酵素特性を向上させたポリシアリルトランスフェラーゼの操作されたバージョン
本発明は、溶解度及び活性を向上させたポリシアリルトランスフェラーゼ及びポリシアル化最終産物、例えばオリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質の作製のためにポリシアリルトランスフェラーゼを使用する方法に関する。一実施形態において、本発明は、供与体基質からシアル酸部分を適切な受容体基質へ転移させる短縮型ポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ）ポリペプチドを提供する。一実施態様において、この短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の３３位から４９５位までのアミノ酸と９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、この短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の２０位から４９５位までのアミノ酸と９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の１位から４９５位までのアミノ酸からなる完全長のＰＳＴポリペプチドよりも可溶性が高いことが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００７年６月１５日に出願された米国仮出願第６０／９４４，３９１号および２００８年２月２９日に出願された米国仮出願第６１／０３２，５８９号（これらの両方は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、溶解度及び活性を向上させたポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ：ｐｏｌｙ−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びポリシアル化最終産物、例えばオリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質の作製のためにこのポリシアリルトランスフェラーゼを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖蛋白質、糖脂質及び多糖は哺乳動物細胞の細胞表面に存在し、多くの生物学的過程における中心的分子である。これらは、生体全体を通じて細胞間認識、細胞分化及び各種リセプター−リガンド相互作用に関与している。これらの生物活性グリカンの多くは、シアル酸又はＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）という必須９−炭素糖を含有する。
【０００４】
哺乳動物宿主に侵入する病原菌の一部は、宿主におけるシアル酸含有複合糖質の存在を利用している。これらの細菌は細菌細胞表面にこうした同じ炭水化物鎖の一部を表示し、実際に、発症におけるこのような炭水化物の関与が明らかにされている。例えば、非特許文献１並びに非特許文献２を参照されたい。こうした炭水化物模倣体が存在すると、この分子が異種とみなされないため、病原体は免疫系による検知を免れるものと考えられている。さらに、こうした炭水化物が存在することによって血清補体の殺作用に対する物理的バリアーが提供される。例えば、非特許文献３を参照されたい。最後に、恐らく、特定の病原体は、伝染（又は宿主への定着（但し、そのメカニズムは多くの病原体ではまだ立証されていない））を促進する手段としてその表面炭水化物構造を認識する正常なヒトの受容体を利用しているのかもしれない。例えば、非特許文献４及び非特許文献５を参照されたい。
【０００５】
Ｂ群Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１の莢膜多糖類は、連鎖中にシアル酸を有し、この連鎖は神経機能に不可欠な脳特異的蛋白質である哺乳動物神経細胞接着分子に主にみられるポリシアル酸（ＰＳＡ）構造の分子擬態である。すなわち、これらは、α−２，８−結合Ｎｅｕ５Ａｃのホモポリマーとして、また、α−２，９結合残基のホモポリマーとして、結合がα−２，８／α−２，９混合型であるコポリマーとして、及び最終的には、Ｙ及びＷ群Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおけるように、他の糖が含まれるポリマーとして存在する。これらのポリシアル酸莢膜は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ及びＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの場合、神経侵襲性疾患において必要とされる。例えば、Ｓｉｌｖｅｒ，Ｒ．Ｐ．及びＥ．Ｒ．Ｖｉｍｒ．、１９９０年、Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｃａｐｓｕｌｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１、ｐ３９−６０、Ｂ．Ｈ．Ｉｇｌｅｗｓｋｉ及びＶ．Ｌ．Ｃｌａｒｋ編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．を参照されたい。これらの病原体の多くはヒト宿主に特異的であるので、動物モデルでの感染データではこうした複合糖質の真の機能の全てが明らかとなるわけではない可能性があることに留意されたい。
【０００６】
これまでのところ、病原菌を用いたシアリルトランスフェラーゼの酵素化学の基礎的な側面に関して詳細な研究はほとんどなされていない。ＬＯＳのシアル化に関与するこうした酵素の一部については発現、精製及び結晶化は可能である。例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：ｐ２８２７１−２８２７６（１９９６年）、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、：ｐ３８９６−３９０６（２０００年）、Ｃｈｉｕ，Ｃ．Ｐ．ほか、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：ｐ１６３−１７０（２００４年）及びＹｕ，Ｈ．ほか、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１２７：ｐ１７６１８−１７６１９（２００５年）を参照されたい。しかしながら、シアル酸ホモポリマー莢膜の生成に関与する酵素に関してはそのような研究は何らなされていない。
【０００７】
ＰＳＡ莢膜産生のための遺伝子座はＥ．ｃｏｌｉ及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのいずれにおいても同定されており、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１及びＫ９２からの組換え酵素（ＮｅｕＳ）に関して研究が一部なされている。例えば、非特許文献６並びに非特許文献７を参照されたい。しかし、この場合も、単離シアリルトランスフェラーゼに関する詳細な酵素化学については報告がない。こうした酵素化学の研究は、この酵素の溶解度が低いためにインビトロでのポリシアル酸結合体の産生が妨げられることによって阻害されている。本発明はこうしたニーズや他のニーズを解決するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｈｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．及びＳｔｅｐｈｅｎｓ，Ｄ．Ｓ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８年）２４：ｐ２８１−３３４
【非特許文献２】Ｍｏｒａｎ，Ａ．Ｐ．ほか、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６年）１６：ｐ１０５−１１５
【非特許文献３】Ｖｏｇｅｌ，Ｕ．ほか、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｂｅｒｌ）（１９９６年）１８５：ｐ８１−８７
【非特許文献４】Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ａ．ほか、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６年）２２：ｐ１３９−１８０
【非特許文献５】Ｈａｒｖｅｙ，Ｈ．Ａ．ほか、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００年）３６：ｐ１０５９−１０７０
【非特許文献６】Ｃｈｏ，Ｊ．及びＴｒｏｙ ＦＡ，Ｉ．Ｉ．、ＰＮＡＳ（１９９４年）９１：ｐ１１４２７−１１４３１
【非特許文献７】Ｓｈｅｎ，Ｇ．Ｊ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９年）２７４：ｐ３５１３９−３５１４６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、供与体基質からシアル酸部分を適切な受容体基質へ転移させる短縮型ポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ）ポリペプチドを提供する。一実施態様において、この短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の３３位から４９５位までのアミノ酸と９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、この短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の２０位から４９５位までのアミノ酸と９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の１位から４９５位までのアミノ酸からなる完全長のＰＳＴポリペプチドよりも可溶性が高いことが好ましい。本発明の短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の１位から４９５位までのアミノ酸からなるアミノ酸配列を含まない。
【００１０】
一態様において、この短縮型ＰＳＴポリペプチドはＭＢＰタグを含む。別の態様では、この短縮型ＰＳＴポリペプチドでシアル化された受容体基質は、例えば、糖ペプチド、糖蛋白質、糖脂質又はガングリオシドである。別の態様では、この受容体基質は糖蛋白質、例えば、第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、トランスフェリン及びフェチュインである。好ましい実施態様では、この糖蛋白質基質はヒト蛋白質である。
【００１１】
本発明は、受容体基質、例えばオリゴ糖又は単糖を短縮型ＰＳＴポリペプチド及びシアル酸部分を含む供与体基質と接触させ、このシアル酸部分の受容体糖への転移を生じさせることによりポリシアル化産物糖を作製することで、ポリシアル化産物糖を作製する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、受容体基質、例えば適切な蛋白質又はペプチドを短縮型ＰＳＴポリペプチド及びシアル酸部分を含む供与体基質と接触させ、このシアル酸部分の受容体糖類への転移を生じさせることによりポリシアル化蛋白質又はペプチドを作製することで、ポリシアル化蛋白質又はペプチドを作製する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、受容体基質、例えば適切な糖脂質又はガングリオシドを短縮型ＰＳＴポリペプチド及びシアル酸部分を含む供与体基質と接触させ、このシアル酸部分の受容体糖類への転移を生じさせることによりポリシアル化糖脂質又はガングリオシドを作製することで、ポリシアル化糖脂質又はガングリオシドを作製する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＳＴのＮ末端短縮化についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の溶解度を分析した。「Ｐ」はペレット画分、「Ｓ」は上清（可溶性）画分を示す。
【図２】ＰＳＴシアリルトランスフェラーゼ反応液の代表的なキャピラリー電気泳動（ＣＥ：ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）図である。この分析結果は、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の２７，０００×ｇ上清（Ｓ）及びペレット（Ｐ）についてのものである。変換％はいずれかのシアル化形態に変換された基質の百分率を示す。
【図３】ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の１０倍希釈２７，０００×ｇ上清の代表的なＣＥ分析結果である。変換％はいずれかのシアル化形態に変換された基質の百分率を示す。ＣＥラインは、上から下にＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）に相当するように順序付けられている。
【図４】精製したＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。矢印はこれらの精製蛋白質のバンドのおおよその予想泳動点である。
【図５】５０ｎｇの精製ＭａｌＥ−Ｐｓｔ融合構造体ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の活性を表す代表的ＣＥ分析結果を示す図である。変換％はシアル化産物に変換された基質の百分率を示す。
【図６】１００，０００×ｇで遠心分離したＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。「Ｓ」は上清（可溶性）画分、「Ｐ」はペレット画分を示す。
【図７】ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の１００，０００×ｇ遠心分離アッセイ物の代表的なＣＥ分析結果を示す図である。「Ｓ」は上清（可溶性）画分、「Ｐ」はペレット画分を示す。変換％はシアル化産物に変換された基質の百分率を示す。
【図８】ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）の安定性アッセイの結果を示す代表的なグラフである。このアッセイには０．３５ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）を用いた。時間（日単位）はＸ軸に、残存活性（％）はＹ軸にプロットされている。
【図９】ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の安定性アッセイの結果を示すグラフである。１．６３ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を用いた。時間（日単位）はＸ軸に、残存活性（％）はＹ軸にプロットされている。
【図１０】ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の安定性アッセイの結果を示すグラフである。１．５６ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を用いた。時間（日単位）はＸ軸に、残存活性（％）はＹ軸にプロットされている。
【図１１】二機能性シアリルトランスフェラーゼＣＳＴ−８９とＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）又はＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）のいずれか一方とを含む反応における第ＩＸ因子のポリシアル化の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。「Ｔ」は反応を進行させた時間（分単位）を示す。
【図１２】細菌ポリシアリルトランスフェラーゼによるフェチュインのポリシアル化の結果を示す図である。以下の酵素をアッセイした：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ酵素のＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）並びにＥ． ｃｏｌｉ酵素のＰＳＴ−５。フィルムは２又は５秒間露光させた。各レーンは以下の通り番号を付した：レーン１：フェチュイン無添加の対照、レーン２：ＣＭＰ−シアル酸無添加の対照、レーン３：１．０μｇ ＰＳＴ、レーン４：５μｇ ＰＳＴ、レーン５：１０μｇ ＰＳＴ、及びレーン６：１５μｇ ＰＳＴ。
【図１３】ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）及びＣＭＰ−シアル酸とのインキュベーション後の各種糖蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。以下の糖蛋白質をアッセイした：第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トランスフェリン及びフェチュイン。インキュベーションは０．５時間、２時間、５時間及び１６時間とした。レーン１：糖蛋白基質無添加の対照、レーン２：ＣＭＰ−シアル酸無添加の対照、レーン３：５．０μｇ ＰＳＴ、レーン４：１５μｇ ＰＳＴ。
【図１４】ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）及びＣＭＰ−シアル酸とのインキュベーション後の各種糖蛋白質のポリシアル化の結果を示す図である。以下の糖蛋白質をアッセイした：第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トランスフェリン及びフェチュイン。インキュベーションは０．５時間又は１６時間とした。レーン１：糖蛋白基質無添加の対照、レーン２：ＣＭＰ−シアル酸無添加の対照、レーン３：５．０μｇ ＰＳＴ、レーン４：１５μｇ ＰＳＴ。
【図１５】ポリシアル酸鎖の長さに対するフェチュイン濃度漸増の結果を示す図である。図は、ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）及びＣＭＰ−シアル酸と図に示した時間、即ち０．５時間、１時間及び一夜インキュベーションした後のポリシアル化フェチュイン産物のウエスタンブロット（２露光時間）を示す図である。各レーンは以下の通り番号を付した：レーン１：フェチュイン無添加の対照、レーン２：ＣＭＰ−シアル酸無添加の対照、レーン３：１．０ｍｇ／ｍｌフェチュイン、レーン４：２．５ｍｇ／ｍ．フェチュイン、レーン５：５．０ｍｇ／ｍｌフェチュイン。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．序文
ポリシアル化産物、例えば、ポリシアル酸基を含有するオリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質を効率的に作製するために、ポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ）ポリペプチドを構築した。ＰＳＴのＮ末端を短縮化すると、溶解度及び活性が増加する。従って、本発明の短縮型ＰＳＴは、修飾されていないＰＳＴ蛋白質に比し、α−２，８又はα−２，９配置でシアル酸残基をより効率的に結合させることができる。
【００１６】
ＩＩ．定義
本明細書では以下の略号を用いている：
Ａｒａ ＝ アラビノシル；
Ｆｒｕ ＝ フラクトシル；
Ｆｕｃ ＝ フコシル；
Ｇａｌ ＝ ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ ＝ Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ ＝ グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ ＝ Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ ＝ マンノシル；及び
ＮｅｕＡｃ ＝ シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。
【００１７】
糖転移酵素、例えばポリシアリルトランスフェラーゼの「受容体基質」又は「受容体糖」は、特定の糖転移酵素の受容体の役目をすることができるオリゴ糖部分である。この受容体基質を対応する糖転移酵素及び糖供与体基質並びに他の必要な反応混液成分と接触させ、この反応混液を十分な時間インキュベートすると、この糖転移酵素は糖供与体基質から糖残基を受容体基質へ転移させる。この受容体基質は種々の特定の糖転移酵素に対して変えることができる。従って、「受容体基質」という用語は、特定の用途に対して対象となる特定の糖転移酵素との関連で解釈する。ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質及び別の糖転移酵素の受容体基質について本明細書で説明する。
【００１８】
糖転移酵素の「供与体基質」は、活性化ヌクレオチド糖である。そのような活性化糖は一般に、ウリジン、グアノシン、シトシンの一リン酸の糖誘導体（それぞれ、ＵＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ）又は二リン酸の糖誘導体（それぞれ、ＵＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ）から成り、この場合、ヌクレオシド一リン酸又は二リン酸は離脱基となる。ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質の供与体基質としては、例えば、目的とするシアル酸を含む活性化ヌクレオチド糖が挙げられる。例えば、ＮｅｕＡｃの場合、この活性化糖はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃである。細菌系、植物系及び真菌系は、時として他の活性化ヌクレオチド糖を用いることがある。
【００１９】
オリゴ糖は、還元末端及び非還元末端を有すると考えられており、その還元末端の単糖が実際に還元糖であるか否かを問わない。一般に認められている命名法に準拠して、本明細書ではオリゴ糖は、左に非還元末端、右に還元末端がくるように記載している。本明細書に記載したオリゴ糖は全て、非還元糖の名称又は略号（例えば、Ｇａｌ）、続いてグリコシド結合の配置（α又はβ）、環結合、その結合に関与する還元糖の環位置、次にこの還元糖の名称又は略号（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）により記載している。２個の糖間の結合は、例えば、２，３、２→３又は（２，３）と表すことができる。各単糖はピラノース又はフラノースである。
【００２０】
本明細書に用いている「シアル酸部分」とは、シアル酸を含む、又はシアル酸から誘導することができる分子のことを指す。シアル酸部分は通常単糖、例えば、ＣＭＰ−シアル酸である。
【００２１】
本明細書に用いている「シアル酸部分のポリマー」とは、多数の結合シアル酸部分（即ち、２個以上）のことを指す。そのようなシアル酸ポリマーとして、全てが同じ配置で結合しているシアル酸のホモポリマー、例えば「α−２，８結合シアル酸部分のホモポリマー」又は「α−２，９結合シアル酸部分のホモポリマー」が挙げられる。また、シアル酸ポリマーとしては「α−２，８／２，９結合シアル酸部分のコポリマー」も挙げられる。シアル酸ポリマーの結合は、ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質に含まれるポリシアリルトランスフェラーゼの識別性によって決まることになる。
【００２２】
本明細書に用いている「ポリシアル化産物又は産物糖」とは、少なくとも３個のシアル酸部分を含む、糖脂質又は糖蛋白質（例えば、生体分子）に非結合又は結合したオリゴ糖、多糖又は炭水化物部分のことを指す。ポリシアル化産物又は産物糖の好ましい実施態様では、第１の単一シアル酸部分は受容体基質又は生体分子にα−２，３配置で結合し、第２の単一シアル酸部分は第１の単一シアル酸部分にα−２，８配置で結合し、第２の単一シアル酸部分には１個以上のシアル酸部分が結合する。ポリシアル化産物又は産物糖は少なくとも３個のシアル酸部分を含む。他の実施態様では、ポリシアル化産物又は産物糖は少なくとも５、７、１２、２５、４５、８０、１００、１５０、２００、２５０又は５００個のシアル酸部分を含む。別の実施態様では、ポリシアル化産物又は産物糖は少なくとも３乃至１２、２５、４５、８０、１００、１５０、２００、２５０又は５００個のシアル酸部分を含む。さらに別の実施態様では、ポリシアル化産物又は産物糖は、最大１２、２５、４５、８０、１００、１５０、２００、２５０又は５００個のシアル酸部分を含む。
【００２３】
また、一部の実施態様では、別の糖転移酵素の作用によって受容体基質に他の糖部分、例えばフコース、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、グルコース又はＧｌｃＮＡｃを付加することによりポリシアル化産物糖を作製する。一部の実施態様では、受容体基質はガラクトース部分を含み、二機能性シアリルトランスフェラーゼ蛋白質を用いて第１の単一シアル酸部分をこのガラクトース部分にα−２，３配置で付加し；次いで、ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質により第２の単一シアル酸部分をα−２，８配置で第１のシアル酸部分に付加することができ；さらに、この第２の単一シアル酸部分に１個以上のシアル酸部分を付加してポリシアル化産物糖を作製する。他の実施態様では、受容体基質は第１のシアル酸部分をα−２，３配置で含み、ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質を用いて第２の単一シアル酸部分をα−２，８配置で第１のシアル酸部分に付加し；次いでこの第２の単一シアル酸部分に１個以上のシアル酸部分を付加してポリシアル化産物糖を作製する。別の実施態様では、受容体基質は、第１のシアル酸部分をこの第１のシアル酸部分に対してα−２，８配置で第２の単一シアル酸部分に結合させたものをα−２，３配置で含み；ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質を用いてこの第２の単一シアル酸部分に１個以上のシアル酸部分を付加してポリシアル化産物糖を作製する。
【００２４】
「シアル酸」又は「シアル酸部分」という用語は、炭素９個のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーのことを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、又はＮＡＮＡと略される）である。ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏほか、（１９８６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：ｐ１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：ｐ２１８１１−２１８１９（１９９０年））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ又は９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、及び９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９位置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２：ｐ２５−４０（１９９２年）；Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）を参照されたい。シアル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用については、１９９２年１０月１日付け公開の国際出願ＷＯ９２／１６６４０号に開示されている。
【００２５】
本出願において必要な命名及び一般的な検査手技の多くは、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版）、第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年に記載されている。以後、この手引き書のことを「Ｓａｍｂｒｏｏｋほか」と称する。
【００２６】
「シアリルトランスフェラーゼ」又は「シアリルトランスフェラーゼ」をコードする核酸という用語は、第１のシアル酸分子の受容体基質への転移を触媒することができる核酸並びにポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異株及び種間ホモログのことを指す。細菌及び哺乳動物のシアリルトランスフェラーゼが知られている。シアル酸残基は種々の結合（例えば、α−２，３、α−２，６及びα−２，８）により受容体基質に結合させることができる。シアリルトランスフェラーゼは１種以上の活性を有することができる。多くのシアリルトランスフェラーゼは単機能性である。例として、ＣＳＴ−Ｉ及びＣＳＴ−ＩＩＩは、シアル酸のα−２，３結合での転移を触媒する、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来の単機能性シアリルトランスフェラーゼである。例えば、米国特許第６，６８９，６０４号及び米国特許第６，６９９，７０５号を参照されたい。他の例示的な単機能性シアリルトランスフェラーゼとしては、米国特許第６，０９６，５２９号に開示されているＮｅｉｓｓｅｒｉａ由来のシアリルトランスフェラーゼがある。
【００２７】
他のシアリルトランスフェラーゼは２種以上の酵素活性を有する、即ち、シアル酸を２種以上の結合で基質に付加する。例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣＳＴ−ＩＩ酵素は、α−２，３及びα−２，８結合のうちの少なくとも１つを用いて受容体分子にシアル酸を付加する。一部のＣＳＴ−ＩＩ酵素は、α−２，８配置で受容体分子に複数のシアル酸を付加する。別のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株由来のＣＳＴ−ＩＩ酵素では活性が異なりうる。各種のＣＳＴ−ＩＩ酵素、核酸及び活性のアッセイについては、例えば、米国特許第６，６９９，７０５号、Ｇｉｌｂｅｒｔほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：ｐ３２７−３７（２００２年）及びＧｉｌｂｅｒｔほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：ｐ３８９６−９０６（２０００年）に開示されている。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の多機能性シアリルトランスフェラーゼについても報告されている。例えば、Ｆｏｘほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：ｐ４００２４−３２（２００６年）を参照されたい。
【００２８】
「ポリシアリルトランスフェラーゼ」又は「ＰＳＴ」並びに、（１）ポリシアリルトランスフェラーゼの核酸によりコードされたアミノ酸配列もしくはポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質のアミノ酸配列（例示的なポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質配列については、例えば、配列番号１参照）に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、６５、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００個以上のアミノ酸の領域にわたって有し、（２）ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質のアミノ酸配列を含む免疫原及びその保存的に修飾された変異体に対する抗体（例えば、ポリクロナール抗体）に結合するポリペプチド多型変異体、対立遺伝子及び種間ホモログ。ＰＳＴの活性ドメインは、例えば配列番号１のポリシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸同一性を有する。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、通常、限定されない例として挙げられるＮｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａなどの細菌由来である。本発明の核酸及び蛋白質には天然分子又は組換え分子のいずれも含まれる。ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、通常、例えばα−２，８結合、α−２，９結合又はα−２，８／２，９結合を作る活性を含むポリシアリルトランスフェラーゼ活性を有する。ポリシアリルトランスフェラーゼのアッセイは、本明細書に記載したように、適切な供与体基質及び受容体基質を用い、当業者に周知の方法に従って実施することができる。通常、ＰＳＴ酵素は、受容体基質に予め結合したシアル酸残基に複数のシアル酸残基を付加する。
【００２９】
本明細書に用いている「短縮型ＰＳＴポリペプチド」又は文法上の変異体は、この短縮型ＰＳＴポリペプチドが酵素活性を保持している限り、自然界に生じる野生型ＰＳＴポリペプチドに比し、操作により少なくとも１個のアミノ酸残基が除去されているＰＳＴポリペプチドのことを指す。野生型、即ち天然のＰＳＴ蛋白質の例としては、例えば配列番号１のものが挙げられる。好ましいＰＳＴの短縮は、配列番号１のＮ末端から１９又は３２個アミノ酸の欠失である。短縮型ＰＳＴ蛋白質の他の好ましい例は、配列番号３及び５、又は配列番号３又は配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列である。別の好ましい実施態様では、短縮型ＰＳＴ蛋白質は、例えばＭａｌ−Ｅ蛋白質又はシアリルトランスフェラーゼに融合させる。
【００３０】
本発明の「融合ＰＳＴポリペプチド」又は「融合ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド」は活性ＰＳＴドメインを含むポリペプチドである。この融合ポリペプチドは、ポリシアル酸転移反応を触媒することができる。通常、この融合ポリペプチドの触媒ドメインは、ＰＳＴ及び触媒ドメインが由来する融合蛋白質のそれと少なくとも実質的に同一であることになる。一部の実施態様では、ポリシアリルトランスフェラーゼとシアリルトランスフェラーゼとの融合体である組換え蛋白質を構築して「自己プライマー化ＰＳＴ」を作製することができる。一部の実施態様では、この自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、第１の単一シアル酸を受容体基質中の非シアル酸糖残基に、シアリルトランスフェラーゼの活性によって通常α−２，３配置で結合させることができる。別の実施態様では、この自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、予め付加された第１の単一シアル酸部分に第２の単一シアル酸部分を多機能性シアリルトランスフェラーゼの活性によって通常α−２，８配置で結合させもする。別の実施態様では、この自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、α−２，３配置で予めシアル化した受容体基質にシアル酸残基を付加する。一旦適切な数のシアル酸残基が受容体基質に付加されてポリシアリルトランスフェラーゼ活性が「プライミング」されると、次いでこの自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、シアル酸部分にポリシアリルトランスフェラーゼの活性によって１個以上のシアル酸部分を結合させることができる。一部の実施態様では、ポリシアリルトランスフェラーゼの活性はシアル酸部分のポリマーを生じる。
【００３１】
本発明の組換え蛋白質は、一端に、蛋白質の精製又は同定を容易にする分子「精製タグ」を有する融合蛋白質として構築し、発現させることができる。このようなタグは、グリコシル化反応時に対象蛋白質の固定化に用いることもできる。好適なタグとしては、「エピトープタグ」が挙げられ、これは抗体によって特異的に認識される蛋白質配列である。エピトープタグは、一般に融合蛋白質に組み込むことによってこの融合蛋白質を明確に検出又は単離するために容易に入手できる抗体を使用することが可能となる。「ＦＬＡＧタグ」は、配列ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ又はこれと実質的に同一の変異体からなる、モノクロナール抗ＦＬＡＧ抗体によって特異的に認識されるよく用いられているエピトープタグである。他にも好適なタグが当業者に周知であり、例えば、ニッケルイオン、コバルトイオンなどの金属イオンに結合するヘキサヒスチジンペプチド又はｍｙｃタグのような親和性タグが挙げられる。精製タグを含む蛋白質は、精製タグを結合する結合パートナー（例えば精製タグに対する抗体、ニッケルもしくはコバルトイオン又は樹脂及びアミロース、マルトース又はシクロデキストリン）を用いて精製することができる。また、精製タグとしてはマルトース結合ドメイン及び澱粉結合ドメインも挙げられる。マルトース結合ドメイン蛋白質の精製は当業者には周知である。澱粉結合ドメインについては国際公開第ＷＯ９９／１５６３６号に開示されており、これは本明細書に参考として援用されている。ベータ−シクロデキストリン（ＢＣＤ：ｂｅｔａ−ｃｙｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）で誘導体化した樹脂を用いた澱粉結合ドメインを含む融合蛋白質の親和性精製については２００５年２月１７日付け公開の国際公開第ＷＯ２００５／０１４７７９号に開示されており、これは本明細書に参考として援用されている。
【００３２】
本明細書中で触れている「アクセサリー酵素」とは、例えばポリシアリルトランスフェラーゼ反応（例えば、シアル酸合成酵素）のためのヌクレオチド糖を形成する反応を触媒することに関与する酵素である。
【００３３】
「触媒ドメイン」又は「活性ドメイン」とは、酵素の部分であって、この酵素により通常行われる酵素反応を触媒するのに十分な部分のことを指す。例えば、ＰＳＴポリペプチドの触媒ドメインには、基質へのシアル酸の転移を触媒するのに十分なＰＳＴの部分を含めることになる。触媒ドメインには、酵素全体、その部分配列を含めることができ、又はその酵素に結合していない別のアミノ酸配列もしくは自然界に存在するような部分配列を含めることができる。
【００３４】
「工業規模」とは、１回の反応でポリシアル化産物のグラム規模の作製のことを指す。好ましい実施態様では、工業規模とは、約５０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５又は２００グラムを超えるポリシアル化産物の作製のことを指す。
【００３５】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列及び核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードしている核酸、又はその核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には本質的に同一の配列のことを指す。遺伝暗号の縮退のため、多数の機能的に同一の核酸が所与の蛋白質をコードしている。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードしている。従って、あるアラニンがあるコドンによって特定されている全ての位置において、コードされるポリペプチドを変えることなしに、このコドンを記載の対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はこの核酸の全ての可能なサイレント変異を表すものでもある。（通常メチオニンの唯一つのコドンであるＡＵＧ及び通常トリプトファンの唯一つのコドンであるＴＧＧを除く）核酸中の各コドンが機能的に同一の分子をもたらすように修飾することができることは、当業者によって認められよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現産物に関する各記載配列では絶対的であるが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。
