酵素固定用担体、固定化酵素および酵素固定用担体の製造方法
【課題】酵素固定化のための両親媒性基の導入量がより多く、更に多量に酵素を固定化することができる酵素固定用坦体およびその製造方法、ならびに坦体に坦持された酵素が有機溶媒中でもより高い触媒活性を有する固定化酵素を提供する。
【解決手段】官能基（Ａ）を有する樹脂粒子に、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーが、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合している酵素固定用担体。また、酵素を前記酵素固定用担体に固定化した固定化酵素。更に、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子と、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーとを、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合させる工程を有する酵素固定用担体の製造方法。
【解決手段】官能基（Ａ）を有する樹脂粒子に、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーが、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合している酵素固定用担体。また、酵素を前記酵素固定用担体に固定化した固定化酵素。更に、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子と、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーとを、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合させる工程を有する酵素固定用担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素固定用担体、固定化酵素および酵素固定用担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体触媒である酵素を利用したポリマー反応は、酵素の高い基質特異性を利用した反応であることから目的物を効率よく製造でき、温和な条件下の反応であるため使用エネルギーが少ないといった優れた方法である。エステル化反応を触媒できる酵素としてはリパーゼが一般的に知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。しかしながらエステル交換反応は有機溶媒中での反応であることから、水溶性のリパーゼでは分散しにくく、回収が困難であり、酵素の失活および活性が低いといった問題がある。
【０００３】
酵素の固定化に関し、以下のことが知られている。
１）有機溶媒中で酵素のエステル交換活性を高めるためは、高分子の固定化担体に官能基として高級脂肪酸のアシル基や両親媒性基である２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エチル基が有効であることが知られている（例えば非特許文献３）。
２）酵素の高分子への有用な固定化方法として、高級脂肪酸のアシル基をグラフト状に配置した高分子を合成してリパーゼを固定化し、グラフト状に配置しない高分子に比較してヘキサン中での安定性を１．５倍に高めた例が知られている（例えば非特許文献４）。
３）官能基（２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エチル基）のポリエトキシ基の重合度が３〜５である場合に有機溶媒中のエステル交換活性が高くなることを見出した（例えば非特許文献５）。
しかし、官能基の高分子粒子への導入量が低く、そのため酵素の固定化量も少ないという問題のため、有機溶媒中でも安定で活性が高い酵素の固定化用担体の開発が依然として望まれていた。
【０００４】
そこで、本発明者等は両親媒性基の導入量が多く、多量に酵素を固定化することができる酵素固定用坦体およびその製造方法を提供すること、ならびに坦体に坦持された酵素が有機溶媒中でも高い触媒活性を有する固定化酵素を提供することを目的として、アゾ基を有する高分子粒子に、アゾ基を重合開始剤として両親媒性官能基を有するモノマーがグラフト状に結合した酵素固定用担体を見出した（特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、該担体も両親媒性基の導入量は十分でなく、さらに多量に酵素を固定化することが可能な酵素固定用坦体およびその製造方法を提供することが望まれていた。また、坦体に坦持された酵素が有機溶媒中でさらに高い触媒活性を有することが可能な固定化酵素が望まれていた。
【０００６】
【非特許文献１】ＰＯＢＥＲＴＬＯＲＴＩＥ， Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅ， Ｖｏｌ．１５， Ｎｏ．１， ｐｐ．１−１５， １９９７
【非特許文献２】Ｅｒｎｓｔ Ｗｅｈｔｊｅ ａｎｄ Ｐａｔｒｉｃｋ Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ， Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ．１１， Ｎｏ．６， ｐｐ．５３７−５４０， １９９７
【非特許文献３】Ｍ． Ｙａｓｕｄａ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９０（６）， ｐｐ．６８７−６８９， ２０００
【非特許文献４】二階堂響；大阪府立大学修士論文集（２００３）
【非特許文献５】Ｍ． Ｙａｓｕｄａ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． Ｊｐｎ．， ３５（６）， ５１９−５２６，２００２
【特許文献１】特開２００５−２５３３８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は酵素固定化のための両親媒性基の導入量がより多く、さらに多量に酵素を固定化することができる酵素固定用坦体およびその製造方法を提供すること、ならびに坦体に坦持された酵素が有機溶媒中でもより高い触媒活性を有する固定化酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、両親媒性基を持つモノマーを高分子化した後に、粒子に導入することにより、多量の両親媒性基を有する粒子が合成でき、酵素固定化担体として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子に、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーが、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合していることを特徴とする酵素固定用担体を提供する。また、本発明は酵素を前記酵素固定用担体に固定化した固定化酵素を提供する。更に本発明は、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子と、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーとを、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合させる工程を有する酵素固定用担体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により得られた酵素固定用坦体は、酵素固定化に有用な両親媒性基が多く、高密度で酵素を固定化することができ、得られた固定化酵素は有機溶媒中での活性の低下が少ない。そのため種々の有機溶剤中の反応触媒として使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、両親媒性基を高分子化した後に粒子に導入することにより、両親媒性基を多量に有する酵素固定用坦体、及び該酵素固定用担体を製造するものである。本発明者らは両親媒性基を持つモノマーを粒子に導入する場合に、該モノマーを高分子化して導入することが重要であることを見出した。固定化担体においては、酵素が固定化される両親媒性基がより多量に導入されていることが望ましいが、両親媒性基を多量に導入することは、該モノマーをより高分子化して導入することにより達成される。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵素固定用担体は、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子（以下、単に「樹脂粒子」ということがある）に、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマー（以下、単に「両親媒性ポリマー」ということがある）が、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合していることを特徴とする。
【００１３】
本発明の酵素固定用担体は、樹脂粒子の単位質量（g）当たりの前記両親媒性ポリマーの結合量が多くできることが特徴であり、その量は１．５×１０−６〔ｍｏｌ／ｇ〕以上から、多いものでは１．９５×１０−４〔ｍｏｌ／ｇ〕以上、より好ましいものは１．９５×１０−４〜１．００×１０−２〔ｍｏｌ／ｇ〕、さらに好ましくは２．００×１０−４〜５．００×１０−４〔ｍｏｌ／ｋｇ〕の範囲である。
また、本発明の酵素固定用担体の粒子状であり、粒径が１〜１００μｍ、より好ましくは１〜１０μｍ、さらに好ましくは２〜５μｍの範囲である。
さらに、本発明の酵素固定用担体の見掛け密度は、６５０〔ｋｇ／ｍ３〕以上であり、より好ましくは７４０〜１０００〔ｋｇ／ｍ３〕であり、より好ましくは７５０〜８５０〔ｋｇ／ｍ３〕の範囲である。
【００１４】
（樹脂粒子について）
上述した酵素固定用担体を得る為には、本発明で使用する樹脂粒子はその粒径が１〜１００μｍ、より好ましくは１〜１０μｍ、さらに好ましくは２〜５μｍの範囲である。また、前記樹脂粒子の重量平均分子量は５〜３０万、有機溶媒中での粒子の膨潤等を抑制する観点からより好ましくは１０〜３０万の範囲のものである。
さらに前記樹脂粒子の粒径分布の標準偏差は１〜５０μｍ、粒子の回収性や分散性の観点から、好ましくは１〜１０μｍ、より好ましくは０．５〜２μｍの範囲である。
【００１５】
ここで、上記官能基（Ａ）としてはアミノ基、グリシジル基、カルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル、ハロホルミル基が挙げられる。
【００１６】
本発明で使用される樹脂粒子を構成する樹脂としては、本発明に使用するポリマーと反応する官能基（Ａ）を有し、かつ、上述の粒径、粒径分布、重量平均分子量を有するものであれば、従来公知の樹脂を始めとした種々の樹脂を特に制限無く使用できる。例えば、スチレンと、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、アクリル酸ペンタエリスリトールまたはエチレングリコールジメタクリレート等の架橋性モノマーとの共重合体や、前記架橋性モノマーとアクリル酸メチルやメタクリル酸メチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル等との共重合体などが好ましいものとして挙げられる。
このうち、得られる樹脂粒子の機械的安定性の点で、スチレンと架橋性モノマーとの共重合体よりなる樹脂粒子が好ましく、さらにスチレンとジビニルベンゼンよりなる樹脂粒子がより好ましい。
【００１７】
さらに、本発明に用いる樹脂粒子は、高分子量、大粒径、単分散性のものが得られる点で、いわゆる二段階膨潤シード重合によって得られた樹脂粒子であることが好ましい。
ここで「シード重合」とは、一般的にスチレン等重合体等の単分散種粒子にビニル系単量体を吸収させた後、重合を行いその粒径を均一に増大させる方法であり、また、「二段階膨潤シード重合」とは、前記シード重合により得られたシード粒子を疎水性化合物により膨潤させた後にビニル系単量体を重合させる方法を意味するものとする。
【００１８】
前記二段階膨潤シード重合により本発明の樹脂粒子を製造する方法は、公知慣用の方法を始めとして種々の方法を用いることができるが、例えば以下の方法により得られることができる。
すなわち、まず、スチレン等のエチレン性不飽和二重結合を有する単量体の分散重合によって単分散樹脂粒子を製造する。該単量体としては、例えば、スチレンや、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、アクリル酸ペンタエリスリトール、エチレングリコールジメタクリレート等の架橋性モノマーや、メタクリル酸メチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル等、およびそれらの組成物などが挙げられる。
なお、得られた単分散樹脂粒子は洗浄法や再沈法などの公知慣用の精製処理を始めとして種々の精製処理法で行うことが好ましい。
【００１９】
次に、該粒子をシード粒子として用い、該シード粒子を疎水性化合物に含浸して、疎水性化合物を吸収・膨潤させた単分散樹脂粒子を得る。
疎水性化合物としては塩化ラウリル、ヘキサデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、アジピン酸ジオクチル、ジオクタノイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド等などのアルカン及びその誘導体が挙げられる。この際、疎水性化合物の使用量は、シード粒子１００重量部に対して、１０〜１００重量部、好ましくは８５〜９５重量部の範囲である。
【００２０】
さらに、前記疎水性化合物を吸収・膨潤させた単分散樹脂粒子に、前記官能基（Ａ）を有し、かつエチレン性不飽和結合を有する単量体を混合して、窒素ガス等の不活性ガス雰囲気中で、２０〜４０℃で２４〜９６時間反応させて、本発明に使用するポリマーと結合するための置換基を有る樹脂粒子を合成することができる。更に得られた樹脂粒子は洗浄法や再沈法などの公知慣用の精製処理を始めとして種々の精製処理法で行うことが好ましい。
【００２１】
前記官能基（Ａ）を有し、かつエチレン性不飽和結合を有する単量体としては、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、アクリル酸ペンタエリスリトール、エチレングリコールジメタクリレート等の架橋性モノマーや、メタクリル酸メチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル等、およびそれらの組成物などが挙げられる。また、該単量体の使用量は、シード粒子１００重量部に対して、４５０〜２０００重量部、好ましくは９００〜１８００重量部の範囲である。
【００２２】
なお、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子に、さらに別の種類の官能基（A）を有する化合物を反応させることによって、もとの官能基（Ａ）とは異なる官能基（Ａ）を有する樹脂粒子を合成することもできる。
