酵素活性測定法及び酵素阻害剤の評価方法
【課題】 前立腺癌組織において、アンドロゲン受容体を活性化する能力を的確に評価し得る酵素活性測定法を提供する。また、アンドロゲン代謝酵素に対する包括的な阻害効果を調べることが可能な酵素阻害剤の評価方法を提供する。
【解決手段】 前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した後、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定する。また、酵素阻害剤の有無による活性の相違を測定し、当該活性の相違に基づいて酵素阻害剤の阻害効果を評価する。アンドロゲン受容体の活性は、例えば前立腺癌細胞に前立腺特異抗原プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、ルシフェラーゼ活性を測定することで測定可能である。
【解決手段】 前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した後、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定する。また、酵素阻害剤の有無による活性の相違を測定し、当該活性の相違に基づいて酵素阻害剤の阻害効果を評価する。アンドロゲン受容体の活性は、例えば前立腺癌細胞に前立腺特異抗原プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、ルシフェラーゼ活性を測定することで測定可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺由来間質細胞を使用した新規な酵素活性測定法に関するものであり、さらには、酵素阻害剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性型男性ホルモン（ＤＨＴ：Dihydrotestosterone）は、細胞内でアンドロゲン受容体（ＡＲ）と結合し、アンドロゲン受容体の標的遺伝子（例えば腫瘍マーカＰＳＡ）の転写活性を制御することで、前立腺癌細胞の増殖を促進している。このため、前立腺癌に対して、男性ホルモン除去療法（ホルモン療法）は９０％以上の症例で有効な治療となっているが、数年後にはホルモン療法抵抗性となって再燃し、再燃後の予後は不良である。
【０００３】
前立腺癌の再燃の機序には、様々なものが考えられている。例えば、ホルモン療法後には、血清中の男性ホルモン量が治療前の５％以下になるにも関わらず、前立腺組織内には治療前の１０〜４０％程度残存している。我々の研究では、ホルモン療法前の２５％が残存していることが確認されている。このことが前立腺癌の再燃に関与している可能性がある。さらに、前立腺癌細胞自体が性質を変化させることによって、残存している低アンドロゲンに対しても感受性となり、増殖を示すことが再燃の一つの機序として考えられている。
【０００４】
ところで、前立腺組織内には、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ：Dhydroepiandrosterone）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換するための多くの代謝酵素の存在が確認されている。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）はホルモン療法によってそれほど変化を受けないが、ホルモン治療後にも前立腺癌組織内でデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）から活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換されることが、血清中より組織中に活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）が高濃度で存在している理由と考えられている。
【０００５】
ここで、例えば、市販の前立腺癌培養細胞（ＬＮＣａＰ）にもデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素が存在することが知られている。したがって、前立腺癌細胞における前記酵素の活性（すなわち、アンドロゲン受容体を活性化する能力）を測定することで、前立腺癌のホルモン治療中あるいは治療後の再燃までの期間を予測し得る可能性がある。
【０００６】
しかしながら、前記前立腺癌培養細胞（ＬＮＣａＰ）にデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加しても、アンドロゲン受容体を活性化する標的遺伝子ＰＳＡのプロモータの転写活性は、僅かに亢進されるに過ぎない。すなわち、前立腺癌組織内では、これら代謝酵素が存在するものの、実際に活性を有しているのか否かを判断することは難しく、また、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）がどのようにして活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換されるのかについても、未だ詳細は判明していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように、例えば前立腺癌患者から得られる前立腺組織において、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）によってどれだけアンドロゲン受容体を活性化することができるのかを評価することが難しいのが実情であるが、仮に、前記活性化する能力を的確に把握することができれば、ホルモン療法から再燃までの期間が予測可能になるものと期待される。
【０００８】
また、前記活性化を評価することができれば、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素の阻害剤を開発する上でも有用と考えられる。例えば製薬会社において、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素の阻害剤を開発する場合、その阻害効果を測定する必要が生ずる。阻害効果の測定は、例えば液体クロマトグラフタンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）が活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換される量を直接測定することにより行うことが可能であるが、高額な設備が必要になり、測定に費用を要する。さらに、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）への変換には、様々な酵素が関与しているものと考えられ、単一の酵素のみを阻害するだけでは不十分である可能性がある。前記方法では、それらの酵素の包括的な阻害効果を測定することは難しい。
【０００９】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する代謝酵素の活性を把握することができ、アンドロゲン受容体を活性化する能力を的確に評価し得る新規な酵素活性測定法を提供することを目的とし、例えば前立腺癌の再燃の予測等に有用な酵素活性測定法を提供することを目的とする。また、本発明は、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する代謝酵素に対する包括的な阻害効果を調べることができ、且つ安価に検査を行うことが可能な酵素阻害剤の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前述の目的を達成するために、種々の研究を重ねてきた。そして、前立腺癌細胞ではなく、間質細胞でのアンドロゲン代謝の可能性に着目し、本発明の酵素活性測定法及び酵素阻害剤の評価方法を案出するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の酵素活性測定法は、前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンを添加した後、前記前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の酵素阻害剤の評価方法は、前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンを添加した後、前記前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定するに際し、前記副腎性アンドロゲンを活性型男性ホルモンに変換する酵素に対する阻害剤の有無による前記活性の相違を測定し、当該活性の相違に基づいて前記阻害剤の阻害効果を評価することを特徴とする。
【００１３】
前立腺癌組織には、前立腺癌細胞の他、前立腺由来間質細胞が含まれる。本発明者は、前立腺癌組織においては、前立腺癌細胞よりも前立腺由来間質細胞における代謝酵素の活性が支配的であり、前立腺由来間質細胞における代謝酵素の活性によって前立腺癌細胞のアンドロゲン受容体の活性（標的遺伝子の転写活性）が決まることを突き止めた。
【００１４】
本発明の酵素活性測定法では、前立腺癌細胞と前立腺由来間質細胞を共培養し、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定しているので、前立腺由来間質細胞により副腎性アンドロゲンがどれだけアンドロゲン受容体を活性化することができるかが測定され、例えばこの活性化する能力と予後とを比較することにより、前立腺癌のホルモン療法中の再燃までの期間が予測可能となる。
【００１５】
また、本発明の酵素阻害剤の評価方法では、前記アッセイ系において阻害剤の有無による前記活性の相違を測定しており、酵素の包括的な活性について、阻害効果の有無が把握される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の酵素活性測定法によれば、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する代謝酵素の実効的な活性を把握することができ、前立腺由来間質細胞のアンドロゲン受容体を活性化する能力を的確に評価することが可能である。したがって、本発明の酵素活性測定法を利用することで、例えば前立腺癌のホルモン療法後の再燃を予測することが可能である。
【００１７】
また、本発明の酵素阻害剤の評価方法によれば、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する代謝酵素の包括的な活性に対する阻害効果の有無を調べることができ、創薬開発のために有用なアッセイ系を提供することが可能である。さらに、本発明の評価方法においては、高価な測定装置等は不要であるので、阻害効果を多大な費用を要することなく測定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を適用した酵素活性測定法及び酵素阻害剤の評価方法の実施形態について、図面を参照して説明する。
【００１９】
