酵素電極並びにこれを備える燃料電池及び酵素センサー
【課題】高い電圧と高電流密度を得ることができる酵素電極、並びに、当該酵素電極を備えた高性能な燃料電池及び酵素センサーを提供する。
【解決手段】電極と、酸化還元酵素と、前記電極−前記酸化還元酵素の間の電子伝達を媒介する電子メディエータと、を備える酵素電極であって、前記酸化還元酵素の補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を備え、前記電子メディエータは、下記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体（Ｒａ〜ＲｉはＨまたは置換基）からなる二座配位子が少なくとも１つオスミウムに配位したオスミウム錯体であることを特徴とする、酵素電極、並びにこれを備える燃料電池及び酵素センサー。
【解決手段】電極と、酸化還元酵素と、前記電極−前記酸化還元酵素の間の電子伝達を媒介する電子メディエータと、を備える酵素電極であって、前記酸化還元酵素の補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を備え、前記電子メディエータは、下記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体（Ｒａ〜ＲｉはＨまたは置換基）からなる二座配位子が少なくとも１つオスミウムに配位したオスミウム錯体であることを特徴とする、酵素電極、並びにこれを備える燃料電池及び酵素センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の酵素及びメディエータを備える酵素電極、並びに該酵素電極を備える燃料電池及びセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、その高い基質特異性から種々の物質の存在量を測定する分析、例えば、酵素センサー等に利用されている。酵素を利用した酵素センサーとしては、例えば、分析の対象である対象物質（基質）と酵素との酸化還元反応により生じる電流を測定し、対象物質の定量を行うセンサーがある。具体的には、グルコースを酸化する酵素とグルコースとの間における酸化還元反応に伴って発生する電流が、グルコース濃度に比例することを利用したグルコースセンサーがある。
さらに、最近では、白金等の金属触媒に代わる燃料電池用新規触媒としても、酵素の研究開発が進められており、特にアノード用触媒（酸化反応触媒）として注目されている。このように、酵素と基質との酸化還元反応に伴い発生する電流を利用した酵素電極は、酵素センサーや燃料電池の他にも広範囲な分野においてその利用が期待されている。
【０００３】
酵素と電極間の電子の授受は一般的に起こりにくいため、酵素と電極間の電子伝達を媒介する電子メディエータによって促進されることが多い。電子メディエータは、基質を酸化した酵素から電子を電極へ輸送、又は、基質を還元する酵素へ電極から電子を輸送するものである。電子メディエータは、酵素と共に電解液中に混合、分散されるか、或いは、電極に固定等される。
【０００４】
電子メディエータとしては、種々の物質が用いられており、例えば、特許文献１にはイミダゾール環を有する二座配位子を含む遷移金属錯体、特許文献２には、ポリマー骨格と、該ポリマー骨格に共有結合したスペーサーと、特定の構造を有する複数の遷移金属錯体とを有し、該遷移金属錯体の配位子のうち少なくとも一つが前記スペーサーのいずれかに共有結合したポリマー遷移金属錯体が記載されている。
【０００５】
また、電子メディエータとしては、下記式（２）で表される２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅや、４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ（以下、４−ｄｍｂｐｙと略する場合がある）が配位したオスミウム錯体（Ｏｓ錯体）が知られている。
【０００６】
【化１】
【０００７】
また、非特許文献１には、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌレオチド）の電気化学的酸化を触媒するジアフォラーゼのメディエータとして、Ｏｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２Ｃｌとポリ−１−ビニルイミダゾールとの複合体を用いて構成した電極が記載されている。
【０００８】
【特許文献１】特表２００３−５１４８２３号公報
【特許文献２】特表２００３−５１４９２４号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００２（１０），１０２２−１０２３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
燃料電池の電位は、アノード、カソードでそれぞれ起こる反応の酸化還元電位で決定するものであり、熱力学的に決定される。高い電池電圧を得るためには、アノードで起こる反応とカソードで起こる反応の電位差を大きくする、すなわち、アノード側においては燃料から取り出された電子がアノードに伝達されるまでの電圧損失を小さくする必要がある。
【００１０】
電子メディエータを介して酵素−電極間の電子伝達が行われる酵素電極において得られる電極電位は、電子メディエータの酸化還元電位に依存する。ゆえに、アノード電極（基質酸化型酵素電極）においては電子メディエータの酸化電位が、当該電子メディエータに直接電子を渡す酵素の酸化還元電位より高い範囲内で低ければ低い（卑な電位）ほど、エネルギー損失は小さく、電池を組んだ場合に得られる電圧は高くなる。
【００１１】
また、電子メディエータを介して酵素−電極間の電子伝達が行われる酵素電極において得られる電流は、電子メディエータの酸化還元反応速度に依存する。すなわち、電子メディエータの酸化還元反応の速度が大きければ大きいほど酵素電極の電流は大きくなる。
【００１２】
従って、アノード電極として酵素電極（基質酸化型酵素電極）を備える燃料電池の場合、電子メディエータの酸化電位が低ければ低いほど、取り出せる電圧が高く、また、電子メディエータの酸化還元反応速度が大きければ大きいほど、電流密度が高く、優れた発電性能を示す。従って、アノード電極として酵素電極を備える燃料電池において、高性能な電子メディエータとは、酸化還元電位が低く、且つ、酸化還元反応速度が大きいものである。
また、得られる電流或いは電圧が大きい酵素電極を備える酵素センサーは、感度が高く、微量成分の検知が可能となる。
【００１３】
しかしながら、上記特許文献１及び２に記載の電子メディエータや、式（２）で表される配位子が配位したＯｓ錯体等、従来の電子メディエータは、酸化還元反応速度は大きいものの、酸化還元電位が高かったり、或いは、酸化還元電位は低いものの、酸化還元反応速度が小さかったり、アノード電極（基質酸化型酵素電極）の電子メディエータに求められる酸化還元反応速度と酸化還元電位を両立していない。
【００１４】
また、酵素電極をアノード側電極として備える燃料電池において、燃料である基質は、入手の容易さや安価であることが求められる。しかしながら、非特許文献１で用いられているジアフォラーゼは、ＮＡＤＨを基質とする酵素である。燃料電池においてＮＡＤＨをそのまま燃料として用いることは、コストが非常に高くなるため実用化が困難である。
そこで、ジアフォラーゼを用いる場合には、グルコース等の糖やアルコール、アルデヒド等を燃料とし、これら燃料を酸化するＮＡＤ依存性の酵素を併用することになる（図６参照）。その結果、アノード電極における酵素反応が少なくとも２段階となり、燃料電池には適用しにくいという問題が生じる。また、このように酵素による酸化還元反応が多段階に及ぶ酵素電極は、酵素センサーに利用した場合、各段階における酸化還元反応の影響を受け、センサーの精度の正確性が不十分となるおそれがある。以上のように、ジアフォラーゼを用いる酵素電極は燃料電池や酵素センサーには適していない。
【００１５】
本発明は、上記実情を鑑みて成し遂げられたものであり、高い電圧と高電流密度を得ることができる酵素電極を提供することを目的とする。また、当該酵素電極を備えた高性能な燃料電池及び酵素センサーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の酵素電極は、電極と、酸化還元酵素と、前記電極−前記酸化還元酵素の間の電子伝達を媒介する電子メディエータと、を備える酵素電極であって、前記酸化還元酵素の補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を備え、前記電子メディエータは、下記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体からなる二座配位子が少なくとも１つオスミウムに配位したオスミウム錯体であることを特徴とする。
【００１７】
【化２】
【００１８】
（式（１）において、Ｒａ〜Ｒiは、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ２、或いは、置換若しくは未置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキシアミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシルアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール又はアルキルのいずれかである。）
【００１９】
通常、電子メディエータの酸化還元電位と、酸化還元酵素の補酵素又は補欠分子族の酸化還元電位との差が小さくなる、すなわち、過電圧が小さくなると、電子メディエータの酸化還元反応速度は小さくなる傾向がある。つまり、得られる電流が小さくなる傾向がある。
これに対して、本発明の酵素電極において用いられる前記電子メディエータは、補欠分子族としてＰＱＱを有する酸化還元酵素と組み合わせることによって、酸化還元電位が卑、すなわち、過電圧が小さくなっても、酸化還元反応速度がそれほど減少しない。すなわち、本発明の酵素電極によれば、高電位且つ高電流密度が得られる。
【００２０】
前記オスミウム錯体が、配位性部位を有するポリマーの該配位性部位が該オスミウム錯体のオスミウムに配位しているか、又は、該オスミウム錯体の配位子にポリマーが結合することにより、ポリマー上に固定されている場合、電子メディエータである該オスミウム錯体の電極への固定が容易になるという利点がある。
前記オスミウム錯体を固定するポリマーとしては、スチレン／無水マレイン酸コポリマー、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（４−ビニルベンジルクロライド）コポリマー、ポリ（アリルアミン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）及びポリ（４−スチレンスルホネート）のいずれかが挙げられる。
【００２１】
前記オスミウム錯体には、上記式（１）のビピリジルアミン又はその誘導体のほかＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＯ、ＣＨ３ＣＯＯ、ＮＨ３、ＮＯ、ピリジン、イミダゾールより選ばれる少なくとも１つがオスミウムに配位していてもよい。
