醤油粕入り発酵飼料の製造方法
【課題】醤油粕入り発酵飼料の新規な製造方法の提供。
【解決手段】固形物全重量に対して90重量％以下の醤油粕と固形物全重量に対して10重量％以上の固体飼料原料との混合物及び当該混合物重量に対して80〜150重量％の水からなる固体培地で、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を培養し、２単位/ｇ以上のフィターゼを蓄積させることを特徴とする醤油粕入り発酵飼料の製造方法。この方法により、醤油粕を有効に利用することができる。
【解決手段】固形物全重量に対して90重量％以下の醤油粕と固形物全重量に対して10重量％以上の固体飼料原料との混合物及び当該混合物重量に対して80〜150重量％の水からなる固体培地で、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を培養し、２単位/ｇ以上のフィターゼを蓄積させることを特徴とする醤油粕入り発酵飼料の製造方法。この方法により、醤油粕を有効に利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醤油粕入り発酵飼料の製造方法に関し、さらに具体的には、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物の作用により醤油粕特有の臭いを脱臭し、且つフィターゼの供給源としても機能する醤油粕入り発酵飼料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
醤油は、日本人の食生活に欠かすことのできない必需品として多量に消費されており、その副生される醤油粕の発生量は年間十数万トンに達する。この醤油粕の有効な処理方法は当業者の重要な課題の一つである。
【０００３】
現状での醤油粕のほとんどが、焼却等によって産業廃棄物として処理されており、家畜用の飼料や農産物の肥料として有効利用されているのは極一部に過ぎない。その理由として、醤油粕は塩分を多量に含んでいるため、飼料や肥料としての配合量はごく少量（５％未満、通常1〜2％程度）に限られること、醤油粕は臭気が強く、混合飼料を製造しても醤油粕由来の臭気が強く残存し、飼料としての価値を低下させることなどが挙げられる。また、この醤油粕の臭気は作業従事者に敬遠されるばかりでなく、混合飼料等を作製する際に使用した機器にいつまでも醤油粕由来の臭気が残存するなどの理由によっても、醤油粕の利用範囲は制限されていた。
【０００４】
また、焼却にあたっては、塩による金属腐食やダイオキシンの発生防止のため、特殊な焼却炉を使用する必要があるなど問題点が多い。さらに、食品リサイクル法が施行され、醤油工場の産業廃棄物の削減およびリサイクルが問題となっており、廃棄物の有効利用という観点でも飼料・肥料への利用が望まれている。
【０００５】
これらのことを解決するために様々な方法が考案されてきたが、いずれも充分な効果をあげているとはいえない。それらの方法はいずれも醤油粕の問題点（醤油粕の食塩、臭い）をある程度解決することはできるが、栄養価が高く、安価な輸入原料が容易に入手できる現状では醤油粕の飼料・肥料としての価値が低く、採算性があわないことが実用化に至らない原因であると考えられる。従って、醤油粕を有効利用するためには、減塩、脱臭が重要ではあることはもちろんだが、処理物の付加価値を向上することが非常に重要であるといえる。
【０００６】
一方、有力な醤油粕の利用分野である畜産分野での問題点のひとつに、家畜の糞尿中に含まれるリンによる河川、湖の富栄養化がある。これは、家禽や豚などの単胃動物は消化器官内でフィターゼが分泌されず、穀物中に含まれるフィチンの30%程度しか利用できないため、飼料中にリン酸カルシウムなどの鉱物性無機リンが家畜の要求量に応じて使用されていることが原因とされている。現在では、家禽や豚用飼料には定常的にフィターゼ（フィチンからリン酸とイノシトールを生成する酵素）を添加することで、鉱物性リンの添加を削減するようになってきた。
【０００７】
一般的な飼料へのフィターゼの添加量は鶏用で200〜500単位/kg、豚用で300〜1000単位/kgといわれている。なお、ここでいうフィターゼの1単位は37℃で1分間に1マイクロモルの無機リン酸を生成する酵素量と定義されている。
【０００８】
現在、上記目的で使用されているフィターゼ剤は、主にアスペルギルス属由来のフィターゼを遺伝子組換え技術を利用して製造したものである。しかし、食の安全・安心が求められる昨今では、遺伝子組換え技術を使用した酵素剤を使用するのは世間の不安をあおる可能性がある。
【０００９】
また、非遺伝子組換えのフィターゼ生産菌としては、アスペルギルス属（アスペルギルス・フィキューム、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニガーなど）、ペニシリウム属、リゾプス属、ノイロスポラ属などのカビやサッカロミセスなどの酵母、バチルスなどの細菌が挙げられる。しかしながら、醤油粕の有効利用の観点からは、そのまま食べられる微生物による発酵が好ましい。アスペルギルス・フィキュームやアスペルギルス・フミガタスなどの有害菌はもちろんのこと、焼酎麹（アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチなど）やブルーチーズに使用するアオカビ（ペニシリウムなど）はカビ菌体を除去して食するもので、食習慣はあるものの、そのまま添加される飼料についてまで、その安全性を担保するものではない。
【００１０】
このような観点から食用に耐え得るフィターゼ生産菌としては、味噌に使用するアスペルギルス・オリゼー、テンペに使用するリゾプス・オリゴスポラス等リゾプス属、オンチョームに使用されるノイロスポラ属等が挙げられる。本発明者らは、ノイロスポラ属及びリゾプス属のカビを小麦フスマ等の培地で固体培養することで、培地中にフィターゼを蓄積することを発見した（特許第２１２８７３７号）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って本発明は、醤油粕の臭いが安全な手段で脱臭されており、且つフィターゼの供給の一助となる醤油粕入り発酵飼料の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本件発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、直接食品に混入しても安全であることが確認されている、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を醤油粕を含む固体培地で培養することにより、醤油粕の臭いを脱臭することができ、かつフィターゼの供給の一助となるのに十分な量のフィターゼを蓄積することを見出し本発明を完成した。
【００１３】
従って、本発明は、固形物全重量に対して90重量％以下の醤油粕と固形物全重量に対して10重量％以上の固体飼料原料との混合物及び当該混合物重量に対して80〜150重量％の水からなる固体培地で、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を培養し、２単位/ｇ以上のフィターゼを蓄積させることを特徴とする醤油粕入り発酵飼料の製造方法を提供する。
【００１４】
上記の方法において、脱臭の完全性及びフィターゼの蓄積量の観点から、好ましくは、固形物全重量に対する醤油粕の量が70重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が30％以上であり、さらに好ましくは、固形物全重量に対する醤油粕の量が60重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が40％以上であり、更に好ましくは、固形物全重量に対する醤油粕の量が50重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が50％以上である。
【００１５】
好ましくは、フィターゼの蓄積量は４単位／ｇ以上であり、更に好ましくは９単位／ｇ以上であり、更に好ましくは15単位／ｇ以上である。
前記ノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）の好ましい例として、独立行政法人製品評価技術基盤機構微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されているノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）及びノイロスポラ・シトフィラNA37株（NITE AP-230）が挙げられ、前記リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）の好ましい例として、リゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）及びリゾプス・オリゴスポラスKT27株（NITE AP-231）が挙げられる。