例えば、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子が、グリシジル基、カルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル、ハロホルミル基を有する樹脂粒子である場合には、グアニジノ基含有化合物、アミノ基含有化合物、アミノ基を含有する高分子などを反応させることによって、アミノ基を有する樹脂粒子を製造することもできる。
【００２３】
グアニジノ基含有化合物としては、例えば、グアニジン炭酸塩、グアニジン塩酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジンりん酸塩、グアニジンスルファミン酸塩、グアニジン硫酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン酢酸、３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホニルグアニジン、炭酸４−クロロフェニルグアニジン、炭酸３，４−ジクロロフェニルグアニジン、Ｎ，Ｎ'−ジフェニルグアニジン、フタル酸ジフェニルグアニジン、１，３−ジ−ｏ−トリルグアニジン、塩酸Ｎ−エチルグアニジン、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ニトログアニジン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、Ｎ，Ｎ'−ジフェニルグアニジン臭化水素酸塩、Ｎ−エチルグアニジン硫酸塩、ヒドロキシグアニジン硫酸塩、ｍ−ヨードベンジルグアニジンヘミ硫酸塩、メチルグアニジン塩酸塩、フェニルグアニジン炭酸塩、Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリフェニルグアニジンが挙げられ、Ｎ，Ｎ'−ジフェニルグアニジン、フタル酸ジフェニルグアニジン、１，３−ジ−ｏ−トリルグアニジン、Ｎ，Ｎ'−ジフェニルグアニジン臭化水素系酸塩が挙げられる。
アミノ基含有化合物としては、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン類やトリアミン類が挙げられる。
アミノ基を含有する高分子としては、ポリアリルアミン、ポリリシン等が挙げられる。
【００２４】
以下、本発明で用いる樹脂粒子の製造法の一例を示す。
具体的には、スチレンの分散重合により得られる単分散ポリスチレン粒子をシード粒子として用い、スチレンおよびジビニルベンゼン、及びメタクリル酸グリシジルを用いた二段階膨潤法によるシード共重合により重合開始基を有する高分子状の樹脂粒子を合成する方法が挙げられる。このようにして得た高分子状の樹脂粒子はエポキシ基を有しており、そのまま目的とする官能基を持つ分子を樹脂粒子に導入することができる。更に、グアニジン塩酸塩を用いてエポキシ基をアミノ化することによっても、カルボキシ基を持つ分子との縮合反応が可能であることから目的とする官能基を持つ分子を樹脂粒子に導入することも可能となる。
【００２５】
（両親媒性ポリマーについて）
次に、本発明で用いる両親媒性基（Ｃ）および官能基（Ｂ）を有するポリマーについて説明する。
本発明に用いる両親媒性基（Ｃ）および官能基（Ｂ）を有するポリマーは、まず、両親媒性基を有するマクロモノマー（以下、単に「両親媒性マクロモノマー」ということがある）を合成した後、官能基（Ｂ）を有する重合開始剤やモノマーとの共重合によって該マクロモノマーを高分子化することにより得られる。
【００２６】
本発明に用いる両親媒性ポリマーの重量平均分子量は１．０×１０４〜４．０×１０６程度であるが、両親媒性基をより担体に導入するためにはより高分子量であることが好ましく、１．０×１０５〜２．０×１０６、さらに好ましくは１．０×１０６〜２．０×１０６の範囲のものを用いることが好ましい。
【００２７】
ここで官能基（Ｂ）は、前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基であり、その種類としてはアミノ基、グリシジル基及びカルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル基およびハロホルミル基からなる群から選ばれる少なくとも一種の官能基が挙げられる。当然、官能基（Ｂ）は官能基（Ａ）との組合せにより選択されることから、官能基（Ａ）および官能基（Ｂ）どちらか一方がアミノ基であるとき、他方にグリシジル基、カルボキシ基、グリシジル基及びカルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル基およびハロホルミル基からなる群から選ばれる少なくとも一種の官能基である。
【００２８】
（両親媒性基マクロモノマー）
両親媒性基のうち、親水性基としてはポリエトキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、アミジノ基、アシルアミノ基等を挙げることができるが、ポリエトキシ基が好ましい。
疎水性基としてはｐ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェノキシ基、高級脂肪酸アシル基、フェノキシ基等を挙げることができるがｐ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェノキシ基が好ましい。
従って、両親媒性基としては、下記一般式
【００２９】
【化１】
【００３０】
で表されるｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ基が好ましい基として挙げられる。前記一般式においてｎは、１〜７６であり、より好ましくは３〜５である。
【００３１】
本発明で用いる両親媒性基の数平均分子量は２５０〜４０００、酵素との親和性の観点から好ましくは２６０〜３６００、より好ましくは３８０〜２０００の範囲である。
【００３２】
（両親媒性マクロモノマーの合成）
両親媒性マクロモノマーの合成法は特に限定されないが、例えば以下のようにアルコールとカルボン酸のエステル反応を利用した合成法にて合成することができる。すなわち、
両親媒性基を有するアルコール化合物及び（メタ）アクリル酸等のカルボキシ基を有する単量体に、塩基性触媒及び有機溶媒を添加して冷却しながら緩やかに攪拌する。そこへ有機溶媒に溶解させた脱水縮合剤を少量ずつ添加した後、緩やかな攪拌を維持したまま１０〜４０℃にて１〜３日反応させる。
【００３３】
両親媒性基を有するアルコール化合物としては、上述した疎水性基及び親水性基を有するアルコール化合物であれば特に限定されることはないが、例えば、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（なお、一般名「４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール」とも言う。以下同様。）（ｎ＝〜５）「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５」、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（ｎ＝〜１０）「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（ｎ＝〜１０）「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（ｎ＝〜１６）「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１６５」（いずれもシグマ社製；商標名）等が挙げられる。
【００３４】
（メタ）アクリル酸などのカルボキシ基を有する単量体の使用量は、両親媒性基を有するアルコール化合物１００重量部に対して、２〜４０重量部である。
塩基性触媒としてはトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。該塩基性触媒の使用量は両親媒性基を有するアルコール化合物１００重量部に対して、０．３〜５重量部の範囲である。
また、有機溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン、メトキシエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素などが挙げられる。該有機溶媒の使用量は、両親媒性基を有するアルコール化合物１００重量部に対して、９０〜１２５０重量部の範囲である。
【００３５】
さらに、脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミドやトリフルオロ酢酸無水物、スルホニルクロリドなどが挙げられる。該脱水縮合剤の使用量は、両親媒性基を有するアルコール化合物１００重量部に対して、７〜９５重量部の範囲である。
【００３６】
以下、本発明で用いる両親媒性マクロモノマーの製造法の一例を示す。
親水基としてポリエトキシ基及び疎水基として２−ｐ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェノキシ基を持つ２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール及びメタクリル酸に４−ジメチルピリジン及びジエチルエーテルを添加して冷却しながら緩やかに攪拌する。そこへジエチルエーテルに溶解させたＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を少量ずつ添加した後、緩やかな攪拌を維持したまま１０〜４０℃にて１〜３日反応させる。
続いて、得られた反応液を、塩酸および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出後、有機相を回収し、有機相中のジエチルエーテルをロータリーエバポレーター等により留去して、両親媒性基マクロモノマーを得ることができる。
【００３７】
なお、両親媒性基マクロモノマーにおいて親水性基のモノマーのポリエトキシ基の重合度は種々の重合度のものを使用することができるが、中でも重合度が３〜５であることが固定化した酵素の有機溶媒中での触媒活性が高くなることから好ましい。
【００３８】
（両親媒性マクロモノマーの高分子化）
次に、両親媒性マクロモノマーを高分子化する方法としては、溶液重合、ミセル重合といった手段があげられるが、高分子化が容易に達成できることから、ミセル重合で行うことが好ましい。また、両親媒性マクロモノマーの単独重合と比べて、より高分子量の両親媒性ポリマーが得られることから、前記両親媒性マクロモノマーとコモノマーとを共重合、好ましくはミセル共重合することが好ましい。
【００３９】
ミセル重合によって溶液重合より高分子化が可能な理由は未だ確定していないものの、以下の理由が考えられる。
ミセル重合では、該モノマー分子が会合してミセルを形成している。その内部では溶液重合に比して、局所的に濃度が高い状態にあるため成長反応が促進できる。さらに、生成するミセル状高分子は立体障害が大きく、その末端の活性点の反応停止が抑制されるため、高分子量化が進みやすいと考えられる。
【００４０】
ミセル重合の方法は公知慣用の方法を始めとして種々の方法で実施できるが、例えば、水性媒体中、前記両親媒性マクロモノマーを、好ましくは該マクロモノマーとコノモマーとを重合開始剤の存在下で３０〜１００℃程度の温度で１〜３０時間程度反応を行えばよい。なお、得られた両親媒性マクロモノマーは洗浄法や再沈法などの公知慣用の精製処理を始めとして種々の精製処理法で行うことが好ましい。
【００４１】
前記コモノマーとしては、官能基（Ｂ）を有しかつエチレン性不飽和結合を有する単量体であれば、従来公知のいずれのものを用いても良い。このような単量体としては、例えば、メタクリル酸、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸アリル、２−ヒドロキシルエチルメタクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、スチレン、ジビニルベンゼン等を挙げることができるがメタクリル酸またはメタクリル酸グリシジルが好ましく、さらにより高分子量のものが得られる点でメタクリル酸を用いることが好ましい。コノモマーの使用量は、両親媒性マクロモノマー１００重量部に対して、０．５重量部以下、より好ましくは０．０２〜０．３重量部の範囲である。
【００４２】
前記重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素などの水溶性重合開始剤を挙げることができる。また、水難溶性重合開始剤を溶媒に溶解して使用することもできる。水難溶性重合開始剤としては、例えば２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサン−１−カルボニトリル、２，２’−アソビスイソバレロニトリル、２，２’−アゾビスイソカプロニトリル、２，２’−アゾビス（フェニルイソブチロニトリル）、ベンゾイルパーオキシド、ジ−ｔ−ブチルパーオキシド、ジラウロイルパーオキシド、クメンハイドロパーオキシド、ジイソプロピルベンゼンハイドロパーオキシド、パラメンタンハイドロパーオキシド、ｔ−ブチルハイドロパーオキシド、３，５，５−トリメチルヘキサノールパーオキシド、ｔ−ブチルパーオキシ（２−エチルヘキサノエート）等を挙げることができる。好ましい水難溶性重合開始剤は、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、ベンゾイルパーオキシド、クメンハイドロパーオキシド、ジイソプロピルベンゼンハイドロパーオキシド、パラメンタンハイドロパーオキシド、ｔ−ブチルハイドロパーオキシド、３，５，５−トリメチルヘキサノールパーオキシド、ｔ−ブチルパーオキシ（２−エチルヘキサノエート）等である。該重合開始剤の使用量は、全単量体１００重量部当たり、通常０．１〜５重量部程度である。
【００４３】
溶媒としては、水難溶性重合開始剤を溶解すればいずれのものでもよいが、例えば、メタノール、エタノールなどのアルコール、メチルエチルケトン、アセトン、トリクロロトリフルオロエタン、メチルイソブチルケトン、ジメチルスルホキシド、トルエン、ジブチルフタレート、メチルピロリドン、酢酸エチル等を挙げることができる。溶媒の使用量は、少量であることが好ましく、水性媒体１００重量部に対して１〜２０重量部、より好ましくは１〜５重量部程度である。
【００４４】
以下、本発明で用いる両親媒性ポリマーの製造法の一例を示す。
例えば両親媒性マクロモノマーの単独重合またはコモノマーとの共重合では、予め重合開始剤を溶解させたごく微量のエタノールまたはコモノマーに両親媒性マクロモノマーを添加したモノマー液を作製し、水にこのモノマー液を添加する。液の添加後、氷浴中で超音波分散器を用いて油滴を乳化・分散させてミセルを形成させ、それを加熱することにより高分子化する。この際、両親媒性基を有するモノマーミセルを形成させるために、両親媒性マクロモノマーの濃度は、１０−４Ｍ以上にする必要がある。
【００４５】
反応終了後、反応液を冷却し、沈殿物を遠心分離し、高分子沈殿を回収する。沈殿した高分子にアセトンを加えて高分子を溶解させ、この高分子アセトン溶液をヘキサン中に滴下して高分子を再沈殿させ高分子の精製を行う。
【００４６】