前立腺癌組織においては、前述の各酵素の存在が確認されているが、その活性の有無や、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）がどのようにして活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）については、未だ未解明な点が多い。このような状況の中、本発明者は、前立腺癌細胞ではなく、間質細胞でのアンドロゲン代謝の可能性に着目し、本発明の酵素活性測定法及び酵素阻害剤の評価方法を開発するに至った。
【００２０】
先ず、前立腺癌組織におけるアンドロゲン代謝としては、前立腺癌細胞ＣａＰにおけるアンドロゲン代謝と、前立腺由来間質細胞ＳＣにおけるアンドロゲン代謝が考えられる。図１は、前立腺癌組織に含まれる前立腺癌細胞ＣａＰと前立腺由来間質細胞ＳＣにおけるアンドロゲン代謝の様子を示すものである。
【００２１】
副腎由来の副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、前立腺癌細胞（prostate cancer cell）及び前立腺由来間質細胞（stromal
cell）において、代謝酵素によって活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換される。具体的には、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）によってアンドロステンジオール（Ａｄｉｏｌ）に変換された後、３β位水酸基脱水素酵素（３β−ＨＳＤ）によってテストステロンＴに変換される。あるいは、３β位水酸基脱水素酵素（３β−ＨＳＤ）によってアンドロステンジオン（Ａｄｉｏｎｅ）に変換された後、１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）によってテストステロンＴに変換される。
【００２２】
テストステロンＴは、さらに還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−steroid reductase）によって活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換される。活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）は、細胞内でアンドロゲン受容体ＡＲと結合し、アンドロゲン受容体ＡＲの標的遺伝子（例えば腫瘍マーカＰＳＡ）の転写活性を制御し、前立腺癌細胞の増殖を促進する。
【００２３】
これがデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の一般的な代謝であるが、特に前立腺由来の間質細胞（stromal cell）でデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は効率良く代謝され、例えばホルモン療法（androgen-deprivation therapy）によって血清中アンドロゲンが１／１０以下に減少しても、前記間質細胞（stromal cell）から多くのテストステロンＴやその前駆体が放出される。そのため、組織中の活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）は１／１０までは低下せず、前立腺癌細胞（prostate cancer cell）に活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を供給する。このことが再燃に結びつくものと考えられる。その他にも、間質細胞（stromal cell）が成長因子を放出し、再燃を助長する可能性もある。
【００２４】
実際、例えば前立腺癌細胞のみを培養し、これにデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加しても、アンドロゲン受容体ＡＲはほとんど活性化されず、標的遺伝子ＰＳＡのプロモータの転写活性も僅かに亢進されるのみである。一方、前立腺癌細胞とともに前立腺由来間質細胞を共培養した場合、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の添加によって、アンドロゲン受容体ＡＲが活性化されることが実験的に確かめられている。したがって、前立腺由来間質細胞はデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する能力を持ち、前立腺癌細胞に活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を供給している可能性が示唆された。
【００２５】
これらの事実から、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した場合に、前立腺癌患者から得られる前立腺由来間質細胞の共培養によりどれだけアンドロゲン受容体ＡＲを活性化できるかを測定することにより、前立腺癌組織における酵素活性を評価し得るものと考えられる。そして、前記測定結果に基づき、例えば測定される酵素活性（アンドロゲン受容体ＡＲを活性化する能力）と予後を比較することにより、前立腺癌のホルモン療法から再燃までの期間が予測可能になるものと考えられる。
【００２６】
本発明の酵素活性測定法は、以上のような仮説に基づくものであり、前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した後、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定する。
【００２７】
前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性は、例えば前立腺癌細胞に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、前立腺癌細胞のルシフェラーゼ活性を測定することで把握することが可能である。
【００２８】
前記アンドロゲン受容体の活性の評価に際しては、例えば市販の前立腺由来間質細胞と前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞についてそれぞれ測定を行い、これらを比較すればよい。前立腺癌患者由来の前立腺由来間質細胞においては、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性を市販の前立腺由来間質細胞よりも明らかに亢進させる場合があり、前記比較により、当該前立腺癌患者の酵素活性（アンドロゲン受容体ＡＲを活性化する能力）を的確に評価することが可能になる。
【００２９】
以上のように、本発明の酵素活性測定法によれば、前立腺癌組織における実効的な酵素活性（すなわちアンドロゲン受容体ＡＲを活性化する能力）を的確に測定することが可能であり、例えば前立腺癌患者の再燃の可能性や再燃までの期間等を評価する上で有用な情報を得ることができる。
【００３０】
なお、前述の酵素活性測定法は、前立腺由来間質細胞以外の細胞に応用することも可能である。例えば、アンドロゲンの減少はメタボリック症候群を誘導すると言われている。また、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は脂肪代謝にも影響を及ぼしていると考えられる。皮下脂肪由来の脂肪前駆細胞や内臓脂肪由来の脂肪前駆細胞は既に市販されているため、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）がどのようにこれらの細胞で代謝され、活性化されるのかを前述の酵素活性測定法で調べることが可能であり、例えば前立腺由来間質細胞の代わりに脂肪細胞を用い、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）が脂肪細胞でどのように代謝されるか、あるいは活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）がどのように脂肪細胞で不活性化されるかを前記の酵素活性測定法で調べることによって、脂肪細胞の増殖、分化への関与を研究することが可能である。さらに、患者から得られる内臓脂肪、皮下脂肪から脂肪細胞を樹立することによっても、同様な研究を行うことが可能である。
【００３１】
デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の起源は副腎である。いくつかの施設から前立腺癌の治療薬であるアンチアンドロゲンのフルタミド（オダイン）が、同じくアンチアンドロゲンであるビカルタミド使用後の前立腺癌再燃の治療に有効であるとの報告がなされている。その機序を明らかにするために、本発明者は、前立腺癌の再燃した患者に対してフルタミド使用後の血清中のＤＨＥＡ−Ｓの濃度を測定した。その結果、ＤＨＥＡ−Ｓが治療後に低下した症例では、有意に再燃の指標である腫瘍マーカＰＳＡが低下することが確認された。これは、フルタミドがアンチアンドロゲンとしてだけでなく、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の生合成にも影響を及ぼしていることを意味している。以上のことより、フルタミドよりも強力にデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の合成を阻害する薬剤の開発は、再燃癌の治療に役立つ可能性がある。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）はコレステロールから合成されるが、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を産生する能力のある市販の副腎癌細胞を間質細胞や前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰとともに共培養し、コレステロールを添加することによって、どのようにデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）が産生され、活性ある活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換されるかをこのアッセイ系で観察することができるものと考えられる。また、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の合成阻害剤の開発に際しても、このアッセイ系でコレステロールからデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）への変換阻害の効果を確認できるものと考えられる。
【００３２】
さらに、前述の酵素活性測定法を応用することにより、酵素阻害剤の阻害効果を評価することも可能である。この場合にも、前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した後、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定するが、当該測定に際し、副腎性アンドロゲンを活性型男性ホルモンに変換する酵素に対する阻害剤の有無による前記活性の相違を測定する。そして、阻害剤の有無による活性の相違に基づいて阻害剤の阻害効果を評価する。
【００３３】
前記酵素阻害剤の評価方法において、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性の測定は、前述の酵素活性測定法の場合と同様、例えば前立腺癌細胞に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、前立腺癌細胞のルシフェラーゼ活性を測定することで行えばよい。
