集積リアルタイムＣＥ検出を用いるマイクロチップ大容量ＰＣＲ
大容量のＰＣＲ、及びエンドポイント又はリアルタイム・キャピラリー電気泳動検出を実施するための適切に集積された構造体を有するマイクロ流体デバイスが提供される。マイクロ流体デバイスは、核酸を増幅するためのチャンバーを有する基材；基材上に配列されたウエル；チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び基材に具備され、チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するためにチャンバーに接続された、１以上の分離チャンネル；を含む。チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルは、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネル中の流体力学的流体抵抗の少なくとも１／１０３以下となるように構成される。本マイクロ流体デバイスは、高い費用対効果を有しながら非常に高感度な検出を達成できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００７年６月１１日に出願された米国仮出願番号６０／９４３，２４８号の優先権を主張し、それは本明細書に参照によって組み入れられている。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、大容量のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び集積キャピラリー電気泳動（ＣＥ）検出を実施するためのマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
マイクロ流体ＰＣＲは、例えば、０．５〜５００μLの範囲の間の非常に小さな寸法を有するチャンバー中のＰＣＲとして一般的に定義される。ゾーンヒーティング、外部ヒーター、集積化抵抗器、ジュール加熱及び赤外線放射のような種々の加熱システムを用いるマイクロ流体システムがあるが、それらのシステムは外部検出を必要とする。それは、反応の終点で、いくつかのサンプルをＰＣＲチャンバーから物理的に取り出し、そしてシステム外でゲル電気泳動又は毛細管電気泳動などの手段によって分析しなければならないことを意味する。このタイプの研究の代表的な例が、Chengらの非特許文献１；Kopp及びManzの非特許文献２；Odaの非特許文献３；及びChenらの非特許文献４に記載されている。外部検出を必要とするシステムは、外部測定を行うに際し、大部分のＰＣＲ反応溶液の取り出しを必要とするため、そのようなシステムはリアルタイム検出機能に適さない。
【０００４】
別の検出方法では、SYBR Greenのようなインターカレーター色素（非特許文献５）や、タックマン・プローブのような蛍光性プローブ（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；及び非特許文献９）を含む光学的検出が使用されている。SYBR Green色素は、ＰＣＲサイクル中に増幅するＤＮＡ産物を検出するための非常に特異的な、二本鎖ＤＮＡ結合色素である。両検出方法とも、リアルタイムＰＣＲ増幅において使用できるが、インターカレーター色素とタックマン・プローブ技術との違いは、インターカレーター色素検出方法が特異的でないということである。従って、プライマー−ダイマー形成のような非特異的ＰＣＲ産物を含む全ての二本鎖ＤＮＡを検出してしまう。この理由から、インターカレーター色素を用いるＰＣＲ増幅では、所望のＰＣＲ産物と非特異的ＰＣＲ増幅とを区別するために、しばしば融解曲線の解析が必要となる。
【０００５】
対照的に、タックマン・プローブＰＣＲ検出法は、蛍光シグナルの発生がプローブと所望のＰＣＲ産物との特異的なハイブリダイゼーションに依存するため、非常に特異的である。しかしながら、タックマン・プローブＰＣＲ検出法では、SYBR Green色素と異なり、異なる配列に対して個々のプローブを合成する必要があり、プローブ標識化のために使用できる蛍光色素の制限によって制約され（例えば、異なる色の色素の数によって制限される）、また、高価な試薬が必要となる。
【０００６】
ＰＣＲのための代替検出法は、反応産物の電気泳動によるＤＮＡサイズの分離を行うことである。これによって、所望の反応産物を、全ての他のＤＮＡ源や汚染源から分離して同定することが可能となる。外部検出を用いる多くのマイクロ流体ＰＣＲシステムでは、特異的であり且つ標的物に特異的な合成プローブを必要としないため、ゲル上での又はキャピラリー電気泳動によるＤＮＡサイジングが行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nucleic Acids Res, 24(2), p.380-5 (1996)
【非特許文献２】Science, 280(5366), p.1046-8(1998)
【非特許文献３】Anal Chem,70(20), p.4361-8 (1998)
【非特許文献４】Anal Chem,77(2): p.658-66 (2005)
【非特許文献５】Rasmussen et al. Biochemica, 1998(2): p.8-111998
【非特許文献６】Kalinina, O. et al. Nucleic Acids Res, 25(10), p.1999-2004 (1997)
【非特許文献７】Belgrader,P. et al.Science, 284 (5413), p.449-50(1999)
【非特許文献８】Belgrader,P. et al. Anal Chem, 75(14), p.3446-50 (2003)
【非特許文献９】Northrup, M.A. et al. Anal Chem, 70(5), p.918-22 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
核酸の増幅及び検出のためのマイクロ流体システムが提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このシステムは、核酸を増幅するためのチャンバーを有する基材；基材上に配列されたウエル；チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び基材に具備され、チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、チャンバーに接続された１以上の分離チャンネル；を含む。チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルは、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルにおける流体力学的流体抵抗の、１／１０３以下、約１／１０３〜約１／１０９、約１／１０３〜約１／１０７、又は約１／１０４〜約１／１０６となるように構成される。流体力学的流体抵抗又は水力学的流体抵抗という用語は、圧力駆動流に対する抵抗を意味し、圧力差を流量比で割った比として定義できる。このシステムは、更に、分離を実施するためのサーマルサイクリングデバイスやその他の部材を含み得る。
【００１０】
更に、核酸を増幅するためのチャンバーを具備する基材；基材上に配列されたウエル；チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び基材に具備され、チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、チャンバーに接続された１以上の分離チャンネル；を含み、１以上の分離チャンネルの総体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の１／１００以下、約１／１００〜約１／１０００、又は約１／３００〜約１／１０００である、核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体システムが提供される。
【００１１】
本システムは、更に、分離を実施し、ＤＮＡを定量するためのサーマルサイクリングデバイスや光学的読取り制御デバイスを含み得る。
【００１２】
更にまた、核酸を増幅するためのチャンバーを具備する基材；基材に具備されたウエル；チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及びチャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、基材に具備され、チャンバーに接続する、１以上の分離チャンネル；を含み、１以上の分離チャンネル中の流体力学的流体抵抗がバルブの代わりとして機能するように、１以上の分離チャンネルの寸法が、フローチャンネル及びチャンバーの各々の寸法よりも小さい、核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体デバイスが供される。
【００１３】
更に、（１）核酸を増幅するためのチャンバー、ウエル、チャンバーを通って溶液の流れを可能とするためにウェルとチャンバーに接続されたフローチャンネル、及びチャンバーに接続された１以上の分離チャンネルを含むマイクロ流体デバイスを提供すること；（２）チャンバー中に核酸の溶液を配置すること；（３）チャンバー中に配置された核酸を増幅すること；（４）増幅された核酸の画分をチャンバーから１以上の分離チャンネル内に導入すること；（５）１以上の分離チャンネルを通して、増幅された核酸画分を分離すること；及び（６）分離された核酸を検出すること；を含む、核酸を増幅及び検出する方法が提供される。工程（３）〜（６）が、リアルタイム検出に対して１回以上の回数繰返されるか、又は工程（３）が１回以上の回数繰返された後に工程（４）〜（６）が１回実施される。本方法は、更に、（８）収集したデータに基にづいて、存在する核酸の量を定量することを含み得る。
【００１４】
従って、本デバイス及び方法はリアルタイム並びにエンドポイントＰＣＲアッセイに好適である。
【００１５】
核酸の分離は、動電学的方法を用いて実施できる。動電学的という用語は、電界に応じた溶液又は分子の運動を意味すると一般的に理解される。それは電界におけるイオンや荷電分子の運動である電気泳動、及び電界によるバルク溶液の運動である電気浸透を含む。核酸の分離は、電気泳動により実施でき、核酸は、分子篩いマトリックスの存在によるサイズ依存型の移動度を有する。しかしながら、他の核酸分離方法が存在し、マイクロ流体システム又はデバイスにおいて使用できる。例えば、ＤＮＡは、質量分析によりＤＮＡ断片を分離することによって配列が調べられてきた（米国特許第５６９１１４１号；Kosterら、Nature Biotech. Vol.14, p.1123 (1996)）。そして多くのマイクロ流体システムと質量分析とのインターフェイスが述べられてきた（例えば、米国特許第５８７２０１０号，第６８０３５６８号，及び第７１０５８１２号を参照）。別の核酸分離方法は、例えば、Lenigkらによって述べられたような、固定化されたプローブへのハイブリダイゼーションによるものである（Anal. Biochem. Vol.311, p.40 (2002)）。更なる制約がない限り、「分離すること」又は「分離」という用語は、一般的意味で使用される。
【００１６】
本発明の更なる特徴は、以下の記述において一部説明され、その記述から一部理解され、又は本発明の実施によって知り得る。本発明の特徴は、特に添付の請求項において指摘される要素及び組合せによって実現され、到達される。
【００１７】
これまでの一般的記述及び以下の詳細な記述の両者が、単に例示的かつ説明的なものであり、そしてクレームされたように本発明を制約するものではないと理解されるべきである。
【００１８】
この明細書中に組込まれ、そしてその一部を構成する添付図は、本発明の実施態様を例示し、そしてその記述と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。更に、本明細書で言及された全ての参考文献は、本明細書に参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】単一基材上でのＰＣＲ−ＣＥ能力を有するマイクロ流体チップの製造方法の例示的実施例である。
【図２】本発明のマイクロ流体システムの実施態様である。
【図３】本発明のマイクロ流体システムの別の実施態様である。
【図４】本発明のマイクロ流体デバイスの別の実施態様である。
【図５】本発明のマイクロ流体デバイスの実施態様を用いて得られた例示的なリアルタイムＰＣＲの成長曲線である。
【図６】本発明のマイクロ流体デバイスの実施態様の例示的なＣＥ分離グラフである。
【図７】本発明のマイクロ流体デバイスの別の実施態様である。
【図８】本発明のマイクロ流体デバイスの実施態様を用いたエンドポイントＰＣＲアッセイの結果である。
【図９】本発明のマイクロ流体デバイスの実施態様を用いたエンドポイントＰＣＲアッセイの別の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の本実施態様（例示的実施態様）について詳細に言及するが、その実施例が添付図において示されている。可能な限り、同じ又は同様の部品を参照するために、図全体を通して、同じ参照番号が使用されている。
【００２１】
本発明の実施態様であるマイクロ流体システムは以下の特徴を有するように構成されている：ＰＣＲチャンバーは、高感度なＤＮＡ増幅を行うために、約１μL〜約１００μL、約１０μL〜約７５μL、又は約２５μL〜約５０μLの体積を有する。一例として、もし信頼し得る増幅ができる最低コピー数が１０であれば、１０μLの体積においては、感度の制限はマイクロリッター当たり１コピーである。１００ｎLの体積においては、感度の制限はマイクロリッター当たり１００コピーであり、約１／１００以下となる。別の特徴は、十分なＤＮＡ増幅を達成するために、ＰＣＲチャンバーの内容物のサーマルサイクリングに適するようにシステムが装備されることである。更に別の特徴は、ＰＣＲチャンバーに接続された十分に小さな寸法のチャンネルのネットワークをシステムが有することである。分離チャンネルと呼ばれるチャンネルのネットワークは、チャンバー中に含まれる核酸の非常に小さな画分の解析を容易にするために、ＰＣＲチャンバーよりも小さな内部体積を有するように構成される。分離チャンネルの総体積は、ＰＣＲチャンバー及びフローチャンネル総体積の、約１／１００以下、約１／１００〜約１／１０００、又は約１／３００〜約１／１０００である。また、チャンネルの寸法は、これらのチャンネルの流体力学的流体抵抗が、ＰＣＲチャンバー及びそのチャンバーにつながるその他のチャンネルの値よりも確実にはるかに大きくなるように小さく保たれる。流体抵抗の比を、約１０３又はそれより高い、又は約１０３〜約１０９、又は約１０３〜約１０７、又は約１０４〜約１０６の範囲内で、非常に高くすることによって、如何なるバルブやプラグも使用せずにチャンネルでのゲート機能を達成することができる。別の特徴において、電気泳動ＤＮＡサイジング解析のためにチャンネルのネットワークが使用される。このサイジング解析を実施するために、チャンネルをＤＮＡ分子篩いマトリックスで充填するための、単純な交差チャンネルトポロジーを採用することができる。更に別の特徴は、全体システムの製作が単独の、使い捨て可能な基材においてなされる点である。