【００２２】
前記酸化還元酵素の基質としては、生物的栄養源となり得る化合物が挙げられ、アルコール、糖及びアルデヒドより選ばれる少なくとも１種が例示できる。
【００２３】
本発明の酵素電極は、燃料電池に用いることができ、具体的には、前記酵素電極をアノード電極として備え、燃料として前記酸化還元酵素の基質を供給する構成が挙げられる。
また、本発明の酵素電極は、酵素センサーに用いることも可能である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の酵素電極によれば、高電圧且つ高電流密度を得ることが可能である。従って、本発明の酵素電極を備える燃料電池は発電性能に優れるものである。また、本発明の酵素電極を備える酵素センサーは感度が高く、微量成分の検出も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の酵素電極は、電極と、酸化還元酵素と、前記電極−前記酸化還元酵素の間の電子伝達を媒介する電子メディエータと、を備える酵素電極であって、前記酸化還元酵素の補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を備え、前記電子メディエータは、下記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体からなる二座配位子が少なくとも１つオスミウムに配位したオスミウム錯体であることを特徴とする。
【００２６】
【化３】
【００２７】
（式（１）において、Ｒａ〜Ｒiは、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ２、或いは、置換若しくは未置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキシアミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシルアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール又はアルキルのいずれかである。）
【００２８】
例えば、燃料となる基質と、当該基質を酸化する酵素と、当該酵素において前記基質を酸化して生成した還元型の補酵素又は補欠分子族から電子を受け取り電極へ伝達する電子メディエータと、を備える酵素電極（基質酸化型電極）において、電子伝達反応の方向は、酸化還元電位が低い方から高い方へと進む。酸化還元電位は電子伝達体の電子の受け取りやすさ及び放出しやすさの尺度であり、酸化還元電位が高いものは電子を受け取りやすく、酸化還元電位が低いものは電子を放出しやすい。すなわち、基質を酸化して電子を受け取り、還元された酵素は、電子伝達体である電子メディエータに酸化され、電子を電子メディエータに渡す。そして、酵素より電子を受け取った還元型の電子メディエータは、電極へと電子を運搬する。
【００２９】
このような基質酸化型酵素電極を備える燃料電池において、得られる電圧は、ほぼ電子メディエータが電極へ電子を渡す、すなわち、電子メディエータの酸化電位と、当該酵素電極の対極との電位差である。従って、基質酸化型酵素電極を備える電池において、電子メディエータの酸化電位が低ければ低い（電子メディエータの酸化電位と酵素の補酵素又は補欠分子族の酸化電位との差ΔＥが小さければ小さい）ほど、得られる電圧は高くなる。
また、電子メディエータの酸化還元反応の速度が大きいほど、多くの電子が電極へと渡されるので、電流密度は高くなる。
【００３０】
しかしながら、従来、基質酸化型酵素電極において用いられてきた電子メディエータは、酸化電位が低い（ΔＥが小さい）ものは酸化還元反応速度が小さく、酸化還元反応速度が大きいものは酸化電位が高い（ΔＥが大きい）のが一般的であり、酸化電位が低く、且つ、酸化還元反応速度が大きいものはない。
【００３１】
従来用いられてきた電子メディエータとして、Ｏｓ錯体が挙げられる。Ｏｓ錯体の酸化還元電位は、Ｏｓ錯体の電子状態で決まり、Ｏｓ錯体の電子状態は配位子の種類によって決まる。Ｏｓ錯体からなる電子メディエータにおいて、酸化還元反応が起こる場、すなわち、電子のやり取りを行う場となるＯｓ原子に配位する配位子が変われば、Ｏｓ錯体の酸化還元電位も変わる。
そこで、本発明者らは、基質酸化型酵素電極（アノード電極）の電位を卑な方向にシフトさせるという目的を達成するため、Ｏｓ錯体の配位子の探索を行い、上記式（１）で表される二座配位子が少なくとも１つ配位したＯｓ錯体（以下、単に、本発明におけるＯｓ錯体、ということがある）の酸化電位が低いことに着目した。
そして、上記式（１）で表される二座配位子が配位したＯｓ錯体を、補欠分子族としてＰＱＱを有する酸化還元酵素と組み合わせて用いることによって、酸化電位が低くても、酸化還元反応速度が高く、優れた電子メディエータとして機能し、高い電流密度と大きな電位を発現する酵素電極が得られることを発見した。
【００３２】
以下、図１を用いて本発明の酵素電極について説明する。
図１は、本発明の酵素電極における電子伝達の概念図である。基質Ｓは、酸化還元酵素Ｅ（ｏｘ）によって酸化され生成物Ｐとなり、酸化型の酸化還元酵素Ｅ（ｏｘ）は、基質Ｓから電子が伝達され、還元型の酸化還元酵素Ｅ（ｒｅｄ）となる。電子を受け取った還元型の酸化還元酵素Ｅ（ｒｅｄ）は、酸化型電子メディエータＭ（ｏｘ）に電子を伝達し、酸化型電子メディエータは、還元型電子メディエータＭ（ｒｅｄ）になる。そして、還元型電子メディエータＭ（ｒｅｄ）により、電極（基質酸化型電極）へと電子が伝達される。
【００３３】
本発明の酵素電極は、まず、酸化還元酵素と電極間の電子伝達を媒介する電子メディエータとして、上記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体からなる二座配位子が少なくとも１つ、オスミウムに配位したオスミウム錯体を用いることを特徴とする。
【００３４】
上記式（１）で表される二座配位子において、Ｒａ〜Ｒｉは、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ２、或いは、置換若しくは未置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキシアミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシルアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール又はアルキルのいずれかであるが、中でも、上記式（１）で表される二座配位子のサイズをできるだけ小さくし、酵素とのアクセスビリティを向上する観点から、Ｒａ〜ＲｉのいずれもがＨであることが好ましい。
【００３５】
オスミウムに対する上記式（１）の二座配位子の配位数は、特に限定されず、１つ〜３つ配位させることができる。上記式（１）の二座配位子を複数配位させる場合、これら二座配位子は互いに異なっていてもよいし、同じでもよい。
本発明において、オスミウム錯体には、上記式（１）の二座配位子以外の配位子が配位していてもよい。例えば、配位性部位を有するポリマーが、該配位性部位においてオスミウム原子に配位していてもよい。ここで、配位性部位は、前記ポリマーの主鎖骨格の一部を形成するものでもよいし、或いは、主鎖骨格からスペーサーとなる化学構造を介して又は主鎖骨格に直接ペンダント状に結合した構造でもよい。例えば、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）やポリ（４−ビニルピリジン）は、それぞれイミダゾール基やピリジン基が一座配位子として機能可能であり、中心金属であるオスミウムに配位し得る。Ｏｓ錯体がポリマー上に固定されることによって、電子メディエータである当該Ｏｓ錯体を電極に固定することが容易となる。
【００３６】
オスミウム錯体がポリマー上に固定されている他の形態としては、該Ｏｓ錯体の配位子にポリマーが結合している形態が挙げられる。例えば、Ｏｓ錯体の配位子が有する反応性基と、ポリマーが有する反応性基とが反応し、共有結合した形態が挙げられる。このとき、ポリマーと配位子は、スペーサーとなる化学構造を介して結合していてもよい。
電子メディエータの電極への固定については、後で説明する。
【００３７】
上記Ｏｓ錯体を固定するポリマーとしては、スチレン／無水マレイン酸コポリマー、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（４−ビニルベンジルクロライド）コポリマー、ポリ（アリルアミン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）及びポリ（４−スチレンスルホネート）のいずれかが好ましい。中でも、Ｏｓ錯体に直接配位できるという観点から、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）、ポリ（４−ビニルピリジン）が好ましい。
【００３８】
また、オスミウム錯体におけるその他の配位子としては、例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＯ、ＣＨ３ＣＯＯ、ＮＨ３、ＮＯ、ピリジン、イミダゾールより選ばれる少なくとも１種が挙げられるが、これらに限定されず、その他の錯形成可能なものでもよい。配位子は、Ｏｓ錯体がポリマー上に固定されているかどうか（電子メディエータを酵素電極表面へ固定するか、それとも電解液へ分散するかどうか）、或いは、得られるＯｓ錯体の酸化還元電位等を考慮して、適宜選択すればよい。
【００３９】
本発明において用いられるオスミウム錯体として特に好ましいものとしては、下記式（３）、（４）で示されるものが挙げられる。
【００４０】
【化４】
【００４１】
【化５】
【００４２】
上記（３）、（４）のＯｓ錯体のうち、特にＯｓ（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２（４−ｃａｌｂｏｘｙｌ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）２［上記式（３−２）］、及びＰｏｌｙ（Ｎ−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ Ｏｓ（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２Ｃｌ（式（４））が好ましい。
【００４３】
ここで、本発明の酵素電極において用いられる電子メディエータの合成例として、上記式（３−４）に示したＯｓ（２，２'−ビピリジルジアミン）２（イミダゾール）２の合成方法について簡単に説明する。
まず、塩素原子が６配位したＯｓ錯体（ＯｓＣｌ６）を準備する。ＯｓＣｌ６と２，２’−ビピリジルアミンとを２００℃で２時間反応させる。その後、亜ジチオン酸塩を添加し、氷上で３０分間反応させると、Ｏｓに配位した塩素原子４つと二座配位子である２，２’−ビピリジルアミン２つとが置換される（Ｏｓ錯体中間体）。次に、得られたＯｓ錯体中間体をイミダゾールと２００℃で２時間反応させ、さらに、ＮＨ４ＰＦ６を添加し、反応させることで、Ｏｓに配位した塩素原子２つとイミダゾール２つとが置換されＯｓ（２，２'−ビピリジルジアミン）２（イミダゾール）２が得られる（式（５）参照）。