【００３４】
アンドロゲン代謝には様々な酵素が関与しているものと考えられ、単一の酵素のみを阻害するだけでは不十分な可能性があるが、本発明の酵素阻害剤の評価方法によれば、それら酵素の包括的な活性を検査することができる。したがって、阻害剤の阻害効果を的確に評価することができ、創薬開発のために有用なアッセイ系となる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
【００３６】
（予備実験１）
市販の前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにＰＳＡプロモータにより制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミド（ｐＧＬ３ＰＳＡｐ−５．８）を導入後、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養した。共培養における培養時間は１２時間である。
【００３７】
次に、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）０．１ｎＭ、あるいはデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）１００ｎＭを共培養した細胞に添加し、２４時間後に細胞を回収した。回収した細胞について、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３８】
前記測定を、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣの添加量が異なるサンプルＰｒＳＣ（２０，０００）及びＰｒＳＣ（４０，０００）について行った。なお、ＰｒＳＣ（２０，０００）は前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを２０，０００個共培養したことを意味し、ＰｒＳＣ（４０，０００）は前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを４０，０００個共培養したことを意味する。また、比較のため、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養しない場合ＰｒＳＣ（０）についても同様の測定を行った。結果を図２及び図３に示す。図２は活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を添加した場合のルシフェラーゼ活性を示す図であり、図３はデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した場合のルシフェラーゼ活性を示す図である。
【００３９】
図２から明らかなように、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を添加した場合には、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養しないＰｒＳＣ（０）において、添加量の増加に伴ってルシフェラーゼ活性が上昇している。このことから、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）によるアンドロゲン受容体の活性化は、前立腺癌細胞において支配的であることがわかる。これに対して、図３に示すように、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した場合には、前立腺癌細胞を単独で培養した場合に比べ、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養した場合の方が明らかにルシフェラーゼ活性が亢進されている。したがって、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素代謝には、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣが関与しているものと考えられる。
【００４０】
（予備実験２）
本実験では、アンチアンドロゲンＢｉｃ（bicalutamide）とＡＲｓｉＲＮＡを用いて実験を行った。前者については、前立腺癌細胞のみの場合（Control）と前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養した場合について、それぞれアンチアンドロゲンＢｉｃを添加した場合と添加しない場合におけるルシフェラーゼ活性を調べた。後者については、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにｉＲＮＡプラスミドであるｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ１、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ２をそれぞれ導入し、非前立腺患者由来の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ（−）または前立腺患者由来の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ（＋）を共培養してルシフェラーゼ活性を調べた（ＲＮＡ interferance 実験）。ｓｈＲＮＡ−controlは、今回の研究とは全く関係のないｉＲＮＡ発現プラスミドである。結果を図４及び図５に示す。
【００４１】
先ず、図４に示すように、アンチアンドロゲンＢｉｃを用いた実験において、コントロール（前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養していない状態）に活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）やデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を加えると活性は上昇するが、アンチアンドロゲンＢｉｃを添加するとその活性は抑制される。前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養においても、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）や亢進したデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性がアンチアンドロゲンＢｉｃの添加によって抑制される。このことは、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養におけるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性亢進も、アンドロゲン受容体を介して働いていることを意味している。
【００４２】
図５に結果を示す実験は、図４の結果をさらに裏付けるために行った実験である。すなわち、図５に示されるように、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにアンドロゲン受容体ＡＲ遺伝子発現を抑えるｉＲＮＡプラスミド（ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ１、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ２）を導入することにより、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰでのアンドロゲン受容体ＡＲ遺伝子発現が低下している。つまり、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）の作用減弱を期待することができる。本実験は、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養の状態でのデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の作用が前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰのアンドロゲン受容体ＡＲを介しているか、そうでないかを確認するために行った実験であり、予想通り、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養の状態でのデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）による活性をｉＲＮＡプラスミド（ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ１、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ２）を導入することで抑制することができた。この結果からも、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養の状態でのデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の作用は、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰでのアンドロゲン受容体ＡＲを介した作用であることが裏付けられた。
【００４３】
以上のように、これら実験により、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣによる活性亢進の機序は、アンドロゲン受容体ＡＲを介した作用であることが示唆された。
【００４４】
（酵素活性測定）
市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを基準として、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９及び骨由来間質細胞（bone-derived stromal cell）ＢＤＳＣ−１，ＢＤＳＣ−２について、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を添加した場合とデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した場合のルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４５】
前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９は、明らかに前立腺癌を疑う患者より同意取得後、前立腺針生検の際に組織の一部を提供してもらい、この組織から一次培養を行った後、間質細胞の培養を行った。間質細胞の培養については、多くの論文で報告されており、本実験でもそれに準じて行った。
【００４６】