【００２２】
バルブやプラグの使用を避けることにはメリットがある。マイクロ流体バルブは存在するが、より多くの多層構造及び貼り合わせ位置精度が要求され、本明細書に述べられたシステムよりも複雑な製作配列が必要になる。そのため、バルブを有するシステムは使い捨て可能なデバイスとして製作するには概して高価になる。更に、マイクロ流体バルブには、デッド・ボリューム及び漏れ流れという欠点がある。Kohら（Anal. Chem., Vol.75, p.4591 (2003)）によって述べられるようなプラグやゲルバルブの使用は、コストパフォーマンスが低く、寿命も限られる。更に、架橋されたゲルプラグを通した核酸の輸送は比較的遅く、その解析時間が長くなる原因になる。その結果、リアルタイムＰＣＲ定量よりもむしろ、エンドポイント解析を実行するためにのみ実用的である。
【００２３】
核酸を輸送するために主として電気泳動力を用いることによって、ＰＣＲチャンバー中の少量の核酸の画分を、チャンバー中の溶液を除くことなく、解析のために移動させることができる。例えば、Slepnev（米国特許第７，０８１，３３９号）によって述べられているような１０μLのような少量の溶液の移動でさえ、ＰＣＲチャンバー中の核酸の画分を著しく失う結果になり、従ってリアルタイム解析が困難になる。
【００２４】
マイクロ流体チップ中の大きなＰＣＲチャンバーは、分離チャンネルの流体力学的流体抵抗が、大きなＰＣＲチャンバーの流体力学的流体抵抗よりも十分大きくなるように、小さなキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離チャンネルと組合わされ得る。高い分離を達成するためのＰＣＲチャンバーの抵抗に対する分離チャンネルの抵抗の比率は計算により求めることができる。ＰＣＲ−ＣＥチップを設計するために、推定された抵抗比の範囲に達するための例示的な計算によれば、圧力差、△Ｐが、溶液をＰＣＲチャンバーの中や外及び分離チャンネルに沿って動かすと仮定される。圧力差△Ｐは以下のように表すことができる：
【００２５】
【００２６】
式中、ＲchamberはＰＣＲチャンバーの流れに対する流体力学的抵抗であり、そしてＶchamberはＰＣＲチャンバーの体積である。計算を単純にするため、チャンバーの流体力学的抵抗が、非ＣＥ分離チャンネルであるフローチャンネルの抵抗を含むものと概算される（以下、チャンバーの抵抗にはフローチャンネルの抵抗が含まれているものと仮定する。）。流量比は、失われたチャンバー体積の画分を解析時間で割ることによって表すことができる。
【００２７】
【００２８】
式中、Ｑchamberはチャンバーを通る流量比であり、ｆは失われた体積の画分である。これらの変数に関して、流体力学的流体抵抗Ｒchamberが次のように与えられる。
【００２９】
【００３０】
分離チャンネルにおいて、流体抵抗方程式は以下のように同様に示される。
【００３１】
【００３２】
式中、Ｒsepは分離チャンネルの流体力学的流体抵抗であり、Ｑsepはこのチャンネルを通る流量比である。一般的に、ＰＣＲチャンバーに接続した複数の分離チャンネルが存在するため、この方程式は、図２又は図３において示されるような大抵のシステムを簡略化したものである。本明細書において、この簡略化は、流体力学的抵抗比をオーダーレベルで概算するための一例としてなされる。流体力学的抵抗Ｒsep及び流量比Ｑsepは、例えば、個々のチャンネル領域の直列及び並列の接続として計算され、システムの実際のチャンネルトポロジーを考慮することによってより正確に計算することができるが、計算目的のために、より複雑な状況を概算するための単純なシステムが仮定される。
【００３３】
分離チャンネルの最高流量比は、溶液のある許容できる溶液の移動度によって定義することができる。この最大溶液の移動度△ｘは、分離される種のバンド幅に関して定義することができる。圧力印加による流体がこれらのバンドの広がりの原因となる。分離能の劣化を避けるために、△ｘは、少なくともバンド幅の少なくとも１／２以下に設定される。バンド幅は分離チャンネル幅に依存するけれども、ＰＣＲ産物の解析に必要な代表的なマイクロ流体ＤＮＡ分離において、バンド幅は１００μｍ程度である。従って、△ｘは１０〜５０μｍの間であると推定される。
【００３４】
チャンネルの断面積がＡである場合、最大許容流量比
【００３５】
【００３６】
は以下のように表される。
【００３７】
【００３８】
流れを確実にこの値未満にするために必要なチャンネル中の最低流体抵抗
【００３９】
【００４０】
（最低分離チャンネル抵抗）は以下のように与えられる。
【００４１】
【００４２】
圧力差及び解析時間は一般に既知ではなく、固定されていない。従って、最低分離チャンネル抵抗の要求を、分離チャンネル抵抗のＰＣＲチャンバー抵抗に対する比に関して表すことが有用である。
【００４３】
【００４４】
従って、この式は、バルブ無しでのＰＣＲチャンバーとＣＥ分離のためのチャンネル一式の集積化を可能にする、流体抵抗の最低要求比を定義する。
【００４５】
流体抵抗比の推定範囲は、この方程式に基づいて与えられる。高感度ＰＣＲに対しては、比較的大きな体積が要求される。例えば、病原体を１００ＣＦＵ／ｍＬの濃度で検出するためには、少なくとも一個の病原体が確実に存在するために少なくとも数十μＬの体積が必要とされる。例示的なチャンバー体積は２５μＬである。解析に実質的な影響を及ぼすことなく失うことができる画分は、約０．１であると仮定される。この画分は一例であり、より少ないほうが良いものの、幾つかの状況においては、より大きな画分を失うことが許容される。従って、上記式の分子の例示的値は２．５μLであると推定される。マイクロ流体チャンネルの断面は広い範囲に亘って変わり得るが、マイクロ流体分野においては、例えば、側部から側部までの長さが約１０μｍ〜約１００μｍである。従って、本実施例では、３０μｍ×３０μｍの平均寸法が選択される。上述したΔｘの値の範囲は、平均３０μｍであると選択される。分母における得られた体積の値は、２．７×１０−５μＬであり、比率は以下によって近似的に与えられる。
【００４６】
【００４７】
明らかにこの値は種々の仮定、最も顕著には分離チャンネルの断面の推定値に依存する。もし、断面寸法が側部から側部までの長さが１０μｍ〜１００μｍの範囲で許容されるのであれば、抵抗比は以下の範囲が得られる。
【００４８】
【００４９】
また、他のパラメーターは、ｆは０．０２〜０．２の間であり得るような範囲を有し、Ｖchamberは１０〜１００μLの範囲を取り得る。もし、これらの更なる変動源を考慮すると、可能な範囲は以下のように広がる。
【００５０】
【００５１】
上記の範囲は、上述のような仮定の数に基づく一例である。上限範囲や下限範囲は、種々のパラメーターがどのように定義されるかに依存して更に増加又は減少し得る。例えば、種々のパラメーターは上限範囲を約１０９に上げるために更に調整され得る。
【００５２】
マイクロ流体システムを設計するための基準も、流体抵抗の比よりもむしろ体積比に基づく。例えば、分離チャンネル及び大きな体積のチャンバー（計算を簡略化するため、フローチャンネルの体積はチャンバー体積中に含まれると仮定する）の両者は、計算目的のために、１からあまりにも大幅に異ならない断面アスペクト比を有する。例えば、幅対深さの比が１０対１であるような大きな体積のチャンバーに対して、この仮定は完全には正確であるとはいえないが、体積比のオーダーレベルでの計算を得るためには、この仮定はやはり有効である（例えば、上述の１０：１の比に対する補正ファクターは、約４倍に過ぎない）。流体抵抗は以下のように表される。
【００５３】
【００５４】
式中、Ｌは長さ、μは動的粘度、及びＤは断面寸法（例えば直径）を表す。円形のチャンネルに対して、数値ファクターαは１２８／πに等しい。従って、流体抵抗の比は以下のように書き換えることができる。
【００５５】
【００５６】
同様に、体積比は以下のように表すことができる。
【００５７】
【００５８】
従って、二つの比は以下のように関係している。
【００５９】
【００６０】
更に、オーダーレベルで計算するために、長さ比及び粘度比の両者が約１であると仮定される。次いで、体積比は抵抗比の平方根に等しくなり、抵抗比における１０４〜１０６の範囲に対して、体積比範囲は以下のようになる。
【００６１】
【００６２】
従って、ＣＥとＰＣＲの間の相互作用無しで、ＰＣＲチャンバーからのサンプルのＣＥ解析を可能とするために、デバイスの分離チャンネルの合計総体積は、ＰＣＲチャンバーとフローチャンネルの合計総体積の１／１００〜１／１０００なる。
【００６３】
分離チャンネル中の粘度がより高く、また、これらのチャンネルの長さがより長くなる場合、体積比は適切な量によって適宜下方向に計算される。
【００６４】
そのようなシステムの製作では、大きく異なる寸法を有するチャンネルを作製することが必要である。ＰＣＲチャンバーの寸法は、用途に従って変わるその所望の体積と関連付けられる。チャンバー体積は、約１μＬ〜約１００μＬ、約１０μＬ〜約７５μＬ、又は約１０μＬ〜約５０μＬ、又は約１０μＬ〜約２５μＬの範囲で設定される。従って、例えば、２５μＬの体積のチャンバーに対して、チャンバー寸法は１０ｍｍ×５ｍｍ×５００μｍである。他の寸法が過剰に大きくなるのを避けるために、チャンバーの深さは少なくとも約５００μｍが望ましい。しかしながら、チャンバーの寸法は上記に限定されるものではなく、所望の体積を達成するために適宜変更、設定できる。
【００６５】
電気泳動分離及び検出のために使用されるチャンネルの寸法は、より小さくできる。例えば、チャンネル寸法は２０μｍ×２０μｍの断面を有する。チャンネルネットワークの深さは、流体抵抗の比を増やすために、５〜７μｍに低下させることができる。上記寸法は単なる例であってそれらに制限されるものではない。ＰＣＲチャンバー及びその接続部又はフローチャンネル中に存在する抵抗に対するこれらのチャンネル中の流体力学的流体抵抗の比が約１０３以上、約１０３〜約１０９、約１０３〜約１０７、又は約１０４〜約１０６であることを十分確保できるのであれば、ＰＣＲチャンバー及びチャンネルネットワークの間の寸法を相異させて作製してもよく、実際の寸法は適宜変更できる。つまり、所望の流体力学的流体抵抗を達成するために、フローチャンネルの寸法は、ＰＣＲチャンバーに関連して適宜設定できる。
【００６６】
例えば、ポリメチルメタクリレートや環状オレフィンポリマーのようなポリマーが、同じ基材における等しくない寸法のマイクロ流体構造を製作するために、及び得られた基材を使い捨て可能にするためには適切である。等しくないチャンネル寸法を有するポリマー製マイクロ流体デバイスは、図１(Ａ)〜１(Ｅ)に示す通り、以下の方法によって製作できる。図１(Ａ)に示すように、所望のチャンネルの深さに等しい厚み、例えば、５００〜６００μｍの範囲内の厚みを有する、両面が研磨されたシリコンウエハ１１０を選択する。次いで、浅いチャンネル用のパターンをシリコンの一側面にフォトリソグラフィー的にパターン化する。パターン化は、次工程のためのマスキング層として、フォトレジスト、酸化シリコン、及び／又は窒化シリコンの組合せを用いる。次いで、深堀り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）〔図１(Ａ)〕のような高アスペクト比プラズマエッチングを用いて浅いチャンネル１２０をエッチングする。他のエッチング技術も可能であるが、ウエハ中に深くて傾斜がきつい側部を有する孔及び溝を創出するためにＤＲＩＥが使用できる。ウエハ１１０をひっくり返し、そして深いチャンネル１３０用のパターンをシリコンの他の側面にフォトリソグラフィーでパターン化し、その反対面にエッチングされたパターンと位置合わせする。これには、シリコンウエハ１１０を調べるための赤外光を用いるなどの幾つかの位置合わせ法が必要である。ＤＲＩＥ〔図１(Ｂ)〕のような高アスペクト比プラズマエッチングを用いてシリコンウエハ全体を通してエッチングする。これによって深いチャンネル１３０の位置で、シリコンウエハ１１０中に開口部が創出される。次いで、パターン化していない硼珪酸ガラスウエハ１４０にシリコンウエハ１１０を陽極接合する〔図１(Ｃ)〕。次いで、電解メッキによって、シリコン／ガラスウエハのニッケル逆レプリカ１５０を作成する〔図１(Ｄ)〕。このレプリカ１５０は電気鋳造１５０と呼ばれる。電気鋳造１５０を使用してポリマー製基材１６０を圧縮成形又はエンボス加工する〔図１(Ｅ)〕。次いでポリマー製基材１６０を適切な位置で穴開けしてウエルを作製し、また端部を切断してマイクロ流体チップを作製し、それを他の材料と積層させ又は加圧／加熱接着させる。チャンネルをシールする一つの方法はポリマー薄膜を用いる積層である。
【００６７】
代替法として、ＰＣＲチャンバー２２０のようなポリマー製マイクロ流体チップにおける大容量空間は、浅い分離チャンネルが成形又はエンボス加工によって製作された後、ＣＮＣ機械加工のような他の方法によって製作できることである。この方法は全てのデバイスに対して繰返される必要があるのでより遅いが、大容量空間の設計においてより多くの柔軟性を持つことができるという利点を有する。
【００６８】
例えば、約２５μLの体積を有するＰＣＲチャンバーを製造するための電気鋳造１５０の一部を作製するために、ウエハ１１０にディープエッチングが実施される。図２にマイクロ流体システムの実施態様を示す。ポリマー製チップ２１０は、深さ５００μｍ及び面積５０ｍｍ２、又は７×７ｍｍの四角形を有するＰＣＲチャンバー２２０で作製される。他の寸法も可能であり、深さ、幅及び高さは、チャンバーの所望の体積に従って適宜制御される。また、チャンバーは、チャンバーに適切な溶液を充填させるために、チャンバーをフローウエル２４０に接続させるアクセス又はフローチャンネル２３０を有する。
【００６９】
ＰＣＲチャンバー２２０も、フローウエル２４０から分離された分離チャンネルに直接的に又は間接的に接続される。分離チャンネルは、なかでも、増幅されたＤＮＡの画分を導入するために使用することができるローディングチャンネル２５０、及びローディングチャンネル２５０と交差する（交差領域）ＣＥチャンネル２００を含むために使用される一般用語であり、増幅されたＤＮＡのサイズを検出するための電気泳動分離を実行するために使用される。図２には一つのローディングチャンネル２５０及び一つのＣＥチャンネル２００のみが示されているが、チップは各々一つより多くを有するように構成できる。分離チャンネル（例えば、ローディングチャンネル２５０及びＣＥチャンネル２００）の内部体積は、ＰＣＲチャンバー２２０及びフローチャンネル２３０の総体積の約１／１００以下、約１／１００〜約１／１０００、又は約１／３００〜約１／１０００となるよう設計される。ＰＣＲチャンバー２２０及びフローチャンネル２３０に存在する流体力学的流体抵抗に対するこれらのチャンバーの流体力学的流体抵抗の比が、約１０３以上、約１０３〜約１０９、約１０３〜約１０７、又は約１０４〜約１０６となることを考慮して、ＰＣＲチャンバー２２０及びフローチャンネル２３０の寸法、及びローディングチャンネル２５０及びＣＥチャンネル２００の寸法を適宜変更することができる。ＰＣＲチャンバー２２０に比較して、ローディングチャンネル２５０及びＣＥチャンネル２００の流体力学的抵抗を高くすることによって、バルブ又はプラグを用いることなくチャンネルに対するゲート機能を達成することができる。ポリマーチップ２１０にも、ポリマーチップ２１０からのシグナルを読みそして処理するための光学的読取り制御デバイス２７０、及びＰＣＲチャンバー２２０をサーマルサイクリングするためのサーマルサイクリングデバイス２８０が供される。