【００３６】
アミノ酸配列に関しては、コードされている配列中の単一のアミノ酸又はごく一部のアミノ酸を変更、付加又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又は蛋白質配列に対する個々の置換、欠失又は付加については、こうした変更がアミノ酸の化学的に類似のアミノ酸による置換をもたらす場合、「保存的に修飾された変異体」であることは、当業者によって認められよう。機能的に類似のアミノ酸を示す保存的置換の表については当該分野では公知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子を排除するものではなく、これらに加わるものである。
【００３７】
蛋白質中の多くのアミノ酸同士をこの蛋白質の機能に影響を与えずに置換することができること、即ち、保存的置換が開示したポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質及びその誘導体などの蛋白質の保存的に修飾された変異体の基礎となり得ることは、当業者によって認められよう。以下は保存的アミノ酸置換の未完成リストである。以下の８グループはそれぞれ、互いに保存的置換となるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。
【００３８】
本発明の細胞及び方法は、概して供与体基質からシアル酸部分を受容体分子へ転移させることによってポリシアル化産物を作製するのに有用である。また、本発明の細胞及び方法は、概して供与体基質から別の単糖又は硫酸基を受容体分子へ転移させることによって別の糖残基を含むポリシアル化産物糖を作製するのにも有用である。一般に、付加は、オリゴ糖、多糖（例えば、ヘパリン、カラゲニンなど）又は糖脂質もしくは糖蛋白質（例えば、生体分子）の炭水化物部分の非還元末端で行われる。本明細書で定義した生体分子としては、炭水化物、オリゴ糖、ペプチド（例えば、糖ペプチド）、蛋白質（例えば、糖蛋白質）及び脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質及びガングリオシド）などの生物学的に重要な分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖状のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーのことを指し、特に限定しない限り、天然のヌクレオチドと同様にして核酸とハイブリッドを形成する天然ヌクレオチドの既知のアナログを包含する。特に示さない限り、特定の核酸配列としてはその相補性配列を含める。「核酸」、「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では同じ意味で用いている。
【００４０】
「動作可能なように連結された」という用語は、（プロモータ、シグナル配列、転写因子結合部位のアレイなどの）核酸発現制御配列と別の核酸配列との機能的な結合であって、発現制御配列はこの別の配列に相当する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を与えるものとする結合のことを指す。
【００４１】
細胞に関連して用いられる場合の「組換え」という用語は、この細胞が異種の核酸を複製し、又は異種の核酸によってコードされるペプチドもしくは蛋白質を発現することを意味する。組換え細胞は、天然（非組み換え）型の細胞内に存在しない遺伝子を含むことができる。また、組換え細胞は、天然型の細胞に存在する遺伝子を修飾して人工的な手段でこの細胞中に再導入したものを含むこともできる。また、この用語は、細胞にとって内因性の核酸であって、細胞から取り出すことなく修飾した核酸を含む細胞を包含し、そのような修飾としては、遺伝子置換、部位特異的突然変異及び関連の技術により得られるものが挙げられる。
【００４２】
「組換え核酸」とは、人工的に構築された（例えば、２種の天然又は合成核酸断片を結合させることにより形成された）核酸のことを指す。また、この用語は、人工的に構築された核酸の複製又は転写によって作製された核酸にも適用される。「組換えポリペプチド」は、組換え核酸（即ち、その細胞に由来しない、又は天然型から修飾されている核酸）が転写され、その後、生じた転写物が翻訳されることによって発現される。
【００４３】
本明細書に用いている「異種ポリヌクレオチド」又は「異種核酸」は、その特定の宿主細胞とは異なる供給源に由来するか、同じ供給源からであってもその元の形態から修飾されているものである。従って、原核宿主細胞中の異種ポリシアリルトランスフェラーゼ遺伝子としては、この特定の宿主細胞に対して内因性ではあるが、修飾されているポリシアリルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。この異種配列の修飾は、例えば、そのＤＮＡを制限酵素で処理することによりプロモータに動作可能なように連結することができるＤＮＡ断片を作製することによって行うことができる。部位特異的突然変異などの技術も異種配列の修飾に有用である。
【００４４】
「部分配列」とは、核酸又はアミノ酸（例えば、ポリペプチド）の長い配列の一部を含む、それぞれ核酸又はアミノ酸のより短い配列のことを指す。
【００４５】
「組換え発現カセット」又は単に「発現カセット」とは、宿主内の構造遺伝子の発現に影響を与えることができる核酸エレメントであって、宿主がそのような配列と共存できる核酸エレメントを有する組換え又は合成により作製した核酸構築体である。発現カセットには、少なくともプロモータ、任意選択的に転写終結シグナルを含ませる。通常、組換え発現カセットには、転写対象の核酸（例えば、目的とするポリペプチドをコードしている核酸）及びプロモータを含ませる。発現を行わせるのに必要又は有用な別の因子も、本明細書に記載したようにして用いてもよい。例えば、発現カセットには、宿主細胞からの発現蛋白質の分泌を誘導するシグナル配列をコードしているヌクレオチド配列を含ませることもできる。転写終結シグナル、エンハンサ及び遺伝子発現に影響を与える他の核酸配列も発現カセットに含ませることができる。
【００４６】
「単離された」という用語は、酵素の活性を妨げる成分を実質的又は本質的に含まない材料のことを指す。本発明の細胞、糖、核酸及びポリペプチドの場合、「単離された」という用語は、天然の状態で存在する材料に通常付随して存在する成分を実質的又は本質的に含まない材料のことを指す。一般的に、本発明の単離された糖、蛋白質又は核酸は、純度測定のための銀染色ゲルのバンド強度その他の方法で測定する純度が少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％又は８５％、通常少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。純度又は均一性は、蛋白質又は核酸サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続く染色による可視化などの当該分野で公知のいくつかの手段によって示すことができる。特定の目的のためには、高分解能が必要とされることになり、ＨＰＬＣ又は同様な精製手段が利用される。オリゴ糖又は他のガラクトシル化産物の場合、純度は、例えば、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又は質量分析を利用して測定することができる。
【００４７】
２本以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列との関連で「同一の」又は「同一性」百分率という用語は、下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つ又は目視検査によって測定して比較及び一致の最大化のために位置合わせをした場合に、２本以上の配列又は部分配列が同一である、又は同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定の割合で有することを指す。
【００４８】
２つの核酸又はポリペプチドとの関連で「実質的に同一の」という語句は、下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つ又は目視検査によって測定して比較及び一致の最大化のために位置合わせした場合に、２本以上の配列又は部分配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性が少なくとも６０％、好ましくは８０％又は８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であることを指す。この実質的な同一性は、好ましくは長さが少なくとも約５０残基の配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、配列同士が少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一であることが最も好ましい。最も好ましい実施態様では、これらの配列はコーディング領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００４９】
配列の比較においては、通常、１つの配列を試験配列と比較する対照配列として用いる。配列比較アルゴリズムを用いる際には、試験および対照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）を指定し、次に、配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを指定する。次いで、指定したプログラム・パラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムにより、対照配列に対する試験配列の配列同一性百分率が算出される。
【００５０】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：ｐ４８２（１９８１年）の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：ｐ４４３（１９７０年）のホモロジー・アラインメント・アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：ｐ２４４４（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、もしくは目視検査（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌほか編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）参照）によって行うことができる。
【００５１】
配列同一性百分率および配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：ｐ４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｅｌほか（１９７７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：ｐ３３８９−３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。このアルゴリズムは、先ず、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインメントさせた時にある正値の閾値スコアＴにマッチするかこれを満たす検索配列中の長さＷの短い文字列を特定することによって高相同性スコア配列対（ＨＳＰ：ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒ）を同定する。Ｔは、近傍文字列スコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、上記文献）と呼ばれる。これらの初期の近傍文字列ヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとなる。次いで、これらの文字列ヒットは、累積アラインメント・スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一対の一致残基のスコア値（ｒｅｗａｒｄ）；常に＞０）およびＮ（不一致残基のペナルティ値；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合、スコアリング・マトリクスを用いて累積スコアを算出する。文字列ヒットの各方向への延長は、以下の場合、即ち、上記累積アラインメント・スコアがその最大到達値から数量Ｘだけ減少した場合、この累積スコアが１つ以上のネガチブ・スコア（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントの蓄積によりゼロ以下になった場合、もしくはどちらの配列においても末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、位置合わせの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：ｐ１０９１５（１９８９年）参照）。
【００５２】
配列同一性百分率を算出する他に、ＢＬＡＳＴアルゴニズムは２本の配列間の類似性の統計的な解析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：ｐ５８７３−５７８７（１９９３年）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴニズムにより得られる類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標となる最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と対照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、この核酸は対照配列と類似しているとみなされる。
【００５３】
２本の核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記のように、第１の核酸によりコードされたポリペプチドが第２の核酸によりコードされたポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。従って、例えば、あるポリペプチドがもう１つのポリペプチドと、保存的置換によってのみ異なる場合、これらの２つのポリペプチドは、通常、実質的に同一である。さらに、２本の核酸配列が実質的に同一であることの指標は、下記のように、これらの２つの分子が緊縮条件下で互いにハイブリッドを形成することである。
【００５４】
「〜と特異的にハイブリッドを形成する」という語句は、複雑な混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡ又はＲＮＡに存在する場合の特定のヌクレオチド配列とのみ緊縮条件下で分子が結合、二重化又はハイブリッド形成することを指す。
【００５５】
「緊縮条件」という用語は、プローブがその標的部分配列とハイブリッドを形成するが、他の配列とはしない条件のことを指す。緊縮条件は配列依存性であり、異なる状況の下では異なることになる。長い配列同士ほど、高温で特異的にハイブリッドを形成する。一般に、緊縮条件は、特定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍは、標的配列に相補性のプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリッドを形成する（特定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下における）温度である。（標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％は平衡状態でふさがれる）。通常、緊縮条件は、塩濃度をｐＨ７．０乃至８．３で約１．０Ｍ Ｎａ＋イオン未満、通常約０．０１乃至１．０Ｍ Ｎａ＋イオンの濃度（又は他の塩）とし、温度を短いプローブ（例えば、１０乃至５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃とする条件である。また、緊縮条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもできる。高緊縮性ＰＣＲ増幅の場合、約６２℃の温度が通常であるが、高緊縮性アニーリング温度は、プライマーの長さ及び特異性に応じて約５０℃乃至約６５℃の範囲とすることができる。高及び低緊縮性増幅の代表的なサイクル条件には、９０乃至９５℃で３０乃至１２０秒間の変性相、３０乃至１２０秒間続くアニーリング相及び約７２℃で１乃至２分間の伸長相が含まれる。低及び高緊縮性増幅反応のプロトコル及び指針については、Ｉｎｎｉｓほか、（１９９０年）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．において入手可能である。
【００５６】
「〜に特異的に結合する」又は「〜に対し特異的な免疫反応性を示す」という語句は、抗体のことを指す場合、蛋白質、糖及び他の生体物質の不均一な集団の存在下に蛋白質又は他の抗原の存在を決定する結合反応のことを意味する。従って、所定のイムノアッセイ条件下において、特定の抗体は特定の抗原に選択的に結合するが、試料中に存在する他の分子とは有意な量で結合しない。そのような条件下で抗原に特異的に結合するには特定の抗原に対する特異性に関して選択された抗体が必要となる。各種イムノアッセイ方式を用いて特定抗原に対して特異的な免疫反応性を示す抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、抗原に対し特異的な免疫反応性を示すモノクロナール抗体を選択するのにルーチン的に用いられている。特異的な免疫反応性を測定するのに用いることができるイムノアッセイ方式および条件の解説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００５７】
「抗体」とは、抗原に特異的に結合し、認識する、免疫グロブリン遺伝子又はその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドのことを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。好ましい実施態様では、自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質に特異的に結合する抗体を作製する。軽鎖はカッパ鎖とラムダ鎖とに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンと分類され、これらはそれぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを構成している。通常、抗体の抗原結合領域は結合の特異性及び親和性に最も重要である。
【００５８】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は同一の２対のポリペプチド鎖で構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１本の「重」鎖（約５０乃至７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識に関与する約１００乃至１１０個以上のアミノ酸からなる可変領域を構成している。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、こうした軽鎖及び重鎖のことを指す。
【００５９】
抗体は、例えば、完全な状態の免疫グロブリンとして、又は各種ペプチダーゼによる消化で生じたいくつかの特性のよく分かった断片として存在する。すなわち、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合の下流で抗体を消化することにより、それ自体ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に接合される軽鎖であるＦａｂの二量体のＦ（ａｂ）’２を生じる。このＦ（ａｂ）’２を緩和な条件下で還元してヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによってＦ（ａｂ）’２二量体はＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は本質的にはヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版１９９３年参照）。各種抗体断片は完全な状態の抗体の消化によって決定されるが、そのような断片が化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成することができることは、当業者であれば理解するであろう。従って、本明細書に用いている抗体という用語には、抗体全体の修飾により作製した抗体断片、又は組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成したもの（例えば、一本鎖Ｆｖ）、又はファージ・ディスプレイ・リイブラリ（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙほか、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：ｐ５５２−５５４（１９９０年））を用いて同定されたものも含まれる。
【００６０】
抗体（例えば、組換え、モノクロナール又はポリクロナール抗体）の調製には、当該分野で周知の多くの技術を用いることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：ｐ４９５−４９７（１９７５年）、Ｋｏｚｂｏｒほか、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：ｐ７２（１９８３年）、Ｃｏｌｅほか、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐ７７−９６、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５年）、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）並びにＧｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版１９８６年）を参照）。対象とする抗体の重及び軽鎖をコードしている遺伝子は細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクロナール抗体をコードしている遺伝子はハイブリドーマからクローニングされ、組換えモノクロナール抗体を作製するのに用いることができる。モノクロナール抗体の重及び軽鎖をコードしている遺伝子ライブラリはハイブリドーマ又は形質細胞から作製することもできる。重及び軽鎖遺伝子産物を無作為に組み合わせることにより異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールが得られる（例えば、Ｋｕｂｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版１９９７年）参照）。一本鎖抗体又は組換え抗体の作製技術（米国特許第４，９４６，７７８号及び同４，８１６，５６７号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体の作製に適用することができる。また、遺伝子導入マウス又は他の哺乳動物などの他の生物を用いてヒト化又はヒト抗体を発現させることもできる（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同５，５４５，８０６号、同５，５６９，８２５号、同５，６２５，１２６号、同５，６３３，４２５号、同５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓほか、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：ｐ７７９−７８３（１９９２年）、Ｌｏｎｂｅｒｇほか、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：ｐ８５６−８５９（１９９４年）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：ｐ８１２−１３（１９９４年）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄほか、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：ｐ８４５−５１（１９９６年）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：ｐ８２６（１９９６年）、並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：ｐ６５−９３（１９９５年）参照）。あるいは、ファージ・ディスプレイ・リイブラリを用いて、特定の抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロメリックＦａｂ断片を特定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙほか、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：ｐ５５２−５５４（１９９０年）、Ｍａｒｋｓほか、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：ｐ７７９−７８３（１９９２年）参照）。また、抗体は、二重特異性、即ち、２種の抗原を認識することができるようにすることもできる（例えば、国際公開第ＷＯ ９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒほか、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：ｐ３６５５−３６５９（１９９１年）及びＳｕｒｅｓｈほか、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：ｐ２１０（１９８６年）参照）。また、抗体はヘテロコンジュゲート、例えば、２つの共有結合した抗体、又は免疫毒素とすることもできる（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、国際公開第ＷＯ９１／００３６０号、同第ＷＯ９２／２００３７３号及びＥＰ０３０８９参照）。
【００６１】
一実施態様において、この抗体は「エフェクタ」部分と結合させる。このエフェクタ部分は診断アッセイ用の放射性標識又は蛍光標識などの標識部分を含む任意の数の分子とすることができる。
【００６２】
抗体に「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「〜に対し特異的な（もしくは選択的な）免疫反応性を示す」という語句は、蛋白質又はペプチドのことを指す場合、しばしば蛋白質類及び他の生体物質類の不均一な集団において、その蛋白質の存在を決定する結合反応のことを意味する。従って、所定のイムノアッセイ条件下において、その特定の抗体は特定の蛋白質にバックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０乃至１００倍超、結合する。そのような条件下で抗体に特異的に結合するには特定の蛋白質に対する特異性に関して選択された抗体が必要となる。例えば、ＩｇＥ蛋白質に対するポリクロナール抗体、多型変異体、対立遺伝子、直系遺伝子及び保存的に修飾された変異体もしくはスプライス亜型又はこれらの部分は、ＩｇＥ蛋白質と特異的に免疫反応性を示し、他の蛋白質とは示さないポリクロナール抗体のみが得られるように選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を取り去ることにより達成することができる。特定の蛋白質と特異的に免疫反応性を示す抗体を選択するには各種のイムノアッセイ方式を用いることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、蛋白質と特異的に免疫反応性を示す抗体を選択するのにルーチン的に用いられている（例えば、特異的な免疫反応性を測定するのに用いることができるイムノアッセイ方式および条件の解説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）参照）。
【００６３】
「抗原」とは、抗体によって認識され、結合される分子、例えば、ペプチド、炭水化物、有機分子、又は糖脂質、糖蛋白質などのより複雑な分子である。抗体結合の標的である抗原の部分は抗原決定基であり、単一の抗原決定基に相当する小さな官能基はハプテンと呼ばれる。
【００６４】
「標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段によって検出可能な成分である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡによく用いられているようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン又は抗血清もしくはモノクロナール抗体が入手可能なハプテン及び蛋白質が挙げられる（例えば、配列番号２のポリペプチドは、例えばこのペプチドに放射性標識を組み込むことにより検出可能となり、このペプチドと特異的に反応する抗体を検出するのに用いることができる）。
【００６５】
「イムノアッセイ」という用語は、抗原に特異的に結合する抗体を用いるアッセイのことである。このイムノアッセイは、抗原を単離し、標的とし、及び／又は定量するために特定抗体の特異的結合性を利用すること特徴とする。
【００６６】
「担体分子」という用語は、Ｔ細胞によって認識される抗原決定基を含有する免疫原性分子のことを意味する。担体分子は蛋白質であってもよく、脂質であってもよい。担体蛋白質をポリペプチドに結合させることによってこのポリペプチドは免疫原性になる。担体蛋白質としては、キーホールリンペットヘモシアニン、カブトガニヘモシアニン及びウシ血清アルブミンが挙げられる。
【００６７】
「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫反応を非特異的に増強する物質である。アジュバントとしては、完全又は不完全フロイントのアジュバント、タイターマックスゴールドアジュバント、ミョウバン、及び細菌ＬＰＳが挙げられる。
【００６８】
「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」という用語は、本明細書では次の用語と同じ意味で用いている：〜と組み合わせる、〜に添加する、〜と混合する、〜上を通す、〜とインキュベートする、〜の上を流す、など。
【００６９】
ＩＩＩ． シアリルトランスフェラーゼ
ポリシアリルトランスフェラーゼはシアル酸残基を受容体基質に付加することができる酵素である。通常、ポリシアリルトランスフェラーゼは「プライミングされた基質」（即ち、その基質にシアル酸残基が結合した基質）にシアル酸残基を付加する。適切なシアル酸残基を付加してＰＳＴ活性のために受容体基質を「プライミングする」のには別のシアリルトランスフェラーゼを用いることができる。
【００７０】
Ａ． ＰＳＴポリペプチド
ＰＳＴ蛋白質はこれまでに同定されており、従って、当業者によって同定可能である。例えば、あるＰＳＴはｐｆａｍ０７３８８、α−２−８−ポリＳＴ、α−２，８−ポリシアリルトランスフェラーゼのコンセンサス配列とアラインメントさせることができる。例えば、Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｐＤ１９２−６（２００５年）を参照されたい。ｐｆａｍ０７３８８にアラインメントを示す他のＰＳＴ蛋白質も本発明に使用することができる。このα−２−８−ポリＳＴ、α−２，８−ポリシアリルトランスフェラーゼファミリーの蛋白質は、配列比較に基づいてそのように同定された一群の蛋白質である。例えば、Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ及びＶｉｍｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：ｐ１５３４９−１５３５９（２００３年）を参照されたい。他の実施態様では、短縮ＰＳＴ蛋白質は、ＣＡＺｙファミリーＧＴ３８のメンバーであるＰＳＴ蛋白質からの配列を含む。例えば、ＵＲＬ：ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／のＣｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．及びＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（１９９９年）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓサーバを参照されたい。ＰＳＴ蛋白質としては、α２，８−結合シアル酸残基のホモポリマー、α２，９−結合シアル酸残基のホモポリマー又はα２，８／α２，９−結合シアル酸残基のコポリマーを合成する蛋白質が挙げられる。
【００７１】
ＰＳＴ蛋白質は、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ又はＥ．ｃｏｌｉ細菌から単離することができる。これらのＰＳＴ蛋白質は、いずれも細菌系のメンバーのみを含む糖転移酵素ファミリーＧＴ−３８由来である。例えば、Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．ほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３２８：ｐ３０７−３１７（２００３年）を参照されたい。例示したＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ及びＥ．ｃｏｌｉの蛋白質はインビボで同一の構造体を作るが、これら２種の蛋白質は３３％の同一性を共有する。
【００７２】
Ｂ． シアリルトランスフェラーゼ
一部のシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、α−２，３シアリルトランスフェラーゼ活性及びα−２，８シアリルトランスフェラーゼ活性のうちの少なくとも１つを有する。その例は、例えば米国特許第６，５０３，７４４号及び米国特許第６，６９９，７０５号に開示されており、これらはあらゆる目的で本明細書に参考として援用されている。このようなシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、ＣＡＺｙファミリー４２のメンバーである。例えば、ＵＲＬ：ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／のＣｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．及びＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（１９９９年）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓサーバを参照されたい。これらの細菌性シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、２種のモチーフ：シアリルトランスフェラーゼモチーフＡ、ＤＶＦＲＣＮＱＦＹＦＥＤ／Ｅ及びこの配列の保存的修飾変異体並びにシアリルトランスフェラーゼモチーフＢ、ＲＩＴＳＧＶＹＭＣ及びこの配列の保存的修飾変異体を含む。一部の実施態様において、これらのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼモチーフＡ ＤＶＦＲＣＮＱＦＹＦＥＤ又はＤＶＦＲＣＮＱＦＹＦＥＥ及びシアリルトランスフェラーゼモチーフＢ ＲＩＴＳＧＶＹＭＣを含む。例えば、あらゆる目的で本明細書に参考として援用されているＰＣＴ／ＣＡ２００５／００１４３２を参照されたい。これらの保存されたシアリルトランスフェラーゼモチーフは多数の細菌性シアリルトランスフェラーゼの分析によって同定されたものである。１８種のシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列がアラインメントされ、これらの保存されたシアリルトランスフェラーゼ配列モチーフＡ及びＢが目視検査により同定された。
【００７３】
例示的なシアリルトランスフェラーゼはＣ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣｓｔＩＩ蛋白質である。ここのファミリーのメンバーのシアリルトランスフェラーゼ蛋白質又は核酸は、以下のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株から単離することができる：ＯＨ４３８４（ジェンバンクアセッション番号ＡＲ２７１７００）、ＯＨ４３８２（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＲ２７１７０１、Ｏ：２３（ジェンバンクアセッション番号ＡＦ４０１５２９）、Ｏ：４１（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＲ２７１７０２）及びＨＢ９３−１３（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＹ２９７０４７）。例えば、米国特許第６，５０３，７４４号及び米国特許第６６９９７０５号も参照されたい。これらの特許はあらゆる目的で本明細書に参考として援用されている。
【００７４】
一部の実施態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは酵素活性に重要と思われる他のアミノ酸残基も含む。例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４由来のＣｓｔ−ＩＩの構造が解析された。（例えば、Ｃｈｉｕほか、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：ｐ１６３−１７０（２００４年）参照）。このＣｓｔ−ＩＩ酵素の突然変異解析によって、例えば、シアリルトランスフェラーゼモチーフＢのアルギニン残基は活性に必要であることが明らかとなった。ＯＨ４３８４蛋白質については残基番号が示されており、他のＣｓｔ−ＩＩ蛋白質の対応する残基は配列アラインメントによって決定することができる。例えば、あらゆる目的で本明細書に参考として援用されているＰＣＴ／ＣＡ２００５／００１４３２を参照されたい。シアリルトランスフェラーゼモチーフＢのアルギニン残基はＣｓｔ−ＩＩのＲ１２９といい、図１のシアリルトランスフェラーゼコンセンサス配列のＲ１６５と関連がある。触媒活性に重要と思われる他のアミノ酸残基としては、Ｃｓｔ−ＩＩ Ｙ１５６、Ｃｓｔ−ＩＩ Ｙ１６２及びＣｓｔ−ＩＩ Ｈ１８８が挙げられる。蛋白質活性に影響する他のアミノ酸についてはＰＣＴ／ＣＡ２００５／００１４３２で検討されている。
【００７５】
ＩＶ． ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸の単離
ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸としては、上記の完全長天然ＰＳＴポリペプチド及びこうした配列の酵素的に活性な短縮配列をコードしている核酸が挙げられる。本発明のＰＳＴポリペプチドは供与体基質からのシアル酸の受容体基質への転移を触媒し、その活性を測定するアッセイが本明細書に開示されている。
【００７６】
本明細書に開示した情報に基づく別のＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸類、及びこのような核酸類を得る方法については当業者には周知である。好適な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくは部分配列（プローブ））は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、転写増幅システム（ＴＡＳ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、自立的配列複製システム（ＳＳＲ：ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）などのインビトロでの方法によってクローニング又は増幅させることができる。多種多様なクローニング及びインビトロ増幅方法が当業者には公知である。多くのクローニング実習を通して当業者を指導するのに十分なこうした技術及び手引き書の例は、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ （Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、（Ｓａｍｂｒｏｏｋほか）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌほか編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（１９９４年補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎほか、米国特許第５，０１７，４７８号；並びにＣａｒｒ、ヨーロッパ特許第０，２４６，８６４号にみられる。
【００７７】
標準的な分子生物学の手法（例えば、ＰＣＲ）を用いて任意の既知ＰＳＴ配列の短縮配列を作製することができる。
【００７８】
ＰＳＴポリペプチド又はその部分配列もしくは短縮配列をコードしているＤＮＡは、上述の任意の適切な方法（これには、例えば、適切な配列のクローニング及び制限酵素による制限が含まれる）によって調製することができる。一実施態様において、ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸をルーチン的なクローニング方法により単離する。ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１のＰＳＴをコードしている核酸配列である。核酸配列を用いることによって、（例えば、サザンブロット又はノーザンブロットにおいて）ゲノムＤＮＡサンプル中のＰＳＴポリペプチドをコードしている遺伝子と、又は全ＲＮＡサンプル中のＰＳＴポリペプチドをコードしているｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成するプローブを得ることができる。ＰＳＴポリペプチドをコードしている目的の核酸を一旦特定すれば、これを当業者に周知の標準的な方法に従って単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；又はＡｕｓｕｂｅｌほか、（１９８７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。更に、単離した核酸は制限酵素で切断することによって完全長のＰＳＴポリペプチド又はその部分配列もしくは短縮配列（例えば、ＰＳＴポリペプチドの触媒ドメインの少なくとも部分配列をコードしている部分配列を含む短縮配列）を作製することができる。次いで、ＰＳＴポリペプチド又はその部分配列をコードしているこうした制限酵素諸断片は結合させることができる。
【００７９】
ＰＳＴポリペプチド又はその部分配列をコードしている核酸は、その発現産物をアッセイすることにより特性化することができる。その発現蛋白質の物理的、化学的又は免疫学的性質の検出に基づいたアッセイを用いることができる。例えば、この核酸によりコードされている蛋白質の、供与体基質のシアル酸の適切な受容体基質への転移を触媒する能力によって、クローン化ＰＳＴポリペプチドを同定することができる。一方法では、キャピラリー電気泳動を用いることにより反応生成物を検出する。この高感度のアッセイは、Ｗａｋａｒｃｈｕｋほか、（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：ｐ２８２７１−２７６に記載されているような、フルオレセインで標識した単糖又は二糖アミノフェニル誘導体を使用するものである。ポリシアリルトランスフェラーゼ活性をアッセイするために、基質としてはＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥ、Ｇａｌ−β−ｌ，３−ＧａｌＮＡｃ−α−ＦＣＨＡＳＥ（Ｔ−Ａｇ−ＦＣＨＡＳＥ）又はＮｅｕＡｃ−α−２，３−Ｇａｌ−β−ｌ，３−ＧａｌＮＡｃ−α−ＦＣＨＡＳＥを用いることができる。例えば、米国特許第６，５０３，７４４号を参照されたい。この特許は本明細書に参考として援用されている。一部の実施態様では、別のシアリルトランスフェラーゼを用いてこの反応をプライミングすることができる。オリゴ糖反応生成物の他の検出方法としては、薄層クロマトグラフィー及びＧＣ／ＭＳが挙げられ、本明細書に参考として援用されている米国特許第６，５０３，７４４号に開示されている。
【００８０】
また、ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸又はその部分配列は化学的に合成することができる。好適な方法としては、Ｎａｒａｎｇほか、（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：ｐ９０−９９の燐酸トリエステル法、Ｂｒｏｗｎほか、（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：ｐ１０９−１５１の燐酸ジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅほか、（１９８１年）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：ｐ１８５９−１８６２のジエチルホスホルアミダイト法、及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体担体法が挙げられる。化学合成では一本鎖オリゴヌクレオチドが作製される。これを、相補配列とのハイブリッド形成又はこの一本鎖を鋳型とするＤＮＡポリメラーゼによる重合によって二本鎖ＤＮＡに変換することができる。ＤＮＡの化学合成では約１００塩基の配列に限定されることが多いが、短い配列同士を結合させることによってさらに長い配列を得ることができることは、当業者によって認められよう。
【００８１】
ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸又はその部分配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を用いてクローニングすることができる。すなわち、例えば、１つの制限酵素部位（例えば、ＮｄｅＩ）を含むセンスプライマー及び別の制限酵素部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）を含むアンチセンスプライマーを用いて核酸又は部分配列をＰＣＲ増幅する。これにより目的のＰＳＴポリペプチド又は部分配列をコードし、末端に制限酵素部位を有する核酸が得られる。次いで、この核酸を適切な対応制限酵素部位を有する発現ベクターに容易に結合させることができる。好適なＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ又は他の供給源に備えられている配列情報を利用して当業者が決定することができる。ＰＳＴポリペプチド又はその蛋白質部分配列をコードしている核酸には部位特異的突然変異により適切な制限酵素部位を付加することもできる。ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸配列又は部分配列を含有するプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断した後、適切なベクターに結合させて標準的な方法に従って増幅及び／又は発現させる。インビトロ増幅法を通して当業者を指導するのに十分な技術の例は、
【００８２】
【数１】
にみられる。
【００８３】
ＰＳＴ蛋白質は、適切なＤＮＡ配列、例えば細菌染色体からのＤＮＡ配列を増幅させることによって単離することができる。ＰＳＴ蛋白質をコードしている核酸を増幅するのに用いることができるＰＣＲプライマーの例としては、次のプライマー対、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＳＴを増幅するためのプライマー：
５’−ＡＡＧＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧ及び３’−ＣＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＡＴＣＧＴＧＣ
が挙げられる。
【００８４】
特定の核酸から発現させた組換えＰＳＴポリペプチドの他の物理的性質を既知のＰＳＴポリペプチドの性質と比較することによって、受容体基質特異性及び／又は触媒活性を決定するＰＳＴポリペプチドの好適な配列又はドメインを特定する別の方法を得ることができる。あるいは、想定上のＰＳＴポリペプチドを変化させ、そのＰＳＴとしての役割又は特定配列又はドメインの役割を、変化させていない天然型又は対照ＰＳＴポリペプチドにより通常作られる炭水化物の構造の変動を検出することにより立証することができる。本発明のＰＳＴポリペプチドの突然変異又は修飾は、二機能性シアリルトランスフェラーゼポリペプチド又はＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸を操作する分子生物学の技術（例えば、ＰＣＲ）によって容易にすることができることは、当業者によって認められよう。
【００８５】
Ｖ． 宿主細胞におけるＰＳＴポリペプチドの発現
本発明のＰＳＴ蛋白質は、Ｅ．ｃｏｌｉその他の細菌宿主及び酵母を含む種々の宿主細胞において発現させることができる。宿主細胞は、好ましくは、例えば酵母細胞、細菌細胞、糸状菌細胞などの微生物である。好適な宿主細胞としては、多くの中でも、例えば、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．が挙げられる。こうした細胞は、以下のものを含むいくつかの属のいずれかのものとすることができる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ（例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ及びＣ．ｈｕｍｉｃｏｌａ）、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ及びＰ．ｏｈｍｅｒｉ）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ（例えば、Ｔ．Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｔ．ｘｙｌｉｎｕｓ、Ｔ．ｆａｍａｔａ及びＴ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｄ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ、Ｄ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ及びＤ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ及びＺ．ｂａｉｌｉｉ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（例えば、Ｈ．ａｎｏｍａｌａ ａｎｄ Ｈ．ｊａｄｉｎｉｉ）、並びにＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｂ．ｌａｍｂｉｃｕｓ及びＢ．ａｎｏｍａｌｕｓ）。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
ＰＳＴポリペプチドを宿主細胞において一旦発現させると、これを用いてポリシアル化産物を作製することができる。例えば、ＰＳＴポリペプチドを標準的な蛋白質精製技術を用いて単離し、本明細書に記載したインビトロ反応に使用することによってポリシアル化産物を作製することができる。また、インビトロ反応に部分精製したＰＳＴポリペプチドを用いることによって、透過性宿主細胞が可能なように、ポリシアル化産物を作製することもできる。また、こうした宿主細胞をインビボ系（例えば、発酵生産）に用いることによりポリシアル化産物を作製することもできる。
【００８７】
通常、ＰＳＴポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞において機能するプロモータの制御下におく。極めて広い種類のプロモータが公知であり、具体的な用途に応じて本発明の発現ベクターに用いることができる。通常、選択されるプロモータはこのプロモータが活性を示すことになる細胞によって決まる。リボソーム結合部位、転写終結部位などの他の発現制御配列も任意選択的に含める。こうした制御配列を１種以上含む構築体は「発現カセット」と名付けられている。従って、本発明は、所望の宿主細胞において高レベルの発現を得るために融合蛋白質をコードしている核酸が組み込まれている発現カセットを提供する。
【００８８】
特定の宿主細胞において使用するのに好適な発現制御配列は、この細胞で発現される遺伝子をクローニングすることによって得られることが多い。リボソーム結合部位配列の他に、転写開始用プロモータを、任意選択的にオペレータと共に含むよう本明細書で定義しているよく用いられている原核細胞制御配列としては、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモータ系（Ｃｈａｎｇｅほか、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７年）１９８：ｐ１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系（Ｇｏｅｄｄｅｌほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０年）８：ｐ４０５７）、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３年）８０：ｐ２１−２５）並びにラムダ由来ＰＬプロモータ及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅほか、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１年）２９２：ｐ１２８）などの一般的なプロモータが挙げられる。特定のプロモータ系が本発明に不可欠であるのではなく、原核生物で機能する入手可能な任意のプロモータを用いることができる。
【００８９】
Ｅ．ｃｏｌｉ以外の原核生物においてＰＳＴ蛋白質を発現させるには、具体的な原核生物種において機能するプロモータが必要とされる。そのようなプロモータはその種からクローニングした遺伝子から得ることができ、又は異種プロモータを用いることができる。例えば、ｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータはＥ．ｃｏｌｉの他にＢａｃｉｌｌｕｓにおいて機能する。
【００９０】
本発明の発現カセットにはリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含ませるのが好都合である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＢＳは開始コドンの上流３乃至１１ヌクレオチドに位置する３乃至９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる（Ｓｈｉｎｅ及びＤａｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５年）２５４：ｐ３４；Ｓｔｅｉｔｚ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）、第 １巻、ｐ３４９、１９７９年、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＮＹ）。
【００９１】
酵母においてＰＳＴ蛋白質を発現させるための好都合なプロモータとしては、ＧＡＬ１−１０（Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＤａｖｉｅｓ（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：ｐ１４４０−１４４８）、ＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌほか、（１９８３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：ｐ２６７４−２６８２）、ＰＨＯ５（ＥＭＢＯＪ．（１９８２年）６：ｐ６７５−６８０）並びにＭＦα（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ及びＯｓｈｉｍａ（１９８２年）Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、Ｊｏｎｅｓ及びＢｒｏａｃｈ編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ｐ１８１−２０９）が挙げられる。酵母用の別の好適なプロモータはＣｏｕｓｅｎｓほか、Ｇｅｎｅ６１：ｐ２６５−２７５（１９８７年）に記載されているＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモータである。例えば真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の株（ＭｃＫｎｉｇｈｔほか、米国特許第４，９３５，３４９号）などの糸状菌の場合、有用なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、ＥＭＢＯ Ｊ．４：ｐ２０９３ ２０９９（１９８５年））、ｔｐｉＡプロモータなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓの解糖系遺伝子由来のものが挙げられる。好適なターミネータの例はＡＤＨ３ターミネータ（ＭｃＫｎｉｇｈｔほか）である。
【００９２】
本発明では構成的又は調節性プロモータを用いることができる。調節性プロモータは、宿主細胞を高密度に増殖させた後に融合蛋白質の発現を誘導することができるので、有利となり得る。異種蛋白質を高レベルで発現させると、状況によっては細胞増殖が遅くなる。誘導プロモータは、発現のレベルが、例えば温度、ｐＨ、嫌気的もしくは好気的条件、光、転写因子、化学物質などの環境的又は発生的要因によって変更可能である場合に遺伝子の発現を誘導するプロモータである。そのようなプロモータを本明細書では「誘導プロモータ」と称し、これによって糖転移酵素又はヌクレオチド糖合成に関与する酵素の発現のタイミングを制御することが可能となる。Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の細菌宿主細胞の誘導プロモータは当業者に周知である。これらのものとしては、例えば、ｌａｃプロモータ、バクテリオファージラムダＰＬプロモータ、ｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ（Ａｍａｎｎほか、（１９８３年）Ｇｅｎｅ ２５：ｐ１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒほか、（１９８３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：ｐ２１）、及びバクテリオファージＴ７プロモータ（Ｓｔｕｄｉｅｒほか、（１９８６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、Ｔａｂｏｒほか、（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：ｐ１０７４−８）が挙げられる。これらのプロモータ及びその使用についてはＳａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献に記載されている。原核生物における発現用の特に好ましい誘導プロモータは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードしている遺伝子又は遺伝子群から得られるプロモータ成分（例えば、ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）からのプロモータ）に連結させたｔａｃプロモータ成分を含む二重プロモータである。この二重ｔａｃ−ｇａｌプロモータについてはＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に開示されている。
【００９３】
適切な宿主細胞に入れた場合にポリヌクレオチドの発現を駆動する遺伝子発現制御シグナルに動作可能なように連結させた対象ポリヌクレオチドを含む構築体は「発現カセット」と名付けられている。本発明の融合蛋白質をコードする発現カセットは、多くの場合、宿主細胞に導入するための発現ベクター中に配置する。通常、こうしたベクターは、発現カセットの他に、このベクターが１種以上の特定の宿主細胞中で独立に複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製することを可能にするものであり、複製起点又は自己複製配列を含む。このような配列は種々の細菌に関して公知である。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は多くのグラム陰性細菌に適している。あるいは、このベクターは、宿主細胞ゲノム相補体に組み込まれ、細胞がＤＮＡ複製を行う時に複製されることにより複製することができる。細菌細胞における上記酵素の発現用の好ましい発現ベクターはｐＴＧＫであり、これは二重ｔａｃ−ｇａｌプロモータを含んでおり、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に開示されている。
【００９４】
ポリヌクレオチド構築物の構築では、一般に細菌において複製することができるベクターを用いることが必要である。細菌からのプラスミドの精製用に多くのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製ＥａｓｙＰｒｅｐＪ及びＦｌｅｘｉＰｒｅｐＪ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＪ、及びＱｉａｇｅｎ社製ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ参照）。次に、単離されて精製されたプラスミドをさらに操作して別のプラスミドを作製し、細胞に形質移入するのに用いることができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓにおけるクローニングも可能である。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるのに用いる発現ベクターには、多くの場合、選択マーカを組み込む。こうした遺伝子は、選択培地で増殖させる形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要な蛋白質などの遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子を含むベクターで形質転換しなかった宿主細胞はこの培地では生残しないことになる。代表的な選択遺伝子は、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンなどの抗生物質その他のトキシンに対する耐性を付与する蛋白質をコードする。あるいは、選択マーカは、栄養素要求性欠損を補完し、又は天然培地からは利用可能でない重要な栄養素を供給する蛋白質をコードすることができる（例えば、Ｂａｃｉｌｌｉのｄ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子）。多くの場合、このベクターは、例えばＥ．ｃｏｌｉ、又はこのベクターが宿主細胞に導入される前に複製される他の細胞において機能する１つの選択マーカを有することになる。いくつかの選択マーカが当業者に周知されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献に記載されている。
【００９６】
上記に列記した成分を１種以上含む好適なベクターの構築には上記で引用した文献に記載されているような標準的な連結技術を使用する。単離したプラスミド又はＤＮＡ断片を切断し、調整して所望の形態に再連結して必要なプラスミドを作製する。構築したプラスミドにおける配列の正確さを確認するために、制限エンドヌクレアーゼ消化及び／又は既知の方法による配列決定などの標準的な技術によってこうしたプラスミドを分析することができる。このような目的を達成するための分子クローニング技術は当該分野では周知である。組換え核酸の構築に適した多種多様なクローニング及びインビトロ増幅方法が当業者には公知である。多くのクローニング訓練を通して当業者を指導するのに十分なこうした技術及び手引き書の例は、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）並びにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌほか編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（１９９８年補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）にみられる。
【００９７】
本発明の発現ベクターを構築するための出発原料として使用するのに好適な種々の一般的ベクターが当該分野で公知である。細菌におけるクローニングの場合、一般的ベクターとしては、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）などのｐＢＲ３２２由来ベクター及びλファージ由来ベクターが挙げられる。酵母では、ベクターとしては酵母組み込みプラスミド（例えば、ＹＩｐ５）及び酵母複製プラスミド（ＹＲｐシリーズプラスミド）及びｐＧＰＤ−２が挙げられる。哺乳動物細胞における発現は、ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩ及びｐ９１０２３並びに溶解性ウィルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス及びバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えば、ウシパピローマウィルス）及びレトロウイルスベクター（例えば、マウスレトロウイルス）を含む種々の一般に入手可能なプラスミドを用いて達成することができる。
【００９８】
特定の宿主細胞にこれらの発現ベクターを導入する方法は特に重要なものではなく、そのような方法は当業者には周知である。例えば、これらの発現ベクターは、塩化カルシウム形質転換法によりＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞に、リン酸カルシウム処理又は電気穿孔法により真核細胞に導入することができる。他の形質転換法も適用できる。
【００９９】
発現を増強させるために翻訳共役を利用してもよい。この方法は、プロモータの下流に配置されている、翻訳系に固有の高度に発現される遺伝子に由来する上流の短い読み取り枠並びにリボソーム結合部位及びこれの数アミノ酸コドン後に続く終結コドンを利用するものである。この終結コドンの直前に第２のリボソーム結合部位があり、終結コドンの次に翻訳開始のための開始コドンがくる。この系はＲＮＡの２次構造を融解させ、その結果、翻訳の効率的な開始が可能となる。Ｓｑｕｉｒｅｓほか、（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：ｐ１６２９７−１６３０２を参照されたい。
【０１００】
ＰＳＴポリペプチドは細胞内に発現させることができ、又は細胞から分泌させることができる。細胞内発現は高収量をもたらすことが多い。必要に応じて、再生処置を行うことにより可溶性の活性融合蛋白質を増加させることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献、Ｍａｒｓｔｏｎほか、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４年）２：ｐ８００、Ｓｃｈｏｎｅｒほか、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５年）３：ｐ１５１参照）。ＰＳＴポリペプチドをペリプラズム又は細胞外培地に細胞から分泌させる実施態様では、そのＤＮＡ配列には切断可能なシグナルペプチド配列が連結させる。シグナル配列は細胞膜を通る融合蛋白質の移行を誘導する。プロモータ−シグナル配列単位を含むＥ．ｃｏｌｉ用の好適なベクターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡプロモータ及びシグナル配列を有するｐＴＡ１５２９である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献、Ｏｋａほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５年）８２：ｐ７２１２、Ｔａｌｍａｄｇｅほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０年）７７：ｐ３９８８、Ｔａｋａｈａｒａほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５年）２６０：ｐ２６７０参照）。別の実施態様では、例えば精製、分泌又は安定性を促進するために、ＰＳＴ蛋白質をプロテインＡ又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の部分配列に融合させる。
【０１０１】
本発明のＰＳＴポリペプチドは、さらに他の細菌蛋白質に連結させることもできる。多くの場合、この方法では、正常な原核生物制御配列が転写及び翻訳を誘導するので、高収量がもたらされる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、異種蛋白質を発現させるのにｌａｃＺ融合体を用いることが多い。ｐＵＲ、ｐＥＸ及びｐＭＲ１００シリーズ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献参照）などの好適なベクターは容易に入手できる。特定の用途のために、精製後の融合蛋白質から非ポリシアリルトランスフェラーゼ及び／又はアクセサリー酵素アミノ酸を切断することが望ましい場合がある。これは、臭化シアン、プロテアーゼ又は第Ｘａ因子による切断を含む当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって達成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献、Ｉｔａｋｕｒａほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７年）１９８：ｐ１０５６、Ｇｏｅｄｄｅｌほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９年）７６：ｐ１０６、Ｎａｇａｉほか、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４年）３０９：ｐ８１０及びＳｕｎｇほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６年）８３：ｐ５６１）。切断部位は、融合蛋白質の遺伝子中に所望の切断点で作ることができる。
【０１０２】
単一発現ベクターに複数の転写カセットを配置することにより、又はクローニング方法に用いる発現ベクターの各々に対して種々の選択マーカを利用することにより単一宿主細胞に２種以上の組換え蛋白質を発現させることができる。例えば、シアリルトランスフェラーゼ（例えば、ＣＳＴ−ＩＩ蛋白質）及びＰＳＴポリペプチドを同じ宿主発現系において発現させることができる。次いで、このような宿主細胞の溶解産物又は精製シアリルトランスフェラーゼ及びＰＳＴポリペプチドを用いてシアル酸残基を転移させることができる。
【０１０３】
ＶＩ． ＰＳＴポリペプチドの精製
本発明の方法では、本発明のＰＳＴ蛋白質は、例えば細胞内蛋白質として又は細胞から分泌される蛋白質として、発現させることができ、この形態で用いることができる。例えば、本発明の方法では、発現された細胞内又は分泌ＰＳＴポリペプチドを含む細胞粗抽出液を用いることができる。
【０１０４】
あるいは、ＰＳＴポリペプチドは、硫安塩析、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該分野の標準的な方法に従って精製することができる（全般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２年）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０年）参照）。少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０％の均一性の実質的に純粋な組成が好ましく、９２、９５、９８乃至９９％以上の均一性が最も好ましい。こうした精製蛋白質は、例えば、抗体を産生させるための免疫原としても用いることができる。
【０１０５】
本発明のＰＳＴポリペプチドの精製を容易にするために、こうした蛋白質をコードする核酸に、親和性結合試薬が入手可能であるエピトープ又は「タグ」（即ち、精製タグ）のコーディング配列を含めることもできる。好適なエピトープの例としてはｍｙｃ及びＶ−５レポータ遺伝子が挙げられ、これらのエピトープを有する融合蛋白質の組換え生産に有用な発現ベクターが市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ及びｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓは哺乳動物細胞における発現用に適している）。本発明のＰＳＴポリペプチドにタグを結合させるのに適した別の発現ベクター及び対応する検出系が当業者に周知であり、いくつかは市販されている（例えば、ＦＬＡＧ”（Ｋｏｄａｋ社、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ））。好適なタグの別の例は、金属キレート親和性リガンドに結合することができるポリヒスチジン配列である。通常、６個の隣接ヒスチジンが使用されるが、６個より多いものや少ないものも使用することができる。ポリヒスチジンタグの結合部分の役目をすることができる好適な金属キレート親和性リガンドとしては、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．（１９９０年）“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ”、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｑｉａｇｅｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）から市販）が挙げられる。他の精製又はエピトープタグとしては、例えば、ＡＵｌ、ＡＵ５、ＤＤＤＤＫ（ＥＣ５）、Ｅ ｔａｇ、Ｅ２ ｔａｇ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、６残基ペプチド、ポリオーマミドルＴ蛋白質由来ＥＹＭＰＭＥ、ＨＡ、ＨＳＶ、ＩＲＳ、ＫＴ３、Ｓ ｔａｇｅ、Ｓ１ ｔａｇ、Ｔ７ ｔａｇ、Ｖ５ ｔａｇ、ＶＳＶ−Ｇ、βガラクトシダーゼ、Ｇａｌ４、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ、プロテインＣ、プロテインＡ、セルロース結合蛋白質、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ステップタグ、Ｎｕｓ−Ｓ，ＰＰＩアーゼ、Ｐｆｇ２７、カルモデュリン結合蛋白質、ｄｓｂ Ａ及びその断片並びにグランザイムＢが挙げられる。エピトープペプチド及びエピトープ配列に特異的に結合する抗体は、例えば、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ａｂｃａｍ Ｌｔｄ．及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。
【０１０６】
精製タグとして、マルトース結合ドメイン及び澱粉結合ドメインも挙げられる。精製タグを含む蛋白質は、精製タグを結合する結合パートナー（例えば精製タグに対する抗体、ニッケルもしくはコバルトイオン又は樹脂及びアミロース、マルトース又はシクロデキストリン）を用いて精製することができる。また、精製タグとして、澱粉結合ドメイン、Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンドメイン（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．及びＡｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から市販されているベクター及び抗体）、並びにＳＵＭＯ蛋白質のカルボキシ末端半分（Ｌｉｆｅ Ｓｅｎｓｏｒｓ Ｉｎｃ．から市販されているベクター及び抗体）も挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来マルトース結合ドメイン、Ａ．ｎｉｇｅｒのアミラーゼ由来ＳＢＤ（澱粉結合ドメイン：ｓｔａｒｃｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）などの澱粉結合ドメインについては、本明細書に参考として援用されている国際公開第ＷＯ９９／１５６３６号に開示されている。ベータシクロデキストリン（ＢＣＤ）誘導体化樹脂を用いた澱粉結合ドメインを含む融合蛋白質の親和性精製については、国際公開第２００５／０１４７７９号に開示されており、その全体が本明細書に参考として援用されている。一部の実施態様において、ＰＳＴポリペプチドは２種以上の精製又はエピトープタグを含む。
【０１０７】
タグとして使用するのに適した他のハプテンについては当業者には周知であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）に記載されている。例えば、ジニトロフェノール（ＤＮＰ：ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン、バルビツール酸塩（例えば、米国特許第５，４１４，０８５号参照）及び数種のフルオロフォアがこれらの化合物の誘導体と同様にハプテンとして有用である。ハプテンその他の部分を蛋白質その他の分子に連結するためのキットが市販されている。例えば、ハプテンがチオールを含む場合、ＳＭＣＣのようなヘテロ二官能性リンカーを用いて捕捉試薬に存在するリジン残基にタグを結合させることができる。
【０１０８】