このようにして得た単独重合体は、重合開始剤である４，４’−アゾビス４−シアノペンタン酸由来のカルボキシ基、共重合高分子は、両親媒性基であるｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ基以外に、またコモノマー由来のカルボキシ基やエポキシ基等を有していることから、粒子の持つアミノ基と縮合反応を行うことにより、樹脂粒子への両親媒性官能基の導入が可能となる。
【００４７】
（樹脂粒子と両親媒性ポリマーとの反応）
次に、本発明の酵素固定用担体の製造方法について説明する。
本発明の酵素固定用担体の製造方法は、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子と、
両親媒性基（Ｃ）及び前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーとを、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合させる工程、を有することを特徴とする。
【００４８】
樹脂粒子への両親媒性基ポリマーの導入方法としては、官能基（Ａ）と官能基（Ｂ）とが反応し結合する種々の方法であってもよく、例えば酸クロリド法や上記脱水縮合剤の存在下での縮合反応などが挙げられ、さらに具体的には以下のような方法で得ることできる。
【００４９】
官能基（Ｂ）を有する両親媒性ポリマーに有機溶媒を加え、更に前記官能基（Ａ）を有する樹脂粒子を添加して、粒子懸濁液を調製する。この粒子懸濁液をガラス製バイアル等に添加する。そこへ有機溶媒に溶解させた脱水縮合剤を少量ずつ添加した後、緩やかな撹拌を維持したまま、１０〜４０℃にて１〜３日反応させる。その際、得られた粒子は洗浄法や再沈法などの公知慣用の方法で精製処理を始めとして種々の精製処理法で行うことが好ましい。
【００５０】
以下、本発明の酵素固定用担体に用いる粒子の製造方法の一例を示す。
例えば、両親媒性基を持つミセル状のポリマーを含むアセトン溶液にアミノ基を有する樹脂粒子を添加する。この粒子懸濁液をガラス製バイアルに添加する。そこへアセトン溶液等の有機溶媒に溶解させたＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を少量ずつ添加した後、緩やかな撹拌を維持したまま、１０〜４０℃にて１日反応させる。反応終了後、粒子をろ過により回収し、アセトン及び蒸留水にて十分に洗浄する。
【００５１】
このようにして得られた本発明の酵素固定用担体は、酵素固定に有効である両親媒性基を多量に導入することが可能であり、また、高分子量の酵素分子が物質移動の影響を受けにくい粒子表層近傍に固定化されるため、活性の高い固定化酵素を得ることができる。
【００５２】
（固定化用の酵素）
本発明の酵素固定用担体に固定化される酵素の好ましい例としてはエステル交換活性を有する酵素を挙げることができる。例として、リパーゼ、ホスホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴエミリエーゼ、クチナーゼ等のエステラーゼまた、一部のプロテアーゼを挙げることができる。
【００５３】
（固定化方法）
本発明の酵素固定用担体への酵素の固定化方法は公知慣用の方法を始めとして種々の方法で行うことができるが、例えば、以下の方法で固定化することができる。本発明の酵素固定用担体と酵素液と緩衝剤を含む水溶液中で振とうさせ固定化させる。緩衝剤のｐＨは酵素を失活させないｐＨであれば良いが、酵素活性の至適ｐＨであることが好ましい。緩衝剤の濃度は酵素を失活させない濃度であれば特に限定されないが、５〜５００ｍＭが良く、好ましくは１０〜１００ｍＭである。固定化温度は酵素を失活させない温度であれば限定されないが、５０℃以下が良く、好ましくは３〜２０℃が良い。固定化反応に要する時間は５時間から４０時間、好ましくは１０〜２４時間である。
【００５４】
固定化方法において、水溶液中の酵素濃度は特に限定されないが、固定化効率の観点から前記酵素の溶解度以下でかつ充分な酵素濃度であることが望ましい。必要に応じて不溶性部分を遠心分離により除去し上澄みを使用しても差し支えない。酵素と坦体の使用割合は固定化酵素坦体１重量部に対して酵素０．０１〜１０重量部、好ましくは０．０５〜５重量部であるがこれに限定されない。酵素を固定化した坦体は、そのまま使用してもよいしあるいは温風乾燥、凍結乾燥により乾燥し使用することができる。
【００５５】
（酵素反応）
（エステル合成反応）
本発明における固定化酵素の反応例として、固定化酵素がエステル交換酵素である場合のエステル合成反応の例を示す。通常のメタノール、エタノール、プロパノール等の１価アルコール、ないしはプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、またはゲラニオール、シトロネロール、メントール等のテルペンアルコールあるいはコレステロール等のステロールと、炭素数２〜３６、好ましくは６〜２４の飽和または不飽和脂肪酸又はその低級アルコールエステルとのエステル化反応を上げることができる。さらにエステル合成反応の例としては、１分子中にカルボキシル基を２個以上含むアジピン酸、グルタル酸、スベリン酸、アゼライン酸等の多価カルボン酸と１分子中に水酸基を２個以上含むプロパンジオール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ジエチレングリコール等の多価値アルコールによるポリエステル反応を挙げることができる。またエスエル交換反応の例として、エステルとアルコールによるアルコリシス反応、エステル同士によるインターエステル化反応、リン脂質と各種アルコールによるトランスホスファチジレーション等の反応が挙げられる。
【００５６】
上記エステル化反応は必要に応じて、ヘキサン、イソクタン、イソプロピルエーテル等の有機溶媒を添加して行うことができる。エステル化反応は１５〜９０℃、好ましくは２０〜８０℃で行うことができる。
【実施例】
【００５７】
以下に本発明の実施例と比較例を挙げるが、本発明は実施例等に限定されるものではない。
【００５８】
（製造例１） 樹脂粒子の合成
（合成装置）
ガラス製３００ｍｌ容量のセパラブルフラスコに３口セパラブルフラスコカバーを取り付けたものを使用した。反応液はフッ素樹脂製三日月攪拌翼を先端に取り付けたガラス攪拌棒を攪拌用モーターに取り付け攪拌した。反応容器は温度コントローラーにより制御された恒温水槽内に設置した。また反応物や生成物の不必要な酸化を防ぐため、ガラス製９０度Ｌ字管を装着し、シルカゲル管を通すことにより乾燥させた窒素を流通させた。
【００５９】
（スチレンの分散重合による単分散ポリスチレン樹脂粒子の合成）
反応容器にスチレン３０．０ｇ、２，２−アゾビスブチロニトリル０．３ｇ、ポリビニルピロリドン（日本触媒「Ｋ−３０」）１．８ｇ、１−ヘキサデカン０．５ｇ、エタノール６７．４ｇを添加して重合反応を行った。重合反応は、窒素雰囲気下、２４時間、６０ｒｐｍ以下で反応液を攪拌させながら、７０℃にて行った。反応終了後、水槽温度を２０℃以下に落とし、反応液を５０ｍｌ容ガラス製遠心管４本に分注した。その後エタノールを分散媒として、粒子を分散させた後に遠心分離（１５００−２５００ｒｐｍ、５分）により回収する操作を３回、及び蒸留水を分散媒として、同様の操作を３回繰り返し、粒子を洗浄した。以上の操作により単分散ポリスチレン樹脂粒子（ＳＤ）を約２５ｇ得た。
【００６０】
（シード共重合（二段階膨潤法）でのエポキシ樹脂粒子の合成）
（第一段階湿潤）
ガラスバイアルに、蒸留水１５．４ｍｌ、ドデシル硫酸ナトリウム０．０２ｇ、塩化ラウリル０．５８５ｇ、シード粒子として反応例１で得た単分散ポリスチレン樹脂粒子０．６５ｇを入れ、ホモジナイザーを用いて１０分間水油混合液を分散処理した後、ソニケーターを用いて１０分間反応液を処理し、得られた液にアセトン１．１７ｍｌ、蒸留水０．２ｍｌを加えた。
この液を上述の合成装置と同様の装置に入れ、３０℃にて１６時間以上攪拌し、塩化ラウリルを吸収・膨潤させたポリスチレン樹脂粒子（ＳＤ）を得た。
【００６１】
（第二段階膨潤によるエポキシ樹脂粒子の合成）
１１０ｍｌ容量ガラス製バイアルに、蒸留水８４ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．２０ｇを添加した水溶液中に、重合開始剤２，２−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．０２５ｇ、ジビニルベンゼン２．６３ｇ、スチレン２．６３ｇ、メタクリル酸グリシジル０．５９ｇを加え、氷浴中で冷却しながらソニケーターで１０分間分散処理し、得られた液をモノマー乳化液とした。
【００６２】
上述反応器内の塩化ラウリルを吸収・膨潤させたポリスチレン樹脂粒子（ＳＤ）を含む分散液中に、モノマー乳化液を入れ、窒素雰囲気下、３０℃にて２時間攪拌した。次いで、７０℃下で２４時間攪拌した。反応により得た樹脂粒子は５Ｃの濾紙を用いて減圧濾過することで回収した。濾紙上の粒子をメタノール、次いで蒸留水により洗浄し、エポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ）約４ｇを得た。
【００６３】
（エポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ）へのグアニジノ基の導入）
グアノジン炭酸塩２．０ｇ、水酸化ナトリウム０．６ｇ、蒸留水３．０ｍｌを入れ、振とう溶解させた反応液と、１，４−ジオキサン５１．５ｇ、エポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ）３．０ｇを入れた反応液を上述反応器内に入れ、７０℃、１００〜２００ｒｐｍで２４ｈｒ攪拌した。反応により得た粒子は濾過により回収した。回収した樹脂粒子はメタノール及び蒸留水により十分に洗浄し、グアニジノ基（Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ−）、すなわちアミノ基を持つエポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）を約３ｇ得た。
【００６４】
（製造例２−１） 両親媒性マクロモノマーの合成
（両親媒性基マクロモノマーの合成装置）
全容量が５００ｍｌのセパラブルフラスコを使用した以外は、上述のエポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）を合成した装置と同じものを使用した。
【００６５】
（両親媒性基マクロモノマーの合成）
上述の装置を設置し反応に用いた。ジエチルエーテル１４０ｇ、メタクリル酸３．５２ｇ、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（シグマ社製 商品名：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５）１６ｇ、４−ジメチルアミノピリジン０．４９ｇを添加し混合の後、反応容器に入れた。ジエチルエーテルを４０ｇ入れそこへ脱水縮合剤Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを８．２４ｇ添加し溶解させた。この溶液を反応容器に添加し、３〜４０℃下、１００ｒｐｍで攪拌しながら２日間反応させた。
反応液を常圧濾過し、濾液に０．５Ｍ希塩酸、次いで、飽和炭酸ナトリウム水溶液を反応液に加えて分液漏斗にて振とうし、有機相と水相を分離した。室温にてジエチルエーテルをロータリーエバポレーターにて減圧留去した。
以上の操作により両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）約１２ｇを得た。
【００６６】
（製造例２−２）〜（製造例２−４）
「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５」の代わりに、「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」、「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−３０５」または「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５」を用いた以外は製造例（２−１）と同様にして両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−９．２０）、両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−２５．７）、両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４０．５）をそれぞれ得た。
【００６７】
（測定例１）
なお「ＭＡＸ−４．３９」の数字部分「４．３９」は両親媒性モノマー中の、官能基（２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エチル基）のポリエトキシ基の重合度を示している。この重合度は以下の方法にて測定した。
【００６８】
２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エチル基中のポリエトキシ基の重合度は、両親媒性基を有するマクロモノマーを、テトラメチルシランを含む重水素化クロロホルムに添加し、超伝導核磁気共鳴装置を用いて、Ｈ１−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られるスペクトル中のポリエトキシ基の水素の積分値（δ＝３．６−４．３）とフェニル基の水素の積分値（δ＝６．８−７．２）の比から算出した平均値である。
なお、下記で合成した粒子等（例えばＳＤ−ＭＡＸ−４．３９）において記述されている４．３９についても上記と同様にポリエトキシ基の重合度の平均値を意味している。
【００６９】
（製造例３−１） 両親媒性ポリマーの合成（その１）
（ミセル共重合による両親媒性基を有するマクロモノマーの高分子化）
両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）とコモノマーとしてメタクリル酸とを水溶液中にて、重合開始剤を用いてミセル共重合を行った。すなわち、５０ｍｌ容ポリチューブに１．５×１０−４ｍｏｌの両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．２９）を秤量し、少量（０．５ｍｌ）のメタノールに溶解させたものをモノマー溶液とした。これに、１．５×１０−５ｍｏｌのメタクリル酸及び２．２５×１０−４ｍｏｌの２，２−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）を含むメタノール（０．５ｍｌ）を加え、さらに蒸留水（２９ｍｌ）を加え反応液とした。反応液は、７０ｏＣの恒温水槽中で所定の時間反応させた。反応終了後、冷却し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、ポリマーの沈殿を得た。上清を除去した後、沈殿したポリマーにアセトンを加えて該ポリマーを溶解させ、この溶液をヘキサン中に滴下してポリマーを再沈殿させた。この操作を３回繰り返し、両親媒性ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９−ｃｏ−ＭＡ））を得た
【００７０】
（製造例３−２）〜（製造例３−４）