【００７０】
ローディングチャンネル２５０は、ＰＣＲチャンバー２２０に接続されていない反対側の両端部でローディング？？？ウエル２６０にそれぞれ接続される。ローディングウエル２６０はＤＮＡを導入又は／及び注入するための電気的接点として機能することができる。ＣＥチャンネル２００の反対側の両端部は各ＣＥウエル３００に接続される。ＣＥウエル３００は電気泳動のための電気的接点として機能することができる。この配置により、フローチャンネル２３０によってＰＣＲチャンバー２２０に接続された２つのフローウエル２４０中に電極を配置することを避けることができる。フローウエル２４０はＰＣＲチャンバー２２０を充填するために十分大きな総体積を有することが必要である。上記設計において、ローディングウエル２６０はフローウエル２４０から分離された状態に維持され、電極に電圧を印加するための電源供給部に接続される。ＣＥウエル３００もまたフローウエル２４０から分離された状態に維持され、電極に電圧を印加するための電源供給部に接続される。この配置は温度サイクリング中にフローウエルをシールするのを容易にする。更に、サイクリング中のチャンバーとウエルの間での過剰な流れを避けるために、要すれば、フロー抵抗器２９０をＰＣＲチャンバーの各端部に設置することができる。
【００７１】
図３にマイクロ流体システムの別の実施態様を示す。ポリマーチップ３１０は、フローウエル３４０につながるフローチャンネル３３０に接続されたＰＣＲチャンバー３２０を有する。フローチャンネル３３０に加えて、ＰＣＲチャンバー３２０は直接的に又は間接的に分離チャンネルに接続される。分離チャンネルは、その両端部がローディングウエル３６０につながるローディングチャンネル３５０、及びローディングチャンネル３５０と交差し（交差領域）、その両端部が各々ＣＥウエル３９５につながるＣＥチャンネル３９０を含む。図３には一つのローディングチャンネル３５０及び一つのＣＥチャンネル３９０のみが示されているが、チップは各々一つより多くを有するように構成できる。この設計は、前述の実施態様よりもコンパクトであり、従って、より多くのチップが単一の電気鋳造から作製できるため、より経済的に作製できる。制限要因は、ＰＣＲの加熱サイクリングが分離を乱さないことを十分確実にするために、分離チャンネル（つまり、ローディングチャンネル３５０及びＣＥチャンネル３９０）をＰＣＲチャンバー３２０から分離する必要性があるということである。前述の実施態様のように、分離チャンネル（ローディングチャンネル３５０及びＣＥチャンネル３９０）の総体積は、ＰＣＲチャンバー３２０及びフローチャンネル３３０の総体積の、約１／１００以下、約１／１００〜約１／１０００、又は約１／３００〜約１／１０００となるよう設計される。ＰＣＲチャンバー３２０及びフローチャンネル３３０の寸法、及びローディングチャンネル３５０及びＣＥチャンネル３９０の寸法は、ＰＣＲチャンバー３２０及びそのフローチャンネル３３０に存在する流体力学的流体抵抗に対するこれらのチャンネル中の流体力学的流体抵抗の比が、約１０３以上、約１０３〜約１０９、約１０３〜約１０７、又は約１０４〜約１０６となることを考慮して、適宜変更することができる。ローディングチャンネル３５０及びＣＥチャンネル３９０の流体力学的抵抗をＰＣＲチャンバー３２０と比較して高くすることによって、バルブ又はプラグを使用せずにチャンネルに対するゲート機能を達成することができる。ポリマーチップ３１０にも、ポリマーチップ３１０からのシグナルを読みそして処理するための光学的読取り制御デバイス３７０、及びＰＣＲチャンバー３２０をサーマルサイクリングするためのサーマルサイクリングデバイス３８０が供される。
【００７２】
ＰＣＲチャンバーの他の付加的特徴は、積層フィルムが比較的大きな面積を被覆する場合に、積層フィルムのたわみを避けるための幾つかの内部支持構造体にある。例えば、図４に示されるように、積層フィルムがたわまないように支えるために、本実施態様では内部支持構造体４００がＰＣＲチャンバー４１０内に設置されていることが示されている。本明細書において、内部支持構造体４００は、チャンバー４１０内の矩形のコーナーに４つの構造体、及び中央部に５番目の支持構造体が設置されており、ＰＣＲチャンバーは最も広いところで５．４ｍｍの幅、０．５ｍｍの深さ、及び２５μＬの総体積を有する。本明細書において記載された寸法は例であり、チャンバーを制限するものではない。構造体４１０は、チャンバーの底部と、チャンバー４１０を覆って設置される積層フィルムとに接続される。支持構造体のサイズ、数、及びレイアウトは、積層フィルムのたわみが生じないことを確実にするため、チャンバーのサイズ及び体積に関連して適宜設定される。つまり、支持構造体は、１つ以上存在し、チャンバーの体積、深さ及び幅を考慮して積層フィルムを最も良好に支持し得るように配置される。支持構造体の材料は、ＰＣＲチャンバーと同じポリマー材料であってもよいが、不活性であり、且つチャンバー中に配置されるどのような溶液とも反応しない限り、異なっていてもよい。
【００７３】
上記した実施態様において述べられたデバイスは、増幅の過程で、ポリマーチップに集積されたＣＥ部品によって幾つかのＤＮＡサンプルを取り出して解析できる、リアルタイムＰＣＲ−ＣＥを実施するために設計されたものである。取り出されたＤＮＡの画分は非常に小さい少量であるため、ＰＣＲプロセスには顕著な影響を及ぼさない。ＤＮＡ分離においては通例であるように、分離チャンネル中の電気浸透流が抑制されると、その結果、ＤＮＡのみ電気泳動によって完全に移動し、ＰＣＲチャンバーから少しのPCR反応液も取り除かれることはない。ＰＣＲの各サイクル又はＰＣＲの２回毎のサイクルに対してサンプルが取り出されて解析される。マイクロ流体チップにおけるＰＣＲサイクルが一般的に１５秒〜６０秒かかり、また、最速のマイクロ流体ＤＮＡ分離が６０秒又はそれより早いオーダーであるため、このようなサンプルの取り出し・解析が可能となる。また、複数のサンプルを同時に分離することができるため、サンプル採取の間の時間間隔は、分離に要する時間よりも短くできる。複数の時点でサンプリングできるという事実は、増幅の終点における単一の時点でもサンプリングできることを意味する（エンドポイントＰＣＲ−ＣＥ）。
【００７４】
実施態様において述べられたような、リアルタイムＣＥ検出でのマイクロチップＰＣＲのためのデバイスの使用に係る方法は、以下のように実施することができる。本方法は図２及び図３に示された例示的システムを参照するものである。マイクロチップ２１０又は３１０の浅い電気泳動のＣＥチャンネル２００又は３９０をＤＮＡ分子篩いマトリックスで満たす。このマトリックスは、電気浸透流を抑制するのに十分にチャンネル壁をコートすることができ、また、どのような圧力誘起流をも低下させ、チャンネルとＰＣＲチャンバーの間の流体力学的流体抵抗比を増大させるために、例えば、約１０〜２０センチポアズの相当に高い粘度を有するものである。このマトリックスにはまた、ＤＮＡ断片を検出するために、臭化エチジウム、Cyber Green、Evergreen、又はSyto色素等の適切なインターカレーター色素を含有させることもできる。次いで、ＰＣＲチャンバー２２０又は３２０を、サンプルを含有する混合物、及び必要な酵素を含有する全ての試薬で満たす。更に、ＰＣＲフローウエル２４０又は３４０をシールし、温度サイクリングシステムにチップを設置する。次いで、ＰＣＲチャンバーからローディングチャンネル２５０又は３５０内にＤＮＡ画分を導入するために、増幅中（各サイクル毎、又は２サイクル毎）、温度サイクリングによる増幅を実施しながら、図２の場合は電気泳動のローディングウエル２６０に、また図３の場合はウエル３６０に電圧を印加する。次いで、ＣＥウエル３００又は３９５に電圧を印加することによって、このＤＮＡの部分が交差領域を通ってＣＥチャンネル２００又は３９０内に注入される。更に、ＤＮＡを分離して、交差領域から適切な距離でＤＮＡを検出する。比較的小さな二本鎖ＤＮＡ断片の迅速な分離のために、分離領域及び分離長さを最適化することができる。次いで、各分離において、所望のＰＣＲ増幅産物に対応するピークを同定し、ピークの高さ又は面積によってそのＰＣＲ増幅産物のサイズを計算する。次いで、得られたピークサイズをサイクル数に対してプロットし、これらのデータを使用してサンプル中に存在する標的ＤＮＡの元の量を求める。
【００７５】
代表的な単一ＰＣＲサイクルには、変性、プライマーの結合又はアニーリング、及びＤＮＡの合成又は伸張の３つの工程が含まれる。変性中に、二本鎖ＤＮＡ鋳型を分離するために出発混合物を最初に約９４℃〜９６℃に加熱する。ＤＮＡの変性後、分離された鎖の相補配列にプライマーを結合させるために混合物を約５５℃に冷却する。プライマーは複製されるべきＤＮＡの末端を規定する。次いで、ＤＮＡポリメラーゼが、鋳型鎖上のアニールしたプライマーの伸張を触媒するように、混合物を約７２℃で加熱する。この１サイクルを１回以上の回数、繰返す。
【００７６】
幾つかの場合において、単一ＰＣＲサイクルは、変性工程、及びＤＮＡ合成とプライマー結合工程の２つの工程のみを含む。この場合、二本鎖ＤＮＡ鋳型を分離するために出発混合物を最初に約９４℃〜９６℃に加熱する。変性後、分離された鎖の相補配列にプライマーを結合させるため、及びＤＮＡポリメラーゼが鋳型鎖上のアニールしたプライマーの伸張を触媒するために、混合物を規定された温度（約６０〜７０℃）に冷却する。この１サイクルを１回以上の回数、繰返す。
【００７７】
ＰＣＲ増幅をより低温で実施することが可能である。例えば、鋳型ＤＮＡの変性温度を下げるために、プロリン等の添加剤又は添加剤類を反応混合物中に含有させる。例えば、約７５℃の低い変性温度、及び約５５℃のプライマーのアニーリング及び伸張温度によって低温サイクルＰＣＲを実施することができる。
【００７８】
別の例においては、ＤＮＡをサーマルサイクリングを必要とせずに増幅することができる。例えば、加熱の代わりにヘリカーゼと呼ばれる酵素によってＤＮＡ鋳型を分離する。このようにして、ＤＮＡをサーマルサイクリングを使用せずに単一温度で増幅することができる。
【００７９】
反応サンプルの一部、例えば、チャンバー中で反応したＰＣＲ増幅産物、を、ＰＣＲ温度サイクリングによる増幅が完了した後ではなく、ＰＣＲ温度サイクリングによる増幅中に、適切な電圧を印加することによって分離チャンネル内に注入する。分離チャンネル中に注入されたＰＣＲ増幅産物を、分離チャンネルで分離する。次いで、分離されたＰＣＲ増幅産物を検出する。更に、これらの注入工程、分離工程、及び検出工程を１回以上の回数、繰返す。
【００８０】
サンプル中に存在する標的核酸の元の量の測定は、検出プロセスを繰返して得られるデータを収集すること、及び収集されたデータに基づいて存在する核酸の量を定量することによって実施することができる。例えば、存在する核酸の量の定量は、スレッシュホールド・サイクル（Ｃｔ値：threshold cycle）の計算によって実施することができる。
【００８１】
一例として、図２におけるＰＣＲチップ２１０を用いるＰＣＲ−ＣＥの実験について述べる。この実験で使用された試薬は以下の通りである：ＢＳＡ溶液（１００μｇ／ｍＬ）；ＢＣＧゲノムＤＮＡ，ｌ０６コピー／μＬ；ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，５Ｕ／μＬ；１０×ＰＣＲ緩衝液；５０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ｄＮＴＰ；ＩＳ＿Ｆ１０フォワードプライマー，ＣＴＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧ，５μＭ；及びＩＳ＿Ｒ８リバースプライマー，ＧＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧ，５μＭ。ＰＣＲ反応溶液（２８μＬ）は以下を含む：１×ＰＣＲ緩衝液；０．４ｍＭ ｄＮＴＰ；３ｍＭ ＭｇＣｌ２；２５０ｎＭ フォワードプライマー；２５０ｎＭ リバースプライマー；１μＬ ＢＣＧゲノムＤＮＡ（１０５コピー）；及び１Ｕ ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００８２】
ＰＣＲ−ＣＥチップ２１０のＣＥチャンネル２００にインターカレーター色素を含有するポリジメチルアクリルアミドのゲルマトリックスを充填し、そして２８μＬのＰＣＲ反応混合物を１つのウエル２４０からＰＣＲチップ２１０にロードした。次いで、ＰＣＲ試薬及びゲルが充填されたＰＣＲチップをサーマルサイクラー２８０のサーマルサイクリングデバイスと一緒に固定した。ＰＣＲサイクリング中の蒸発を抑制するために、チップ２１０に亘ってかつ密閉的に覆って設置されたマニホールドデバイスを通して、全てのウエルに３０ｐｓｉの圧力をかけた。このマニホールドデバイスは２００７年５月１５日に出願された米国仮出願番号６０／９３８，１７１号の優先権を主張する、２００８年５月１５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６２６６号中により詳細に述べられており、その両者は本明細書に引用することによりその全体が組込まれている。以下のサイクルプロトコールを用いてＰＣＲを実施した：１×９６℃，３０ｓ；及び４０×９６℃，１５ｓ，６２℃，１５ｓ，及び７２℃，３０ｓ。
【００８３】
ローディングウエル２６０の間に、１４、１６、１８、２０、２２、２５及び３０サイクルで電圧を印加することによって、チャンバー２２０からのＰＣＲ産物サンプルをローディングチャンネル２５０内に移動した。次いで、ＣＥウエル３００の間に電圧を印加することによって、ＰＣＲ産物サンプルをＣＥチャンネル２００内に注入して分離し、そして光学的読取り制御デバイス２７０によって解析した。ＰＣＲ混合物中の内部マーカー（１００ｂｐのＤＮＡ）を用いてＰＣＲ産物のピーク面積を正規化し、サイクル数に対してプロットして図５に示すＰＣＲ成長曲線を得た。図６に標的ＰＣＲ産物サンプル（２００ｂｐ）が検出可能となり始めた時点である１８サイクル目でのＣＥ分離のエレクトロフェログラムを示す。合計時間は１時間であった。
【００８４】
リアルタイムＰＣＲにおける相対的定量計算のための種々の方法が知られている。例えば、米国特許第６，９４２，９７１号には、ＤＮＡ量を定量するために、核酸の成長曲線を規定するシグナル値を保存し、成長曲線の微分係数を求め、そして微分係数の特性に関連があるサイクル数又は時間値を計算するためのプログラムが開示されている。YuanらのBMC Bioinformartics 7:85 (2006)において、著者らは、ＤＮＡ産物の量を定量するための、リアルタイムＰＣＲデータの統計的解析を提案している。PfafflのNucleic Acid Research, vol.29, No.9 (2001)において、著者は、リアルタイムＰＣＲにおける相対的定量のための新しい数学モデルを開示している。これらの何れの方法もそしてこの分野で公知の他の方法も、リアルタイムＰＣＲにおける核酸の量を定量するために使用することができる。
【００８５】