ＰＳＴポリペプチドの触媒又は機能ドメインをその生物活性を減じることなく修飾することができることは、当業者によって認められるであろう。触媒ドメインのクローニング、発現又は溶融蛋白質中への組込みを容易にするために部分的に修飾することができる。このような修飾は当業者には公知であり、例えば、触媒ドメインをコードしているポリヌクレオチドのいずれか一方の末端にコドンを付加して、例えば、アミノ末端にメチオニンを付加して開始部位を形成し、又はいずれか一方の末端に追加的なアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を配置して好都合な位置にある制限酵素部位もしくは終止コドンもしくは精製配列を作ることが挙げられる。
【０１０９】
ＶＩＩ． 供与体基質及び受容体基質
本発明の方法においてＰＳＴポリペプチド及び他の糖転移酵素により利用される好適な供与体基質としては、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ並びにＣＭＰ−シアル酸及び他の活性化シアル酸部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｇｕｏほか、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．６８：ｐ１−２０（１９９７年）。
【０１１０】
通常、ＰＳＴ酵素の受容体基質は、α−２，８結合で第２のシアル酸を付加するためのα−２，３結合の末端シアル酸、又はα−２，８結合で１個以上のシアル酸部分を付加するためのα−２，８結合の末端シアル酸を含む。
【０１１１】
第１のシアル酸付加のための受容体基質としては、例えば、α−２，３結合でシアル酸部分を付加するための末端ガラクトースが挙げられる。通常、ＰＳＴ酵素の受容体基質は、α−２，８結合で第２のシアル酸を付加するためのα−２，３結合の末端シアル酸、又はα−２，８結合で１個以上のシアル酸部分を付加するためのα−２，８結合の末端シアル酸を含む。好適な受容体の例としては、β１，４結合によりＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃに結合した末端Ｇａｌ及びＧｌｃＮＡｃもしくはＧａｌＮＡｃにβ１，３結合した末端Ｇａｌが挙げられる。好適な受容体としては、例えば、Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβｌ，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβｌ，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体及び当業者に周知の他の受容体が挙げられる。ガラクトース部分が結合する末端残基はこれ自体、例えば、Ｈ、単糖、オリゴ糖又は少なくとも１つの炭水化物原子を有するアグリコンに結合することができる。一部の実施態様において、受容体残基は、例えば、ペプチド、蛋白質、脂質又はプロテオグリカンに結合しているオリゴ糖の一部分である。
【０１１２】
ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド及び本発明の方法によって利用される好適な受容体基質としては、多糖及びオリゴ糖が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載したポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを多酵素系に用いることによって好都合な出発原料から所望の産物を生成させることができる。
【０１１３】
ＰＳＴポリペプチド及び本発明の方法によって利用される好適な受容体基質として、蛋白質、脂質、ガングリオシド、及び本発明の方法により修飾することができる他の生物学的構造（例えば、細胞全体）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。通常、こうした受容体基質は上記の多糖又はオリゴ糖分子を含むことになる。
【０１１４】
本発明は、オリゴ糖、所望のオリゴ糖部分を有する糖蛋白質及び糖脂質の生成能から選択されるＰＳＴポリペプチドを提供する。同様に、所望の活性化糖基質又は産物オリゴ糖に存在する糖に基づいて、アクセサリー酵素（存在する場合）（例えば、基質に適切なシアル酸を付加することにより反応をプライミングすることができるシアリルトランスフェラーゼ）を選択する。
【０１１５】
糖蛋白質の合成の場合、種々の量の対象ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド（例えば、０．０１乃至１００ｍＵ／ｍｇ蛋白質）を、この対象ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質によるグリコシル化のための受容体となる可能性のある部位を有するオリゴ糖が連結している糖蛋白質（例えば、１乃至１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させることによって好適なポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを容易に特定することができる。本発明の組換えポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質の所望受容体部位における糖類残基の付加能に関して、所望の性質（例えば、受容体基質特異性又は触媒活性）を有する既知のポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドと比較する。
【０１１６】
一般に、ポリシアル化オリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質の酵素合成の有効性は、本発明の組換え生成短縮型ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを用いることによって高めることができる。組換え技術を用いることにより、大規模なインビトロでのオリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質の修飾に必要な短縮型でより可溶性のポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを大量に作製することが可能となる。
【０１１７】
一部の実施態様において、本発明のポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド及び方法により利用されるのに好適なオリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質は、グリコシル化反応時に固体担体に固定化した糖蛋白質及び糖脂質とすることができる。「固体担体」という用語は、半固体担体をも包含する。一部の実施態様では、標的糖蛋白質又は糖脂質は、グリコシル化反応が完了した後に糖蛋白質又は糖脂質をそれぞれ放出させることができるように可逆性に固定化する。多くの好適なマトリックスが当業者に周知である。例えば、イオン交換を利用して、グリコシル化反応が進行している間、適切な樹脂上に糖蛋白質又は糖脂質を一時的に固定化することができる。対象の糖蛋白質又は糖脂質に特異的に結合するリガンドを親和性に基づく固定化のために用いることもできる。例えば、糖蛋白質に特異的に結合する抗体が好適である。また、対象の糖蛋白質がそれ自体抗体であるかその断片を含む場合には、プロテインＡ又はＧを親和性樹脂として用いることができる。対象糖蛋白質又は糖脂質に特異的に結合する色素及び他の分子も好適である。
【０１１８】
受容体糖が完全長の糖蛋白質の短縮型である場合、一部の実施態様では、これはその完全長の糖蛋白質の生物活性部分配列を含む。生物活性部分配列の例としては、酵素活性部位、リセプター結合部位、リガンド結合部位、抗体の相補性決定領域及び抗原の抗原性領域が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
ＶＩＩＩ． ポリシアル化産物の作製
ＰＳＴポリペプチドを用いて、インビトロ反応混液中に、又はインビボ反応によって、例えば、ＰＳＴポリペプチドをコードしているヌクレオチドを含む組換え微生物の発酵性増殖によってポリシアル化産物を作製することができる。
【０１２０】
Ａ． インビトロ反応
ＰＳＴポリペプチドを用いて、インビトロ反応混液中にポリシアル化産物を作製することができる。こうしたインビトロ反応混液には、ＰＳＴポリペプチド、部分精製ＰＳＴポリペプチド又は精製ＰＳＴポリペプチドを含む透過性微生物、並びに供与体基質、受容体基質及び適切な反応緩衝液を含ませることができる。インビトロ反応の場合、ＰＳＴポリペプチドなどの組換え糖転移酵素蛋白質、受容体基質、供与体基質及び他の反応混液成分を水性反応媒体中で混合することにより化合させる。所望のＰＳＴ産物に応じて、別の糖転移酵素をＰＳＴポリペプチドと組み合わせて用いることができる。この媒体のｐＨ値は、一般に約５乃至約８．５である。媒体は、媒体がｐＨ値を所望のレベルに維持する能力に基づいて選択する。従って、一部の実施態様では、媒体を約７．５のｐＨ値に緩衝化する。緩衝液を使用しない場合は、媒体のｐＨは、使用する具体的な糖転移酵素に応じて、約５乃至８．５に維持するべきである。ＰＳＴポリペプチドの場合、このｐＨ範囲は約５．５乃至８．０に維持する。
【０１２１】
酵素の量又は濃度は、触媒作用の初速度の指標である活性単位で表す。１活性単位は、所与の温度（通常、３７℃）及びｐＨ値（通常、７．５）における毎分１μｍｏｌの産物の形成を触媒する。従って、１０単位の酵素は、１０μｍｏｌの基質を３７℃の温度及び７．５のｐＨ値において１分で１０μｍｏｌの産物に変換する酵素の触媒量である。
【０１２２】
反応混液には２価の金属陽イオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋）を含めることができる。また、反応媒体は、必要に応じて、可溶化界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ又はＳＤＳ）及びメタノール、エタノールなどの有機溶媒を含むこともできる。酵素は、溶液中単独で利用してもよいし、ポリマーなどの担体に結合させてもよい。従って、反応混液は、最初は実質的に均一であるが、反応中にいくらかの沈澱物が形成されることがある。
【０１２３】
上記のプロセスを実施する温度は氷点のすぐ上から最も感受性の高い酵素が変性する温度の範囲とすることができる。この温度範囲は、好ましくは約０℃乃至約４５℃、より好ましくは約２０℃乃至約３７℃である。
【０１２４】
そのようにして形成した反応混液は、所望の高収量のポリシアル化産物を得るのに十分な時間維持する。大規模調製の場合、反応は、約０．５乃至２４０時間、より典型的には約１乃至３６時間進行させることになることが多い。
【０１２５】
Ｂ． インビボ反応
ＰＳＴポリペプチドを用いて、インビボ反応、例えば、ＰＳＴポリペプチドを含む組換え微生物の発酵性増殖によりポリシアル化産物を作製することができる。組換え微生物の発酵性増殖は、受容体基質及び供与体基質又は供与体基質の前駆体（例えば、ガラクトース又はＧａｌＮＡｃ）を含む媒体の存在下に行うことができる。例えば、Ｐｒｉｅｍほか、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：ｐ２３５−２４０（２００２年）を参照されたい。こうした微生物は受容体基質及び供与体基質又は供与体基質の前駆体を取り込み、この生細胞内で供与体基質の受容体基質への付加が行われる。この微生物は、受容体基質の取り込みを、例えば、糖輸送蛋白質を発現させることにより、容易にするよう改造することができる。例えば、ラクトースが受容体糖である場合、ＬａｃＹ透過酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を用いることができる。他の方法を用いて受容体糖の分解を低減させ、又は供与体糖又は供与体糖の前駆体の産生を増加させることができる。一部の実施態様では、宿主微生物を操作することによってポリシアル化産物の生成を増強する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでは、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素を欠く宿主株（ＮａｎＡ−）用いることによってシアル酸の分解をできるだけ少なくすることができる。（Ｅ．ｃｏｌｉでは、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素は分解酵素であるように思われる。）また、Ｅ．ｃｏｌｉでは、ラクトースが、例えば、受容体糖又はポリシアル化産物合成の中間体である場合、ＬａｃＺ−である宿主細胞を用いることでラクトースの分解を最小限に抑えることができる。シアル酸含有オリゴ糖を含むオリゴ糖のインビボ合成の方法については、例えば、Ｓａｍａｉｎ及びＰｒｉｅｍ 国際公開第ＷＯ／２００１／００４３４１号（２００１年）並びにＪｏｈｎｓｏｎほか 国際公開第ＷＯ／２００６／０３４２２５号（２００６年）に記載されている。
【０１２６】
一部の実施態様では、インビボのポリシアル化系は、シアリルトランスフェラーゼを含むことにより本発明のＰＳＴのためのプライミングされた基質をもたらすこともできる。
【０１２７】
Ｃ． ポリシアル化産物の特性化及び単離
ポリシアル化産物の生成は、例えば、所望の産物の生成が行われたことを確認することによって、又は受容体基質のような基質が減少したことを確認することによって監視することができる。オリゴ糖などのポリシアル化産物が、例えばろ紙もしくはＴＬＣプレートを用いるクロマトグラフィーなどの技術を用いて、又はマススペクトロメトリー、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメトリーもしくはＮＭＲスペクトロメトリーによって同定することができることは、当業者によって認められよう。ポリシアル化産物の同定方法については当業者に周知であり、例えば、あらゆる目的で本明細書に参考として援用されている米国特許第６，６９９，７０５号、及びＶａｒｋｉほか、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１７章（Ａｕｓｕｂｅｌほか編、１９９３年）に記載されている。
【０１２８】
一部の実施態様では、本発明のＰＳＴポリペプチド及び方法を用いて実質的に均一なグリコシル化パターンを有する糖蛋白質又は糖脂質を酵素的に合成する。こうした糖蛋白質及び糖脂質としては、糖型の変更が所望される、蛋白質、糖蛋白質、脂質又は糖脂質に単糖又はオリゴ糖が結合したものが挙げられる。この単糖又はオリゴ糖は糖転移酵素の受容体基質として機能することができる構造を含む。受容体基質がグリコシル化されると、所望のオリゴ糖部分が形成される。この所望のオリゴ糖部分は、それが結合する糖蛋白質又は糖脂質に所望の生物活性を付与する部分である。本発明の成分において、予め選択された単糖残基は、対象の受容体となる可能性のある部位の少なくとも約３０％に連結される。より好ましくは、この予め選択された単糖残基は、対象の受容体となる可能性のある基質の少なくとも約５０％、さらにより好ましくは対象の受容体となる可能性のある基質の少なくとも７０％に連結される。出発糖蛋白質又は糖脂質が対象のオリゴ糖部分において不均一性を示す（例えば、出発糖蛋白質又は糖脂質のオリゴ糖の一部が対象の受容体基質に結合した予め選択された単糖残基を既に有する）場合、記載した百分率にはそのような予め結合された単糖残基が含まれる。
【０１２９】
「変更された」という用語は、本発明のＰＳＴポリペプチド及び方法の適用後に、元々産生された糖蛋白質にみられるのとは異なるグリコシル化パターンを有する対象の糖蛋白質又は糖脂質のことを指す。そのような複合糖質の例は、糖蛋白質の糖型が、生物の細胞により産生され、その生物に固有の糖蛋白質に存在する糖型と異なる糖蛋白質である。また、ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、並びに糖蛋白質及び糖脂質を酵素的に合成するためにそのような蛋白質を使用する方法であって、複合糖質のグリコシル化パターンがその天然の複合糖質が産生される細胞と同じか異なる種のものとすることができる宿主細胞により元々産生された複合糖質のグリコシル化パターンと比べて修飾されている方法も提供する。
【０１３０】
グリコシル化パターンの相違は、糖蛋白質及び糖脂質の構造分析によるばかりではなく、複合糖質の１種以上の生物活性の比較によっても評価することができる。例えば、「変更された糖型」を有する糖蛋白質には、非修飾糖蛋白質と比較してグリコシル化反応後の糖蛋白質の１種以上の生物活性に改善を示すものが含まれる。例えば、変更された複合糖質には、本発明のポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド及び方法の適用後に、対象リガンドもしくはリセプターに対する結合親和性の増大、治療半減期の延長、抗原性の低下及び特定組織へのターゲッティングを示すものが含まれる。観察される改善の大きさは、統計的に有意であることが好ましく、より好ましくは少なくとも約２５％の改善であり、さらにより好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％である。
【０１３１】
ＰＳＴポリペプチドを用いて作製された産物は精製することなく使用することができる。しかしながら、グリコシル化糖を回収するために、標準的な公知技術、例えば、薄層もしくは厚層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は膜ろ過を利用することができる。また、例えば、本発明の譲受人に譲渡されたオーストラリア特許第７３５６９５号に記載されているナノろ過又は逆浸透膜を用いる膜ろ過を利用してもよい。別の例として、膜が約１，０００乃至約１０，０００ダルトンの分画分子量を有する膜ろ過を利用して蛋白質を除去することができる。別の例として、次に、ナノろ過又は逆浸透を利用して塩を除去することができる。ナノろ過膜は、１価の塩は通すが、多価の塩及び使用する膜に応じて約２００乃至約１，０００ダルトンより大きな非荷電溶質を保持する逆浸透膜の部類である。従って、例えば、本発明の成分及び方法により作製されるオリゴ糖は膜内に保持することができ、夾雑塩は通過することになる。
【０１３２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の原文において用いられている単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」及び「ｔｈｅ（前記）」は、文脈上明らかに別の意味に解すべき場合を除き、複数も対象に含むことに留意されたい。従って、例えば、「ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（核酸）」という表現には複数のそのような核酸が含まれ、「ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ポリヌクレオチド）」という表現には１種以上のポリペプチド及び当業者に周知のその均等物が含まれる、などである。
【０１３３】
本明細書に記載した刊行物は、もっぱら本願の出願日以前の開示内容に関して提供されている。本明細書に記載のどの刊行物も、本発明が先行発明に基づくそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、示された発刊日は実際の発刊日と異なる可能性があり、これについては別途確認が必要となる。全ての引用文献は本明細書に参考として援用されている。
【実施例】
【０１３４】
種々の天然ポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ）蛋白質はポリシアリルトランスフェラーゼ活性を有している。本実験ではポリシアリルトランスフェラーゼ活性に必要なＰＳＴのコア構造並びにＰＳＴ蛋白質の修飾と関連付けられる酵素活性及び可溶性の大幅な改善について確認する。
【０１３５】
（実施例１）
ＰＳＴのＮ末端短縮化
以下の実験はＰＳＴ−１３（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来完全長シアリルトランスフェラーゼへのＮ末端ＭａｌＥ融合体）の短縮化産物にもとづくものである。このＰＳＴ蛋白質のＮ末端を分析すると、これは比較的多数の塩基性及び芳香族性残基からなることが分かった（最初の１４個のアミノ酸中６個がリジンである）。
【０１３６】
２種の短縮化、即ち、１９残基短縮化（下記に下線を付けたＭで示した）及び３２残基短縮化（下記に下線を付けたＲで示した）を行った。
ＮＨ２−ＭＬＫＫＩＫＫＡＬＦＱＰＫＫＦＦＱＤＳＭＷＬＴＴＳＰＦＹＬＴＰＰＲＮＮＬＦＶＩＳＮＬＧＱＬＮＱＶＱＳＬＩＫ．．． （配列番号６）
これら２種の短縮型はＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰｓｔΔｌ９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰｓｔΔ３２）である。
【０１３７】
（実施例２）
短縮型ＰＳＴの可溶性評価
これら２種の短縮型蛋白質の可溶性を完全長の親蛋白質と比較するために、これらの構築体をＥ．ｃｏｌｉ ＡＤ２０２に形質転換し、１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ＹＴ培地中で増殖させた。この培養液に約０．１のＯＤ６００で一夜培養物を接種した。細胞は２００ｒｐｍで振盪しながら約２時間３７℃で増殖させることによりＯＤ６００が０．２乃至０．５に達した。培養物を０．５μＭ ＩＰＴＧで誘導し、２００ｒｐｍで振盪しながら約２４時間２０℃でインキュベートした。最終ＯＤ６００は約４乃至５であった。細胞を採取し、溶解させて遠心分離した。ＰＳＴ構築体を過剰発現する溶解細胞のペレット及び上清を収集して分析した。
【０１３８】
図１に示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、いずれの変異体も十分に発現したことが分かる。ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）構築体の発現のレベルはより高かったが、２種の短縮型は、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）構築体とは対照的に、２７，０００×ｇ上清中にほとんど完全に留まり、これらがより可溶性であることが分かった。以下の反応条件を用いてＧＴ３−ＦＣＨＡＳＥ基質において活性のアッセイを行った：０．５ｍＭ ＧＴ３−ＦＣＨＡＳＥ、５０ｍＭ ＮａＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡＣ、１０％酵素、３７℃５分間。（図２に示した）ＣＥ分析から分かるように、短縮型は活性があった。酵素の１／１０希釈液を用いて２７，０００×ｇ上清についてアッセイを繰り返し、直接比較した（図３）。図３に示した結果は、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）が両短縮型よりも活性が高かったことを示している。
【０１３９】
（実施例３）
短縮型ＰＳＴ蛋白質の精製
相対比活性を測定するために、３種の蛋白質を全て先ず親和性クロマトグラフィーにより精製した。２７，０００×ｇ上清５ｍＬを８ｍＬのアミロースカラムに通し、１０ｍＭマルトースで溶出させた。３種の蛋白質全てからのクロマトグラムはほとんど同一のようにみえる。従来、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）は、膜上に沈殿するため遠心分離によって濃縮するのが困難であった。短縮型が同じように挙動するかどうかを調べるために、各精製蛋白質５ｍＬをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて２５分間遠心分離した。１．５ｍＬまで濃縮したＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）の場合、典型的な白色沈殿が膜上に生じた。ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴΔｌ９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴΔ３２）膜上には極めて少量の沈殿物が存在したが、親蛋白質と到底同じ程度ではなく、短縮型は同じ時間で０．８ｍＬまで濃縮することができた。これらの酵素の蛋白質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）により測定した後、各３μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした（図１５）。両短縮型は親蛋白質よりも高度に精製されたが、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴΔｌ９）は最も純度が高いように思われた。
【０１４０】
精製した短縮化タンパク質の相対比活性を測定するために、各タンパク質５０ｎｇを、各ＰＳＴの５０ｎｇ／μＬ溶液を作製した後、ＧＴ３−ＦＣＨＡＳＥとの反応に酵素１μＬを加えることで、（上記の反応条件の）反応に加えた。これらの２種の短縮型酵素が高濃度であるため、酵素間で正確な活性比較を行うには希釈する必要があった。図５から明らかなように、試験条件下では、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）は２種の短縮型タンパク質の活性よりほぼ３倍高い活性を示す。
【０１４１】
（実施例４）
短縮型ＰＳＴの可溶性分析
短縮型の可溶性を試験するために、各２７，０００×ｇ上清５ｍＬを１００，０００×ｇで４℃６０分間遠心分離した。ペレットを５ｍＬの緩衝液に再懸濁して直接上清と比較した。図６に示したように、各サンプル３μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。３通りの場合の全てにおいて、酵素の多くはペレットを形成したように思われた。しかしながら、活性の分析から（図７）、ペレットに対して上清に存在する酵素の相対量は２種の短縮型でより高く、実際にはＰＳＴ−３０の活性は上清とペレットとの間でほぼ等しく分布することが分かる。こうした酵素の可溶性によって、これらの酵素は、より複雑な基質（例えば、オリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質）の修飾用試薬として用いるのに魅力的な候補となる。
【０１４２】
（実施例５）
ＰＳＴの安定性分析
蛋白質をアミロース親和性クロマトグラフィーにより精製し、グリセロールを添加及び無添加の下、４℃又は−２０℃に維持した。活性のアッセイを上記のようにして行い、ＣＥにより分析して残存活性を時間の関数として求めた。図８、９及び１０に示したように、ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）標品は、４℃で２週間まで貯蔵したとき、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）よりも活性が高かった。２０％グリセロールを添加すると、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）標品及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）標品の活性は同程度に維持された。
【０１４３】
（実施例６）
短縮型ＰＳＴによる糖蛋白質のポリシアル化
第ＩＸ因子は完全長ＰＳＴでポリシアル化することができる。種々の供給源からのＰＳＴは第ＩＸ因子を種々の程度にポリシアル化することができた。ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）によるシアル化の比較を図１１に示した。等量のＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を反応液に添加した。ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を、第ＩＸ因子に第１のシアル酸残基を付加するのに用いられる二重特異性シアリルトランスフェラーゼのＣＳＴ−８９と併用すると、第ＩＸ因子の全てがシアル化を示す高分子量物質へと基質転換した（図１１）。この高分子量物質はポリシアル化第ＩＸ因子に相当する。何故なら、これが、Ｈａｎｎｏｖｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ （Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したポリシアル酸特異的モノクロナール抗体７３５に対して免疫反応性を示したからである。こうした結果から、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のより可溶性の短縮型ＰＳＴは、第ＩＸ因子をポリシアル化型へほぼ完全に変換することから明らかなように、治療的基質に対してより高い活性を有することが分かる。
【０１４４】
漸増量のＰＳＴをＩＩＩ型フェチュインを基質としてアッセイした。９ｍｇのＩＩＩ型フェチュインを８４６ｍＵのＣＳＴ−８１（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来Ｃｓｔ−ＩＩ）で処理してＰＳＴ酵素の二シアル化基質を形成させた。次いで、この二シアル化ＩＩＩ型フェチュインを陰イオン交換により精製した（蛋白回収率は約３８％であった）。
【０１４５】
漸増量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ酵素：ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を用いてアッセイを行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＳＴ酵素ＰＳＴ−０５もアッセイした。１ｍｇ／ｍＬの「ジ−シアリル−フェチュイン」５０μｇを３０℃で５０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ ８、１０ｍＭ ＭｇＣ１２、７．８ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ中、精製ＰＳＴ蛋白質１、５、１０又は１５μｇとインキュベートした。サンプルを５分、１時間、２時間、４時間及び一夜の後に採取し、−８０℃に設置して反応をとめた。各酵素に対してフェチュイン及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを対照としなかった。サンプルは、先ず８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、この場合、各反応液２．５μＬをサンプル緩衝液で希釈し、３７℃で約１０分間変性させた。
【０１４６】
次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルについて、８個のＮｅｕＡｃより長いポリシアル酸を検出するモノクロナール抗体ｍＡｂ７３５を用いて免疫ブロッティングを行った。この一次抗体ｍＡｂ７３５をブロッキング緩衝液で１：７５００に希釈し、これにブロットを４℃で一夜インキュベートした。結合抗体をヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ社）で検出した。次いで、ブロットを、ルミノール試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）と６０秒間インキュベートした後、Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘライトフィルム（Ｓｉｇｍａ社）を２乃至１０秒間露光させることにより分析した。免疫ブロッティングの結果は図１２に示した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ酵素ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）は、完全長のＮｅｉｓｓｅｒｉａ酵素ＰＳＴ−１３を上回る最も高い活性を示した。また、Ｅ．ｃｏｌｉのＰＳＴ蛋白質は、ポリシアル酸（ＰＳＡ）をもたらしたが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ酵素よりも低いレベルではあった。
【０１４７】
比較（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）アッセイを行って第ＩＸ因子、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＥＰＯ）で産生させたヒトエリスロポエチン、トランスフェリン及びフェチュインに対するＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）ポリシアル化活性を測定した。先ず、これらの糖蛋白質基質をＣ．ｊｅｊｕｎｉ由来ＣｓｔＩＩ蛋白質とインキュベートしてポリシアリルトランスフェラーゼの適切な基質を作製した。３０℃で２時間反応を行い、得られた二シアル化基質糖蛋白質を１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム及び漸増勾配のＮＨ４ＨＣＯ３を用いて約ｐＨ７．５で精製した。
【０１４８】
５０μｇの第ＩＸ因子、ＥＰＯ、トランスフェリン及び１ｍｇ／ｍＬのフェチュインを反応緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び７．８ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）中３０℃で０．５時間、２時間、５時間及び一夜、５μｇ及び１５μｇの精製ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）とインキュベートした。これらの各時点でサンプルを取りだし、−８０℃に置いて反応を止めた。アッセイした各糖蛋白質に対して対照（即ち、糖蛋白質不含又はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ不含）も組み込んだ。反応生成物（２．５μＬ）はサンプル緩衝液で希釈し、３７℃で約１０分間変性させ、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。こうしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは図１３に示した。
【０１４９】
次に、０．５時間及び一夜後のものについてウエスタンブロッティングにより分析した。０．５時間反応液の場合、１２０ｎｇの蛋白質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。一夜反応液の場合、３０ｎｇの蛋白質をロードした。ｍＡｂ７３５を用い、上記と同様にしてウエスタンブロッティングを行い、ポリシアル酸を検出した。結果は図１４に示した。短縮型Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＰＳＴ蛋白質ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）はこれらの哺乳動物基質蛋白質：第ＩＸ因子、ＥＰＯ、トランスフェリン及びフェチュインのそれぞれをシアル化することができた。
【０１５０】
（実施例７）
ポリシアル酸鎖の長さに及ぼす糖蛋白質基質濃度の影響
種々の濃度のフェチュインを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中７μｇのＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）及び１０ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと３０℃で０．５、１、２、４時間及び一夜インキュベートした。フェチュインが２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ中にあるので、濃度はその中により多くの塩を有する。各一夜反応液からの２．５μｇのフェチュインを上記と同様に８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。次いで、これらのサンプルを免疫ブロットにより分析した。その結果を図１５に示した。０．５ｈ、１ｈ及び一夜反応液のそれぞれからの２０ｎｇのフェチュインを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、上記と同様に免疫ブロットした。５ｍｇ／ｍＬフェチュイン基質を用いて得られた一夜反応液はより短いＰＳＡ鎖を有するばかりでなく、これらの鎖は全て長さがより均一である（０．５ｍｇ／ｍＬ反応液における長いスミアーとは対照的に、より密なバンドとして認められる）。
【０１５１】
（実施例８）
短縮型ＰＳＴのシアリルトランスフェラーゼへの融合
短縮型Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＰＳＴのＣＳＴ−ＩＩとの融合体は活性があり、ポリシアル化産物を作製するのに用いることができる。
【０１５２】
これまで本発明について、理解し易くするために説明および実施例によって少し詳しく述べてきたが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなくこれに特定の変更および修正をおこなうことができることは、本発明の教示内容からして当業者には容易に理解されよう。
【０１５３】
非公式の配列表
【０１５４】
【化１】
【０１５５】
【化２】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００７年６月１５日に出願された米国仮出願第６０／９４４，３９１号および２００８年２月２９日に出願された米国仮出願第６１／０３２，５８９号（これらの両方は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、溶解度及び活性を向上させたポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ：ｐｏｌｙ−ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びポリシアル化最終産物、例えばオリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質の作製のためにこのポリシアリルトランスフェラーゼを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖蛋白質、糖脂質及び多糖は哺乳動物細胞の細胞表面に存在し、多くの生物学的過程における中心的分子である。これらは、生体全体を通じて細胞間認識、細胞分化及び各種リセプター−リガンド相互作用に関与している。これらの生物活性グリカンの多くは、シアル酸又はＮ−アセチル−ノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）という必須９−炭素糖を含有する。
【０００４】
哺乳動物宿主に侵入する病原菌の一部は、宿主におけるシアル酸含有複合糖質の存在を利用している。これらの細菌は細菌細胞表面にこうした同じ炭水化物鎖の一部を表示し、実際に、発症におけるこのような炭水化物の関与が明らかにされている。例えば、非特許文献１並びに非特許文献２を参照されたい。こうした炭水化物模倣体が存在すると、この分子が異種とみなされないため、病原体は免疫系による検知を免れるものと考えられている。さらに、こうした炭水化物が存在することによって血清補体の殺作用に対する物理的バリアーが提供される。例えば、非特許文献３を参照されたい。最後に、恐らく、特定の病原体は、伝染（又は宿主への定着（但し、そのメカニズムは多くの病原体ではまだ立証されていない））を促進する手段としてその表面炭水化物構造を認識する正常なヒトの受容体を利用しているのかもしれない。例えば、非特許文献４及び非特許文献５を参照されたい。
【０００５】