両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）の代わりに、両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−９．２０）、両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−２５．７）、または両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４０．５）を用いたこと以外は、製造例３−１と同様の方法で、両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−９．２０−ｃｏ−ＭＡ）、両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−２５．７−ｃｏ−ＭＡ）、または両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−４０．５−ｃｏ−ＭＡ）を得た。
【００７１】
（製造例４） 両親媒性ポリマーの合成（その２）
また、コモノマーを添加しなかったこと以外は製造工程例６と同様の方法で合成した両親媒性マクロモノマーの単独重合体を両親媒性ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９））という。
【００７２】
（製造例５） 両親媒性ポリマーの合成（その３）
（溶液重合によるポリマーの合成）
１ｍｌ容エッペンチューブに製造例５で得られた両親媒性基マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）を２３．４ｍｇ秤量し、クロロホルムを１．５ｇ加えモノマー溶液とした。このモノマー溶液に重合開始剤２，２−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）を１．８ｍｇ加え反応液とした。反応液は６０ｏＣの恒温水槽中で所定の時間反応させた。反応終了後、冷却し沈殿した両親媒性ポリマー（ｐ（ＭＡＸ−４．３９））を回収した。
【００７３】
（測定例２）
（両親媒性ポリマーの分子量の測定）
製造例４で得られた両親媒性基ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９））及び製造例５で得られた溶液重合により合成した高分子化した両親媒性ポリマー（ｐ（ＭＡＸ−４．３９））の分子量を測定した。分子量はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した。表１に分子量を示す。
【００７４】
【表１】
【００７５】
ミセル共重合により合成したｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９）は分子量が大きく、高分子量化されていることがわかった。
【００７６】
（実施例１） 酵素固定用担体に用いる粒子の合成
（両親媒性基ポリマーと樹脂粒子との合成）
樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）のアミノ基と両親媒性ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９−ｃｏ−ＭＡ））のカルボキシ基とを縮合することにより、両親媒性高分子ミセルを樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）に導入した。
すなわち、１１０ｍｌ容ガラス製バイアルに樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）０．３５ｇ、両親媒性ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９−ｃｏ−ＭＡ））０．２５ｇを含むアセトン溶液（１８ｍｌ）を加えた。バイアルに攪拌子を加え、１５０ｒｐｍにて攪拌しながら、室温にて２４時間反応させた。反応終了後、５Ｃの濾紙とヌッチェを用いて減圧濾過することにより粒子を回収し、ヌッチェ上の粒子にアセトン３００ｍｌを加えて減圧濾過し、さらに蒸留水３００ｍｌを加え減圧濾過することによって洗浄し、酵素固定用担体に用いる粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）を得た。
【００７７】
（実施例２〜４）
両親媒性ポリマーとして（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９−ｃｏ−ＭＡ））の代わりに、両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−９．２０−ｃｏ−ＭＡ）、両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−２５．７−ｃｏ−ＭＡ）、または両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−４０．５−ｃｏ−ＭＡ）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、酵素固定用担体に用いる粒子（ｍ−ＭＡＸ−９．２０）、粒子（ｍ−ＭＡＸ−２５．７）、粒子（ｍ−ＭＡＸ−４０．５）を得た。
【００７８】
（比較例１）
高分子化していない両親媒性基マクロモノマーを用いて二段階膨潤法によるシード共重合により、両親媒性基を持つ酵素固定用粒子を作製した。
すなわち、製造例１のシード共重合（二段階膨潤法）でのエポキシ樹脂粒子の合成において、第二段階膨潤によるエポキシ粒子の合成時に、モノマー乳化液中のメタクリル酸グリシジルの代わりに、同じく製造例２−１で得られた両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）０．５９ｇを添加して、両親媒性基を持つ粒子（以下「ＳＤ−ＭＡＸ−４．３９粒子」という）を４．５ｇを得た。
【００７９】
（比較例２）
製造例１に示した方法により、両親媒性基を持たないエポキシ樹脂粒子（ＳＧＤ）を得た。
【００８０】
（比較例３）
特開２００５−２５３３８１に記載の方法に準じて、アゾ基を有する高分子粒子に、アゾ基を重合開始剤として両親媒性官能基を有するモノマーがグラフト状に結合した酵素固定用担体として用いる粒子を作製した。
すなわち、製造例１のシード共重合（二段階膨潤法）でのエポキシ樹脂粒子の合成において、第二段階膨潤によるエポキシ粒子の合成時に、モノマー乳化液中のメタクリル酸グリシジルの代わりに、下記の２，２−アゾビス−（Ｎ−（２−プロペニル）−２−メチルプロピオンアミド）（和光純薬社製）０．１３ｇを用いた以外は、製造例１と同様の方法でアゾ基を持つアゾ粒子を約４ｇ得た。
続いて、ガラス試験管にトルエン（ナカライテクス社製）４．５ｇに、前記アゾ粒子０．９２ｇ、メタクリル酸（ナカライテクス社製）０．１８ｇを添加して、１００℃で４時間反応させた。得られた粒子をトルエン、メタノール、蒸留水、最後に緩衝液にて洗浄後、粒子（ｇ−ＭＡＸ−４．３９−ＳＤ）を得た。
【００８１】
（測定例３）
（粒子中の両親媒性基の測定）
実施例１で得られたｍ−ＭＡＸ−４．３９粒子及び比較例１で得られたＳＤ−ＭＡＸ−４．３９粒子は、両親媒性基を有する。そこで、示差走査型熱量分析装置（ＤＳＣ）を用いて粒子中の示差熱量のサーモグラムを測定し、得られるポリエトキシ基のピーク面積を解析することにより粒子中に導入された両親媒性基（ＭＡＸ−４．３９）の量を定量した。表２に各粒子中の両親媒性基（ＭＡＸ−４．３９）の量を示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
表２より実施例１で得られた粒子は比較例粒子より両親媒性基の導入量が多いことがわかった。
【００８４】
（応用例１）
（酵素固定用担体へのリパーゼの固定化）
実施例１、比較例１、比較例２及び比較例３で得られた各粒子を酵素固定用担体として用いリパーゼの固定化を行った。すなわち、各粒子１０ｍｇとＲｈｉｚｏｐｕｓ．ｄｅｌｅｍａｒ由来のリパーゼ（生化学工業社製 ＦＩＮＥ ｇｒａｄｅ）３．７ｍｇをｐＨ５．５の１０ｍＭリン酸緩衝液１ｍｌ中に添加して、４℃にて２４時間固定化処理した。
【００８５】
固定化処理前のタンパク質濃度と固定化処理後のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量し固定化量を求めた。表２に各粒子へのリパーゼの固定化量を示す。
また酵素が固定化した各粒子の加水分解活性を測定した。
具体的には、２，３−ジメルカプトプロパノールトリブチレイト（シグマ社製；以下ＢＡＬＢと称す）の分解速度を５，５’−チオビス（２−ニトロ安息香酸）（ナカライテクス社製：以下ＤＴＮＢと称す）を発色試薬として定量する方法により行った。３ｍＭＤＴＮＢを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに固定化リパーゼ１０ｍｇを入れ３０℃で５分間保温した。この溶液に基質として２０ｍＢＡＬＡを含むエタノール（ナカライテクス社製）１００μｌを加えて１０分間反応させた。反応停止のためにアセトン（ナカライテクス社製）２ｍｌを添加し、分光光度計にて４１２ｎｍの吸光度を測定した。酵素活性は１分間に１μｍｏｌのＳＨ基を遊離させる酵素量を１Ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義して次式により求めた。
【００８６】
酵素活性（Ｕ）＝４１２ｎｍ吸光度の増分／４．７５（モル吸光係数に反応液体積を乗じμｍｏｌに換算したもの）／反応時間（ｍｉｎ）
【００８７】
表３に各粒子の分解活性を示した。
【００８８】
【表３】
【００８９】
表３より実施例１の酵素固定用担体は、両親媒性基を有し、比較例の酵素固定用担体よりリパーゼの固定化量が多いことがわかった。また単位担体当たりのリパーゼの比活性も実施例１の酵素固定用担体に固定化した場合が最も高かった。
これは表１の結果より両親媒性基の導入量が多い、即ち疎水基であるｐ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェノキシ基の導入量が多いためである。
【００９０】
（応用例２）
（粒子へ固定化したリパーゼのヘキサン中での安定性）
応用例１と同様の方法にてリパーゼを固定化させた粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）を１０ｍＭのｐＨ５．５のリン酸緩衝液に懸濁させ遠心分離器により粒子を分離した。凍結乾燥機を用いて減圧下で乾燥させた。酵素を固定化した粒子３０ｍｇをヘキサン３０ｍｌに懸濁させ３７℃にて、特定時間放置した後、０．４５μｍのメンブレンフィルターにて濾過し、回収したリパーゼの残存活性率を測定した。
残存活性率の測定は応用例１で示した方法と同様のエステル加水分解反応により酵素活性を測定することにより行った。
【００９１】
残存活性率は、ヘキサン中に懸濁した直後の酵素活性に対する、ヘキサン中での特定時間放置後における酵素活性の比として求めた。得られた残存活性率の経時的変化を図１に示す。
図１中には比較として同様の酵素固定化処理を行った比較例１で得られた粒子（ＳＤ−ＭＡＸ−４．３９）の結果を合わせて示した。
図１の結果より実施例１の粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化したリパーゼは比較例１の粒子（ＳＤ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化したリパーゼに比較してヘキサン中における加水分解活性の低下が少ないことがわかった。また図１から推定される加水分解活性の半減期は比較例１の粒子（ＳＤ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化したリパーゼで９００時間、実施例１の粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化されたリパーゼは５４００時間と計算され、粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化されたリパーゼは半減期が６倍長くなった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明により得られた固定化坦体は、酵素固定化量が多く各種酵素の固定化に有用である。また坦体に固定化された酵素は有機溶媒中での高い安定性を示し、また高い活性を示すことから有機溶媒中における各種のエステル化反応に利用することができる。例えば各種ポリステルの製造、各種脂肪酸エステル、糖エステル、ステロイド等の製造、あるいは植物油、動物油の改質方法に適用でき、産業上の幅広い分野への利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】両親媒性粒子により合成された酵素固定用坦体（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化されたリパーゼのヘキサン中での安定性、即ちヘキサン中での残存活性率（Ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の経時変化を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素固定用担体、固定化酵素および酵素固定用担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体触媒である酵素を利用したポリマー反応は、酵素の高い基質特異性を利用した反応であることから目的物を効率よく製造でき、温和な条件下の反応であるため使用エネルギーが少ないといった優れた方法である。エステル化反応を触媒できる酵素としてはリパーゼが一般的に知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。しかしながらエステル交換反応は有機溶媒中での反応であることから、水溶性のリパーゼでは分散しにくく、回収が困難であり、酵素の失活および活性が低いといった問題がある。
【０００３】
酵素の固定化に関し、以下のことが知られている。
１）有機溶媒中で酵素のエステル交換活性を高めるためは、高分子の固定化担体に官能基として高級脂肪酸のアシル基や両親媒性基である２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エチル基が有効であることが知られている（例えば非特許文献３）。
２）酵素の高分子への有用な固定化方法として、高級脂肪酸のアシル基をグラフト状に配置した高分子を合成してリパーゼを固定化し、グラフト状に配置しない高分子に比較してヘキサン中での安定性を１．５倍に高めた例が知られている（例えば非特許文献４）。
３）官能基（２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エチル基）のポリエトキシ基の重合度が３〜５である場合に有機溶媒中のエステル交換活性が高くなることを見出した（例えば非特許文献５）。
しかし、官能基の高分子粒子への導入量が低く、そのため酵素の固定化量も少ないという問題のため、有機溶媒中でも安定で活性が高い酵素の固定化用担体の開発が依然として望まれていた。
【０００４】
