電気化学的測定方法および新規ｐ−フェニレンジアミン化合物
【目的】測定感度が良好で、試料が血液等の妨害物質を含有するものであっても、安定的に再現性の良好な測定を行え、使い捨ての用途にも好適に利用することができる電気化学的測定方法、およびこれに用いる新規ｐ−フェニレンジアミン化合物を提供する。
【構成】酸化還元酵素を用いた電気化学的測定方法において、測定系に酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を配し、前記電子伝達物質として、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有するｐ−フェニレンジアミン誘導体またはその塩、あるいは、前述の基を有するアルキル基ならびに水素原子を有するｐ−フェニレンジアミン誘導体またはその塩を用いることにより、前記目的を達成する。
【構成】酸化還元酵素を用いた電気化学的測定方法において、測定系に酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を配し、前記電子伝達物質として、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有するｐ−フェニレンジアミン誘導体またはその塩、あるいは、前述の基を有するアルキル基ならびに水素原子を有するｐ−フェニレンジアミン誘導体またはその塩を用いることにより、前記目的を達成する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は電子伝達物質を用いた電気化学的測定方法および新規なｐ−フェニレンジアミン化合物に関する。詳しくは、少なくとも１つの酸化還元酵素、電極、および所定の電子伝達物質（electron mediator)を有する系によって、液性試料中の分析対象物を測定する電気化学的測定方法、例えば、酵素電極法あるいは特異結合分析方法、ならびに、この電気化学的測定方法に利用可能な新規ｐ−フェニレンジアミン化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素電極法とは、一般に酵素固定化膜と電極とを組み合わせた装置を使用して、酵素の分子識別能を利用して化学物質を選択的に測定する方法であり、生化学的分析方法の分野では、酵素センサー等を用いた簡便で迅速な測定方法が既に開示されている。一例をあげると、特公平２−５９４２４号、特開昭６０−１７３４６号、同６０−１７３４７号の各公報に開示される測定方法が例示される。他方、特異結合分析法としては、抗原抗体反応を応用したイムノアッセイ、受容体を用いたレセプターアッセイ、相補的核酸配列のハイブリダイゼーションを用いた核酸プローブアッセイなど多くの方法が知られており、その特異性の高さから、臨床検査をはじめとする広い分野で繁用されている。
【０００３】一方、電気化学センサーの特異結合分析方法への応用の試みも積極的に行われている。例えば、特開昭５８−５８４６７号公報には、酵素（カタラーゼ）標識抗体を用いた電極表面での特異結合反応が； 特開平２−１７９４６１号公報には、酵素（グルコースオキシダーゼ）標識物を用いた電極表面での競合的特異結合反応が； 特開昭６０−１７３６０号公報には、酸化還元酵素（グルコースオキシダーゼなど）と電子メディエータ（フェロセン誘導体など）を用いた特異結合反応が； それぞれ開示されている。さらに、これらと同様な技術として、特開平３−２５３６０号、特開昭６０−１２７４５０号、同６０−２４２３６１号、同６３−１３９２４８号、特表昭６１−５００７０６号の各公報や、米国特許第４，９６３，２４５号、米国特許第５，０６６，３７２号の各明細書、さらには、Anal.Chem.,Vol.56,2355-2360(1984) やClin.Chem.,Vol.31,1449-1452(1985) 等に各種の開示がある。
【０００４】このような酵素電極法や特異結合分析法のうち、電流計測型の酵素電極法および電気化学センサーを用いた特異結合分析法等においては、酵素などの生物学的な酸化還元反応と電極反応とを媒介する低分子化合物、いわゆる電子伝達物質が汎用されている。すなわち、電子伝達物質とは、少なくとも１つの酸化還元酵素、および系内において電子移動可能な電極を用いる測定系において、酵素反応と電極反応との間の電子の伝達移動を媒介する化合物である。
【０００５】このような電子伝達物質は、酵素反応で「還元／酸化」され、電極反応で「酸化／還元」されるものであり、この２つの反応間を循環して、酵素反応から電極反応あるいは電極反応から酵素反応への電子が伝達移動するのを媒介する。そのため、このような電子伝達物質には、■酵素反応によって効率よく酸化あるいは還元される化合物であること；
■電極反応で酸化あるいは還元され、再び、酵素反応が利用できる状態へ戻ること；
■酵素反応あるいは電極反応によって酸化あるいは還元された化合物が安定であること； 等の特性を有することが要求される。
さらに、酵素反応と電極反応との間の電子の移動を媒介する電子伝達物質は、作用極の測定可能範囲内の電位で酸化還元される必要がある。電極の種類や溶液条件で電極の測定可能範囲（電位窓）は異なるが、カーボン電極では通常、−１．２Ｖ〜＋１．０Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）程度が好ましい。
【０００６】これらの電子伝達物質としては、フェロセン誘導体などの有機金属化合物（英国特許８１３２０３４号公報）、フェリ（あるいはフェロ）シアン化カリウムなどの無機化合物や、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）誘導体などの有機化合物等、多数のものが知られている。例えば、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）誘導体であるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）は、亜硫酸(sulfite) イオンを硫酸(sulfate) イオンに酸化する反応を触媒するsulfite oxidase と電極との間の電子移動を媒介（メディエート）することが知られている(Anal.Chem.,1993,65,242-246)。また、ＷＯ９２／０７２６３号公報には、還元型が水に難溶性である電子伝達物質として、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、モルフォリニル基、ピペリジル基を１，４位に有するベンゼン誘導体が開示されている。
【０００７】一方、ＰＰＤ誘導体であるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＨＥＰＤ）およびＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキスカルボキシメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＣＰＤ）は、従来、感光材料・キレート剤として用いられていた（Photographic Science and Engineering 1962,vol.6,No.1,p39 ; Nature 1964,vol.204,p180 ; Z.Chem.1964,vol.4,No.11,p436 ; Z.Chem. 1964,vol.4,No.12,p463 ; An.Quin.Ser.B 1963,vol.59,No7-8,p501 ; An.Quin.Ser.B 1965,vol.61,No.5,p717 ; An.Quin.Ser.B 1965,vol.61,No.5,p723 ; An.Quin.Ser.B 1963,vol.59,No.7-8,p493 ; An.Quin.Ser.B 1986,vol.82,No.2,p133 ; Research Disclosure 1981,vol.212,p428 ）。また、ＴＨＥＰＤは、パーオキシダーゼ、ナフトール誘導体および過酸化水素の存在下で反応させると、そのラジカルとナフトール誘導体とが結合して発色物質を形成することから、パーオキシダーゼ反応の呈色試薬として利用可能であることが知られていた（欧州特許０５０４６６３号公報）。しかしながら、ＴＨＥＰＤおよびＴＣＰＤが前記の特性を有する電子伝達物質として機能することは知られていなかった。
【０００８】ところで、電子伝達物質を用いた測定方法において、従来の電子伝達物質の主たる用途は酵素電極であるので、前述のＷＯ９２／０７２６３号公報に記載されているように、水に難溶性である電子伝達物質が好まれている。なぜならば、電極に固定化あるいは不溶化された酸化還元酵素と電極との電子移動を媒介する場合において安定な電気化学的信号を得るためには、電子伝達物質を電極近傍に存在させて、試料液中に電子伝達物質が流出しないようにする必要があるからである。また、電子伝達物質が試料中のアスコルビン酸、尿酸、ヘモグロビン、酸素等の妨害物質の影響を受けやすい化合物である場合には、電子伝達物質を水に不溶性の化合物として電極内に存在させ、妨害物質との接触を避ける必要がある。しかしながら、この方法では電子伝達物質が電極内に存在しているので反応の場が限定され、電極内の電子伝達物質と有効に接触できる酵素のみが反応に関与できるに過ぎず、一般に信号強度が小さくなるという欠点を有していた。
【０００９】他方、最近では、フェリシアン化カリウムなどの水溶性の電子伝達物質を使用する使い捨て型の酵素電極分析片も開発された（特開平１−１５６６５８号公報参照）。水溶性の電子伝達物質は、ある程度電極から離れた位置の酵素と電極との間の電子移動も媒介できるため、有効な酵素分子数が増大し酵素電極の特性向上が可能となる。このような使い捨て型の酵素電極分析片では、電極の動作に必要な成分をあらかじめ分析片の中に組み込んでおき、検体試料を添加するだけで測定が可能であることが望ましい。そのため、電子伝達物質としては、水溶性が高く、かつ、乾燥が容易で乾燥状態で安定であることが望まれる。水溶性のフェロセン誘導体、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体などの金属錯体の電子伝達物質は、これらの条件をある程度満足する。しかし、これらは酵素との間で電子を交互に伝達し移動する速度が小さく、速度を早くするためには、高濃度の電子伝達物質を必要とするという欠点が残されている。また、水溶性の電子伝達物質は検体試料液中で反応するため、アスコルビン酸、尿酸、ヘモグロビン、酸素等の検体試料中の妨害物質の影響を受けやすい。そのため、妨害物質による影響の少ない化合物の開発が望まれている。
【００１０】さらに、最近、酸化還元酵素を標識剤とし、液体試料と共にマトリクス中に展開することにより、液体試料中の分析対象物と特異結合物質との特異結合反応によって標識剤の電極部からの距離分布を形成させ、電子伝達物質の拡散に律速された液体試料中の分析対象物の濃度に対応する電流値を計測し、これによって分析対象物濃度を測定する特異結合分析方法としてＭＥＤＩＡ法(Mediator Diffusion-Controlled Immunoassay) が知られている（特開平５−２６４５５２号公報（欧州特許公開公報 0 525 723 A2 号）参照）。このような測定法においても、妨害物質を含有する血液や尿などの試料液中で、酵素と電極間の安定な電子伝達を媒介できる電子伝達物質が望まれている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前記従来技術の問題点を解決することにあり、水溶性の電子伝達物質を用いた電気化学的な測定方法、例えば、酵素電極法あるいは例えばＭＥＤＩＡ法のような特異結合分析方法等の測定方法において、測定感度（応答性）が良好で、試料が血液や尿等の妨害物質を含有するものであっても、常に安定して再現性の良好な測定を行うことができ、しかも、使い捨ての用途にも好適に利用することができる電気化学的測定方法、およびこの電気化学的測定方法に電子伝達物質として用いることができる新規ｐ−フェニレンジアミン化合物を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】電子伝達物質を用いた測定方法、より詳細には、電極と少なくとも１つの酸化還元酵素とを用いて液性試料中の分析対象物を定量する測定方法において、利用される酸化還元酵素の代表例としては以下のようなものがある。
■酸化酵素（オキシダーゼ）
生体中では、酸素を電子受容体としており、フラビン補酵素、金属原子、ヘムなどを含有する。
例：グルコースオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなど。
■ヒドロペルオキシダーゼ生体中では、過酸化水素を受容体とする。
例：パーオキシダーゼ、カタラーゼなど。
■脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）
生体中では、ＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）を受容体（あるいは供与体）とする。
例：アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼなど。
【００１３】これらの酸化還元酵素のうち、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は血糖値測定用の酵素電極に使用されており、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）はＤＮＡハイブリダイゼーションや免疫測定法などの特異結合分析方法の標識酵素として使用されている。本発明者らの実験によれば、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼはいずれもハイドロキノン（ＨＱ）／ベンゾキノン（ＢＱ）を電子伝達物質とした時に緩衝液中で良好な電流応答を示し、フェロセン誘導体、無機イオン、金属錯体などの従来の電子伝達物質よりも特性が優れていた。しかし、これらの電子伝達物質は、血液・尿などが存在すると干渉を受け、再現性の良い安定な応答が認められなかった。また、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、ＴＭＰＤ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラエチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＥＰＤ）など、緩衝液中で良好な電流応答を示すＰＰＤ系の電子伝達物質も、血液・尿などの存在下では同様な干渉が認められた。
【００１４】さらに、使い捨て型の分析片を製造する目的で、ＨＱ、ＰＰＤ、ＴＭＰＤあるいはＴＥＰＤの溶液をセルロース濾紙あるいはガラス濾紙などに含浸し、電極上で乾燥（凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等）するか、あるいは乾燥後に電極上に設置して、測定時に試料によって溶解するように構成した場合には、電流応答が小さくなり、極めて悪い特性しか示さない。
【００１５】本発明者らの詳細な研究の結果、これらの現象の主要な原因として次のような問題点の存在が推定された。
■電子伝達物質となる化合物の酸化型もしくは還元型化合物の水に対する溶解度が低い。
■電子伝達物質となる化合物の蒸気圧が高く、乾燥後の安定性が悪い。
■電子伝達物質となる化合物の酸化型（あるいはラジカル状態）もしくは還元型化合物の生体試料、例えば血液・尿中での安定性が悪い。
【００１６】本発明者らは、このような問題点を解決するために鋭意検討を重ねた結果、酸化還元酵素と、この酸化還元酵素と電子の伝達が可能な電子伝達物質と、この電子伝達物質との間で電子移動可能な電極とを有する系において、電子伝達物質として下記式［Ｉ］または［II］で示される化合物またはその塩を用いることにより、生体成分の各種測定方法に好適に用いることができることを見い出した。すなわち、本発明者らは鋭意検討の結果、式［Ｉ］または式［II］の化合物またはその塩は、酵素電極法あるいは例えばＭＥＤＩＡ法のような特異結合分析方法等の電気化学的測定において、優れた電子伝達物質として作用し、しかも、水溶性が高い； 乾燥（凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等）が容易でかつ乾燥状態で安定である： 酵素との電子移動速度が大きい； 血液や尿などの検体試料中の妨害物質の影響が少ない電子伝達物質として機能する； 等の優れた特性を有することを見い出し、本発明を成すに至った。
【００１７】本発明は、少なくとも１つの酸化還元酵素を用いて液性試料中の分析対象物を測定する測定方法において、その測定系に酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を配し、前記電子伝達物質として、下記式［Ｉ］または［II］で示される化合物またはその塩を用いることを特徴とする電気化学的測定方法を提供する。
【００１８】式［Ｉ］は、下記の構造を有するものでる。
【化６】
（上記式［Ｉ］中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示す。但し、上記式［Ｉ］において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有する。また、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、同一であっても互いに異なるものであってもよい。）
【００１９】ここで上記式［Ｉ］において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を有するのが好ましく、特に、下記に示される化合物の１以上が好ましい。
【化７】
【００２０】式［II］は下記の構造を有するものである。
【化８】
（上記式［II］中、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、水素原子または、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示す。但し、上記式［II］において、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は同一であっても互いに異なるものであってもよく、このうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有するアルキル基であり、少なくとも１つが水素原子である。）
【００２１】ここで上記式［II］で、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基を有するのが好ましく、下記の化合物が例示される。
【化９】
【００２２】また、前記分析対象物が前記酸化還元酵素の基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビターであり、この基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビター量に応じて生じる酵素反応の変調を前記電極における電気化学的信号の変調として検出するのが好ましい。
【００２３】また、前記分析対象物に対する特異結合物質を少なくとも一種用い、前記酸化還元酵素を標識物質として用いた特異結合反応によって、前記分析対象物を測定するのが好ましい。
【００２４】さらに、ＭＥＤＩＡ法を利用した例、つまり前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部において信号を発する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させてから、前記マトリクスに導入する； ことにより、前記酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物との複合体、酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物と第１の特異結合物質との複合体、あるいは複合体を形成していない酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質のうち、少なくとも１つの分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出するのが好ましい。