Ｂ群Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１の莢膜多糖類は、連鎖中にシアル酸を有し、この連鎖は神経機能に不可欠な脳特異的蛋白質である哺乳動物神経細胞接着分子に主にみられるポリシアル酸（ＰＳＡ）構造の分子擬態である。すなわち、これらは、α−２，８−結合Ｎｅｕ５Ａｃのホモポリマーとして、また、α−２，９結合残基のホモポリマーとして、結合がα−２，８／α−２，９混合型であるコポリマーとして、及び最終的には、Ｙ及びＷ群Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおけるように、他の糖が含まれるポリマーとして存在する。これらのポリシアル酸莢膜は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ及びＰ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａの場合、神経侵襲性疾患において必要とされる。例えば、Ｓｉｌｖｅｒ，Ｒ．Ｐ．及びＥ．Ｒ．Ｖｉｍｒ．、１９９０年、Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｃａｐｓｕｌｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１、ｐ３９−６０、Ｂ．Ｈ．Ｉｇｌｅｗｓｋｉ及びＶ．Ｌ．Ｃｌａｒｋ編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．を参照されたい。これらの病原体の多くはヒト宿主に特異的であるので、動物モデルでの感染データではこうした複合糖質の真の機能の全てが明らかとなるわけではない可能性があることに留意されたい。
【０００６】
これまでのところ、病原菌を用いたシアリルトランスフェラーゼの酵素化学の基礎的な側面に関して詳細な研究はほとんどなされていない。ＬＯＳのシアル化に関与するこうした酵素の一部については発現、精製及び結晶化は可能である。例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：ｐ２８２７１−２８２７６（１９９６年）、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、：ｐ３８９６−３９０６（２０００年）、Ｃｈｉｕ，Ｃ．Ｐ．ほか、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：ｐ１６３−１７０（２００４年）及びＹｕ，Ｈ．ほか、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１２７：ｐ１７６１８−１７６１９（２００５年）を参照されたい。しかしながら、シアル酸ホモポリマー莢膜の生成に関与する酵素に関してはそのような研究は何らなされていない。
【０００７】
ＰＳＡ莢膜産生のための遺伝子座はＥ．ｃｏｌｉ及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのいずれにおいても同定されており、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１及びＫ９２からの組換え酵素（ＮｅｕＳ）に関して研究が一部なされている。例えば、非特許文献６並びに非特許文献７を参照されたい。しかし、この場合も、単離シアリルトランスフェラーゼに関する詳細な酵素化学については報告がない。こうした酵素化学の研究は、この酵素の溶解度が低いためにインビトロでのポリシアル酸結合体の産生が妨げられることによって阻害されている。本発明はこうしたニーズや他のニーズを解決するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｈｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．及びＳｔｅｐｈｅｎｓ，Ｄ．Ｓ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８年）２４：ｐ２８１−３３４
【非特許文献２】Ｍｏｒａｎ，Ａ．Ｐ．ほか、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６年）１６：ｐ１０５−１１５
【非特許文献３】Ｖｏｇｅｌ，Ｕ．ほか、Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｂｅｒｌ）（１９９６年）１８５：ｐ８１−８７
【非特許文献４】Ｐｒｅｓｔｏｎ，Ａ．ほか、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６年）２２：ｐ１３９−１８０
【非特許文献５】Ｈａｒｖｅｙ，Ｈ．Ａ．ほか、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００年）３６：ｐ１０５９−１０７０
【非特許文献６】Ｃｈｏ，Ｊ．及びＴｒｏｙ ＦＡ，Ｉ．Ｉ．、ＰＮＡＳ（１９９４年）９１：ｐ１１４２７−１１４３１
【非特許文献７】Ｓｈｅｎ，Ｇ．Ｊ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９年）２７４：ｐ３５１３９−３５１４６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、供与体基質からシアル酸部分を適切な受容体基質へ転移させる短縮型ポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ）ポリペプチドを提供する。一実施態様において、この短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の３３位から４９５位までのアミノ酸と９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、この短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の２０位から４９５位までのアミノ酸と９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。この短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の１位から４９５位までのアミノ酸からなる完全長のＰＳＴポリペプチドよりも可溶性が高いことが好ましい。本発明の短縮型ＰＳＴポリペプチドは、配列番号１の１位から４９５位までのアミノ酸からなるアミノ酸配列を含まない。
【００１０】
一態様において、この短縮型ＰＳＴポリペプチドはＭＢＰタグを含む。別の態様では、この短縮型ＰＳＴポリペプチドでシアル化された受容体基質は、例えば、糖ペプチド、糖蛋白質、糖脂質又はガングリオシドである。別の態様では、この受容体基質は糖蛋白質、例えば、第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、トランスフェリン及びフェチュインである。好ましい実施態様では、この糖蛋白質基質はヒト蛋白質である。
【００１１】
本発明は、受容体基質、例えばオリゴ糖又は単糖を短縮型ＰＳＴポリペプチド及びシアル酸部分を含む供与体基質と接触させ、このシアル酸部分の受容体糖への転移を生じさせることによりポリシアル化産物糖を作製することで、ポリシアル化産物糖を作製する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、受容体基質、例えば適切な蛋白質又はペプチドを短縮型ＰＳＴポリペプチド及びシアル酸部分を含む供与体基質と接触させ、このシアル酸部分の受容体糖類への転移を生じさせることによりポリシアル化蛋白質又はペプチドを作製することで、ポリシアル化蛋白質又はペプチドを作製する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、受容体基質、例えば適切な糖脂質又はガングリオシドを短縮型ＰＳＴポリペプチド及びシアル酸部分を含む供与体基質と接触させ、このシアル酸部分の受容体糖類への転移を生じさせることによりポリシアル化糖脂質又はガングリオシドを作製することで、ポリシアル化糖脂質又はガングリオシドを作製する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＳＴのＮ末端短縮化についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の溶解度を分析した。「Ｐ」はペレット画分、「Ｓ」は上清（可溶性）画分を示す。
【図２】ＰＳＴシアリルトランスフェラーゼ反応液の代表的なキャピラリー電気泳動（ＣＥ：ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）図である。この分析結果は、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の２７，０００×ｇ上清（Ｓ）及びペレット（Ｐ）についてのものである。変換％はいずれかのシアル化形態に変換された基質の百分率を示す。
【図３】ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の１０倍希釈２７，０００×ｇ上清の代表的なＣＥ分析結果である。変換％はいずれかのシアル化形態に変換された基質の百分率を示す。ＣＥラインは、上から下にＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）に相当するように順序付けられている。
【図４】精製したＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。矢印はこれらの精製蛋白質のバンドのおおよその予想泳動点である。
【図５】５０ｎｇの精製ＭａｌＥ−Ｐｓｔ融合構造体ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の活性を表す代表的ＣＥ分析結果を示す図である。変換％はシアル化産物に変換された基質の百分率を示す。
【図６】１００，０００×ｇで遠心分離したＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。「Ｓ」は上清（可溶性）画分、「Ｐ」はペレット画分を示す。
【図７】ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ１９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の１００，０００×ｇ遠心分離アッセイ物の代表的なＣＥ分析結果を示す図である。「Ｓ」は上清（可溶性）画分、「Ｐ」はペレット画分を示す。変換％はシアル化産物に変換された基質の百分率を示す。
【図８】ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）の安定性アッセイの結果を示す代表的なグラフである。このアッセイには０．３５ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）を用いた。時間（日単位）はＸ軸に、残存活性（％）はＹ軸にプロットされている。
【図９】ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の安定性アッセイの結果を示すグラフである。１．６３ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を用いた。時間（日単位）はＸ軸に、残存活性（％）はＹ軸にプロットされている。
【図１０】ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）の安定性アッセイの結果を示すグラフである。１．５６ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を用いた。時間（日単位）はＸ軸に、残存活性（％）はＹ軸にプロットされている。
【図１１】二機能性シアリルトランスフェラーゼＣＳＴ−８９とＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）又はＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）のいずれか一方とを含む反応における第ＩＸ因子のポリシアル化の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。「Ｔ」は反応を進行させた時間（分単位）を示す。
【図１２】細菌ポリシアリルトランスフェラーゼによるフェチュインのポリシアル化の結果を示す図である。以下の酵素をアッセイした：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ酵素のＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）並びにＥ． ｃｏｌｉ酵素のＰＳＴ−５。フィルムは２又は５秒間露光させた。各レーンは以下の通り番号を付した：レーン１：フェチュイン無添加の対照、レーン２：ＣＭＰ−シアル酸無添加の対照、レーン３：１．０μｇ ＰＳＴ、レーン４：５μｇ ＰＳＴ、レーン５：１０μｇ ＰＳＴ、及びレーン６：１５μｇ ＰＳＴ。
【図１３】ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）及びＣＭＰ−シアル酸とのインキュベーション後の各種糖蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。以下の糖蛋白質をアッセイした：第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トランスフェリン及びフェチュイン。インキュベーションは０．５時間、２時間、５時間及び１６時間とした。レーン１：糖蛋白基質無添加の対照、レーン２：ＣＭＰ−シアル酸無添加の対照、レーン３：５．０μｇ ＰＳＴ、レーン４：１５μｇ ＰＳＴ。
【図１４】ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）及びＣＭＰ−シアル酸とのインキュベーション後の各種糖蛋白質のポリシアル化の結果を示す図である。以下の糖蛋白質をアッセイした：第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トランスフェリン及びフェチュイン。インキュベーションは０．５時間又は１６時間とした。レーン１：糖蛋白基質無添加の対照、レーン２：ＣＭＰ−シアル酸無添加の対照、レーン３：５．０μｇ ＰＳＴ、レーン４：１５μｇ ＰＳＴ。
【図１５】ポリシアル酸鎖の長さに対するフェチュイン濃度漸増の結果を示す図である。図は、ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）及びＣＭＰ−シアル酸と図に示した時間、即ち０．５時間、１時間及び一夜インキュベーションした後のポリシアル化フェチュイン産物のウエスタンブロット（２露光時間）を示す図である。各レーンは以下の通り番号を付した：レーン１：フェチュイン無添加の対照、レーン２：ＣＭＰ−シアル酸無添加の対照、レーン３：１．０ｍｇ／ｍｌフェチュイン、レーン４：２．５ｍｇ／ｍ．フェチュイン、レーン５：５．０ｍｇ／ｍｌフェチュイン。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．序文
ポリシアル化産物、例えば、ポリシアル酸基を含有するオリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質を効率的に作製するために、ポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ）ポリペプチドを構築した。ＰＳＴのＮ末端を短縮化すると、溶解度及び活性が増加する。従って、本発明の短縮型ＰＳＴは、修飾されていないＰＳＴ蛋白質に比し、α−２，８又はα−２，９配置でシアル酸残基をより効率的に結合させることができる。
【００１６】
ＩＩ．定義
本明細書では以下の略号を用いている：
Ａｒａ ＝ アラビノシル；
Ｆｒｕ ＝ フラクトシル；
Ｆｕｃ ＝ フコシル；
Ｇａｌ ＝ ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ ＝ Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ ＝ グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ ＝ Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ ＝ マンノシル；及び
ＮｅｕＡｃ ＝ シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。
【００１７】
糖転移酵素、例えばポリシアリルトランスフェラーゼの「受容体基質」又は「受容体糖」は、特定の糖転移酵素の受容体の役目をすることができるオリゴ糖部分である。この受容体基質を対応する糖転移酵素及び糖供与体基質並びに他の必要な反応混液成分と接触させ、この反応混液を十分な時間インキュベートすると、この糖転移酵素は糖供与体基質から糖残基を受容体基質へ転移させる。この受容体基質は種々の特定の糖転移酵素に対して変えることができる。従って、「受容体基質」という用語は、特定の用途に対して対象となる特定の糖転移酵素との関連で解釈する。ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質及び別の糖転移酵素の受容体基質について本明細書で説明する。
【００１８】
糖転移酵素の「供与体基質」は、活性化ヌクレオチド糖である。そのような活性化糖は一般に、ウリジン、グアノシン、シトシンの一リン酸の糖誘導体（それぞれ、ＵＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ）又は二リン酸の糖誘導体（それぞれ、ＵＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ）から成り、この場合、ヌクレオシド一リン酸又は二リン酸は離脱基となる。ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質の供与体基質としては、例えば、目的とするシアル酸を含む活性化ヌクレオチド糖が挙げられる。例えば、ＮｅｕＡｃの場合、この活性化糖はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃである。細菌系、植物系及び真菌系は、時として他の活性化ヌクレオチド糖を用いることがある。
【００１９】
オリゴ糖は、還元末端及び非還元末端を有すると考えられており、その還元末端の単糖が実際に還元糖であるか否かを問わない。一般に認められている命名法に準拠して、本明細書ではオリゴ糖は、左に非還元末端、右に還元末端がくるように記載している。本明細書に記載したオリゴ糖は全て、非還元糖の名称又は略号（例えば、Ｇａｌ）、続いてグリコシド結合の配置（α又はβ）、環結合、その結合に関与する還元糖の環位置、次にこの還元糖の名称又は略号（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）により記載している。２個の糖間の結合は、例えば、２，３、２→３又は（２，３）と表すことができる。各単糖はピラノース又はフラノースである。
【００２０】
本明細書に用いている「シアル酸部分」とは、シアル酸を含む、又はシアル酸から誘導することができる分子のことを指す。シアル酸部分は通常単糖、例えば、ＣＭＰ−シアル酸である。
【００２１】
本明細書に用いている「シアル酸部分のポリマー」とは、多数の結合シアル酸部分（即ち、２個以上）のことを指す。そのようなシアル酸ポリマーとして、全てが同じ配置で結合しているシアル酸のホモポリマー、例えば「α−２，８結合シアル酸部分のホモポリマー」又は「α−２，９結合シアル酸部分のホモポリマー」が挙げられる。また、シアル酸ポリマーとしては「α−２，８／２，９結合シアル酸部分のコポリマー」も挙げられる。シアル酸ポリマーの結合は、ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質に含まれるポリシアリルトランスフェラーゼの識別性によって決まることになる。
【００２２】
本明細書に用いている「ポリシアル化産物又は産物糖」とは、少なくとも３個のシアル酸部分を含む、糖脂質又は糖蛋白質（例えば、生体分子）に非結合又は結合したオリゴ糖、多糖又は炭水化物部分のことを指す。ポリシアル化産物又は産物糖の好ましい実施態様では、第１の単一シアル酸部分は受容体基質又は生体分子にα−２，３配置で結合し、第２の単一シアル酸部分は第１の単一シアル酸部分にα−２，８配置で結合し、第２の単一シアル酸部分には１個以上のシアル酸部分が結合する。ポリシアル化産物又は産物糖は少なくとも３個のシアル酸部分を含む。他の実施態様では、ポリシアル化産物又は産物糖は少なくとも５、７、１２、２５、４５、８０、１００、１５０、２００、２５０又は５００個のシアル酸部分を含む。別の実施態様では、ポリシアル化産物又は産物糖は少なくとも３乃至１２、２５、４５、８０、１００、１５０、２００、２５０又は５００個のシアル酸部分を含む。さらに別の実施態様では、ポリシアル化産物又は産物糖は、最大１２、２５、４５、８０、１００、１５０、２００、２５０又は５００個のシアル酸部分を含む。
【００２３】
また、一部の実施態様では、別の糖転移酵素の作用によって受容体基質に他の糖部分、例えばフコース、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、グルコース又はＧｌｃＮＡｃを付加することによりポリシアル化産物糖を作製する。一部の実施態様では、受容体基質はガラクトース部分を含み、二機能性シアリルトランスフェラーゼ蛋白質を用いて第１の単一シアル酸部分をこのガラクトース部分にα−２，３配置で付加し；次いで、ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質により第２の単一シアル酸部分をα−２，８配置で第１のシアル酸部分に付加することができ；さらに、この第２の単一シアル酸部分に１個以上のシアル酸部分を付加してポリシアル化産物糖を作製する。他の実施態様では、受容体基質は第１のシアル酸部分をα−２，３配置で含み、ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質を用いて第２の単一シアル酸部分をα−２，８配置で第１のシアル酸部分に付加し；次いでこの第２の単一シアル酸部分に１個以上のシアル酸部分を付加してポリシアル化産物糖を作製する。別の実施態様では、受容体基質は、第１のシアル酸部分をこの第１のシアル酸部分に対してα−２，８配置で第２の単一シアル酸部分に結合させたものをα−２，３配置で含み；ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質を用いてこの第２の単一シアル酸部分に１個以上のシアル酸部分を付加してポリシアル化産物糖を作製する。
【００２４】
「シアル酸」又は「シアル酸部分」という用語は、炭素９個のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーのことを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、又はＮＡＮＡと略される）である。ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏほか、（１９８６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：ｐ１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：ｐ２１８１１−２１８１９（１９９０年））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ又は９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、及び９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９位置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２：ｐ２５−４０（１９９２年）；Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）を参照されたい。シアル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用については、１９９２年１０月１日付け公開の国際出願ＷＯ９２／１６６４０号に開示されている。
【００２５】
本出願において必要な命名及び一般的な検査手技の多くは、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版）、第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年に記載されている。以後、この手引き書のことを「Ｓａｍｂｒｏｏｋほか」と称する。
【００２６】
「シアリルトランスフェラーゼ」又は「シアリルトランスフェラーゼ」をコードする核酸という用語は、第１のシアル酸分子の受容体基質への転移を触媒することができる核酸並びにポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異株及び種間ホモログのことを指す。細菌及び哺乳動物のシアリルトランスフェラーゼが知られている。シアル酸残基は種々の結合（例えば、α−２，３、α−２，６及びα−２，８）により受容体基質に結合させることができる。シアリルトランスフェラーゼは１種以上の活性を有することができる。多くのシアリルトランスフェラーゼは単機能性である。例として、ＣＳＴ−Ｉ及びＣＳＴ−ＩＩＩは、シアル酸のα−２，３結合での転移を触媒する、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来の単機能性シアリルトランスフェラーゼである。例えば、米国特許第６，６８９，６０４号及び米国特許第６，６９９，７０５号を参照されたい。他の例示的な単機能性シアリルトランスフェラーゼとしては、米国特許第６，０９６，５２９号に開示されているＮｅｉｓｓｅｒｉａ由来のシアリルトランスフェラーゼがある。
【００２７】
他のシアリルトランスフェラーゼは２種以上の酵素活性を有する、即ち、シアル酸を２種以上の結合で基質に付加する。例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣＳＴ−ＩＩ酵素は、α−２，３及びα−２，８結合のうちの少なくとも１つを用いて受容体分子にシアル酸を付加する。一部のＣＳＴ−ＩＩ酵素は、α−２，８配置で受容体分子に複数のシアル酸を付加する。別のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株由来のＣＳＴ−ＩＩ酵素では活性が異なりうる。各種のＣＳＴ−ＩＩ酵素、核酸及び活性のアッセイについては、例えば、米国特許第６，６９９，７０５号、Ｇｉｌｂｅｒｔほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：ｐ３２７−３７（２００２年）及びＧｉｌｂｅｒｔほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：ｐ３８９６−９０６（２０００年）に開示されている。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の多機能性シアリルトランスフェラーゼについても報告されている。例えば、Ｆｏｘほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：ｐ４００２４−３２（２００６年）を参照されたい。
【００２８】
「ポリシアリルトランスフェラーゼ」又は「ＰＳＴ」並びに、（１）ポリシアリルトランスフェラーゼの核酸によりコードされたアミノ酸配列もしくはポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質のアミノ酸配列（例示的なポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質配列については、例えば、配列番号１参照）に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、６５、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００個以上のアミノ酸の領域にわたって有し、（２）ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質のアミノ酸配列を含む免疫原及びその保存的に修飾された変異体に対する抗体（例えば、ポリクロナール抗体）に結合するポリペプチド多型変異体、対立遺伝子及び種間ホモログ。ＰＳＴの活性ドメインは、例えば配列番号１のポリシアリルトランスフェラーゼ活性ドメインに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸同一性を有する。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、通常、限定されない例として挙げられるＮｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａなどの細菌由来である。本発明の核酸及び蛋白質には天然分子又は組換え分子のいずれも含まれる。ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、通常、例えばα−２，８結合、α−２，９結合又はα−２，８／２，９結合を作る活性を含むポリシアリルトランスフェラーゼ活性を有する。ポリシアリルトランスフェラーゼのアッセイは、本明細書に記載したように、適切な供与体基質及び受容体基質を用い、当業者に周知の方法に従って実施することができる。通常、ＰＳＴ酵素は、受容体基質に予め結合したシアル酸残基に複数のシアル酸残基を付加する。
【００２９】
本明細書に用いている「短縮型ＰＳＴポリペプチド」又は文法上の変異体は、この短縮型ＰＳＴポリペプチドが酵素活性を保持している限り、自然界に生じる野生型ＰＳＴポリペプチドに比し、操作により少なくとも１個のアミノ酸残基が除去されているＰＳＴポリペプチドのことを指す。野生型、即ち天然のＰＳＴ蛋白質の例としては、例えば配列番号１のものが挙げられる。好ましいＰＳＴの短縮は、配列番号１のＮ末端から１９又は３２個アミノ酸の欠失である。短縮型ＰＳＴ蛋白質の他の好ましい例は、配列番号３及び５、又は配列番号３又は配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列である。別の好ましい実施態様では、短縮型ＰＳＴ蛋白質は、例えばＭａｌ−Ｅ蛋白質又はシアリルトランスフェラーゼに融合させる。
【００３０】
本発明の「融合ＰＳＴポリペプチド」又は「融合ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド」は活性ＰＳＴドメインを含むポリペプチドである。この融合ポリペプチドは、ポリシアル酸転移反応を触媒することができる。通常、この融合ポリペプチドの触媒ドメインは、ＰＳＴ及び触媒ドメインが由来する融合蛋白質のそれと少なくとも実質的に同一であることになる。一部の実施態様では、ポリシアリルトランスフェラーゼとシアリルトランスフェラーゼとの融合体である組換え蛋白質を構築して「自己プライマー化ＰＳＴ」を作製することができる。一部の実施態様では、この自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、第１の単一シアル酸を受容体基質中の非シアル酸糖残基に、シアリルトランスフェラーゼの活性によって通常α−２，３配置で結合させることができる。別の実施態様では、この自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、予め付加された第１の単一シアル酸部分に第２の単一シアル酸部分を多機能性シアリルトランスフェラーゼの活性によって通常α−２，８配置で結合させもする。別の実施態様では、この自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、α−２，３配置で予めシアル化した受容体基質にシアル酸残基を付加する。一旦適切な数のシアル酸残基が受容体基質に付加されてポリシアリルトランスフェラーゼ活性が「プライミング」されると、次いでこの自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、シアル酸部分にポリシアリルトランスフェラーゼの活性によって１個以上のシアル酸部分を結合させることができる。一部の実施態様では、ポリシアリルトランスフェラーゼの活性はシアル酸部分のポリマーを生じる。
【００３１】
本発明の組換え蛋白質は、一端に、蛋白質の精製又は同定を容易にする分子「精製タグ」を有する融合蛋白質として構築し、発現させることができる。このようなタグは、グリコシル化反応時に対象蛋白質の固定化に用いることもできる。好適なタグとしては、「エピトープタグ」が挙げられ、これは抗体によって特異的に認識される蛋白質配列である。エピトープタグは、一般に融合蛋白質に組み込むことによってこの融合蛋白質を明確に検出又は単離するために容易に入手できる抗体を使用することが可能となる。「ＦＬＡＧタグ」は、配列ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ又はこれと実質的に同一の変異体からなる、モノクロナール抗ＦＬＡＧ抗体によって特異的に認識されるよく用いられているエピトープタグである。他にも好適なタグが当業者に周知であり、例えば、ニッケルイオン、コバルトイオンなどの金属イオンに結合するヘキサヒスチジンペプチド又はｍｙｃタグのような親和性タグが挙げられる。精製タグを含む蛋白質は、精製タグを結合する結合パートナー（例えば精製タグに対する抗体、ニッケルもしくはコバルトイオン又は樹脂及びアミロース、マルトース又はシクロデキストリン）を用いて精製することができる。また、精製タグとしてはマルトース結合ドメイン及び澱粉結合ドメインも挙げられる。マルトース結合ドメイン蛋白質の精製は当業者には周知である。澱粉結合ドメインについては国際公開第ＷＯ９９／１５６３６号に開示されており、これは本明細書に参考として援用されている。ベータ−シクロデキストリン（ＢＣＤ：ｂｅｔａ−ｃｙｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）で誘導体化した樹脂を用いた澱粉結合ドメインを含む融合蛋白質の親和性精製については２００５年２月１７日付け公開の国際公開第ＷＯ２００５／０１４７７９号に開示されており、これは本明細書に参考として援用されている。
【００３２】
本明細書中で触れている「アクセサリー酵素」とは、例えばポリシアリルトランスフェラーゼ反応（例えば、シアル酸合成酵素）のためのヌクレオチド糖を形成する反応を触媒することに関与する酵素である。
【００３３】
「触媒ドメイン」又は「活性ドメイン」とは、酵素の部分であって、この酵素により通常行われる酵素反応を触媒するのに十分な部分のことを指す。例えば、ＰＳＴポリペプチドの触媒ドメインには、基質へのシアル酸の転移を触媒するのに十分なＰＳＴの部分を含めることになる。触媒ドメインには、酵素全体、その部分配列を含めることができ、又はその酵素に結合していない別のアミノ酸配列もしくは自然界に存在するような部分配列を含めることができる。
【００３４】
「工業規模」とは、１回の反応でポリシアル化産物のグラム規模の作製のことを指す。好ましい実施態様では、工業規模とは、約５０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５又は２００グラムを超えるポリシアル化産物の作製のことを指す。
【００３５】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列及び核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードしている核酸、又はその核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には本質的に同一の配列のことを指す。遺伝暗号の縮退のため、多数の機能的に同一の核酸が所与の蛋白質をコードしている。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードしている。従って、あるアラニンがあるコドンによって特定されている全ての位置において、コードされるポリペプチドを変えることなしに、このコドンを記載の対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はこの核酸の全ての可能なサイレント変異を表すものでもある。（通常メチオニンの唯一つのコドンであるＡＵＧ及び通常トリプトファンの唯一つのコドンであるＴＧＧを除く）核酸中の各コドンが機能的に同一の分子をもたらすように修飾することができることは、当業者によって認められよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、発現産物に関する各記載配列では絶対的であるが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。
【００３６】
アミノ酸配列に関しては、コードされている配列中の単一のアミノ酸又はごく一部のアミノ酸を変更、付加又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又は蛋白質配列に対する個々の置換、欠失又は付加については、こうした変更がアミノ酸の化学的に類似のアミノ酸による置換をもたらす場合、「保存的に修飾された変異体」であることは、当業者によって認められよう。機能的に類似のアミノ酸を示す保存的置換の表については当該分野では公知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子を排除するものではなく、これらに加わるものである。
【００３７】
蛋白質中の多くのアミノ酸同士をこの蛋白質の機能に影響を与えずに置換することができること、即ち、保存的置換が開示したポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質及びその誘導体などの蛋白質の保存的に修飾された変異体の基礎となり得ることは、当業者によって認められよう。以下は保存的アミノ酸置換の未完成リストである。以下の８グループはそれぞれ、互いに保存的置換となるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。
【００３８】
本発明の細胞及び方法は、概して供与体基質からシアル酸部分を受容体分子へ転移させることによってポリシアル化産物を作製するのに有用である。また、本発明の細胞及び方法は、概して供与体基質から別の単糖又は硫酸基を受容体分子へ転移させることによって別の糖残基を含むポリシアル化産物糖を作製するのにも有用である。一般に、付加は、オリゴ糖、多糖（例えば、ヘパリン、カラゲニンなど）又は糖脂質もしくは糖蛋白質（例えば、生体分子）の炭水化物部分の非還元末端で行われる。本明細書で定義した生体分子としては、炭水化物、オリゴ糖、ペプチド（例えば、糖ペプチド）、蛋白質（例えば、糖蛋白質）及び脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質及びガングリオシド）などの生物学的に重要な分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖状のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーのことを指し、特に限定しない限り、天然のヌクレオチドと同様にして核酸とハイブリッドを形成する天然ヌクレオチドの既知のアナログを包含する。特に示さない限り、特定の核酸配列としてはその相補性配列を含める。「核酸」、「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では同じ意味で用いている。
【００４０】
「動作可能なように連結された」という用語は、（プロモータ、シグナル配列、転写因子結合部位のアレイなどの）核酸発現制御配列と別の核酸配列との機能的な結合であって、発現制御配列はこの別の配列に相当する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を与えるものとする結合のことを指す。
【００４１】