市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣと前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９及び骨由来間質細胞ＢＤＳＣ−１，ＢＤＳＣ−２について、予備実験１と同様の実験を行い、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）及びデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）によるルシフェラーゼ活性の違いを観察した。結果を表１に示す。また、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８についての測定結果をグラフ化したものを図６に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９及び骨由来間質細胞ＢＤＳＣ−１，ＢＤＳＣ−２において、患者によっては市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣと比べてデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性を明らかに亢進させることが判明した。
【００４９】
そこでさらに、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９、市販の前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰについて、アンドロゲンメタボリック酵素の発現パターンを調べた。結果を図７及び図８に示す。これら図７や図８からも明らかな通り、前立腺由来間質細胞であっても試料によって酵素の発現パターンは大きく異なっている。
【００５０】
例えば、図７は、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ並びに前立腺癌患者の前立腺癌組織から得られた前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９からＲＮＡを抽出し、様々な１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）、３β位水酸基脱水素酵素（３β−ＨＳＤ）、及び還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−steroid reductase）のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認したものである。１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）の発現パターンとデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性亢進とは必ずしも相関するものではなく、このことから全ての酵素の活性の総和が重要なのではないかと推測された。また、図８では、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにおいても、１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）や３β位水酸基脱水素酵素（３β−ＨＳＤ）、還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−steroid reductase）を発現していることがわかる。例えば還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−steroid reductase）について言えば、従来、ＳＲＤ５Ａ−２（type２）が前立腺組織に多く発現することが報告されているが、本実験においてはそれほど発現しておらず、最近新しく同定されたＳＲＤ５Ａ−３（type３）が多く発現していた。
【００５１】
（酵素阻害剤による阻害効果の確認）
本実験では、テストステロンを活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−reductase）の阻害剤であるＤｕｔ（dutasteride）の有無による活性の相違を調べた。具体的には、前立腺癌細胞のみ（Control）、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８について、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）及び阻害剤Ｄｕｔの添加の有無による活性の相違を調べた。結果を図９に示す。図９において、記号（−）は添加していない場合を、記号（＋）は添加した場合をそれぞれ示す。
【００５２】
図９から明らかなように、阻害剤Ｄｕｔは、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８によるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性亢進を抑制した。
【００５３】
（他臓器由来間質細胞についての実験）
本実験では、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣの他、ヒト骨髄間質細胞ＨＭＳＣ及びヒト肺由来間質細胞ＨＬＦａ（human lung fibroblast）について、予備実験１と同様の実験を行った。結果を図１０に示す。
【００５４】
他臓器由来の間質細胞（ヒト骨髄間質細胞ＨＭＳＣ及びヒト肺由来間質細胞ＨＬＦａ）を前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣと比較すると、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）による活性は、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣと異なる反応を示すことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の酵素活性測定法によれば、前立腺癌組織におけるアンドロゲン代謝酵素の包括的な活性を測定することができ、アンドロゲン受容体を活性化する能力を把握することが可能である。したがって、例えばこの活性化する能力と予後とを比較することにより、前立腺癌のホルモン療法から再燃までの期間を予測することが可能になり、前立腺癌の治療方針を決める上で有用な知見を得ることが可能になる。
【００５６】
また、製薬会社等においては、前立腺癌の再燃を防止するために、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素の阻害剤に関する研究が進められている。このような酵素阻害剤の開発に当たっては、阻害効果を確認する必要があるが、単一の酵素のみに対する阻害効果だけでは不十分な可能性がある。本発明の酵素阻害剤の評価方法では、アンドロゲン代謝酵素の包括的な活性についての阻害効果を確認することができ、創薬のための有用なアッセイ系となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】前立腺癌細胞及び前立腺由来間質細胞におけるアンドロゲン代謝を説明する模式図である。
【図２】前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣの共培養の有無による活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）のルシフェラーゼ活性の相違を示す図である。
【図３】前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣの共培養の有無によるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）のルシフェラーゼ活性の相違を示す図である。
【図４】前立腺癌細胞（Control）と前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣについて、アンチアンドロゲンＢｉｃを添加した場合と添加しない場合におけるルシフェラーゼ活性の相違を示す図である。
【図５】非前立腺患者由来の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ（−）と前立腺患者由来の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ（＋）について、ｓｈＲＮＡ−control、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ１、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ２をそれぞれ添加した場合のルシフェラーゼ活性の相違を示す図である。
【図６】前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８についての測定結果を示す図である。
【図７】市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ及び前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９におけるアンドロゲンメタボリック酵素の発現パターンを示す図である。
【図８】市販の前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにおけるアンドロゲンメタボリック酵素の発現パターンを示す図である。
【図９】前立腺癌細胞のみ（Control）、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８について、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）及び阻害剤Ｄｕｔの添加の有無による活性の相違を示す図である。
【図１０】他臓器由来の間質細胞（ヒト骨髄間質細胞ＨＭＳＣ及びヒト肺由来間質細胞ＨＬＦａ）における活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）及びデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）のルシフェラーゼ活性を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺由来間質細胞を使用した新規な酵素活性測定法に関するものであり、さらには、酵素阻害剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性型男性ホルモン（ＤＨＴ：Dihydrotestosterone）は、細胞内でアンドロゲン受容体（ＡＲ）と結合し、アンドロゲン受容体の標的遺伝子（例えば腫瘍マーカＰＳＡ）の転写活性を制御することで、前立腺癌細胞の増殖を促進している。このため、前立腺癌に対して、男性ホルモン除去療法（ホルモン療法）は９０％以上の症例で有効な治療となっているが、数年後にはホルモン療法抵抗性となって再燃し、再燃後の予後は不良である。
【０００３】
前立腺癌の再燃の機序には、様々なものが考えられている。例えば、ホルモン療法後には、血清中の男性ホルモン量が治療前の５％以下になるにも関わらず、前立腺組織内には治療前の１０〜４０％程度残存している。我々の研究では、ホルモン療法前の２５％が残存していることが確認されている。このことが前立腺癌の再燃に関与している可能性がある。さらに、前立腺癌細胞自体が性質を変化させることによって、残存している低アンドロゲンに対しても感受性となり、増殖を示すことが再燃の一つの機序として考えられている。