【００４４】
【化６】
【００４５】
また、上記式（４）に示したポリ（Ｎ−イミダゾール）とＯｓ錯体との複合体［Ｐｏｌｙ（Ｎ−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ Ｏｓ（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２Ｃｌ］の合成方法について説明する。
【００４６】
まず、（ＮＨ４）２［ＯｓＣｌ６］（１ｍｍｏｌ）と２．０当量の２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ（２ｍｍｏｌ）を、１，２−エタノジオール（１８ｍＬ）中で１時間、アルゴン雰囲気下還流する。冷却後、反応混合物を１Ｍ Ｎａ２Ｓ２Ｏ４ ３０ｍＬで処理する。得られる反応混合物を氷浴中で３０分間冷却し、沈殿するＯｓ錯体を冷水とジエチルエーテルで完全に洗浄し、バキューム乾燥させると、ｃｉｓ−［ＯｓＣｌ２（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２］が得られる。
次に、ポリ−１−ビニルイミダゾール（ＰＶＩ）と、上記にて得られたｃｉｓ−［ＯｓＣｌ２（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２］とを、エタノール２００ｍＬ中で二日間、ＰＶＩ（２００ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）と還流させ、ろ過し、得られた溶液を１．５Ｌのジエチルエーテル中に攪拌しながら注ぐことによって、ポリ−１−ビニルイミダゾール（ＰＶＩ）と、ｃｉｓ−［ＯｓＣｌ２（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２］との複合体を得ることができる。
【００４７】
本発明の酵素電極のもう一つの特徴は、補欠分子族としてＰＱＱ（式（６）、ピロロキノリンキノン）を有する酸化還元酵素（ＰＱＱ依存性酸化還元酵素）を備えることである。
ＰＱＱは、酸化電位が−０．１８４Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ２、飽和ＫＣｌ溶液）であり、式（１）で表される二座配位子が少なくとも１つ配位したＯｓ錯体は、酸化還元電位が−０．１５Ｖに非常に近いものが得られる。さらに、上記Ｏｓ錯体はＰＱＱとして有する補酵と組み合わせた場合、−０．１５Ｖ付近でも高い酸化還元反応速度を保持する。
【００４８】
【化７】
【００４９】
ＰＱＱ依存性の酸化還元酵素としては、デヒドロゲナーゼが挙げられる。具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルボースデヒドロゲナーゼ、アルカン−１−ｏｌデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ポリビニルアルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。中でも、燃料の普及、使いやすさの観点から、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼが好ましく用いられる。
【００５０】
本発明において、用いる酸化還元酵素は１種類に限定されず、２種類以上を組み合わせてもよい。また、酵素反応が２段階以上であってもよいが、燃料電池等への適用の容易さの点では、酵素反応は１段階であることが好ましい。
【００５１】
酸化還元酵素、電子メディエータは、電極反応である酸化還元反応が効率よく定常的に進行するように、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等の緩衝液によって、最適なｐＨ、例えば、ｐＨ７付近に維持されることが好ましい。
また、酸化還元酵素、電子メディエータは、電解溶液に溶解、分散させた状態で用いてもよいが、固定化材料によって電極表面に固定化されることが好ましい。酸化還元酵素、電子メディエータを電極に固定し、電極近傍にて酵素反応を進行させることによって、効率よく電極へ電子を伝達させることが可能となるからである。
【００５２】
酸化還元酵素、電子メディエータの電極への固定方法は特に限定されない。例えば、電子メディエータとして、上記したように、Ｏｓ錯体がポリマー上に固定された上記式（４）で表されるＰＶＩ−Ｏｓなどを用いる場合には、電極の基板となる導電体（例えば、カーボンシートなど）表面に、ＰＶＩ−Ｏｓを含有する溶液を滴下し、続いて、酸化還元酵素（ＧＤＨなど）を含む溶液を滴下し、さらに、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（以下、ＰＥＧＤＥ）等の架橋試薬を滴下することで、電子メディエータであるＰＶＩ−Ｏｓのポリビニルイミダゾール鎖にＰＥＧＤＥを介して酸化還元酵素を結合させ、乾燥させる方法が挙げられる。架橋試薬としては、一般的なものを用いることができ、ＰＥＧＤＥのほか、グルタルアルデヒド等を用いることもできる。
【００５３】
電子メディエータとして、Ｏｓ錯体がポリマー上に固定されていないものを用いる場合にも、酵素や電子メディエータ等を電極に固定化するために一般的に用いられているポリマーや架橋試薬を用いることができる。具体的には、ポリマーとして、ポリビニルイミダゾール、ポリアリルアミン、ポリアミノ酸、ポリピロール、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール等を用いることができる。また、架橋試薬としては、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド等を用いることができる。
【００５４】
電極反応が効率よく定常的に進行するようにするためには、酸化還元酵素、電子メディエータの温度も、例えば、２０〜３０℃程度に維持されていることが好ましい。
【００５５】
酸化還元酵素の基質としては、生物学的栄養源を広く利用することができ、例えば、炭水化物やその発酵生産物が挙げられ、特に、アルコール、糖及びアルデヒドが好ましく用いられる。具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、グリセリン、ポリビニルアルコール等のアルコール；グルコース、フルクトース、ソルボース等の糖類；ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド等のアルデヒド等が挙げられる。その他にも、脂肪類、タンパク質等の糖代謝の中間生成物等の有機酸、これら混合物などを用いることができる。
本発明の酵素電極を燃料電池用電極として用いる場合には、取り扱いが極めて容易であること、入手が容易であること、環境への負荷が小さいこと等の観点から、特にグルコース、アルコールが好適に用いられる。
【００５６】
電極としては、グラファイト、カーボンブラック、活性炭等の導電性炭素質からなるものや、金電極等を用いることができる。
【００５７】
以下、本発明の酵素電極を備える燃料電池の一形態例について説明する（図４参照）。
まず、ＰＱＱ依存性酸化還元酵素（ＰＱＱ−ＧＤＨ）が、燃料であるグルコース等の基質を酸化し、酸化還元酵素の補欠分子族であるＰＱＱが電子を受け取る。次に、電子を受け取ったＰＱＱは、電子メディエータであるＯｓ錯体に電子を受け渡し、当該Ｏｓ錯体により電極（アノード）へ電子が受け渡される。そして、アノードから外部回路を通ってカソードに電子が到達することで、電流が発生する。上記過程において発生するプロトン（Ｈ＋）は、プロトン伝導膜又はプロトン伝導膜のない電解液内をカソードまで移動する。
【００５８】
そして、カソードでは、電解液内を移動して到達したプロトンと、外部回路を経てアノード側から移動してきた電子と、酸素や過酸化水素等の酸化剤とが反応して水が生成される。カソードでは、酸化剤の還元反応に有効な触媒として、白金や白金合金等、燃料電池において電極触媒として一般的に用いられているものを用いることができる。白金や白金合金は、グラファイト、カーボンブラック、活性炭のような炭素質材料や、金等からなる電極に担持させたり、又は、白金や白金合金そのものからなる電極を用いることで、カソード触媒として用いることができる。或いは、ラッカーゼやビリルビンオキシターゼ等の公知の酵素を電極触媒として用い、導電性電極に固定、又は、電解液に含有させてもよい。
【００５９】
カソード電極における電極反応を妨害する不純物（例えば、アスコルビン酸、尿酸等）による影響を回避するために、ジメチルポリシロキサン等の酸素選択性の膜をカソード電極の周囲に配置してもよい。
【００６０】
上述したように、本発明の酵素電極は、燃料である基質の酸化電位と非常に酸化電位が近い電子メディエータを選択することができるため、アノード側半電池における酵素反応（電極反応）での電圧のロスが少なく、高電圧を得ることが可能である。さらには、高電圧が得られるにも関わらず、高電流密度を得ることも可能であるため、高電圧・高電流密度を発現する優れた燃料電池を提供することができる。
【００６１】
本発明の酵素電極は、燃料電池用電極の他、酵素センサー、酵素トランジスタ等に用いることができる。
本発明の酵素電極を酵素センサーに用いる場合、酵素と基質の酸化還元反応の進行によって、発生した電流又は電圧を検知することで、基質の存在の有無或いは濃度を測定することができる。本発明の酵素電極によれば、高電流密度及び高電圧が得られるため、感度の高い酵素センサーを提供することができる。本発明の酵素電極は、電子メディエータの酸化還元反応速度が大きいことから、当該酵素電極を備える酵素センサーは、電子メディエータの酸化還元反応が妨害種による妨害を受けにくく、測定精度が高いという利点もある。
【実施例】
【００６２】
（Ｏｓ錯体合成例）
表１に示す二座配位子（Ｌ１）と一座配位子（Ｌ２）とが各々２つずつ配位したＯｓ錯体（ａ）〜（ｊ）を以下のようにして合成した。
まず、塩素原子が６配位したＯｓ錯体（ＯｓＣｌ６）を準備した。次に、ＯｓＣｌ６と二座配位子（Ｌ１）とを２００℃で２時間反応させた。その後、亜ジチオン酸塩を添加し、氷上で３０分間反応させ、Ｏｓに配位した塩素原子４つと二座配位子（Ｌ１）とを置換した（Ｏｓ錯体中間体）。次に、得られたＯｓ錯体中間体を一座配位子（Ｌ２）と２００℃で２時間反応させ、さらに、ＮＨ４ＰＦ６を添加して反応させ、Ｏｓに配位した塩素原子２つと一座配位子（Ｌ２）２つとを置換し、Ｏｓ（Ｌ１）２（Ｌ２）２を合成した（式５参照）。
【００６３】
【表１】
【００６４】
（実施例１、比較例１〜２）
表２に示すように電子メディエータと酵素とを組み合わせて、電解液（モルホリノプロパンスルホン酸１００ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ2水溶液）中に分散させ、下記条件下、３電極式でサイクリックボルタンメトリーを行い、酸化還元電位及び酸化還元反応速度を調べた。