【００１６】
前記固体飼料原料は、例えば、小麦フスマ、米糠、豆腐粕、油粕、大豆粕、節粕、コーングルテンミール、醤油製造時に副生する生オリ、又は醤油製造時に副生する火入れオリ、あるいはこれらの２種類以上混合物である。
本発明の１態様においては、更に、油脂類、醤油油が添加される。
本発明は更に、上記のようにして製造した醤油粕入り発酵飼料を、飼料全重量に対して10重量％以下の量で飼料に添加することを特徴とする、醤油粕入り混合飼料の製造方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
微生物
本発明においては、フィターゼ生産能を有し、且つ安全性が確認されている微生物として、ノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を使用する。これらの微生物は、フィターゼ生産能の程度に関係なく醤油粕の臭いを脱臭する能力を有する。従って、微生物の選択は、主としてフィターゼの生産能を考慮して行なわれる。
【００１８】
一般に、飼料へのフィターゼの添加量は、養鶏用飼料で200〜500単位/kg、養豚用飼料で300〜1000単位/kgといわれる。従って、醤油粕が食塩を含むためにその飼料への添加量が５％未満に限定されることを、考慮すれば、本発明の醤油粕入り発酵飼料中のフィターゼ量は20単位/ｇ以上であることが望ましい。しかしながら、飼料に添加されるフィターゼの全てを本発明の醤油粕入り発酵飼料により賄う必要はなく、飼料へのフィターゼ添加の一助となればよい。したがって、本発明の醤油粕入り発酵飼料中のフィターゼの量は２単位/ｇ以上あればよい。
【００１９】
従って、本発明において使用する微生物としては、フィターゼ生産能を有することが知られている既知の微生物、例えばノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）NBRC 31635、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）NBRC 8631などを挙げることができ、これらはNBRC（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター）から入手可能である。
しかしながら、前記の如く、本発明の微生物としては、できるだけフィターゼ生産能の高いものが好ましく、このためにはフィターゼ高生産性変異株を得るのが好ましい。変異株は目的とする変異株を得るための常法に従って得ることができる。
【００２０】
その具体的な方法を実施例２に示す。それによれば、ノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）については、ノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）、ノイロスポラ・シトフィラNA37株（NITE AP-230）、ノイロスポラ・シトフィラNA33株など数本のフィターゼ高生産株が比較的高い効率（およそ10,000株中１株）で得られた。従って、本発明によれば、上記の寄託されている変異株のみならず、同等の変異株を容易に作出して使用することができる。なお、ノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）及びノイロスポラ・シトフィラNA37株（NITE AP-230）は、少なくとも20単位/ｇのフィターゼ生産能を有する（実施例３）。
【００２１】
また、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）については、リゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）、リゾプス・オリゴスポラKT27株（NITE AP-231）、リゾプス・オリゴスポラKT26など数本のフィターゼ高生産株が比較的高い効率（およそ10,000株中１株）で得られた。従って、本発明によれば、上記の寄託されている変異株のみならず、同等の変異株を容易に作出して使用することができる。なお、リゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）は少なくとも６単位/ｇ以上のフィターゼ生産能を有する（実施例３）。
【００２２】
なお、本発明においては、フィターゼの１単位は、5mMフィチン酸ナトリウム溶液を含む100mM酢酸緩衝液(pH5.7)中で37℃にて反応させ、１分間に1マイクロモルの無機リン酸を遊離させる酵素量と定義する。
【００２３】
醤油粕
本発明に使用できる醤油粕は、特別なものに限定されない。すなわち、本醸造方式、新式醸造方式、アミノ酸液混合方式、酵素処理液混合方式など各種方式により副製する醤油粕を原料として使用できる。これらの醤油粕は乾燥処理を施したものであっても施してないものであってもよい。また、通常の醤油粕の他に、食塩存在で麹を加水分解して得られる水不溶画分、醤油様調味液を製造する際に得られる水不溶画分、しょっつるなどの魚醤油を製造する際に得られる水不溶画分などの各種含塩調味液製造時に得られる水不溶画分も本発明方法の原料として使用することができる。したがって、本明細書中の「醤油粕」は、上記のものを全て包含する。
【００２４】
飼料原料
混合する飼料原料としては、本発明の微生物の固体培地として使用できるものであれば特に限定されない。例えば、小麦フスマ、米糠、豆腐粕、油粕、大豆粕、節粕、トウモロコシ澱粉の製造の再に副生するコーングルテンミール、醤油製造時に副生する生オリや火入オリなど、食品工場で排出される未利用資源など、広範囲のものが使用可能である。これらの２種類以上を混合して使用することもできる。
【００２５】
培地の調製
培地の調製に当っては、所定量の醤油粕と所定量の上記の飼料原料とを混合し、これに、前記醤油粕と飼料原料との合計重量（100％）に対して80〜150重量％の水を加えて全体を混合する。ここで、水の量80〜150％とは、例えば醤油粕と飼料原料との合計重量100kgに水を80〜150kg添加することを意味する。水分量が少なすぎると微生物の増殖が不十分となり、水分が多すぎると固体培地中の通気が悪くなり、やはり微生物の増殖が不良となる。次に殺菌を行なう。殺菌は例えば、121℃（ゲージ圧：１気圧）にて15〜30分間蒸気殺菌（オートクレーブ殺菌）すればよい。
培養
培養のための種菌としてわざわざ麹を調製する必要がなく、胞子を醤油粕含有固体培地に混合するだけで微生物の接種を完了させることができる。胞子の接種量は１×103個／ｇ固体培地以上、好ましくは１×105〜106個／ｇ固体培地、程度であればよい。接種量が上記の範囲よりも少ない場合には、培養時間が長期化したり、他の微生物の汚染を受けたりして好ましくない。培養温度は麹菌の通常の生育範囲でよく、特に温度管理は必要とするものではないが、胞子が発芽、麹菌の生育のための好条件としては25〜40℃の範囲が適当である。
【００２６】
培養中の通気は特に必要としないが、酸欠のため菌の生育の停止、菌の死滅を防止する程度の通気を適宜行えばよい。培養時間は水分含量、培養温度、pH等により異なるが、通常は16〜48時間程度の培養時間が適当である。醤油油の添加方法は特に限定されないが、培地にはじめから加えてもよいが、酵素の生産を考慮すると発酵終了直前に添加するのが好ましい。培養終了及び乾燥は、30〜70℃の加熱乾燥処理により行うことができる。
【００２７】
醤油油の添加
醤油の製造においては、醤油粕のみならず醤油油も副生し、醤油油も醤油臭を有するので、そのままでは利用できない。しかしながら、脱臭すれば飼料の栄養成分として有用である。従って、本発明の一つの態様として、醤油油を固体培地に最初から添加して微生物の培養を行なうか、または培養開始後培養終了前に、培養物に醤油油を添加することができる。この方法により脱臭された醤油油を含み脂肪分が強化された、醤油粕入り発酵飼料添加物を得ることができる。更には醤油油に限らず油脂類を添加しても良い。油脂類とは例えば、食用油、米油、ヤシ油、魚油、アマン油脂である。
【００２８】
飼料の製造
本発明の飼料原料は醤油粕に由来する食塩を通常３％程度含むので、飼料への添加量はおよそ10％未満に制限される。従って、本発明の醤油粕入り混合飼料の製造方法は、本発明の醤油粕入り発酵飼料を飼料に対して10％未満の量で添加することを特徴とする。
【実施例】
【００２９】
以下、実験例および実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
実施例１. 各種の麹菌での醤油粕の発酵試験
醤油粕：小麦フスマ：水を1：1：２の重量比で混合した培地25gを500ml容メリクロンフラスコにいれてオートクレーブ殺菌(121℃、15分)し、あらかじめPDA斜面寒天培地に培養しておいた各種麹菌（表１に記載）を1白金耳接種し、30℃、3日間培養した。得られた培養物を50℃、６時間通風乾燥を行った後、培養物3gに生理食塩水27mlを加え、ホモジナイズ（12,000rpm、2分）し、ホモジネートをNo.６濾紙で濾過して濾液を得た。この濾液について下記の方法に従ってフィターゼ活性を測定した。