【０００４】
ところで、前立腺組織内には、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ：Dhydroepiandrosterone）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換するための多くの代謝酵素の存在が確認されている。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）はホルモン療法によってそれほど変化を受けないが、ホルモン治療後にも前立腺癌組織内でデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）から活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換されることが、血清中より組織中に活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）が高濃度で存在している理由と考えられている。
【０００５】
ここで、例えば、市販の前立腺癌培養細胞（ＬＮＣａＰ）にもデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素が存在することが知られている。したがって、前立腺癌細胞における前記酵素の活性（すなわち、アンドロゲン受容体を活性化する能力）を測定することで、前立腺癌のホルモン治療中あるいは治療後の再燃までの期間を予測し得る可能性がある。
【０００６】
しかしながら、前記前立腺癌培養細胞（ＬＮＣａＰ）にデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加しても、アンドロゲン受容体を活性化する標的遺伝子ＰＳＡのプロモータの転写活性は、僅かに亢進されるに過ぎない。すなわち、前立腺癌組織内では、これら代謝酵素が存在するものの、実際に活性を有しているのか否かを判断することは難しく、また、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）がどのようにして活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換されるのかについても、未だ詳細は判明していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように、例えば前立腺癌患者から得られる前立腺組織において、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）によってどれだけアンドロゲン受容体を活性化することができるのかを評価することが難しいのが実情であるが、仮に、前記活性化する能力を的確に把握することができれば、ホルモン療法から再燃までの期間が予測可能になるものと期待される。
【０００８】
また、前記活性化を評価することができれば、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素の阻害剤を開発する上でも有用と考えられる。例えば製薬会社において、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素の阻害剤を開発する場合、その阻害効果を測定する必要が生ずる。阻害効果の測定は、例えば液体クロマトグラフタンデム型質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によってデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）が活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換される量を直接測定することにより行うことが可能であるが、高額な設備が必要になり、測定に費用を要する。さらに、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）への変換には、様々な酵素が関与しているものと考えられ、単一の酵素のみを阻害するだけでは不十分である可能性がある。前記方法では、それらの酵素の包括的な阻害効果を測定することは難しい。
【０００９】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する代謝酵素の活性を把握することができ、アンドロゲン受容体を活性化する能力を的確に評価し得る新規な酵素活性測定法を提供することを目的とし、例えば前立腺癌の再燃の予測等に有用な酵素活性測定法を提供することを目的とする。また、本発明は、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する代謝酵素に対する包括的な阻害効果を調べることができ、且つ安価に検査を行うことが可能な酵素阻害剤の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前述の目的を達成するために、種々の研究を重ねてきた。そして、前立腺癌細胞ではなく、間質細胞でのアンドロゲン代謝の可能性に着目し、本発明の酵素活性測定法及び酵素阻害剤の評価方法を案出するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の酵素活性測定法は、前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンを添加した後、前記前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の酵素阻害剤の評価方法は、前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンを添加した後、前記前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定するに際し、前記副腎性アンドロゲンを活性型男性ホルモンに変換する酵素に対する阻害剤の有無による前記活性の相違を測定し、当該活性の相違に基づいて前記阻害剤の阻害効果を評価することを特徴とする。
【００１３】
前立腺癌組織には、前立腺癌細胞の他、前立腺由来間質細胞が含まれる。本発明者は、前立腺癌組織においては、前立腺癌細胞よりも前立腺由来間質細胞における代謝酵素の活性が支配的であり、前立腺由来間質細胞における代謝酵素の活性によって前立腺癌細胞のアンドロゲン受容体の活性（標的遺伝子の転写活性）が決まることを突き止めた。
【００１４】
本発明の酵素活性測定法では、前立腺癌細胞と前立腺由来間質細胞を共培養し、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定しているので、前立腺由来間質細胞により副腎性アンドロゲンがどれだけアンドロゲン受容体を活性化することができるかが測定され、例えばこの活性化する能力と予後とを比較することにより、前立腺癌のホルモン療法中の再燃までの期間が予測可能となる。
【００１５】
また、本発明の酵素阻害剤の評価方法では、前記アッセイ系において阻害剤の有無による前記活性の相違を測定しており、酵素の包括的な活性について、阻害効果の有無が把握される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の酵素活性測定法によれば、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する代謝酵素の実効的な活性を把握することができ、前立腺由来間質細胞のアンドロゲン受容体を活性化する能力を的確に評価することが可能である。したがって、本発明の酵素活性測定法を利用することで、例えば前立腺癌のホルモン療法後の再燃を予測することが可能である。
【００１７】
また、本発明の酵素阻害剤の評価方法によれば、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する代謝酵素の包括的な活性に対する阻害効果の有無を調べることができ、創薬開発のために有用なアッセイ系を提供することが可能である。さらに、本発明の評価方法においては、高価な測定装置等は不要であるので、阻害効果を多大な費用を要することなく測定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を適用した酵素活性測定法及び酵素阻害剤の評価方法の実施形態について、図面を参照して説明する。
【００１９】
前立腺癌組織においては、前述の各酵素の存在が確認されているが、その活性の有無や、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）がどのようにして活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）については、未だ未解明な点が多い。このような状況の中、本発明者は、前立腺癌細胞ではなく、間質細胞でのアンドロゲン代謝の可能性に着目し、本発明の酵素活性測定法及び酵素阻害剤の評価方法を開発するに至った。
【００２０】
先ず、前立腺癌組織におけるアンドロゲン代謝としては、前立腺癌細胞ＣａＰにおけるアンドロゲン代謝と、前立腺由来間質細胞ＳＣにおけるアンドロゲン代謝が考えられる。図１は、前立腺癌組織に含まれる前立腺癌細胞ＣａＰと前立腺由来間質細胞ＳＣにおけるアンドロゲン代謝の様子を示すものである。
【００２１】
副腎由来の副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、前立腺癌細胞（prostate cancer cell）及び前立腺由来間質細胞（stromal
cell）において、代謝酵素によって活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換される。具体的には、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）によってアンドロステンジオール（Ａｄｉｏｌ）に変換された後、３β位水酸基脱水素酵素（３β−ＨＳＤ）によってテストステロンＴに変換される。あるいは、３β位水酸基脱水素酵素（３β−ＨＳＤ）によってアンドロステンジオン（Ａｄｉｏｎｅ）に変換された後、１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）によってテストステロンＴに変換される。
【００２２】
テストステロンＴは、さらに還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−steroid reductase）によって活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換される。活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）は、細胞内でアンドロゲン受容体ＡＲと結合し、アンドロゲン受容体ＡＲの標的遺伝子（例えば腫瘍マーカＰＳＡ）の転写活性を制御し、前立腺癌細胞の増殖を促進する。
【００２３】
これがデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の一般的な代謝であるが、特に前立腺由来の間質細胞（stromal cell）でデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は効率良く代謝され、例えばホルモン療法（androgen-deprivation therapy）によって血清中アンドロゲンが１／１０以下に減少しても、前記間質細胞（stromal cell）から多くのテストステロンＴやその前駆体が放出される。そのため、組織中の活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）は１／１０までは低下せず、前立腺癌細胞（prostate cancer cell）に活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を供給する。このことが再燃に結びつくものと考えられる。その他にも、間質細胞（stromal cell）が成長因子を放出し、再燃を助長する可能性もある。
【００２４】
実際、例えば前立腺癌細胞のみを培養し、これにデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加しても、アンドロゲン受容体ＡＲはほとんど活性化されず、標的遺伝子ＰＳＡのプロモータの転写活性も僅かに亢進されるのみである。一方、前立腺癌細胞とともに前立腺由来間質細胞を共培養した場合、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の添加によって、アンドロゲン受容体ＡＲが活性化されることが実験的に確かめられている。したがって、前立腺由来間質細胞はデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する能力を持ち、前立腺癌細胞に活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を供給している可能性が示唆された。
【００２５】
これらの事実から、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した場合に、前立腺癌患者から得られる前立腺由来間質細胞の共培養によりどれだけアンドロゲン受容体ＡＲを活性化できるかを測定することにより、前立腺癌組織における酵素活性を評価し得るものと考えられる。そして、前記測定結果に基づき、例えば測定される酵素活性（アンドロゲン受容体ＡＲを活性化する能力）と予後を比較することにより、前立腺癌のホルモン療法から再燃までの期間が予測可能になるものと考えられる。
【００２６】
本発明の酵素活性測定法は、以上のような仮説に基づくものであり、前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した後、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定する。
【００２７】
前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性は、例えば前立腺癌細胞に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、前立腺癌細胞のルシフェラーゼ活性を測定することで把握することが可能である。
【００２８】
前記アンドロゲン受容体の活性の評価に際しては、例えば市販の前立腺由来間質細胞と前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞についてそれぞれ測定を行い、これらを比較すればよい。前立腺癌患者由来の前立腺由来間質細胞においては、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性を市販の前立腺由来間質細胞よりも明らかに亢進させる場合があり、前記比較により、当該前立腺癌患者の酵素活性（アンドロゲン受容体ＡＲを活性化する能力）を的確に評価することが可能になる。
【００２９】
以上のように、本発明の酵素活性測定法によれば、前立腺癌組織における実効的な酵素活性（すなわちアンドロゲン受容体ＡＲを活性化する能力）を的確に測定することが可能であり、例えば前立腺癌患者の再燃の可能性や再燃までの期間等を評価する上で有用な情報を得ることができる。
【００３０】
なお、前述の酵素活性測定法は、前立腺由来間質細胞以外の細胞に応用することも可能である。例えば、アンドロゲンの減少はメタボリック症候群を誘導すると言われている。また、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は脂肪代謝にも影響を及ぼしていると考えられる。皮下脂肪由来の脂肪前駆細胞や内臓脂肪由来の脂肪前駆細胞は既に市販されているため、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）がどのようにこれらの細胞で代謝され、活性化されるのかを前述の酵素活性測定法で調べることが可能であり、例えば前立腺由来間質細胞の代わりに脂肪細胞を用い、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）が脂肪細胞でどのように代謝されるか、あるいは活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）がどのように脂肪細胞で不活性化されるかを前記の酵素活性測定法で調べることによって、脂肪細胞の増殖、分化への関与を研究することが可能である。さらに、患者から得られる内臓脂肪、皮下脂肪から脂肪細胞を樹立することによっても、同様な研究を行うことが可能である。
【００３１】
デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の起源は副腎である。いくつかの施設から前立腺癌の治療薬であるアンチアンドロゲンのフルタミド（オダイン）が、同じくアンチアンドロゲンであるビカルタミド使用後の前立腺癌再燃の治療に有効であるとの報告がなされている。その機序を明らかにするために、本発明者は、前立腺癌の再燃した患者に対してフルタミド使用後の血清中のＤＨＥＡ−Ｓの濃度を測定した。その結果、ＤＨＥＡ−Ｓが治療後に低下した症例では、有意に再燃の指標である腫瘍マーカＰＳＡが低下することが確認された。これは、フルタミドがアンチアンドロゲンとしてだけでなく、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の生合成にも影響を及ぼしていることを意味している。以上のことより、フルタミドよりも強力にデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の合成を阻害する薬剤の開発は、再燃癌の治療に役立つ可能性がある。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）はコレステロールから合成されるが、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を産生する能力のある市販の副腎癌細胞を間質細胞や前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰとともに共培養し、コレステロールを添加することによって、どのようにデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）が産生され、活性ある活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換されるかをこのアッセイ系で観察することができるものと考えられる。また、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の合成阻害剤の開発に際しても、このアッセイ系でコレステロールからデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）への変換阻害の効果を確認できるものと考えられる。
【００３２】
さらに、前述の酵素活性測定法を応用することにより、酵素阻害剤の阻害効果を評価することも可能である。この場合にも、前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した後、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定するが、当該測定に際し、副腎性アンドロゲンを活性型男性ホルモンに変換する酵素に対する阻害剤の有無による前記活性の相違を測定する。そして、阻害剤の有無による活性の相違に基づいて阻害剤の阻害効果を評価する。
【００３３】
前記酵素阻害剤の評価方法において、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性の測定は、前述の酵素活性測定法の場合と同様、例えば前立腺癌細胞に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、前立腺癌細胞のルシフェラーゼ活性を測定することで行えばよい。
【００３４】
アンドロゲン代謝には様々な酵素が関与しているものと考えられ、単一の酵素のみを阻害するだけでは不十分な可能性があるが、本発明の酵素阻害剤の評価方法によれば、それら酵素の包括的な活性を検査することができる。したがって、阻害剤の阻害効果を的確に評価することができ、創薬開発のために有用なアッセイ系となる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
【００３６】
（予備実験１）
市販の前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにＰＳＡプロモータにより制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミド（ｐＧＬ３ＰＳＡｐ−５．８）を導入後、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養した。共培養における培養時間は１２時間である。
【００３７】
次に、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）０．１ｎＭ、あるいはデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）１００ｎＭを共培養した細胞に添加し、２４時間後に細胞を回収した。回収した細胞について、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３８】
前記測定を、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣの添加量が異なるサンプルＰｒＳＣ（２０，０００）及びＰｒＳＣ（４０，０００）について行った。なお、ＰｒＳＣ（２０，０００）は前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを２０，０００個共培養したことを意味し、ＰｒＳＣ（４０，０００）は前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを４０，０００個共培養したことを意味する。また、比較のため、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養しない場合ＰｒＳＣ（０）についても同様の測定を行った。結果を図２及び図３に示す。図２は活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を添加した場合のルシフェラーゼ活性を示す図であり、図３はデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した場合のルシフェラーゼ活性を示す図である。
