遺伝子操作されたウサギ抗体可変ドメイン及びその使用
本発明は、抗原と免疫特異的に結合し、ウサギ免疫グロブリン由来の結合ドメインを含むポリペプチドをスクリーニング及び産生するための方法に関する。本発明の方法は、ウサギ抗体重鎖又は軽鎖スキャフォールドの使用により、特にげっ歯動物抗体由来のドメインと比べて、単離された免疫グロブリン可変ドメインに安定性及び／又は親和性の増強を付与する新規なＣＤＲループ及びフレームワーク領域の同定を可能にする。本発明の可変ドメインの安定性及び／又は親和性の増強により、単一ドメイン免疫特異的ポリペプチドを含む、つまりＶＨ又はＶＬドメインの一方を含む研究ツール又は治療用免疫特異的ポリペプチドの産生におけるそれらの使用が可能になる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と免疫特異的に結合するウサギＶＬ又はＶＨドメインを作製するための方法であって、
ａ）ファージ発現ライブラリーから、前記抗原と免疫特異的に結合するＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組のＤＮＡ配列を選択するステップであって、前記ファージ発現ライブラリーが、免疫グロブリンを発現する細胞を含有するウサギの生体試料から取得された、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列から調製されるステップと；
ｂ）前記一組の配列又はそのサブセットをＣＡＴとの融合タンパク質として細菌内で発現させ、ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択し、前記選択された細菌からウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする配列を取得するステップとを含む方法。
【請求項２】
抗原と免疫特異的に結合するウサギＶＬ又はＶＨドメインを作製するための方法であって、
ａ）ＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列をＣＡＴとの融合タンパク質として細菌内で発現させるステップであって、前記ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列が、免疫グロブリンを発現する細胞を含有するウサギの生体試料から取得されたステップと；
ｂ）ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択し、前記選択された細菌からウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組の配列を取得するステップと；
ｃ）前記抗原と免疫特異的に結合するＶＨ又はＶＬドメインをコードするファージ発現ライブラリーＤＮＡ配列を選択するステップであって、前記ライブラリーが前記一組の配列又はそのサブセットから調製されるステップとを含む方法。
【請求項３】
ウサギ生体試料が、抗原で免疫されたウサギに由来する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）が１回又は複数回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップｃ）が１回又は複数回繰り返される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
生体試料が形質細胞を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生体試料が、リンパ系組織、骨髄組織、又は虫垂組織を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
試料がリンパ系組織を含み、前記リンパ系組織が脾臓組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料がリンパ系組織を含み、前記リンパ系組織がリンパ節組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に従って作製されたＶＨ又はＶＬドメインを含む抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１１】
抗体が単鎖抗体である、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１２】
抗体が単一ドメイン抗体である、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１３】
抗体が抗体断片である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ断片である、請求項１３に記載の断片。
【請求項１５】
抗体がミニボディである、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１６】
抗体がダイアボディである、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１７】
抗体が二重特異性抗体である、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１８】
抗体がナノボディである、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１９】
抗体がＣＨ１ドメインを含まない、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項２０】
請求項１０〜１９のいずれかに記載の抗体又は断片のキメラ型。
【請求項２１】
請求項９〜１１のいずれかに記載の抗体又は断片のヒト化型。
【請求項２２】
抗原がマウス又はラットにおいて免疫原性でない、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項２３】
抗原がマウス又はラットにおいて免疫原性でない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｂ）において選択が、少なくとも１．８ｍＭのクロラムフェニコール濃度での選択である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２５】
組換えＶＨ又はＶＬドメインが少なくとも５４℃のＴｍを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２６】
組換えＶＨ又はＶＬドメインが、抗原に対して２０ｎＭ以下のＫｄを示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２７】
抗原と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの一方又は両方を含み、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はＣＬドメインの１又は複数を有していない；又はＶＨ若しくはＶＬドメインの一方を有していないポリペプチド。