【００３０】
即ち、あらかじめ、37℃に保温しておいた5mMフィチン酸ナトリウム溶液を含む100mM酢酸緩衝液(pH5.7)0.9mlに上述の濾液0.1mLを加えて、37℃にて20分間反応させた。対照としてフィチン酸ナトリウムを含まない100mM 酢酸緩衝液(pH5.7)を用いて同様の操作を行った。反応終了後、フィスケ・スバロー法に従って遊離したリン酸の定量を行った。フィターゼ活性の１単位は上記酵素活性測定条件下において１分間に1マイクロモルの無機リン酸を遊離させる酵素量と定義した。
【００３１】
醤油粕臭の評価方法は、パネラーは5名で行い、処理前の臭気を5とした場合の臭気の程度をその強弱に応じて5〜0の6段階で評価したものである。
その結果、表１に示したように、ノイロスポラ属及びリゾプス属のカビで発酵させることで、培地中にフィターゼが生産されることが分かった。また、飼料添加物として添加されているキシラナーゼ、CMCase、β-ラクタマーゼ、リパーゼの生産も認められた。脱臭効果はいずれもわずかにカビ臭がするものの、醤油粕臭は残っておらず、室温で1ヶ月放置したあと、戻り香を評価したが、戻り香もなかった。
【００３２】
【表１】
【００３３】
実施例２. ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635及びリゾプス・オリゴスポラスNBRC 8631の変異処理による高フィターゼ活性変異株の取得
ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635及びリゾプス・オリゴスポラスNBRC 8631の胞子懸濁液を調製し、常法に従ってUV照射を行い、変異を誘発させた。UV処理した胞子懸濁液をPDA平板培地に塗沫し、生育した候補株をPDA斜面培地に釣菌して30℃、3日間培養した。微生物培養用プレート内で1mLの液体培地（0.3％ポリペプトン、0.3％酵母エキス、0.3％麦芽エキス、１％ぶどう糖、pH5.5）に候補株を1白金耳接種し、30℃、１週間培養した。菌体を除去した培養上清0.01mLを用いて、5mMフィチン酸ナトリウム溶液を含む100mM酢酸緩衝液(pH5.7) 0.1mLを加えて、37℃にて20分間反応させた。反応終了後、フィスケ・スバロー法に従って遊離リン酸の分析を行い、目視により高フィターゼ活性変異株を選択した。
【００３４】
実施例３. 変異株を使用した醤油粕と小麦フスマでの発酵処理
醤油粕と小麦フスマを1：3で混合し、等量の水を加えた培地（１）と、醤油粕と小麦フスマを1：1で混合し等量の水を加えた培地（２）をそれぞれ10gとり、100ml容三角フラスコに入れてオートクレーブ殺菌し、上記実施例２で作成した高フィターゼ活性変異株を１白金耳接種し、30℃にて３日間培養した。得られた発酵物を通風乾燥を行った後、実施例１に記載した方法に従ってフィターゼ活性（単位/ｇ）を測定した結果を下記表に示した。なお、醤油粕臭はいずれも全く感じなかった。得られた高フィターゼ活性変異株の中からノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）、NA37株（NITE AP-230）とリゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）、KT27株（NITE AP-231）を寄託した。
【００３５】
【表２】
【００３６】
実施例４. ノイロスポラ・シトフィラNA38株を使用した醤油粕と豆腐粕での発酵処理
醤油粕と豆腐粕を下記表の割合で混合し、等量の水を加えた培地（３）〜（７）をそれぞれ10gとり100ml容三角フラスコに入れてオートクレーブし、ノイロスポラ・シトフィラNA38株を１白金耳接種し、30℃、３日間培養した。得られた発酵物を通風乾燥を行った後、実施例１に記載した方法に従ってフィターゼ活性（単位/ｇ）と醤油粕臭を評価した結果、表３に示したように醤油粕の配合割合によってフィターゼ活性は低下するが、醤油粕90%の培地でもノイロスポラ・シトフィラNA38株は生育し、フィターゼ活性と脱臭効果を発揮することが分かった。
【００３７】
【表３】
【００３８】
実施例５. 醤油油を添加した醤油粕と豆腐粕と米糠の発酵処理
醤油粕と豆腐粕と米糠を下記表の割合で混合し、等量の水を加えた培地（８）〜（10）をそれぞれ50gとり500ml容メリクロンフラスコに入れてオートクレーブし、ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635を１白金耳接種し、30℃、３日間培養した。培地（11）及び（12）については、培地（８）で培養した後、培養終了１時間前に醤油油を添加した。培養終了後、50℃、６時間通風乾燥を行い、得られた発酵物を上記1に記載した方法に従ってフィターゼ活性（単位/ｇ）と醤油粕臭を評価した。
【００３９】
その結果、表４に示したように醤油油を培地に混合してもノイロスポラ・シトフィラNBRC31635は生育し、醤油粕ならびに醤油油の臭いは完全に除去された。しかし、フィターゼ活性は有意に低下してしまった。そこで、醤油油を酵素生産が終了した時点で添加し、１時間放置した後、乾燥することでフィターゼ活性を低下させることなく、醤油粕と醤油油の臭いを除去することが出来た。
【００４０】
【表４】
【００４１】
実施例６. リゾプス・オリゴスポラスKT28株を使用した醤油粕と豆腐粕での発酵処理
醤油粕と豆腐粕と菜種粕と小麦フスマを5：10：3：2の割合で混合し、等量の水を加えた培地（13）と醤油粕と豆腐粕と小麦フスマを2：1：1の割合で混合し等量の水を加えた培地（14）をそれぞれ10gとり100ml容三角フラスコに入れてオートクレーブし、リゾプス・オリゴスポラスKT28株を１白金耳接種し、30℃にて３日間培養した。得られた発酵物を上記1に記載した方法に従ってフィターゼ活性と醤油粕臭を評価した結果、培地（13）で6.2単位/ｇ、培地（14）で4.1単位/ｇのフィターゼ活性が得られた。いずれも醤油粕臭はほとんど感じなかった。
【００４２】
実施例７. ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635を使用した大規模発酵処理（醤油粕25%）
醤油粕25%、豆腐粕25%、米糠25%、菜種粕15%、コーングルテンミール10%の割合で混合した培地100kgに等量の水を加え、100℃、30分間殺菌したものを製麹機に移し、30℃まで冷却した後、種麹としてノイロスポラ・シトフィラNBRC31635胞子を接種して混合し、30℃にて3日間培養した。製麹中は1日目、2日目にそれぞれ手入れ（混合・攪拌）をして均一にした。発酵終了後、発酵物を通風乾燥（50℃、6時間）させ、粉砕機にて粉砕した。得られた発酵物のフィターゼ活性は9.8単位/gであった。醤油粕臭は全く感じなかった。以下、本方法で製造された醤油粕入り発酵飼料を「S25」と略称する。
【００４３】
実施例８. ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635を使用した大規模発酵処理（醤油粕50%）
醤油粕50%、豆腐粕25%、米糠25%の割合で混合した培地100kgに等量の水を加え、121℃、15分の加圧殺菌したものを製麹機に移し、30℃まで冷却した後、種麹としてノイロスポラ・シトフィラNBRC31635胞子を加えて混合し30℃にて3日間培養した。製麹中は1日目、2日目にそれぞれ手入れ（混合・攪拌）をして均一にした。発酵処理終了後、発酵物を通風乾燥（50℃、6時間）させた後、粉砕機にて粉砕した。得られた発酵物のフィターゼ活性は3.0単位/gであった。醤油粕臭は全く感じなかった。以下、本方法で製造された醤油粕入り発酵飼料を「S50」と略称する。
【００４４】
実施例９. ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635を使用した大規模発酵処理（醤油粕50%+醤油油25%）
醤油粕50%、豆腐粕25%、米糠25%の割合で混合した培地100kgに等量の水を加え、121℃、15分の加圧殺菌したものを製麹機に移し、30℃まで冷却した後、種麹としてノイロスポラ・シトフィラNBRC31635胞子を加えて混合し30℃にて3日間培養した。製麹中は1日目、2日目にそれぞれ手入れ（混合・攪拌）をして均一にした。フィターゼ活性を確認した後、醤油油25kgを添加した。1時間後に発酵物を通風乾燥（50℃、6時間）し、粉砕機で粉砕した。得られた発酵物のフィターゼ活性は3.0単位/gであった。醤油粕及び醤油油臭は全く感じなかった。以下、本方法で製造された醤油粕入り発酵飼料をS50F25と略称する。
【００４５】
実施例10. ノイロスポラ・シトフィラを用いた醤油粕混合飼料（S25）の豚への効果