尚、試料極として炭素電極（グラッシーカーボン電極）、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ２、対極としてＰｔワイヤーを用いた。結果を図２に示す。図２中の番号は、表２中に表示した番号の酵素／Ｏｓ錯体／基質の組み合わせから得られたデータであることを示している。また、表２中の（ＰＦ6）2は、Ｏｓの電荷を中性にするためのカウンターイオンである。
【００６５】
＜試験条件＞
・温度：室温（約２０℃）
・電解液：ＭＯＰＳ ３０ｍＭ及びＣａＣｌ２ ３ｍＭを含む水溶液（ｐＨ７．０）
・燃料：グルコース１００ｍＭ
・サイクリックボルタンメトリー条件：掃引速度 ５ｍＶ／ｓｅｃ
掃引範囲 −４００ｍＶ〜４００ｍＶ
【００６６】
【表２】
【００６７】
図２において、横軸は、電子メディエータの酸化還元電位（Ｅｍｅｄ）と酸化還元酵素の酸化還元電位（Ｅｅｎｚ）の電位差（ΔＥ＝Ｅｍｅｄ−Ｅｅｎｚ）である。
比較例２の酸化還元酵素（ジアフォラーゼ）と電子メディエータとの組み合わせ［図２の（１１）〜（１５）］では、ΔＥが０．４Ｖ付近から、電位の低下と共に反応速度の低下が生じているのに対して、ＰＱＱ依存性酸化還元酵素（ＰＱＱ−ＧＤＨ）と、上記式（１）で表される二座配位子が配位したＯｓ錯体とを組み合わせた実施例１［図２の（１）〜（５）］は、ΔＥが０．４Ｖ以下となっても、ほぼ一定の反応速度を示し、ΔＥがゼロ近くなっても、高い反応速度を保持した。
一方、実施例１と同様、酸化還元酵素としてＰＱＱ−ＧＤＨを用い、上記式（１）の二座配位子とは異なる二座配位子が配位したＯｓ錯体を電子メディエータとして組み合わせた比較例１［図２の（６）〜（１０）］では、実施例１と同等の酸化還元反応速度を示す組み合わせもあったが、実施例１と比較して酸化還元電位が高かった。
【００６８】
以上の結果から、本発明の酵素電極における酸化還元酵素と電子メディエータとを組み合わせた実施例１は、比較例１及び比較例２と比べて、ΔＥが小さい、すなわち、電極反応における電圧ロスが少なく、且つ、反応速度が大きい、すなわち、電流密度が高いことがわかる。
【００６９】
（参考データ）
図７［Biochim. Biophys. Acta(1983) 744, 57 より引用］、及び、図８［J.Electroanal. Chem., (1992) 337, 253 及びAnal.Sci.(2001) 17,945 より引用］に示すデータから、酸化還元酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存性グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用い、様々な電子メディエータと組み合わせた場合に得られる酸化還元電位（ΔＥ）と酸化還元反応速度を算出した。得られたデータを図２に併せて示す。
【００７０】
尚、図７は、ＦＡＤ依存性ＧＯＤとキノン系電子メディエータとを組み合わせたデータ、図８は、ＦＡＤ依存性ＧＯＤと金属（Ｆｅ、Ｏｓ、Ｒｕ）錯体電子メディエータとを組み合わせたデータである。
図２に示すように、従来のＦＡＤ依存性ＧＯＤと電子メディエータとからなる組み合わせでは、比較例２同様、ΔＥが０．４Ｖ付近から、電位の低下と共に反応速度の低下が生じており、実施例１に劣ることがわかる。
【００７１】
（実施例２）
ＰＱＱ依存性酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性ＧＤＨ、電子メディエータとしてＯｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２ＣｌをＰｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と複合化したもの、を用いて酵素電極を構成し、以下のようにしてグルコースの酸化電流を測定した。結果を図３に示す。
【００７２】
＜酵素電極の作製＞
カーボンシート表面に、ポリ（１−ビニルイミダゾール）とＯｓ（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）２Ｃｌとの複合体（ＰＶＩ−Ｏｓ）の１０ｍｇ／ｍｌ水溶液を１０μｌ／ｃｍ２滴下した。次に、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の１００μＭリン酸緩衝溶液を１０μｌ／ｃｍ２滴下した。
さらに、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）の３ｍｇ／ｍｌ水溶液を１０μｌ／ｃｍ２滴下した。これを一晩放置して乾燥させ、ＰＶＩ−Ｏｓのポリビニルイミダゾール鎖にＰＥＧＤＥを介してＧＤＨを結合させると同時に、カーボンシート表面に、酵素であるＧＤＨとメディエータであるＰＶＩ−Ｏｓとを固定した。
図５に示すようにして、上記にて酵素と電子メディエータとを固定した酵素電極をナイロン製ネット及びＯリングにより先端に固定した試料極を作製した。
【００７３】
＜酸化電流の測定条件＞
［酵素電極の評価］
上記試料極を用いて、下記条件下、３電極式でサイクリックボルタンメトリーを行った。尚、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ２、対極としてＰｔワイヤーを用いた。
【００７４】
＜試験条件＞
・温度：室温（約２０℃）
・電解液：ＭＯＰＳ ３０ｍＭ及びＣａＣｌ２ ３ｍＭを含む水溶液（ｐＨ７．０）
・燃料：グルコース１００ｍＭ
・サイクリックボルタンメトリー条件：掃引速度 ５ｍＶ／ｓｅｃ
掃引範囲 −４００ｍＶ〜４００ｍＶ
【００７５】
（比較例３）
実施例２において、酵素としてＰＱＱ依存性ＧＤＨ、電子メディエータとしてＯｓ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）２ＣｌをＰｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と複合化したもの、を組み合わせた以外は、同様にして酵素電極を作製し、グルコースの酸化電流を測定した。結果をあわせて図３に示す。
【００７６】
図３に示すように、電子メディエータとしてＯｓ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）２ＣｌをＰｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と複合化したものを用いた比較例３の酵素電極と比較して、電子メディエータとしてＯｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２ＣｌをＰｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と複合化したものを用いた実施例２の酵素電極は、約−２００ｍＶの卑な電位から酸化電流が測定され、約１５０ｍＶの電位範囲まで高い電流密度が得られた。実施例２では、０〜４００ｍＶまでの電位範囲において、約−１０００μＡ／ｃｍ２という一定の高い電流密度を示した。約１５０ｍＶ以上の電位範囲においては、実施例２よりも比較例３の酵素電極の方が高い電流密度を示したが、より卑な電位において高い電流密度を示すということがアノード側電極に求められる条件であり、この点において、実施例２の酵素電極の優位性が確認できる。すなわち、本発明の酵素電極を用いることによって、高電圧、高電流密度が得られることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の酵素電極における電子伝達の概念図である。
【図２】実施例における結果を示すグラフである。
【図３】実施例における結果を示すグラフである。
【図４】本発明の酵素電極を備えた燃料電池の一形態例を示す概念図である。
【図５】実施例における酵素電極の作製方法を説明する図である。
【図６】ＮＡＤＨ以外の反応物質を燃料としてＮＡＤ依存型酵素とジアフォラーゼの２段階酵素反応で構成された酵素電極における電子伝達の概念図である。
【図７】Biochim. Biophys. Acta(1983) 744, 57 より引用したグラフである。
【図８】J.Electroanal. Chem., (1992) 337, 253 及びAnal.Sci.(2001) 17,945 より引用したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の酵素及びメディエータを備える酵素電極、並びに該酵素電極を備える燃料電池及びセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、その高い基質特異性から種々の物質の存在量を測定する分析、例えば、酵素センサー等に利用されている。酵素を利用した酵素センサーとしては、例えば、分析の対象である対象物質（基質）と酵素との酸化還元反応により生じる電流を測定し、対象物質の定量を行うセンサーがある。具体的には、グルコースを酸化する酵素とグルコースとの間における酸化還元反応に伴って発生する電流が、グルコース濃度に比例することを利用したグルコースセンサーがある。
さらに、最近では、白金等の金属触媒に代わる燃料電池用新規触媒としても、酵素の研究開発が進められており、特にアノード用触媒（酸化反応触媒）として注目されている。このように、酵素と基質との酸化還元反応に伴い発生する電流を利用した酵素電極は、酵素センサーや燃料電池の他にも広範囲な分野においてその利用が期待されている。
【０００３】
酵素と電極間の電子の授受は一般的に起こりにくいため、酵素と電極間の電子伝達を媒介する電子メディエータによって促進されることが多い。電子メディエータは、基質を酸化した酵素から電子を電極へ輸送、又は、基質を還元する酵素へ電極から電子を輸送するものである。電子メディエータは、酵素と共に電解液中に混合、分散されるか、或いは、電極に固定等される。
【０００４】
電子メディエータとしては、種々の物質が用いられており、例えば、特許文献１にはイミダゾール環を有する二座配位子を含む遷移金属錯体、特許文献２には、ポリマー骨格と、該ポリマー骨格に共有結合したスペーサーと、特定の構造を有する複数の遷移金属錯体とを有し、該遷移金属錯体の配位子のうち少なくとも一つが前記スペーサーのいずれかに共有結合したポリマー遷移金属錯体が記載されている。
【０００５】
また、電子メディエータとしては、下記式（２）で表される２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅや、４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ（以下、４−ｄｍｂｐｙと略する場合がある）が配位したオスミウム錯体（Ｏｓ錯体）が知られている。
【０００６】
【化１】
【０００７】
また、非特許文献１には、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌレオチド）の電気化学的酸化を触媒するジアフォラーゼのメディエータとして、Ｏｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２Ｃｌとポリ−１−ビニルイミダゾールとの複合体を用いて構成した電極が記載されている。