【請求項２８】
ウサギＶＨドメインを含まない、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
ウサギ以外の種のＶＨドメインを含まない、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
ウサギＶＬドメインを含まない、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ウサギ以外の種のＶＬドメインを含まない、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
ＣＨ１ドメインを含まない、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
ＣＨ２ドメインを含まない、請求項２７又は請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ＣＨ３ドメインを含まない、請求項２７、３２、又は３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
抗原がマウス又はラットにおいて免疫原性でない、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
単鎖抗体である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
単一ドメイン抗体である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
抗体断片である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ断片である、請求項３８に記載の断片。
【請求項４０】
ミニボディである、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ダイアボディである、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
二重特異性抗体又は多特異性抗体である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ポリペプチドがナノボディである、請求項２７に記載のポリペプチド又は断片。
【請求項４４】
治療用作用剤、アルブミン相互作用ペプチド、フィブロネクチン相互作用ペプチド、フィブロネクチン、アルブミン、プロテインＡ、又はプロテインＧをさらに含む請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
治療用作用剤が細胞毒素である、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
治療用作用剤、アルブミン相互作用ペプチド、フィブロネクチン相互作用ペプチド、フィブロネクチン、アルブミン、プロテインＡ、又はプロテインＧとさらにコンジュゲートしている、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
治療用作用剤が細胞毒素又はｓｉＲＮＡである、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
治療用作用剤、アルブミン相互作用ペプチド、フィブロネクチン相互作用ペプチド、フィブロネクチン、アルブミン、プロテインＡ、又はプロテインＧとさらにコンジュゲートしている、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項４９】
治療用作用剤が細胞毒素又はｓｉＲＮＡである、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
抗原と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの一方又は両方を含み、かつ
（ａ）アミノ酸配列QEQLMETESGGGAEGGLVKPGASLTLTCTAS（配列番号５７）を有するＶＨ ＦＲ１ドメイン；
（ｂ）アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWIG（配列番号６９）を有するＶＨ ＦＲ２ドメイン；
（ｃ）アミノ酸配列YATWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQLNSLTAADTATYYCAR（配列番号９５）を有するＶＨ ＦＲ３ドメイン；
（ｄ）アミノ酸配列WGQGTLVTVSS（配列番号１３９）を有するＶＨ ＦＲ４ドメイン；
（ｅ）アミノ酸配列ELVLTQTPPSLSASVGETVRIRC（配列番号１５０）又はELVLTQTPSSVSAAVGGTVTINC（配列番号１５５）を有するＶＬ ＦＲ１ドメイン；
（ｆ）アミノ酸配列WYQQKPEKPPTLLIS（配列番号１７４）又はWYQQKPGQRPKLLIY（配列番号１８１）を有するＶＬ ＦＲ２ドメイン；
（ｇ）アミノ酸配列GVPPRFSGSGSGTDYTLTIGGVQAEDVATYYC（配列番号１８３）又はGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYC（配列番号２０５）を有するＶＬ ＦＲ３ドメイン；又は
（ｈ）アミノ酸配列FGAGTNVEIK（配列番号２０６）又はFAFGGGTELEIL（配列番号２１０）を有するＶＬ ＦＲ４ドメインの少なくとも１つを含むポリペプチド。
【請求項５１】
抗原と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの一方又を含み、かつ、
（ａ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの４６位フェニルアラニン；
（ｂ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５３位グルタミン酸；
（ｃ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５４位アルギニン；
（ｄ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５６位グリシン；
（ｅ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５８位アラニン；
（ｆ）ＶＨ ＣＤＲ１ドメインの４４位システイン；
（ｇ）ＶＨ ＣＤＲ２ドメインの５９位システイン；
（ｈ）ＶＨ ＦＲ４ドメインの１２６位アルギニン；
（ｉ）ＶＬ ＦＲ２ドメインの３９位フェニルアラニン又はチロシン；
（ｊ）ＶＬ ＦＲ２ドメインの４５位リジン；又は
（ｋ）ＶＬ ＦＲ３ドメインの９１位システインの少なくとも１つを含み、
前記位置が、それぞれ図３及び４のＶＨドメイン配列アラインメント又はＶＬドメイン配列アラインメントの位置に一致するポリペプチド。
【請求項１】
抗原と免疫特異的に結合するウサギＶＬ又はＶＨドメインを作製するための方法であって、
