遺伝子導入剤
【課題】遺伝子導入効率の高い遺伝子導入剤を提供する。
【解決手段】芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤において、該分岐鎖に炭酸系イオンが結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。炭酸系イオンとしては、炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンが好ましい。
【解決手段】芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤において、該分岐鎖に炭酸系イオンが結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。炭酸系イオンとしては、炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に係り、特に遺伝子導入効率が高い遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
ところで、合成高分子製ベクターの遺伝子導入効率を向上させるためには、ＤＮＡとのイオン複合体が細胞内へ取り込まれた後に、いかにエンドソーム内から脱出するかに依存している、と考えられている。エンドソームからイオン複合体が脱出するには、カチオン性高分子のアミンを中和するために大量のプロトンがエンドソーム内へ浸透することで内圧が上がり破裂するためと推測されている（プロトンスポンジ現象）。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率が高い遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
請求項１の遺伝子導入剤は、芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤において、該分岐鎖に炭酸系イオンが結合していることを特徴とするものである。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、炭酸系イオンが炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンであることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項３又は４において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項３ないし５のいずれか１項において、該分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項３ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、異なるモノマーとのランダム又はブロック共重合体であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項８の遺伝子導入剤は、前記異なるモノマーは、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の遺伝子導入剤は、負電荷を有する核酸とイオン複合体を形成し、細胞へ作用させることでエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる。細胞取り込み後は強酸性でかつ３７℃付近の生理的温度下にあるエンドソーム中でポリカチオンの側鎖に付加した炭酸塩から炭酸ガスが気体として放出され、容積の膨張によってエンドソームへ穿孔してイオン複合体のエンドソーム脱出を促進する。
【００１４】
このように、本発明は浸透したプロトンによるエンドソーム内外の浸透圧差だけでなく、イオン複合体から積極的に炭酸ガスを放出させることで内圧を上げてエンドソーム膜の破壊を助長させるものである。なお、生成した二酸化炭素は生体への影響が少ない。
【００１５】
前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。
【００１６】
このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合しているものが好ましい。
【００１７】
このビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、及びこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上が好ましい。
【００１８】
本発明では、分岐鎖は、ビニル系モノマーのホモポリマーであってもよく、２種以上のモノマーのランダム又はブロック共重合体であってもよい。共重合するモノマーとしては、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤
【００１９】
なお、上記のＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のブロックは、温度感応性を有しており、所定温度よりも低い温度では親水性であり、水溶性であるため、遺伝子導入剤を水に溶解させて核酸と複合させることができ、この遺伝子導入剤は、所定温度よりも高い温度になると疎水性となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香族環から放射状等に伸延した複数のカチオン性分岐鎖を有したスター形分岐型重合体（スター形ポリマー）よりなる。
【００２１】
このスター形分岐型重合体としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体が好適である。
【００２２】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２３】
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００２４】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００２５】
このイニファターに重合させるモノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等、とりわけビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２６】
イニファターと上記モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００２７】
このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。
【００２８】
イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００２９】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００３０】
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００３１】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００３２】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００３３】
この光照射により、反応液中に分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体としてのカチオン性ホモポリマーを得る。
【００３４】
この分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、2,000〜500,000、特に2,000〜150,000、とりわけ2,000〜100,000程度が好ましい。
【００３５】
本発明では、この分岐型重合体（スター形ポリマー）は、上記ホモポリマーであってもよく、さらに異なる重合体とのブロック共重合体又はランダム共重合体であってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。なお、先にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマーよりなる分岐鎖を有した分岐型重合体を形成し、その後、各分岐鎖の先端側にカチオン性ポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００３６】
このＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。なお、これにより遺伝子導入剤が上記温度応答性を具備するようになる。
【００３７】
カチオン性ポリマーブロックにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドあるいはＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成したスター形分岐型重合体を好ましくはアルコール例えばメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型ポリマーの濃度は0.01〜10重量％程度が好適であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は0.3〜30重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長250〜400ｎｍ、照射時間1〜150分、照射強度100〜10,000μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３８】
このスター形分岐型重合体の分子量は3,000〜600,000、特に3,000〜150,000であることが好ましい。
【００３９】
本発明では、このスター形分岐型重合体の分岐鎖に炭酸系イオンを結合させる。この結合は、分岐鎖の正電荷と炭酸系イオンの負電荷との静電引力によるものと考えられる。
【００４０】
炭酸系イオンとしては、炭酸イオン及び炭酸水素イオンの少なくとも１種が好ましい。炭酸系イオンの結合量としては、分岐鎖の主鎖の炭素原子１０００個当たり、炭酸系イオンが１０〜５００程度結合する程度が好ましい。
【００４１】
炭酸系イオンとして炭酸イオンを分岐鎖に結合させるには、この分岐型重合体（スター形ホモポリマー）の架橋を行うには、スター形ホモポリマーの濃度０．１〜２０ｗｔ％程度の水溶液に炭酸ガスをバブリング（通気）するのが好ましい。炭酸ガスの通気量としては、水溶液１Ｌ当り０．１〜５．０Ｌ／ｍｉｎ程度であればよいが、これに限定されない。通気時間は１０〜６０ｍｉｎ程度が好適である。この通気時の水温は低い方が好ましい。
【００４２】
前記した通り、本発明の遺伝子導入剤は、負電荷を有する核酸とイオン複合体を形成し、細胞へ作用させることでエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる。細胞取り込み後は、強酸性でかつ３７℃付近の生理的温度下にあるエンドソーム中でポリカチオンの側鎖に付加した炭酸塩から炭酸ガスが気体として放出され、容積の膨張によってエンドソームへ穿孔してイオン複合体のエンドソーム脱出を促進する。
【００４３】
上記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【００４４】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【００４５】
このようにして生成した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００４６】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４７】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４８】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４９】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００５０】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００５１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００５２】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００５３】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００５４】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５５】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５６】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５７】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５８】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
実施例１
１） イニファターの合成
イニファターである１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した（化１）。
【００６０】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００６１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００６２】
【化１】
【００６３】
２） カチオン性ホモポリマーの合成（化２）
上記のようにして合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、減圧蒸留により精製してある３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を２０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５００ｍＷ／ｃｍ２で調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンよりなるカチオン性ポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより４０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３）と測定された。
【００６４】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６５】
【化２】
【００６６】
３) 炭酸ガスの担持
２)で合成した４分岐型スター型カチオン性ホモポリマー（ｐＤＭＡＰＡＡｍ）０．４グラムを４０ｍＬの水へ溶解し、氷冷した。緩やかに攪拌しながら高純度炭酸ガスをパスツールピペットからバブリングした。３０分後、溶液は粘性を増し、若干の白濁を確認した。水溶性に寄与しているジメチルアミノ基の運動が制限された結果と推測される。溶液を２−プロパノールへ滴下すると結晶性の沈殿を生じ、アルコールへの溶解性が落ちていることが分かった。
ガラス板上でキャストフィルムを作成し赤外吸収を確認するとＣ＝Ｏストレッチの吸収が上がり、ポリマーフィルム中にＣＯ２が担持されていることが確認された。さらに１Ｎ塩酸をフィルムへ滴下するとフィルムが溶解するのと同時に発泡が観察され、酸性雰囲気下で炭酸ガスを放出することが確認された。
【００６７】
４) 遺伝子導入活性の評価
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。添加量は、１ｍＬ容の溶液を滴下することで０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液濃度を調整して培養細胞へ加えた。遺伝子導入剤とＤＮＡの混合比はＣＯ２担持前の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭホモポリマーとＤＮＡの電荷数の関係で、陽電荷数が陰電荷数の５倍となるように調整した。４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭホモポリマーの単位重量あたりの陽電荷数は中和滴定により求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