【０００８】
【特許文献１】特表２００３−５１４８２３号公報
【特許文献２】特表２００３−５１４９２４号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００２（１０），１０２２−１０２３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
燃料電池の電位は、アノード、カソードでそれぞれ起こる反応の酸化還元電位で決定するものであり、熱力学的に決定される。高い電池電圧を得るためには、アノードで起こる反応とカソードで起こる反応の電位差を大きくする、すなわち、アノード側においては燃料から取り出された電子がアノードに伝達されるまでの電圧損失を小さくする必要がある。
【００１０】
電子メディエータを介して酵素−電極間の電子伝達が行われる酵素電極において得られる電極電位は、電子メディエータの酸化還元電位に依存する。ゆえに、アノード電極（基質酸化型酵素電極）においては電子メディエータの酸化電位が、当該電子メディエータに直接電子を渡す酵素の酸化還元電位より高い範囲内で低ければ低い（卑な電位）ほど、エネルギー損失は小さく、電池を組んだ場合に得られる電圧は高くなる。
【００１１】
また、電子メディエータを介して酵素−電極間の電子伝達が行われる酵素電極において得られる電流は、電子メディエータの酸化還元反応速度に依存する。すなわち、電子メディエータの酸化還元反応の速度が大きければ大きいほど酵素電極の電流は大きくなる。
【００１２】
従って、アノード電極として酵素電極（基質酸化型酵素電極）を備える燃料電池の場合、電子メディエータの酸化電位が低ければ低いほど、取り出せる電圧が高く、また、電子メディエータの酸化還元反応速度が大きければ大きいほど、電流密度が高く、優れた発電性能を示す。従って、アノード電極として酵素電極を備える燃料電池において、高性能な電子メディエータとは、酸化還元電位が低く、且つ、酸化還元反応速度が大きいものである。
また、得られる電流或いは電圧が大きい酵素電極を備える酵素センサーは、感度が高く、微量成分の検知が可能となる。
【００１３】
しかしながら、上記特許文献１及び２に記載の電子メディエータや、式（２）で表される配位子が配位したＯｓ錯体等、従来の電子メディエータは、酸化還元反応速度は大きいものの、酸化還元電位が高かったり、或いは、酸化還元電位は低いものの、酸化還元反応速度が小さかったり、アノード電極（基質酸化型酵素電極）の電子メディエータに求められる酸化還元反応速度と酸化還元電位を両立していない。
【００１４】
また、酵素電極をアノード側電極として備える燃料電池において、燃料である基質は、入手の容易さや安価であることが求められる。しかしながら、非特許文献１で用いられているジアフォラーゼは、ＮＡＤＨを基質とする酵素である。燃料電池においてＮＡＤＨをそのまま燃料として用いることは、コストが非常に高くなるため実用化が困難である。
そこで、ジアフォラーゼを用いる場合には、グルコース等の糖やアルコール、アルデヒド等を燃料とし、これら燃料を酸化するＮＡＤ依存性の酵素を併用することになる（図６参照）。その結果、アノード電極における酵素反応が少なくとも２段階となり、燃料電池には適用しにくいという問題が生じる。また、このように酵素による酸化還元反応が多段階に及ぶ酵素電極は、酵素センサーに利用した場合、各段階における酸化還元反応の影響を受け、センサーの精度の正確性が不十分となるおそれがある。以上のように、ジアフォラーゼを用いる酵素電極は燃料電池や酵素センサーには適していない。
【００１５】
本発明は、上記実情を鑑みて成し遂げられたものであり、高い電圧と高電流密度を得ることができる酵素電極を提供することを目的とする。また、当該酵素電極を備えた高性能な燃料電池及び酵素センサーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の酵素電極は、電極と、酸化還元酵素と、前記電極−前記酸化還元酵素の間の電子伝達を媒介する電子メディエータと、を備える酵素電極であって、前記酸化還元酵素の補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を備え、前記電子メディエータは、下記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体からなる二座配位子が少なくとも１つオスミウムに配位したオスミウム錯体であることを特徴とする。
【００１７】
【化２】
【００１８】
（式（１）において、Ｒａ〜Ｒiは、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ２、或いは、置換若しくは未置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキシアミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシルアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール又はアルキルのいずれかである。）
【００１９】
通常、電子メディエータの酸化還元電位と、酸化還元酵素の補酵素又は補欠分子族の酸化還元電位との差が小さくなる、すなわち、過電圧が小さくなると、電子メディエータの酸化還元反応速度は小さくなる傾向がある。つまり、得られる電流が小さくなる傾向がある。
これに対して、本発明の酵素電極において用いられる前記電子メディエータは、補欠分子族としてＰＱＱを有する酸化還元酵素と組み合わせることによって、酸化還元電位が卑、すなわち、過電圧が小さくなっても、酸化還元反応速度がそれほど減少しない。すなわち、本発明の酵素電極によれば、高電位且つ高電流密度が得られる。
【００２０】
前記オスミウム錯体が、配位性部位を有するポリマーの該配位性部位が該オスミウム錯体のオスミウムに配位しているか、又は、該オスミウム錯体の配位子にポリマーが結合することにより、ポリマー上に固定されている場合、電子メディエータである該オスミウム錯体の電極への固定が容易になるという利点がある。
前記オスミウム錯体を固定するポリマーとしては、スチレン／無水マレイン酸コポリマー、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（４−ビニルベンジルクロライド）コポリマー、ポリ（アリルアミン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）及びポリ（４−スチレンスルホネート）のいずれかが挙げられる。
【００２１】
前記オスミウム錯体には、上記式（１）のビピリジルアミン又はその誘導体のほかＣｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＯ、ＣＨ３ＣＯＯ、ＮＨ３、ＮＯ、ピリジン、イミダゾールより選ばれる少なくとも１つがオスミウムに配位していてもよい。
【００２２】
前記酸化還元酵素の基質としては、生物的栄養源となり得る化合物が挙げられ、アルコール、糖及びアルデヒドより選ばれる少なくとも１種が例示できる。
【００２３】
本発明の酵素電極は、燃料電池に用いることができ、具体的には、前記酵素電極をアノード電極として備え、燃料として前記酸化還元酵素の基質を供給する構成が挙げられる。
また、本発明の酵素電極は、酵素センサーに用いることも可能である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の酵素電極によれば、高電圧且つ高電流密度を得ることが可能である。従って、本発明の酵素電極を備える燃料電池は発電性能に優れるものである。また、本発明の酵素電極を備える酵素センサーは感度が高く、微量成分の検出も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の酵素電極は、電極と、酸化還元酵素と、前記電極−前記酸化還元酵素の間の電子伝達を媒介する電子メディエータと、を備える酵素電極であって、前記酸化還元酵素の補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を備え、前記電子メディエータは、下記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体からなる二座配位子が少なくとも１つオスミウムに配位したオスミウム錯体であることを特徴とする。
【００２６】
【化３】
【００２７】
（式（１）において、Ｒａ〜Ｒiは、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ２、或いは、置換若しくは未置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキシアミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシルアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール又はアルキルのいずれかである。）
【００２８】
例えば、燃料となる基質と、当該基質を酸化する酵素と、当該酵素において前記基質を酸化して生成した還元型の補酵素又は補欠分子族から電子を受け取り電極へ伝達する電子メディエータと、を備える酵素電極（基質酸化型電極）において、電子伝達反応の方向は、酸化還元電位が低い方から高い方へと進む。酸化還元電位は電子伝達体の電子の受け取りやすさ及び放出しやすさの尺度であり、酸化還元電位が高いものは電子を受け取りやすく、酸化還元電位が低いものは電子を放出しやすい。すなわち、基質を酸化して電子を受け取り、還元された酵素は、電子伝達体である電子メディエータに酸化され、電子を電子メディエータに渡す。そして、酵素より電子を受け取った還元型の電子メディエータは、電極へと電子を運搬する。
【００２９】
このような基質酸化型酵素電極を備える燃料電池において、得られる電圧は、ほぼ電子メディエータが電極へ電子を渡す、すなわち、電子メディエータの酸化電位と、当該酵素電極の対極との電位差である。従って、基質酸化型酵素電極を備える電池において、電子メディエータの酸化電位が低ければ低い（電子メディエータの酸化電位と酵素の補酵素又は補欠分子族の酸化電位との差ΔＥが小さければ小さい）ほど、得られる電圧は高くなる。
また、電子メディエータの酸化還元反応の速度が大きいほど、多くの電子が電極へと渡されるので、電流密度は高くなる。
【００３０】
しかしながら、従来、基質酸化型酵素電極において用いられてきた電子メディエータは、酸化電位が低い（ΔＥが小さい）ものは酸化還元反応速度が小さく、酸化還元反応速度が大きいものは酸化電位が高い（ΔＥが大きい）のが一般的であり、酸化電位が低く、且つ、酸化還元反応速度が大きいものはない。
【００３１】
従来用いられてきた電子メディエータとして、Ｏｓ錯体が挙げられる。Ｏｓ錯体の酸化還元電位は、Ｏｓ錯体の電子状態で決まり、Ｏｓ錯体の電子状態は配位子の種類によって決まる。Ｏｓ錯体からなる電子メディエータにおいて、酸化還元反応が起こる場、すなわち、電子のやり取りを行う場となるＯｓ原子に配位する配位子が変われば、Ｏｓ錯体の酸化還元電位も変わる。