ａ）ファージ発現ライブラリーから、前記抗原と免疫特異的に結合するＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組のＤＮＡ配列を選択するステップであって、前記ファージ発現ライブラリーが、免疫グロブリンを発現する細胞を含有するウサギの生体試料から取得された、ＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列から調製されるステップと；
ｂ）前記一組の配列又はそのサブセットをＣＡＴとの融合タンパク質として細菌内で発現させ、ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択し、前記選択された細菌からウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする配列を取得するステップとを含む方法。
【請求項２】
抗原と免疫特異的に結合するウサギＶＬ又はＶＨドメインを作製するための方法であって、
ａ）ＶＨ又はＶＬドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列をＣＡＴとの融合タンパク質として細菌内で発現させるステップであって、前記ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列が、免疫グロブリンを発現する細胞を含有するウサギの生体試料から取得されたステップと；
ｂ）ＣＡＴ発現によるクロラムフェニコール耐性を有する細菌を選択し、前記選択された細菌からウサギＶＨ又はＶＬドメインをコードする一組の配列を取得するステップと；
ｃ）前記抗原と免疫特異的に結合するＶＨ又はＶＬドメインをコードするファージ発現ライブラリーＤＮＡ配列を選択するステップであって、前記ライブラリーが前記一組の配列又はそのサブセットから調製されるステップとを含む方法。
【請求項３】
ウサギ生体試料が、抗原で免疫されたウサギに由来する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）が１回又は複数回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップｃ）が１回又は複数回繰り返される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
生体試料が形質細胞を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
生体試料が、リンパ系組織、骨髄組織、又は虫垂組織を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
試料がリンパ系組織を含み、前記リンパ系組織が脾臓組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試料がリンパ系組織を含み、前記リンパ系組織がリンパ節組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に従って作製されたＶＨ又はＶＬドメインを含む抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項１１】
抗体が単鎖抗体である、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１２】
抗体が単一ドメイン抗体である、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１３】
抗体が抗体断片である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１４】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ断片である、請求項１３に記載の断片。
【請求項１５】
抗体がミニボディである、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１６】
抗体がダイアボディである、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１７】
抗体が二重特異性抗体である、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１８】
抗体がナノボディである、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項１９】
抗体がＣＨ１ドメインを含まない、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項２０】
請求項１０〜１９のいずれかに記載の抗体又は断片のキメラ型。
【請求項２１】
請求項９〜１１のいずれかに記載の抗体又は断片のヒト化型。
【請求項２２】
抗原がマウス又はラットにおいて免疫原性でない、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項２３】
抗原がマウス又はラットにおいて免疫原性でない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｂ）において選択が、少なくとも１．８ｍＭのクロラムフェニコール濃度での選択である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２５】
組換えＶＨ又はＶＬドメインが少なくとも５４℃のＴｍを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２６】
組換えＶＨ又はＶＬドメインが、抗原に対して２０ｎＭ以下のＫｄを示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２７】
抗原と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの一方又は両方を含み、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はＣＬドメインの１又は複数を有していない；又はＶＨ若しくはＶＬドメインの一方を有していないポリペプチド。
【請求項２８】
ウサギＶＨドメインを含まない、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
ウサギ以外の種のＶＨドメインを含まない、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
ウサギＶＬドメインを含まない、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ウサギ以外の種のＶＬドメインを含まない、請求項３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
ＣＨ１ドメインを含まない、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