【００２５】また、ＭＥＤＩＡ法を利用したもう１つの例、つまり前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、前記分析対象物に対する特異結合物質、あるいは特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のいずれか一方が、前記電極で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識されており、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させる； あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させてから、前記マトリクスに導入する； ことにより、前記特異結合物質と分析対象物との複合体、特異結合物質と特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質との複合体、複合体を形成していない特異結合物質、あるいは複合体を形成していない特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のうち、少なくとも１つの酸化還元酵素で標識された分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出するのが好ましい。
【００２６】以下、本発明の電気化学的測定方法および電気化学的測定方法に利用可能な新規ｐ−フェニレンジアミン化合物についてより詳細に説明する。前述のように、本発明の電気化学的測定方法（以下、測定方法とする）は、少なくとも１つの酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を測定系に有するものであり、電子伝達物質として、下記式［Ｉ］または［II］で示される化合物またはその塩を用いる。
【００２７】
【化１０】
【００２８】式［Ｉ］において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示すものであり、また、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有する。式［II］において、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、水素原子またはそれぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示すものであり、また、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有するアルキル基であり、少なくとも一つは水素原子である。
【００２９】本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、上記式［Ｉ］または式［II］で示される化合物が電気化学的測定で電子伝達物質として良好に作用することを初めて見出した。さらに、上記式［Ｉ］または式［II］で示される化合物が、Ｒ1 〜Ｒ8の少なくとも一つに、ヒドロキシル基・メルカプト基・カルボキシル基・ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれた１以上の基を有する場合には、得られる化合物は蒸気圧が低くかつ水に対する溶解性が高いため、乾燥（凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等）が容易でかつ乾燥状態で安定で、試料液の添加で直ちに溶解して良好な応答を示すことも見出した。すなわち、この化合物は、各種濾紙等の多孔質材に含浸・乾燥して、使い捨ての用途にも好適に利用可能である；血液や尿などの検体試料中の妨害を低減できる； 酵素との電子移動反応が大きく妨げられず、良好な電流応答を示す： 等の電子伝達物質に要求される特性を良好に有することも同時に見出した。従って、上記式［Ｉ］または［II］の化合物を電子伝達物質として利用する本発明の測定方法によれば、測定感度（応答性）が良好で、使い捨ての用途にも好適に利用することができ、しかも、試料が血液や尿等の妨害物質を含有するものであっても、常に安定して再現性の良好な測定を行うことが可能である。
【００３０】上記式［Ｉ］の化合物において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 としては上記要件を満たす公知の基が全て利用可能であるが、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、１，２−ジヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−（１−ヒドロキシ）プロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−（１，３−ジヒドロキシ）プロピル基、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル基、メルカプトメチル基、カルボキシメチル基、ホスホノオキシメチル基およびスルホメチル基等が好適に例示される。中でも、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−（１−ヒドロキシ）プロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基等が特に好適に例示される。また、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一であっても互いに異なるものであってもよい。
【００３１】上記式［II］の化合物において、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 としては上記要件を満たす公知の基が全て利用可能であるが、具体的には、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、１，２−ジヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−（１−ヒドロキシ）プロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−（１，３−ジヒドロキシ）プロピル基、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル基、メルカプトメチル基、カルボキシメチル基、ホスホノオキシメチル基およびスルホメチル基等が好適に例示される。中でも、水素原子、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−（１−ヒドロキシ）プロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基等が特に好適に例示される。また、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は同一であっても互いに異なるものであってもよく、少なくとも一つはアルキル基で少なくとも一つは水素原子である。
【００３２】本発明の測定方法において、このような式［Ｉ］または式［II］に示される化合物としては、具体的には、下記（１）〜（２７）の各化合物が例示される。
【００３３】
【化１１】
【００３４】
【化１２】
【００３５】
【化１３】
【００３６】中でも特に、（１）に示されるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＨＥＰＤ）、（２）に示されるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキスカルボキシメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＣＰＤ）、（３）に示されるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′，３′−ジヒドロキシプロピル）−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＤＨＰＤ）、（１１）に示されるＮ−２′−ヒドロキシエチル−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−トリエチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＨＴＥＰＤ）、（１２）に示されるＮ，Ｎ−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ′−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ）、（１３）に示されるＮ，Ｎ′−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ′−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ）等は好適に利用される。また、（２１）に示されるＮ，Ｎ′−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン（Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ）、および（２４）に示されるＮ−２′−ヒドロキシプロピル−ｐ−フェニレンジアミン（ＨＰＰＤ）も好適に利用される。
【００３７】さらに、下記式で示される化合物も好適に利用可能である。
【化１４】
【００３８】このような式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質は、公知の各種の方法で合成することができる。合成方法の一例を挙げれば、ｐ−フェニレンジアミンと、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 あるいはＲ8 に対応する化合物のハロゲン化物とをアルコール等の溶媒に溶解して、加熱下で還流して反応し、得られた目的物を濾過やカラムクロマトグラフィー等によって分離精製する方法が例示される。また、Ｒ1 〜Ｒ8 の２位の炭素にヒドロキシル基を有する化合物を合成する場合は、ｐ−フェニレンジアミンとエチレンオキサイド誘導体とを溶媒に溶解し、加熱下で還流して反応し、得られた目的物を濾過、カラムクロマトグラフィー等によって分離精製する方法が例示される。
【００３９】本発明の測定方法においては、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質の塩も好適に利用可能である。具体的には、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等が例示される。また、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質がカルボキシル基、ホスホノオキシ基、およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有する場合、そのナトリウム塩やカリウム塩等も好適に使用される。中でも特に、ＴＨＥＰＤの塩酸塩、ＴＣＰＤの塩酸塩、ＴＤＨＰＤの塩酸塩等は好適に使用される。
【００４０】式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質は、酸化還元酵素あるいは電極によって酸化還元されて、酸化状態の電子伝達物質種あるいは還元状態の電子伝達物質種となる。酸化還元酵素による酸化還元反応によって、酸化状態の電子伝達物質種が生成する場合には、生成された酸化状態の電子伝達物質種は電極反応によって還元状態に戻り、その時、電極では還元電流が信号として検出される（図１（ａ））。逆に、酸化還元酵素による酸化還元反応によって、還元状態の電子伝達物質種が生成する場合には、生成された還元状態の電子伝達物質種は電極反応によって酸化状態に戻り、その時、電極では酸化電流が信号として検出される（図１（ｂ））。すなわち、本発明の測定方法においては、図１R>１（ａ）および図１（ｂ）のどちらにおいても、酸化状態あるいは還元状態のいずれの電子伝達物質種から反応が始まっても、同等の効果がある。従って、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質としては、電子伝達物質が酸化状態の電子伝達物質種、あるいは電子伝達物質が還元状態の電子伝達物質種が含まれる。
【００４１】本発明の測定方法において、このような式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質の使用量には特に限定はなく、使用する電極、酸化還元酵素、測定対象物質の種類や量等に応じて適宜決定すればよい。
【００４２】また、本発明の測定方法において、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質は各種の状態で使用することができる。例えば、測定系に直接溶解・混合して使用する方法、乾燥あるいは凍結乾燥して測定時に溶解して使用する方法、電極のペースト中に存在させる方法、緩衝液等に溶解して濾紙に含浸して乾燥して測定時に試料溶液等で溶解する方法等が例示される。いずれの場合であっても、この電子伝達物質が有する優れた水溶性、乾燥性および乾燥後の安定性、電流応答性、さらに検体試料中の妨害物質の影響が低いこと等によって、良好な電気化学的測定を実現することが可能である。
【００４３】本発明の測定方法は、少なくとも１つの酸化還元酵素を利用した電気化学的測定を行うものである。本発明に利用される酸化還元酵素には特に限定はなく、測定目的物の種類等に応じて、各種の酸化還元酵素が選択・使用される。具体的には、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等のパーオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ビルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ジアフォラーゼ等が好適に使用される。中でも特に、血糖値測定用としてのグルコースオキシダーゼ、特異結合分析方法に用いる標識酵素としての西洋ワサビパーオキシダーゼ等は好適に使用される。また、酸化還元酵素の使用量にも特に限定はなく、使用する電極、電子伝達物質、測定対象物の種類や量等に応じて適宜決定すればよい。
【００４４】本発明の測定方法に使用される電極としては、酵素電極法や特異結合分析法などの電気化学的測定に通常使用される各種の電極が例示される。具体的には、グラッシーカーボン(glassy carbon) 電極、パイロリティックグラファイト(pyrolytic graphite)電極、カーボンペースト(carbon paste)電極、カーボンファイバー(carbon fiber)電極などのカーボン電極、白金電極、金電極、ＩＴＯ電極などの導電性透明電極、TiO2などの酸化物電極、機能性化合物で修飾された修飾電極等が例示される。本発明の測定方法においては、導電性カーボンインクを用いてスクリーン印刷等で基板上にパターン印刷された電極が、その応用性の広さから特に好適に使用される。また、電極の形状（平面電極、多孔性電極など）や大きさにも特に限定はなく、測定対象物質の種類や量、測定試料の量や特性（例えば粘度など）、測定用途や条件等に応じて適宜決定すればよい。
【００４５】基本的に、このような酸化還元酵素、電子伝達物質、および電極を有する系で行われる本発明の測定方法は、酵素電極法や特異結合分析法等の、公知の各種の電気化学的な測定に好適に利用可能である。具体的には、電流計測型の酵素センサ、免疫センサ、核酸センサなどに利用可能である。より具体的には、酵素センサを用いた血中グルコース，コレステロール，尿酸，乳酸等の測定、特異結合分析法を用いたヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ），黄体形成ホルモン（ＬＨ），ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ），エストロゲン等の各種ホルモンの測定、ＨＢｓ抗体，ＨＢｓ抗原，ＨＢｃ抗体，ＨＢｅ抗原，ＨＣＶ抗体，ＨＩＶ抗体等の各種ウイルス関連の抗原・抗体の測定、各種アレルゲンに対応する特異ＩｇＥ抗体の測定、ＡＦＰ，ＣＥＡ等の腫瘍マーカーの測定、β2 ｍ，ＣＲＰ等の各種血中蛋白，薬物，およびこれらの代謝産物の測定、ウイルスおよび腫瘍関連のポリヌクレチオド配列の測定等が利用例として好適に例示される。
【００４６】本発明の測定方法は、周知の酵素電極法や特異結合分析法等の各種の電気化学的な測定を、通常の測定と同様の方法で実施することができる。本発明の測定方法は、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質の有する優れた水溶性、乾燥性および乾燥安定性等を生かして、セルロース濾紙やガラス濾紙等に電子伝達物質を含浸させて乾燥させた分析片を作製し、この電子伝達物質を測定時に試料溶液によって溶解してマトリクス内を拡散移動させ、信号である電子を伝達する物質として作用させるような、使い捨ての測定装置には特に好適に利用される。
【００４７】図２に、本発明の測定方法を実施する例として、ＭＥＤＩＡ法を利用した、使い捨てタイプの特異結合反応測定装置を示す。なお、この測定装置における分析方法の詳細な説明は、特開平５−２６４５５２号公報に詳述されている。
【００４８】図２に示される測定装置は、上から、上部カバー１０、フィルター１２、標識抗体含浸部１４、電子伝達物質含浸部１６、連通部材１８、電極部２０、マトリクス２２、吸収部２４、および下部基板２６を有して構成され、図３に示されるように、各部材が上記順番で積み重ねられて組み合わされて構成される。また、フィルター１２、標識抗体含浸部１４、電子伝達物質含浸部１６および連通部材１８によって試料導入部３８が構成される。なお、本発明の測定方法を利用する測定装置は、これらの各部材を全て有するものに限定はされず、前記特開平５−２６４５５２号公報に記載される構成も各種利用可能である。
【００４９】上部カバー１０は、アクリル、ポリ塩化ビニル、ガラス、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、エポキシ樹脂等の各種の合成樹脂によって成形されるものであり、中心部分には試料を注入するための試料導入口１０ａが形成される。フィルター１２は、試料に含まれる測定に不要な固形物（妨害物質）を除去すると共に、試料の導入が均一に行えるようにするものであって、通常、織布や不織布等によって形成される。
【００５０】標識抗体含浸部１４は、ガラス繊維濾紙，セルロース繊維濾紙，不織布等に、本発明の構成要素の一つである酸化還元酵素標識抗体を含浸・乾燥してなるものである。つまり、試料が標識抗体含浸部１４を通過することにより、酸化還元酵素標識抗体が溶出して分析対象物と酸化還元酵素標識抗体とが混合され、あるいは反応が開始される。
【００５１】電子伝達物質含浸部１６は、ガラス繊維濾紙，セルロース繊維濾紙，不織布等に本発明の特徴的な要素である電子伝達物質を含浸・乾燥してなるものである。試料が電子伝達物質含浸部１６を通過することにより、電子伝達物質が溶出して試料と混合される。なお、本発明の測定方法においては、電子伝達物質として式［Ｉ］または式［II］で示される化合物を使用するので、電子伝達物質の乾燥性および乾燥安定性が良好で、しかも迅速に溶出して混合するのは前述のとおりである。図示例の装置においては、好ましい態様として、電子伝達物質含浸部１６の上面中心部分には水が通過不可能なシール部１６ａが形成される。このシール部１６ａを有することにより、標識抗体含浸部１４までは鉛直方向であった試料の流れを水平方向に変更することができ、試料の流れ時間を長くして反応時間を十分に確保することが可能になると共に、混合効果によって反応効率が上り、より正確な測定を行うことができる。シール部１６ａの形成材料および形成方法には特に限定はなく、塩化ビニルやセルロースアセテート等の各種の水不透性材料を、接着剤、例えばアクリル系接着剤等の手段を用いて電子伝達物質含浸部１６の中心部分に貼着すればよい。