【００３９】
図２から明らかなように、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を添加した場合には、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養しないＰｒＳＣ（０）において、添加量の増加に伴ってルシフェラーゼ活性が上昇している。このことから、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）によるアンドロゲン受容体の活性化は、前立腺癌細胞において支配的であることがわかる。これに対して、図３に示すように、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した場合には、前立腺癌細胞を単独で培養した場合に比べ、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養した場合の方が明らかにルシフェラーゼ活性が亢進されている。したがって、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素代謝には、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣが関与しているものと考えられる。
【００４０】
（予備実験２）
本実験では、アンチアンドロゲンＢｉｃ（bicalutamide）とＡＲｓｉＲＮＡを用いて実験を行った。前者については、前立腺癌細胞のみの場合（Control）と前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養した場合について、それぞれアンチアンドロゲンＢｉｃを添加した場合と添加しない場合におけるルシフェラーゼ活性を調べた。後者については、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにｉＲＮＡプラスミドであるｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ１、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ２をそれぞれ導入し、非前立腺患者由来の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ（−）または前立腺患者由来の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ（＋）を共培養してルシフェラーゼ活性を調べた（ＲＮＡ interferance 実験）。ｓｈＲＮＡ−controlは、今回の研究とは全く関係のないｉＲＮＡ発現プラスミドである。結果を図４及び図５に示す。
【００４１】
先ず、図４に示すように、アンチアンドロゲンＢｉｃを用いた実験において、コントロール（前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを共培養していない状態）に活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）やデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を加えると活性は上昇するが、アンチアンドロゲンＢｉｃを添加するとその活性は抑制される。前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養においても、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）や亢進したデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性がアンチアンドロゲンＢｉｃの添加によって抑制される。このことは、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養におけるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性亢進も、アンドロゲン受容体を介して働いていることを意味している。
【００４２】
図５に結果を示す実験は、図４の結果をさらに裏付けるために行った実験である。すなわち、図５に示されるように、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにアンドロゲン受容体ＡＲ遺伝子発現を抑えるｉＲＮＡプラスミド（ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ１、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ２）を導入することにより、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰでのアンドロゲン受容体ＡＲ遺伝子発現が低下している。つまり、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）の作用減弱を期待することができる。本実験は、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養の状態でのデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の作用が前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰのアンドロゲン受容体ＡＲを介しているか、そうでないかを確認するために行った実験であり、予想通り、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養の状態でのデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）による活性をｉＲＮＡプラスミド（ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ１、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ２）を導入することで抑制することができた。この結果からも、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣとの共培養の状態でのデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の作用は、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰでのアンドロゲン受容体ＡＲを介した作用であることが裏付けられた。
【００４３】
以上のように、これら実験により、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣによる活性亢進の機序は、アンドロゲン受容体ＡＲを介した作用であることが示唆された。
【００４４】
（酵素活性測定）
市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣを基準として、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９及び骨由来間質細胞（bone-derived stromal cell）ＢＤＳＣ−１，ＢＤＳＣ−２について、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）を添加した場合とデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を添加した場合のルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４５】
前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９は、明らかに前立腺癌を疑う患者より同意取得後、前立腺針生検の際に組織の一部を提供してもらい、この組織から一次培養を行った後、間質細胞の培養を行った。間質細胞の培養については、多くの論文で報告されており、本実験でもそれに準じて行った。
【００４６】
市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣと前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９及び骨由来間質細胞ＢＤＳＣ−１，ＢＤＳＣ−２について、予備実験１と同様の実験を行い、活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）及びデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）によるルシフェラーゼ活性の違いを観察した。結果を表１に示す。また、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８についての測定結果をグラフ化したものを図６に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９及び骨由来間質細胞ＢＤＳＣ−１，ＢＤＳＣ−２において、患者によっては市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣと比べてデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性を明らかに亢進させることが判明した。
【００４９】
そこでさらに、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９、市販の前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰについて、アンドロゲンメタボリック酵素の発現パターンを調べた。結果を図７及び図８に示す。これら図７や図８からも明らかな通り、前立腺由来間質細胞であっても試料によって酵素の発現パターンは大きく異なっている。
【００５０】
例えば、図７は、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ並びに前立腺癌患者の前立腺癌組織から得られた前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９からＲＮＡを抽出し、様々な１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）、３β位水酸基脱水素酵素（３β−ＨＳＤ）、及び還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−steroid reductase）のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認したものである。１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）の発現パターンとデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性亢進とは必ずしも相関するものではなく、このことから全ての酵素の活性の総和が重要なのではないかと推測された。また、図８では、前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにおいても、１７β位水酸基脱水素酵素（１７β−ＨＳＤ）や３β位水酸基脱水素酵素（３β−ＨＳＤ）、還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−steroid reductase）を発現していることがわかる。例えば還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−steroid reductase）について言えば、従来、ＳＲＤ５Ａ−２（type２）が前立腺組織に多く発現することが報告されているが、本実験においてはそれほど発現しておらず、最近新しく同定されたＳＲＤ５Ａ−３（type３）が多く発現していた。