ＣＨ２ドメインを含まない、請求項２７又は請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ＣＨ３ドメインを含まない、請求項２７、３２、又は３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
抗原がマウス又はラットにおいて免疫原性でない、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
単鎖抗体である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
単一ドメイン抗体である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
抗体断片である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ断片である、請求項３８に記載の断片。
【請求項４０】
ミニボディである、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ダイアボディである、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
二重特異性抗体又は多特異性抗体である、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ポリペプチドがナノボディである、請求項２７に記載のポリペプチド又は断片。
【請求項４４】
治療用作用剤、アルブミン相互作用ペプチド、フィブロネクチン相互作用ペプチド、フィブロネクチン、アルブミン、プロテインＡ、又はプロテインＧをさらに含む請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
治療用作用剤が細胞毒素である、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
治療用作用剤、アルブミン相互作用ペプチド、フィブロネクチン相互作用ペプチド、フィブロネクチン、アルブミン、プロテインＡ、又はプロテインＧとさらにコンジュゲートしている、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
治療用作用剤が細胞毒素又はｓｉＲＮＡである、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
治療用作用剤、アルブミン相互作用ペプチド、フィブロネクチン相互作用ペプチド、フィブロネクチン、アルブミン、プロテインＡ、又はプロテインＧとさらにコンジュゲートしている、請求項１０に記載の抗体又は断片。
【請求項４９】
治療用作用剤が細胞毒素又はｓｉＲＮＡである、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
抗原と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの一方又は両方を含み、かつ
（ａ）アミノ酸配列QEQLMETESGGGAEGGLVKPGASLTLTCTAS（配列番号５７）を有するＶＨ ＦＲ１ドメイン；
（ｂ）アミノ酸配列WVRQAPGKGLEWIG（配列番号６９）を有するＶＨ ＦＲ２ドメイン；
（ｃ）アミノ酸配列YATWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQLNSLTAADTATYYCAR（配列番号９５）を有するＶＨ ＦＲ３ドメイン；
（ｄ）アミノ酸配列WGQGTLVTVSS（配列番号１３９）を有するＶＨ ＦＲ４ドメイン；
（ｅ）アミノ酸配列ELVLTQTPPSLSASVGETVRIRC（配列番号１５０）又はELVLTQTPSSVSAAVGGTVTINC（配列番号１５５）を有するＶＬ ＦＲ１ドメイン；
（ｆ）アミノ酸配列WYQQKPEKPPTLLIS（配列番号１７４）又はWYQQKPGQRPKLLIY（配列番号１８１）を有するＶＬ ＦＲ２ドメイン；
（ｇ）アミノ酸配列GVPPRFSGSGSGTDYTLTIGGVQAEDVATYYC（配列番号１８３）又はGVSSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYC（配列番号２０５）を有するＶＬ ＦＲ３ドメイン；又は
（ｈ）アミノ酸配列FGAGTNVEIK（配列番号２０６）又はFAFGGGTELEIL（配列番号２１０）を有するＶＬ ＦＲ４ドメインの少なくとも１つを含むポリペプチド。
【請求項５１】
抗原と免疫特異的に結合するポリペプチドであって、ウサギＶＨ又はＶＬドメインの一方又を含み、かつ、
（ａ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの４６位フェニルアラニン；
（ｂ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５３位グルタミン酸；
（ｃ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５４位アルギニン；
（ｄ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５６位グリシン；
（ｅ）ＶＨ ＦＲ２ドメインの５８位アラニン；
（ｆ）ＶＨ ＣＤＲ１ドメインの４４位システイン；
（ｇ）ＶＨ ＣＤＲ２ドメインの５９位システイン；
（ｈ）ＶＨ ＦＲ４ドメインの１２６位アルギニン；
（ｉ）ＶＬ ＦＲ２ドメインの３９位フェニルアラニン又はチロシン；
（ｊ）ＶＬ ＦＲ２ドメインの４５位リジン；又は
（ｋ）ＶＬ ＦＲ３ドメインの９１位システインの少なくとも１つを含み、
前記位置が、それぞれ図３及び４のＶＨドメイン配列アラインメント又はＶＬドメイン配列アラインメントの位置に一致するポリペプチド。
【公表番号】特表２０１０−５２５８０８（Ｐ２０１０−５２５８０８Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６１１１（Ｐ２０１０−５０６１１１）
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＰＴ２００８／００００１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３６６９４
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０９３０２４６７）テクノファージ， インベスティガサン エ デセンボルビメント エム ビオテクノロジア，エスエー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＰＴ２００８／００００１８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３６６９４
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０９３０２４６７）テクノファージ， インベスティガサン エ デセンボルビメント エム ビオテクノロジア，エスエー (2)
【Ｆターム（参考）】
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