別の実施態様において、エンドポイントＰＣＲアッセイが実証されている。ＣＥ検出を用いるＰＣＲのためのマイクロ流体チップ６００は、図７に示すように、各々約３０μｍの幅のチャンネル６０５、及び約５００μｍの深さのＰＣＲチャンバー６１０を有する。基本的に、ウエル１〜８を有するチップ６００の寸法は図２における寸法と同じである。
【００８６】
エンドポイントＰＣＲアッセイを実施するために、チャンネルに、ｐＨ８の２００ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液、２％ ポリジメチルアクリルアミド分子篩いマトリックス及びエチジウム ブロマイド ダイマー蛍光色素からなる分離ゲルを最初に充填した。次いで、チャンバー６１０に、ＰＣＲ反応のために必要な全ての試薬（プライマー、酵素、緩衝液、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ’ｓ）を含有するＰＣＲ緩衝液、及び異なるコピー数の標的物をロードした。標的物としてプラスミドＤＮＡの２００ｂｐ断片を使用した。チャンバー６１０とローディング電極ウエル５の間を接続したチャンネル６０５にＰＣＲ緩衝液が充填された。全てのチャンネル及びチャンバーが充填された後、各ウエルに分離ゲル、マーカー又はＰＣＲ緩衝液を充填した。
【００８７】
次に、チップ６００を、ヒーター及び冷却手段に接続されている平らな銅板からなるサーマルサイクリングデバイス（図示していない）に設置した。３７ｐｓｉの圧力を、マニホールドデバイス（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６２６６号に記載されている）を通して全てのウエルに同時に印加した。サーマルサイクリングは以下のタイミングで４０サイクル設定した。変性１５ｓ、アニーリング２０ｓ、及び伸張１５ｓ。合計サイクル時間は２１００ｓであった。ＰＣＲサイクルの後、圧力をゆっくりと開放した。
【００８８】
サーマルサイクリングの後、オン−チップキャピラリー電気泳動を実施した。蛍光顕微鏡を用いて光学的検出を行いながら、挿入された白金電極を用いて、ウエルに電圧を印加した。５３２ｎｍの緑色ダイオードレーザーからの入射光を使用し、６１０±３５ｎｍの励起フィルターを使用した。
【００８９】
ウエル３からのＤＮＡサイズマーカー（１００ｂｐ及び７００ｂｐ）と混合させながら、ＰＣＲチャンバーからサンプルを電気泳動的にウエル８の方向に移動させた。同時に、ウエル１及び７からの電流も交差点に向けて流し、その交差点でサンプルを閉じ込めた。次の工程において、引き抜き電流をウエル８及び３からサンプルローディングチャンネル中に維持しながら、分離を実施するために、ＤＮＡをウエル７からウエル１に移動させた。下表に、ＣＥ分離のために印加した電圧と電流を示す。
【００９０】
【表１】
【００９１】
図８(Ａ)〜(Ｆ)に、ＰＣＲ緩衝液中の標的ＤＮＡの異なる元のコピー数〔１０５、１０４、１０３、１０２、１０及び０（コントロール）コピー数〕を用いて、上述のように実施した一連の実験によって得られたＣＥの結果を示す。この結果は、元のコピー数が１０コピーであっても、その増幅から得られる産物が検出できることを示している。図９に示したように、この１０コピーを用いた実験を次の日に繰返し行った（後述する、表２における「１０＿２日」）。増幅されたピークは、はるかに小さいもののまだ検出可能であることが判る。
【００９２】
この実験における各ピークの大きさは、別途実施された検量実験に基づいてＤＮＡ濃度を測定するために使用することができる。本例示的マイクロ流体デバイスから及び他のデバイスからの濃度の測定結果を下表に示す。
【００９３】
図８(Ａ)〜(Ｆ)及び図９に示されるＰＣＲ試験の後、サンプルをチップから取り出して、各ピークの濃度を測定するために使用されるAgilent 2100 Bioanalyzerで解析した。別のコントロール実験として、同様にＤＮＡ濃度を測定するCepheid社のSmart Cycler（登録商標）を用いて、同じＰＣＲを実施した。上記で得られた結果を併せて下表に示す。
【００９４】
【表２】
【００９５】
マイクロ流体デバイスは、他の検出デバイスより優れていないとしても同等の感度を有していることが判る。結果のバラツキは、希釈を行うたびに実際に存在するコピー数の統計的変動によって説明できる。各増幅後に存在するＤＮＡの定量レベルは、全ての方法で同程度であり、標的の元のコピー数に従って単調に増大した。
【００９６】
上述の設計及び方法に加えることができる多くの変更や追加可能な特徴が存在する。一例は、特大体積のウエルを用いることによるサンプルとＰＣＲ混合物とのオン−チップ混合である。この例では、解析されるべきサンプル、及びプライマー、酵素及びヌクレオチドを含有するＰＣＲマスター混合物を連続してウエル中に配置するための外部ピペッターの使用を含んでいてもよい。そのようなウエルは、少なくともＰＣＲチャンバーと同じほど大きい、約１０〜１００μLの範囲の体積を必要とするかもしれない。別の例は、ＰＣＲ反応からのＤＮＡサンプルとDNA長を決定する標準物とのオン−チップ混合である。これを行うためには、ＤＮＡ標準物又はマーカーを含有する特別のウエル、及びＰＣＲチャンバー２２０と注入交差点の間でそのウエルをチャンネルの部分に接続するチャンネルの追加が必要である。ＰＣＲチャンバーからのＤＮＡサンプルとＤＮＡ標準物の間の混合比は分離ウエル２６０及び追加のＤＮＡマーカーウエルに印加される電圧又は電流によって制御することができる。
【００９７】
本明細書に開示された本発明の明細書及び実施例を考慮すれば、本発明の他の実施態様が当業者にとって明白であろう。明細書及び実施例は単に例示的なものとして考えられ、そして本発明の範囲と精神は以下の請求の範囲によって示されることを意図するものである。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明は、大容量のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び集積キャピラリー電気泳動（ＣＥ）検出を実施するためのマイクロ流体デバイスに関する。本マイクロ流体デバイスは、高いコスト効率でありながら検出における非常に高感度を達成できる。
【符号の説明】
【００９９】
１１０ シリコンウエハ
１２０ 浅いチャンネル
１３０ 深いチャンネル
１４０ 硼珪酸ガラスウエハ
１５０ ニッケル逆レプリカ（電気鋳造）
１６０ ポリマー製基材
２００、３９０ ＣＥチャンネル
２１０、３１０、６００ チップ
２２０、３２０、４１０、６１０ ＰＣＲチャンバー
２３０、３３０ フローチャンネル
２４０、３４０ フローウエル
２５０、３５０ ローディングチャンネル
２６０、３６０ ローディングウエル
２７０、３７０ 光学的読取り制御デバイス
２８０、３８０ サーマルサイクリングデバイス
２９０ フロー抵抗器
３００、３９５ ＣＥウエル
４００ 内部支持構造体
６０５ チャネル
１、２、３、４、５、６、７、８ ウエル
【図１（Ａ）】
【図１（Ｂ）】
【図１（Ｃ）】
【図１（Ｄ）】
【図１（Ｅ）】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２００７年６月１１日に出願された米国仮出願番号６０／９４３，２４８号の優先権を主張し、それは本明細書に参照によって組み入れられている。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、大容量のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び集積キャピラリー電気泳動（ＣＥ）検出を実施するためのマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
マイクロ流体ＰＣＲは、例えば、０．５〜５００μLの範囲の間の非常に小さな寸法を有するチャンバー中のＰＣＲとして一般的に定義される。ゾーンヒーティング、外部ヒーター、集積化抵抗器、ジュール加熱及び赤外線放射のような種々の加熱システムを用いるマイクロ流体システムがあるが、それらのシステムは外部検出を必要とする。それは、反応の終点で、いくつかのサンプルをＰＣＲチャンバーから物理的に取り出し、そしてシステム外でゲル電気泳動又は毛細管電気泳動などの手段によって分析しなければならないことを意味する。このタイプの研究の代表的な例が、Chengらの非特許文献１；Kopp及びManzの非特許文献２；Odaの非特許文献３；及びChenらの非特許文献４に記載されている。外部検出を必要とするシステムは、外部測定を行うに際し、大部分のＰＣＲ反応溶液の取り出しを必要とするため、そのようなシステムはリアルタイム検出機能に適さない。
【０００４】
別の検出方法では、SYBR Greenのようなインターカレーター色素（非特許文献５）や、タックマン・プローブのような蛍光性プローブ（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；及び非特許文献９）を含む光学的検出が使用されている。SYBR Green色素は、ＰＣＲサイクル中に増幅するＤＮＡ産物を検出するための非常に特異的な、二本鎖ＤＮＡ結合色素である。両検出方法とも、リアルタイムＰＣＲ増幅において使用できるが、インターカレーター色素とタックマン・プローブ技術との違いは、インターカレーター色素検出方法が特異的でないということである。従って、プライマー−ダイマー形成のような非特異的ＰＣＲ産物を含む全ての二本鎖ＤＮＡを検出してしまう。この理由から、インターカレーター色素を用いるＰＣＲ増幅では、所望のＰＣＲ産物と非特異的ＰＣＲ増幅とを区別するために、しばしば融解曲線の解析が必要となる。
【０００５】
対照的に、タックマン・プローブＰＣＲ検出法は、蛍光シグナルの発生がプローブと所望のＰＣＲ産物との特異的なハイブリダイゼーションに依存するため、非常に特異的である。しかしながら、タックマン・プローブＰＣＲ検出法では、SYBR Green色素と異なり、異なる配列に対して個々のプローブを合成する必要があり、プローブ標識化のために使用できる蛍光色素の制限によって制約され（例えば、異なる色の色素の数によって制限される）、また、高価な試薬が必要となる。
【０００６】
ＰＣＲのための代替検出法は、反応産物の電気泳動によるＤＮＡサイズの分離を行うことである。これによって、所望の反応産物を、全ての他のＤＮＡ源や汚染源から分離して同定することが可能となる。外部検出を用いる多くのマイクロ流体ＰＣＲシステムでは、特異的であり且つ標的物に特異的な合成プローブを必要としないため、ゲル上での又はキャピラリー電気泳動によるＤＮＡサイジングが行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nucleic Acids Res, 24(2), p.380-5 (1996)
【非特許文献２】Science, 280(5366), p.1046-8(1998)
【非特許文献３】Anal Chem,70(20), p.4361-8 (1998)
【非特許文献４】Anal Chem,77(2): p.658-66 (2005)
【非特許文献５】Rasmussen et al. Biochemica, 1998(2): p.8-111998
【非特許文献６】Kalinina, O. et al. Nucleic Acids Res, 25(10), p.1999-2004 (1997)
【非特許文献７】Belgrader,P. et al.Science, 284 (5413), p.449-50(1999)
【非特許文献８】Belgrader,P. et al. Anal Chem, 75(14), p.3446-50 (2003)
【非特許文献９】Northrup, M.A. et al. Anal Chem, 70(5), p.918-22 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
核酸の増幅及び検出のためのマイクロ流体システムが提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このシステムは、核酸を増幅するためのチャンバーを有する基材；基材上に配列されたウエル；チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び基材に具備され、チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、チャンバーに接続された１以上の分離チャンネル；を含む。チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルは、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルにおける流体力学的流体抵抗の、１／１０３以下、約１／１０３〜約１／１０９、約１／１０３〜約１／１０７、又は約１／１０４〜約１／１０６となるように構成される。流体力学的流体抵抗又は水力学的流体抵抗という用語は、圧力駆動流に対する抵抗を意味し、圧力差を流量比で割った比として定義できる。このシステムは、更に、分離を実施するためのサーマルサイクリングデバイスやその他の部材を含み得る。
【００１０】
更に、核酸を増幅するためのチャンバーを具備する基材；基材上に配列されたウエル；チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び基材に具備され、チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、チャンバーに接続された１以上の分離チャンネル；を含み、１以上の分離チャンネルの総体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の１／１００以下、約１／１００〜約１／１０００、又は約１／３００〜約１／１０００である、核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体システムが提供される。
【００１１】
本システムは、更に、分離を実施し、ＤＮＡを定量するためのサーマルサイクリングデバイスや光学的読取り制御デバイスを含み得る。
【００１２】
更にまた、核酸を増幅するためのチャンバーを具備する基材；基材に具備されたウエル；チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及びチャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、基材に具備され、チャンバーに接続する、１以上の分離チャンネル；を含み、１以上の分離チャンネル中の流体力学的流体抵抗がバルブの代わりとして機能するように、１以上の分離チャンネルの寸法が、フローチャンネル及びチャンバーの各々の寸法よりも小さい、核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体デバイスが供される。
【００１３】