【００５２】図示例の測定装置においては、酸化還元酵素標識抗体を保持する標識抗体含浸部１４、および電子伝達物質を保持する電子伝達物質含浸部１６が別々に形成されるものであるが、本発明に利用される測定装置は、この構成以外にも、酸化還元酵素標識抗体と電子伝達物質の両者を保持する試薬含浸部とする構成であってもよい。また、図示例の測定装置においては、電子伝達物質は電子伝達物質含浸部１６に保持されているが、前述のように、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質は、良好な乾燥性および水溶性を有するので、これ以外、例えば、後述するマトリクス２２や吸収部２４等に保持されていても、良好な測定が可能である。
【００５３】連通部材１８は、電子伝達物質含浸部１６を通過した試料等を電極部２０の所定位置を通過させてマトリクス２２に導入するものであり、ガラス繊維濾紙やセルロース繊維濾紙等より形成される。このような連通部材１８は、後述する電極部２０の貫通孔３０に挿入されて配置される。
【００５４】電極部２０は、本発明の構成要素の一つである測定用の電極を有するものであり、図示例の装置においては、図２および図４に示されるように、絶縁性の基板２８に円形の貫通孔３０を形成し、基板２８上面の貫通孔３０周囲に参照極（対極）３２およびその端子３２ａが、基板２８下面の貫通孔３０周囲に検出用電極である作用極３４およびその端子３４ａが、それぞれ形成される。測定時には両極の端子は外部の測定器に接続されている。また、参照極３２および作用極３４以外の電子伝達物質含浸部１６および後述するマトリクス２２が接触する部分には、電極部２０の基板２８の上下面共に、図４に斜線で示されるように絶縁層３６が形成されている。
【００５５】検出用電極である作用極３４は前述の各種の材料によって形成される。参照極３２は、銀／塩化銀電極等である。基板２８は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ポリ塩化ビニル、ポリイミド、ポリエステル等の公知の各種の絶縁性材料で形成される。絶縁層３６は、アクリル系樹脂、ポリエステル等の公知の各種の絶縁性インク材料で形成される。なお、図示例の装置において、作用極３４、参照極３２および絶縁層３６は、共に、スクリーン印刷やドクターナイフ等の厚膜形成技術、スパッタリングやＣＶＤ等の薄膜形成技術等の公知の膜形成技術によって形成すればよい。
【００５６】マトリクス２２は、液体試料中の分析対象物と酸化還元酵素標識抗体との特異結合で生じた酵素標識体を分布させる場であり、この標識体の作用極３４からの距離分布が、前述の電子伝達物質を介して電流値として測定される。このようなマトリクス２２は、例えば、メンブレン等の多孔質膜に、特異結合反応のための抗体や抗原、核酸等を、不溶化して保持・乾燥してなるものである。試料がこのマトリクス２２に流入し、不溶化抗体と分析対象物との間の特異結合反応がおこり、酵素標識体の分布が変化すると、酵素反応によって生成する電子伝達物質種が拡散移動し、作用極３４によって反応に対応した電気化学的変調として検出される。また、余剰の試料は、このマトリクス２２を通過して後述の吸収部２４で吸収される。
【００５７】吸収部２４は、前述のようにマトリクス２２を通過した余剰の試料を吸収するもので、例えば、クロマトグラフ濾紙などのセルロース濾紙、高吸水性ポリマーで形成される。なお、図示例の装置においては、この吸収部２４は酵素反応の基質含浸部としても機能し、上述の材料に過酸化水素−尿素乾燥体等の酵素反応基質を保持してなるものである。図示例の装置においては、好ましい態様として吸収部２４の上面中心部分に水が通過不可能なシール部２４ａが形成される。前述のシール部１６ａと同様、シール部２４ａを有することにより、鉛直方向であった試料の流れを水平方向に変更することができ、試料の流れ時間を長くして、特異結合反応の効率を向上させると共に、マトリクス内の標識体分布が明瞭になり、より正確な測定を実現することができる。なお、シール部２４ａは、前述のシール部１６ａと同様に形成される。
【００５８】図示例の測定装置は、これらの各部材を図２R>２および図３に示される順序で、下部基板２６上に積層して構成される。下部基板２６は、上部カバー１０と同様、アクリル等の各種の樹脂材料によって形成される。
【００５９】このような測定装置においては、試料は上部カバー１０に形成される試料導入口１０ａより注入される。試料導入口１０ａより注入された試料は、フィルター１２を通過して異物等を除去され、標識抗体含浸部１４に流入する。標識抗体含浸部１４においては、試料が流入することによって乾燥・保持された酸化還元酵素標識抗体が溶出して試料と混合され、あるいは分析対象物と酸化還元酵素標識抗体との特異結合反応が開始される。
【００６０】試料は、次いで、電子伝達物質含浸部１６に流入する。前述のように、電子伝達物質含浸部１６には電子伝達物質が乾燥・保持されているので、試料の流入によって、電子伝達物質が溶出して試料と混合される。なお、図示例の装置においては、電子伝達物質含浸部１６の上面にはシール部１６ａが形成されるので、試料の流れ方向が鉛直方向から水平方向に変更され、十分な反応時間が確保できるのは前述のとおりである。
【００６１】電子伝達物質含浸部１６を通過した試料は、連通部材１８を通って電極部２０の貫通孔３０を通過して、マトリクス２２に流入する。マトリクス２２に試料が流入すると、液体試料中の分析対象物と不溶化抗体との特異結合によってマトリクス２２内における酸化還元酵素標識体の分布が決まり、酸化還元酵素標識体の酵素反応によって生成する電極反応可能な電子伝達物質種が拡散によって作用極３４に到達する。すなわち、分析対象物の作用極３４半径方向の分布が酵素反応に対応した電気化学的変調として作用極３４で検出される。余剰の試料は、マトリクス２２を通過して吸収部２４で吸収される。
【００６２】従って、上記測定装置によれば、マトリクス２２内における分析対象物と不溶化抗体との特異結合反応の結果、試料に含有される分析対象物の量に応じて前記特異結合反応によって生じる酵素標識体のマトリクス２２内における分布が決り、この酵素標識体によって生成される電子伝達物質種の拡散移動を介して作用極３４で電子の授受が行われ、電極反応による電子移動が電気化学的変調として検出される。その結果、マトリクス２２の半径方向の特異結合反応の分布を測定して、試料中の分析対象物を測定できる。
【００６３】以上、本発明のＭＥＤＩＡ法を利用した電気化学的測定方法および新規ｐ−フェニレンジアミン化合物について詳細に説明したが、本発明は上述の例に限定はされず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の変更および改良を行ってもよいのはもちろんである。
【００６４】
【実施例】以下、本発明の具体的実施例を挙げ、本発明についてより詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されない。
【００６５】＜合成例１＞（従来技術に対応）
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラエチル−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩（ＴＥＰＤ・２ＨＣｌ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（１ｇ）、ヨウ化エチル（１０．７ｇ）、および炭酸ナトリウム（４．４ｇ）をメタノ−ル（１０mL）に溶解し、加熱下で１晩還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、減圧下で溶媒を留去し、残分にアセトンを加え不溶物を濾別した。得られた濾液から減圧下で溶媒を留去し、残分を酢酸エチル−エ−テル混合液で再結晶し、４級アンモニウム塩６．８ｇを得た。
【００６６】次いで、この４級アンモニウム塩６．８ｇと、チオ硫酸ナトリウム５水和物１２．５ｇとをジメチルホルムアミド５０mLに溶解し、加熱下で１晩還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、蒸留水を加えてトルエンで抽出を行い、抽出層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去しＴＥＰＤを１．０ｇ得た。さらに、このＴＥＰＤにエタノ−ル１０mLを加え、４Ｎ塩酸／酢酸エチル５mLを氷冷下で滴下し、さらに、５℃で１時間攪拌した。生じた沈殿を濾過し、得られた沈殿をエタノ−ルおよびエ−テルで洗浄し、ＴＥＰＤ・２ＨＣｌを１．３ｇ得た。
【００６７】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲ（赤外吸光分析）およびＭＳ（マススペクトル）での分析結果より、目的とするＴＥＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ １．２（１２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Hz） ３．７（８Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Hz） ７．９（４Ｈ，Ｓ）
ＩＲ(cm-1)：７１５，８４０，１０２０，１２７６，１５１６，２４２０ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２２１
【００６８】＜合成例２＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキスカルボキシメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＣＰＤ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（１ｇ）、クロロ酢酸（３．５ｇ）、水酸化ナトリウム（３．１ｇ）およびヨウ化カリウム（４６０mg）を蒸留水（４６mL）に溶解し、加熱下で１時間還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、濃塩酸３．７mLを氷冷下で滴下し、生じた沈殿を濾過した。沈殿をメタノール−エタノール混合液で再結晶して、ＴＣＰＤを７００mg得た。
【００６９】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＴＣＰＤであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ ３．９（８Ｈ，Ｓ） ６．３（４Ｈ，Ｓ） １１．２（４Ｈ，Ｓ）
ＩＲ（cm-1）：７００，８２０，１０３０，１５１４，１７２０，２７００，３３００ＭＳ：Ｍ+ ＋１ ３４１
【００７０】＜合成例３＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩（ＴＨＥＰＤ・２ＨＣｌ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（１ｇ）、２−クロロエタノール（３．０ｇ）、および水酸化ナトリウム（１．５ｇ）を蒸留水６mLに溶解し、加熱下に２時間還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、減圧下で溶媒を留去し、残分にエタノールを加え不溶物を濾別した。得られた濾液から、減圧下で溶媒を留去し、残分をクロロホルム−メタノール混合液を溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ＴＨＥＰＤを１．５ｇ得た。
【００７１】次いで、このＴＨＥＰＤ１．５ｇをエタノール１０mLに溶解し、この溶液に４Ｎ塩酸／酢酸エチル５mLを氷冷下で滴下し、さらに５℃で１時間攪拌した。生じた沈殿を濾過し、得られた沈殿をエタノールで洗浄し、ＴＨＥＰＤ・２ＨＣｌを１．１ｇ得た。
【００７２】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＴＨＥＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ ３．５（１６Ｈ，ｂｒＳ） ７．０（４Ｈ，ｍ） ７．１（４Ｈ，Ｓ）
ＩＲ（cm-1）：７２０，８９０，１０２０，１２１０，１３９０，１５００，２７００，３３００ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２８５
【００７３】＜合成例４＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′，３′−ジヒドロキシプロピル）−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩（ＴＤＨＰＤ・２ＨＣｌ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（１．０ｇ）、３−クロロ−１，２−プロパンジオール（４．６ｇ）および水酸化ナトリウム（１．６ｇ）を蒸留水３０mLに溶解し、加熱下で２時間還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、減圧下で溶媒を留去し、残分にエタノールを加え不溶物を濾別した。減圧下において得られた濾液から溶媒を留去し、残分をクロロホルム−メタノールを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ＴＤＨＰＤを１．１ｇ得た。
【００７４】次いで、このＴＤＨＰＤ１．１ｇをエタノール１０mLに溶解し、この溶液に４Ｎ塩酸／酢酸エチル５mLを氷冷下で滴下し、さらに５℃で１時間攪拌した。次いで生じた沈殿を濾過し、得られた沈殿をエタノールで洗浄し、ＴＤＨＰＤ・２ＨＣｌを８２０mg得た。
【００７５】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＴＤＨＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ ３．７（２０Ｈ，ｍ） ７．１（４Ｈ，Ｓ）
ＩＲ（cm-1）：７２０，８７０，１０４０，１２６０，１３７０，１５２０，３３００ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ４０５
【００７６】＜合成例５＞（本発明に対応）
Ｎ−２′−ヒドロキシエチル−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−トリエチル−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩（ＨＴＥＰＤ・２ＨＣｌ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（５ｇ）のメタノール溶液（１００mL）に炭酸カリウム（１２．８ｇ）を加え、この溶液にヨウ化エチル（１４．４ｇ）を室温にて１０分で滴下した。反応液を５０℃で撹拌し、原料の消失を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で確認後、減圧濃縮を行なった。次いで、濃縮物をｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１に溶解し、析出した結晶を濾別し、濾液を減圧濃縮した。ついで、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製し、Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−トリエチル−ｐ−フェニレンジアミン１．５ｇを得た。
【００７７】次いで、Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−トリエチル−ｐ−フェニレンジアミン１．５ｇをｎ−ブタノール（２０mL）に溶解し、水酸化ナトリウム（２．２ｇ）を添加した溶液に２−クロロエタノール（４．４ｇ）を室温にて５分で滴下し、１時間還流した。薄層クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で原料の消失を確認した後、反応液を室温まで冷却し、析出した結晶を濾別した。その後残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製しＨＴＥＰＤを得た。次いで、ＨＴＥＰＤをエタノール１５mLに溶解し、氷冷下にて４Ｎ塩酸／酢酸エチル（２．４mL）を滴下し、生じた析出結晶をエタノールにて洗浄しＨＴＥＰＤ・２ＨＣｌを１．０ｇ得た。
【００７８】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＨＴＥＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ １．１（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ） ３．５（１０Ｈ，ｍ）
７．４（４Ｈ，ｍ）
ＩＲ（cm-1）：７００，８３０，１０６０，１３７０，１４５０，１５００，２３５０，２９００，３３５０ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２３７
【００７９】＜合成例６＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−Ｎ′，Ｎ′−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン・２塩酸塩（Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌ）の合成Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（５ｇ）のｎ−ブタノール溶液（３０mL）に、水酸化ナトリウム３．７ｇを加え、さらに２−クロロエタノール（７．３ｇ）を室温にて１０分で滴下した。この溶液を４時間還流し、原料の消失を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で確認後、室温まで冷却した。析出結晶を濾別して濾液を減圧濃縮し、その残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）にて精製しＮ，Ｎ−ＢＨＤＰＤを得た。
【００８０】次いで、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤをエタノール（２０mL）に溶解し、氷冷下にて４Ｎ塩酸／酢酸エチル（２．７４mL）を滴下し、生じた析出結晶をエタノールにて洗浄しＮ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌを１．２２ｇ得た。
【００８１】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＮ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ １．０（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ） ３．５（１２Ｈ，ｍ）
６．７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ） ７．５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
ＩＲ（cm-1）：７００，８３０，１０５０，１３８０，１４５０，１５００，２４８０，２９００，３３００ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２５３
【００８２】＜合成例７＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ′−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン（Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（５ｇ）のエタノール溶液（１００mL）に水酸化ナトリウム４．４ｇを加え、５５℃に加温した。さらに、この溶液に２−クロロエタノール８．９ｇを１０分で滴下した。１晩還流し、原料の消失を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で確認後、室温まで冷却した。析出結晶を濾別し、その濾液を減圧濃縮した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）にて精製しＮ，Ｎ′−ＢＨＰＤ５．０ｇを得た。