そこで、本発明者らは、基質酸化型酵素電極（アノード電極）の電位を卑な方向にシフトさせるという目的を達成するため、Ｏｓ錯体の配位子の探索を行い、上記式（１）で表される二座配位子が少なくとも１つ配位したＯｓ錯体（以下、単に、本発明におけるＯｓ錯体、ということがある）の酸化電位が低いことに着目した。
そして、上記式（１）で表される二座配位子が配位したＯｓ錯体を、補欠分子族としてＰＱＱを有する酸化還元酵素と組み合わせて用いることによって、酸化電位が低くても、酸化還元反応速度が高く、優れた電子メディエータとして機能し、高い電流密度と大きな電位を発現する酵素電極が得られることを発見した。
【００３２】
以下、図１を用いて本発明の酵素電極について説明する。
図１は、本発明の酵素電極における電子伝達の概念図である。基質Ｓは、酸化還元酵素Ｅ（ｏｘ）によって酸化され生成物Ｐとなり、酸化型の酸化還元酵素Ｅ（ｏｘ）は、基質Ｓから電子が伝達され、還元型の酸化還元酵素Ｅ（ｒｅｄ）となる。電子を受け取った還元型の酸化還元酵素Ｅ（ｒｅｄ）は、酸化型電子メディエータＭ（ｏｘ）に電子を伝達し、酸化型電子メディエータは、還元型電子メディエータＭ（ｒｅｄ）になる。そして、還元型電子メディエータＭ（ｒｅｄ）により、電極（基質酸化型電極）へと電子が伝達される。
【００３３】
本発明の酵素電極は、まず、酸化還元酵素と電極間の電子伝達を媒介する電子メディエータとして、上記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体からなる二座配位子が少なくとも１つ、オスミウムに配位したオスミウム錯体を用いることを特徴とする。
【００３４】
上記式（１）で表される二座配位子において、Ｒａ〜Ｒｉは、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ２、或いは、置換若しくは未置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキシアミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシルアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール又はアルキルのいずれかであるが、中でも、上記式（１）で表される二座配位子のサイズをできるだけ小さくし、酵素とのアクセスビリティを向上する観点から、Ｒａ〜ＲｉのいずれもがＨであることが好ましい。
【００３５】
オスミウムに対する上記式（１）の二座配位子の配位数は、特に限定されず、１つ〜３つ配位させることができる。上記式（１）の二座配位子を複数配位させる場合、これら二座配位子は互いに異なっていてもよいし、同じでもよい。
本発明において、オスミウム錯体には、上記式（１）の二座配位子以外の配位子が配位していてもよい。例えば、配位性部位を有するポリマーが、該配位性部位においてオスミウム原子に配位していてもよい。ここで、配位性部位は、前記ポリマーの主鎖骨格の一部を形成するものでもよいし、或いは、主鎖骨格からスペーサーとなる化学構造を介して又は主鎖骨格に直接ペンダント状に結合した構造でもよい。例えば、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）やポリ（４−ビニルピリジン）は、それぞれイミダゾール基やピリジン基が一座配位子として機能可能であり、中心金属であるオスミウムに配位し得る。Ｏｓ錯体がポリマー上に固定されることによって、電子メディエータである当該Ｏｓ錯体を電極に固定することが容易となる。
【００３６】
オスミウム錯体がポリマー上に固定されている他の形態としては、該Ｏｓ錯体の配位子にポリマーが結合している形態が挙げられる。例えば、Ｏｓ錯体の配位子が有する反応性基と、ポリマーが有する反応性基とが反応し、共有結合した形態が挙げられる。このとき、ポリマーと配位子は、スペーサーとなる化学構造を介して結合していてもよい。
電子メディエータの電極への固定については、後で説明する。
【００３７】
上記Ｏｓ錯体を固定するポリマーとしては、スチレン／無水マレイン酸コポリマー、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（４−ビニルベンジルクロライド）コポリマー、ポリ（アリルアミン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）及びポリ（４−スチレンスルホネート）のいずれかが好ましい。中でも、Ｏｓ錯体に直接配位できるという観点から、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）、ポリ（４−ビニルピリジン）が好ましい。
【００３８】
また、オスミウム錯体におけるその他の配位子としては、例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＯ、ＣＨ３ＣＯＯ、ＮＨ３、ＮＯ、ピリジン、イミダゾールより選ばれる少なくとも１種が挙げられるが、これらに限定されず、その他の錯形成可能なものでもよい。配位子は、Ｏｓ錯体がポリマー上に固定されているかどうか（電子メディエータを酵素電極表面へ固定するか、それとも電解液へ分散するかどうか）、或いは、得られるＯｓ錯体の酸化還元電位等を考慮して、適宜選択すればよい。
【００３９】
本発明において用いられるオスミウム錯体として特に好ましいものとしては、下記式（３）、（４）で示されるものが挙げられる。
【００４０】
【化４】
【００４１】
【化５】
【００４２】
上記（３）、（４）のＯｓ錯体のうち、特にＯｓ（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２（４−ｃａｌｂｏｘｙｌ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）２［上記式（３−２）］、及びＰｏｌｙ（Ｎ−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ Ｏｓ（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２Ｃｌ（式（４））が好ましい。
【００４３】
ここで、本発明の酵素電極において用いられる電子メディエータの合成例として、上記式（３−４）に示したＯｓ（２，２'−ビピリジルジアミン）２（イミダゾール）２の合成方法について簡単に説明する。
まず、塩素原子が６配位したＯｓ錯体（ＯｓＣｌ６）を準備する。ＯｓＣｌ６と２，２’−ビピリジルアミンとを２００℃で２時間反応させる。その後、亜ジチオン酸塩を添加し、氷上で３０分間反応させると、Ｏｓに配位した塩素原子４つと二座配位子である２，２’−ビピリジルアミン２つとが置換される（Ｏｓ錯体中間体）。次に、得られたＯｓ錯体中間体をイミダゾールと２００℃で２時間反応させ、さらに、ＮＨ４ＰＦ６を添加し、反応させることで、Ｏｓに配位した塩素原子２つとイミダゾール２つとが置換されＯｓ（２，２'−ビピリジルジアミン）２（イミダゾール）２が得られる（式（５）参照）。
【００４４】
【化６】
【００４５】
また、上記式（４）に示したポリ（Ｎ−イミダゾール）とＯｓ錯体との複合体［Ｐｏｌｙ（Ｎ−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ Ｏｓ（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２Ｃｌ］の合成方法について説明する。
【００４６】
まず、（ＮＨ４）２［ＯｓＣｌ６］（１ｍｍｏｌ）と２．０当量の２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ（２ｍｍｏｌ）を、１，２−エタノジオール（１８ｍＬ）中で１時間、アルゴン雰囲気下還流する。冷却後、反応混合物を１Ｍ Ｎａ２Ｓ２Ｏ４ ３０ｍＬで処理する。得られる反応混合物を氷浴中で３０分間冷却し、沈殿するＯｓ錯体を冷水とジエチルエーテルで完全に洗浄し、バキューム乾燥させると、ｃｉｓ−［ＯｓＣｌ２（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２］が得られる。
次に、ポリ−１−ビニルイミダゾール（ＰＶＩ）と、上記にて得られたｃｉｓ−［ＯｓＣｌ２（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２］とを、エタノール２００ｍＬ中で二日間、ＰＶＩ（２００ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）と還流させ、ろ過し、得られた溶液を１．５Ｌのジエチルエーテル中に攪拌しながら注ぐことによって、ポリ−１−ビニルイミダゾール（ＰＶＩ）と、ｃｉｓ−［ＯｓＣｌ２（２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２］との複合体を得ることができる。
【００４７】
本発明の酵素電極のもう一つの特徴は、補欠分子族としてＰＱＱ（式（６）、ピロロキノリンキノン）を有する酸化還元酵素（ＰＱＱ依存性酸化還元酵素）を備えることである。
ＰＱＱは、酸化電位が−０．１８４Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ２、飽和ＫＣｌ溶液）であり、式（１）で表される二座配位子が少なくとも１つ配位したＯｓ錯体は、酸化還元電位が−０．１５Ｖに非常に近いものが得られる。さらに、上記Ｏｓ錯体はＰＱＱとして有する補酵と組み合わせた場合、−０．１５Ｖ付近でも高い酸化還元反応速度を保持する。
【００４８】
【化７】
【００４９】
ＰＱＱ依存性の酸化還元酵素としては、デヒドロゲナーゼが挙げられる。具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルボースデヒドロゲナーゼ、アルカン−１−ｏｌデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ポリビニルアルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。中でも、燃料の普及、使いやすさの観点から、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼが好ましく用いられる。
【００５０】
本発明において、用いる酸化還元酵素は１種類に限定されず、２種類以上を組み合わせてもよい。また、酵素反応が２段階以上であってもよいが、燃料電池等への適用の容易さの点では、酵素反応は１段階であることが好ましい。
【００５１】
酸化還元酵素、電子メディエータは、電極反応である酸化還元反応が効率よく定常的に進行するように、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等の緩衝液によって、最適なｐＨ、例えば、ｐＨ７付近に維持されることが好ましい。
また、酸化還元酵素、電子メディエータは、電解溶液に溶解、分散させた状態で用いてもよいが、固定化材料によって電極表面に固定化されることが好ましい。酸化還元酵素、電子メディエータを電極に固定し、電極近傍にて酵素反応を進行させることによって、効率よく電極へ電子を伝達させることが可能となるからである。