更に、（１）核酸を増幅するためのチャンバー、ウエル、チャンバーを通って溶液の流れを可能とするためにウェルとチャンバーに接続されたフローチャンネル、及びチャンバーに接続された１以上の分離チャンネルを含むマイクロ流体デバイスを提供すること；（２）チャンバー中に核酸の溶液を配置すること；（３）チャンバー中に配置された核酸を増幅すること；（４）増幅された核酸の画分をチャンバーから１以上の分離チャンネル内に導入すること；（５）１以上の分離チャンネルを通して、増幅された核酸画分を分離すること；及び（６）分離された核酸を検出すること；を含む、核酸を増幅及び検出する方法が提供される。工程（３）〜（６）が、リアルタイム検出に対して１回以上の回数繰返されるか、又は工程（３）が１回以上の回数繰返された後に工程（４）〜（６）が１回実施される。本方法は、更に、（８）収集したデータに基にづいて、存在する核酸の量を定量することを含み得る。
【００１４】
従って、本デバイス及び方法はリアルタイム並びにエンドポイントＰＣＲアッセイに好適である。
【００１５】
核酸の分離は、動電学的方法を用いて実施できる。動電学的という用語は、電界に応じた溶液又は分子の運動を意味すると一般的に理解される。それは電界におけるイオンや荷電分子の運動である電気泳動、及び電界によるバルク溶液の運動である電気浸透を含む。核酸の分離は、電気泳動により実施でき、核酸は、分子篩いマトリックスの存在によるサイズ依存型の移動度を有する。しかしながら、他の核酸分離方法が存在し、マイクロ流体システム又はデバイスにおいて使用できる。例えば、ＤＮＡは、質量分析によりＤＮＡ断片を分離することによって配列が調べられてきた（米国特許第５６９１１４１号；Kosterら、Nature Biotech. Vol.14, p.1123 (1996)）。そして多くのマイクロ流体システムと質量分析とのインターフェイスが述べられてきた（例えば、米国特許第５８７２０１０号，第６８０３５６８号，及び第７１０５８１２号を参照）。別の核酸分離方法は、例えば、Lenigkらによって述べられたような、固定化されたプローブへのハイブリダイゼーションによるものである（Anal. Biochem. Vol.311, p.40 (2002)）。更なる制約がない限り、「分離すること」又は「分離」という用語は、一般的意味で使用される。
【００１６】
本発明の更なる特徴は、以下の記述において一部説明され、その記述から一部理解され、又は本発明の実施によって知り得る。本発明の特徴は、特に添付の請求項において指摘される要素及び組合せによって実現され、到達される。
【００１７】
これまでの一般的記述及び以下の詳細な記述の両者が、単に例示的かつ説明的なものであり、そしてクレームされたように本発明を制約するものではないと理解されるべきである。
【００１８】
この明細書中に組込まれ、そしてその一部を構成する添付図は、本発明の実施態様を例示し、そしてその記述と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。更に、本明細書で言及された全ての参考文献は、本明細書に参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】単一基材上でのＰＣＲ−ＣＥ能力を有するマイクロ流体チップの製造方法の例示的実施例である。
【図２】本発明のマイクロ流体システムの実施態様である。
【図３】本発明のマイクロ流体システムの別の実施態様である。
【図４】本発明のマイクロ流体デバイスの別の実施態様である。
【図５】本発明のマイクロ流体デバイスの実施態様を用いて得られた例示的なリアルタイムＰＣＲの成長曲線である。
【図６】本発明のマイクロ流体デバイスの実施態様の例示的なＣＥ分離グラフである。
【図７】本発明のマイクロ流体デバイスの別の実施態様である。
【図８】本発明のマイクロ流体デバイスの実施態様を用いたエンドポイントＰＣＲアッセイの結果である。
【図９】本発明のマイクロ流体デバイスの実施態様を用いたエンドポイントＰＣＲアッセイの別の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の本実施態様（例示的実施態様）について詳細に言及するが、その実施例が添付図において示されている。可能な限り、同じ又は同様の部品を参照するために、図全体を通して、同じ参照番号が使用されている。
【００２１】
本発明の実施態様であるマイクロ流体システムは以下の特徴を有するように構成されている：ＰＣＲチャンバーは、高感度なＤＮＡ増幅を行うために、約１μL〜約１００μL、約１０μL〜約７５μL、又は約２５μL〜約５０μLの体積を有する。一例として、もし信頼し得る増幅ができる最低コピー数が１０であれば、１０μLの体積においては、感度の制限はマイクロリッター当たり１コピーである。１００ｎLの体積においては、感度の制限はマイクロリッター当たり１００コピーであり、約１／１００以下となる。別の特徴は、十分なＤＮＡ増幅を達成するために、ＰＣＲチャンバーの内容物のサーマルサイクリングに適するようにシステムが装備されることである。更に別の特徴は、ＰＣＲチャンバーに接続された十分に小さな寸法のチャンネルのネットワークをシステムが有することである。分離チャンネルと呼ばれるチャンネルのネットワークは、チャンバー中に含まれる核酸の非常に小さな画分の解析を容易にするために、ＰＣＲチャンバーよりも小さな内部体積を有するように構成される。分離チャンネルの総体積は、ＰＣＲチャンバー及びフローチャンネル総体積の、約１／１００以下、約１／１００〜約１／１０００、又は約１／３００〜約１／１０００である。また、チャンネルの寸法は、これらのチャンネルの流体力学的流体抵抗が、ＰＣＲチャンバー及びそのチャンバーにつながるその他のチャンネルの値よりも確実にはるかに大きくなるように小さく保たれる。流体抵抗の比を、約１０３又はそれより高い、又は約１０３〜約１０９、又は約１０３〜約１０７、又は約１０４〜約１０６の範囲内で、非常に高くすることによって、如何なるバルブやプラグも使用せずにチャンネルでのゲート機能を達成することができる。別の特徴において、電気泳動ＤＮＡサイジング解析のためにチャンネルのネットワークが使用される。このサイジング解析を実施するために、チャンネルをＤＮＡ分子篩いマトリックスで充填するための、単純な交差チャンネルトポロジーを採用することができる。更に別の特徴は、全体システムの製作が単独の、使い捨て可能な基材においてなされる点である。
【００２２】
バルブやプラグの使用を避けることにはメリットがある。マイクロ流体バルブは存在するが、より多くの多層構造及び貼り合わせ位置精度が要求され、本明細書に述べられたシステムよりも複雑な製作配列が必要になる。そのため、バルブを有するシステムは使い捨て可能なデバイスとして製作するには概して高価になる。更に、マイクロ流体バルブには、デッド・ボリューム及び漏れ流れという欠点がある。Kohら（Anal. Chem., Vol.75, p.4591 (2003)）によって述べられるようなプラグやゲルバルブの使用は、コストパフォーマンスが低く、寿命も限られる。更に、架橋されたゲルプラグを通した核酸の輸送は比較的遅く、その解析時間が長くなる原因になる。その結果、リアルタイムＰＣＲ定量よりもむしろ、エンドポイント解析を実行するためにのみ実用的である。
【００２３】
核酸を輸送するために主として電気泳動力を用いることによって、ＰＣＲチャンバー中の少量の核酸の画分を、チャンバー中の溶液を除くことなく、解析のために移動させることができる。例えば、Slepnev（米国特許第７，０８１，３３９号）によって述べられているような１０μLのような少量の溶液の移動でさえ、ＰＣＲチャンバー中の核酸の画分を著しく失う結果になり、従ってリアルタイム解析が困難になる。
【００２４】
マイクロ流体チップ中の大きなＰＣＲチャンバーは、分離チャンネルの流体力学的流体抵抗が、大きなＰＣＲチャンバーの流体力学的流体抵抗よりも十分大きくなるように、小さなキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離チャンネルと組合わされ得る。高い分離を達成するためのＰＣＲチャンバーの抵抗に対する分離チャンネルの抵抗の比率は計算により求めることができる。ＰＣＲ−ＣＥチップを設計するために、推定された抵抗比の範囲に達するための例示的な計算によれば、圧力差、△Ｐが、溶液をＰＣＲチャンバーの中や外及び分離チャンネルに沿って動かすと仮定される。圧力差△Ｐは以下のように表すことができる：
【００２５】
【００２６】
式中、ＲchamberはＰＣＲチャンバーの流れに対する流体力学的抵抗であり、そしてＶchamberはＰＣＲチャンバーの体積である。計算を単純にするため、チャンバーの流体力学的抵抗が、非ＣＥ分離チャンネルであるフローチャンネルの抵抗を含むものと概算される（以下、チャンバーの抵抗にはフローチャンネルの抵抗が含まれているものと仮定する。）。流量比は、失われたチャンバー体積の画分を解析時間で割ることによって表すことができる。
【００２７】
【００２８】
式中、Ｑchamberはチャンバーを通る流量比であり、ｆは失われた体積の画分である。これらの変数に関して、流体力学的流体抵抗Ｒchamberが次のように与えられる。
【００２９】
【００３０】
分離チャンネルにおいて、流体抵抗方程式は以下のように同様に示される。
【００３１】
【００３２】
式中、Ｒsepは分離チャンネルの流体力学的流体抵抗であり、Ｑsepはこのチャンネルを通る流量比である。一般的に、ＰＣＲチャンバーに接続した複数の分離チャンネルが存在するため、この方程式は、図２又は図３において示されるような大抵のシステムを簡略化したものである。本明細書において、この簡略化は、流体力学的抵抗比をオーダーレベルで概算するための一例としてなされる。流体力学的抵抗Ｒsep及び流量比Ｑsepは、例えば、個々のチャンネル領域の直列及び並列の接続として計算され、システムの実際のチャンネルトポロジーを考慮することによってより正確に計算することができるが、計算目的のために、より複雑な状況を概算するための単純なシステムが仮定される。
【００３３】
分離チャンネルの最高流量比は、溶液のある許容できる溶液の移動度によって定義することができる。この最大溶液の移動度△ｘは、分離される種のバンド幅に関して定義することができる。圧力印加による流体がこれらのバンドの広がりの原因となる。分離能の劣化を避けるために、△ｘは、少なくともバンド幅の少なくとも１／２以下に設定される。バンド幅は分離チャンネル幅に依存するけれども、ＰＣＲ産物の解析に必要な代表的なマイクロ流体ＤＮＡ分離において、バンド幅は１００μｍ程度である。従って、△ｘは１０〜５０μｍの間であると推定される。
【００３４】
チャンネルの断面積がＡである場合、最大許容流量比
【００３５】
【００３６】
は以下のように表される。
【００３７】
【００３８】
流れを確実にこの値未満にするために必要なチャンネル中の最低流体抵抗
【００３９】
【００４０】
（最低分離チャンネル抵抗）は以下のように与えられる。
【００４１】
【００４２】
圧力差及び解析時間は一般に既知ではなく、固定されていない。従って、最低分離チャンネル抵抗の要求を、分離チャンネル抵抗のＰＣＲチャンバー抵抗に対する比に関して表すことが有用である。
【００４３】
【００４４】
従って、この式は、バルブ無しでのＰＣＲチャンバーとＣＥ分離のためのチャンネル一式の集積化を可能にする、流体抵抗の最低要求比を定義する。
【００４５】
流体抵抗比の推定範囲は、この方程式に基づいて与えられる。高感度ＰＣＲに対しては、比較的大きな体積が要求される。例えば、病原体を１００ＣＦＵ／ｍＬの濃度で検出するためには、少なくとも一個の病原体が確実に存在するために少なくとも数十μＬの体積が必要とされる。例示的なチャンバー体積は２５μＬである。解析に実質的な影響を及ぼすことなく失うことができる画分は、約０．１であると仮定される。この画分は一例であり、より少ないほうが良いものの、幾つかの状況においては、より大きな画分を失うことが許容される。従って、上記式の分子の例示的値は２．５μLであると推定される。マイクロ流体チャンネルの断面は広い範囲に亘って変わり得るが、マイクロ流体分野においては、例えば、側部から側部までの長さが約１０μｍ〜約１００μｍである。従って、本実施例では、３０μｍ×３０μｍの平均寸法が選択される。上述したΔｘの値の範囲は、平均３０μｍであると選択される。分母における得られた体積の値は、２．７×１０−５μＬであり、比率は以下によって近似的に与えられる。
【００４６】
【００４７】
明らかにこの値は種々の仮定、最も顕著には分離チャンネルの断面の推定値に依存する。もし、断面寸法が側部から側部までの長さが１０μｍ〜１００μｍの範囲で許容されるのであれば、抵抗比は以下の範囲が得られる。
【００４８】
【００４９】
また、他のパラメーターは、ｆは０．０２〜０．２の間であり得るような範囲を有し、Ｖchamberは１０〜１００μLの範囲を取り得る。もし、これらの更なる変動源を考慮すると、可能な範囲は以下のように広がる。
【００５０】
【００５１】
上記の範囲は、上述のような仮定の数に基づく一例である。上限範囲や下限範囲は、種々のパラメーターがどのように定義されるかに依存して更に増加又は減少し得る。例えば、種々のパラメーターは上限範囲を約１０９に上げるために更に調整され得る。
【００５２】
マイクロ流体システムを設計するための基準も、流体抵抗の比よりもむしろ体積比に基づく。例えば、分離チャンネル及び大きな体積のチャンバー（計算を簡略化するため、フローチャンネルの体積はチャンバー体積中に含まれると仮定する）の両者は、計算目的のために、１からあまりにも大幅に異ならない断面アスペクト比を有する。例えば、幅対深さの比が１０対１であるような大きな体積のチャンバーに対して、この仮定は完全には正確であるとはいえないが、体積比のオーダーレベルでの計算を得るためには、この仮定はやはり有効である（例えば、上述の１０：１の比に対する補正ファクターは、約４倍に過ぎない）。流体抵抗は以下のように表される。
【００５３】
【００５４】
式中、Ｌは長さ、μは動的粘度、及びＤは断面寸法（例えば直径）を表す。円形のチャンネルに対して、数値ファクターαは１２８／πに等しい。従って、流体抵抗の比は以下のように書き換えることができる。
【００５５】
【００５６】
同様に、体積比は以下のように表すことができる。
【００５７】
【００５８】
従って、二つの比は以下のように関係している。
【００５９】
【００６０】
更に、オーダーレベルで計算するために、長さ比及び粘度比の両者が約１であると仮定される。次いで、体積比は抵抗比の平方根に等しくなり、抵抗比における１０４〜１０６の範囲に対して、体積比範囲は以下のようになる。
【００６１】
【００６２】
従って、ＣＥとＰＣＲの間の相互作用無しで、ＰＣＲチャンバーからのサンプルのＣＥ解析を可能とするために、デバイスの分離チャンネルの合計総体積は、ＰＣＲチャンバーとフローチャンネルの合計総体積の１／１００〜１／１０００なる。
【００６３】
分離チャンネル中の粘度がより高く、また、これらのチャンネルの長さがより長くなる場合、体積比は適切な量によって適宜下方向に計算される。
【００６４】
そのようなシステムの製作では、大きく異なる寸法を有するチャンネルを作製することが必要である。ＰＣＲチャンバーの寸法は、用途に従って変わるその所望の体積と関連付けられる。チャンバー体積は、約１μＬ〜約１００μＬ、約１０μＬ〜約７５μＬ、又は約１０μＬ〜約５０μＬ、又は約１０μＬ〜約２５μＬの範囲で設定される。従って、例えば、２５μＬの体積のチャンバーに対して、チャンバー寸法は１０ｍｍ×５ｍｍ×５００μｍである。他の寸法が過剰に大きくなるのを避けるために、チャンバーの深さは少なくとも約５００μｍが望ましい。しかしながら、チャンバーの寸法は上記に限定されるものではなく、所望の体積を達成するために適宜変更、設定できる。