上記6に記載のS25を用いて、現在使用している酵素剤にかわり、ノイロスポラ・シトフィラの生産するフィターゼが養豚用飼料として実際に応用できるかどうかについて以下の方法で検証した。すなわち、フィターゼを含まない対照区飼料（リン含量0.55%）に対し、S25を５％含んだ試験飼料（リン含量0.45%、フィターゼ活性約500単位）を作成し、リンの消化率と出納について調査した。その結果、子豚のリンの消化率は対照区飼料よりも有意に増加し（対照区57.6% vs 試験区73.1%）、リンの蓄積率は同等であった（対照区5.41g/day vs 試験区5.19g/day）。これにより、豚に対するS25のフィターゼ効果は証明された。
【００４６】
次に、S25を一般飼料に配合し、豚の成長および肉質に如何なる影響を及ぼすかについて調査した。平均体重約68kgの豚６頭を２区に分け、一般飼料（粗蛋白質14%、可消化養分総量77%）とS25を5%配合した試験飼料（粗蛋白質14%、可消化養分総量77%）を各々給与し、平均体重約112kgまで飼育した。その間の飼料摂取量（一般飼料2.863kg/day vs S25試験飼料2.966kg/day）、日増体量（一般飼料0.879kg/day vs S25試験飼料0.968kg/day）、飼料要求率（一般飼料3.257 vs S25試験飼料3.064）は、いずれもS25配合試験飼料区の方が優れた値を示した。従ってS25は、豚成長に対して負の影響をもたないばかりか、むしろ改善する可能性が示唆された。
【００４７】
また、これら供試豚の肉質について調査したところ、肉色、背脂肪融点、背脂肪脂肪酸組成のいずれのパラメーターも一般飼料区と同等であり、S25配合の悪影響は認められなかった。また、この供試豚の肉を用いてロース肉、バラ肉の３点識別官能検査を実施したが、統計的な差はなかった。従って、S25は豚肉質に何ら悪影響を及ぼさないことが判明した。
【００４８】
実施例11. ノイロスポラ・シトフィラを用いた醤油粕混合飼料（S25）の鶏への効果
市販産卵鶏飼料には，フィターゼが飼料添加物として認可され広く普及している。従って、S25を飼料に配合すれば、飼料添加物としてのフィターゼの代替として期待できることになる。本試験では、S25が市販飼料添加物フィターゼ代替として使用し得るかを調査した。試験区は、採卵鶏用に推奨されるフィターゼ300単位/kg飼料となるように調整した市販フィターゼ区、および、フィターゼ294単位/kg飼料となるように調整したS25区（S25を3%配合）の２区とし、各試験飼料の栄養成分は等しくなるように調整した。
【００４９】
供試鶏は、試験用ウインドウレス鶏舎のケージ単飼とし、各区6羽の計12羽使用し、試験開始日齢は705で、試験期間を8週間とした。S25給与が体重、飼料摂取量、産卵率および卵重に悪影響を及ぼすことはなかった。また、卵の品質に関与する、ハウユニット、卵比重においても同様に悪影響を及ぼすことはなかった。以上のことから、S25を3%配合し、フィターゼ294単位/kg飼料となるように調整した飼料を産卵鶏に給与すれば、市販フィターゼを用いてフィターゼ300単位/kg飼料となるよう調整した飼料を産卵鶏に給与した場合と同等の結果が得ることがわかった。
【００５０】
実施例12. ノイロスポラ・シトフィラを用いた醤油粕混合飼料（S50、S50F25）の豚への効果
S50及びS50F25のもつ効果について検証するため、S50及びS50F25の消化率について調査した。粗蛋白質15.8%、可消化養分総量77.3%の基礎飼料およびこの基礎飼料にS50及びS50F25をそれぞれ20%配合した飼料を摂取させ、基礎飼料、S50混合飼料、S50F25混合飼料の消化率を測定した。その結果、S50のTDNは63.3%、S50F25のTDNは85.6%であり、中でも粗脂肪の消化率が顕著に向上し（基礎飼料58.5% vs S50混合飼料63.7%）、S50自体の粗脂肪消化率は65〜83.7%を示した。また、同様の傾向はS25にも認められた（基礎飼料58.7% vs S25混合飼料72.7%）。従って、醤油粕とその他飼料原料を配合したものを本発明の方法で処理したものには、飼料中粗脂肪の消化率を向上させる効果があることが確認された。
【００５１】
実施例13. ノイロスポラ・シトフィラを用いた醤油粕混合飼料（S50、S50F25）の鶏への効果
S50およびS50F25のいずれにおいても鶏用飼料に使用するためには、それらの代謝エネルギー値（ME, kcal/kg）が飼料設計において不可欠となる。そこで、S50およびS50F25のME測定を実施した。供試鶏は，試験用ウインドウレス鶏舎のケージ群飼（8から9羽／ケージ）で1ケージ1単位とし，各区16または17羽の計50羽使用した。試験開始日齢は56とした。試験飼料順化期間を5日とし、その後2日間をME測定期間とした。MEは，飼料の全エネルギー摂取量から糞尿の全排泄エネルギーの差に窒素補正を加えた結果とした。
【００５２】
S50およびS50F25のMEは、それぞれ2735および3860の結果を得た。鶏用飼料原料としての価値は，MEの観点からS50F25がS50より優れるので、S50F25を産卵鶏に給与することで、ME測定結果の妥当性を調査した。飼料は，対照区と試験区ともに同一の栄養成分設計とし、試験区にはS50F25を3%使用した。S50F25の栄養成分で判明していない可消化アミノ酸、有効リン、ビタミンおよび微量ミネラル等の含量は成分0として扱った。
【００５３】
試験開始および終了日齢を、それぞれ125および300とし、供試鶏は、試験用ウインドウレス鶏舎のケージ群飼（6羽／ケージ）とし、連続3ケージを1単位として取り扱い、各区72羽の計144羽使用した。試験期間を通じて、飼料摂取量、産卵率、総生産量ならびに飼料要求率に対して、S50F25が悪影響を及ぼすことはなく、S50F25のME測定結果の妥当性が示された。以上のことから、S50F25は、そのMEを3860として扱い、産卵鶏用飼料への使用を3%とした場合、産卵成績に支障を及ぼすことなく使用し得ることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醤油粕入り発酵飼料の製造方法に関し、さらに具体的には、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物の作用により醤油粕特有の臭いを脱臭し、且つフィターゼの供給源としても機能する醤油粕入り発酵飼料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
醤油は、日本人の食生活に欠かすことのできない必需品として多量に消費されており、その副生される醤油粕の発生量は年間十数万トンに達する。この醤油粕の有効な処理方法は当業者の重要な課題の一つである。
【０００３】
現状での醤油粕のほとんどが、焼却等によって産業廃棄物として処理されており、家畜用の飼料や農産物の肥料として有効利用されているのは極一部に過ぎない。その理由として、醤油粕は塩分を多量に含んでいるため、飼料や肥料としての配合量はごく少量（５％未満、通常1〜2％程度）に限られること、醤油粕は臭気が強く、混合飼料を製造しても醤油粕由来の臭気が強く残存し、飼料としての価値を低下させることなどが挙げられる。また、この醤油粕の臭気は作業従事者に敬遠されるばかりでなく、混合飼料等を作製する際に使用した機器にいつまでも醤油粕由来の臭気が残存するなどの理由によっても、醤油粕の利用範囲は制限されていた。
【０００４】
また、焼却にあたっては、塩による金属腐食やダイオキシンの発生防止のため、特殊な焼却炉を使用する必要があるなど問題点が多い。さらに、食品リサイクル法が施行され、醤油工場の産業廃棄物の削減およびリサイクルが問題となっており、廃棄物の有効利用という観点でも飼料・肥料への利用が望まれている。
【０００５】
これらのことを解決するために様々な方法が考案されてきたが、いずれも充分な効果をあげているとはいえない。それらの方法はいずれも醤油粕の問題点（醤油粕の食塩、臭い）をある程度解決することはできるが、栄養価が高く、安価な輸入原料が容易に入手できる現状では醤油粕の飼料・肥料としての価値が低く、採算性があわないことが実用化に至らない原因であると考えられる。従って、醤油粕を有効利用するためには、減塩、脱臭が重要ではあることはもちろんだが、処理物の付加価値を向上することが非常に重要であるといえる。
【０００６】
一方、有力な醤油粕の利用分野である畜産分野での問題点のひとつに、家畜の糞尿中に含まれるリンによる河川、湖の富栄養化がある。これは、家禽や豚などの単胃動物は消化器官内でフィターゼが分泌されず、穀物中に含まれるフィチンの30%程度しか利用できないため、飼料中にリン酸カルシウムなどの鉱物性無機リンが家畜の要求量に応じて使用されていることが原因とされている。現在では、家禽や豚用飼料には定常的にフィターゼ（フィチンからリン酸とイノシトールを生成する酵素）を添加することで、鉱物性リンの添加を削減するようになってきた。
【０００７】
一般的な飼料へのフィターゼの添加量は鶏用で200〜500単位/kg、豚用で300〜1000単位/kgといわれている。なお、ここでいうフィターゼの1単位は37℃で1分間に1マイクロモルの無機リン酸を生成する酵素量と定義されている。
【０００８】