【００５２】
酸化還元酵素、電子メディエータの電極への固定方法は特に限定されない。例えば、電子メディエータとして、上記したように、Ｏｓ錯体がポリマー上に固定された上記式（４）で表されるＰＶＩ−Ｏｓなどを用いる場合には、電極の基板となる導電体（例えば、カーボンシートなど）表面に、ＰＶＩ−Ｏｓを含有する溶液を滴下し、続いて、酸化還元酵素（ＧＤＨなど）を含む溶液を滴下し、さらに、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（以下、ＰＥＧＤＥ）等の架橋試薬を滴下することで、電子メディエータであるＰＶＩ−Ｏｓのポリビニルイミダゾール鎖にＰＥＧＤＥを介して酸化還元酵素を結合させ、乾燥させる方法が挙げられる。架橋試薬としては、一般的なものを用いることができ、ＰＥＧＤＥのほか、グルタルアルデヒド等を用いることもできる。
【００５３】
電子メディエータとして、Ｏｓ錯体がポリマー上に固定されていないものを用いる場合にも、酵素や電子メディエータ等を電極に固定化するために一般的に用いられているポリマーや架橋試薬を用いることができる。具体的には、ポリマーとして、ポリビニルイミダゾール、ポリアリルアミン、ポリアミノ酸、ポリピロール、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール等を用いることができる。また、架橋試薬としては、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド等を用いることができる。
【００５４】
電極反応が効率よく定常的に進行するようにするためには、酸化還元酵素、電子メディエータの温度も、例えば、２０〜３０℃程度に維持されていることが好ましい。
【００５５】
酸化還元酵素の基質としては、生物学的栄養源を広く利用することができ、例えば、炭水化物やその発酵生産物が挙げられ、特に、アルコール、糖及びアルデヒドが好ましく用いられる。具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、グリセリン、ポリビニルアルコール等のアルコール；グルコース、フルクトース、ソルボース等の糖類；ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド等のアルデヒド等が挙げられる。その他にも、脂肪類、タンパク質等の糖代謝の中間生成物等の有機酸、これら混合物などを用いることができる。
本発明の酵素電極を燃料電池用電極として用いる場合には、取り扱いが極めて容易であること、入手が容易であること、環境への負荷が小さいこと等の観点から、特にグルコース、アルコールが好適に用いられる。
【００５６】
電極としては、グラファイト、カーボンブラック、活性炭等の導電性炭素質からなるものや、金電極等を用いることができる。
【００５７】
以下、本発明の酵素電極を備える燃料電池の一形態例について説明する（図４参照）。
まず、ＰＱＱ依存性酸化還元酵素（ＰＱＱ−ＧＤＨ）が、燃料であるグルコース等の基質を酸化し、酸化還元酵素の補欠分子族であるＰＱＱが電子を受け取る。次に、電子を受け取ったＰＱＱは、電子メディエータであるＯｓ錯体に電子を受け渡し、当該Ｏｓ錯体により電極（アノード）へ電子が受け渡される。そして、アノードから外部回路を通ってカソードに電子が到達することで、電流が発生する。上記過程において発生するプロトン（Ｈ＋）は、プロトン伝導膜又はプロトン伝導膜のない電解液内をカソードまで移動する。
【００５８】
そして、カソードでは、電解液内を移動して到達したプロトンと、外部回路を経てアノード側から移動してきた電子と、酸素や過酸化水素等の酸化剤とが反応して水が生成される。カソードでは、酸化剤の還元反応に有効な触媒として、白金や白金合金等、燃料電池において電極触媒として一般的に用いられているものを用いることができる。白金や白金合金は、グラファイト、カーボンブラック、活性炭のような炭素質材料や、金等からなる電極に担持させたり、又は、白金や白金合金そのものからなる電極を用いることで、カソード触媒として用いることができる。或いは、ラッカーゼやビリルビンオキシターゼ等の公知の酵素を電極触媒として用い、導電性電極に固定、又は、電解液に含有させてもよい。
【００５９】
カソード電極における電極反応を妨害する不純物（例えば、アスコルビン酸、尿酸等）による影響を回避するために、ジメチルポリシロキサン等の酸素選択性の膜をカソード電極の周囲に配置してもよい。
【００６０】
上述したように、本発明の酵素電極は、燃料である基質の酸化電位と非常に酸化電位が近い電子メディエータを選択することができるため、アノード側半電池における酵素反応（電極反応）での電圧のロスが少なく、高電圧を得ることが可能である。さらには、高電圧が得られるにも関わらず、高電流密度を得ることも可能であるため、高電圧・高電流密度を発現する優れた燃料電池を提供することができる。
【００６１】
本発明の酵素電極は、燃料電池用電極の他、酵素センサー、酵素トランジスタ等に用いることができる。
本発明の酵素電極を酵素センサーに用いる場合、酵素と基質の酸化還元反応の進行によって、発生した電流又は電圧を検知することで、基質の存在の有無或いは濃度を測定することができる。本発明の酵素電極によれば、高電流密度及び高電圧が得られるため、感度の高い酵素センサーを提供することができる。本発明の酵素電極は、電子メディエータの酸化還元反応速度が大きいことから、当該酵素電極を備える酵素センサーは、電子メディエータの酸化還元反応が妨害種による妨害を受けにくく、測定精度が高いという利点もある。
【実施例】
【００６２】
（Ｏｓ錯体合成例）
表１に示す二座配位子（Ｌ１）と一座配位子（Ｌ２）とが各々２つずつ配位したＯｓ錯体（ａ）〜（ｊ）を以下のようにして合成した。
まず、塩素原子が６配位したＯｓ錯体（ＯｓＣｌ６）を準備した。次に、ＯｓＣｌ６と二座配位子（Ｌ１）とを２００℃で２時間反応させた。その後、亜ジチオン酸塩を添加し、氷上で３０分間反応させ、Ｏｓに配位した塩素原子４つと二座配位子（Ｌ１）とを置換した（Ｏｓ錯体中間体）。次に、得られたＯｓ錯体中間体を一座配位子（Ｌ２）と２００℃で２時間反応させ、さらに、ＮＨ４ＰＦ６を添加して反応させ、Ｏｓに配位した塩素原子２つと一座配位子（Ｌ２）２つとを置換し、Ｏｓ（Ｌ１）２（Ｌ２）２を合成した（式５参照）。
【００６３】
【表１】
【００６４】
（実施例１、比較例１〜２）
表２に示すように電子メディエータと酵素とを組み合わせて、電解液（モルホリノプロパンスルホン酸１００ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ2水溶液）中に分散させ、下記条件下、３電極式でサイクリックボルタンメトリーを行い、酸化還元電位及び酸化還元反応速度を調べた。
尚、試料極として炭素電極（グラッシーカーボン電極）、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ２、対極としてＰｔワイヤーを用いた。結果を図２に示す。図２中の番号は、表２中に表示した番号の酵素／Ｏｓ錯体／基質の組み合わせから得られたデータであることを示している。また、表２中の（ＰＦ6）2は、Ｏｓの電荷を中性にするためのカウンターイオンである。
【００６５】
＜試験条件＞
・温度：室温（約２０℃）
・電解液：ＭＯＰＳ ３０ｍＭ及びＣａＣｌ２ ３ｍＭを含む水溶液（ｐＨ７．０）
・燃料：グルコース１００ｍＭ
・サイクリックボルタンメトリー条件：掃引速度 ５ｍＶ／ｓｅｃ
掃引範囲 −４００ｍＶ〜４００ｍＶ
【００６６】
【表２】
【００６７】
図２において、横軸は、電子メディエータの酸化還元電位（Ｅｍｅｄ）と酸化還元酵素の酸化還元電位（Ｅｅｎｚ）の電位差（ΔＥ＝Ｅｍｅｄ−Ｅｅｎｚ）である。
比較例２の酸化還元酵素（ジアフォラーゼ）と電子メディエータとの組み合わせ［図２の（１１）〜（１５）］では、ΔＥが０．４Ｖ付近から、電位の低下と共に反応速度の低下が生じているのに対して、ＰＱＱ依存性酸化還元酵素（ＰＱＱ−ＧＤＨ）と、上記式（１）で表される二座配位子が配位したＯｓ錯体とを組み合わせた実施例１［図２の（１）〜（５）］は、ΔＥが０．４Ｖ以下となっても、ほぼ一定の反応速度を示し、ΔＥがゼロ近くなっても、高い反応速度を保持した。
一方、実施例１と同様、酸化還元酵素としてＰＱＱ−ＧＤＨを用い、上記式（１）の二座配位子とは異なる二座配位子が配位したＯｓ錯体を電子メディエータとして組み合わせた比較例１［図２の（６）〜（１０）］では、実施例１と同等の酸化還元反応速度を示す組み合わせもあったが、実施例１と比較して酸化還元電位が高かった。
【００６８】
以上の結果から、本発明の酵素電極における酸化還元酵素と電子メディエータとを組み合わせた実施例１は、比較例１及び比較例２と比べて、ΔＥが小さい、すなわち、電極反応における電圧ロスが少なく、且つ、反応速度が大きい、すなわち、電流密度が高いことがわかる。
【００６９】
（参考データ）
図７［Biochim. Biophys. Acta(1983) 744, 57 より引用］、及び、図８［J.Electroanal. Chem., (1992) 337, 253 及びAnal.Sci.(2001) 17,945 より引用］に示すデータから、酸化還元酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存性グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用い、様々な電子メディエータと組み合わせた場合に得られる酸化還元電位（ΔＥ）と酸化還元反応速度を算出した。得られたデータを図２に併せて示す。
【００７０】
尚、図７は、ＦＡＤ依存性ＧＯＤとキノン系電子メディエータとを組み合わせたデータ、図８は、ＦＡＤ依存性ＧＯＤと金属（Ｆｅ、Ｏｓ、Ｒｕ）錯体電子メディエータとを組み合わせたデータである。
図２に示すように、従来のＦＡＤ依存性ＧＯＤと電子メディエータとからなる組み合わせでは、比較例２同様、ΔＥが０．４Ｖ付近から、電位の低下と共に反応速度の低下が生じており、実施例１に劣ることがわかる。
【００７１】
（実施例２）
ＰＱＱ依存性酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性ＧＤＨ、電子メディエータとしてＯｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２ＣｌをＰｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と複合化したもの、を用いて酵素電極を構成し、以下のようにしてグルコースの酸化電流を測定した。結果を図３に示す。
【００７２】
＜酵素電極の作製＞
カーボンシート表面に、ポリ（１−ビニルイミダゾール）とＯｓ（４，４’−ジメチル−２，２’−ビピリジン）２Ｃｌとの複合体（ＰＶＩ−Ｏｓ）の１０ｍｇ／ｍｌ水溶液を１０μｌ／ｃｍ２滴下した。次に、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の１００μＭリン酸緩衝溶液を１０μｌ／ｃｍ２滴下した。