ＣＯ２担持させた４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭホモポリマーの溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を０分〜３０分間窒素ガスでバブリングして実施例の遺伝子導入剤溶液とした。
この遺伝子導入剤溶液とＤＮＡ溶液を室温下で温和に混合しＯＰＴＩ−ＭＥＭで希釈し、培養細胞へ加えた。３時間後にＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄したあとに完全培地を加え、４８時間培養を行った。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。
【００６８】
比較例１
比較例の遺伝子導入剤溶液は、ＣＯ２ガスを担持していない２)で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭホモポリマーの溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を３０分間窒素ガスでバブリングして使用した。
この比較例１の遺伝子導入剤溶液についても、実施例１と同様にして遺伝子導入活性を評価した。結果を図１に示す。
【００６９】
図１より、実施例の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーのＣＯ２担持体は比較例よりも高い遺伝子導入活性を持っていた。この理由としてはＤＮＡと形成させたポリプレックスが細胞内へエンドサイトーシスによって取り込まれた後に酸性環境下のエンドソーム内でポリマー側鎖に担持されたＣＯ２が気化して体積が増えることでエンドソームを膨張させ、ポリプレックスのエンドソームからの脱出を助長していることが推定される。
【００７０】
図１の通り、実施例の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーのＣＯ２担持体は溶液調製後に窒素ガスをバブリングすることで時間依存性に遺伝子導入活性が減少し、１０分後には比較例と同等まで減少した。これは、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーの側鎖のジメチルアミノ基に担持させたＣＯ２が窒素ガスのバブリングによって除去された結果と考えられる。
【００７１】
４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーへのＣＯ２ガスの担持量の定量化（制御方法）、最適化、保存時の経時変化（自然に脱気される分）など今後の課題は多いが、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーのＣＯ２ガス担持体を遺伝子導入剤として使用することにより、効率の良い遺伝子導入が可能であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】実施例の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に係り、特に遺伝子導入効率が高い遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香族環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
ところで、合成高分子製ベクターの遺伝子導入効率を向上させるためには、ＤＮＡとのイオン複合体が細胞内へ取り込まれた後に、いかにエンドソーム内から脱出するかに依存している、と考えられている。エンドソームからイオン複合体が脱出するには、カチオン性高分子のアミンを中和するために大量のプロトンがエンドソーム内へ浸透することで内圧が上がり破裂するためと推測されている（プロトンスポンジ現象）。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率が高い遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
請求項１の遺伝子導入剤は、芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤において、該分岐鎖に炭酸系イオンが結合していることを特徴とするものである。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、炭酸系イオンが炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンであることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項３又は４において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項３ないし５のいずれか１項において、該分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項３ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、異なるモノマーとのランダム又はブロック共重合体であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項８の遺伝子導入剤は、前記異なるモノマーは、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の遺伝子導入剤は、負電荷を有する核酸とイオン複合体を形成し、細胞へ作用させることでエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる。細胞取り込み後は強酸性でかつ３７℃付近の生理的温度下にあるエンドソーム中でポリカチオンの側鎖に付加した炭酸塩から炭酸ガスが気体として放出され、容積の膨張によってエンドソームへ穿孔してイオン複合体のエンドソーム脱出を促進する。
【００１４】
このように、本発明は浸透したプロトンによるエンドソーム内外の浸透圧差だけでなく、イオン複合体から積極的に炭酸ガスを放出させることで内圧を上げてエンドソーム膜の破壊を助長させるものである。なお、生成した二酸化炭素は生体への影響が少ない。
【００１５】
前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。
【００１６】
このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合しているものが好ましい。
【００１７】
このビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、及びこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上が好ましい。
【００１８】
本発明では、分岐鎖は、ビニル系モノマーのホモポリマーであってもよく、２種以上のモノマーのランダム又はブロック共重合体であってもよい。共重合するモノマーとしては、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤
【００１９】
なお、上記のＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のブロックは、温度感応性を有しており、所定温度よりも低い温度では親水性であり、水溶性であるため、遺伝子導入剤を水に溶解させて核酸と複合させることができ、この遺伝子導入剤は、所定温度よりも高い温度になると疎水性となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香族環から放射状等に伸延した複数のカチオン性分岐鎖を有したスター形分岐型重合体（スター形ポリマー）よりなる。
【００２１】
このスター形分岐型重合体としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体が好適である。
【００２２】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２３】
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００２４】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００２５】