細胞に関連して用いられる場合の「組換え」という用語は、この細胞が異種の核酸を複製し、又は異種の核酸によってコードされるペプチドもしくは蛋白質を発現することを意味する。組換え細胞は、天然（非組み換え）型の細胞内に存在しない遺伝子を含むことができる。また、組換え細胞は、天然型の細胞に存在する遺伝子を修飾して人工的な手段でこの細胞中に再導入したものを含むこともできる。また、この用語は、細胞にとって内因性の核酸であって、細胞から取り出すことなく修飾した核酸を含む細胞を包含し、そのような修飾としては、遺伝子置換、部位特異的突然変異及び関連の技術により得られるものが挙げられる。
【００４２】
「組換え核酸」とは、人工的に構築された（例えば、２種の天然又は合成核酸断片を結合させることにより形成された）核酸のことを指す。また、この用語は、人工的に構築された核酸の複製又は転写によって作製された核酸にも適用される。「組換えポリペプチド」は、組換え核酸（即ち、その細胞に由来しない、又は天然型から修飾されている核酸）が転写され、その後、生じた転写物が翻訳されることによって発現される。
【００４３】
本明細書に用いている「異種ポリヌクレオチド」又は「異種核酸」は、その特定の宿主細胞とは異なる供給源に由来するか、同じ供給源からであってもその元の形態から修飾されているものである。従って、原核宿主細胞中の異種ポリシアリルトランスフェラーゼ遺伝子としては、この特定の宿主細胞に対して内因性ではあるが、修飾されているポリシアリルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。この異種配列の修飾は、例えば、そのＤＮＡを制限酵素で処理することによりプロモータに動作可能なように連結することができるＤＮＡ断片を作製することによって行うことができる。部位特異的突然変異などの技術も異種配列の修飾に有用である。
【００４４】
「部分配列」とは、核酸又はアミノ酸（例えば、ポリペプチド）の長い配列の一部を含む、それぞれ核酸又はアミノ酸のより短い配列のことを指す。
【００４５】
「組換え発現カセット」又は単に「発現カセット」とは、宿主内の構造遺伝子の発現に影響を与えることができる核酸エレメントであって、宿主がそのような配列と共存できる核酸エレメントを有する組換え又は合成により作製した核酸構築体である。発現カセットには、少なくともプロモータ、任意選択的に転写終結シグナルを含ませる。通常、組換え発現カセットには、転写対象の核酸（例えば、目的とするポリペプチドをコードしている核酸）及びプロモータを含ませる。発現を行わせるのに必要又は有用な別の因子も、本明細書に記載したようにして用いてもよい。例えば、発現カセットには、宿主細胞からの発現蛋白質の分泌を誘導するシグナル配列をコードしているヌクレオチド配列を含ませることもできる。転写終結シグナル、エンハンサ及び遺伝子発現に影響を与える他の核酸配列も発現カセットに含ませることができる。
【００４６】
「単離された」という用語は、酵素の活性を妨げる成分を実質的又は本質的に含まない材料のことを指す。本発明の細胞、糖、核酸及びポリペプチドの場合、「単離された」という用語は、天然の状態で存在する材料に通常付随して存在する成分を実質的又は本質的に含まない材料のことを指す。一般的に、本発明の単離された糖、蛋白質又は核酸は、純度測定のための銀染色ゲルのバンド強度その他の方法で測定する純度が少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％又は８５％、通常少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。純度又は均一性は、蛋白質又は核酸サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続く染色による可視化などの当該分野で公知のいくつかの手段によって示すことができる。特定の目的のためには、高分解能が必要とされることになり、ＨＰＬＣ又は同様な精製手段が利用される。オリゴ糖又は他のガラクトシル化産物の場合、純度は、例えば、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又は質量分析を利用して測定することができる。
【００４７】
２本以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列との関連で「同一の」又は「同一性」百分率という用語は、下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つ又は目視検査によって測定して比較及び一致の最大化のために位置合わせをした場合に、２本以上の配列又は部分配列が同一である、又は同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定の割合で有することを指す。
【００４８】
２つの核酸又はポリペプチドとの関連で「実質的に同一の」という語句は、下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つ又は目視検査によって測定して比較及び一致の最大化のために位置合わせした場合に、２本以上の配列又は部分配列のヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性が少なくとも６０％、好ましくは８０％又は８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であることを指す。この実質的な同一性は、好ましくは長さが少なくとも約５０残基の配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、配列同士が少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一であることが最も好ましい。最も好ましい実施態様では、これらの配列はコーディング領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００４９】
配列の比較においては、通常、１つの配列を試験配列と比較する対照配列として用いる。配列比較アルゴリズムを用いる際には、試験および対照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、部分配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）を指定し、次に、配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを指定する。次いで、指定したプログラム・パラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムにより、対照配列に対する試験配列の配列同一性百分率が算出される。
【００５０】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：ｐ４８２（１９８１年）の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：ｐ４４３（１９７０年）のホモロジー・アラインメント・アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：ｐ２４４４（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、もしくは目視検査（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌほか編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）参照）によって行うことができる。
【００５１】
配列同一性百分率および配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：ｐ４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｅｌほか（１９７７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：ｐ３３８９−３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。このアルゴリズムは、先ず、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインメントさせた時にある正値の閾値スコアＴにマッチするかこれを満たす検索配列中の長さＷの短い文字列を特定することによって高相同性スコア配列対（ＨＳＰ：ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒ）を同定する。Ｔは、近傍文字列スコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌほか、上記文献）と呼ばれる。これらの初期の近傍文字列ヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとなる。次いで、これらの文字列ヒットは、累積アラインメント・スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一対の一致残基のスコア値（ｒｅｗａｒｄ）；常に＞０）およびＮ（不一致残基のペナルティ値；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合、スコアリング・マトリクスを用いて累積スコアを算出する。文字列ヒットの各方向への延長は、以下の場合、即ち、上記累積アラインメント・スコアがその最大到達値から数量Ｘだけ減少した場合、この累積スコアが１つ以上のネガチブ・スコア（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントの蓄積によりゼロ以下になった場合、もしくはどちらの配列においても末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、位置合わせの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：ｐ１０９１５（１９８９年）参照）。
【００５２】
配列同一性百分率を算出する他に、ＢＬＡＳＴアルゴニズムは２本の配列間の類似性の統計的な解析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：ｐ５８７３−５７８７（１９９３年）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴニズムにより得られる類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標となる最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と対照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、この核酸は対照配列と類似しているとみなされる。
【００５３】
２本の核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記のように、第１の核酸によりコードされたポリペプチドが第２の核酸によりコードされたポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。従って、例えば、あるポリペプチドがもう１つのポリペプチドと、保存的置換によってのみ異なる場合、これらの２つのポリペプチドは、通常、実質的に同一である。さらに、２本の核酸配列が実質的に同一であることの指標は、下記のように、これらの２つの分子が緊縮条件下で互いにハイブリッドを形成することである。
【００５４】
「〜と特異的にハイブリッドを形成する」という語句は、複雑な混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡ又はＲＮＡに存在する場合の特定のヌクレオチド配列とのみ緊縮条件下で分子が結合、二重化又はハイブリッド形成することを指す。
【００５５】
「緊縮条件」という用語は、プローブがその標的部分配列とハイブリッドを形成するが、他の配列とはしない条件のことを指す。緊縮条件は配列依存性であり、異なる状況の下では異なることになる。長い配列同士ほど、高温で特異的にハイブリッドを形成する。一般に、緊縮条件は、特定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択する。Ｔｍは、標的配列に相補性のプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリッドを形成する（特定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下における）温度である。（標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％は平衡状態でふさがれる）。通常、緊縮条件は、塩濃度をｐＨ７．０乃至８．３で約１．０Ｍ Ｎａ＋イオン未満、通常約０．０１乃至１．０Ｍ Ｎａ＋イオンの濃度（又は他の塩）とし、温度を短いプローブ（例えば、１０乃至５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃とする条件である。また、緊縮条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもできる。高緊縮性ＰＣＲ増幅の場合、約６２℃の温度が通常であるが、高緊縮性アニーリング温度は、プライマーの長さ及び特異性に応じて約５０℃乃至約６５℃の範囲とすることができる。高及び低緊縮性増幅の代表的なサイクル条件には、９０乃至９５℃で３０乃至１２０秒間の変性相、３０乃至１２０秒間続くアニーリング相及び約７２℃で１乃至２分間の伸長相が含まれる。低及び高緊縮性増幅反応のプロトコル及び指針については、Ｉｎｎｉｓほか、（１９９０年）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．において入手可能である。
【００５６】
「〜に特異的に結合する」又は「〜に対し特異的な免疫反応性を示す」という語句は、抗体のことを指す場合、蛋白質、糖及び他の生体物質の不均一な集団の存在下に蛋白質又は他の抗原の存在を決定する結合反応のことを意味する。従って、所定のイムノアッセイ条件下において、特定の抗体は特定の抗原に選択的に結合するが、試料中に存在する他の分子とは有意な量で結合しない。そのような条件下で抗原に特異的に結合するには特定の抗原に対する特異性に関して選択された抗体が必要となる。各種イムノアッセイ方式を用いて特定抗原に対して特異的な免疫反応性を示す抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、抗原に対し特異的な免疫反応性を示すモノクロナール抗体を選択するのにルーチン的に用いられている。特異的な免疫反応性を測定するのに用いることができるイムノアッセイ方式および条件の解説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ（１９８８年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００５７】
「抗体」とは、抗原に特異的に結合し、認識する、免疫グロブリン遺伝子又はその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドのことを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。好ましい実施態様では、自己プライマー化ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質に特異的に結合する抗体を作製する。軽鎖はカッパ鎖とラムダ鎖とに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンと分類され、これらはそれぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを構成している。通常、抗体の抗原結合領域は結合の特異性及び親和性に最も重要である。
【００５８】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は同一の２対のポリペプチド鎖で構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１本の「重」鎖（約５０乃至７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識に関与する約１００乃至１１０個以上のアミノ酸からなる可変領域を構成している。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語はそれぞれ、こうした軽鎖及び重鎖のことを指す。
【００５９】
抗体は、例えば、完全な状態の免疫グロブリンとして、又は各種ペプチダーゼによる消化で生じたいくつかの特性のよく分かった断片として存在する。すなわち、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合の下流で抗体を消化することにより、それ自体ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に接合される軽鎖であるＦａｂの二量体のＦ（ａｂ）’２を生じる。このＦ（ａｂ）’２を緩和な条件下で還元してヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによってＦ（ａｂ）’２二量体はＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は本質的にはヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版１９９３年参照）。各種抗体断片は完全な状態の抗体の消化によって決定されるが、そのような断片が化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成することができることは、当業者であれば理解するであろう。従って、本明細書に用いている抗体という用語には、抗体全体の修飾により作製した抗体断片、又は組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成したもの（例えば、一本鎖Ｆｖ）、又はファージ・ディスプレイ・リイブラリ（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙほか、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：ｐ５５２−５５４（１９９０年））を用いて同定されたものも含まれる。
【００６０】
抗体（例えば、組換え、モノクロナール又はポリクロナール抗体）の調製には、当該分野で周知の多くの技術を用いることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：ｐ４９５−４９７（１９７５年）、Ｋｏｚｂｏｒほか、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：ｐ７２（１９８３年）、Ｃｏｌｅほか、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐ７７−９６、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５年）、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）並びにＧｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版１９８６年）を参照）。対象とする抗体の重及び軽鎖をコードしている遺伝子は細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクロナール抗体をコードしている遺伝子はハイブリドーマからクローニングされ、組換えモノクロナール抗体を作製するのに用いることができる。モノクロナール抗体の重及び軽鎖をコードしている遺伝子ライブラリはハイブリドーマ又は形質細胞から作製することもできる。重及び軽鎖遺伝子産物を無作為に組み合わせることにより異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールが得られる（例えば、Ｋｕｂｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版１９９７年）参照）。一本鎖抗体又は組換え抗体の作製技術（米国特許第４，９４６，７７８号及び同４，８１６，５６７号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体の作製に適用することができる。また、遺伝子導入マウス又は他の哺乳動物などの他の生物を用いてヒト化又はヒト抗体を発現させることもできる（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同５，５４５，８０６号、同５，５６９，８２５号、同５，６２５，１２６号、同５，６３３，４２５号、同５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓほか、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：ｐ７７９−７８３（１９９２年）、Ｌｏｎｂｅｒｇほか、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：ｐ８５６−８５９（１９９４年）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：ｐ８１２−１３（１９９４年）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄほか、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：ｐ８４５−５１（１９９６年）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：ｐ８２６（１９９６年）、並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：ｐ６５−９３（１９９５年）参照）。あるいは、ファージ・ディスプレイ・リイブラリを用いて、特定の抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロメリックＦａｂ断片を特定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙほか、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：ｐ５５２−５５４（１９９０年）、Ｍａｒｋｓほか、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：ｐ７７９−７８３（１９９２年）参照）。また、抗体は、二重特異性、即ち、２種の抗原を認識することができるようにすることもできる（例えば、国際公開第ＷＯ ９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒほか、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：ｐ３６５５−３６５９（１９９１年）及びＳｕｒｅｓｈほか、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：ｐ２１０（１９８６年）参照）。また、抗体はヘテロコンジュゲート、例えば、２つの共有結合した抗体、又は免疫毒素とすることもできる（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、国際公開第ＷＯ９１／００３６０号、同第ＷＯ９２／２００３７３号及びＥＰ０３０８９参照）。
【００６１】
一実施態様において、この抗体は「エフェクタ」部分と結合させる。このエフェクタ部分は診断アッセイ用の放射性標識又は蛍光標識などの標識部分を含む任意の数の分子とすることができる。
【００６２】
抗体に「特異的に（又は選択的に）結合する」又は「〜に対し特異的な（もしくは選択的な）免疫反応性を示す」という語句は、蛋白質又はペプチドのことを指す場合、しばしば蛋白質類及び他の生体物質類の不均一な集団において、その蛋白質の存在を決定する結合反応のことを意味する。従って、所定のイムノアッセイ条件下において、その特定の抗体は特定の蛋白質にバックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０乃至１００倍超、結合する。そのような条件下で抗体に特異的に結合するには特定の蛋白質に対する特異性に関して選択された抗体が必要となる。例えば、ＩｇＥ蛋白質に対するポリクロナール抗体、多型変異体、対立遺伝子、直系遺伝子及び保存的に修飾された変異体もしくはスプライス亜型又はこれらの部分は、ＩｇＥ蛋白質と特異的に免疫反応性を示し、他の蛋白質とは示さないポリクロナール抗体のみが得られるように選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を取り去ることにより達成することができる。特定の蛋白質と特異的に免疫反応性を示す抗体を選択するには各種のイムノアッセイ方式を用いることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、蛋白質と特異的に免疫反応性を示す抗体を選択するのにルーチン的に用いられている（例えば、特異的な免疫反応性を測定するのに用いることができるイムノアッセイ方式および条件の解説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）参照）。
【００６３】
「抗原」とは、抗体によって認識され、結合される分子、例えば、ペプチド、炭水化物、有機分子、又は糖脂質、糖蛋白質などのより複雑な分子である。抗体結合の標的である抗原の部分は抗原決定基であり、単一の抗原決定基に相当する小さな官能基はハプテンと呼ばれる。
【００６４】
「標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段によって検出可能な成分である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡによく用いられているようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン又は抗血清もしくはモノクロナール抗体が入手可能なハプテン及び蛋白質が挙げられる（例えば、配列番号２のポリペプチドは、例えばこのペプチドに放射性標識を組み込むことにより検出可能となり、このペプチドと特異的に反応する抗体を検出するのに用いることができる）。
【００６５】
「イムノアッセイ」という用語は、抗原に特異的に結合する抗体を用いるアッセイのことである。このイムノアッセイは、抗原を単離し、標的とし、及び／又は定量するために特定抗体の特異的結合性を利用すること特徴とする。
【００６６】
「担体分子」という用語は、Ｔ細胞によって認識される抗原決定基を含有する免疫原性分子のことを意味する。担体分子は蛋白質であってもよく、脂質であってもよい。担体蛋白質をポリペプチドに結合させることによってこのポリペプチドは免疫原性になる。担体蛋白質としては、キーホールリンペットヘモシアニン、カブトガニヘモシアニン及びウシ血清アルブミンが挙げられる。
【００６７】
「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫反応を非特異的に増強する物質である。アジュバントとしては、完全又は不完全フロイントのアジュバント、タイターマックスゴールドアジュバント、ミョウバン、及び細菌ＬＰＳが挙げられる。
【００６８】
「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」という用語は、本明細書では次の用語と同じ意味で用いている：〜と組み合わせる、〜に添加する、〜と混合する、〜上を通す、〜とインキュベートする、〜の上を流す、など。
【００６９】
ＩＩＩ． シアリルトランスフェラーゼ
ポリシアリルトランスフェラーゼはシアル酸残基を受容体基質に付加することができる酵素である。通常、ポリシアリルトランスフェラーゼは「プライミングされた基質」（即ち、その基質にシアル酸残基が結合した基質）にシアル酸残基を付加する。適切なシアル酸残基を付加してＰＳＴ活性のために受容体基質を「プライミングする」のには別のシアリルトランスフェラーゼを用いることができる。
【００７０】
Ａ． ＰＳＴポリペプチド
ＰＳＴ蛋白質はこれまでに同定されており、従って、当業者によって同定可能である。例えば、あるＰＳＴはｐｆａｍ０７３８８、α−２−８−ポリＳＴ、α−２，８−ポリシアリルトランスフェラーゼのコンセンサス配列とアラインメントさせることができる。例えば、Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｐＤ１９２−６（２００５年）を参照されたい。ｐｆａｍ０７３８８にアラインメントを示す他のＰＳＴ蛋白質も本発明に使用することができる。このα−２−８−ポリＳＴ、α−２，８−ポリシアリルトランスフェラーゼファミリーの蛋白質は、配列比較に基づいてそのように同定された一群の蛋白質である。例えば、Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ及びＶｉｍｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：ｐ１５３４９−１５３５９（２００３年）を参照されたい。他の実施態様では、短縮ＰＳＴ蛋白質は、ＣＡＺｙファミリーＧＴ３８のメンバーであるＰＳＴ蛋白質からの配列を含む。例えば、ＵＲＬ：ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／のＣｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．及びＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（１９９９年）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓサーバを参照されたい。ＰＳＴ蛋白質としては、α２，８−結合シアル酸残基のホモポリマー、α２，９−結合シアル酸残基のホモポリマー又はα２，８／α２，９−結合シアル酸残基のコポリマーを合成する蛋白質が挙げられる。
【００７１】
ＰＳＴ蛋白質は、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ又はＥ．ｃｏｌｉ細菌から単離することができる。これらのＰＳＴ蛋白質は、いずれも細菌系のメンバーのみを含む糖転移酵素ファミリーＧＴ−３８由来である。例えば、Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．ほか、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３２８：ｐ３０７−３１７（２００３年）を参照されたい。例示したＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ及びＥ．ｃｏｌｉの蛋白質はインビボで同一の構造体を作るが、これら２種の蛋白質は３３％の同一性を共有する。
【００７２】
Ｂ． シアリルトランスフェラーゼ
一部のシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、α−２，３シアリルトランスフェラーゼ活性及びα−２，８シアリルトランスフェラーゼ活性のうちの少なくとも１つを有する。その例は、例えば米国特許第６，５０３，７４４号及び米国特許第６，６９９，７０５号に開示されており、これらはあらゆる目的で本明細書に参考として援用されている。このようなシアリルトランスフェラーゼ蛋白質は、ＣＡＺｙファミリー４２のメンバーである。例えば、ＵＲＬ：ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／のＣｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．及びＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（１９９９年）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓサーバを参照されたい。これらの細菌性シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、２種のモチーフ：シアリルトランスフェラーゼモチーフＡ、ＤＶＦＲＣＮＱＦＹＦＥＤ／Ｅ及びこの配列の保存的修飾変異体並びにシアリルトランスフェラーゼモチーフＢ、ＲＩＴＳＧＶＹＭＣ及びこの配列の保存的修飾変異体を含む。一部の実施態様において、これらのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、シアリルトランスフェラーゼモチーフＡ ＤＶＦＲＣＮＱＦＹＦＥＤ又はＤＶＦＲＣＮＱＦＹＦＥＥ及びシアリルトランスフェラーゼモチーフＢ ＲＩＴＳＧＶＹＭＣを含む。例えば、あらゆる目的で本明細書に参考として援用されているＰＣＴ／ＣＡ２００５／００１４３２を参照されたい。これらの保存されたシアリルトランスフェラーゼモチーフは多数の細菌性シアリルトランスフェラーゼの分析によって同定されたものである。１８種のシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列がアラインメントされ、これらの保存されたシアリルトランスフェラーゼ配列モチーフＡ及びＢが目視検査により同定された。
【００７３】
例示的なシアリルトランスフェラーゼはＣ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣｓｔＩＩ蛋白質である。ここのファミリーのメンバーのシアリルトランスフェラーゼ蛋白質又は核酸は、以下のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株から単離することができる：ＯＨ４３８４（ジェンバンクアセッション番号ＡＲ２７１７００）、ＯＨ４３８２（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＲ２７１７０１、Ｏ：２３（ジェンバンクアセッション番号ＡＦ４０１５２９）、Ｏ：４１（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＲ２７１７０２）及びＨＢ９３−１３（ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＹ２９７０４７）。例えば、米国特許第６，５０３，７４４号及び米国特許第６６９９７０５号も参照されたい。これらの特許はあらゆる目的で本明細書に参考として援用されている。
【００７４】
一部の実施態様において、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは酵素活性に重要と思われる他のアミノ酸残基も含む。例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４由来のＣｓｔ−ＩＩの構造が解析された。（例えば、Ｃｈｉｕほか、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：ｐ１６３−１７０（２００４年）参照）。このＣｓｔ−ＩＩ酵素の突然変異解析によって、例えば、シアリルトランスフェラーゼモチーフＢのアルギニン残基は活性に必要であることが明らかとなった。ＯＨ４３８４蛋白質については残基番号が示されており、他のＣｓｔ−ＩＩ蛋白質の対応する残基は配列アラインメントによって決定することができる。例えば、あらゆる目的で本明細書に参考として援用されているＰＣＴ／ＣＡ２００５／００１４３２を参照されたい。シアリルトランスフェラーゼモチーフＢのアルギニン残基はＣｓｔ−ＩＩのＲ１２９といい、図１のシアリルトランスフェラーゼコンセンサス配列のＲ１６５と関連がある。触媒活性に重要と思われる他のアミノ酸残基としては、Ｃｓｔ−ＩＩ Ｙ１５６、Ｃｓｔ−ＩＩ Ｙ１６２及びＣｓｔ−ＩＩ Ｈ１８８が挙げられる。蛋白質活性に影響する他のアミノ酸についてはＰＣＴ／ＣＡ２００５／００１４３２で検討されている。
【００７５】
ＩＶ． ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸の単離
ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸としては、上記の完全長天然ＰＳＴポリペプチド及びこうした配列の酵素的に活性な短縮配列をコードしている核酸が挙げられる。本発明のＰＳＴポリペプチドは供与体基質からのシアル酸の受容体基質への転移を触媒し、その活性を測定するアッセイが本明細書に開示されている。
【００７６】
本明細書に開示した情報に基づく別のＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸類、及びこのような核酸類を得る方法については当業者には周知である。好適な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくは部分配列（プローブ））は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、転写増幅システム（ＴＡＳ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、自立的配列複製システム（ＳＳＲ：ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）などのインビトロでの方法によってクローニング又は増幅させることができる。多種多様なクローニング及びインビトロ増幅方法が当業者には公知である。多くのクローニング実習を通して当業者を指導するのに十分なこうした技術及び手引き書の例は、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ （Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、（Ｓａｍｂｒｏｏｋほか）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌほか編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（１９９４年補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎほか、米国特許第５，０１７，４７８号；並びにＣａｒｒ、ヨーロッパ特許第０，２４６，８６４号にみられる。
【００７７】
標準的な分子生物学の手法（例えば、ＰＣＲ）を用いて任意の既知ＰＳＴ配列の短縮配列を作製することができる。
【００７８】
ＰＳＴポリペプチド又はその部分配列もしくは短縮配列をコードしているＤＮＡは、上述の任意の適切な方法（これには、例えば、適切な配列のクローニング及び制限酵素による制限が含まれる）によって調製することができる。一実施態様において、ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸をルーチン的なクローニング方法により単離する。ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１のＰＳＴをコードしている核酸配列である。核酸配列を用いることによって、（例えば、サザンブロット又はノーザンブロットにおいて）ゲノムＤＮＡサンプル中のＰＳＴポリペプチドをコードしている遺伝子と、又は全ＲＮＡサンプル中のＰＳＴポリペプチドをコードしているｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成するプローブを得ることができる。ＰＳＴポリペプチドをコードしている目的の核酸を一旦特定すれば、これを当業者に周知の標準的な方法に従って単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；又はＡｕｓｕｂｅｌほか、（１９８７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。更に、単離した核酸は制限酵素で切断することによって完全長のＰＳＴポリペプチド又はその部分配列もしくは短縮配列（例えば、ＰＳＴポリペプチドの触媒ドメインの少なくとも部分配列をコードしている部分配列を含む短縮配列）を作製することができる。次いで、ＰＳＴポリペプチド又はその部分配列をコードしているこうした制限酵素諸断片は結合させることができる。