【００６５】
電気泳動分離及び検出のために使用されるチャンネルの寸法は、より小さくできる。例えば、チャンネル寸法は２０μｍ×２０μｍの断面を有する。チャンネルネットワークの深さは、流体抵抗の比を増やすために、５〜７μｍに低下させることができる。上記寸法は単なる例であってそれらに制限されるものではない。ＰＣＲチャンバー及びその接続部又はフローチャンネル中に存在する抵抗に対するこれらのチャンネル中の流体力学的流体抵抗の比が約１０３以上、約１０３〜約１０９、約１０３〜約１０７、又は約１０４〜約１０６であることを十分確保できるのであれば、ＰＣＲチャンバー及びチャンネルネットワークの間の寸法を相異させて作製してもよく、実際の寸法は適宜変更できる。つまり、所望の流体力学的流体抵抗を達成するために、フローチャンネルの寸法は、ＰＣＲチャンバーに関連して適宜設定できる。
【００６６】
例えば、ポリメチルメタクリレートや環状オレフィンポリマーのようなポリマーが、同じ基材における等しくない寸法のマイクロ流体構造を製作するために、及び得られた基材を使い捨て可能にするためには適切である。等しくないチャンネル寸法を有するポリマー製マイクロ流体デバイスは、図１(Ａ)〜１(Ｅ)に示す通り、以下の方法によって製作できる。図１(Ａ)に示すように、所望のチャンネルの深さに等しい厚み、例えば、５００〜６００μｍの範囲内の厚みを有する、両面が研磨されたシリコンウエハ１１０を選択する。次いで、浅いチャンネル用のパターンをシリコンの一側面にフォトリソグラフィー的にパターン化する。パターン化は、次工程のためのマスキング層として、フォトレジスト、酸化シリコン、及び／又は窒化シリコンの組合せを用いる。次いで、深堀り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）〔図１(Ａ)〕のような高アスペクト比プラズマエッチングを用いて浅いチャンネル１２０をエッチングする。他のエッチング技術も可能であるが、ウエハ中に深くて傾斜がきつい側部を有する孔及び溝を創出するためにＤＲＩＥが使用できる。ウエハ１１０をひっくり返し、そして深いチャンネル１３０用のパターンをシリコンの他の側面にフォトリソグラフィーでパターン化し、その反対面にエッチングされたパターンと位置合わせする。これには、シリコンウエハ１１０を調べるための赤外光を用いるなどの幾つかの位置合わせ法が必要である。ＤＲＩＥ〔図１(Ｂ)〕のような高アスペクト比プラズマエッチングを用いてシリコンウエハ全体を通してエッチングする。これによって深いチャンネル１３０の位置で、シリコンウエハ１１０中に開口部が創出される。次いで、パターン化していない硼珪酸ガラスウエハ１４０にシリコンウエハ１１０を陽極接合する〔図１(Ｃ)〕。次いで、電解メッキによって、シリコン／ガラスウエハのニッケル逆レプリカ１５０を作成する〔図１(Ｄ)〕。このレプリカ１５０は電気鋳造１５０と呼ばれる。電気鋳造１５０を使用してポリマー製基材１６０を圧縮成形又はエンボス加工する〔図１(Ｅ)〕。次いでポリマー製基材１６０を適切な位置で穴開けしてウエルを作製し、また端部を切断してマイクロ流体チップを作製し、それを他の材料と積層させ又は加圧／加熱接着させる。チャンネルをシールする一つの方法はポリマー薄膜を用いる積層である。
【００６７】
代替法として、ＰＣＲチャンバー２２０のようなポリマー製マイクロ流体チップにおける大容量空間は、浅い分離チャンネルが成形又はエンボス加工によって製作された後、ＣＮＣ機械加工のような他の方法によって製作できることである。この方法は全てのデバイスに対して繰返される必要があるのでより遅いが、大容量空間の設計においてより多くの柔軟性を持つことができるという利点を有する。
【００６８】
例えば、約２５μLの体積を有するＰＣＲチャンバーを製造するための電気鋳造１５０の一部を作製するために、ウエハ１１０にディープエッチングが実施される。図２にマイクロ流体システムの実施態様を示す。ポリマー製チップ２１０は、深さ５００μｍ及び面積５０ｍｍ２、又は７×７ｍｍの四角形を有するＰＣＲチャンバー２２０で作製される。他の寸法も可能であり、深さ、幅及び高さは、チャンバーの所望の体積に従って適宜制御される。また、チャンバーは、チャンバーに適切な溶液を充填させるために、チャンバーをフローウエル２４０に接続させるアクセス又はフローチャンネル２３０を有する。
【００６９】
ＰＣＲチャンバー２２０も、フローウエル２４０から分離された分離チャンネルに直接的に又は間接的に接続される。分離チャンネルは、なかでも、増幅されたＤＮＡの画分を導入するために使用することができるローディングチャンネル２５０、及びローディングチャンネル２５０と交差する（交差領域）ＣＥチャンネル２００を含むために使用される一般用語であり、増幅されたＤＮＡのサイズを検出するための電気泳動分離を実行するために使用される。図２には一つのローディングチャンネル２５０及び一つのＣＥチャンネル２００のみが示されているが、チップは各々一つより多くを有するように構成できる。分離チャンネル（例えば、ローディングチャンネル２５０及びＣＥチャンネル２００）の内部体積は、ＰＣＲチャンバー２２０及びフローチャンネル２３０の総体積の約１／１００以下、約１／１００〜約１／１０００、又は約１／３００〜約１／１０００となるよう設計される。ＰＣＲチャンバー２２０及びフローチャンネル２３０に存在する流体力学的流体抵抗に対するこれらのチャンバーの流体力学的流体抵抗の比が、約１０３以上、約１０３〜約１０９、約１０３〜約１０７、又は約１０４〜約１０６となることを考慮して、ＰＣＲチャンバー２２０及びフローチャンネル２３０の寸法、及びローディングチャンネル２５０及びＣＥチャンネル２００の寸法を適宜変更することができる。ＰＣＲチャンバー２２０に比較して、ローディングチャンネル２５０及びＣＥチャンネル２００の流体力学的抵抗を高くすることによって、バルブ又はプラグを用いることなくチャンネルに対するゲート機能を達成することができる。ポリマーチップ２１０にも、ポリマーチップ２１０からのシグナルを読みそして処理するための光学的読取り制御デバイス２７０、及びＰＣＲチャンバー２２０をサーマルサイクリングするためのサーマルサイクリングデバイス２８０が供される。
【００７０】
ローディングチャンネル２５０は、ＰＣＲチャンバー２２０に接続されていない反対側の両端部でローディング？？？ウエル２６０にそれぞれ接続される。ローディングウエル２６０はＤＮＡを導入又は／及び注入するための電気的接点として機能することができる。ＣＥチャンネル２００の反対側の両端部は各ＣＥウエル３００に接続される。ＣＥウエル３００は電気泳動のための電気的接点として機能することができる。この配置により、フローチャンネル２３０によってＰＣＲチャンバー２２０に接続された２つのフローウエル２４０中に電極を配置することを避けることができる。フローウエル２４０はＰＣＲチャンバー２２０を充填するために十分大きな総体積を有することが必要である。上記設計において、ローディングウエル２６０はフローウエル２４０から分離された状態に維持され、電極に電圧を印加するための電源供給部に接続される。ＣＥウエル３００もまたフローウエル２４０から分離された状態に維持され、電極に電圧を印加するための電源供給部に接続される。この配置は温度サイクリング中にフローウエルをシールするのを容易にする。更に、サイクリング中のチャンバーとウエルの間での過剰な流れを避けるために、要すれば、フロー抵抗器２９０をＰＣＲチャンバーの各端部に設置することができる。
【００７１】
図３にマイクロ流体システムの別の実施態様を示す。ポリマーチップ３１０は、フローウエル３４０につながるフローチャンネル３３０に接続されたＰＣＲチャンバー３２０を有する。フローチャンネル３３０に加えて、ＰＣＲチャンバー３２０は直接的に又は間接的に分離チャンネルに接続される。分離チャンネルは、その両端部がローディングウエル３６０につながるローディングチャンネル３５０、及びローディングチャンネル３５０と交差し（交差領域）、その両端部が各々ＣＥウエル３９５につながるＣＥチャンネル３９０を含む。図３には一つのローディングチャンネル３５０及び一つのＣＥチャンネル３９０のみが示されているが、チップは各々一つより多くを有するように構成できる。この設計は、前述の実施態様よりもコンパクトであり、従って、より多くのチップが単一の電気鋳造から作製できるため、より経済的に作製できる。制限要因は、ＰＣＲの加熱サイクリングが分離を乱さないことを十分確実にするために、分離チャンネル（つまり、ローディングチャンネル３５０及びＣＥチャンネル３９０）をＰＣＲチャンバー３２０から分離する必要性があるということである。前述の実施態様のように、分離チャンネル（ローディングチャンネル３５０及びＣＥチャンネル３９０）の総体積は、ＰＣＲチャンバー３２０及びフローチャンネル３３０の総体積の、約１／１００以下、約１／１００〜約１／１０００、又は約１／３００〜約１／１０００となるよう設計される。ＰＣＲチャンバー３２０及びフローチャンネル３３０の寸法、及びローディングチャンネル３５０及びＣＥチャンネル３９０の寸法は、ＰＣＲチャンバー３２０及びそのフローチャンネル３３０に存在する流体力学的流体抵抗に対するこれらのチャンネル中の流体力学的流体抵抗の比が、約１０３以上、約１０３〜約１０９、約１０３〜約１０７、又は約１０４〜約１０６となることを考慮して、適宜変更することができる。ローディングチャンネル３５０及びＣＥチャンネル３９０の流体力学的抵抗をＰＣＲチャンバー３２０と比較して高くすることによって、バルブ又はプラグを使用せずにチャンネルに対するゲート機能を達成することができる。ポリマーチップ３１０にも、ポリマーチップ３１０からのシグナルを読みそして処理するための光学的読取り制御デバイス３７０、及びＰＣＲチャンバー３２０をサーマルサイクリングするためのサーマルサイクリングデバイス３８０が供される。
【００７２】
ＰＣＲチャンバーの他の付加的特徴は、積層フィルムが比較的大きな面積を被覆する場合に、積層フィルムのたわみを避けるための幾つかの内部支持構造体にある。例えば、図４に示されるように、積層フィルムがたわまないように支えるために、本実施態様では内部支持構造体４００がＰＣＲチャンバー４１０内に設置されていることが示されている。本明細書において、内部支持構造体４００は、チャンバー４１０内の矩形のコーナーに４つの構造体、及び中央部に５番目の支持構造体が設置されており、ＰＣＲチャンバーは最も広いところで５．４ｍｍの幅、０．５ｍｍの深さ、及び２５μＬの総体積を有する。本明細書において記載された寸法は例であり、チャンバーを制限するものではない。構造体４１０は、チャンバーの底部と、チャンバー４１０を覆って設置される積層フィルムとに接続される。支持構造体のサイズ、数、及びレイアウトは、積層フィルムのたわみが生じないことを確実にするため、チャンバーのサイズ及び体積に関連して適宜設定される。つまり、支持構造体は、１つ以上存在し、チャンバーの体積、深さ及び幅を考慮して積層フィルムを最も良好に支持し得るように配置される。支持構造体の材料は、ＰＣＲチャンバーと同じポリマー材料であってもよいが、不活性であり、且つチャンバー中に配置されるどのような溶液とも反応しない限り、異なっていてもよい。
【００７３】
上記した実施態様において述べられたデバイスは、増幅の過程で、ポリマーチップに集積されたＣＥ部品によって幾つかのＤＮＡサンプルを取り出して解析できる、リアルタイムＰＣＲ−ＣＥを実施するために設計されたものである。取り出されたＤＮＡの画分は非常に小さい少量であるため、ＰＣＲプロセスには顕著な影響を及ぼさない。ＤＮＡ分離においては通例であるように、分離チャンネル中の電気浸透流が抑制されると、その結果、ＤＮＡのみ電気泳動によって完全に移動し、ＰＣＲチャンバーから少しのPCR反応液も取り除かれることはない。ＰＣＲの各サイクル又はＰＣＲの２回毎のサイクルに対してサンプルが取り出されて解析される。マイクロ流体チップにおけるＰＣＲサイクルが一般的に１５秒〜６０秒かかり、また、最速のマイクロ流体ＤＮＡ分離が６０秒又はそれより早いオーダーであるため、このようなサンプルの取り出し・解析が可能となる。また、複数のサンプルを同時に分離することができるため、サンプル採取の間の時間間隔は、分離に要する時間よりも短くできる。複数の時点でサンプリングできるという事実は、増幅の終点における単一の時点でもサンプリングできることを意味する（エンドポイントＰＣＲ−ＣＥ）。
【００７４】
実施態様において述べられたような、リアルタイムＣＥ検出でのマイクロチップＰＣＲのためのデバイスの使用に係る方法は、以下のように実施することができる。本方法は図２及び図３に示された例示的システムを参照するものである。マイクロチップ２１０又は３１０の浅い電気泳動のＣＥチャンネル２００又は３９０をＤＮＡ分子篩いマトリックスで満たす。このマトリックスは、電気浸透流を抑制するのに十分にチャンネル壁をコートすることができ、また、どのような圧力誘起流をも低下させ、チャンネルとＰＣＲチャンバーの間の流体力学的流体抵抗比を増大させるために、例えば、約１０〜２０センチポアズの相当に高い粘度を有するものである。このマトリックスにはまた、ＤＮＡ断片を検出するために、臭化エチジウム、Cyber Green、Evergreen、又はSyto色素等の適切なインターカレーター色素を含有させることもできる。次いで、ＰＣＲチャンバー２２０又は３２０を、サンプルを含有する混合物、及び必要な酵素を含有する全ての試薬で満たす。更に、ＰＣＲフローウエル２４０又は３４０をシールし、温度サイクリングシステムにチップを設置する。次いで、ＰＣＲチャンバーからローディングチャンネル２５０又は３５０内にＤＮＡ画分を導入するために、増幅中（各サイクル毎、又は２サイクル毎）、温度サイクリングによる増幅を実施しながら、図２の場合は電気泳動のローディングウエル２６０に、また図３の場合はウエル３６０に電圧を印加する。次いで、ＣＥウエル３００又は３９５に電圧を印加することによって、このＤＮＡの部分が交差領域を通ってＣＥチャンネル２００又は３９０内に注入される。更に、ＤＮＡを分離して、交差領域から適切な距離でＤＮＡを検出する。比較的小さな二本鎖ＤＮＡ断片の迅速な分離のために、分離領域及び分離長さを最適化することができる。次いで、各分離において、所望のＰＣＲ増幅産物に対応するピークを同定し、ピークの高さ又は面積によってそのＰＣＲ増幅産物のサイズを計算する。次いで、得られたピークサイズをサイクル数に対してプロットし、これらのデータを使用してサンプル中に存在する標的ＤＮＡの元の量を求める。
【００７５】
代表的な単一ＰＣＲサイクルには、変性、プライマーの結合又はアニーリング、及びＤＮＡの合成又は伸張の３つの工程が含まれる。変性中に、二本鎖ＤＮＡ鋳型を分離するために出発混合物を最初に約９４℃〜９６℃に加熱する。ＤＮＡの変性後、分離された鎖の相補配列にプライマーを結合させるために混合物を約５５℃に冷却する。プライマーは複製されるべきＤＮＡの末端を規定する。次いで、ＤＮＡポリメラーゼが、鋳型鎖上のアニールしたプライマーの伸張を触媒するように、混合物を約７２℃で加熱する。この１サイクルを１回以上の回数、繰返す。
【００７６】