現在、上記目的で使用されているフィターゼ剤は、主にアスペルギルス属由来のフィターゼを遺伝子組換え技術を利用して製造したものである。しかし、食の安全・安心が求められる昨今では、遺伝子組換え技術を使用した酵素剤を使用するのは世間の不安をあおる可能性がある。
【０００９】
また、非遺伝子組換えのフィターゼ生産菌としては、アスペルギルス属（アスペルギルス・フィキューム、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニガーなど）、ペニシリウム属、リゾプス属、ノイロスポラ属などのカビやサッカロミセスなどの酵母、バチルスなどの細菌が挙げられる。しかしながら、醤油粕の有効利用の観点からは、そのまま食べられる微生物による発酵が好ましい。アスペルギルス・フィキュームやアスペルギルス・フミガタスなどの有害菌はもちろんのこと、焼酎麹（アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・カワチなど）やブルーチーズに使用するアオカビ（ペニシリウムなど）はカビ菌体を除去して食するもので、食習慣はあるものの、そのまま添加される飼料についてまで、その安全性を担保するものではない。
【００１０】
このような観点から食用に耐え得るフィターゼ生産菌としては、味噌に使用するアスペルギルス・オリゼー、テンペに使用するリゾプス・オリゴスポラス等リゾプス属、オンチョームに使用されるノイロスポラ属等が挙げられる。本発明者らは、ノイロスポラ属及びリゾプス属のカビを小麦フスマ等の培地で固体培養することで、培地中にフィターゼを蓄積することを発見した（特許第２１２８７３７号）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って本発明は、醤油粕の臭いが安全な手段で脱臭されており、且つフィターゼの供給の一助となる醤油粕入り発酵飼料の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本件発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、直接食品に混入しても安全であることが確認されている、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を醤油粕を含む固体培地で培養することにより、醤油粕の臭いを脱臭することができ、かつフィターゼの供給の一助となるのに十分な量のフィターゼを蓄積することを見出し本発明を完成した。
【００１３】
従って、本発明は、固形物全重量に対して90重量％以下の醤油粕と固形物全重量に対して10重量％以上の固体飼料原料との混合物及び当該混合物重量に対して80〜150重量％の水からなる固体培地で、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を培養し、２単位/ｇ以上のフィターゼを蓄積させることを特徴とする醤油粕入り発酵飼料の製造方法を提供する。
【００１４】
上記の方法において、脱臭の完全性及びフィターゼの蓄積量の観点から、好ましくは、固形物全重量に対する醤油粕の量が70重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が30％以上であり、さらに好ましくは、固形物全重量に対する醤油粕の量が60重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が40％以上であり、更に好ましくは、固形物全重量に対する醤油粕の量が50重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が50％以上である。
【００１５】
好ましくは、フィターゼの蓄積量は４単位／ｇ以上であり、更に好ましくは９単位／ｇ以上であり、更に好ましくは15単位／ｇ以上である。
前記ノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）の好ましい例として、独立行政法人製品評価技術基盤機構微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されているノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）及びノイロスポラ・シトフィラNA37株（NITE AP-230）が挙げられ、前記リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）の好ましい例として、リゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）及びリゾプス・オリゴスポラスKT27株（NITE AP-231）が挙げられる。
【００１６】
前記固体飼料原料は、例えば、小麦フスマ、米糠、豆腐粕、油粕、大豆粕、節粕、コーングルテンミール、醤油製造時に副生する生オリ、又は醤油製造時に副生する火入れオリ、あるいはこれらの２種類以上混合物である。
本発明の１態様においては、更に、油脂類、醤油油が添加される。
本発明は更に、上記のようにして製造した醤油粕入り発酵飼料を、飼料全重量に対して10重量％以下の量で飼料に添加することを特徴とする、醤油粕入り混合飼料の製造方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
微生物
本発明においては、フィターゼ生産能を有し、且つ安全性が確認されている微生物として、ノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を使用する。これらの微生物は、フィターゼ生産能の程度に関係なく醤油粕の臭いを脱臭する能力を有する。従って、微生物の選択は、主としてフィターゼの生産能を考慮して行なわれる。
【００１８】
一般に、飼料へのフィターゼの添加量は、養鶏用飼料で200〜500単位/kg、養豚用飼料で300〜1000単位/kgといわれる。従って、醤油粕が食塩を含むためにその飼料への添加量が５％未満に限定されることを、考慮すれば、本発明の醤油粕入り発酵飼料中のフィターゼ量は20単位/ｇ以上であることが望ましい。しかしながら、飼料に添加されるフィターゼの全てを本発明の醤油粕入り発酵飼料により賄う必要はなく、飼料へのフィターゼ添加の一助となればよい。したがって、本発明の醤油粕入り発酵飼料中のフィターゼの量は２単位/ｇ以上あればよい。
【００１９】
従って、本発明において使用する微生物としては、フィターゼ生産能を有することが知られている既知の微生物、例えばノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）NBRC 31635、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）NBRC 8631などを挙げることができ、これらはNBRC（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター）から入手可能である。
しかしながら、前記の如く、本発明の微生物としては、できるだけフィターゼ生産能の高いものが好ましく、このためにはフィターゼ高生産性変異株を得るのが好ましい。変異株は目的とする変異株を得るための常法に従って得ることができる。
【００２０】
その具体的な方法を実施例２に示す。それによれば、ノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）については、ノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）、ノイロスポラ・シトフィラNA37株（NITE AP-230）、ノイロスポラ・シトフィラNA33株など数本のフィターゼ高生産株が比較的高い効率（およそ10,000株中１株）で得られた。従って、本発明によれば、上記の寄託されている変異株のみならず、同等の変異株を容易に作出して使用することができる。なお、ノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）及びノイロスポラ・シトフィラNA37株（NITE AP-230）は、少なくとも20単位/ｇのフィターゼ生産能を有する（実施例３）。
【００２１】
また、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）については、リゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）、リゾプス・オリゴスポラKT27株（NITE AP-231）、リゾプス・オリゴスポラKT26など数本のフィターゼ高生産株が比較的高い効率（およそ10,000株中１株）で得られた。従って、本発明によれば、上記の寄託されている変異株のみならず、同等の変異株を容易に作出して使用することができる。なお、リゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）は少なくとも６単位/ｇ以上のフィターゼ生産能を有する（実施例３）。
【００２２】