このイニファターに重合させるモノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等、とりわけビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２６】
イニファターと上記モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００２７】
このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。
【００２８】
イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００２９】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００３０】
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００３１】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００３２】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００３３】
この光照射により、反応液中に分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体としてのカチオン性ホモポリマーを得る。
【００３４】
この分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、2,000〜500,000、特に2,000〜150,000、とりわけ2,000〜100,000程度が好ましい。
【００３５】
本発明では、この分岐型重合体（スター形ポリマー）は、上記ホモポリマーであってもよく、さらに異なる重合体とのブロック共重合体又はランダム共重合体であってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。なお、先にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマーよりなる分岐鎖を有した分岐型重合体を形成し、その後、各分岐鎖の先端側にカチオン性ポリマーブロックを導入するようにしてもよい。
【００３６】
このＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有する。なお、これにより遺伝子導入剤が上記温度応答性を具備するようになる。
【００３７】
カチオン性ポリマーブロックにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドあるいはＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成したスター形分岐型重合体を好ましくはアルコール例えばメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型ポリマーの濃度は0.01〜10重量％程度が好適であり、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド又はＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は0.3〜30重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長250〜400ｎｍ、照射時間1〜150分、照射強度100〜10,000μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３８】
このスター形分岐型重合体の分子量は3,000〜600,000、特に3,000〜150,000であることが好ましい。
【００３９】
本発明では、このスター形分岐型重合体の分岐鎖に炭酸系イオンを結合させる。この結合は、分岐鎖の正電荷と炭酸系イオンの負電荷との静電引力によるものと考えられる。
【００４０】
炭酸系イオンとしては、炭酸イオン及び炭酸水素イオンの少なくとも１種が好ましい。炭酸系イオンの結合量としては、分岐鎖の主鎖の炭素原子１０００個当たり、炭酸系イオンが１０〜５００程度結合する程度が好ましい。
【００４１】
炭酸系イオンとして炭酸イオンを分岐鎖に結合させるには、この分岐型重合体（スター形ホモポリマー）の架橋を行うには、スター形ホモポリマーの濃度０．１〜２０ｗｔ％程度の水溶液に炭酸ガスをバブリング（通気）するのが好ましい。炭酸ガスの通気量としては、水溶液１Ｌ当り０．１〜５．０Ｌ／ｍｉｎ程度であればよいが、これに限定されない。通気時間は１０〜６０ｍｉｎ程度が好適である。この通気時の水温は低い方が好ましい。
【００４２】
前記した通り、本発明の遺伝子導入剤は、負電荷を有する核酸とイオン複合体を形成し、細胞へ作用させることでエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる。細胞取り込み後は、強酸性でかつ３７℃付近の生理的温度下にあるエンドソーム中でポリカチオンの側鎖に付加した炭酸塩から炭酸ガスが気体として放出され、容積の膨張によってエンドソームへ穿孔してイオン複合体のエンドソーム脱出を促進する。
【００４３】
上記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【００４４】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【００４５】
このようにして生成した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００４６】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４７】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４８】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４９】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００５０】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００５１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００５２】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００５３】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００５４】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５５】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５６】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５７】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５８】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
実施例１
１） イニファターの合成
イニファターである１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した（化１）。
【００６０】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００６１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００６２】
【化１】
【００６３】
２） カチオン性ホモポリマーの合成（化２）
上記のようにして合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、減圧蒸留により精製してある３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を２０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５００ｍＷ／ｃｍ２で調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンよりなるカチオン性ポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより４０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３）と測定された。