そこで、本発明者等は両親媒性基の導入量が多く、多量に酵素を固定化することができる酵素固定用坦体およびその製造方法を提供すること、ならびに坦体に坦持された酵素が有機溶媒中でも高い触媒活性を有する固定化酵素を提供することを目的として、アゾ基を有する高分子粒子に、アゾ基を重合開始剤として両親媒性官能基を有するモノマーがグラフト状に結合した酵素固定用担体を見出した（特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、該担体も両親媒性基の導入量は十分でなく、さらに多量に酵素を固定化することが可能な酵素固定用坦体およびその製造方法を提供することが望まれていた。また、坦体に坦持された酵素が有機溶媒中でさらに高い触媒活性を有することが可能な固定化酵素が望まれていた。
【０００６】
【非特許文献１】ＰＯＢＥＲＴＬＯＲＴＩＥ， Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅ， Ｖｏｌ．１５， Ｎｏ．１， ｐｐ．１−１５， １９９７
【非特許文献２】Ｅｒｎｓｔ Ｗｅｈｔｊｅ ａｎｄ Ｐａｔｒｉｃｋ Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ， Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ．１１， Ｎｏ．６， ｐｐ．５３７−５４０， １９９７
【非特許文献３】Ｍ． Ｙａｓｕｄａ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９０（６）， ｐｐ．６８７−６８９， ２０００
【非特許文献４】二階堂響；大阪府立大学修士論文集（２００３）
【非特許文献５】Ｍ． Ｙａｓｕｄａ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． Ｊｐｎ．， ３５（６）， ５１９−５２６，２００２
【特許文献１】特開２００５−２５３３８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は酵素固定化のための両親媒性基の導入量がより多く、さらに多量に酵素を固定化することができる酵素固定用坦体およびその製造方法を提供すること、ならびに坦体に坦持された酵素が有機溶媒中でもより高い触媒活性を有する固定化酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、両親媒性基を持つモノマーを高分子化した後に、粒子に導入することにより、多量の両親媒性基を有する粒子が合成でき、酵素固定化担体として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子に、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーが、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合していることを特徴とする酵素固定用担体を提供する。また、本発明は酵素を前記酵素固定用担体に固定化した固定化酵素を提供する。更に本発明は、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子と、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーとを、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合させる工程を有する酵素固定用担体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により得られた酵素固定用坦体は、酵素固定化に有用な両親媒性基が多く、高密度で酵素を固定化することができ、得られた固定化酵素は有機溶媒中での活性の低下が少ない。そのため種々の有機溶剤中の反応触媒として使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、両親媒性基を高分子化した後に粒子に導入することにより、両親媒性基を多量に有する酵素固定用坦体、及び該酵素固定用担体を製造するものである。本発明者らは両親媒性基を持つモノマーを粒子に導入する場合に、該モノマーを高分子化して導入することが重要であることを見出した。固定化担体においては、酵素が固定化される両親媒性基がより多量に導入されていることが望ましいが、両親媒性基を多量に導入することは、該モノマーをより高分子化して導入することにより達成される。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵素固定用担体は、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子（以下、単に「樹脂粒子」ということがある）に、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマー（以下、単に「両親媒性ポリマー」ということがある）が、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合していることを特徴とする。
【００１３】
本発明の酵素固定用担体は、樹脂粒子の単位質量（g）当たりの前記両親媒性ポリマーの結合量が多くできることが特徴であり、その量は１．５×１０−６〔ｍｏｌ／ｇ〕以上から、多いものでは１．９５×１０−４〔ｍｏｌ／ｇ〕以上、より好ましいものは１．９５×１０−４〜１．００×１０−２〔ｍｏｌ／ｇ〕、さらに好ましくは２．００×１０−４〜５．００×１０−４〔ｍｏｌ／ｋｇ〕の範囲である。
また、本発明の酵素固定用担体の粒子状であり、粒径が１〜１００μｍ、より好ましくは１〜１０μｍ、さらに好ましくは２〜５μｍの範囲である。
さらに、本発明の酵素固定用担体の見掛け密度は、６５０〔ｋｇ／ｍ３〕以上であり、より好ましくは７４０〜１０００〔ｋｇ／ｍ３〕であり、より好ましくは７５０〜８５０〔ｋｇ／ｍ３〕の範囲である。
【００１４】
（樹脂粒子について）
上述した酵素固定用担体を得る為には、本発明で使用する樹脂粒子はその粒径が１〜１００μｍ、より好ましくは１〜１０μｍ、さらに好ましくは２〜５μｍの範囲である。また、前記樹脂粒子の重量平均分子量は５〜３０万、有機溶媒中での粒子の膨潤等を抑制する観点からより好ましくは１０〜３０万の範囲のものである。
さらに前記樹脂粒子の粒径分布の標準偏差は１〜５０μｍ、粒子の回収性や分散性の観点から、好ましくは１〜１０μｍ、より好ましくは０．５〜２μｍの範囲である。
【００１５】
ここで、上記官能基（Ａ）としてはアミノ基、グリシジル基、カルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル、ハロホルミル基が挙げられる。
【００１６】
本発明で使用される樹脂粒子を構成する樹脂としては、本発明に使用するポリマーと反応する官能基（Ａ）を有し、かつ、上述の粒径、粒径分布、重量平均分子量を有するものであれば、従来公知の樹脂を始めとした種々の樹脂を特に制限無く使用できる。例えば、スチレンと、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、アクリル酸ペンタエリスリトールまたはエチレングリコールジメタクリレート等の架橋性モノマーとの共重合体や、前記架橋性モノマーとアクリル酸メチルやメタクリル酸メチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル等との共重合体などが好ましいものとして挙げられる。
このうち、得られる樹脂粒子の機械的安定性の点で、スチレンと架橋性モノマーとの共重合体よりなる樹脂粒子が好ましく、さらにスチレンとジビニルベンゼンよりなる樹脂粒子がより好ましい。
【００１７】
さらに、本発明に用いる樹脂粒子は、高分子量、大粒径、単分散性のものが得られる点で、いわゆる二段階膨潤シード重合によって得られた樹脂粒子であることが好ましい。
ここで「シード重合」とは、一般的にスチレン等重合体等の単分散種粒子にビニル系単量体を吸収させた後、重合を行いその粒径を均一に増大させる方法であり、また、「二段階膨潤シード重合」とは、前記シード重合により得られたシード粒子を疎水性化合物により膨潤させた後にビニル系単量体を重合させる方法を意味するものとする。
【００１８】
前記二段階膨潤シード重合により本発明の樹脂粒子を製造する方法は、公知慣用の方法を始めとして種々の方法を用いることができるが、例えば以下の方法により得られることができる。
すなわち、まず、スチレン等のエチレン性不飽和二重結合を有する単量体の分散重合によって単分散樹脂粒子を製造する。該単量体としては、例えば、スチレンや、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、アクリル酸ペンタエリスリトール、エチレングリコールジメタクリレート等の架橋性モノマーや、メタクリル酸メチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル等、およびそれらの組成物などが挙げられる。
なお、得られた単分散樹脂粒子は洗浄法や再沈法などの公知慣用の精製処理を始めとして種々の精製処理法で行うことが好ましい。
【００１９】
次に、該粒子をシード粒子として用い、該シード粒子を疎水性化合物に含浸して、疎水性化合物を吸収・膨潤させた単分散樹脂粒子を得る。
疎水性化合物としては塩化ラウリル、ヘキサデカン、テトラデカン、ヘキサデカン、アジピン酸ジオクチル、ジオクタノイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド等などのアルカン及びその誘導体が挙げられる。この際、疎水性化合物の使用量は、シード粒子１００重量部に対して、１０〜１００重量部、好ましくは８５〜９５重量部の範囲である。
【００２０】
さらに、前記疎水性化合物を吸収・膨潤させた単分散樹脂粒子に、前記官能基（Ａ）を有し、かつエチレン性不飽和結合を有する単量体を混合して、窒素ガス等の不活性ガス雰囲気中で、２０〜４０℃で２４〜９６時間反応させて、本発明に使用するポリマーと結合するための置換基を有る樹脂粒子を合成することができる。更に得られた樹脂粒子は洗浄法や再沈法などの公知慣用の精製処理を始めとして種々の精製処理法で行うことが好ましい。
【００２１】
前記官能基（Ａ）を有し、かつエチレン性不飽和結合を有する単量体としては、ジビニルベンゼン、トリメリット酸トリアリル、アクリル酸ペンタエリスリトール、エチレングリコールジメタクリレート等の架橋性モノマーや、メタクリル酸メチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル等、およびそれらの組成物などが挙げられる。また、該単量体の使用量は、シード粒子１００重量部に対して、４５０〜２０００重量部、好ましくは９００〜１８００重量部の範囲である。
【００２２】
なお、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子に、さらに別の種類の官能基（A）を有する化合物を反応させることによって、もとの官能基（Ａ）とは異なる官能基（Ａ）を有する樹脂粒子を合成することもできる。
例えば、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子が、グリシジル基、カルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル、ハロホルミル基を有する樹脂粒子である場合には、グアニジノ基含有化合物、アミノ基含有化合物、アミノ基を含有する高分子などを反応させることによって、アミノ基を有する樹脂粒子を製造することもできる。
【００２３】
グアニジノ基含有化合物としては、例えば、グアニジン炭酸塩、グアニジン塩酸塩、グアニジン硝酸塩、グアニジンりん酸塩、グアニジンスルファミン酸塩、グアニジン硫酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン酢酸、３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホニルグアニジン、炭酸４−クロロフェニルグアニジン、炭酸３，４−ジクロロフェニルグアニジン、Ｎ，Ｎ'−ジフェニルグアニジン、フタル酸ジフェニルグアニジン、１，３−ジ−ｏ−トリルグアニジン、塩酸Ｎ−エチルグアニジン、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ニトログアニジン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、Ｎ，Ｎ'−ジフェニルグアニジン臭化水素酸塩、Ｎ−エチルグアニジン硫酸塩、ヒドロキシグアニジン硫酸塩、ｍ−ヨードベンジルグアニジンヘミ硫酸塩、メチルグアニジン塩酸塩、フェニルグアニジン炭酸塩、Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリフェニルグアニジンが挙げられ、Ｎ，Ｎ'−ジフェニルグアニジン、フタル酸ジフェニルグアニジン、１，３−ジ−ｏ−トリルグアニジン、Ｎ，Ｎ'−ジフェニルグアニジン臭化水素系酸塩が挙げられる。
アミノ基含有化合物としては、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン類やトリアミン類が挙げられる。
アミノ基を含有する高分子としては、ポリアリルアミン、ポリリシン等が挙げられる。
【００２４】
以下、本発明で用いる樹脂粒子の製造法の一例を示す。
具体的には、スチレンの分散重合により得られる単分散ポリスチレン粒子をシード粒子として用い、スチレンおよびジビニルベンゼン、及びメタクリル酸グリシジルを用いた二段階膨潤法によるシード共重合により重合開始基を有する高分子状の樹脂粒子を合成する方法が挙げられる。このようにして得た高分子状の樹脂粒子はエポキシ基を有しており、そのまま目的とする官能基を持つ分子を樹脂粒子に導入することができる。更に、グアニジン塩酸塩を用いてエポキシ基をアミノ化することによっても、カルボキシ基を持つ分子との縮合反応が可能であることから目的とする官能基を持つ分子を樹脂粒子に導入することも可能となる。
【００２５】
（両親媒性ポリマーについて）
次に、本発明で用いる両親媒性基（Ｃ）および官能基（Ｂ）を有するポリマーについて説明する。
本発明に用いる両親媒性基（Ｃ）および官能基（Ｂ）を有するポリマーは、まず、両親媒性基を有するマクロモノマー（以下、単に「両親媒性マクロモノマー」ということがある）を合成した後、官能基（Ｂ）を有する重合開始剤やモノマーとの共重合によって該マクロモノマーを高分子化することにより得られる。
【００２６】
本発明に用いる両親媒性ポリマーの重量平均分子量は１．０×１０４〜４．０×１０６程度であるが、両親媒性基をより担体に導入するためにはより高分子量であることが好ましく、１．０×１０５〜２．０×１０６、さらに好ましくは１．０×１０６〜２．０×１０６の範囲のものを用いることが好ましい。
【００２７】
ここで官能基（Ｂ）は、前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基であり、その種類としてはアミノ基、グリシジル基及びカルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル基およびハロホルミル基からなる群から選ばれる少なくとも一種の官能基が挙げられる。当然、官能基（Ｂ）は官能基（Ａ）との組合せにより選択されることから、官能基（Ａ）および官能基（Ｂ）どちらか一方がアミノ基であるとき、他方にグリシジル基、カルボキシ基、グリシジル基及びカルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル基およびハロホルミル基からなる群から選ばれる少なくとも一種の官能基である。