なお、本発明においては、フィターゼの１単位は、5mMフィチン酸ナトリウム溶液を含む100mM酢酸緩衝液(pH5.7)中で37℃にて反応させ、１分間に1マイクロモルの無機リン酸を遊離させる酵素量と定義する。
【００２３】
醤油粕
本発明に使用できる醤油粕は、特別なものに限定されない。すなわち、本醸造方式、新式醸造方式、アミノ酸液混合方式、酵素処理液混合方式など各種方式により副製する醤油粕を原料として使用できる。これらの醤油粕は乾燥処理を施したものであっても施してないものであってもよい。また、通常の醤油粕の他に、食塩存在で麹を加水分解して得られる水不溶画分、醤油様調味液を製造する際に得られる水不溶画分、しょっつるなどの魚醤油を製造する際に得られる水不溶画分などの各種含塩調味液製造時に得られる水不溶画分も本発明方法の原料として使用することができる。したがって、本明細書中の「醤油粕」は、上記のものを全て包含する。
【００２４】
飼料原料
混合する飼料原料としては、本発明の微生物の固体培地として使用できるものであれば特に限定されない。例えば、小麦フスマ、米糠、豆腐粕、油粕、大豆粕、節粕、トウモロコシ澱粉の製造の再に副生するコーングルテンミール、醤油製造時に副生する生オリや火入オリなど、食品工場で排出される未利用資源など、広範囲のものが使用可能である。これらの２種類以上を混合して使用することもできる。
【００２５】
培地の調製
培地の調製に当っては、所定量の醤油粕と所定量の上記の飼料原料とを混合し、これに、前記醤油粕と飼料原料との合計重量（100％）に対して80〜150重量％の水を加えて全体を混合する。ここで、水の量80〜150％とは、例えば醤油粕と飼料原料との合計重量100kgに水を80〜150kg添加することを意味する。水分量が少なすぎると微生物の増殖が不十分となり、水分が多すぎると固体培地中の通気が悪くなり、やはり微生物の増殖が不良となる。次に殺菌を行なう。殺菌は例えば、121℃（ゲージ圧：１気圧）にて15〜30分間蒸気殺菌（オートクレーブ殺菌）すればよい。
培養
培養のための種菌としてわざわざ麹を調製する必要がなく、胞子を醤油粕含有固体培地に混合するだけで微生物の接種を完了させることができる。胞子の接種量は１×103個／ｇ固体培地以上、好ましくは１×105〜106個／ｇ固体培地、程度であればよい。接種量が上記の範囲よりも少ない場合には、培養時間が長期化したり、他の微生物の汚染を受けたりして好ましくない。培養温度は麹菌の通常の生育範囲でよく、特に温度管理は必要とするものではないが、胞子が発芽、麹菌の生育のための好条件としては25〜40℃の範囲が適当である。
【００２６】
培養中の通気は特に必要としないが、酸欠のため菌の生育の停止、菌の死滅を防止する程度の通気を適宜行えばよい。培養時間は水分含量、培養温度、pH等により異なるが、通常は16〜48時間程度の培養時間が適当である。醤油油の添加方法は特に限定されないが、培地にはじめから加えてもよいが、酵素の生産を考慮すると発酵終了直前に添加するのが好ましい。培養終了及び乾燥は、30〜70℃の加熱乾燥処理により行うことができる。
【００２７】
醤油油の添加
醤油の製造においては、醤油粕のみならず醤油油も副生し、醤油油も醤油臭を有するので、そのままでは利用できない。しかしながら、脱臭すれば飼料の栄養成分として有用である。従って、本発明の一つの態様として、醤油油を固体培地に最初から添加して微生物の培養を行なうか、または培養開始後培養終了前に、培養物に醤油油を添加することができる。この方法により脱臭された醤油油を含み脂肪分が強化された、醤油粕入り発酵飼料添加物を得ることができる。更には醤油油に限らず油脂類を添加しても良い。油脂類とは例えば、食用油、米油、ヤシ油、魚油、アマン油脂である。
【００２８】
飼料の製造
本発明の飼料原料は醤油粕に由来する食塩を通常３％程度含むので、飼料への添加量はおよそ10％未満に制限される。従って、本発明の醤油粕入り混合飼料の製造方法は、本発明の醤油粕入り発酵飼料を飼料に対して10％未満の量で添加することを特徴とする。
【実施例】
【００２９】
以下、実験例および実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
実施例１. 各種の麹菌での醤油粕の発酵試験
醤油粕：小麦フスマ：水を1：1：２の重量比で混合した培地25gを500ml容メリクロンフラスコにいれてオートクレーブ殺菌(121℃、15分)し、あらかじめPDA斜面寒天培地に培養しておいた各種麹菌（表１に記載）を1白金耳接種し、30℃、3日間培養した。得られた培養物を50℃、６時間通風乾燥を行った後、培養物3gに生理食塩水27mlを加え、ホモジナイズ（12,000rpm、2分）し、ホモジネートをNo.６濾紙で濾過して濾液を得た。この濾液について下記の方法に従ってフィターゼ活性を測定した。
【００３０】
即ち、あらかじめ、37℃に保温しておいた5mMフィチン酸ナトリウム溶液を含む100mM酢酸緩衝液(pH5.7)0.9mlに上述の濾液0.1mLを加えて、37℃にて20分間反応させた。対照としてフィチン酸ナトリウムを含まない100mM 酢酸緩衝液(pH5.7)を用いて同様の操作を行った。反応終了後、フィスケ・スバロー法に従って遊離したリン酸の定量を行った。フィターゼ活性の１単位は上記酵素活性測定条件下において１分間に1マイクロモルの無機リン酸を遊離させる酵素量と定義した。
【００３１】
醤油粕臭の評価方法は、パネラーは5名で行い、処理前の臭気を5とした場合の臭気の程度をその強弱に応じて5〜0の6段階で評価したものである。
その結果、表１に示したように、ノイロスポラ属及びリゾプス属のカビで発酵させることで、培地中にフィターゼが生産されることが分かった。また、飼料添加物として添加されているキシラナーゼ、CMCase、β-ラクタマーゼ、リパーゼの生産も認められた。脱臭効果はいずれもわずかにカビ臭がするものの、醤油粕臭は残っておらず、室温で1ヶ月放置したあと、戻り香を評価したが、戻り香もなかった。
【００３２】
【表１】
【００３３】
実施例２. ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635及びリゾプス・オリゴスポラスNBRC 8631の変異処理による高フィターゼ活性変異株の取得
ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635及びリゾプス・オリゴスポラスNBRC 8631の胞子懸濁液を調製し、常法に従ってUV照射を行い、変異を誘発させた。UV処理した胞子懸濁液をPDA平板培地に塗沫し、生育した候補株をPDA斜面培地に釣菌して30℃、3日間培養した。微生物培養用プレート内で1mLの液体培地（0.3％ポリペプトン、0.3％酵母エキス、0.3％麦芽エキス、１％ぶどう糖、pH5.5）に候補株を1白金耳接種し、30℃、１週間培養した。菌体を除去した培養上清0.01mLを用いて、5mMフィチン酸ナトリウム溶液を含む100mM酢酸緩衝液(pH5.7) 0.1mLを加えて、37℃にて20分間反応させた。反応終了後、フィスケ・スバロー法に従って遊離リン酸の分析を行い、目視により高フィターゼ活性変異株を選択した。
【００３４】
実施例３. 変異株を使用した醤油粕と小麦フスマでの発酵処理
醤油粕と小麦フスマを1：3で混合し、等量の水を加えた培地（１）と、醤油粕と小麦フスマを1：1で混合し等量の水を加えた培地（２）をそれぞれ10gとり、100ml容三角フラスコに入れてオートクレーブ殺菌し、上記実施例２で作成した高フィターゼ活性変異株を１白金耳接種し、30℃にて３日間培養した。得られた発酵物を通風乾燥を行った後、実施例１に記載した方法に従ってフィターゼ活性（単位/ｇ）を測定した結果を下記表に示した。なお、醤油粕臭はいずれも全く感じなかった。得られた高フィターゼ活性変異株の中からノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）、NA37株（NITE AP-230）とリゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）、KT27株（NITE AP-231）を寄託した。
【００３５】
【表２】
【００３６】
実施例４. ノイロスポラ・シトフィラNA38株を使用した醤油粕と豆腐粕での発酵処理
醤油粕と豆腐粕を下記表の割合で混合し、等量の水を加えた培地（３）〜（７）をそれぞれ10gとり100ml容三角フラスコに入れてオートクレーブし、ノイロスポラ・シトフィラNA38株を１白金耳接種し、30℃、３日間培養した。得られた発酵物を通風乾燥を行った後、実施例１に記載した方法に従ってフィターゼ活性（単位/ｇ）と醤油粕臭を評価した結果、表３に示したように醤油粕の配合割合によってフィターゼ活性は低下するが、醤油粕90%の培地でもノイロスポラ・シトフィラNA38株は生育し、フィターゼ活性と脱臭効果を発揮することが分かった。
【００３７】
【表３】
【００３８】
実施例５. 醤油油を添加した醤油粕と豆腐粕と米糠の発酵処理