【００６４】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６５】
【化２】
【００６６】
３) 炭酸ガスの担持
２)で合成した４分岐型スター型カチオン性ホモポリマー（ｐＤＭＡＰＡＡｍ）０．４グラムを４０ｍＬの水へ溶解し、氷冷した。緩やかに攪拌しながら高純度炭酸ガスをパスツールピペットからバブリングした。３０分後、溶液は粘性を増し、若干の白濁を確認した。水溶性に寄与しているジメチルアミノ基の運動が制限された結果と推測される。溶液を２−プロパノールへ滴下すると結晶性の沈殿を生じ、アルコールへの溶解性が落ちていることが分かった。
ガラス板上でキャストフィルムを作成し赤外吸収を確認するとＣ＝Ｏストレッチの吸収が上がり、ポリマーフィルム中にＣＯ２が担持されていることが確認された。さらに１Ｎ塩酸をフィルムへ滴下するとフィルムが溶解するのと同時に発泡が観察され、酸性雰囲気下で炭酸ガスを放出することが確認された。
【００６７】
４) 遺伝子導入活性の評価
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。添加量は、１ｍＬ容の溶液を滴下することで０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液濃度を調整して培養細胞へ加えた。遺伝子導入剤とＤＮＡの混合比はＣＯ２担持前の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭホモポリマーとＤＮＡの電荷数の関係で、陽電荷数が陰電荷数の５倍となるように調整した。４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭホモポリマーの単位重量あたりの陽電荷数は中和滴定により求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
ＣＯ２担持させた４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭホモポリマーの溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を０分〜３０分間窒素ガスでバブリングして実施例の遺伝子導入剤溶液とした。
この遺伝子導入剤溶液とＤＮＡ溶液を室温下で温和に混合しＯＰＴＩ−ＭＥＭで希釈し、培養細胞へ加えた。３時間後にＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄したあとに完全培地を加え、４８時間培養を行った。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。
【００６８】
比較例１
比較例の遺伝子導入剤溶液は、ＣＯ２ガスを担持していない２)で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭホモポリマーの溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を３０分間窒素ガスでバブリングして使用した。
この比較例１の遺伝子導入剤溶液についても、実施例１と同様にして遺伝子導入活性を評価した。結果を図１に示す。
【００６９】
図１より、実施例の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーのＣＯ２担持体は比較例よりも高い遺伝子導入活性を持っていた。この理由としてはＤＮＡと形成させたポリプレックスが細胞内へエンドサイトーシスによって取り込まれた後に酸性環境下のエンドソーム内でポリマー側鎖に担持されたＣＯ２が気化して体積が増えることでエンドソームを膨張させ、ポリプレックスのエンドソームからの脱出を助長していることが推定される。
【００７０】
図１の通り、実施例の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーのＣＯ２担持体は溶液調製後に窒素ガスをバブリングすることで時間依存性に遺伝子導入活性が減少し、１０分後には比較例と同等まで減少した。これは、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーの側鎖のジメチルアミノ基に担持させたＣＯ２が窒素ガスのバブリングによって除去された結果と考えられる。
【００７１】
４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーへのＣＯ２ガスの担持量の定量化（制御方法）、最適化、保存時の経時変化（自然に脱気される分）など今後の課題は多いが、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡＭポリマーのＣＯ２ガス担持体を遺伝子導入剤として使用することにより、効率の良い遺伝子導入が可能であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】実施例の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤において、該分岐鎖に炭酸系イオンが結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、炭酸系イオンが炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項３又は４において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項３ないし５のいずれか１項において、該分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項３ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、異なるモノマーとのランダム又はブロック共重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項７において、前記異なるモノマーは、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１】
芳香族環を核とし、それから伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤において、該分岐鎖に炭酸系イオンが結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、炭酸系イオンが炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項３又は４において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項３ないし５のいずれか１項において、該分岐鎖はビニル系モノマーのホモポリマーよりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項３ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記ビニル系モノマーと、異なるモノマーとのランダム又はブロック共重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項７において、前記異なるモノマーは、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【図１】
【公開番号】特開２００９−８２０８３（Ｐ２００９−８２０８３Ａ）
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５７６２６（Ｐ２００７−２５７６２６）
【出願日】平成１９年１０月１日（２００７．１０．１）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１日（２００７．１０．１）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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