【００８３】＜合成例８＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ′−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ′−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン・２塩酸塩（Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌ）の合成Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ４．５ｇのエタノール溶液（１００mL）に炭酸カリウム８．９ｇおよびヨウ化エチル９．５ｇを加え、１晩還流した。原料の消失を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５：１）で確認後室温まで冷却した。析出結晶を濾別し、その濾液を減圧濃縮した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル１００％）にて精製し、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤを２３３ｍｇ得た。次いで、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤをエタノール５mLに溶解後、氷冷下にて１０％塩化水素／メタノールを滴下し、生じた析出結晶を濾別し、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌを２６６ｍｇ得た。
【００８４】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＮ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ １．１（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ） ３．５（１２Ｈ，ｍ）
７．４（４Ｈ，ｓ）
ＩＲ（cm-1）：６７０，８３０，１０７０，１５００，２５００，２９００，３３５０ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２５３
【００８５】＜合成例９＞（本発明に対応）
ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応によるＮ原子上の各置換体の合成ｐ−フェニレンジアミン（５ｇ）のメタノール溶液（１００mL）に水酸化ナトリウム１．３ｇを加え、さらにプロピレンオキサイド１．１ｇを滴下した。３０℃にて１晩撹拌した後、減圧濃縮を行った。その後、濃縮物にクロロホルムを添加し、クロロホルム抽出物７ｇを得た。次いで、溶離液としてアセトニトリル：５０ｍＭ酢酸アンモニウム＝１５．６：８４．４を用い、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ、２０ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）にて、クロロホルム抽出物のＨＰＬＣ分取を行った。この際、流速は１５mL／ｍｉｎとし、２５４ｎｍを検出波長とした。この分取により、ｐ−フェニレンジアミンＮ原子上の１、２および３置換体を各々分離した。下記に示す 1ＨＮＭＲおよびＭＳによる分析結果より、目的物であることが確認された。なお、各置換数は、質量スペクトルにて決定した。
１置換体 1ＨＮＭＲ：δ １．１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ） ２．８（２Ｈ，ｍ） ３．８（１Ｈ，ｍ） ４．９（３Ｈ，ｂｒｓ） ６．４（４Ｈ，ｍ）
ＭＳ：１６７（Ｍ＋１）
２置換体 ＭＳ：２２５（Ｍ＋１）
３置換体 ＭＳ：２８３（Ｍ＋１）
また、 1ＨＮＭＲおよびＭＳによる分析結果より、１置換体はＮ−２′−ヒドロキシプロピル−ｐ−フェニレンジアミン（ＨＰＰＤ）であることが確認された。
【００８６】＜実験例１＞ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）、ＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの蒸気圧測定ＰＰＤ（和光純薬社製）、ＴＭＰＤ（東京化成社製）および前述の合成例１〜４の途中で得られたＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤについて蒸気圧を測定した。一定温度の固体試料（ＰＰＤ，ＴＭＰＤ，ＴＥＰＤ，ＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤ）と接触するようにキャリアガス（窒素ガス）を流し、試料の蒸気を飽和させて蒸気密度（蒸発量／体積）を測定し、蒸気が理想気体の法則に従うと仮定して各化合物の蒸気圧を求めた（気体流通法）。試料の蒸発速度（減量速度）は電気天秤を、またキャリアガス流量は流量計を用いて測定し、試料の蒸気密度を求めた。蒸気密度から蒸気圧を求めるために、次式を用いた。
Ｐ＝（ｋ／ｖ）Ｖπ／Ｍ上記式において、Ｐ：蒸気圧[mmHg]、ｋ：蒸発速度[mg/min]、ｖ：キャリアガス流量[mL/min]、ｋ／ｖ：蒸気密度[mg/mL] 、Ｍ：試料の分子量、π：系の圧力[mmHg]、Ｖ：キャリアガスのモル体積[L/mol] である。
【００８７】図５に、各温度におけるＴＥＰＤおよびＴＨＥＰＤの蒸気圧曲線を１例として示した。また、２５℃における各化合物の蒸気圧を図２４に示した。図５および図２４に示されるように、ＰＰＤ，ＴＭＰＤおよびＴＥＰＤに比してＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの蒸気圧は低く、具体的には、２５℃でのＴＥＰＤ，ＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの蒸気圧はそれぞれ４．２×１０-4mmHg、８．７×１０-9mmHg、１．３×１０-6mmHgおよび１．０×１０-9mmHgでありＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの蒸気圧はＴＥＰＤの蒸気圧に比べ、それぞれ、約１／５００００、約１／３００、約１／４２００００である。この結果より、ＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤはＰＰＤ，ＴＭＰＤおよびＴＥＰＤに比べ、乾燥（凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等）性および乾燥体の安定性に優れることが解る。
【００８８】＜実験例２＞ＴＥＰＤ・２ＨＣｌ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ・２ＨＣｌ、ＴＤＨＰＤ・２ＨＣｌ、ＨＴＥＰＤ・２ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体（以下、２ＨＣｌは省略）のサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）の測定前述の合成例１〜９で作製したＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体を、ｐＨ６．０の０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、５．０×１０-4Ｍの溶液を調製し、これらのＣＶを測定した。作用電極としてグラッシーカーボン電極（BIOANALYTICAL SYSTEMS 社製、ＭＦ２０１２）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極（BIOANALYTICAL SYSTEMS 社製、ＭＦ２０２０）、対向電極として白金線（BIOANALYTICAL SYSTEMS 社製）を、それぞれ用い、これらをポテンショスタットＨＡ−１５０（北斗電工社製）に接続した。さらに電極電位設定のためのファンクションジェネレーターＨＢ−１０４（北斗電工社製）および記録計を接続した。記録計からＧＰＩＢラインを通じてコンピュータへ接続し、計測およびデータ処理を行った。ＣＶ測定は、初期電位−５００mV（vs Ag/AgCl、以下同様）〜反転電位＋８００mV、あるいは初期電位−２００mV〜反転電位＋３００mVに設定し、いずれも５０mV/secの速度で電位掃引を行った。
【００８９】ＴＥＰＤの−５００mV〜＋８００mVの結果を図６に、−２００mV〜＋３００mVの結果を図７に、以下同様に、ＴＣＰＤの結果を図８および図９に、ＴＨＥＰＤの結果を図１０および図１１に、ＴＤＨＰＤの結果を図１２および図１３に、それぞれ示す。また、ＨＴＥＰＤの結果を図２５および図２６に、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの結果を図２７および図２８に、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの結果を図２９および図３０に、ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の結果を図３１および図３２に、同じく２置換体の結果を図３３および図３４に、同じく３置換体の結果を図３５および図３６に、それぞれ示す。
【００９０】図８〜図１３および図２５〜図３６のＣＶに示される様に、本発明の測定方法に使用されるＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体も、前述のＴＥＰＤ（図６および図７R>７）と同様に電極上で酸化還元可能な物質であることが示唆され、電気化学的な測定方法において、電子伝達物質として好適に利用可能であることが解る。さらに、図９R>９、図１１、図１３、図２６、図２８、図３０、図３２R>２、図３４および図３６に示されるように、これらの物質によれば、−２００mVから＋３００mVの電位幅で可逆的な酸化還元反応が行われていると考えられる。
【００９１】＜実験例３＞ＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の電子伝達活性の測定１グルコ−スオキシダ−ゼ（ＧＯＤ、ベ−リンガ−マンハイム社製）を、ｐＨ６．０の０．１ＭＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、０Ｍおよび４．０×１０-4Ｍの溶液を調製した。また、グルコース（純正化学社製）を同様の緩衝液に溶解し、１．５Ｍの溶液を調製した。さらに、合成例１〜９で合成したＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の各化合物を同様の緩衝液に溶解し、５．０×１０-3Ｍの溶液を調製した。これらの各溶液を、測定直前に下記の量比でｐＨ６．０の０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液中で混合し、下記に示される組成Ａおよび組成Ｂで示される溶液を作製し、ＧＯＤ存在下（組成Ａ）あるいは非存在下（組成Ｂ）での電流値を連続的に測定した。
【００９２】
組成Ａ────────────────────────────────── ＧＯＤ ４．０×１０-4Ｍ １００μＬ グルコ−ス １．５Ｍ １．０mL 化合物溶液 ５．０×１０-3Ｍ １．０mL ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ ７．９mL────────────────────────────────── 組成Ｂ────────────────────────────────── ＧＯＤ ０Ｍ １００μＬ グルコ−ス １．５Ｍ １．０mL 化合物溶液 ５．０×１０-3Ｍ １．０mL ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ ７．９mL──────────────────────────────────
【００９３】測定は、前述の実験例２と同様の装置で行い、測定時には＋３００mV（vs Ag/AgCl）の電位を作用極に印加し、ＧＯＤ存在下（組成Ａ）およびＧＯＤ非存在下（組成Ｂ）の電流値を電位印加後１０分間測定した。
【００９４】ＴＥＰＤの測定結果（ＧＯＤ−グルコ−ス−ＴＥＰＤ）を図１４に、ＴＣＰＤの測定結果（ＧＯＤ−グルコ−ス−ＴＣＰＤ）を図１５に、ＴＨＥＰＤの測定結果（ＧＯＤ−グルコ−ス−ＴＨＥＤＰ）を図１６に、ＴＤＨＰＤの測定結果（ＧＯＤ−グルコ−ス−ＴＤＨＰＤ）を図１７に、それぞれ示す。また、ＨＴＥＰＤの測定結果を図３７に、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの測定結果を図３８に、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの測定結果を図３９に、ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の測定結果を図４０に、同じく２置換体の測定結果を図４１に、同じく３置換体の測定結果を図４２に、それぞれ示す。
【００９５】図１４〜図１７および図３７〜図４２に示されるように、いずれの物質による測定でも、ＧＯＤを含有する場合（組成Ａ）には、含有しない場合（組成Ｂ）に比して酸化電流値が増大するので、本発明例のＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体は共に、従来例のＴＥＰＤと同様、ＧＯＤと電極間の可逆的な電子伝達物質としての機能を有することが明らかである。また、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤも、ＧＯＤと電極間の可逆的な電子伝達物質としての機能を有していた。
【００９６】＜実験例４＞ＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の電子伝達活性の測定２西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ、東洋紡社製）を、ｐＨ６．０の０．１ＭＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、０Ｍおよび５．０×１０-7Ｍの溶液を調製した。また、過酸化水素（和光純薬社製）を同様の緩衝液に溶解し、１．０×１０-1Ｍの溶液を調製した。さらに、合成例１〜９で合成したＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の各化合物を同様の緩衝液に溶解し、５．０×１０-3Ｍの溶液を調製した。これらの各溶液を、測定直前に下記の量比でｐＨ６．０の０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液中で混合し、下記に示される組成Ａおよび組成Ｂで示される溶液を作製し、ＨＲＰＯ存在下（組成Ａ）あるいは非存在下（組成Ｂ）での電流値を連続的に測定した。
【００９７】
────────────────────────────────── ＨＲＰＯ ５．０×１０-7Ｍ １００μＬ 過酸化水素 １．０×１０-1Ｍ １００μＬ 化合物溶液 ５．０×１０-3Ｍ １．０mL ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ ８．８mL────────────────────────────────── 組成Ｂ────────────────────────────────── ＨＲＰＯ ０Ｍ １００μＬ 過酸化水素 １．０×１０-1Ｍ １００μＬ 化合物溶液 ５．０×１０-3Ｍ １．０mL ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ ８．８mL──────────────────────────────────
【００９８】測定は、前述の実験例２と同様の装置で行い、測定時には、ＴＥＰＤ、ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの場合−８０mV（vs Ag/AgCl 以下同様）の電位を、ＴＣＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の場合−１５０mVの電位を、それぞれ作用極に印加し、ＨＲＰＯ存在下（組成Ａ）およびＨＲＰＯ非存在下（組成Ｂ）の電流値を電位印加後１０分間もしくは５分間測定した。
【００９９】ＴＥＰＤの測定結果（ＨＲＰＯ−過酸化水素−ＴＥＰＤ）を図１８に、ＴＣＰＤの測定結果（ＨＲＰＯ−過酸化水素−ＴＣＰＤ）を図１９に、ＴＨＥＰＤの測定結果（ＨＲＰＯ−過酸化水素−ＴＨＥＰＤ）を図２０２０に、ＴＤＨＰＤの測定結果（ＨＲＰＯ−過酸化水素−ＴＤＨＰＤ）を図２１に、それぞれ示す。また、ＨＴＥＰＤの測定結果を図４３に、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの測定結果を図４４に、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの測定結果を図４５に、ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の測定結果を図４６に、同じく２置換体の測定結果を図４７に、同じく３置換体の測定結果を図４８に、それぞれ示す。
【０１００】図１８〜図２１および図４３〜図４８に示されるように、いずれの物質もＨＲＰＯを含有する場合（組成Ａ）には、含有しない場合（組成Ｂ）に比して還元電流値が増大しており、本発明例のＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体は共に、従来例のＴＥＰＤと同様、ＨＲＰＯと電極間の可逆的な電子伝達物質としての機能を有することが明らかである。また、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤも、ＨＲＰＯと電極間の可逆的な電子伝達物質としての機能を有していた。
【０１０１】＜実施例＞図２および図３に示される特異結合分析装置を作製し、それを用いて試料中のｈＣＧ濃度を測定した。まず、特異結合分析装置を作製するために、下記の各部材を作製した。
【０１０２】■ 抗ｈＣＧ抗体と西洋ワサビパーオキシダーゼとの結合体（標識抗体）の作製ｈＣＧを認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ８１（持田製薬社製）を１００mM塩化ナトリウム−１mMＥＤＴＡ−６０mMトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０ ＴＥＡ緩衝液）に８．３mg/mL 濃度となるように溶解し、窒素ガス置換したＴＥＡ緩衝液に十分に透析した。この抗体溶液１．１mLに対して、ＴＥＡ緩衝液中に調製した５０mMの２−イミノチオラン塩酸塩（Pierce社製）溶液６１μＬを添加し、撹拌後、窒素ガス雰囲気下、４℃で１．５時間静置した。その後、窒素ガス置換した１００mM塩化ナトリウム−１mMＥＤＴＡ−１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０ ＥＤＴＡ−ＰＢ）で十分に透析し、ＳＨ基が導入された抗ｈＣＧ抗体ＨＭ８１を得た。
【０１０３】一方、１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２０mg/mL 濃度に調製された西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ，東洋紡社製）溶液５００μＬを３０℃でゆっくり撹拌しながら、５０mMのスルホＳＭＣＣ（Pierce社製）５００μＬを添加して２０分間反応させた。反応後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−ＰＢで平衡化した Sephadex Ｇ−２５（ファルマシア社製）カラム（２．６φ×１５ｃｍ）を通して未反応のスルホＳＭＣＣを除去し、濃縮器CENTRIPREP−１０（Amicon社製）を用いて濃縮し、マレイミド化ＨＲＰＯを得た。得られたマレイミド化ＨＲＰＯの濃度は、４０３nmの吸光度から求めた。