醤油粕と豆腐粕と米糠を下記表の割合で混合し、等量の水を加えた培地（８）〜（10）をそれぞれ50gとり500ml容メリクロンフラスコに入れてオートクレーブし、ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635を１白金耳接種し、30℃、３日間培養した。培地（11）及び（12）については、培地（８）で培養した後、培養終了１時間前に醤油油を添加した。培養終了後、50℃、６時間通風乾燥を行い、得られた発酵物を上記1に記載した方法に従ってフィターゼ活性（単位/ｇ）と醤油粕臭を評価した。
【００３９】
その結果、表４に示したように醤油油を培地に混合してもノイロスポラ・シトフィラNBRC31635は生育し、醤油粕ならびに醤油油の臭いは完全に除去された。しかし、フィターゼ活性は有意に低下してしまった。そこで、醤油油を酵素生産が終了した時点で添加し、１時間放置した後、乾燥することでフィターゼ活性を低下させることなく、醤油粕と醤油油の臭いを除去することが出来た。
【００４０】
【表４】
【００４１】
実施例６. リゾプス・オリゴスポラスKT28株を使用した醤油粕と豆腐粕での発酵処理
醤油粕と豆腐粕と菜種粕と小麦フスマを5：10：3：2の割合で混合し、等量の水を加えた培地（13）と醤油粕と豆腐粕と小麦フスマを2：1：1の割合で混合し等量の水を加えた培地（14）をそれぞれ10gとり100ml容三角フラスコに入れてオートクレーブし、リゾプス・オリゴスポラスKT28株を１白金耳接種し、30℃にて３日間培養した。得られた発酵物を上記1に記載した方法に従ってフィターゼ活性と醤油粕臭を評価した結果、培地（13）で6.2単位/ｇ、培地（14）で4.1単位/ｇのフィターゼ活性が得られた。いずれも醤油粕臭はほとんど感じなかった。
【００４２】
実施例７. ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635を使用した大規模発酵処理（醤油粕25%）
醤油粕25%、豆腐粕25%、米糠25%、菜種粕15%、コーングルテンミール10%の割合で混合した培地100kgに等量の水を加え、100℃、30分間殺菌したものを製麹機に移し、30℃まで冷却した後、種麹としてノイロスポラ・シトフィラNBRC31635胞子を接種して混合し、30℃にて3日間培養した。製麹中は1日目、2日目にそれぞれ手入れ（混合・攪拌）をして均一にした。発酵終了後、発酵物を通風乾燥（50℃、6時間）させ、粉砕機にて粉砕した。得られた発酵物のフィターゼ活性は9.8単位/gであった。醤油粕臭は全く感じなかった。以下、本方法で製造された醤油粕入り発酵飼料を「S25」と略称する。
【００４３】
実施例８. ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635を使用した大規模発酵処理（醤油粕50%）
醤油粕50%、豆腐粕25%、米糠25%の割合で混合した培地100kgに等量の水を加え、121℃、15分の加圧殺菌したものを製麹機に移し、30℃まで冷却した後、種麹としてノイロスポラ・シトフィラNBRC31635胞子を加えて混合し30℃にて3日間培養した。製麹中は1日目、2日目にそれぞれ手入れ（混合・攪拌）をして均一にした。発酵処理終了後、発酵物を通風乾燥（50℃、6時間）させた後、粉砕機にて粉砕した。得られた発酵物のフィターゼ活性は3.0単位/gであった。醤油粕臭は全く感じなかった。以下、本方法で製造された醤油粕入り発酵飼料を「S50」と略称する。
【００４４】
実施例９. ノイロスポラ・シトフィラNBRC31635を使用した大規模発酵処理（醤油粕50%+醤油油25%）
醤油粕50%、豆腐粕25%、米糠25%の割合で混合した培地100kgに等量の水を加え、121℃、15分の加圧殺菌したものを製麹機に移し、30℃まで冷却した後、種麹としてノイロスポラ・シトフィラNBRC31635胞子を加えて混合し30℃にて3日間培養した。製麹中は1日目、2日目にそれぞれ手入れ（混合・攪拌）をして均一にした。フィターゼ活性を確認した後、醤油油25kgを添加した。1時間後に発酵物を通風乾燥（50℃、6時間）し、粉砕機で粉砕した。得られた発酵物のフィターゼ活性は3.0単位/gであった。醤油粕及び醤油油臭は全く感じなかった。以下、本方法で製造された醤油粕入り発酵飼料をS50F25と略称する。
【００４５】
実施例10. ノイロスポラ・シトフィラを用いた醤油粕混合飼料（S25）の豚への効果
上記6に記載のS25を用いて、現在使用している酵素剤にかわり、ノイロスポラ・シトフィラの生産するフィターゼが養豚用飼料として実際に応用できるかどうかについて以下の方法で検証した。すなわち、フィターゼを含まない対照区飼料（リン含量0.55%）に対し、S25を５％含んだ試験飼料（リン含量0.45%、フィターゼ活性約500単位）を作成し、リンの消化率と出納について調査した。その結果、子豚のリンの消化率は対照区飼料よりも有意に増加し（対照区57.6% vs 試験区73.1%）、リンの蓄積率は同等であった（対照区5.41g/day vs 試験区5.19g/day）。これにより、豚に対するS25のフィターゼ効果は証明された。
【００４６】
次に、S25を一般飼料に配合し、豚の成長および肉質に如何なる影響を及ぼすかについて調査した。平均体重約68kgの豚６頭を２区に分け、一般飼料（粗蛋白質14%、可消化養分総量77%）とS25を5%配合した試験飼料（粗蛋白質14%、可消化養分総量77%）を各々給与し、平均体重約112kgまで飼育した。その間の飼料摂取量（一般飼料2.863kg/day vs S25試験飼料2.966kg/day）、日増体量（一般飼料0.879kg/day vs S25試験飼料0.968kg/day）、飼料要求率（一般飼料3.257 vs S25試験飼料3.064）は、いずれもS25配合試験飼料区の方が優れた値を示した。従ってS25は、豚成長に対して負の影響をもたないばかりか、むしろ改善する可能性が示唆された。
【００４７】
また、これら供試豚の肉質について調査したところ、肉色、背脂肪融点、背脂肪脂肪酸組成のいずれのパラメーターも一般飼料区と同等であり、S25配合の悪影響は認められなかった。また、この供試豚の肉を用いてロース肉、バラ肉の３点識別官能検査を実施したが、統計的な差はなかった。従って、S25は豚肉質に何ら悪影響を及ぼさないことが判明した。
【００４８】
実施例11. ノイロスポラ・シトフィラを用いた醤油粕混合飼料（S25）の鶏への効果
市販産卵鶏飼料には，フィターゼが飼料添加物として認可され広く普及している。従って、S25を飼料に配合すれば、飼料添加物としてのフィターゼの代替として期待できることになる。本試験では、S25が市販飼料添加物フィターゼ代替として使用し得るかを調査した。試験区は、採卵鶏用に推奨されるフィターゼ300単位/kg飼料となるように調整した市販フィターゼ区、および、フィターゼ294単位/kg飼料となるように調整したS25区（S25を3%配合）の２区とし、各試験飼料の栄養成分は等しくなるように調整した。
【００４９】
供試鶏は、試験用ウインドウレス鶏舎のケージ単飼とし、各区6羽の計12羽使用し、試験開始日齢は705で、試験期間を8週間とした。S25給与が体重、飼料摂取量、産卵率および卵重に悪影響を及ぼすことはなかった。また、卵の品質に関与する、ハウユニット、卵比重においても同様に悪影響を及ぼすことはなかった。以上のことから、S25を3%配合し、フィターゼ294単位/kg飼料となるように調整した飼料を産卵鶏に給与すれば、市販フィターゼを用いてフィターゼ300単位/kg飼料となるよう調整した飼料を産卵鶏に給与した場合と同等の結果が得ることがわかった。
【００５０】
実施例12. ノイロスポラ・シトフィラを用いた醤油粕混合飼料（S50、S50F25）の豚への効果
S50及びS50F25のもつ効果について検証するため、S50及びS50F25の消化率について調査した。粗蛋白質15.8%、可消化養分総量77.3%の基礎飼料およびこの基礎飼料にS50及びS50F25をそれぞれ20%配合した飼料を摂取させ、基礎飼料、S50混合飼料、S50F25混合飼料の消化率を測定した。その結果、S50のTDNは63.3%、S50F25のTDNは85.6%であり、中でも粗脂肪の消化率が顕著に向上し（基礎飼料58.5% vs S50混合飼料63.7%）、S50自体の粗脂肪消化率は65〜83.7%を示した。また、同様の傾向はS25にも認められた（基礎飼料58.7% vs S25混合飼料72.7%）。従って、醤油粕とその他飼料原料を配合したものを本発明の方法で処理したものには、飼料中粗脂肪の消化率を向上させる効果があることが確認された。
【００５１】
実施例13. ノイロスポラ・シトフィラを用いた醤油粕混合飼料（S50、S50F25）の鶏への効果
S50およびS50F25のいずれにおいても鶏用飼料に使用するためには、それらの代謝エネルギー値（ME, kcal/kg）が飼料設計において不可欠となる。そこで、S50およびS50F25のME測定を実施した。供試鶏は，試験用ウインドウレス鶏舎のケージ群飼（8から9羽／ケージ）で1ケージ1単位とし，各区16または17羽の計50羽使用した。試験開始日齢は56とした。試験飼料順化期間を5日とし、その後2日間をME測定期間とした。MEは，飼料の全エネルギー摂取量から糞尿の全排泄エネルギーの差に窒素補正を加えた結果とした。