さらに、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）の３ｍｇ／ｍｌ水溶液を１０μｌ／ｃｍ２滴下した。これを一晩放置して乾燥させ、ＰＶＩ−Ｏｓのポリビニルイミダゾール鎖にＰＥＧＤＥを介してＧＤＨを結合させると同時に、カーボンシート表面に、酵素であるＧＤＨとメディエータであるＰＶＩ−Ｏｓとを固定した。
図５に示すようにして、上記にて酵素と電子メディエータとを固定した酵素電極をナイロン製ネット及びＯリングにより先端に固定した試料極を作製した。
【００７３】
＜酸化電流の測定条件＞
［酵素電極の評価］
上記試料極を用いて、下記条件下、３電極式でサイクリックボルタンメトリーを行った。尚、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ２、対極としてＰｔワイヤーを用いた。
【００７４】
＜試験条件＞
・温度：室温（約２０℃）
・電解液：ＭＯＰＳ ３０ｍＭ及びＣａＣｌ２ ３ｍＭを含む水溶液（ｐＨ７．０）
・燃料：グルコース１００ｍＭ
・サイクリックボルタンメトリー条件：掃引速度 ５ｍＶ／ｓｅｃ
掃引範囲 −４００ｍＶ〜４００ｍＶ
【００７５】
（比較例３）
実施例２において、酵素としてＰＱＱ依存性ＧＤＨ、電子メディエータとしてＯｓ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）２ＣｌをＰｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と複合化したもの、を組み合わせた以外は、同様にして酵素電極を作製し、グルコースの酸化電流を測定した。結果をあわせて図３に示す。
【００７６】
図３に示すように、電子メディエータとしてＯｓ（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）２ＣｌをＰｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と複合化したものを用いた比較例３の酵素電極と比較して、電子メディエータとしてＯｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｌａｍｉｎｅ）２ＣｌをＰｏｌｙ（１−ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と複合化したものを用いた実施例２の酵素電極は、約−２００ｍＶの卑な電位から酸化電流が測定され、約１５０ｍＶの電位範囲まで高い電流密度が得られた。実施例２では、０〜４００ｍＶまでの電位範囲において、約−１０００μＡ／ｃｍ２という一定の高い電流密度を示した。約１５０ｍＶ以上の電位範囲においては、実施例２よりも比較例３の酵素電極の方が高い電流密度を示したが、より卑な電位において高い電流密度を示すということがアノード側電極に求められる条件であり、この点において、実施例２の酵素電極の優位性が確認できる。すなわち、本発明の酵素電極を用いることによって、高電圧、高電流密度が得られることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の酵素電極における電子伝達の概念図である。
【図２】実施例における結果を示すグラフである。
【図３】実施例における結果を示すグラフである。
【図４】本発明の酵素電極を備えた燃料電池の一形態例を示す概念図である。
【図５】実施例における酵素電極の作製方法を説明する図である。
【図６】ＮＡＤＨ以外の反応物質を燃料としてＮＡＤ依存型酵素とジアフォラーゼの２段階酵素反応で構成された酵素電極における電子伝達の概念図である。
【図７】Biochim. Biophys. Acta(1983) 744, 57 より引用したグラフである。
【図８】J.Electroanal. Chem., (1992) 337, 253 及びAnal.Sci.(2001) 17,945 より引用したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極と、酸化還元酵素と、前記電極−前記酸化還元酵素の間の電子伝達を媒介する電子メディエータと、を備える酵素電極であって、
前記酸化還元酵素の補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を備え、
前記電子メディエータは、下記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体からなる二座配位子が少なくとも１つオスミウムに配位したオスミウム錯体であることを特徴とする、酵素電極。
【化１】
（式（１）において、Ｒａ〜Ｒiは、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ２、或いは、置換若しくは未置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキシアミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシルアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール又はアルキルのいずれかである。）
【請求項２】
前記オスミウム錯体は、配位性部位を有するポリマーの該配位性部位が該オスミウム錯体のオスミウムに配位しているか、又は、該オスミウム錯体の配位子にポリマーが結合することにより、ポリマー上に固定されている、請求項１に記載の酵素電極。
【請求項３】
前記オスミウム錯体を固定するポリマーが、スチレン／無水マレイン酸コポリマー、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（４−ビニルベンジルクロライド）コポリマー、ポリ（アリルアミン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）及びポリ（４−スチレンスルホネート）のいずれかである、請求項２に記載の酵素電極。
【請求項４】
前記オスミウム錯体において、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＯ、ＣＨ３ＣＯＯ、ＮＨ３、ＮＯ、ピリジン、イミダゾールより選ばれる少なくとも１つがオスミウムに配位している、請求項１乃至３のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項５】
前記酸化還元酵素の基質が、生物的栄養源となり得る化合物である、請求項１乃至４のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項６】
前記基質が、アルコール、糖及びアルデヒドより選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の酵素電極。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の酵素電極をアノード電極として備え、燃料として前記酸化還元酵素の基質を供給する、燃料電池。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれかに記載の酵素電極を備えることを特徴とする、酵素センサー。
【請求項１】
電極と、酸化還元酵素と、前記電極−前記酸化還元酵素の間の電子伝達を媒介する電子メディエータと、を備える酵素電極であって、
前記酸化還元酵素の補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を備え、
前記電子メディエータは、下記式（１）で表されるビピリジルアミン又はビピリジルアミン誘導体からなる二座配位子が少なくとも１つオスミウムに配位したオスミウム錯体であることを特徴とする、酵素電極。
【化１】
（式（１）において、Ｒａ〜Ｒiは、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨＮＨ２、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ２、或いは、置換若しくは未置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキシアミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシルアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール又はアルキルのいずれかである。）
【請求項２】
前記オスミウム錯体は、配位性部位を有するポリマーの該配位性部位が該オスミウム錯体のオスミウムに配位しているか、又は、該オスミウム錯体の配位子にポリマーが結合することにより、ポリマー上に固定されている、請求項１に記載の酵素電極。
【請求項３】
前記オスミウム錯体を固定するポリマーが、スチレン／無水マレイン酸コポリマー、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（４−ビニルベンジルクロライド）コポリマー、ポリ（アリルアミン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）及びポリ（４−スチレンスルホネート）のいずれかである、請求項２に記載の酵素電極。
【請求項４】
前記オスミウム錯体において、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ、ＣＯ、ＣＨ３ＣＯＯ、ＮＨ３、ＮＯ、ピリジン、イミダゾールより選ばれる少なくとも１つがオスミウムに配位している、請求項１乃至３のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項５】
前記酸化還元酵素の基質が、生物的栄養源となり得る化合物である、請求項１乃至４のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項６】
前記基質が、アルコール、糖及びアルデヒドより選ばれる少なくとも１種である、請求項５に記載の酵素電極。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の酵素電極をアノード電極として備え、燃料として前記酸化還元酵素の基質を供給する、燃料電池。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれかに記載の酵素電極を備えることを特徴とする、酵素センサー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−５９８００（Ｐ２００８−５９８００Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３２５３８（Ｐ２００６−２３２５３８）
【出願日】平成１８年８月２９日（２００６．８．２９）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２９日（２００６．８．２９）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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