【００２８】
（両親媒性基マクロモノマー）
両親媒性基のうち、親水性基としてはポリエトキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、アミジノ基、アシルアミノ基等を挙げることができるが、ポリエトキシ基が好ましい。
疎水性基としてはｐ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェノキシ基、高級脂肪酸アシル基、フェノキシ基等を挙げることができるがｐ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェノキシ基が好ましい。
従って、両親媒性基としては、下記一般式
【００２９】
【化１】
【００３０】
で表されるｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ基が好ましい基として挙げられる。前記一般式においてｎは、１〜７６であり、より好ましくは３〜５である。
【００３１】
本発明で用いる両親媒性基の数平均分子量は２５０〜４０００、酵素との親和性の観点から好ましくは２６０〜３６００、より好ましくは３８０〜２０００の範囲である。
【００３２】
（両親媒性マクロモノマーの合成）
両親媒性マクロモノマーの合成法は特に限定されないが、例えば以下のようにアルコールとカルボン酸のエステル反応を利用した合成法にて合成することができる。すなわち、
両親媒性基を有するアルコール化合物及び（メタ）アクリル酸等のカルボキシ基を有する単量体に、塩基性触媒及び有機溶媒を添加して冷却しながら緩やかに攪拌する。そこへ有機溶媒に溶解させた脱水縮合剤を少量ずつ添加した後、緩やかな攪拌を維持したまま１０〜４０℃にて１〜３日反応させる。
【００３３】
両親媒性基を有するアルコール化合物としては、上述した疎水性基及び親水性基を有するアルコール化合物であれば特に限定されることはないが、例えば、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（なお、一般名「４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール」とも言う。以下同様。）（ｎ＝〜５）「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５」、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（ｎ＝〜１０）「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（ｎ＝〜１０）「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（ｎ＝〜１６）「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１６５」（いずれもシグマ社製；商標名）等が挙げられる。
【００３４】
（メタ）アクリル酸などのカルボキシ基を有する単量体の使用量は、両親媒性基を有するアルコール化合物１００重量部に対して、２〜４０重量部である。
塩基性触媒としてはトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。該塩基性触媒の使用量は両親媒性基を有するアルコール化合物１００重量部に対して、０．３〜５重量部の範囲である。
また、有機溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン、メトキシエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素などが挙げられる。該有機溶媒の使用量は、両親媒性基を有するアルコール化合物１００重量部に対して、９０〜１２５０重量部の範囲である。
【００３５】
さらに、脱水縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミドやトリフルオロ酢酸無水物、スルホニルクロリドなどが挙げられる。該脱水縮合剤の使用量は、両親媒性基を有するアルコール化合物１００重量部に対して、７〜９５重量部の範囲である。
【００３６】
以下、本発明で用いる両親媒性マクロモノマーの製造法の一例を示す。
親水基としてポリエトキシ基及び疎水基として２−ｐ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェノキシ基を持つ２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール及びメタクリル酸に４−ジメチルピリジン及びジエチルエーテルを添加して冷却しながら緩やかに攪拌する。そこへジエチルエーテルに溶解させたＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を少量ずつ添加した後、緩やかな攪拌を維持したまま１０〜４０℃にて１〜３日反応させる。
続いて、得られた反応液を、塩酸および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出後、有機相を回収し、有機相中のジエチルエーテルをロータリーエバポレーター等により留去して、両親媒性基マクロモノマーを得ることができる。
【００３７】
なお、両親媒性基マクロモノマーにおいて親水性基のモノマーのポリエトキシ基の重合度は種々の重合度のものを使用することができるが、中でも重合度が３〜５であることが固定化した酵素の有機溶媒中での触媒活性が高くなることから好ましい。
【００３８】
（両親媒性マクロモノマーの高分子化）
次に、両親媒性マクロモノマーを高分子化する方法としては、溶液重合、ミセル重合といった手段があげられるが、高分子化が容易に達成できることから、ミセル重合で行うことが好ましい。また、両親媒性マクロモノマーの単独重合と比べて、より高分子量の両親媒性ポリマーが得られることから、前記両親媒性マクロモノマーとコモノマーとを共重合、好ましくはミセル共重合することが好ましい。
【００３９】
ミセル重合によって溶液重合より高分子化が可能な理由は未だ確定していないものの、以下の理由が考えられる。
ミセル重合では、該モノマー分子が会合してミセルを形成している。その内部では溶液重合に比して、局所的に濃度が高い状態にあるため成長反応が促進できる。さらに、生成するミセル状高分子は立体障害が大きく、その末端の活性点の反応停止が抑制されるため、高分子量化が進みやすいと考えられる。
【００４０】
ミセル重合の方法は公知慣用の方法を始めとして種々の方法で実施できるが、例えば、水性媒体中、前記両親媒性マクロモノマーを、好ましくは該マクロモノマーとコノモマーとを重合開始剤の存在下で３０〜１００℃程度の温度で１〜３０時間程度反応を行えばよい。なお、得られた両親媒性マクロモノマーは洗浄法や再沈法などの公知慣用の精製処理を始めとして種々の精製処理法で行うことが好ましい。
【００４１】
前記コモノマーとしては、官能基（Ｂ）を有しかつエチレン性不飽和結合を有する単量体であれば、従来公知のいずれのものを用いても良い。このような単量体としては、例えば、メタクリル酸、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸アリル、２−ヒドロキシルエチルメタクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、アリルグリシジルエーテル、スチレン、ジビニルベンゼン等を挙げることができるがメタクリル酸またはメタクリル酸グリシジルが好ましく、さらにより高分子量のものが得られる点でメタクリル酸を用いることが好ましい。コノモマーの使用量は、両親媒性マクロモノマー１００重量部に対して、０．５重量部以下、より好ましくは０．０２〜０．３重量部の範囲である。
【００４２】
前記重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素などの水溶性重合開始剤を挙げることができる。また、水難溶性重合開始剤を溶媒に溶解して使用することもできる。水難溶性重合開始剤としては、例えば２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサン−１−カルボニトリル、２，２’−アソビスイソバレロニトリル、２，２’−アゾビスイソカプロニトリル、２，２’−アゾビス（フェニルイソブチロニトリル）、ベンゾイルパーオキシド、ジ−ｔ−ブチルパーオキシド、ジラウロイルパーオキシド、クメンハイドロパーオキシド、ジイソプロピルベンゼンハイドロパーオキシド、パラメンタンハイドロパーオキシド、ｔ−ブチルハイドロパーオキシド、３，５，５−トリメチルヘキサノールパーオキシド、ｔ−ブチルパーオキシ（２−エチルヘキサノエート）等を挙げることができる。好ましい水難溶性重合開始剤は、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、ベンゾイルパーオキシド、クメンハイドロパーオキシド、ジイソプロピルベンゼンハイドロパーオキシド、パラメンタンハイドロパーオキシド、ｔ−ブチルハイドロパーオキシド、３，５，５−トリメチルヘキサノールパーオキシド、ｔ−ブチルパーオキシ（２−エチルヘキサノエート）等である。該重合開始剤の使用量は、全単量体１００重量部当たり、通常０．１〜５重量部程度である。
【００４３】
溶媒としては、水難溶性重合開始剤を溶解すればいずれのものでもよいが、例えば、メタノール、エタノールなどのアルコール、メチルエチルケトン、アセトン、トリクロロトリフルオロエタン、メチルイソブチルケトン、ジメチルスルホキシド、トルエン、ジブチルフタレート、メチルピロリドン、酢酸エチル等を挙げることができる。溶媒の使用量は、少量であることが好ましく、水性媒体１００重量部に対して１〜２０重量部、より好ましくは１〜５重量部程度である。
【００４４】
以下、本発明で用いる両親媒性ポリマーの製造法の一例を示す。
例えば両親媒性マクロモノマーの単独重合またはコモノマーとの共重合では、予め重合開始剤を溶解させたごく微量のエタノールまたはコモノマーに両親媒性マクロモノマーを添加したモノマー液を作製し、水にこのモノマー液を添加する。液の添加後、氷浴中で超音波分散器を用いて油滴を乳化・分散させてミセルを形成させ、それを加熱することにより高分子化する。この際、両親媒性基を有するモノマーミセルを形成させるために、両親媒性マクロモノマーの濃度は、１０−４Ｍ以上にする必要がある。
【００４５】
反応終了後、反応液を冷却し、沈殿物を遠心分離し、高分子沈殿を回収する。沈殿した高分子にアセトンを加えて高分子を溶解させ、この高分子アセトン溶液をヘキサン中に滴下して高分子を再沈殿させ高分子の精製を行う。
【００４６】
このようにして得た単独重合体は、重合開始剤である４，４’−アゾビス４−シアノペンタン酸由来のカルボキシ基、共重合高分子は、両親媒性基であるｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ基以外に、またコモノマー由来のカルボキシ基やエポキシ基等を有していることから、粒子の持つアミノ基と縮合反応を行うことにより、樹脂粒子への両親媒性官能基の導入が可能となる。
【００４７】
（樹脂粒子と両親媒性ポリマーとの反応）
次に、本発明の酵素固定用担体の製造方法について説明する。
本発明の酵素固定用担体の製造方法は、官能基（Ａ）を有する樹脂粒子と、
両親媒性基（Ｃ）及び前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーとを、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合させる工程、を有することを特徴とする。
【００４８】
樹脂粒子への両親媒性基ポリマーの導入方法としては、官能基（Ａ）と官能基（Ｂ）とが反応し結合する種々の方法であってもよく、例えば酸クロリド法や上記脱水縮合剤の存在下での縮合反応などが挙げられ、さらに具体的には以下のような方法で得ることできる。
【００４９】
官能基（Ｂ）を有する両親媒性ポリマーに有機溶媒を加え、更に前記官能基（Ａ）を有する樹脂粒子を添加して、粒子懸濁液を調製する。この粒子懸濁液をガラス製バイアル等に添加する。そこへ有機溶媒に溶解させた脱水縮合剤を少量ずつ添加した後、緩やかな撹拌を維持したまま、１０〜４０℃にて１〜３日反応させる。その際、得られた粒子は洗浄法や再沈法などの公知慣用の方法で精製処理を始めとして種々の精製処理法で行うことが好ましい。
【００５０】
以下、本発明の酵素固定用担体に用いる粒子の製造方法の一例を示す。
例えば、両親媒性基を持つミセル状のポリマーを含むアセトン溶液にアミノ基を有する樹脂粒子を添加する。この粒子懸濁液をガラス製バイアルに添加する。そこへアセトン溶液等の有機溶媒に溶解させたＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を少量ずつ添加した後、緩やかな撹拌を維持したまま、１０〜４０℃にて１日反応させる。反応終了後、粒子をろ過により回収し、アセトン及び蒸留水にて十分に洗浄する。
【００５１】
このようにして得られた本発明の酵素固定用担体は、酵素固定に有効である両親媒性基を多量に導入することが可能であり、また、高分子量の酵素分子が物質移動の影響を受けにくい粒子表層近傍に固定化されるため、活性の高い固定化酵素を得ることができる。
【００５２】
（固定化用の酵素）
本発明の酵素固定用担体に固定化される酵素の好ましい例としてはエステル交換活性を有する酵素を挙げることができる。例として、リパーゼ、ホスホリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴエミリエーゼ、クチナーゼ等のエステラーゼまた、一部のプロテアーゼを挙げることができる。
【００５３】
（固定化方法）
本発明の酵素固定用担体への酵素の固定化方法は公知慣用の方法を始めとして種々の方法で行うことができるが、例えば、以下の方法で固定化することができる。本発明の酵素固定用担体と酵素液と緩衝剤を含む水溶液中で振とうさせ固定化させる。緩衝剤のｐＨは酵素を失活させないｐＨであれば良いが、酵素活性の至適ｐＨであることが好ましい。緩衝剤の濃度は酵素を失活させない濃度であれば特に限定されないが、５〜５００ｍＭが良く、好ましくは１０〜１００ｍＭである。固定化温度は酵素を失活させない温度であれば限定されないが、５０℃以下が良く、好ましくは３〜２０℃が良い。固定化反応に要する時間は５時間から４０時間、好ましくは１０〜２４時間である。
【００５４】
固定化方法において、水溶液中の酵素濃度は特に限定されないが、固定化効率の観点から前記酵素の溶解度以下でかつ充分な酵素濃度であることが望ましい。必要に応じて不溶性部分を遠心分離により除去し上澄みを使用しても差し支えない。酵素と坦体の使用割合は固定化酵素坦体１重量部に対して酵素０．０１〜１０重量部、好ましくは０．０５〜５重量部であるがこれに限定されない。酵素を固定化した坦体は、そのまま使用してもよいしあるいは温風乾燥、凍結乾燥により乾燥し使用することができる。