幾つかの場合において、単一ＰＣＲサイクルは、変性工程、及びＤＮＡ合成とプライマー結合工程の２つの工程のみを含む。この場合、二本鎖ＤＮＡ鋳型を分離するために出発混合物を最初に約９４℃〜９６℃に加熱する。変性後、分離された鎖の相補配列にプライマーを結合させるため、及びＤＮＡポリメラーゼが鋳型鎖上のアニールしたプライマーの伸張を触媒するために、混合物を規定された温度（約６０〜７０℃）に冷却する。この１サイクルを１回以上の回数、繰返す。
【００７７】
ＰＣＲ増幅をより低温で実施することが可能である。例えば、鋳型ＤＮＡの変性温度を下げるために、プロリン等の添加剤又は添加剤類を反応混合物中に含有させる。例えば、約７５℃の低い変性温度、及び約５５℃のプライマーのアニーリング及び伸張温度によって低温サイクルＰＣＲを実施することができる。
【００７８】
別の例においては、ＤＮＡをサーマルサイクリングを必要とせずに増幅することができる。例えば、加熱の代わりにヘリカーゼと呼ばれる酵素によってＤＮＡ鋳型を分離する。このようにして、ＤＮＡをサーマルサイクリングを使用せずに単一温度で増幅することができる。
【００７９】
反応サンプルの一部、例えば、チャンバー中で反応したＰＣＲ増幅産物、を、ＰＣＲ温度サイクリングによる増幅が完了した後ではなく、ＰＣＲ温度サイクリングによる増幅中に、適切な電圧を印加することによって分離チャンネル内に注入する。分離チャンネル中に注入されたＰＣＲ増幅産物を、分離チャンネルで分離する。次いで、分離されたＰＣＲ増幅産物を検出する。更に、これらの注入工程、分離工程、及び検出工程を１回以上の回数、繰返す。
【００８０】
サンプル中に存在する標的核酸の元の量の測定は、検出プロセスを繰返して得られるデータを収集すること、及び収集されたデータに基づいて存在する核酸の量を定量することによって実施することができる。例えば、存在する核酸の量の定量は、スレッシュホールド・サイクル（Ｃｔ値：threshold cycle）の計算によって実施することができる。
【００８１】
一例として、図２におけるＰＣＲチップ２１０を用いるＰＣＲ−ＣＥの実験について述べる。この実験で使用された試薬は以下の通りである：ＢＳＡ溶液（１００μｇ／ｍＬ）；ＢＣＧゲノムＤＮＡ，ｌ０６コピー／μＬ；ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ，５Ｕ／μＬ；１０×ＰＣＲ緩衝液；５０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ｄＮＴＰ；ＩＳ＿Ｆ１０フォワードプライマー，ＣＴＣＡＣＣＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧ，５μＭ；及びＩＳ＿Ｒ８リバースプライマー，ＧＧＴＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧ，５μＭ。ＰＣＲ反応溶液（２８μＬ）は以下を含む：１×ＰＣＲ緩衝液；０．４ｍＭ ｄＮＴＰ；３ｍＭ ＭｇＣｌ２；２５０ｎＭ フォワードプライマー；２５０ｎＭ リバースプライマー；１μＬ ＢＣＧゲノムＤＮＡ（１０５コピー）；及び１Ｕ ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。
【００８２】
ＰＣＲ−ＣＥチップ２１０のＣＥチャンネル２００にインターカレーター色素を含有するポリジメチルアクリルアミドのゲルマトリックスを充填し、そして２８μＬのＰＣＲ反応混合物を１つのウエル２４０からＰＣＲチップ２１０にロードした。次いで、ＰＣＲ試薬及びゲルが充填されたＰＣＲチップをサーマルサイクラー２８０のサーマルサイクリングデバイスと一緒に固定した。ＰＣＲサイクリング中の蒸発を抑制するために、チップ２１０に亘ってかつ密閉的に覆って設置されたマニホールドデバイスを通して、全てのウエルに３０ｐｓｉの圧力をかけた。このマニホールドデバイスは２００７年５月１５日に出願された米国仮出願番号６０／９３８，１７１号の優先権を主張する、２００８年５月１５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６２６６号中により詳細に述べられており、その両者は本明細書に引用することによりその全体が組込まれている。以下のサイクルプロトコールを用いてＰＣＲを実施した：１×９６℃，３０ｓ；及び４０×９６℃，１５ｓ，６２℃，１５ｓ，及び７２℃，３０ｓ。
【００８３】
ローディングウエル２６０の間に、１４、１６、１８、２０、２２、２５及び３０サイクルで電圧を印加することによって、チャンバー２２０からのＰＣＲ産物サンプルをローディングチャンネル２５０内に移動した。次いで、ＣＥウエル３００の間に電圧を印加することによって、ＰＣＲ産物サンプルをＣＥチャンネル２００内に注入して分離し、そして光学的読取り制御デバイス２７０によって解析した。ＰＣＲ混合物中の内部マーカー（１００ｂｐのＤＮＡ）を用いてＰＣＲ産物のピーク面積を正規化し、サイクル数に対してプロットして図５に示すＰＣＲ成長曲線を得た。図６に標的ＰＣＲ産物サンプル（２００ｂｐ）が検出可能となり始めた時点である１８サイクル目でのＣＥ分離のエレクトロフェログラムを示す。合計時間は１時間であった。
【００８４】
リアルタイムＰＣＲにおける相対的定量計算のための種々の方法が知られている。例えば、米国特許第６，９４２，９７１号には、ＤＮＡ量を定量するために、核酸の成長曲線を規定するシグナル値を保存し、成長曲線の微分係数を求め、そして微分係数の特性に関連があるサイクル数又は時間値を計算するためのプログラムが開示されている。YuanらのBMC Bioinformartics 7:85 (2006)において、著者らは、ＤＮＡ産物の量を定量するための、リアルタイムＰＣＲデータの統計的解析を提案している。PfafflのNucleic Acid Research, vol.29, No.9 (2001)において、著者は、リアルタイムＰＣＲにおける相対的定量のための新しい数学モデルを開示している。これらの何れの方法もそしてこの分野で公知の他の方法も、リアルタイムＰＣＲにおける核酸の量を定量するために使用することができる。
【００８５】
別の実施態様において、エンドポイントＰＣＲアッセイが実証されている。ＣＥ検出を用いるＰＣＲのためのマイクロ流体チップ６００は、図７に示すように、各々約３０μｍの幅のチャンネル６０５、及び約５００μｍの深さのＰＣＲチャンバー６１０を有する。基本的に、ウエル１〜８を有するチップ６００の寸法は図２における寸法と同じである。
【００８６】
エンドポイントＰＣＲアッセイを実施するために、チャンネルに、ｐＨ８の２００ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液、２％ ポリジメチルアクリルアミド分子篩いマトリックス及びエチジウム ブロマイド ダイマー蛍光色素からなる分離ゲルを最初に充填した。次いで、チャンバー６１０に、ＰＣＲ反応のために必要な全ての試薬（プライマー、酵素、緩衝液、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ’ｓ）を含有するＰＣＲ緩衝液、及び異なるコピー数の標的物をロードした。標的物としてプラスミドＤＮＡの２００ｂｐ断片を使用した。チャンバー６１０とローディング電極ウエル５の間を接続したチャンネル６０５にＰＣＲ緩衝液が充填された。全てのチャンネル及びチャンバーが充填された後、各ウエルに分離ゲル、マーカー又はＰＣＲ緩衝液を充填した。
【００８７】
次に、チップ６００を、ヒーター及び冷却手段に接続されている平らな銅板からなるサーマルサイクリングデバイス（図示していない）に設置した。３７ｐｓｉの圧力を、マニホールドデバイス（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６２６６号に記載されている）を通して全てのウエルに同時に印加した。サーマルサイクリングは以下のタイミングで４０サイクル設定した。変性１５ｓ、アニーリング２０ｓ、及び伸張１５ｓ。合計サイクル時間は２１００ｓであった。ＰＣＲサイクルの後、圧力をゆっくりと開放した。
【００８８】
サーマルサイクリングの後、オン−チップキャピラリー電気泳動を実施した。蛍光顕微鏡を用いて光学的検出を行いながら、挿入された白金電極を用いて、ウエルに電圧を印加した。５３２ｎｍの緑色ダイオードレーザーからの入射光を使用し、６１０±３５ｎｍの励起フィルターを使用した。
【００８９】
ウエル３からのＤＮＡサイズマーカー（１００ｂｐ及び７００ｂｐ）と混合させながら、ＰＣＲチャンバーからサンプルを電気泳動的にウエル８の方向に移動させた。同時に、ウエル１及び７からの電流も交差点に向けて流し、その交差点でサンプルを閉じ込めた。次の工程において、引き抜き電流をウエル８及び３からサンプルローディングチャンネル中に維持しながら、分離を実施するために、ＤＮＡをウエル７からウエル１に移動させた。下表に、ＣＥ分離のために印加した電圧と電流を示す。
【００９０】
【表１】
【００９１】
図８(Ａ)〜(Ｆ)に、ＰＣＲ緩衝液中の標的ＤＮＡの異なる元のコピー数〔１０５、１０４、１０３、１０２、１０及び０（コントロール）コピー数〕を用いて、上述のように実施した一連の実験によって得られたＣＥの結果を示す。この結果は、元のコピー数が１０コピーであっても、その増幅から得られる産物が検出できることを示している。図９に示したように、この１０コピーを用いた実験を次の日に繰返し行った（後述する、表２における「１０＿２日」）。増幅されたピークは、はるかに小さいもののまだ検出可能であることが判る。
【００９２】
この実験における各ピークの大きさは、別途実施された検量実験に基づいてＤＮＡ濃度を測定するために使用することができる。本例示的マイクロ流体デバイスから及び他のデバイスからの濃度の測定結果を下表に示す。
【００９３】
図８(Ａ)〜(Ｆ)及び図９に示されるＰＣＲ試験の後、サンプルをチップから取り出して、各ピークの濃度を測定するために使用されるAgilent 2100 Bioanalyzerで解析した。別のコントロール実験として、同様にＤＮＡ濃度を測定するCepheid社のSmart Cycler（登録商標）を用いて、同じＰＣＲを実施した。上記で得られた結果を併せて下表に示す。
【００９４】
【表２】
【００９５】
マイクロ流体デバイスは、他の検出デバイスより優れていないとしても同等の感度を有していることが判る。結果のバラツキは、希釈を行うたびに実際に存在するコピー数の統計的変動によって説明できる。各増幅後に存在するＤＮＡの定量レベルは、全ての方法で同程度であり、標的の元のコピー数に従って単調に増大した。
【００９６】
上述の設計及び方法に加えることができる多くの変更や追加可能な特徴が存在する。一例は、特大体積のウエルを用いることによるサンプルとＰＣＲ混合物とのオン−チップ混合である。この例では、解析されるべきサンプル、及びプライマー、酵素及びヌクレオチドを含有するＰＣＲマスター混合物を連続してウエル中に配置するための外部ピペッターの使用を含んでいてもよい。そのようなウエルは、少なくともＰＣＲチャンバーと同じほど大きい、約１０〜１００μLの範囲の体積を必要とするかもしれない。別の例は、ＰＣＲ反応からのＤＮＡサンプルとDNA長を決定する標準物とのオン−チップ混合である。これを行うためには、ＤＮＡ標準物又はマーカーを含有する特別のウエル、及びＰＣＲチャンバー２２０と注入交差点の間でそのウエルをチャンネルの部分に接続するチャンネルの追加が必要である。ＰＣＲチャンバーからのＤＮＡサンプルとＤＮＡ標準物の間の混合比は分離ウエル２６０及び追加のＤＮＡマーカーウエルに印加される電圧又は電流によって制御することができる。
【００９７】
本明細書に開示された本発明の明細書及び実施例を考慮すれば、本発明の他の実施態様が当業者にとって明白であろう。明細書及び実施例は単に例示的なものとして考えられ、そして本発明の範囲と精神は以下の請求の範囲によって示されることを意図するものである。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明は、大容量のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び集積キャピラリー電気泳動（ＣＥ）検出を実施するためのマイクロ流体デバイスに関する。本マイクロ流体デバイスは、高いコスト効率でありながら検出における非常に高感度を達成できる。
【符号の説明】
【００９９】
１１０ シリコンウエハ
１２０ 浅いチャンネル
１３０ 深いチャンネル
１４０ 硼珪酸ガラスウエハ
１５０ ニッケル逆レプリカ（電気鋳造）
１６０ ポリマー製基材
２００、３９０ ＣＥチャンネル
２１０、３１０、６００ チップ
２２０、３２０、４１０、６１０ ＰＣＲチャンバー
２３０、３３０ フローチャンネル
２４０、３４０ フローウエル
２５０、３５０ ローディングチャンネル
２６０、３６０ ローディングウエル
２７０、３７０ 光学的読取り制御デバイス
２８０、３８０ サーマルサイクリングデバイス
２９０ フロー抵抗器
３００、３９５ ＣＥウエル
４００ 内部支持構造体
６０５ チャネル
１、２、３、４、５、６、７、８ ウエル
【図１（Ａ）】
【図１（Ｂ）】
【図１（Ｃ）】
【図１（Ｄ）】
【図１（Ｅ）】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体システムであって：
核酸を増幅するためのチャンバーを有する基材；
基材上に配列された複数のウエル；
チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び
チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、チャンバーと他のウエルとを接続する、基材に具備された１以上の分離チャンネル；
を含み、
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗の少なくとも１／１０３以下となるように構成されるマイクロ流体システム。
【請求項２】
更に、チャンバー中で核酸の増幅を行うためのサーマルサイクリングデバイスを含む、請求項１記載のマイクロ流体システム。
【請求項３】
チャンバー及びフローチャンネルの流体力学的流体抵抗に対する、１以上の分離チャンネル中の流体力学的流体抵抗の抵抗比が、約１０３から約１０９の間である、請求項１記載のマイクロ流体システム。
【請求項４】
更に、電気泳動的に分離された核酸画分からの信号を光学的に検出し、その信号を処理するための光学的読取り制御デバイスを含む、請求項１記載のマイクロ流体システム。
【請求項５】
核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体システムであって：
核酸を増幅するためのチャンバーを有する基材；
基材上に配列されたウエル；
チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び
基材に具備され、チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するためにチャンバーに接続された、１以上の分離チャンネル；
を含み、
１以上の分離チャンネルの総体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の少なくとも１／１００以下である、マイクロ流体システム。
【請求項６】
更に、チャンバー中で核酸の増幅を行うためのサーマルサイクリングデバイスを含む、請求項５記載のマイクロ流体システム。
【請求項７】
