５６から計算して求めた。一方、ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列ＭＡＰによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
この６分岐スター型カチオン性ポリマーをＤＮＡと１５０μＬのＴＥ緩衝溶液中で混合して３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の１５倍となるように（ＣＡ比＝１５）調整した。
この１５０μＬ溶液に、上記希釈したＡｄウイルス溶液をそれぞれ６０μＬ混合してからＯＰＴＩ−ＭＥＭ培養液１００μＬへ加えて混合し、３０分間インキュベートしてから培養細胞へ加えた（各Ｗｅｌｌに０．５μｇのＤＮＡを投与した）。３時間の培養の後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄した後に完全培地を加えてさらに４８時間培養を行った。４８時間後にルシフェラーゼアッセイキットにより遺伝子導入活性の評価を行った。補正（規格化）は総タンパク濃度で行い、総タンパク定量はＢｉｏ Ｒａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
ＦＳＨｆｂへの導入結果を図４に示す。
【０１００】
なお、各Ａｄウイルス溶液の６分岐スター型カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算した混合量は以下の通りである。
精製品１／２０倍希釈：６．３×１０１２ＴＣＩＤ５０
未精製品１／２０倍希釈：７．６×１０８ＴＣＩＤ５０
未精製品１／８０倍希釈：１．９×１０８ＴＣＩＤ５０
未精製品１／１６０倍希釈：９．５×１０７ＴＣＩＤ５０
未精製品１／３２０倍希釈：４．８×１０７ＴＣＩＤ５０
未精製品１／６４０倍希釈：２．４×１０７ＴＣＩＤ５０
未精製品１／１２８０倍希釈：１．２×１０７ＴＣＩＤ５０
【０１０１】
［考察］
図１〜４より次のことが分かる。
【０１０２】
図１より、核酸複合体へＡｄウイルスを混合することで初めてカチオン性ポリマーベクターによるＦＳＨｆｂへの遺伝子導入が可能となったことが分かる。ただしＡｄウイルス混合の効果は濃度依存性に向上する傾向ではなく、むしろ混合量が少ない方で顕著な効果が得られていることと、Ａｄウイルスへ挿入したＤＮＡはＬａｃＺをコードする遺伝子であり、このホタルルシフェラーゼの活性とは無関係であることより、Ａｄウイルスへ挿入されたＤＮＡの導入との相乗効果ではないことが確認された。
【０１０３】
図２より、株化されたＨｅｌａ細胞ではＡｄウイルスを混合しなくとも６分岐スター型ポリマー単体でも遺伝子導入が可能であることが分かる。これは本発明者らが報告してきた公知事実である。一方、Ａｄウイルスを混合することでＨｅｌａ細胞でも遺伝子導入活性が向上し、株化細胞への導入でも本発明は有効であることが分かる。
【０１０４】
図３より、Ａｄウイルスを混合しなければＦＳＨｆｂでは導入活性が得られないカチオン性ポリマーベクターの構造において、直鎖型と６分岐スター型とで遺伝子導入活性に差異が認められ、同じ分子量であれば分岐構造が有利であることが示唆された。
また、図１と図３との結果から、同じ６分岐スター型構造でも、分子量が高い方が高い遺伝子導入活性を得られる可能性が高いことが分かる。
また、Ａｄウイルス単体での活性の評価ではホタルルシフェラーゼの活性は認められず、今回の実施例で使用したＡｄウイルスへ挿入したＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）が非特異的にホタルルシフェラーゼ活性評価反応に寄与していないことも示された。
【０１０５】
図４より、Ａｄウイルスは未精製でも核酸複合体へ混合すれば効果が得られることが分かる。通常は精製処理を行って高タイターとして細胞への遺伝子導入に使用される事実からすれば、未精製品で高活性が発現されることは画期的である。未精製品を希釈して１／１６０の濃度としたもので活性が発現されていることから、Ａｄウイルスは核酸複合体へ微量に混合されている状態で効果を発現していることが分かり、細胞へ何らかの作用を印加し、核酸複合体自体の遺伝子導入活性を助長している可能性があることが推測される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性ポリマー、核酸、及びアデノウイルスの少なくとも一部を含むことを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項２】
請求項１において、前記カチオン性ポリマーは、カチオン性ビニル系モノマーを主体とするポリマー鎖（以下、「カチオン性ポリマー鎖」と称す。）を有することを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項３】
請求項２において、前記カチオン性ポリマーは、前記カチオン性ポリマー鎖を４本以上有するスター型カチオン性ポリマーであることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項４】
請求項３において、前記カチオン性ポリマーは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としての前記カチオン性ポリマー鎖が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記アデノウイルスは、失活した個体を含むことを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算して、アデノウイルス１０×１０１２ＴＣＩＤ５０以下を混合してなることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記カチオン性ポリマーと核酸とを複合化させてなる核酸複合体に更にアデノウイルスの少なくとも一部を混合してなることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項８】
カチオン性ポリマーとアデノウイルスの少なくとも一部とを併用することを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項１】
カチオン性ポリマー、核酸、及びアデノウイルスの少なくとも一部を含むことを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項２】
請求項１において、前記カチオン性ポリマーは、カチオン性ビニル系モノマーを主体とするポリマー鎖（以下、「カチオン性ポリマー鎖」と称す。）を有することを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項３】
請求項２において、前記カチオン性ポリマーは、前記カチオン性ポリマー鎖を４本以上有するスター型カチオン性ポリマーであることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項４】
請求項３において、前記カチオン性ポリマーは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖としての前記カチオン性ポリマー鎖が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記アデノウイルスは、失活した個体を含むことを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記カチオン性ポリマー１ｇあたりに換算して、アデノウイルス１０×１０１２ＴＣＩＤ５０以下を混合してなることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記カチオン性ポリマーと核酸とを複合化させてなる核酸複合体に更にアデノウイルスの少なくとも一部を混合してなることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項８】
カチオン性ポリマーとアデノウイルスの少なくとも一部とを併用することを特徴とする遺伝子導入方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２１７３８８（Ｐ２０１２−２１７３８８Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８６５０９（Ｐ２０１１−８６５０９）
【出願日】平成２３年４月８日（２０１１．４．８）
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月８日（２０１１．４．８）
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【Ｆターム（参考）】
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