【００５５】
（酵素反応）
（エステル合成反応）
本発明における固定化酵素の反応例として、固定化酵素がエステル交換酵素である場合のエステル合成反応の例を示す。通常のメタノール、エタノール、プロパノール等の１価アルコール、ないしはプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、またはゲラニオール、シトロネロール、メントール等のテルペンアルコールあるいはコレステロール等のステロールと、炭素数２〜３６、好ましくは６〜２４の飽和または不飽和脂肪酸又はその低級アルコールエステルとのエステル化反応を上げることができる。さらにエステル合成反応の例としては、１分子中にカルボキシル基を２個以上含むアジピン酸、グルタル酸、スベリン酸、アゼライン酸等の多価カルボン酸と１分子中に水酸基を２個以上含むプロパンジオール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ジエチレングリコール等の多価値アルコールによるポリエステル反応を挙げることができる。またエスエル交換反応の例として、エステルとアルコールによるアルコリシス反応、エステル同士によるインターエステル化反応、リン脂質と各種アルコールによるトランスホスファチジレーション等の反応が挙げられる。
【００５６】
上記エステル化反応は必要に応じて、ヘキサン、イソクタン、イソプロピルエーテル等の有機溶媒を添加して行うことができる。エステル化反応は１５〜９０℃、好ましくは２０〜８０℃で行うことができる。
【実施例】
【００５７】
以下に本発明の実施例と比較例を挙げるが、本発明は実施例等に限定されるものではない。
【００５８】
（製造例１） 樹脂粒子の合成
（合成装置）
ガラス製３００ｍｌ容量のセパラブルフラスコに３口セパラブルフラスコカバーを取り付けたものを使用した。反応液はフッ素樹脂製三日月攪拌翼を先端に取り付けたガラス攪拌棒を攪拌用モーターに取り付け攪拌した。反応容器は温度コントローラーにより制御された恒温水槽内に設置した。また反応物や生成物の不必要な酸化を防ぐため、ガラス製９０度Ｌ字管を装着し、シルカゲル管を通すことにより乾燥させた窒素を流通させた。
【００５９】
（スチレンの分散重合による単分散ポリスチレン樹脂粒子の合成）
反応容器にスチレン３０．０ｇ、２，２−アゾビスブチロニトリル０．３ｇ、ポリビニルピロリドン（日本触媒「Ｋ−３０」）１．８ｇ、１−ヘキサデカン０．５ｇ、エタノール６７．４ｇを添加して重合反応を行った。重合反応は、窒素雰囲気下、２４時間、６０ｒｐｍ以下で反応液を攪拌させながら、７０℃にて行った。反応終了後、水槽温度を２０℃以下に落とし、反応液を５０ｍｌ容ガラス製遠心管４本に分注した。その後エタノールを分散媒として、粒子を分散させた後に遠心分離（１５００−２５００ｒｐｍ、５分）により回収する操作を３回、及び蒸留水を分散媒として、同様の操作を３回繰り返し、粒子を洗浄した。以上の操作により単分散ポリスチレン樹脂粒子（ＳＤ）を約２５ｇ得た。
【００６０】
（シード共重合（二段階膨潤法）でのエポキシ樹脂粒子の合成）
（第一段階湿潤）
ガラスバイアルに、蒸留水１５．４ｍｌ、ドデシル硫酸ナトリウム０．０２ｇ、塩化ラウリル０．５８５ｇ、シード粒子として反応例１で得た単分散ポリスチレン樹脂粒子０．６５ｇを入れ、ホモジナイザーを用いて１０分間水油混合液を分散処理した後、ソニケーターを用いて１０分間反応液を処理し、得られた液にアセトン１．１７ｍｌ、蒸留水０．２ｍｌを加えた。
この液を上述の合成装置と同様の装置に入れ、３０℃にて１６時間以上攪拌し、塩化ラウリルを吸収・膨潤させたポリスチレン樹脂粒子（ＳＤ）を得た。
【００６１】
（第二段階膨潤によるエポキシ樹脂粒子の合成）
１１０ｍｌ容量ガラス製バイアルに、蒸留水８４ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．２０ｇを添加した水溶液中に、重合開始剤２，２−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．０２５ｇ、ジビニルベンゼン２．６３ｇ、スチレン２．６３ｇ、メタクリル酸グリシジル０．５９ｇを加え、氷浴中で冷却しながらソニケーターで１０分間分散処理し、得られた液をモノマー乳化液とした。
【００６２】
上述反応器内の塩化ラウリルを吸収・膨潤させたポリスチレン樹脂粒子（ＳＤ）を含む分散液中に、モノマー乳化液を入れ、窒素雰囲気下、３０℃にて２時間攪拌した。次いで、７０℃下で２４時間攪拌した。反応により得た樹脂粒子は５Ｃの濾紙を用いて減圧濾過することで回収した。濾紙上の粒子をメタノール、次いで蒸留水により洗浄し、エポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ）約４ｇを得た。
【００６３】
（エポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ）へのグアニジノ基の導入）
グアノジン炭酸塩２．０ｇ、水酸化ナトリウム０．６ｇ、蒸留水３．０ｍｌを入れ、振とう溶解させた反応液と、１，４−ジオキサン５１．５ｇ、エポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ）３．０ｇを入れた反応液を上述反応器内に入れ、７０℃、１００〜２００ｒｐｍで２４ｈｒ攪拌した。反応により得た粒子は濾過により回収した。回収した樹脂粒子はメタノール及び蒸留水により十分に洗浄し、グアニジノ基（Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ−）、すなわちアミノ基を持つエポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）を約３ｇ得た。
【００６４】
（製造例２−１） 両親媒性マクロモノマーの合成
（両親媒性基マクロモノマーの合成装置）
全容量が５００ｍｌのセパラブルフラスコを使用した以外は、上述のエポキシ樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）を合成した装置と同じものを使用した。
【００６５】
（両親媒性基マクロモノマーの合成）
上述の装置を設置し反応に用いた。ジエチルエーテル１４０ｇ、メタクリル酸３．５２ｇ、２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エタノール（シグマ社製 商品名：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５）１６ｇ、４−ジメチルアミノピリジン０．４９ｇを添加し混合の後、反応容器に入れた。ジエチルエーテルを４０ｇ入れそこへ脱水縮合剤Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを８．２４ｇ添加し溶解させた。この溶液を反応容器に添加し、３〜４０℃下、１００ｒｐｍで攪拌しながら２日間反応させた。
反応液を常圧濾過し、濾液に０．５Ｍ希塩酸、次いで、飽和炭酸ナトリウム水溶液を反応液に加えて分液漏斗にて振とうし、有機相と水相を分離した。室温にてジエチルエーテルをロータリーエバポレーターにて減圧留去した。
以上の操作により両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）約１２ｇを得た。
【００６６】
（製造例２−２）〜（製造例２−４）
「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５」の代わりに、「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」、「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−３０５」または「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４０５」を用いた以外は製造例（２−１）と同様にして両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−９．２０）、両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−２５．７）、両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４０．５）をそれぞれ得た。
【００６７】
（測定例１）
なお「ＭＡＸ−４．３９」の数字部分「４．３９」は両親媒性モノマー中の、官能基（２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エチル基）のポリエトキシ基の重合度を示している。この重合度は以下の方法にて測定した。
【００６８】
２−［ｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシ］エチル基中のポリエトキシ基の重合度は、両親媒性基を有するマクロモノマーを、テトラメチルシランを含む重水素化クロロホルムに添加し、超伝導核磁気共鳴装置を用いて、Ｈ１−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られるスペクトル中のポリエトキシ基の水素の積分値（δ＝３．６−４．３）とフェニル基の水素の積分値（δ＝６．８−７．２）の比から算出した平均値である。
なお、下記で合成した粒子等（例えばＳＤ−ＭＡＸ−４．３９）において記述されている４．３９についても上記と同様にポリエトキシ基の重合度の平均値を意味している。
【００６９】
（製造例３−１） 両親媒性ポリマーの合成（その１）
（ミセル共重合による両親媒性基を有するマクロモノマーの高分子化）
両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）とコモノマーとしてメタクリル酸とを水溶液中にて、重合開始剤を用いてミセル共重合を行った。すなわち、５０ｍｌ容ポリチューブに１．５×１０−４ｍｏｌの両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．２９）を秤量し、少量（０．５ｍｌ）のメタノールに溶解させたものをモノマー溶液とした。これに、１．５×１０−５ｍｏｌのメタクリル酸及び２．２５×１０−４ｍｏｌの２，２−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）を含むメタノール（０．５ｍｌ）を加え、さらに蒸留水（２９ｍｌ）を加え反応液とした。反応液は、７０ｏＣの恒温水槽中で所定の時間反応させた。反応終了後、冷却し、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、ポリマーの沈殿を得た。上清を除去した後、沈殿したポリマーにアセトンを加えて該ポリマーを溶解させ、この溶液をヘキサン中に滴下してポリマーを再沈殿させた。この操作を３回繰り返し、両親媒性ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９−ｃｏ−ＭＡ））を得た
【００７０】
（製造例３−２）〜（製造例３−４）
両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）の代わりに、両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−９．２０）、両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−２５．７）、または両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４０．５）を用いたこと以外は、製造例３−１と同様の方法で、両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−９．２０−ｃｏ−ＭＡ）、両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−２５．７−ｃｏ−ＭＡ）、または両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−４０．５−ｃｏ−ＭＡ）を得た。
【００７１】
（製造例４） 両親媒性ポリマーの合成（その２）
また、コモノマーを添加しなかったこと以外は製造工程例６と同様の方法で合成した両親媒性マクロモノマーの単独重合体を両親媒性ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９））という。
【００７２】
（製造例５） 両親媒性ポリマーの合成（その３）
（溶液重合によるポリマーの合成）
１ｍｌ容エッペンチューブに製造例５で得られた両親媒性基マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）を２３．４ｍｇ秤量し、クロロホルムを１．５ｇ加えモノマー溶液とした。このモノマー溶液に重合開始剤２，２−アゾビス−（２，４−ジメチルバレロニトリル）を１．８ｍｇ加え反応液とした。反応液は６０ｏＣの恒温水槽中で所定の時間反応させた。反応終了後、冷却し沈殿した両親媒性ポリマー（ｐ（ＭＡＸ−４．３９））を回収した。
【００７３】
（測定例２）
（両親媒性ポリマーの分子量の測定）
製造例４で得られた両親媒性基ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９））及び製造例５で得られた溶液重合により合成した高分子化した両親媒性ポリマー（ｐ（ＭＡＸ−４．３９））の分子量を測定した。分子量はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した。表１に分子量を示す。
【００７４】
【表１】
【００７５】
ミセル共重合により合成したｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９）は分子量が大きく、高分子量化されていることがわかった。
【００７６】
（実施例１） 酵素固定用担体に用いる粒子の合成
（両親媒性基ポリマーと樹脂粒子との合成）
樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）のアミノ基と両親媒性ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９−ｃｏ−ＭＡ））のカルボキシ基とを縮合することにより、両親媒性高分子ミセルを樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）に導入した。
すなわち、１１０ｍｌ容ガラス製バイアルに樹脂粒子（ＳＤＧ−Ｇ）０．３５ｇ、両親媒性ポリマー（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９−ｃｏ−ＭＡ））０．２５ｇを含むアセトン溶液（１８ｍｌ）を加えた。バイアルに攪拌子を加え、１５０ｒｐｍにて攪拌しながら、室温にて２４時間反応させた。反応終了後、５Ｃの濾紙とヌッチェを用いて減圧濾過することにより粒子を回収し、ヌッチェ上の粒子にアセトン３００ｍｌを加えて減圧濾過し、さらに蒸留水３００ｍｌを加え減圧濾過することによって洗浄し、酵素固定用担体に用いる粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）を得た。
【００７７】
（実施例２〜４）