更に、電気泳動的に分離された核酸画分からの信号を光学的に検出し、その信号を処理するための光学的読取り制御デバイスを含む、請求項５記載のマイクロ流体システム。
【請求項８】
１以上の分離チャンネルの総体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の少なくとも約１／１００〜約１／１０００である、請求項５記載のマイクロ流体システム。
【請求項９】
核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体デバイスであって：
核酸を増幅するためのチャンバーを有する基材；
基材に具備された複数のウエル；
チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び
チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、チャンバーと他のウエルとを接続する、基材に具備された１以上の分離チャンネル；
を含み、
１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗がバルブの代わりとして機能するように、１以上の分離チャンネルの寸法が、フローチャンネル及びチャンバーの各々の寸法よりも小さいマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗の約１／１０３以下となるように構成される、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１つ又はそれ以上の分離チャンネル中の流体力学的流体抵抗の約１／１０３〜１／１０９となるように構成される、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
チャンバーが、約１０μＬ〜約２５μＬの体積を有する、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
１以上の分離チャンネルの体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の少なくとも１／１００以下である、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
１以上の分離チャンネルの体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の約１／１００〜約１／１０００である、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
電気泳動ＤＮＡサイジング分析を行うためのチャンネルネットワークを形成するために、１つより多くの分離チャンネルが基材に具備される、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
マイクロ流体デバイスを用いて核酸を増幅及び検出する方法であって、
（１）核酸を増幅するためのチャンバー、ウエル、チャンバーを通って溶液の流れを可能とするためにウェルとチャンバーに接続されたフローチャンネル、及びチャンバーに接続された１つ又はそれ以上の分離チャンネルを含むマイクロ流体デバイスを供すること；
（２）チャンバー中に核酸の溶液を配置すること；
（３）チャンバー中に配置された核酸を増幅すること；
（４）増幅された核酸の画分をチャンバーから１つ又はそれ以上の分離チャンネル内に導入すること；
（５）１つ又はそれ以上の分離チャンネルを通して、増幅された核酸画分を分離すること；及び
（６）分離された核酸を検出すること；
を含み、
工程（３）〜（６）が１回以上の回数、繰返されるか、又は工程（３）が１回以上の回数、繰返された後に工程（４）〜（６）が１回実行される方法。
【請求項１７】
チャンバー中に配置された核酸の増幅が、サーマルサイクリングによって行われる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
更に、（８）収集したデータに基づいて、存在する核酸の量を定量すること、を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
存在する核酸量の定量が、スレッシュホールド・サイクル（Ｃｔ値：threshold cycle）の計算によって求められる、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗の少なくとも１／１０３以下となるように構成される、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗の約１／１０３〜１／１０９となるように構成される、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
チャンバーが、約１０μＬ〜約２５μＬの体積を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
１つ又はそれ以上の分離チャンネルの体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の少なくとも１／１００以下である、請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
１つ又はそれ以上の分離チャンネルの体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の約１／１００〜約１／１０００である、請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
電気泳動ＤＮＡサイジング分析を行うためのチャンネルのネットワークを形成するために、１つより多くの分離チャンネルが基材に具備される、請求項１６記載の方法。
【請求項１】
核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体システムであって：
核酸を増幅するためのチャンバーを有する基材；
基材上に配列された複数のウエル；
チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び
チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、チャンバーと他のウエルとを接続する、基材に具備された１以上の分離チャンネル；
を含み、
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗の少なくとも１／１０３以下となるように構成されるマイクロ流体システム。
【請求項２】
更に、チャンバー中で核酸の増幅を行うためのサーマルサイクリングデバイスを含む、請求項１記載のマイクロ流体システム。
【請求項３】
チャンバー及びフローチャンネルの流体力学的流体抵抗に対する、１以上の分離チャンネル中の流体力学的流体抵抗の抵抗比が、約１０３から約１０９の間である、請求項１記載のマイクロ流体システム。
【請求項４】
更に、電気泳動的に分離された核酸画分からの信号を光学的に検出し、その信号を処理するための光学的読取り制御デバイスを含む、請求項１記載のマイクロ流体システム。
【請求項５】
核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体システムであって：
核酸を増幅するためのチャンバーを有する基材；
基材上に配列されたウエル；
チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び
基材に具備され、チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するためにチャンバーに接続された、１以上の分離チャンネル；
を含み、
１以上の分離チャンネルの総体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の少なくとも１／１００以下である、マイクロ流体システム。
【請求項６】
更に、チャンバー中で核酸の増幅を行うためのサーマルサイクリングデバイスを含む、請求項５記載のマイクロ流体システム。
【請求項７】
更に、電気泳動的に分離された核酸画分からの信号を光学的に検出し、その信号を処理するための光学的読取り制御デバイスを含む、請求項５記載のマイクロ流体システム。
【請求項８】
１以上の分離チャンネルの総体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の少なくとも約１／１００〜約１／１０００である、請求項５記載のマイクロ流体システム。
【請求項９】
核酸を増幅及び検出するためのマイクロ流体デバイスであって：
核酸を増幅するためのチャンバーを有する基材；
基材に具備された複数のウエル；
チャンバーを通って溶液の流れを可能とするために、基材においてウエルとチャンバーとを接続するフローチャンネル；及び
チャンバー中で増幅された核酸の画分を分離及び検出するために、チャンバーと他のウエルとを接続する、基材に具備された１以上の分離チャンネル；
を含み、
１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗がバルブの代わりとして機能するように、１以上の分離チャンネルの寸法が、フローチャンネル及びチャンバーの各々の寸法よりも小さいマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗の約１／１０３以下となるように構成される、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１つ又はそれ以上の分離チャンネル中の流体力学的流体抵抗の約１／１０３〜１／１０９となるように構成される、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
チャンバーが、約１０μＬ〜約２５μＬの体積を有する、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
１以上の分離チャンネルの体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の少なくとも１／１００以下である、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
１以上の分離チャンネルの体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の約１／１００〜約１／１０００である、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
電気泳動ＤＮＡサイジング分析を行うためのチャンネルネットワークを形成するために、１つより多くの分離チャンネルが基材に具備される、請求項９記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１６】
マイクロ流体デバイスを用いて核酸を増幅及び検出する方法であって、
（１）核酸を増幅するためのチャンバー、ウエル、チャンバーを通って溶液の流れを可能とするためにウェルとチャンバーに接続されたフローチャンネル、及びチャンバーに接続された１つ又はそれ以上の分離チャンネルを含むマイクロ流体デバイスを供すること；
（２）チャンバー中に核酸の溶液を配置すること；
（３）チャンバー中に配置された核酸を増幅すること；
（４）増幅された核酸の画分をチャンバーから１つ又はそれ以上の分離チャンネル内に導入すること；
（５）１つ又はそれ以上の分離チャンネルを通して、増幅された核酸画分を分離すること；及び
（６）分離された核酸を検出すること；
を含み、
工程（３）〜（６）が１回以上の回数、繰返されるか、又は工程（３）が１回以上の回数、繰返された後に工程（４）〜（６）が１回実行される方法。
【請求項１７】
チャンバー中に配置された核酸の増幅が、サーマルサイクリングによって行われる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
更に、（８）収集したデータに基づいて、存在する核酸の量を定量すること、を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
存在する核酸量の定量が、スレッシュホールド・サイクル（Ｃｔ値：threshold cycle）の計算によって求められる、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗の少なくとも１／１０３以下となるように構成される、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
チャンバー、フローチャンネル及び１以上の分離チャンネルが、チャンバーとフローチャンネルを合わせた流体力学的流体抵抗が１以上の分離チャンネルの流体力学的流体抵抗の約１／１０３〜１／１０９となるように構成される、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
チャンバーが、約１０μＬ〜約２５μＬの体積を有する、請求項１６記載の方法。
【請求項２３】
１つ又はそれ以上の分離チャンネルの体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の少なくとも１／１００以下である、請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
１つ又はそれ以上の分離チャンネルの体積が、チャンバー及びフローチャンネルの総体積の約１／１００〜約１／１０００である、請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
電気泳動ＤＮＡサイジング分析を行うためのチャンネルのネットワークを形成するために、１つより多くの分離チャンネルが基材に具備される、請求項１６記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５２８６７６（Ｐ２０１０−５２８６７６Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１２１９０（Ｐ２０１０−５１２１９０）
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７３５９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５４０３６
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（０００２５２３００）和光純薬工業株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７３５９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５４０３６
【国際公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【出願人】（０００２５２３００）和光純薬工業株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
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