【００７９】
ＰＳＴポリペプチド又はその部分配列をコードしている核酸は、その発現産物をアッセイすることにより特性化することができる。その発現蛋白質の物理的、化学的又は免疫学的性質の検出に基づいたアッセイを用いることができる。例えば、この核酸によりコードされている蛋白質の、供与体基質のシアル酸の適切な受容体基質への転移を触媒する能力によって、クローン化ＰＳＴポリペプチドを同定することができる。一方法では、キャピラリー電気泳動を用いることにより反応生成物を検出する。この高感度のアッセイは、Ｗａｋａｒｃｈｕｋほか、（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：ｐ２８２７１−２７６に記載されているような、フルオレセインで標識した単糖又は二糖アミノフェニル誘導体を使用するものである。ポリシアリルトランスフェラーゼ活性をアッセイするために、基質としてはＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥ、Ｇａｌ−β−ｌ，３−ＧａｌＮＡｃ−α−ＦＣＨＡＳＥ（Ｔ−Ａｇ−ＦＣＨＡＳＥ）又はＮｅｕＡｃ−α−２，３−Ｇａｌ−β−ｌ，３−ＧａｌＮＡｃ−α−ＦＣＨＡＳＥを用いることができる。例えば、米国特許第６，５０３，７４４号を参照されたい。この特許は本明細書に参考として援用されている。一部の実施態様では、別のシアリルトランスフェラーゼを用いてこの反応をプライミングすることができる。オリゴ糖反応生成物の他の検出方法としては、薄層クロマトグラフィー及びＧＣ／ＭＳが挙げられ、本明細書に参考として援用されている米国特許第６，５０３，７４４号に開示されている。
【００８０】
また、ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸又はその部分配列は化学的に合成することができる。好適な方法としては、Ｎａｒａｎｇほか、（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：ｐ９０−９９の燐酸トリエステル法、Ｂｒｏｗｎほか、（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：ｐ１０９−１５１の燐酸ジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅほか、（１９８１年）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：ｐ１８５９−１８６２のジエチルホスホルアミダイト法、及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体担体法が挙げられる。化学合成では一本鎖オリゴヌクレオチドが作製される。これを、相補配列とのハイブリッド形成又はこの一本鎖を鋳型とするＤＮＡポリメラーゼによる重合によって二本鎖ＤＮＡに変換することができる。ＤＮＡの化学合成では約１００塩基の配列に限定されることが多いが、短い配列同士を結合させることによってさらに長い配列を得ることができることは、当業者によって認められよう。
【００８１】
ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸又はその部分配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を用いてクローニングすることができる。すなわち、例えば、１つの制限酵素部位（例えば、ＮｄｅＩ）を含むセンスプライマー及び別の制限酵素部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）を含むアンチセンスプライマーを用いて核酸又は部分配列をＰＣＲ増幅する。これにより目的のＰＳＴポリペプチド又は部分配列をコードし、末端に制限酵素部位を有する核酸が得られる。次いで、この核酸を適切な対応制限酵素部位を有する発現ベクターに容易に結合させることができる。好適なＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ又は他の供給源に備えられている配列情報を利用して当業者が決定することができる。ＰＳＴポリペプチド又はその蛋白質部分配列をコードしている核酸には部位特異的突然変異により適切な制限酵素部位を付加することもできる。ＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸配列又は部分配列を含有するプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断した後、適切なベクターに結合させて標準的な方法に従って増幅及び／又は発現させる。インビトロ増幅法を通して当業者を指導するのに十分な技術の例は、
【００８２】
【数１】
にみられる。
【００８３】
ＰＳＴ蛋白質は、適切なＤＮＡ配列、例えば細菌染色体からのＤＮＡ配列を増幅させることによって単離することができる。ＰＳＴ蛋白質をコードしている核酸を増幅するのに用いることができるＰＣＲプライマーの例としては、次のプライマー対、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＳＴを増幅するためのプライマー：
５’−ＡＡＧＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧ及び３’−ＣＣＴＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＡＴＣＧＴＧＣ
が挙げられる。
【００８４】
特定の核酸から発現させた組換えＰＳＴポリペプチドの他の物理的性質を既知のＰＳＴポリペプチドの性質と比較することによって、受容体基質特異性及び／又は触媒活性を決定するＰＳＴポリペプチドの好適な配列又はドメインを特定する別の方法を得ることができる。あるいは、想定上のＰＳＴポリペプチドを変化させ、そのＰＳＴとしての役割又は特定配列又はドメインの役割を、変化させていない天然型又は対照ＰＳＴポリペプチドにより通常作られる炭水化物の構造の変動を検出することにより立証することができる。本発明のＰＳＴポリペプチドの突然変異又は修飾は、二機能性シアリルトランスフェラーゼポリペプチド又はＰＳＴポリペプチドをコードしている核酸を操作する分子生物学の技術（例えば、ＰＣＲ）によって容易にすることができることは、当業者によって認められよう。
【００８５】
Ｖ． 宿主細胞におけるＰＳＴポリペプチドの発現
本発明のＰＳＴ蛋白質は、Ｅ．ｃｏｌｉその他の細菌宿主及び酵母を含む種々の宿主細胞において発現させることができる。宿主細胞は、好ましくは、例えば酵母細胞、細菌細胞、糸状菌細胞などの微生物である。好適な宿主細胞としては、多くの中でも、例えば、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（例えば、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．が挙げられる。こうした細胞は、以下のものを含むいくつかの属のいずれかのものとすることができる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ（例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ及びＣ．ｈｕｍｉｃｏｌａ）、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ及びＰ．ｏｈｍｅｒｉ）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ（例えば、Ｔ．Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｔ．ｘｙｌｉｎｕｓ、Ｔ．ｆａｍａｔａ及びＴ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｄ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ、Ｄ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ及びＤ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ及びＺ．ｂａｉｌｉｉ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（例えば、Ｈ．ａｎｏｍａｌａ ａｎｄ Ｈ．ｊａｄｉｎｉｉ）、並びにＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｂ．ｌａｍｂｉｃｕｓ及びＢ．ａｎｏｍａｌｕｓ）。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
ＰＳＴポリペプチドを宿主細胞において一旦発現させると、これを用いてポリシアル化産物を作製することができる。例えば、ＰＳＴポリペプチドを標準的な蛋白質精製技術を用いて単離し、本明細書に記載したインビトロ反応に使用することによってポリシアル化産物を作製することができる。また、インビトロ反応に部分精製したＰＳＴポリペプチドを用いることによって、透過性宿主細胞が可能なように、ポリシアル化産物を作製することもできる。また、こうした宿主細胞をインビボ系（例えば、発酵生産）に用いることによりポリシアル化産物を作製することもできる。
【００８７】
通常、ＰＳＴポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞において機能するプロモータの制御下におく。極めて広い種類のプロモータが公知であり、具体的な用途に応じて本発明の発現ベクターに用いることができる。通常、選択されるプロモータはこのプロモータが活性を示すことになる細胞によって決まる。リボソーム結合部位、転写終結部位などの他の発現制御配列も任意選択的に含める。こうした制御配列を１種以上含む構築体は「発現カセット」と名付けられている。従って、本発明は、所望の宿主細胞において高レベルの発現を得るために融合蛋白質をコードしている核酸が組み込まれている発現カセットを提供する。
【００８８】
特定の宿主細胞において使用するのに好適な発現制御配列は、この細胞で発現される遺伝子をクローニングすることによって得られることが多い。リボソーム結合部位配列の他に、転写開始用プロモータを、任意選択的にオペレータと共に含むよう本明細書で定義しているよく用いられている原核細胞制御配列としては、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモータ系（Ｃｈａｎｇｅほか、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７年）１９８：ｐ１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系（Ｇｏｅｄｄｅｌほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０年）８：ｐ４０５７）、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３年）８０：ｐ２１−２５）並びにラムダ由来ＰＬプロモータ及びＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅほか、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１年）２９２：ｐ１２８）などの一般的なプロモータが挙げられる。特定のプロモータ系が本発明に不可欠であるのではなく、原核生物で機能する入手可能な任意のプロモータを用いることができる。
【００８９】
Ｅ．ｃｏｌｉ以外の原核生物においてＰＳＴ蛋白質を発現させるには、具体的な原核生物種において機能するプロモータが必要とされる。そのようなプロモータはその種からクローニングした遺伝子から得ることができ、又は異種プロモータを用いることができる。例えば、ｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータはＥ．ｃｏｌｉの他にＢａｃｉｌｌｕｓにおいて機能する。
【００９０】
本発明の発現カセットにはリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含ませるのが好都合である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＢＳは開始コドンの上流３乃至１１ヌクレオチドに位置する３乃至９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる（Ｓｈｉｎｅ及びＤａｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５年）２５４：ｐ３４；Ｓｔｅｉｔｚ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）、第 １巻、ｐ３４９、１９７９年、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＮＹ）。
【００９１】
酵母においてＰＳＴ蛋白質を発現させるための好都合なプロモータとしては、ＧＡＬ１−１０（Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＤａｖｉｅｓ（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：ｐ１４４０−１４４８）、ＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌほか、（１９８３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：ｐ２６７４−２６８２）、ＰＨＯ５（ＥＭＢＯＪ．（１９８２年）６：ｐ６７５−６８０）並びにＭＦα（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ及びＯｓｈｉｍａ（１９８２年）Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、Ｊｏｎｅｓ及びＢｒｏａｃｈ編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ｐ１８１−２０９）が挙げられる。酵母用の別の好適なプロモータはＣｏｕｓｅｎｓほか、Ｇｅｎｅ６１：ｐ２６５−２７５（１９８７年）に記載されているＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモータである。例えば真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の株（ＭｃＫｎｉｇｈｔほか、米国特許第４，９３５，３４９号）などの糸状菌の場合、有用なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、ＥＭＢＯ Ｊ．４：ｐ２０９３ ２０９９（１９８５年））、ｔｐｉＡプロモータなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓの解糖系遺伝子由来のものが挙げられる。好適なターミネータの例はＡＤＨ３ターミネータ（ＭｃＫｎｉｇｈｔほか）である。
【００９２】
本発明では構成的又は調節性プロモータを用いることができる。調節性プロモータは、宿主細胞を高密度に増殖させた後に融合蛋白質の発現を誘導することができるので、有利となり得る。異種蛋白質を高レベルで発現させると、状況によっては細胞増殖が遅くなる。誘導プロモータは、発現のレベルが、例えば温度、ｐＨ、嫌気的もしくは好気的条件、光、転写因子、化学物質などの環境的又は発生的要因によって変更可能である場合に遺伝子の発現を誘導するプロモータである。そのようなプロモータを本明細書では「誘導プロモータ」と称し、これによって糖転移酵素又はヌクレオチド糖合成に関与する酵素の発現のタイミングを制御することが可能となる。Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の細菌宿主細胞の誘導プロモータは当業者に周知である。これらのものとしては、例えば、ｌａｃプロモータ、バクテリオファージラムダＰＬプロモータ、ｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ（Ａｍａｎｎほか、（１９８３年）Ｇｅｎｅ ２５：ｐ１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒほか、（１９８３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：ｐ２１）、及びバクテリオファージＴ７プロモータ（Ｓｔｕｄｉｅｒほか、（１９８６年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、Ｔａｂｏｒほか、（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：ｐ１０７４−８）が挙げられる。これらのプロモータ及びその使用についてはＳａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献に記載されている。原核生物における発現用の特に好ましい誘導プロモータは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードしている遺伝子又は遺伝子群から得られるプロモータ成分（例えば、ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）からのプロモータ）に連結させたｔａｃプロモータ成分を含む二重プロモータである。この二重ｔａｃ−ｇａｌプロモータについてはＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に開示されている。
【００９３】
適切な宿主細胞に入れた場合にポリヌクレオチドの発現を駆動する遺伝子発現制御シグナルに動作可能なように連結させた対象ポリヌクレオチドを含む構築体は「発現カセット」と名付けられている。本発明の融合蛋白質をコードする発現カセットは、多くの場合、宿主細胞に導入するための発現ベクター中に配置する。通常、こうしたベクターは、発現カセットの他に、このベクターが１種以上の特定の宿主細胞中で独立に複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製することを可能にするものであり、複製起点又は自己複製配列を含む。このような配列は種々の細菌に関して公知である。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は多くのグラム陰性細菌に適している。あるいは、このベクターは、宿主細胞ゲノム相補体に組み込まれ、細胞がＤＮＡ複製を行う時に複製されることにより複製することができる。細菌細胞における上記酵素の発現用の好ましい発現ベクターはｐＴＧＫであり、これは二重ｔａｃ−ｇａｌプロモータを含んでおり、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９８／２０１１１号に開示されている。
【００９４】
ポリヌクレオチド構築物の構築では、一般に細菌において複製することができるベクターを用いることが必要である。細菌からのプラスミドの精製用に多くのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製ＥａｓｙＰｒｅｐＪ及びＦｌｅｘｉＰｒｅｐＪ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＪ、及びＱｉａｇｅｎ社製ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ参照）。次に、単離されて精製されたプラスミドをさらに操作して別のプラスミドを作製し、細胞に形質移入するのに用いることができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓにおけるクローニングも可能である。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるのに用いる発現ベクターには、多くの場合、選択マーカを組み込む。こうした遺伝子は、選択培地で増殖させる形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要な蛋白質などの遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子を含むベクターで形質転換しなかった宿主細胞はこの培地では生残しないことになる。代表的な選択遺伝子は、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンなどの抗生物質その他のトキシンに対する耐性を付与する蛋白質をコードする。あるいは、選択マーカは、栄養素要求性欠損を補完し、又は天然培地からは利用可能でない重要な栄養素を供給する蛋白質をコードすることができる（例えば、Ｂａｃｉｌｌｉのｄ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子）。多くの場合、このベクターは、例えばＥ．ｃｏｌｉ、又はこのベクターが宿主細胞に導入される前に複製される他の細胞において機能する１つの選択マーカを有することになる。いくつかの選択マーカが当業者に周知されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献に記載されている。
【００９６】
上記に列記した成分を１種以上含む好適なベクターの構築には上記で引用した文献に記載されているような標準的な連結技術を使用する。単離したプラスミド又はＤＮＡ断片を切断し、調整して所望の形態に再連結して必要なプラスミドを作製する。構築したプラスミドにおける配列の正確さを確認するために、制限エンドヌクレアーゼ消化及び／又は既知の方法による配列決定などの標準的な技術によってこうしたプラスミドを分析することができる。このような目的を達成するための分子クローニング技術は当該分野では周知である。組換え核酸の構築に適した多種多様なクローニング及びインビトロ増幅方法が当業者には公知である。多くのクローニング訓練を通して当業者を指導するのに十分なこうした技術及び手引き書の例は、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）並びにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌほか編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、（１９９８年補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）にみられる。
【００９７】
本発明の発現ベクターを構築するための出発原料として使用するのに好適な種々の一般的ベクターが当該分野で公知である。細菌におけるクローニングの場合、一般的ベクターとしては、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（商標）などのｐＢＲ３２２由来ベクター及びλファージ由来ベクターが挙げられる。酵母では、ベクターとしては酵母組み込みプラスミド（例えば、ＹＩｐ５）及び酵母複製プラスミド（ＹＲｐシリーズプラスミド）及びｐＧＰＤ−２が挙げられる。哺乳動物細胞における発現は、ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩ及びｐ９１０２３並びに溶解性ウィルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス及びバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えば、ウシパピローマウィルス）及びレトロウイルスベクター（例えば、マウスレトロウイルス）を含む種々の一般に入手可能なプラスミドを用いて達成することができる。
【００９８】
特定の宿主細胞にこれらの発現ベクターを導入する方法は特に重要なものではなく、そのような方法は当業者には周知である。例えば、これらの発現ベクターは、塩化カルシウム形質転換法によりＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞に、リン酸カルシウム処理又は電気穿孔法により真核細胞に導入することができる。他の形質転換法も適用できる。
【００９９】
発現を増強させるために翻訳共役を利用してもよい。この方法は、プロモータの下流に配置されている、翻訳系に固有の高度に発現される遺伝子に由来する上流の短い読み取り枠並びにリボソーム結合部位及びこれの数アミノ酸コドン後に続く終結コドンを利用するものである。この終結コドンの直前に第２のリボソーム結合部位があり、終結コドンの次に翻訳開始のための開始コドンがくる。この系はＲＮＡの２次構造を融解させ、その結果、翻訳の効率的な開始が可能となる。Ｓｑｕｉｒｅｓほか、（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：ｐ１６２９７−１６３０２を参照されたい。
【０１００】
ＰＳＴポリペプチドは細胞内に発現させることができ、又は細胞から分泌させることができる。細胞内発現は高収量をもたらすことが多い。必要に応じて、再生処置を行うことにより可溶性の活性融合蛋白質を増加させることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献、Ｍａｒｓｔｏｎほか、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４年）２：ｐ８００、Ｓｃｈｏｎｅｒほか、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５年）３：ｐ１５１参照）。ＰＳＴポリペプチドをペリプラズム又は細胞外培地に細胞から分泌させる実施態様では、そのＤＮＡ配列には切断可能なシグナルペプチド配列が連結させる。シグナル配列は細胞膜を通る融合蛋白質の移行を誘導する。プロモータ−シグナル配列単位を含むＥ．ｃｏｌｉ用の好適なベクターの例は、Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡプロモータ及びシグナル配列を有するｐＴＡ１５２９である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献、Ｏｋａほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５年）８２：ｐ７２１２、Ｔａｌｍａｄｇｅほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０年）７７：ｐ３９８８、Ｔａｋａｈａｒａほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５年）２６０：ｐ２６７０参照）。別の実施態様では、例えば精製、分泌又は安定性を促進するために、ＰＳＴ蛋白質をプロテインＡ又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の部分配列に融合させる。
【０１０１】
本発明のＰＳＴポリペプチドは、さらに他の細菌蛋白質に連結させることもできる。多くの場合、この方法では、正常な原核生物制御配列が転写及び翻訳を誘導するので、高収量がもたらされる。Ｅ．ｃｏｌｉでは、異種蛋白質を発現させるのにｌａｃＺ融合体を用いることが多い。ｐＵＲ、ｐＥＸ及びｐＭＲ１００シリーズ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献参照）などの好適なベクターは容易に入手できる。特定の用途のために、精製後の融合蛋白質から非ポリシアリルトランスフェラーゼ及び／又はアクセサリー酵素アミノ酸を切断することが望ましい場合がある。これは、臭化シアン、プロテアーゼ又は第Ｘａ因子による切断を含む当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって達成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上記文献、Ｉｔａｋｕｒａほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７年）１９８：ｐ１０５６、Ｇｏｅｄｄｅｌほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９年）７６：ｐ１０６、Ｎａｇａｉほか、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４年）３０９：ｐ８１０及びＳｕｎｇほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６年）８３：ｐ５６１）。切断部位は、融合蛋白質の遺伝子中に所望の切断点で作ることができる。
【０１０２】
単一発現ベクターに複数の転写カセットを配置することにより、又はクローニング方法に用いる発現ベクターの各々に対して種々の選択マーカを利用することにより単一宿主細胞に２種以上の組換え蛋白質を発現させることができる。例えば、シアリルトランスフェラーゼ（例えば、ＣＳＴ−ＩＩ蛋白質）及びＰＳＴポリペプチドを同じ宿主発現系において発現させることができる。次いで、このような宿主細胞の溶解産物又は精製シアリルトランスフェラーゼ及びＰＳＴポリペプチドを用いてシアル酸残基を転移させることができる。
【０１０３】
ＶＩ． ＰＳＴポリペプチドの精製
本発明の方法では、本発明のＰＳＴ蛋白質は、例えば細胞内蛋白質として又は細胞から分泌される蛋白質として、発現させることができ、この形態で用いることができる。例えば、本発明の方法では、発現された細胞内又は分泌ＰＳＴポリペプチドを含む細胞粗抽出液を用いることができる。
【０１０４】
あるいは、ＰＳＴポリペプチドは、硫安塩析、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該分野の標準的な方法に従って精製することができる（全般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２年）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０年）参照）。少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０％の均一性の実質的に純粋な組成が好ましく、９２、９５、９８乃至９９％以上の均一性が最も好ましい。こうした精製蛋白質は、例えば、抗体を産生させるための免疫原としても用いることができる。
【０１０５】
本発明のＰＳＴポリペプチドの精製を容易にするために、こうした蛋白質をコードする核酸に、親和性結合試薬が入手可能であるエピトープ又は「タグ」（即ち、精製タグ）のコーディング配列を含めることもできる。好適なエピトープの例としてはｍｙｃ及びＶ−５レポータ遺伝子が挙げられ、これらのエピトープを有する融合蛋白質の組換え生産に有用な発現ベクターが市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ及びｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓは哺乳動物細胞における発現用に適している）。本発明のＰＳＴポリペプチドにタグを結合させるのに適した別の発現ベクター及び対応する検出系が当業者に周知であり、いくつかは市販されている（例えば、ＦＬＡＧ”（Ｋｏｄａｋ社、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ））。好適なタグの別の例は、金属キレート親和性リガンドに結合することができるポリヒスチジン配列である。通常、６個の隣接ヒスチジンが使用されるが、６個より多いものや少ないものも使用することができる。ポリヒスチジンタグの結合部分の役目をすることができる好適な金属キレート親和性リガンドとしては、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．（１９９０年）“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ａｄｓｏｒｂｅｎｔｓ”、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｑｉａｇｅｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）から市販）が挙げられる。他の精製又はエピトープタグとしては、例えば、ＡＵｌ、ＡＵ５、ＤＤＤＤＫ（ＥＣ５）、Ｅ ｔａｇ、Ｅ２ ｔａｇ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、６残基ペプチド、ポリオーマミドルＴ蛋白質由来ＥＹＭＰＭＥ、ＨＡ、ＨＳＶ、ＩＲＳ、ＫＴ３、Ｓ ｔａｇｅ、Ｓ１ ｔａｇ、Ｔ７ ｔａｇ、Ｖ５ ｔａｇ、ＶＳＶ−Ｇ、βガラクトシダーゼ、Ｇａｌ４、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ、プロテインＣ、プロテインＡ、セルロース結合蛋白質、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ステップタグ、Ｎｕｓ−Ｓ，ＰＰＩアーゼ、Ｐｆｇ２７、カルモデュリン結合蛋白質、ｄｓｂ Ａ及びその断片並びにグランザイムＢが挙げられる。エピトープペプチド及びエピトープ配列に特異的に結合する抗体は、例えば、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ａｂｃａｍ Ｌｔｄ．及びＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。
【０１０６】
精製タグとして、マルトース結合ドメイン及び澱粉結合ドメインも挙げられる。精製タグを含む蛋白質は、精製タグを結合する結合パートナー（例えば精製タグに対する抗体、ニッケルもしくはコバルトイオン又は樹脂及びアミロース、マルトース又はシクロデキストリン）を用いて精製することができる。また、精製タグとして、澱粉結合ドメイン、Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンドメイン（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．及びＡｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から市販されているベクター及び抗体）、並びにＳＵＭＯ蛋白質のカルボキシ末端半分（Ｌｉｆｅ Ｓｅｎｓｏｒｓ Ｉｎｃ．から市販されているベクター及び抗体）も挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来マルトース結合ドメイン、Ａ．ｎｉｇｅｒのアミラーゼ由来ＳＢＤ（澱粉結合ドメイン：ｓｔａｒｃｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）などの澱粉結合ドメインについては、本明細書に参考として援用されている国際公開第ＷＯ９９／１５６３６号に開示されている。ベータシクロデキストリン（ＢＣＤ）誘導体化樹脂を用いた澱粉結合ドメインを含む融合蛋白質の親和性精製については、国際公開第２００５／０１４７７９号に開示されており、その全体が本明細書に参考として援用されている。一部の実施態様において、ＰＳＴポリペプチドは２種以上の精製又はエピトープタグを含む。
【０１０７】
タグとして使用するのに適した他のハプテンについては当業者には周知であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）に記載されている。例えば、ジニトロフェノール（ＤＮＰ：ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン、バルビツール酸塩（例えば、米国特許第５，４１４，０８５号参照）及び数種のフルオロフォアがこれらの化合物の誘導体と同様にハプテンとして有用である。ハプテンその他の部分を蛋白質その他の分子に連結するためのキットが市販されている。例えば、ハプテンがチオールを含む場合、ＳＭＣＣのようなヘテロ二官能性リンカーを用いて捕捉試薬に存在するリジン残基にタグを結合させることができる。
【０１０８】
ＰＳＴポリペプチドの触媒又は機能ドメインをその生物活性を減じることなく修飾することができることは、当業者によって認められるであろう。触媒ドメインのクローニング、発現又は溶融蛋白質中への組込みを容易にするために部分的に修飾することができる。このような修飾は当業者には公知であり、例えば、触媒ドメインをコードしているポリヌクレオチドのいずれか一方の末端にコドンを付加して、例えば、アミノ末端にメチオニンを付加して開始部位を形成し、又はいずれか一方の末端に追加的なアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を配置して好都合な位置にある制限酵素部位もしくは終止コドンもしくは精製配列を作ることが挙げられる。
【０１０９】
ＶＩＩ． 供与体基質及び受容体基質
本発明の方法においてＰＳＴポリペプチド及び他の糖転移酵素により利用される好適な供与体基質としては、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ並びにＣＭＰ−シアル酸及び他の活性化シアル酸部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｇｕｏほか、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．６８：ｐ１−２０（１９９７年）。
【０１１０】
通常、ＰＳＴ酵素の受容体基質は、α−２，８結合で第２のシアル酸を付加するためのα−２，３結合の末端シアル酸、又はα−２，８結合で１個以上のシアル酸部分を付加するためのα−２，８結合の末端シアル酸を含む。
【０１１１】
第１のシアル酸付加のための受容体基質としては、例えば、α−２，３結合でシアル酸部分を付加するための末端ガラクトースが挙げられる。通常、ＰＳＴ酵素の受容体基質は、α−２，８結合で第２のシアル酸を付加するためのα−２，３結合の末端シアル酸、又はα−２，８結合で１個以上のシアル酸部分を付加するためのα−２，８結合の末端シアル酸を含む。好適な受容体の例としては、β１，４結合によりＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃに結合した末端Ｇａｌ及びＧｌｃＮＡｃもしくはＧａｌＮＡｃにβ１，３結合した末端Ｇａｌが挙げられる。好適な受容体としては、例えば、Ｇａｌβｌ，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβｌ，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβｌ，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体及び当業者に周知の他の受容体が挙げられる。ガラクトース部分が結合する末端残基はこれ自体、例えば、Ｈ、単糖、オリゴ糖又は少なくとも１つの炭水化物原子を有するアグリコンに結合することができる。一部の実施態様において、受容体残基は、例えば、ペプチド、蛋白質、脂質又はプロテオグリカンに結合しているオリゴ糖の一部分である。
【０１１２】
ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド及び本発明の方法によって利用される好適な受容体基質としては、多糖及びオリゴ糖が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載したポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを多酵素系に用いることによって好都合な出発原料から所望の産物を生成させることができる。
【０１１３】
ＰＳＴポリペプチド及び本発明の方法によって利用される好適な受容体基質として、蛋白質、脂質、ガングリオシド、及び本発明の方法により修飾することができる他の生物学的構造（例えば、細胞全体）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。通常、こうした受容体基質は上記の多糖又はオリゴ糖分子を含むことになる。