【０１０４】１．２５×１０-8モルもしくは１．５６×１０-8モルのマレイミド化ＨＲＰＯ溶液に、それぞれ３倍モル量もしくは１／３倍モル量のＳＨ基導入抗ｈＣＧ抗体ＨＭ８１を添加混合後、窒素ガス雰囲気下、４℃で１２時間反応させた。次いで、それぞれ５０mMのシステアミン溶液５０μＬを添加し、窒素ガス雰囲気下、４℃にて６０分間反応させ、その後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−ＰＢで平衡化した ULTROGEL ＡｃＡ３４（ＩＢＦ Biotechnics社製）カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。２８０nmおよび４０３nmにおける吸光度測定を、ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出分画について行い、遊離の酵素を含まないＨＭ８１とＨＲＰＯとの結合体の分画を集めて濃縮した。得られた濃縮品（以下、ＨＲＰＯ−ＨＭ８１とする）は、Phast システムによる電気泳動（ファルマシア社製）で分子量を確認後、吸光度と酵素活性から含有される抗体および酵素量を決定し、後記する測定において酸化還元酵素標識抗体として用いた。
【０１０５】■ 西洋ワサビパーオキシターゼ標識抗ｈＣＧ抗体（ＨＲＰＯ−ＨＭ８１）を含浸させた乾燥体の作製前記■で作製したＨＲＰＯ−ＨＭ８１を５％正常ウサギ血清（ＮＲＳ）−１０％サッカロ−ス／ｐＨ６．０の０．１Ｍ ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液で希釈し、パーオキシターゼ活性０．６３U/mL溶液を調製した。次いで、ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社製）からパンチングして作製した直径１２mmの円形濾紙に上記溶液を１４０μＬ点着し凍結乾燥して、標識抗体含浸部１４となるＨＲＰＯ−ＨＭ８１の乾燥体を作製した。
【０１０６】■ ＴＨＥＰＤを含浸させた乾燥体の作製（本発明例に対応）
前述の合成例３で合成したＴＨＥＰＤをｐＨ ６．０の０．１Ｍ ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液に溶解し、５．０mMの溶液を調製した。次いで、ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社製）からパンチングして作製した直径１２mmの円形濾紙に上記溶液を１４０μＬ点着し、凍結乾燥を行い、本発明に対応する電子伝達物質含浸部１６となるＴＨＥＰＤの乾燥体を作製した。
【０１０７】■ ＴＥＰＤを含浸させた乾燥体の作製（比較例に対応）
前述の合成例１で合成したＴＥＰＤをｐＨ６．０の１Ｍ ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液に溶解し、５．０mMの溶液を調製した。次いで、ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社製）からパンチングして作製した直径１２mmの円形濾紙に上記溶液を１４０μＬ点着し、凍結乾燥を行い、電子伝達物質含浸部１６となるＴＥＰＤの乾燥体を作製した。
【０１０８】■ 過酸化水素を含浸させた乾燥体の作製過酸化水素（和光純薬工業社製）および尿素（和光純薬工業社製）を蒸留水に溶解し、０．５Ｍ過酸化水素−０．５Ｍ尿素溶液を調製した。次いで、クロマトグラフ濾紙（１７Chr 、Whatman 社製）からパンチングして作製した直径１２mmの円形濾紙に上記溶液を１２０μＬ点着し、凍結乾燥を行い、吸収部２４となる過酸化水素−尿素の乾燥体を作製した。
【０１０９】■ 抗ｈＣＧ抗体不溶化多孔性セルロース混合エステル膜の作製ウシγグロブリン（製品コードＧ７５１６、シグマ社製）の１．０％(W/V) ＰＢＳ溶液２００mLを入れたビーカー中に、ポアサイズ８．０μｍ、直径１３mmの円形の酢酸セルロース／硝酸セルロース混合エステル多孔性膜（カタログ番号ＳＣＷＰ０１３００、日本ミリポア工業社製）２００枚を入れ、ゆっくり撹拌しながら６０℃で２時間加熱した。上澄みを除去し、残液を吸引除去した後、洗浄液として十分量の０．０７６Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ６．４（ＰＢＳ）を加えてよく撹拌し、再度内容液を除去して洗浄を行った。ＰＢＳの洗浄をさらに２回行い、その後、蒸留水での洗浄を７回繰り返した。洗浄終了後、１．０％グルタルアルデヒド水溶液２００mLを添加し、ゆっくり撹拌しながら２５℃で３時間反応させた。反応後、蒸留水で１０回洗浄を行い、ガラス板の上に多孔性膜を１枚ずつ並べて乾燥した。
【０１１０】ｈＣＧを認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ２１（持田製薬社製）を０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム−０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶解して、濃度を１．０mg/mL に調製した。この溶液を、ガラス板上で乾燥させた多孔性膜（１３mmφ）当たり２５μＬを中央部分から浸潤させた。室温で１時間反応させた後、多孔性膜を０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液２００mLに移し、振とう撹拌しながら、４℃で２日間ブロッキング反応した。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で３回洗浄し、さらにＰＢＳで７回洗浄し、乾燥して、マトリクス２２となる抗ｈＣＧ抗体（ＨＭ２１）不溶化多孔性セルロース混合エステル膜を得た。
【０１１１】■ 検出部（電極）２０の作製長さ５０mm、幅２０mm、厚さ０．２５mmの透明ＰＥＴフィルムの裏側および表側に、図４に示されるように、導電性カーボンインク（４００−ＣＴ、アサヒ化研社製）でスクリーン印刷した。また、表側中心部の円形部の上層に、導電性銀インク（ＬＳ４１１Ｎ、アサヒ化研社製）で参照極３２をスクリーン印刷した。さらに電極裏側および表側の絶縁層３６を絶縁インク（ＸＢ−１０１Ｇ 藤倉化成社製）でスクリーン印刷した。次いで、円形部の中央をパンチングし、直径３mmの孔を開けて貫通口３０とし、貫通口３０の表側表面および裏側表面に環状の電極が残るようにした。また、開口後、表側と裏側の電極が互いに電気的に独立していることを確認した。次に、導電性銀インクを重層スクリーン印刷した部分について、０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液中で電解反応（＋１．０Ｖ vs Ag/AgCl）を１０分間行ない、表面に塩化銀層を形成させた。露出している環状部の内、銀／塩化銀層が重層されている側を参照極３２（および対極）、カーボンのみの側を検出用の作用極３４として用いた。
【０１１２】［発明例用装置の作製］以上のようにして作製した各部材を用い、ＭＥＤＩＡ法を利用した本発明の測定方法を実施するための図２および図３に示される測定装置を作製した。すなわち、アクリル製の下部基板２６に、前記■で作製した吸収部２４を載せ、上面中央にメンディングテープ（住友スリーエム社製）からパンチングして作製した直径６mmのシールを貼り付け、シール部２４ａとした。この上部に、前記■で作製したマトリクス２２を、吸収部２４のシール部２４ａに中心位置を合わせて積層した。次いで、マトリクス２２上に、参照極３２を上面としてマトリクス２２の中心と貫通孔３０とを一致させて、前記■で作製した電極部２０を重ね、ガラス繊維濾紙（ＧＡ５５、アドバンテック東洋社製）からパンチングして作製した直径３mmの円形濾紙を、貫通口３０に嵌入して連通部材１８とした。次に、前記■で作製したＴＨＥＰＤを含浸・乾燥した電子伝達物質含浸部１６を、その中心が電極部２０の貫通口３０の中心と一致するように重積した。この電子伝達物質含浸部１６の上面中央には、メンディングテープからパンチングして作製した直径６mmのシールを貼り付け、シール部１６ａとした。その上に、前記■で作製した標識抗体含浸部１４を重積して、界面活性剤処理をしたエルタス（カタログ番号Ａ０５０７０、旭化成社製）からパンチングして作製した直径１２mmの円形部材を重積してフィルター１２とした。その上に、厚さ５mmのアクリル板によって作製した、直径６mmの試料導入口１０ａを有する上部カバー１０を、試料導入口１０ａの中心が電極部２０の貫通口３０の中心と一致するように積層して、ｈＣＧ濃度測定用の特異結合分析装置を作製した。なお、この装置においては、上部板の下面と下部支持体の上面とは、３４００μｍの間隔を維持するようにした。
【０１１３】［比較例用装置の作製］前記■で作製したＴＨＥＰＤを含浸・乾燥した電子伝達物質含浸部１６を用いないで、前記■で作製したＴＥＰＤを含浸・乾燥した電子伝達物質含浸部１６を用いた以外は、前記発明例と全く同様にしてｈＣＧ濃度測定用の特異結合分析装置を作製した。
【０１１４】［全血中でのｈＣＧ測定］前述のように作製した前記発明例および比較例のｈＣＧ濃度測定用の特異結合分析装置を、前記実験例２と同様にしてポテンショスタット等の測定装置を接続した。他方、ヘパリン添加健常男性血液にｈＣＧを添加して、ｈＣＧ ０ＩＵ／Ｌ全血（Ａ）およびｈＣＧ １０００ＩＵ／Ｌ全血（Ｂ）を調製した。前記発明例および比較例で作製した特異結合分析装置のそれぞれに付き、溶液（Ａ）および溶液（Ｂ）のいずれかを、上部カバー１０の試料導入口１０ａを通じて、試料導入部３８に２６０μＬ導入した。試料点着時から３０秒経過後に、作用極を対極・参照極に対して−１５０mVとなるように電位設定し、電流値を記録した。発明例の結果を図２２に、比較例の結果を図２３に、それぞれ示す。
【０１１５】図２２に示されるように、電子伝達物質を保持する電子伝達物質含浸部１６としてＴＨＥＰＤ乾燥体を導入した発明例にかかる特異結合分析装置ではｈＣＧ濃度に依存して電流値は大きくなった。これに対し、電子伝達物質含浸部１６としてＴＥＰＤ乾燥体を導入した比較例の特異結合分析装置では、図２３に示されるように、ｈＣＧ濃度を高めても電流値は大きくはならなかった。これは、前述の実験例１でも示されたように、ＴＥＰＤは乾燥性および乾燥安定性が悪く、さらに試料中の妨害物質の影響を受けやすく、試料中での安定性が悪いために、上記態様では測定時に良好な電子伝達物質として作用することができなかったためであると考えられる。
【０１１６】この結果から、本発明の電子伝達物質を用いた装置によって試料中のｈＣＧ濃度の定量を簡便、迅速に行え、本発明の効果が明らかとなった。
【０１１７】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明の電気化学的測定方法および新規ｐ−フェニレンジアミン化合物によれば、酵素電極法あるいは例えばＭＥＤＩＡ法のような特異結合分析方法等の測定において、測定感度（応答性）が良好で、使い捨ての用途にも好適に利用することができ、しかも、試料が血液や尿等の妨害物質を含有するものであっても、常に安定して再現性の良好な測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）および（ｂ）は、それぞれ電子伝達物質の作用を説明するための模式図である。
【図２】本発明の電気化学的測定方法を実施する（特異結合）分析装置の一例を示す概略分解斜視図である。
【図３】図２に示される（特異結合）分析装置の組み立て状態の断面を概念的に示す図である。
【図４】図２に示される（特異結合）分析装置の電極部の概略平面図である。
【図５】ＴＥＰＤおよびＴＨＥＰＤの蒸気圧を示すグラフである。
【図６】ＴＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図７】ＴＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図８】ＴＣＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図９】ＴＣＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１０】ＴＨＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１１】ＴＨＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１２】ＴＤＨＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１３】ＴＤＨＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１４】ＴＥＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図１５】ＴＣＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図１６】ＴＨＥＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図１７】ＴＤＨＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図１８】ＴＥＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図１９】ＴＣＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図２０】ＴＨＥＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図２１】ＴＤＨＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図２２】本発明の電子伝達物質を用いた実施例による測定結果を示すグラフである。
【図２３】従来の電子伝達物質を用いた測定方法による測定結果を示すグラフである。
【図２４】ＰＰＤ，ＴＭＰＤ，ＴＥＰＤ，ＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤ，ＴＤＨＰＤの２５℃における蒸気圧を示すグラフである。
【図２５】ＨＴＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図２６】ＨＴＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図２７】Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図２８】Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図２９】Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３０】Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３１】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３２】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３３】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の２置換体のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３４】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の２置換体のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３５】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の３置換体のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３６】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の３置換体のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３７】ＨＴＥＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図３８】Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図３９】Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図４０】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の電子伝達活性を示すグラフである。
【図４１】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の２置換体の電子伝達活性を示すグラフである。
【図４２】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の３置換体の電子伝達活性を示すグラフである。
【図４３】ＨＴＥＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４４】Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４５】Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４６】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４７】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の２置換体の電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４８】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の３置換体の電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【符号の説明】
１０ 上部カバー
１０ａ 試料導入口
１２ フィルター
１４ 標識体含浸部
１６ 電子伝達物質含浸部
１６ａ，２４ａ シール部
１８ 連通部材
２０ 電極部
２２ マトリクス
２４ シール部
２６ 下部基板
２８ 基板
３０ 貫通孔
３２ 参照極
３４ 作用極
３６ 絶縁部
３８ 試料導入部
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は電子伝達物質を用いた電気化学的測定方法および新規なｐ−フェニレンジアミン化合物に関する。詳しくは、少なくとも１つの酸化還元酵素、電極、および所定の電子伝達物質（electron mediator)を有する系によって、液性試料中の分析対象物を測定する電気化学的測定方法、例えば、酵素電極法あるいは特異結合分析方法、ならびに、この電気化学的測定方法に利用可能な新規ｐ−フェニレンジアミン化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素電極法とは、一般に酵素固定化膜と電極とを組み合わせた装置を使用して、酵素の分子識別能を利用して化学物質を選択的に測定する方法であり、生化学的分析方法の分野では、酵素センサー等を用いた簡便で迅速な測定方法が既に開示されている。一例をあげると、特公平２−５９４２４号、特開昭６０−１７３４６号、同６０−１７３４７号の各公報に開示される測定方法が例示される。他方、特異結合分析法としては、抗原抗体反応を応用したイムノアッセイ、受容体を用いたレセプターアッセイ、相補的核酸配列のハイブリダイゼーションを用いた核酸プローブアッセイなど多くの方法が知られており、その特異性の高さから、臨床検査をはじめとする広い分野で繁用されている。
【０００３】一方、電気化学センサーの特異結合分析方法への応用の試みも積極的に行われている。例えば、特開昭５８−５８４６７号公報には、酵素（カタラーゼ）標識抗体を用いた電極表面での特異結合反応が； 特開平２−１７９４６１号公報には、酵素（グルコースオキシダーゼ）標識物を用いた電極表面での競合的特異結合反応が； 特開昭６０−１７３６０号公報には、酸化還元酵素（グルコースオキシダーゼなど）と電子メディエータ（フェロセン誘導体など）を用いた特異結合反応が； それぞれ開示されている。さらに、これらと同様な技術として、特開平３−２５３６０号、特開昭６０−１２７４５０号、同６０−２４２３６１号、同６３−１３９２４８号、特表昭６１−５００７０６号の各公報や、米国特許第４，９６３，２４５号、米国特許第５，０６６，３７２号の各明細書、さらには、Anal.Chem.,Vol.56,2355-2360(1984) やClin.Chem.,Vol.31,1449-1452(1985) 等に各種の開示がある。