両親媒性ポリマーとして（ｍ−ｐ（ＭＡＸ−４．３９−ｃｏ−ＭＡ））の代わりに、両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−９．２０−ｃｏ−ＭＡ）、両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−２５．７−ｃｏ−ＭＡ）、または両親媒性ポリマー（ＭＡＸ−４０．５−ｃｏ−ＭＡ）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、酵素固定用担体に用いる粒子（ｍ−ＭＡＸ−９．２０）、粒子（ｍ−ＭＡＸ−２５．７）、粒子（ｍ−ＭＡＸ−４０．５）を得た。
【００７８】
（比較例１）
高分子化していない両親媒性基マクロモノマーを用いて二段階膨潤法によるシード共重合により、両親媒性基を持つ酵素固定用粒子を作製した。
すなわち、製造例１のシード共重合（二段階膨潤法）でのエポキシ樹脂粒子の合成において、第二段階膨潤によるエポキシ粒子の合成時に、モノマー乳化液中のメタクリル酸グリシジルの代わりに、同じく製造例２−１で得られた両親媒性マクロモノマー（ＭＡＸ−４．３９）０．５９ｇを添加して、両親媒性基を持つ粒子（以下「ＳＤ−ＭＡＸ−４．３９粒子」という）を４．５ｇを得た。
【００７９】
（比較例２）
製造例１に示した方法により、両親媒性基を持たないエポキシ樹脂粒子（ＳＧＤ）を得た。
【００８０】
（比較例３）
特開２００５−２５３３８１に記載の方法に準じて、アゾ基を有する高分子粒子に、アゾ基を重合開始剤として両親媒性官能基を有するモノマーがグラフト状に結合した酵素固定用担体として用いる粒子を作製した。
すなわち、製造例１のシード共重合（二段階膨潤法）でのエポキシ樹脂粒子の合成において、第二段階膨潤によるエポキシ粒子の合成時に、モノマー乳化液中のメタクリル酸グリシジルの代わりに、下記の２，２−アゾビス−（Ｎ−（２−プロペニル）−２−メチルプロピオンアミド）（和光純薬社製）０．１３ｇを用いた以外は、製造例１と同様の方法でアゾ基を持つアゾ粒子を約４ｇ得た。
続いて、ガラス試験管にトルエン（ナカライテクス社製）４．５ｇに、前記アゾ粒子０．９２ｇ、メタクリル酸（ナカライテクス社製）０．１８ｇを添加して、１００℃で４時間反応させた。得られた粒子をトルエン、メタノール、蒸留水、最後に緩衝液にて洗浄後、粒子（ｇ−ＭＡＸ−４．３９−ＳＤ）を得た。
【００８１】
（測定例３）
（粒子中の両親媒性基の測定）
実施例１で得られたｍ−ＭＡＸ−４．３９粒子及び比較例１で得られたＳＤ−ＭＡＸ−４．３９粒子は、両親媒性基を有する。そこで、示差走査型熱量分析装置（ＤＳＣ）を用いて粒子中の示差熱量のサーモグラムを測定し、得られるポリエトキシ基のピーク面積を解析することにより粒子中に導入された両親媒性基（ＭＡＸ−４．３９）の量を定量した。表２に各粒子中の両親媒性基（ＭＡＸ−４．３９）の量を示す。
【００８２】
【表２】
【００８３】
表２より実施例１で得られた粒子は比較例粒子より両親媒性基の導入量が多いことがわかった。
【００８４】
（応用例１）
（酵素固定用担体へのリパーゼの固定化）
実施例１、比較例１、比較例２及び比較例３で得られた各粒子を酵素固定用担体として用いリパーゼの固定化を行った。すなわち、各粒子１０ｍｇとＲｈｉｚｏｐｕｓ．ｄｅｌｅｍａｒ由来のリパーゼ（生化学工業社製 ＦＩＮＥ ｇｒａｄｅ）３．７ｍｇをｐＨ５．５の１０ｍＭリン酸緩衝液１ｍｌ中に添加して、４℃にて２４時間固定化処理した。
【００８５】
固定化処理前のタンパク質濃度と固定化処理後のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量し固定化量を求めた。表２に各粒子へのリパーゼの固定化量を示す。
また酵素が固定化した各粒子の加水分解活性を測定した。
具体的には、２，３−ジメルカプトプロパノールトリブチレイト（シグマ社製；以下ＢＡＬＢと称す）の分解速度を５，５’−チオビス（２−ニトロ安息香酸）（ナカライテクス社製：以下ＤＴＮＢと称す）を発色試薬として定量する方法により行った。３ｍＭＤＴＮＢを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに固定化リパーゼ１０ｍｇを入れ３０℃で５分間保温した。この溶液に基質として２０ｍＢＡＬＡを含むエタノール（ナカライテクス社製）１００μｌを加えて１０分間反応させた。反応停止のためにアセトン（ナカライテクス社製）２ｍｌを添加し、分光光度計にて４１２ｎｍの吸光度を測定した。酵素活性は１分間に１μｍｏｌのＳＨ基を遊離させる酵素量を１Ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義して次式により求めた。
【００８６】
酵素活性（Ｕ）＝４１２ｎｍ吸光度の増分／４．７５（モル吸光係数に反応液体積を乗じμｍｏｌに換算したもの）／反応時間（ｍｉｎ）
【００８７】
表３に各粒子の分解活性を示した。
【００８８】
【表３】
【００８９】
表３より実施例１の酵素固定用担体は、両親媒性基を有し、比較例の酵素固定用担体よりリパーゼの固定化量が多いことがわかった。また単位担体当たりのリパーゼの比活性も実施例１の酵素固定用担体に固定化した場合が最も高かった。
これは表１の結果より両親媒性基の導入量が多い、即ち疎水基であるｐ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェノキシ基の導入量が多いためである。
【００９０】
（応用例２）
（粒子へ固定化したリパーゼのヘキサン中での安定性）
応用例１と同様の方法にてリパーゼを固定化させた粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）を１０ｍＭのｐＨ５．５のリン酸緩衝液に懸濁させ遠心分離器により粒子を分離した。凍結乾燥機を用いて減圧下で乾燥させた。酵素を固定化した粒子３０ｍｇをヘキサン３０ｍｌに懸濁させ３７℃にて、特定時間放置した後、０．４５μｍのメンブレンフィルターにて濾過し、回収したリパーゼの残存活性率を測定した。
残存活性率の測定は応用例１で示した方法と同様のエステル加水分解反応により酵素活性を測定することにより行った。
【００９１】
残存活性率は、ヘキサン中に懸濁した直後の酵素活性に対する、ヘキサン中での特定時間放置後における酵素活性の比として求めた。得られた残存活性率の経時的変化を図１に示す。
図１中には比較として同様の酵素固定化処理を行った比較例１で得られた粒子（ＳＤ−ＭＡＸ−４．３９）の結果を合わせて示した。
図１の結果より実施例１の粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化したリパーゼは比較例１の粒子（ＳＤ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化したリパーゼに比較してヘキサン中における加水分解活性の低下が少ないことがわかった。また図１から推定される加水分解活性の半減期は比較例１の粒子（ＳＤ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化したリパーゼで９００時間、実施例１の粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化されたリパーゼは５４００時間と計算され、粒子（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化されたリパーゼは半減期が６倍長くなった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明により得られた固定化坦体は、酵素固定化量が多く各種酵素の固定化に有用である。また坦体に固定化された酵素は有機溶媒中での高い安定性を示し、また高い活性を示すことから有機溶媒中における各種のエステル化反応に利用することができる。例えば各種ポリステルの製造、各種脂肪酸エステル、糖エステル、ステロイド等の製造、あるいは植物油、動物油の改質方法に適用でき、産業上の幅広い分野への利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】両親媒性粒子により合成された酵素固定用坦体（ｍ−ＭＡＸ−４．３９）に固定化されたリパーゼのヘキサン中での安定性、即ちヘキサン中での残存活性率（Ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の経時変化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能基（Ａ）を有する樹脂粒子に、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーが、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合していることを特徴とする酵素固定用担体。
【請求項２】
前記樹脂粒子の単位質量（ｇ）当たりの前記ポリマーの結合量（ｍｏｌ）が、１．５×１０−６ｍｏｌ／ｇ以上である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項３】
前記酵素固定用担体の粒径が０．５μｍ以上である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項４】
前記官能基（Ａ）および前記官能基（Ｂ）のどちらか一方がアミノ基であり、他方がグリシジル基、カルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル基およびハロホルミル基からなる群から選ばれる少なくとも一種の官能基である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項５】
前記ポリマーの重量平均分子量が１万〜４００万の範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項６】
前記両親媒性基（Ｃ）の重量平均分子量が２５０〜４０００の範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項７】
前記両親媒性基（Ｃ）が下記一般式
【化１】
で表される基である請求項１記載の酵素固定用坦体。
【請求項８】
前記一般式においてｎが３〜５である請求項１記載の固定酵素用坦体。
【請求項９】
前記樹脂粒子の粒径が１〜１００μｍの範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項１０】
前記樹脂粒子の重量平均分子量が５〜３０万の範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項１１】
前記樹脂粒子の粒径分布の標準偏差が１〜５０μｍの範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項１２】
酵素を請求項１記載の酵素固定用担体に固定化した固定化酵素。
【請求項１３】
前記酵素がエステラーゼ又はプロテアーゼである請求項１２記載の固定化酵素。
【請求項１４】
官能基（Ａ）を有する樹脂粒子と、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーとを、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合させる工程、を有することを特徴とする酵素固定用担体の製造方法。
【請求項１５】
前記樹脂粒子と前記ポリマーの割合がモル（ｍｏｌ）比で、樹脂粒子：ポリマー＝１０：１〜１０００：１の範囲である請求項１４記載の酵素固定用担体の製造方法。
【請求項１】
官能基（Ａ）を有する樹脂粒子に、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーが、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合していることを特徴とする酵素固定用担体。
【請求項２】
前記樹脂粒子の単位質量（ｇ）当たりの前記ポリマーの結合量（ｍｏｌ）が、１．５×１０−６ｍｏｌ／ｇ以上である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項３】
前記酵素固定用担体の粒径が０．５μｍ以上である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項４】
前記官能基（Ａ）および前記官能基（Ｂ）のどちらか一方がアミノ基であり、他方がグリシジル基、カルボキシ基、イソシアナト基、スルホ基、ハロスルホニル基、マレイミド基、ホルミル基およびハロホルミル基からなる群から選ばれる少なくとも一種の官能基である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項５】
前記ポリマーの重量平均分子量が１万〜４００万の範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項６】
前記両親媒性基（Ｃ）の重量平均分子量が２５０〜４０００の範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項７】
前記両親媒性基（Ｃ）が下記一般式
【化１】
で表される基である請求項１記載の酵素固定用坦体。
【請求項８】
前記一般式においてｎが３〜５である請求項１記載の固定酵素用坦体。
【請求項９】
前記樹脂粒子の粒径が１〜１００μｍの範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項１０】
前記樹脂粒子の重量平均分子量が５〜３０万の範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項１１】
前記樹脂粒子の粒径分布の標準偏差が１〜５０μｍの範囲である請求項１記載の酵素固定用担体。
【請求項１２】
酵素を請求項１記載の酵素固定用担体に固定化した固定化酵素。
【請求項１３】
前記酵素がエステラーゼ又はプロテアーゼである請求項１２記載の固定化酵素。
【請求項１４】
官能基（Ａ）を有する樹脂粒子と、両親媒性基（Ｃ）および前記官能基（Ａ）と反応しうる官能基（Ｂ）を有するポリマーとを、該官能基（Ａ）と該官能基（Ｂ）とを反応させることにより結合させる工程、を有することを特徴とする酵素固定用担体の製造方法。
【請求項１５】
前記樹脂粒子と前記ポリマーの割合がモル（ｍｏｌ）比で、樹脂粒子：ポリマー＝１０：１〜１０００：１の範囲である請求項１４記載の酵素固定用担体の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−１０４３５９（Ｐ２００８−１０４３５９Ａ）
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８７４２８（Ｐ２００６−２８７４２８）
【出願日】平成１８年１０月２３日（２００６．１０．２３）
【出願人】（０００００２８８６）大日本インキ化学工業株式会社 (2,597)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２３日（２００６．１０．２３）
【出願人】（０００００２８８６）大日本インキ化学工業株式会社 (2,597)
【Ｆターム（参考）】
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