【００５２】
S50およびS50F25のMEは、それぞれ2735および3860の結果を得た。鶏用飼料原料としての価値は，MEの観点からS50F25がS50より優れるので、S50F25を産卵鶏に給与することで、ME測定結果の妥当性を調査した。飼料は，対照区と試験区ともに同一の栄養成分設計とし、試験区にはS50F25を3%使用した。S50F25の栄養成分で判明していない可消化アミノ酸、有効リン、ビタミンおよび微量ミネラル等の含量は成分0として扱った。
【００５３】
試験開始および終了日齢を、それぞれ125および300とし、供試鶏は、試験用ウインドウレス鶏舎のケージ群飼（6羽／ケージ）とし、連続3ケージを1単位として取り扱い、各区72羽の計144羽使用した。試験期間を通じて、飼料摂取量、産卵率、総生産量ならびに飼料要求率に対して、S50F25が悪影響を及ぼすことはなく、S50F25のME測定結果の妥当性が示された。以上のことから、S50F25は、そのMEを3860として扱い、産卵鶏用飼料への使用を3%とした場合、産卵成績に支障を及ぼすことなく使用し得ることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形物全重量に対して90重量％以下の醤油粕と固形物全重量に対して10重量％以上の固体飼料原料との混合物及び当該混合物重量に対して80〜150重量％の水からなる固体培地で、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を培養し、２単位/ｇ以上のフィターゼを蓄積させることを特徴とする醤油粕入り発酵飼料の製造方法。
【請求項２】
固形物全重量に対する醤油粕の量が70重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が30％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固形物全重量に対する醤油粕の量が60重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が40％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
固形物全重量に対する醤油粕の量が50重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が50％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
フィターゼの蓄積量が４単位/ｇ以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
フィターゼの蓄積量が９単位/ｇ以上である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
フィターゼの蓄積量が15単位/ｇ以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）が、ノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）又はノイロスポラ・シトフィラNA37株（NITE AP-230）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）が、リゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）又はリゾプス・オリゴスポラスKT27株（NITE AP-231）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体飼料原料が、小麦フスマ、米糠、豆腐粕、油粕、大豆粕、節粕、コーングルテンミール、醤油製造時に副生する生オリ、又は醤油製造時に副生する火入れオリ、あるいはこれらの２種類以上混合物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
更に、油脂類を添加する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記油脂類が醤油油である、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜12のいずれか１項に記載の醤油粕入り発酵飼料を、飼料全重量に対して10重量％以下の量で飼料に添加することを特徴とする、醤油粕入り混合飼料の製造方法。
【請求項１】
固形物全重量に対して90重量％以下の醤油粕と固形物全重量に対して10重量％以上の固体飼料原料との混合物及び当該混合物重量に対して80〜150重量％の水からなる固体培地で、フィターゼ生産能を有するノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）種又はリゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）種に属する微生物を培養し、２単位/ｇ以上のフィターゼを蓄積させることを特徴とする醤油粕入り発酵飼料の製造方法。
【請求項２】
固形物全重量に対する醤油粕の量が70重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が30％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固形物全重量に対する醤油粕の量が60重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が40％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
固形物全重量に対する醤油粕の量が50重量％以下であり、固形物全重量に対する固体飼料原料の量が50％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
フィターゼの蓄積量が４単位/ｇ以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
フィターゼの蓄積量が９単位/ｇ以上である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
フィターゼの蓄積量が15単位/ｇ以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ノイロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）が、ノイロスポラ・シトフィラNA38株（NITE AP-229）又はノイロスポラ・シトフィラNA37株（NITE AP-230）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）が、リゾプス・オリゴスポラスKT28株（NITE AP-232）又はリゾプス・オリゴスポラスKT27株（NITE AP-231）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記固体飼料原料が、小麦フスマ、米糠、豆腐粕、油粕、大豆粕、節粕、コーングルテンミール、醤油製造時に副生する生オリ、又は醤油製造時に副生する火入れオリ、あるいはこれらの２種類以上混合物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
更に、油脂類を添加する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記油脂類が醤油油である、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜12のいずれか１項に記載の醤油粕入り発酵飼料を、飼料全重量に対して10重量％以下の量で飼料に添加することを特徴とする、醤油粕入り混合飼料の製造方法。
【公開番号】特開２００７−３００８５１（Ｐ２００７−３００８５１Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１３２３７２（Ｐ２００６−１３２３７２）
【出願日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５９１１７５３３２）イチビキ株式会社 (6)
【出願人】（５９３１４９４９８）豊橋飼料株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５９１１７５３３２）イチビキ株式会社 (6)
【出願人】（５９３１４９４９８）豊橋飼料株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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