【０００４】このような酵素電極法や特異結合分析法のうち、電流計測型の酵素電極法および電気化学センサーを用いた特異結合分析法等においては、酵素などの生物学的な酸化還元反応と電極反応とを媒介する低分子化合物、いわゆる電子伝達物質が汎用されている。すなわち、電子伝達物質とは、少なくとも１つの酸化還元酵素、および系内において電子移動可能な電極を用いる測定系において、酵素反応と電極反応との間の電子の伝達移動を媒介する化合物である。
【０００５】このような電子伝達物質は、酵素反応で「還元／酸化」され、電極反応で「酸化／還元」されるものであり、この２つの反応間を循環して、酵素反応から電極反応あるいは電極反応から酵素反応への電子が伝達移動するのを媒介する。そのため、このような電子伝達物質には、
さらに、酵素反応と電極反応との間の電子の移動を媒介する電子伝達物質は、作用極の測定可能範囲内の電位で酸化還元される必要がある。電極の種類や溶液条件で電極の測定可能範囲（電位窓）は異なるが、カーボン電極では通常、−１．２Ｖ〜＋１．０Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）程度が好ましい。
【０００６】これらの電子伝達物質としては、フェロセン誘導体などの有機金属化合物（英国特許８１３２０３４号公報）、フェリ（あるいはフェロ）シアン化カリウムなどの無機化合物や、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）誘導体などの有機化合物等、多数のものが知られている。例えば、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）誘導体であるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）は、亜硫酸(sulfite) イオンを硫酸(sulfate) イオンに酸化する反応を触媒するsulfite oxidase と電極との間の電子移動を媒介（メディエート）することが知られている(Anal.Chem.,1993,65,242-246)。また、ＷＯ９２／０７２６３号公報には、還元型が水に難溶性である電子伝達物質として、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、モルフォリニル基、ピペリジル基を１，４位に有するベンゼン誘導体が開示されている。
【０００７】一方、ＰＰＤ誘導体であるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＨＥＰＤ）およびＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキスカルボキシメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＣＰＤ）は、従来、感光材料・キレート剤として用いられていた（Photographic Science and Engineering 1962,vol.6,No.1,p39 ; Nature 1964,vol.204,p180 ; Z.Chem.1964,vol.4,No.11,p436 ; Z.Chem. 1964,vol.4,No.12,p463 ; An.Quin.Ser.B 1963,vol.59,No7-8,p501 ; An.Quin.Ser.B 1965,vol.61,No.5,p717 ; An.Quin.Ser.B 1965,vol.61,No.5,p723 ; An.Quin.Ser.B 1963,vol.59,No.7-8,p493 ; An.Quin.Ser.B 1986,vol.82,No.2,p133 ; Research Disclosure 1981,vol.212,p428 ）。また、ＴＨＥＰＤは、パーオキシダーゼ、ナフトール誘導体および過酸化水素の存在下で反応させると、そのラジカルとナフトール誘導体とが結合して発色物質を形成することから、パーオキシダーゼ反応の呈色試薬として利用可能であることが知られていた（欧州特許０５０４６６３号公報）。しかしながら、ＴＨＥＰＤおよびＴＣＰＤが前記の特性を有する電子伝達物質として機能することは知られていなかった。
【０００８】ところで、電子伝達物質を用いた測定方法において、従来の電子伝達物質の主たる用途は酵素電極であるので、前述のＷＯ９２／０７２６３号公報に記載されているように、水に難溶性である電子伝達物質が好まれている。なぜならば、電極に固定化あるいは不溶化された酸化還元酵素と電極との電子移動を媒介する場合において安定な電気化学的信号を得るためには、電子伝達物質を電極近傍に存在させて、試料液中に電子伝達物質が流出しないようにする必要があるからである。また、電子伝達物質が試料中のアスコルビン酸、尿酸、ヘモグロビン、酸素等の妨害物質の影響を受けやすい化合物である場合には、電子伝達物質を水に不溶性の化合物として電極内に存在させ、妨害物質との接触を避ける必要がある。しかしながら、この方法では電子伝達物質が電極内に存在しているので反応の場が限定され、電極内の電子伝達物質と有効に接触できる酵素のみが反応に関与できるに過ぎず、一般に信号強度が小さくなるという欠点を有していた。
【０００９】他方、最近では、フェリシアン化カリウムなどの水溶性の電子伝達物質を使用する使い捨て型の酵素電極分析片も開発された（特開平１−１５６６５８号公報参照）。水溶性の電子伝達物質は、ある程度電極から離れた位置の酵素と電極との間の電子移動も媒介できるため、有効な酵素分子数が増大し酵素電極の特性向上が可能となる。このような使い捨て型の酵素電極分析片では、電極の動作に必要な成分をあらかじめ分析片の中に組み込んでおき、検体試料を添加するだけで測定が可能であることが望ましい。そのため、電子伝達物質としては、水溶性が高く、かつ、乾燥が容易で乾燥状態で安定であることが望まれる。水溶性のフェロセン誘導体、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体などの金属錯体の電子伝達物質は、これらの条件をある程度満足する。しかし、これらは酵素との間で電子を交互に伝達し移動する速度が小さく、速度を早くするためには、高濃度の電子伝達物質を必要とするという欠点が残されている。また、水溶性の電子伝達物質は検体試料液中で反応するため、アスコルビン酸、尿酸、ヘモグロビン、酸素等の検体試料中の妨害物質の影響を受けやすい。そのため、妨害物質による影響の少ない化合物の開発が望まれている。
【００１０】さらに、最近、酸化還元酵素を標識剤とし、液体試料と共にマトリクス中に展開することにより、液体試料中の分析対象物と特異結合物質との特異結合反応によって標識剤の電極部からの距離分布を形成させ、電子伝達物質の拡散に律速された液体試料中の分析対象物の濃度に対応する電流値を計測し、これによって分析対象物濃度を測定する特異結合分析方法としてＭＥＤＩＡ法(Mediator Diffusion-Controlled Immunoassay) が知られている（特開平５−２６４５５２号公報（欧州特許公開公報 0 525 723 A2 号）参照）。このような測定法においても、妨害物質を含有する血液や尿などの試料液中で、酵素と電極間の安定な電子伝達を媒介できる電子伝達物質が望まれている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前記従来技術の問題点を解決することにあり、水溶性の電子伝達物質を用いた電気化学的な測定方法、例えば、酵素電極法あるいは例えばＭＥＤＩＡ法のような特異結合分析方法等の測定方法において、測定感度（応答性）が良好で、試料が血液や尿等の妨害物質を含有するものであっても、常に安定して再現性の良好な測定を行うことができ、しかも、使い捨ての用途にも好適に利用することができる電気化学的測定方法、およびこの電気化学的測定方法に電子伝達物質として用いることができる新規ｐ−フェニレンジアミン化合物を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】電子伝達物質を用いた測定方法、より詳細には、電極と少なくとも１つの酸化還元酵素とを用いて液性試料中の分析対象物を定量する測定方法において、利用される酸化還元酵素の代表例としては以下のようなものがある。
生体中では、酸素を電子受容体としており、フラビン補酵素、金属原子、ヘムなどを含有する。
例：グルコースオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなど。
例：パーオキシダーゼ、カタラーゼなど。
生体中では、ＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）を受容体（あるいは供与体）とする。
例：アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼなど。
【００１３】これらの酸化還元酵素のうち、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は血糖値測定用の酵素電極に使用されており、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）はＤＮＡハイブリダイゼーションや免疫測定法などの特異結合分析方法の標識酵素として使用されている。本発明者らの実験によれば、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼはいずれもハイドロキノン（ＨＱ）／ベンゾキノン（ＢＱ）を電子伝達物質とした時に緩衝液中で良好な電流応答を示し、フェロセン誘導体、無機イオン、金属錯体などの従来の電子伝達物質よりも特性が優れていた。しかし、これらの電子伝達物質は、血液・尿などが存在すると干渉を受け、再現性の良い安定な応答が認められなかった。また、ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、ＴＭＰＤ、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラエチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＥＰＤ）など、緩衝液中で良好な電流応答を示すＰＰＤ系の電子伝達物質も、血液・尿などの存在下では同様な干渉が認められた。
【００１４】さらに、使い捨て型の分析片を製造する目的で、ＨＱ、ＰＰＤ、ＴＭＰＤあるいはＴＥＰＤの溶液をセルロース濾紙あるいはガラス濾紙などに含浸し、電極上で乾燥（凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等）するか、あるいは乾燥後に電極上に設置して、測定時に試料によって溶解するように構成した場合には、電流応答が小さくなり、極めて悪い特性しか示さない。
【００１５】本発明者らの詳細な研究の結果、これらの現象の主要な原因として次のような問題点の存在が推定された。
【００１６】本発明者らは、このような問題点を解決するために鋭意検討を重ねた結果、酸化還元酵素と、この酸化還元酵素と電子の伝達が可能な電子伝達物質と、この電子伝達物質との間で電子移動可能な電極とを有する系において、電子伝達物質として下記式［Ｉ］または［II］で示される化合物またはその塩を用いることにより、生体成分の各種測定方法に好適に用いることができることを見い出した。すなわち、本発明者らは鋭意検討の結果、式［Ｉ］または式［II］の化合物またはその塩は、酵素電極法あるいは例えばＭＥＤＩＡ法のような特異結合分析方法等の電気化学的測定において、優れた電子伝達物質として作用し、しかも、水溶性が高い； 乾燥（凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等）が容易でかつ乾燥状態で安定である： 酵素との電子移動速度が大きい； 血液や尿などの検体試料中の妨害物質の影響が少ない電子伝達物質として機能する； 等の優れた特性を有することを見い出し、本発明を成すに至った。
【００１７】本発明は、少なくとも１つの酸化還元酵素を用いて液性試料中の分析対象物を測定する測定方法において、その測定系に酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を配し、前記電子伝達物質として、下記式［Ｉ］または［II］で示される化合物またはその塩を用いることを特徴とする電気化学的測定方法を提供する。
【００１８】式［Ｉ］は、下記の構造を有するものでる。
【化６】
（上記式［Ｉ］中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示す。但し、上記式［Ｉ］において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有する。また、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、同一であっても互いに異なるものであってもよい。）
【００１９】ここで上記式［Ｉ］において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を有するのが好ましく、特に、下記に示される化合物の１以上が好ましい。
【化７】
【００２０】式［II］は下記の構造を有するものである。
【化８】
（上記式［II］中、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、水素原子または、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示す。但し、上記式［II］において、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は同一であっても互いに異なるものであってもよく、このうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有するアルキル基であり、少なくとも１つが水素原子である。）
【００２１】ここで上記式［II］で、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基を有するのが好ましく、下記の化合物が例示される。
【化９】
【００２２】また、前記分析対象物が前記酸化還元酵素の基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビターであり、この基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビター量に応じて生じる酵素反応の変調を前記電極における電気化学的信号の変調として検出するのが好ましい。
【００２３】また、前記分析対象物に対する特異結合物質を少なくとも一種用い、前記酸化還元酵素を標識物質として用いた特異結合反応によって、前記分析対象物を測定するのが好ましい。
【００２４】さらに、ＭＥＤＩＡ法を利用した例、つまり前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部において信号を発する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させてから、前記マトリクスに導入する； ことにより、前記酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物との複合体、酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物と第１の特異結合物質との複合体、あるいは複合体を形成していない酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質のうち、少なくとも１つの分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出するのが好ましい。
【００２５】また、ＭＥＤＩＡ法を利用したもう１つの例、つまり前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、前記分析対象物に対する特異結合物質、あるいは特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のいずれか一方が、前記電極で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識されており、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させる； あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させてから、前記マトリクスに導入する； ことにより、前記特異結合物質と分析対象物との複合体、特異結合物質と特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質との複合体、複合体を形成していない特異結合物質、あるいは複合体を形成していない特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のうち、少なくとも１つの酸化還元酵素で標識された分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出するのが好ましい。
【００２６】以下、本発明の電気化学的測定方法および電気化学的測定方法に利用可能な新規ｐ−フェニレンジアミン化合物についてより詳細に説明する。前述のように、本発明の電気化学的測定方法（以下、測定方法とする）は、少なくとも１つの酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を測定系に有するものであり、電子伝達物質として、下記式［Ｉ］または［II］で示される化合物またはその塩を用いる。
【００２７】
【化１０】
【００２８】式［Ｉ］において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示すものであり、また、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有する。式［II］において、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、水素原子またはそれぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示すものであり、また、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有するアルキル基であり、少なくとも一つは水素原子である。
【００２９】本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、上記式［Ｉ］または式［II］で示される化合物が電気化学的測定で電子伝達物質として良好に作用することを初めて見出した。さらに、上記式［Ｉ］または式［II］で示される化合物が、Ｒ1 〜Ｒ8の少なくとも一つに、ヒドロキシル基・メルカプト基・カルボキシル基・ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれた１以上の基を有する場合には、得られる化合物は蒸気圧が低くかつ水に対する溶解性が高いため、乾燥（凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等）が容易でかつ乾燥状態で安定で、試料液の添加で直ちに溶解して良好な応答を示すことも見出した。すなわち、この化合物は、各種濾紙等の多孔質材に含浸・乾燥して、使い捨ての用途にも好適に利用可能である；血液や尿などの検体試料中の妨害を低減できる； 酵素との電子移動反応が大きく妨げられず、良好な電流応答を示す： 等の電子伝達物質に要求される特性を良好に有することも同時に見出した。従って、上記式［Ｉ］または［II］の化合物を電子伝達物質として利用する本発明の測定方法によれば、測定感度（応答性）が良好で、使い捨ての用途にも好適に利用することができ、しかも、試料が血液や尿等の妨害物質を含有するものであっても、常に安定して再現性の良好な測定を行うことが可能である。