【０１１４】
本発明は、オリゴ糖、所望のオリゴ糖部分を有する糖蛋白質及び糖脂質の生成能から選択されるＰＳＴポリペプチドを提供する。同様に、所望の活性化糖基質又は産物オリゴ糖に存在する糖に基づいて、アクセサリー酵素（存在する場合）（例えば、基質に適切なシアル酸を付加することにより反応をプライミングすることができるシアリルトランスフェラーゼ）を選択する。
【０１１５】
糖蛋白質の合成の場合、種々の量の対象ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド（例えば、０．０１乃至１００ｍＵ／ｍｇ蛋白質）を、この対象ポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質によるグリコシル化のための受容体となる可能性のある部位を有するオリゴ糖が連結している糖蛋白質（例えば、１乃至１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させることによって好適なポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを容易に特定することができる。本発明の組換えポリシアリルトランスフェラーゼ蛋白質の所望受容体部位における糖類残基の付加能に関して、所望の性質（例えば、受容体基質特異性又は触媒活性）を有する既知のポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドと比較する。
【０１１６】
一般に、ポリシアル化オリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質の酵素合成の有効性は、本発明の組換え生成短縮型ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを用いることによって高めることができる。組換え技術を用いることにより、大規模なインビトロでのオリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質の修飾に必要な短縮型でより可溶性のポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを大量に作製することが可能となる。
【０１１７】
一部の実施態様において、本発明のポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド及び方法により利用されるのに好適なオリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質は、グリコシル化反応時に固体担体に固定化した糖蛋白質及び糖脂質とすることができる。「固体担体」という用語は、半固体担体をも包含する。一部の実施態様では、標的糖蛋白質又は糖脂質は、グリコシル化反応が完了した後に糖蛋白質又は糖脂質をそれぞれ放出させることができるように可逆性に固定化する。多くの好適なマトリックスが当業者に周知である。例えば、イオン交換を利用して、グリコシル化反応が進行している間、適切な樹脂上に糖蛋白質又は糖脂質を一時的に固定化することができる。対象の糖蛋白質又は糖脂質に特異的に結合するリガンドを親和性に基づく固定化のために用いることもできる。例えば、糖蛋白質に特異的に結合する抗体が好適である。また、対象の糖蛋白質がそれ自体抗体であるかその断片を含む場合には、プロテインＡ又はＧを親和性樹脂として用いることができる。対象糖蛋白質又は糖脂質に特異的に結合する色素及び他の分子も好適である。
【０１１８】
受容体糖が完全長の糖蛋白質の短縮型である場合、一部の実施態様では、これはその完全長の糖蛋白質の生物活性部分配列を含む。生物活性部分配列の例としては、酵素活性部位、リセプター結合部位、リガンド結合部位、抗体の相補性決定領域及び抗原の抗原性領域が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
ＶＩＩＩ． ポリシアル化産物の作製
ＰＳＴポリペプチドを用いて、インビトロ反応混液中に、又はインビボ反応によって、例えば、ＰＳＴポリペプチドをコードしているヌクレオチドを含む組換え微生物の発酵性増殖によってポリシアル化産物を作製することができる。
【０１２０】
Ａ． インビトロ反応
ＰＳＴポリペプチドを用いて、インビトロ反応混液中にポリシアル化産物を作製することができる。こうしたインビトロ反応混液には、ＰＳＴポリペプチド、部分精製ＰＳＴポリペプチド又は精製ＰＳＴポリペプチドを含む透過性微生物、並びに供与体基質、受容体基質及び適切な反応緩衝液を含ませることができる。インビトロ反応の場合、ＰＳＴポリペプチドなどの組換え糖転移酵素蛋白質、受容体基質、供与体基質及び他の反応混液成分を水性反応媒体中で混合することにより化合させる。所望のＰＳＴ産物に応じて、別の糖転移酵素をＰＳＴポリペプチドと組み合わせて用いることができる。この媒体のｐＨ値は、一般に約５乃至約８．５である。媒体は、媒体がｐＨ値を所望のレベルに維持する能力に基づいて選択する。従って、一部の実施態様では、媒体を約７．５のｐＨ値に緩衝化する。緩衝液を使用しない場合は、媒体のｐＨは、使用する具体的な糖転移酵素に応じて、約５乃至８．５に維持するべきである。ＰＳＴポリペプチドの場合、このｐＨ範囲は約５．５乃至８．０に維持する。
【０１２１】
酵素の量又は濃度は、触媒作用の初速度の指標である活性単位で表す。１活性単位は、所与の温度（通常、３７℃）及びｐＨ値（通常、７．５）における毎分１μｍｏｌの産物の形成を触媒する。従って、１０単位の酵素は、１０μｍｏｌの基質を３７℃の温度及び７．５のｐＨ値において１分で１０μｍｏｌの産物に変換する酵素の触媒量である。
【０１２２】
反応混液には２価の金属陽イオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋）を含めることができる。また、反応媒体は、必要に応じて、可溶化界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ又はＳＤＳ）及びメタノール、エタノールなどの有機溶媒を含むこともできる。酵素は、溶液中単独で利用してもよいし、ポリマーなどの担体に結合させてもよい。従って、反応混液は、最初は実質的に均一であるが、反応中にいくらかの沈澱物が形成されることがある。
【０１２３】
上記のプロセスを実施する温度は氷点のすぐ上から最も感受性の高い酵素が変性する温度の範囲とすることができる。この温度範囲は、好ましくは約０℃乃至約４５℃、より好ましくは約２０℃乃至約３７℃である。
【０１２４】
そのようにして形成した反応混液は、所望の高収量のポリシアル化産物を得るのに十分な時間維持する。大規模調製の場合、反応は、約０．５乃至２４０時間、より典型的には約１乃至３６時間進行させることになることが多い。
【０１２５】
Ｂ． インビボ反応
ＰＳＴポリペプチドを用いて、インビボ反応、例えば、ＰＳＴポリペプチドを含む組換え微生物の発酵性増殖によりポリシアル化産物を作製することができる。組換え微生物の発酵性増殖は、受容体基質及び供与体基質又は供与体基質の前駆体（例えば、ガラクトース又はＧａｌＮＡｃ）を含む媒体の存在下に行うことができる。例えば、Ｐｒｉｅｍほか、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：ｐ２３５−２４０（２００２年）を参照されたい。こうした微生物は受容体基質及び供与体基質又は供与体基質の前駆体を取り込み、この生細胞内で供与体基質の受容体基質への付加が行われる。この微生物は、受容体基質の取り込みを、例えば、糖輸送蛋白質を発現させることにより、容易にするよう改造することができる。例えば、ラクトースが受容体糖である場合、ＬａｃＹ透過酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を用いることができる。他の方法を用いて受容体糖の分解を低減させ、又は供与体糖又は供与体糖の前駆体の産生を増加させることができる。一部の実施態様では、宿主微生物を操作することによってポリシアル化産物の生成を増強する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでは、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素を欠く宿主株（ＮａｎＡ−）用いることによってシアル酸の分解をできるだけ少なくすることができる。（Ｅ．ｃｏｌｉでは、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素は分解酵素であるように思われる。）また、Ｅ．ｃｏｌｉでは、ラクトースが、例えば、受容体糖又はポリシアル化産物合成の中間体である場合、ＬａｃＺ−である宿主細胞を用いることでラクトースの分解を最小限に抑えることができる。シアル酸含有オリゴ糖を含むオリゴ糖のインビボ合成の方法については、例えば、Ｓａｍａｉｎ及びＰｒｉｅｍ 国際公開第ＷＯ／２００１／００４３４１号（２００１年）並びにＪｏｈｎｓｏｎほか 国際公開第ＷＯ／２００６／０３４２２５号（２００６年）に記載されている。
【０１２６】
一部の実施態様では、インビボのポリシアル化系は、シアリルトランスフェラーゼを含むことにより本発明のＰＳＴのためのプライミングされた基質をもたらすこともできる。
【０１２７】
Ｃ． ポリシアル化産物の特性化及び単離
ポリシアル化産物の生成は、例えば、所望の産物の生成が行われたことを確認することによって、又は受容体基質のような基質が減少したことを確認することによって監視することができる。オリゴ糖などのポリシアル化産物が、例えばろ紙もしくはＴＬＣプレートを用いるクロマトグラフィーなどの技術を用いて、又はマススペクトロメトリー、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメトリーもしくはＮＭＲスペクトロメトリーによって同定することができることは、当業者によって認められよう。ポリシアル化産物の同定方法については当業者に周知であり、例えば、あらゆる目的で本明細書に参考として援用されている米国特許第６，６９９，７０５号、及びＶａｒｋｉほか、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１７章（Ａｕｓｕｂｅｌほか編、１９９３年）に記載されている。
【０１２８】
一部の実施態様では、本発明のＰＳＴポリペプチド及び方法を用いて実質的に均一なグリコシル化パターンを有する糖蛋白質又は糖脂質を酵素的に合成する。こうした糖蛋白質及び糖脂質としては、糖型の変更が所望される、蛋白質、糖蛋白質、脂質又は糖脂質に単糖又はオリゴ糖が結合したものが挙げられる。この単糖又はオリゴ糖は糖転移酵素の受容体基質として機能することができる構造を含む。受容体基質がグリコシル化されると、所望のオリゴ糖部分が形成される。この所望のオリゴ糖部分は、それが結合する糖蛋白質又は糖脂質に所望の生物活性を付与する部分である。本発明の成分において、予め選択された単糖残基は、対象の受容体となる可能性のある部位の少なくとも約３０％に連結される。より好ましくは、この予め選択された単糖残基は、対象の受容体となる可能性のある基質の少なくとも約５０％、さらにより好ましくは対象の受容体となる可能性のある基質の少なくとも７０％に連結される。出発糖蛋白質又は糖脂質が対象のオリゴ糖部分において不均一性を示す（例えば、出発糖蛋白質又は糖脂質のオリゴ糖の一部が対象の受容体基質に結合した予め選択された単糖残基を既に有する）場合、記載した百分率にはそのような予め結合された単糖残基が含まれる。
【０１２９】
「変更された」という用語は、本発明のＰＳＴポリペプチド及び方法の適用後に、元々産生された糖蛋白質にみられるのとは異なるグリコシル化パターンを有する対象の糖蛋白質又は糖脂質のことを指す。そのような複合糖質の例は、糖蛋白質の糖型が、生物の細胞により産生され、その生物に固有の糖蛋白質に存在する糖型と異なる糖蛋白質である。また、ポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、並びに糖蛋白質及び糖脂質を酵素的に合成するためにそのような蛋白質を使用する方法であって、複合糖質のグリコシル化パターンがその天然の複合糖質が産生される細胞と同じか異なる種のものとすることができる宿主細胞により元々産生された複合糖質のグリコシル化パターンと比べて修飾されている方法も提供する。
【０１３０】
グリコシル化パターンの相違は、糖蛋白質及び糖脂質の構造分析によるばかりではなく、複合糖質の１種以上の生物活性の比較によっても評価することができる。例えば、「変更された糖型」を有する糖蛋白質には、非修飾糖蛋白質と比較してグリコシル化反応後の糖蛋白質の１種以上の生物活性に改善を示すものが含まれる。例えば、変更された複合糖質には、本発明のポリシアリルトランスフェラーゼポリペプチド及び方法の適用後に、対象リガンドもしくはリセプターに対する結合親和性の増大、治療半減期の延長、抗原性の低下及び特定組織へのターゲッティングを示すものが含まれる。観察される改善の大きさは、統計的に有意であることが好ましく、より好ましくは少なくとも約２５％の改善であり、さらにより好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、９０％又は９５％である。
【０１３１】
ＰＳＴポリペプチドを用いて作製された産物は精製することなく使用することができる。しかしながら、グリコシル化糖を回収するために、標準的な公知技術、例えば、薄層もしくは厚層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は膜ろ過を利用することができる。また、例えば、本発明の譲受人に譲渡されたオーストラリア特許第７３５６９５号に記載されているナノろ過又は逆浸透膜を用いる膜ろ過を利用してもよい。別の例として、膜が約１，０００乃至約１０，０００ダルトンの分画分子量を有する膜ろ過を利用して蛋白質を除去することができる。別の例として、次に、ナノろ過又は逆浸透を利用して塩を除去することができる。ナノろ過膜は、１価の塩は通すが、多価の塩及び使用する膜に応じて約２００乃至約１，０００ダルトンより大きな非荷電溶質を保持する逆浸透膜の部類である。従って、例えば、本発明の成分及び方法により作製されるオリゴ糖は膜内に保持することができ、夾雑塩は通過することになる。
【０１３２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の原文において用いられている単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」及び「ｔｈｅ（前記）」は、文脈上明らかに別の意味に解すべき場合を除き、複数も対象に含むことに留意されたい。従って、例えば、「ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（核酸）」という表現には複数のそのような核酸が含まれ、「ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ポリヌクレオチド）」という表現には１種以上のポリペプチド及び当業者に周知のその均等物が含まれる、などである。
【０１３３】
本明細書に記載した刊行物は、もっぱら本願の出願日以前の開示内容に関して提供されている。本明細書に記載のどの刊行物も、本発明が先行発明に基づくそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、示された発刊日は実際の発刊日と異なる可能性があり、これについては別途確認が必要となる。全ての引用文献は本明細書に参考として援用されている。
【実施例】
【０１３４】
種々の天然ポリシアリルトランスフェラーゼ（ＰＳＴ）蛋白質はポリシアリルトランスフェラーゼ活性を有している。本実験ではポリシアリルトランスフェラーゼ活性に必要なＰＳＴのコア構造並びにＰＳＴ蛋白質の修飾と関連付けられる酵素活性及び可溶性の大幅な改善について確認する。
【０１３５】
（実施例１）
ＰＳＴのＮ末端短縮化
以下の実験はＰＳＴ−１３（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来完全長シアリルトランスフェラーゼへのＮ末端ＭａｌＥ融合体）の短縮化産物にもとづくものである。このＰＳＴ蛋白質のＮ末端を分析すると、これは比較的多数の塩基性及び芳香族性残基からなることが分かった（最初の１４個のアミノ酸中６個がリジンである）。
【０１３６】
２種の短縮化、即ち、１９残基短縮化（下記に下線を付けたＭで示した）及び３２残基短縮化（下記に下線を付けたＲで示した）を行った。
ＮＨ２−ＭＬＫＫＩＫＫＡＬＦＱＰＫＫＦＦＱＤＳＭＷＬＴＴＳＰＦＹＬＴＰＰＲＮＮＬＦＶＩＳＮＬＧＱＬＮＱＶＱＳＬＩＫ．．． （配列番号６）
これら２種の短縮型はＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰｓｔΔｌ９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰｓｔΔ３２）である。
【０１３７】
（実施例２）
短縮型ＰＳＴの可溶性評価
これら２種の短縮型蛋白質の可溶性を完全長の親蛋白質と比較するために、これらの構築体をＥ．ｃｏｌｉ ＡＤ２０２に形質転換し、１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ＹＴ培地中で増殖させた。この培養液に約０．１のＯＤ６００で一夜培養物を接種した。細胞は２００ｒｐｍで振盪しながら約２時間３７℃で増殖させることによりＯＤ６００が０．２乃至０．５に達した。培養物を０．５μＭ ＩＰＴＧで誘導し、２００ｒｐｍで振盪しながら約２４時間２０℃でインキュベートした。最終ＯＤ６００は約４乃至５であった。細胞を採取し、溶解させて遠心分離した。ＰＳＴ構築体を過剰発現する溶解細胞のペレット及び上清を収集して分析した。
【０１３８】
図１に示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、いずれの変異体も十分に発現したことが分かる。ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）構築体の発現のレベルはより高かったが、２種の短縮型は、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）構築体とは対照的に、２７，０００×ｇ上清中にほとんど完全に留まり、これらがより可溶性であることが分かった。以下の反応条件を用いてＧＴ３−ＦＣＨＡＳＥ基質において活性のアッセイを行った：０．５ｍＭ ＧＴ３−ＦＣＨＡＳＥ、５０ｍＭ ＮａＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡＣ、１０％酵素、３７℃５分間。（図２に示した）ＣＥ分析から分かるように、短縮型は活性があった。酵素の１／１０希釈液を用いて２７，０００×ｇ上清についてアッセイを繰り返し、直接比較した（図３）。図３に示した結果は、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）が両短縮型よりも活性が高かったことを示している。
【０１３９】
（実施例３）
短縮型ＰＳＴ蛋白質の精製
相対比活性を測定するために、３種の蛋白質を全て先ず親和性クロマトグラフィーにより精製した。２７，０００×ｇ上清５ｍＬを８ｍＬのアミロースカラムに通し、１０ｍＭマルトースで溶出させた。３種の蛋白質全てからのクロマトグラムはほとんど同一のようにみえる。従来、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）は、膜上に沈殿するため遠心分離によって濃縮するのが困難であった。短縮型が同じように挙動するかどうかを調べるために、各精製蛋白質５ｍＬをＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて２５分間遠心分離した。１．５ｍＬまで濃縮したＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）の場合、典型的な白色沈殿が膜上に生じた。ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴΔｌ９）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴΔ３２）膜上には極めて少量の沈殿物が存在したが、親蛋白質と到底同じ程度ではなく、短縮型は同じ時間で０．８ｍＬまで濃縮することができた。これらの酵素の蛋白質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）により測定した後、各３μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした（図１５）。両短縮型は親蛋白質よりも高度に精製されたが、ＰＳＴ−２９（ＭａｌＥ−ＰＳＴΔｌ９）は最も純度が高いように思われた。
【０１４０】
精製した短縮化タンパク質の相対比活性を測定するために、各タンパク質５０ｎｇを、各ＰＳＴの５０ｎｇ／μＬ溶液を作製した後、ＧＴ３−ＦＣＨＡＳＥとの反応に酵素１μＬを加えることで、（上記の反応条件の）反応に加えた。これらの２種の短縮型酵素が高濃度であるため、酵素間で正確な活性比較を行うには希釈する必要があった。図５から明らかなように、試験条件下では、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）は２種の短縮型タンパク質の活性よりほぼ３倍高い活性を示す。
【０１４１】
（実施例４）
短縮型ＰＳＴの可溶性分析
短縮型の可溶性を試験するために、各２７，０００×ｇ上清５ｍＬを１００，０００×ｇで４℃６０分間遠心分離した。ペレットを５ｍＬの緩衝液に再懸濁して直接上清と比較した。図６に示したように、各サンプル３μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。３通りの場合の全てにおいて、酵素の多くはペレットを形成したように思われた。しかしながら、活性の分析から（図７）、ペレットに対して上清に存在する酵素の相対量は２種の短縮型でより高く、実際にはＰＳＴ−３０の活性は上清とペレットとの間でほぼ等しく分布することが分かる。こうした酵素の可溶性によって、これらの酵素は、より複雑な基質（例えば、オリゴ糖、糖蛋白質及び糖脂質）の修飾用試薬として用いるのに魅力的な候補となる。
【０１４２】
（実施例５）
ＰＳＴの安定性分析
蛋白質をアミロース親和性クロマトグラフィーにより精製し、グリセロールを添加及び無添加の下、４℃又は−２０℃に維持した。活性のアッセイを上記のようにして行い、ＣＥにより分析して残存活性を時間の関数として求めた。図８、９及び１０に示したように、ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）標品は、４℃で２週間まで貯蔵したとき、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）よりも活性が高かった。２０％グリセロールを添加すると、ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）標品及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）標品の活性は同程度に維持された。
【０１４３】
（実施例６）
短縮型ＰＳＴによる糖蛋白質のポリシアル化
第ＩＸ因子は完全長ＰＳＴでポリシアル化することができる。種々の供給源からのＰＳＴは第ＩＸ因子を種々の程度にポリシアル化することができた。ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）によるシアル化の比較を図１１に示した。等量のＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を反応液に添加した。ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を、第ＩＸ因子に第１のシアル酸残基を付加するのに用いられる二重特異性シアリルトランスフェラーゼのＣＳＴ−８９と併用すると、第ＩＸ因子の全てがシアル化を示す高分子量物質へと基質転換した（図１１）。この高分子量物質はポリシアル化第ＩＸ因子に相当する。何故なら、これが、Ｈａｎｎｏｖｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ （Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したポリシアル酸特異的モノクロナール抗体７３５に対して免疫反応性を示したからである。こうした結果から、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のより可溶性の短縮型ＰＳＴは、第ＩＸ因子をポリシアル化型へほぼ完全に変換することから明らかなように、治療的基質に対してより高い活性を有することが分かる。
【０１４４】
漸増量のＰＳＴをＩＩＩ型フェチュインを基質としてアッセイした。９ｍｇのＩＩＩ型フェチュインを８４６ｍＵのＣＳＴ−８１（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来Ｃｓｔ−ＩＩ）で処理してＰＳＴ酵素の二シアル化基質を形成させた。次いで、この二シアル化ＩＩＩ型フェチュインを陰イオン交換により精製した（蛋白回収率は約３８％であった）。
【０１４５】
漸増量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ酵素：ＰＳＴ−１３（ＭａｌＥ−完全長ＰＳＴ）及びＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）を用いてアッセイを行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＳＴ酵素ＰＳＴ−０５もアッセイした。１ｍｇ／ｍＬの「ジ−シアリル−フェチュイン」５０μｇを３０℃で５０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ ８、１０ｍＭ ＭｇＣ１２、７．８ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ中、精製ＰＳＴ蛋白質１、５、１０又は１５μｇとインキュベートした。サンプルを５分、１時間、２時間、４時間及び一夜の後に採取し、−８０℃に設置して反応をとめた。各酵素に対してフェチュイン及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを対照としなかった。サンプルは、先ず８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、この場合、各反応液２．５μＬをサンプル緩衝液で希釈し、３７℃で約１０分間変性させた。
【０１４６】
次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルについて、８個のＮｅｕＡｃより長いポリシアル酸を検出するモノクロナール抗体ｍＡｂ７３５を用いて免疫ブロッティングを行った。この一次抗体ｍＡｂ７３５をブロッキング緩衝液で１：７５００に希釈し、これにブロットを４℃で一夜インキュベートした。結合抗体をヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ社）で検出した。次いで、ブロットを、ルミノール試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）と６０秒間インキュベートした後、Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘライトフィルム（Ｓｉｇｍａ社）を２乃至１０秒間露光させることにより分析した。免疫ブロッティングの結果は図１２に示した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ酵素ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）は、完全長のＮｅｉｓｓｅｒｉａ酵素ＰＳＴ−１３を上回る最も高い活性を示した。また、Ｅ．ｃｏｌｉのＰＳＴ蛋白質は、ポリシアル酸（ＰＳＡ）をもたらしたが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ酵素よりも低いレベルではあった。
【０１４７】
比較（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）アッセイを行って第ＩＸ因子、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＥＰＯ）で産生させたヒトエリスロポエチン、トランスフェリン及びフェチュインに対するＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）ポリシアル化活性を測定した。先ず、これらの糖蛋白質基質をＣ．ｊｅｊｕｎｉ由来ＣｓｔＩＩ蛋白質とインキュベートしてポリシアリルトランスフェラーゼの適切な基質を作製した。３０℃で２時間反応を行い、得られた二シアル化基質糖蛋白質を１ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラム及び漸増勾配のＮＨ４ＨＣＯ３を用いて約ｐＨ７．５で精製した。
【０１４８】
５０μｇの第ＩＸ因子、ＥＰＯ、トランスフェリン及び１ｍｇ／ｍＬのフェチュインを反応緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び７．８ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）中３０℃で０．５時間、２時間、５時間及び一夜、５μｇ及び１５μｇの精製ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）とインキュベートした。これらの各時点でサンプルを取りだし、−８０℃に置いて反応を止めた。アッセイした各糖蛋白質に対して対照（即ち、糖蛋白質不含又はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ不含）も組み込んだ。反応生成物（２．５μＬ）はサンプル緩衝液で希釈し、３７℃で約１０分間変性させ、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。こうしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは図１３に示した。
【０１４９】
次に、０．５時間及び一夜後のものについてウエスタンブロッティングにより分析した。０．５時間反応液の場合、１２０ｎｇの蛋白質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。一夜反応液の場合、３０ｎｇの蛋白質をロードした。ｍＡｂ７３５を用い、上記と同様にしてウエスタンブロッティングを行い、ポリシアル酸を検出した。結果は図１４に示した。短縮型Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＰＳＴ蛋白質ＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）はこれらの哺乳動物基質蛋白質：第ＩＸ因子、ＥＰＯ、トランスフェリン及びフェチュインのそれぞれをシアル化することができた。
【０１５０】
（実施例７）
ポリシアル酸鎖の長さに及ぼす糖蛋白質基質濃度の影響
種々の濃度のフェチュインを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中７μｇのＰＳＴ−３０（ＭａｌＥ−ＰＳＴ−Δ３２）及び１０ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと３０℃で０．５、１、２、４時間及び一夜インキュベートした。フェチュインが２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ中にあるので、濃度はその中により多くの塩を有する。各一夜反応液からの２．５μｇのフェチュインを上記と同様に８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。次いで、これらのサンプルを免疫ブロットにより分析した。その結果を図１５に示した。０．５ｈ、１ｈ及び一夜反応液のそれぞれからの２０ｎｇのフェチュインを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、上記と同様に免疫ブロットした。５ｍｇ／ｍＬフェチュイン基質を用いて得られた一夜反応液はより短いＰＳＡ鎖を有するばかりでなく、これらの鎖は全て長さがより均一である（０．５ｍｇ／ｍＬ反応液における長いスミアーとは対照的に、より密なバンドとして認められる）。
【０１５１】
（実施例８）
短縮型ＰＳＴのシアリルトランスフェラーゼへの融合
短縮型Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＰＳＴのＣＳＴ−ＩＩとの融合体は活性があり、ポリシアル化産物を作製するのに用いることができる。
【０１５２】
これまで本発明について、理解し易くするために説明および実施例によって少し詳しく述べてきたが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲を逸脱することなくこれに特定の変更および修正をおこなうことができることは、本発明の教示内容からして当業者には容易に理解されよう。
【０１５３】
非公式の配列表
【０１５４】
【化１】
【０１５５】
【化２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３又は配列番号５に対して９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリシアル酸トランスフェラーゼ（ＰＳＴ）ポリペプチドであって、供与体基質からシアル酸部分を受容体基質に転移させる、ＰＳＴポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１の１位から４９５位までのアミノ酸からなる完全長のＰＳＴポリペプチドよりも可溶性が高い請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１の１位から４９５位までのアミノ酸からなるアミノ酸配列を含まない請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項４】
ＭＢＰタグをさらに含む請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項５】
前記受容体基質が糖ペプチド、糖蛋白質、糖脂質又はガングリオシドである請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項６】
前記受容体基質が第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トランスフェリン及びフェチュインからなる群から選ばれる糖蛋白質である請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項７】
ポリシアル化産物糖を作製する方法であって、
ａ） 受容体基質をシアル酸部分含有供与体基質及び請求項１に記載のＰＳＴポリペプチドと接触させる工程、並びに
ｂ） 該シアル酸部分の該受容体糖への転移を生じさせることによって該ポリシアル化産物糖を作製する工程
を含む方法。
【請求項８】
ポリシアル化蛋白質又はペプチドを作製する方法であって、
ａ） 受容体基質をシアル酸部分含有供与体基質及び請求項１に記載のＰＳＴポリペプチドと接触させる工程、並びに
ｂ） 該シアル酸部分の該受容体糖への転移を生じさせることによって該ポリシアル化蛋白質又はペプチドを作製する工程
を含む方法。
【請求項９】
ポリシアル化糖脂質又はガングリオシドを作製する方法であって、
ａ） 受容体基質をシアル酸部分含有供与体基質及び請求項１に記載のＰＳＴポリペプチドと接触させる工程、並びに
ｂ） 該シアル酸部分の該受容体糖への転移を生じさせることによって該ポリシアル化糖脂質又はガングリオシドを作製する工程
を含む方法。
【請求項１】
配列番号３又は配列番号５に対して９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリシアル酸トランスフェラーゼ（ＰＳＴ）ポリペプチドであって、供与体基質からシアル酸部分を受容体基質に転移させる、ＰＳＴポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１の１位から４９５位までのアミノ酸からなる完全長のＰＳＴポリペプチドよりも可溶性が高い請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１の１位から４９５位までのアミノ酸からなるアミノ酸配列を含まない請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項４】
ＭＢＰタグをさらに含む請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項５】
前記受容体基質が糖ペプチド、糖蛋白質、糖脂質又はガングリオシドである請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項６】
前記受容体基質が第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トランスフェリン及びフェチュインからなる群から選ばれる糖蛋白質である請求項１に記載のＰＳＴポリペプチド。
【請求項７】
ポリシアル化産物糖を作製する方法であって、
ａ） 受容体基質をシアル酸部分含有供与体基質及び請求項１に記載のＰＳＴポリペプチドと接触させる工程、並びに
ｂ） 該シアル酸部分の該受容体糖への転移を生じさせることによって該ポリシアル化産物糖を作製する工程
を含む方法。
【請求項８】
ポリシアル化蛋白質又はペプチドを作製する方法であって、
ａ） 受容体基質をシアル酸部分含有供与体基質及び請求項１に記載のＰＳＴポリペプチドと接触させる工程、並びに
ｂ） 該シアル酸部分の該受容体糖への転移を生じさせることによって該ポリシアル化蛋白質又はペプチドを作製する工程
を含む方法。
【請求項９】
ポリシアル化糖脂質又はガングリオシドを作製する方法であって、
ａ） 受容体基質をシアル酸部分含有供与体基質及び請求項１に記載のＰＳＴポリペプチドと接触させる工程、並びに
ｂ） 該シアル酸部分の該受容体糖への転移を生じさせることによって該ポリシアル化糖脂質又はガングリオシドを作製する工程
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１５】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１５】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５２９８４６（Ｐ２０１０−５２９８４６Ａ）
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１１４６５（Ｐ２０１０−５１１４６５）
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１１５６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１４４８
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０９３４４５７１）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１１５６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５１４４８
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（５０９３４４５７１）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (1)
【Ｆターム（参考）】
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