【００５１】
（酵素阻害剤による阻害効果の確認）
本実験では、テストステロンを活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する還元酵素（ＳＲＤ５Ａｓ：５α−reductase）の阻害剤であるＤｕｔ（dutasteride）の有無による活性の相違を調べた。具体的には、前立腺癌細胞のみ（Control）、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８について、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）及び阻害剤Ｄｕｔの添加の有無による活性の相違を調べた。結果を図９に示す。図９において、記号（−）は添加していない場合を、記号（＋）は添加した場合をそれぞれ示す。
【００５２】
図９から明らかなように、阻害剤Ｄｕｔは、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８によるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の活性亢進を抑制した。
【００５３】
（他臓器由来間質細胞についての実験）
本実験では、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣの他、ヒト骨髄間質細胞ＨＭＳＣ及びヒト肺由来間質細胞ＨＬＦａ（human lung fibroblast）について、予備実験１と同様の実験を行った。結果を図１０に示す。
【００５４】
他臓器由来の間質細胞（ヒト骨髄間質細胞ＨＭＳＣ及びヒト肺由来間質細胞ＨＬＦａ）を前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣと比較すると、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）による活性は、前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣと異なる反応を示すことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の酵素活性測定法によれば、前立腺癌組織におけるアンドロゲン代謝酵素の包括的な活性を測定することができ、アンドロゲン受容体を活性化する能力を把握することが可能である。したがって、例えばこの活性化する能力と予後とを比較することにより、前立腺癌のホルモン療法から再燃までの期間を予測することが可能になり、前立腺癌の治療方針を決める上で有用な知見を得ることが可能になる。
【００５６】
また、製薬会社等においては、前立腺癌の再燃を防止するために、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）を活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）に変換する酵素の阻害剤に関する研究が進められている。このような酵素阻害剤の開発に当たっては、阻害効果を確認する必要があるが、単一の酵素のみに対する阻害効果だけでは不十分な可能性がある。本発明の酵素阻害剤の評価方法では、アンドロゲン代謝酵素の包括的な活性についての阻害効果を確認することができ、創薬のための有用なアッセイ系となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】前立腺癌細胞及び前立腺由来間質細胞におけるアンドロゲン代謝を説明する模式図である。
【図２】前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣの共培養の有無による活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）のルシフェラーゼ活性の相違を示す図である。
【図３】前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣの共培養の有無によるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）のルシフェラーゼ活性の相違を示す図である。
【図４】前立腺癌細胞（Control）と前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣについて、アンチアンドロゲンＢｉｃを添加した場合と添加しない場合におけるルシフェラーゼ活性の相違を示す図である。
【図５】非前立腺患者由来の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ（−）と前立腺患者由来の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ（＋）について、ｓｈＲＮＡ−control、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ１、ｓｈＲＮＡ−ｈＡＲ２をそれぞれ添加した場合のルシフェラーゼ活性の相違を示す図である。
【図６】前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８についての測定結果を示す図である。
【図７】市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ及び前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−１〜ＰｒＳＣ−９におけるアンドロゲンメタボリック酵素の発現パターンを示す図である。
【図８】市販の前立腺癌培養細胞ＬＮＣａＰにおけるアンドロゲンメタボリック酵素の発現パターンを示す図である。
【図９】前立腺癌細胞のみ（Control）、市販の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ、前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞ＰｒＳＣ−８について、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）及び阻害剤Ｄｕｔの添加の有無による活性の相違を示す図である。
【図１０】他臓器由来の間質細胞（ヒト骨髄間質細胞ＨＭＳＣ及びヒト肺由来間質細胞ＨＬＦａ）における活性型男性ホルモン（ＤＨＴ）及びデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）のルシフェラーゼ活性を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンを添加した後、前記前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定することを特徴とする酵素活性測定法。
【請求項２】
前記前立腺癌細胞に、前立腺特異抗原プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、前立腺癌細胞のルシフェラーゼ活性を測定することで前記アンドロゲン受容体の活性を測定することを特徴とする請求項１記載の酵素活性測定法。
【請求項３】
市販の前立腺由来間質細胞と前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞についてそれぞれ測定を行い、これらを比較することを特徴とする請求項１または２記載の酵素活性測定法。
【請求項４】
前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンを添加した後、前記前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定するに際し、
前記副腎性アンドロゲンを活性型男性ホルモンに変換する酵素に対する阻害剤の有無による前記活性の相違を測定し、当該活性の相違に基づいて前記阻害剤の阻害効果を評価することを特徴とする酵素阻害剤の評価方法。
【請求項５】
前記前立腺癌細胞に、前立腺特異抗原プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、前立腺癌細胞のルシフェラーゼ活性を測定することで前記アンドロゲン受容体の活性を測定することを特徴とする請求項４記載の酵素阻害剤の評価方法。
【請求項１】
前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンを添加した後、前記前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定することを特徴とする酵素活性測定法。
【請求項２】
前記前立腺癌細胞に、前立腺特異抗原プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、前立腺癌細胞のルシフェラーゼ活性を測定することで前記アンドロゲン受容体の活性を測定することを特徴とする請求項１記載の酵素活性測定法。
【請求項３】
市販の前立腺由来間質細胞と前立腺癌患者の前立腺由来間質細胞についてそれぞれ測定を行い、これらを比較することを特徴とする請求項１または２記載の酵素活性測定法。
【請求項４】
前立腺由来間質細胞を前立腺癌細胞とともに共培養し、副腎性アンドロゲンを添加した後、前記前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体の活性を測定するに際し、
前記副腎性アンドロゲンを活性型男性ホルモンに変換する酵素に対する阻害剤の有無による前記活性の相違を測定し、当該活性の相違に基づいて前記阻害剤の阻害効果を評価することを特徴とする酵素阻害剤の評価方法。
【請求項５】
前記前立腺癌細胞に、前立腺特異抗原プロモータによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミドを導入し、前立腺癌細胞のルシフェラーゼ活性を測定することで前記アンドロゲン受容体の活性を測定することを特徴とする請求項４記載の酵素阻害剤の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−２２２３４（Ｐ２０１０−２２２３４Ａ）
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１８４９６５（Ｐ２００８−１８４９６５）
【出願日】平成２０年７月１６日（２００８．７．１６）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１６日（２００８．７．１６）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]