【００３０】上記式［Ｉ］の化合物において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 としては上記要件を満たす公知の基が全て利用可能であるが、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、１，２−ジヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−（１−ヒドロキシ）プロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−（１，３−ジヒドロキシ）プロピル基、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル基、メルカプトメチル基、カルボキシメチル基、ホスホノオキシメチル基およびスルホメチル基等が好適に例示される。中でも、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−（１−ヒドロキシ）プロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基等が特に好適に例示される。また、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一であっても互いに異なるものであってもよい。
【００３１】上記式［II］の化合物において、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 としては上記要件を満たす公知の基が全て利用可能であるが、具体的には、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、１，２−ジヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−（１−ヒドロキシ）プロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−（１，３−ジヒドロキシ）プロピル基、３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル基、メルカプトメチル基、カルボキシメチル基、ホスホノオキシメチル基およびスルホメチル基等が好適に例示される。中でも、水素原子、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２−（１−ヒドロキシ）プロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基等が特に好適に例示される。また、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は同一であっても互いに異なるものであってもよく、少なくとも一つはアルキル基で少なくとも一つは水素原子である。
【００３２】本発明の測定方法において、このような式［Ｉ］または式［II］に示される化合物としては、具体的には、下記（１）〜（２７）の各化合物が例示される。
【００３３】
【化１１】
【００３４】
【化１２】
【００３５】
【化１３】
【００３６】中でも特に、（１）に示されるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＨＥＰＤ）、（２）に示されるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキスカルボキシメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＣＰＤ）、（３）に示されるＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′，３′−ジヒドロキシプロピル）−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＤＨＰＤ）、（１１）に示されるＮ−２′−ヒドロキシエチル−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−トリエチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＨＴＥＰＤ）、（１２）に示されるＮ，Ｎ−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ′−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ）、（１３）に示されるＮ，Ｎ′−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ′−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ）等は好適に利用される。また、（２１）に示されるＮ，Ｎ′−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン（Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ）、および（２４）に示されるＮ−２′−ヒドロキシプロピル−ｐ−フェニレンジアミン（ＨＰＰＤ）も好適に利用される。
【００３７】さらに、下記式で示される化合物も好適に利用可能である。
【化１４】
【００３８】このような式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質は、公知の各種の方法で合成することができる。合成方法の一例を挙げれば、ｐ−フェニレンジアミンと、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 あるいはＲ8 に対応する化合物のハロゲン化物とをアルコール等の溶媒に溶解して、加熱下で還流して反応し、得られた目的物を濾過やカラムクロマトグラフィー等によって分離精製する方法が例示される。また、Ｒ1 〜Ｒ8 の２位の炭素にヒドロキシル基を有する化合物を合成する場合は、ｐ−フェニレンジアミンとエチレンオキサイド誘導体とを溶媒に溶解し、加熱下で還流して反応し、得られた目的物を濾過、カラムクロマトグラフィー等によって分離精製する方法が例示される。
【００３９】本発明の測定方法においては、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質の塩も好適に利用可能である。具体的には、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等が例示される。また、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質がカルボキシル基、ホスホノオキシ基、およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有する場合、そのナトリウム塩やカリウム塩等も好適に使用される。中でも特に、ＴＨＥＰＤの塩酸塩、ＴＣＰＤの塩酸塩、ＴＤＨＰＤの塩酸塩等は好適に使用される。
【００４０】式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質は、酸化還元酵素あるいは電極によって酸化還元されて、酸化状態の電子伝達物質種あるいは還元状態の電子伝達物質種となる。酸化還元酵素による酸化還元反応によって、酸化状態の電子伝達物質種が生成する場合には、生成された酸化状態の電子伝達物質種は電極反応によって還元状態に戻り、その時、電極では還元電流が信号として検出される（図１（ａ））。逆に、酸化還元酵素による酸化還元反応によって、還元状態の電子伝達物質種が生成する場合には、生成された還元状態の電子伝達物質種は電極反応によって酸化状態に戻り、その時、電極では酸化電流が信号として検出される（図１（ｂ））。すなわち、本発明の測定方法においては、図１R>１（ａ）および図１（ｂ）のどちらにおいても、酸化状態あるいは還元状態のいずれの電子伝達物質種から反応が始まっても、同等の効果がある。従って、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質としては、電子伝達物質が酸化状態の電子伝達物質種、あるいは電子伝達物質が還元状態の電子伝達物質種が含まれる。
【００４１】本発明の測定方法において、このような式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質の使用量には特に限定はなく、使用する電極、酸化還元酵素、測定対象物質の種類や量等に応じて適宜決定すればよい。
【００４２】また、本発明の測定方法において、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質は各種の状態で使用することができる。例えば、測定系に直接溶解・混合して使用する方法、乾燥あるいは凍結乾燥して測定時に溶解して使用する方法、電極のペースト中に存在させる方法、緩衝液等に溶解して濾紙に含浸して乾燥して測定時に試料溶液等で溶解する方法等が例示される。いずれの場合であっても、この電子伝達物質が有する優れた水溶性、乾燥性および乾燥後の安定性、電流応答性、さらに検体試料中の妨害物質の影響が低いこと等によって、良好な電気化学的測定を実現することが可能である。
【００４３】本発明の測定方法は、少なくとも１つの酸化還元酵素を利用した電気化学的測定を行うものである。本発明に利用される酸化還元酵素には特に限定はなく、測定目的物の種類等に応じて、各種の酸化還元酵素が選択・使用される。具体的には、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等のパーオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ビルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ジアフォラーゼ等が好適に使用される。中でも特に、血糖値測定用としてのグルコースオキシダーゼ、特異結合分析方法に用いる標識酵素としての西洋ワサビパーオキシダーゼ等は好適に使用される。また、酸化還元酵素の使用量にも特に限定はなく、使用する電極、電子伝達物質、測定対象物の種類や量等に応じて適宜決定すればよい。
【００４４】本発明の測定方法に使用される電極としては、酵素電極法や特異結合分析法などの電気化学的測定に通常使用される各種の電極が例示される。具体的には、グラッシーカーボン(glassy carbon) 電極、パイロリティックグラファイト(pyrolytic graphite)電極、カーボンペースト(carbon paste)電極、カーボンファイバー(carbon fiber)電極などのカーボン電極、白金電極、金電極、ＩＴＯ電極などの導電性透明電極、TiO2などの酸化物電極、機能性化合物で修飾された修飾電極等が例示される。本発明の測定方法においては、導電性カーボンインクを用いてスクリーン印刷等で基板上にパターン印刷された電極が、その応用性の広さから特に好適に使用される。また、電極の形状（平面電極、多孔性電極など）や大きさにも特に限定はなく、測定対象物質の種類や量、測定試料の量や特性（例えば粘度など）、測定用途や条件等に応じて適宜決定すればよい。
【００４５】基本的に、このような酸化還元酵素、電子伝達物質、および電極を有する系で行われる本発明の測定方法は、酵素電極法や特異結合分析法等の、公知の各種の電気化学的な測定に好適に利用可能である。具体的には、電流計測型の酵素センサ、免疫センサ、核酸センサなどに利用可能である。より具体的には、酵素センサを用いた血中グルコース，コレステロール，尿酸，乳酸等の測定、特異結合分析法を用いたヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ），黄体形成ホルモン（ＬＨ），ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ），エストロゲン等の各種ホルモンの測定、ＨＢｓ抗体，ＨＢｓ抗原，ＨＢｃ抗体，ＨＢｅ抗原，ＨＣＶ抗体，ＨＩＶ抗体等の各種ウイルス関連の抗原・抗体の測定、各種アレルゲンに対応する特異ＩｇＥ抗体の測定、ＡＦＰ，ＣＥＡ等の腫瘍マーカーの測定、β2 ｍ，ＣＲＰ等の各種血中蛋白，薬物，およびこれらの代謝産物の測定、ウイルスおよび腫瘍関連のポリヌクレチオド配列の測定等が利用例として好適に例示される。
【００４６】本発明の測定方法は、周知の酵素電極法や特異結合分析法等の各種の電気化学的な測定を、通常の測定と同様の方法で実施することができる。本発明の測定方法は、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質の有する優れた水溶性、乾燥性および乾燥安定性等を生かして、セルロース濾紙やガラス濾紙等に電子伝達物質を含浸させて乾燥させた分析片を作製し、この電子伝達物質を測定時に試料溶液によって溶解してマトリクス内を拡散移動させ、信号である電子を伝達する物質として作用させるような、使い捨ての測定装置には特に好適に利用される。
【００４７】図２に、本発明の測定方法を実施する例として、ＭＥＤＩＡ法を利用した、使い捨てタイプの特異結合反応測定装置を示す。なお、この測定装置における分析方法の詳細な説明は、特開平５−２６４５５２号公報に詳述されている。
【００４８】図２に示される測定装置は、上から、上部カバー１０、フィルター１２、標識抗体含浸部１４、電子伝達物質含浸部１６、連通部材１８、電極部２０、マトリクス２２、吸収部２４、および下部基板２６を有して構成され、図３に示されるように、各部材が上記順番で積み重ねられて組み合わされて構成される。また、フィルター１２、標識抗体含浸部１４、電子伝達物質含浸部１６および連通部材１８によって試料導入部３８が構成される。なお、本発明の測定方法を利用する測定装置は、これらの各部材を全て有するものに限定はされず、前記特開平５−２６４５５２号公報に記載される構成も各種利用可能である。
【００４９】上部カバー１０は、アクリル、ポリ塩化ビニル、ガラス、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、エポキシ樹脂等の各種の合成樹脂によって成形されるものであり、中心部分には試料を注入するための試料導入口１０ａが形成される。フィルター１２は、試料に含まれる測定に不要な固形物（妨害物質）を除去すると共に、試料の導入が均一に行えるようにするものであって、通常、織布や不織布等によって形成される。
【００５０】標識抗体含浸部１４は、ガラス繊維濾紙，セルロース繊維濾紙，不織布等に、本発明の構成要素の一つである酸化還元酵素標識抗体を含浸・乾燥してなるものである。つまり、試料が標識抗体含浸部１４を通過することにより、酸化還元酵素標識抗体が溶出して分析対象物と酸化還元酵素標識抗体とが混合され、あるいは反応が開始される。
【００５１】電子伝達物質含浸部１６は、ガラス繊維濾紙，セルロース繊維濾紙，不織布等に本発明の特徴的な要素である電子伝達物質を含浸・乾燥してなるものである。試料が電子伝達物質含浸部１６を通過することにより、電子伝達物質が溶出して試料と混合される。なお、本発明の測定方法においては、電子伝達物質として式［Ｉ］または式［II］で示される化合物を使用するので、電子伝達物質の乾燥性および乾燥安定性が良好で、しかも迅速に溶出して混合するのは前述のとおりである。図示例の装置においては、好ましい態様として、電子伝達物質含浸部１６の上面中心部分には水が通過不可能なシール部１６ａが形成される。このシール部１６ａを有することにより、標識抗体含浸部１４までは鉛直方向であった試料の流れを水平方向に変更することができ、試料の流れ時間を長くして反応時間を十分に確保することが可能になると共に、混合効果によって反応効率が上り、より正確な測定を行うことができる。シール部１６ａの形成材料および形成方法には特に限定はなく、塩化ビニルやセルロースアセテート等の各種の水不透性材料を、接着剤、例えばアクリル系接着剤等の手段を用いて電子伝達物質含浸部１６の中心部分に貼着すればよい。
【００５２】図示例の測定装置においては、酸化還元酵素標識抗体を保持する標識抗体含浸部１４、および電子伝達物質を保持する電子伝達物質含浸部１６が別々に形成されるものであるが、本発明に利用される測定装置は、この構成以外にも、酸化還元酵素標識抗体と電子伝達物質の両者を保持する試薬含浸部とする構成であってもよい。また、図示例の測定装置においては、電子伝達物質は電子伝達物質含浸部１６に保持されているが、前述のように、式［Ｉ］または式［II］で示される電子伝達物質は、良好な乾燥性および水溶性を有するので、これ以外、例えば、後述するマトリクス２２や吸収部２４等に保持されていても、良好な測定が可能である。
【００５３】連通部材１８は、電子伝達物質含浸部１６を通過した試料等を電極部２０の所定位置を通過させてマトリクス２２に導入するものであり、ガラス繊維濾紙やセルロース繊維濾紙等より形成される。このような連通部材１８は、後述する電極部２０の貫通孔３０に挿入されて配置される。
【００５４】電極部２０は、本発明の構成要素の一つである測定用の電極を有するものであり、図示例の装置においては、図２および図４に示されるように、絶縁性の基板２８に円形の貫通孔３０を形成し、基板２８上面の貫通孔３０周囲に参照極（対極）３２およびその端子３２ａが、基板２８下面の貫通孔３０周囲に検出用電極である作用極３４およびその端子３４ａが、それぞれ形成される。測定時には両極の端子は外部の測定器に接続されている。また、参照極３２および作用極３４以外の電子伝達物質含浸部１６および後述するマトリクス２２が接触する部分には、電極部２０の基板２８の上下面共に、図４に斜線で示されるように絶縁層３６が形成されている。
【００５５】検出用電極である作用極３４は前述の各種の材料によって形成される。参照極３２は、銀／塩化銀電極等である。基板２８は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ポリ塩化ビニル、ポリイミド、ポリエステル等の公知の各種の絶縁性材料で形成される。絶縁層３６は、アクリル系樹脂、ポリエステル等の公知の各種の絶縁性インク材料で形成される。なお、図示例の装置において、作用極３４、参照極３２および絶縁層３６は、共に、スクリーン印刷やドクターナイフ等の厚膜形成技術、スパッタリングやＣＶＤ等の薄膜形成技術等の公知の膜形成技術によって形成すればよい。
【００５６】マトリクス２２は、液体試料中の分析対象物と酸化還元酵素標識抗体との特異結合で生じた酵素標識体を分布させる場であり、この標識体の作用極３４からの距離分布が、前述の電子伝達物質を介して電流値として測定される。このようなマトリクス２２は、例えば、メンブレン等の多孔質膜に、特異結合反応のための抗体や抗原、核酸等を、不溶化して保持・乾燥してなるものである。試料がこのマトリクス２２に流入し、不溶化抗体と分析対象物との間の特異結合反応がおこり、酵素標識体の分布が変化すると、酵素反応によって生成する電子伝達物質種が拡散移動し、作用極３４によって反応に対応した電気化学的変調として検出される。また、余剰の試料は、このマトリクス２２を通過して後述の吸収部２４で吸収される。
【００５７】吸収部２４は、前述のようにマトリクス２２を通過した余剰の試料を吸収するもので、例えば、クロマトグラフ濾紙などのセルロース濾紙、高吸水性ポリマーで形成される。なお、図示例の装置においては、この吸収部２４は酵素反応の基質含浸部としても機能し、上述の材料に過酸化水素−尿素乾燥体等の酵素反応基質を保持してなるものである。図示例の装置においては、好ましい態様として吸収部２４の上面中心部分に水が通過不可能なシール部２４ａが形成される。前述のシール部１６ａと同様、シール部２４ａを有することにより、鉛直方向であった試料の流れを水平方向に変更することができ、試料の流れ時間を長くして、特異結合反応の効率を向上させると共に、マトリクス内の標識体分布が明瞭になり、より正確な測定を実現することができる。なお、シール部２４ａは、前述のシール部１６ａと同様に形成される。
【００５８】図示例の測定装置は、これらの各部材を図２R>２および図３に示される順序で、下部基板２６上に積層して構成される。下部基板２６は、上部カバー１０と同様、アクリル等の各種の樹脂材料によって形成される。
【００５９】このような測定装置においては、試料は上部カバー１０に形成される試料導入口１０ａより注入される。試料導入口１０ａより注入された試料は、フィルター１２を通過して異物等を除去され、標識抗体含浸部１４に流入する。標識抗体含浸部１４においては、試料が流入することによって乾燥・保持された酸化還元酵素標識抗体が溶出して試料と混合され、あるいは分析対象物と酸化還元酵素標識抗体との特異結合反応が開始される。
【００６０】試料は、次いで、電子伝達物質含浸部１６に流入する。前述のように、電子伝達物質含浸部１６には電子伝達物質が乾燥・保持されているので、試料の流入によって、電子伝達物質が溶出して試料と混合される。なお、図示例の装置においては、電子伝達物質含浸部１６の上面にはシール部１６ａが形成されるので、試料の流れ方向が鉛直方向から水平方向に変更され、十分な反応時間が確保できるのは前述のとおりである。
【００６１】電子伝達物質含浸部１６を通過した試料は、連通部材１８を通って電極部２０の貫通孔３０を通過して、マトリクス２２に流入する。マトリクス２２に試料が流入すると、液体試料中の分析対象物と不溶化抗体との特異結合によってマトリクス２２内における酸化還元酵素標識体の分布が決まり、酸化還元酵素標識体の酵素反応によって生成する電極反応可能な電子伝達物質種が拡散によって作用極３４に到達する。すなわち、分析対象物の作用極３４半径方向の分布が酵素反応に対応した電気化学的変調として作用極３４で検出される。余剰の試料は、マトリクス２２を通過して吸収部２４で吸収される。
【００６２】従って、上記測定装置によれば、マトリクス２２内における分析対象物と不溶化抗体との特異結合反応の結果、試料に含有される分析対象物の量に応じて前記特異結合反応によって生じる酵素標識体のマトリクス２２内における分布が決り、この酵素標識体によって生成される電子伝達物質種の拡散移動を介して作用極３４で電子の授受が行われ、電極反応による電子移動が電気化学的変調として検出される。その結果、マトリクス２２の半径方向の特異結合反応の分布を測定して、試料中の分析対象物を測定できる。
【００６３】以上、本発明のＭＥＤＩＡ法を利用した電気化学的測定方法および新規ｐ−フェニレンジアミン化合物について詳細に説明したが、本発明は上述の例に限定はされず、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の変更および改良を行ってもよいのはもちろんである。
【００６４】
【実施例】以下、本発明の具体的実施例を挙げ、本発明についてより詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されない。
【００６５】＜合成例１＞（従来技術に対応）
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラエチル−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩（ＴＥＰＤ・２ＨＣｌ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（１ｇ）、ヨウ化エチル（１０．７ｇ）、および炭酸ナトリウム（４．４ｇ）をメタノ−ル（１０mL）に溶解し、加熱下で１晩還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、減圧下で溶媒を留去し、残分にアセトンを加え不溶物を濾別した。得られた濾液から減圧下で溶媒を留去し、残分を酢酸エチル−エ−テル混合液で再結晶し、４級アンモニウム塩６．８ｇを得た。
【００６６】次いで、この４級アンモニウム塩６．８ｇと、チオ硫酸ナトリウム５水和物１２．５ｇとをジメチルホルムアミド５０mLに溶解し、加熱下で１晩還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、蒸留水を加えてトルエンで抽出を行い、抽出層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去しＴＥＰＤを１．０ｇ得た。さらに、このＴＥＰＤにエタノ−ル１０mLを加え、４Ｎ塩酸／酢酸エチル５mLを氷冷下で滴下し、さらに、５℃で１時間攪拌した。生じた沈殿を濾過し、得られた沈殿をエタノ−ルおよびエ−テルで洗浄し、ＴＥＰＤ・２ＨＣｌを１．３ｇ得た。
【００６７】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲ（赤外吸光分析）およびＭＳ（マススペクトル）での分析結果より、目的とするＴＥＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ １．２（１２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Hz） ３．７（８Ｈ，ｑ，Ｊ＝７Hz） ７．９（４Ｈ，Ｓ）
ＩＲ(cm-1)：７１５，８４０，１０２０，１２７６，１５１６，２４２０ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２２１
【００６８】＜合成例２＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキスカルボキシメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＣＰＤ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（１ｇ）、クロロ酢酸（３．５ｇ）、水酸化ナトリウム（３．１ｇ）およびヨウ化カリウム（４６０mg）を蒸留水（４６mL）に溶解し、加熱下で１時間還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、濃塩酸３．７mLを氷冷下で滴下し、生じた沈殿を濾過した。沈殿をメタノール−エタノール混合液で再結晶して、ＴＣＰＤを７００mg得た。
【００６９】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＴＣＰＤであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ ３．９（８Ｈ，Ｓ） ６．３（４Ｈ，Ｓ） １１．２（４Ｈ，Ｓ）
ＩＲ（cm-1）：７００，８２０，１０３０，１５１４，１７２０，２７００，３３００ＭＳ：Ｍ+ ＋１ ３４１
【００７０】＜合成例３＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩（ＴＨＥＰＤ・２ＨＣｌ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（１ｇ）、２−クロロエタノール（３．０ｇ）、および水酸化ナトリウム（１．５ｇ）を蒸留水６mLに溶解し、加熱下に２時間還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、減圧下で溶媒を留去し、残分にエタノールを加え不溶物を濾別した。得られた濾液から、減圧下で溶媒を留去し、残分をクロロホルム−メタノール混合液を溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ＴＨＥＰＤを１．５ｇ得た。
【００７１】次いで、このＴＨＥＰＤ１．５ｇをエタノール１０mLに溶解し、この溶液に４Ｎ塩酸／酢酸エチル５mLを氷冷下で滴下し、さらに５℃で１時間攪拌した。生じた沈殿を濾過し、得られた沈殿をエタノールで洗浄し、ＴＨＥＰＤ・２ＨＣｌを１．１ｇ得た。
【００７２】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＴＨＥＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ ３．５（１６Ｈ，ｂｒＳ） ７．０（４Ｈ，ｍ） ７．１（４Ｈ，Ｓ）
ＩＲ（cm-1）：７２０，８９０，１０２０，１２１０，１３９０，１５００，２７００，３３００ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２８５
【００７３】＜合成例４＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス−（２′，３′−ジヒドロキシプロピル）−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩（ＴＤＨＰＤ・２ＨＣｌ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（１．０ｇ）、３−クロロ−１，２−プロパンジオール（４．６ｇ）および水酸化ナトリウム（１．６ｇ）を蒸留水３０mLに溶解し、加熱下で２時間還流した。反応混合物を室温まで冷却した後、減圧下で溶媒を留去し、残分にエタノールを加え不溶物を濾別した。減圧下において得られた濾液から溶媒を留去し、残分をクロロホルム−メタノールを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ＴＤＨＰＤを１．１ｇ得た。
【００７４】次いで、このＴＤＨＰＤ１．１ｇをエタノール１０mLに溶解し、この溶液に４Ｎ塩酸／酢酸エチル５mLを氷冷下で滴下し、さらに５℃で１時間攪拌した。次いで生じた沈殿を濾過し、得られた沈殿をエタノールで洗浄し、ＴＤＨＰＤ・２ＨＣｌを８２０mg得た。
【００７５】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＴＤＨＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ ３．７（２０Ｈ，ｍ） ７．１（４Ｈ，Ｓ）
ＩＲ（cm-1）：７２０，８７０，１０４０，１２６０，１３７０，１５２０，３３００ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ４０５
【００７６】＜合成例５＞（本発明に対応）
Ｎ−２′−ヒドロキシエチル−Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−トリエチル−ｐ−フェニレンジアミン２塩酸塩（ＨＴＥＰＤ・２ＨＣｌ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（５ｇ）のメタノール溶液（１００mL）に炭酸カリウム（１２．８ｇ）を加え、この溶液にヨウ化エチル（１４．４ｇ）を室温にて１０分で滴下した。反応液を５０℃で撹拌し、原料の消失を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で確認後、減圧濃縮を行なった。次いで、濃縮物をｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１に溶解し、析出した結晶を濾別し、濾液を減圧濃縮した。ついで、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製し、Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−トリエチル−ｐ−フェニレンジアミン１．５ｇを得た。
【００７７】次いで、Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−トリエチル−ｐ−フェニレンジアミン１．５ｇをｎ−ブタノール（２０mL）に溶解し、水酸化ナトリウム（２．２ｇ）を添加した溶液に２−クロロエタノール（４．４ｇ）を室温にて５分で滴下し、１時間還流した。薄層クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で原料の消失を確認した後、反応液を室温まで冷却し、析出した結晶を濾別した。その後残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製しＨＴＥＰＤを得た。次いで、ＨＴＥＰＤをエタノール１５mLに溶解し、氷冷下にて４Ｎ塩酸／酢酸エチル（２．４mL）を滴下し、生じた析出結晶をエタノールにて洗浄しＨＴＥＰＤ・２ＨＣｌを１．０ｇ得た。
【００７８】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＨＴＥＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ １．１（９Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ） ３．５（１０Ｈ，ｍ）
７．４（４Ｈ，ｍ）
ＩＲ（cm-1）：７００，８３０，１０６０，１３７０，１４５０，１５００，２３５０，２９００，３３５０ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２３７
【００７９】＜合成例６＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−Ｎ′，Ｎ′−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン・２塩酸塩（Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌ）の合成Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン（５ｇ）のｎ−ブタノール溶液（３０mL）に、水酸化ナトリウム３．７ｇを加え、さらに２−クロロエタノール（７．３ｇ）を室温にて１０分で滴下した。この溶液を４時間還流し、原料の消失を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で確認後、室温まで冷却した。析出結晶を濾別して濾液を減圧濃縮し、その残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）にて精製しＮ，Ｎ−ＢＨＤＰＤを得た。
【００８０】次いで、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤをエタノール（２０mL）に溶解し、氷冷下にて４Ｎ塩酸／酢酸エチル（２．７４mL）を滴下し、生じた析出結晶をエタノールにて洗浄しＮ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌを１．２２ｇ得た。
【００８１】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＮ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ １．０（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ） ３．５（１２Ｈ，ｍ）
６．７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ） ７．５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）
ＩＲ（cm-1）：７００，８３０，１０５０，１３８０，１４５０，１５００，２４８０，２９００，３３００ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２５３
【００８２】＜合成例７＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ′−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−ｐ−フェニレンジアミン（Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ）の合成ｐ−フェニレンジアミン（５ｇ）のエタノール溶液（１００mL）に水酸化ナトリウム４．４ｇを加え、５５℃に加温した。さらに、この溶液に２−クロロエタノール８．９ｇを１０分で滴下した。１晩還流し、原料の消失を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）で確認後、室温まで冷却した。析出結晶を濾別し、その濾液を減圧濃縮した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）にて精製しＮ，Ｎ′−ＢＨＰＤ５．０ｇを得た。
【００８３】＜合成例８＞（本発明に対応）
Ｎ，Ｎ′−ビス−（２′−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ′−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン・２塩酸塩（Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌ）の合成Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ４．５ｇのエタノール溶液（１００mL）に炭酸カリウム８．９ｇおよびヨウ化エチル９．５ｇを加え、１晩還流した。原料の消失を薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５：１）で確認後室温まで冷却した。析出結晶を濾別し、その濾液を減圧濃縮した後、残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル１００％）にて精製し、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤを２３３ｍｇ得た。次いで、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤをエタノール５mLに溶解後、氷冷下にて１０％塩化水素／メタノールを滴下し、生じた析出結晶を濾別し、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌを２６６ｍｇ得た。
【００８４】下記に示す 1ＨＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳによる分析結果より、目的とするＮ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌであることが確認された。
1ＨＮＭＲ：δ １．１（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ） ３．５（１２Ｈ，ｍ）
７．４（４Ｈ，ｓ）
ＩＲ（cm-1）：６７０，８３０，１０７０，１５００，２５００，２９００，３３５０ＭＳ：Ｍ+ −２ＨＣｌ＋１ ２５３
【００８５】＜合成例９＞（本発明に対応）
ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応によるＮ原子上の各置換体の合成ｐ−フェニレンジアミン（５ｇ）のメタノール溶液（１００mL）に水酸化ナトリウム１．３ｇを加え、さらにプロピレンオキサイド１．１ｇを滴下した。３０℃にて１晩撹拌した後、減圧濃縮を行った。その後、濃縮物にクロロホルムを添加し、クロロホルム抽出物７ｇを得た。次いで、溶離液としてアセトニトリル：５０ｍＭ酢酸アンモニウム＝１５．６：８４．４を用い、ＯＤＳカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ、２０ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）にて、クロロホルム抽出物のＨＰＬＣ分取を行った。この際、流速は１５mL／ｍｉｎとし、２５４ｎｍを検出波長とした。この分取により、ｐ−フェニレンジアミンＮ原子上の１、２および３置換体を各々分離した。下記に示す 1ＨＮＭＲおよびＭＳによる分析結果より、目的物であることが確認された。なお、各置換数は、質量スペクトルにて決定した。
１置換体 1ＨＮＭＲ：δ １．１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ） ２．８（２Ｈ，ｍ） ３．８（１Ｈ，ｍ） ４．９（３Ｈ，ｂｒｓ） ６．４（４Ｈ，ｍ）
ＭＳ：１６７（Ｍ＋１）
２置換体 ＭＳ：２２５（Ｍ＋１）
３置換体 ＭＳ：２８３（Ｍ＋１）
また、 1ＨＮＭＲおよびＭＳによる分析結果より、１置換体はＮ−２′−ヒドロキシプロピル−ｐ−フェニレンジアミン（ＨＰＰＤ）であることが確認された。
【００８６】＜実験例１＞ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）、ＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの蒸気圧測定ＰＰＤ（和光純薬社製）、ＴＭＰＤ（東京化成社製）および前述の合成例１〜４の途中で得られたＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤについて蒸気圧を測定した。一定温度の固体試料（ＰＰＤ，ＴＭＰＤ，ＴＥＰＤ，ＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤ）と接触するようにキャリアガス（窒素ガス）を流し、試料の蒸気を飽和させて蒸気密度（蒸発量／体積）を測定し、蒸気が理想気体の法則に従うと仮定して各化合物の蒸気圧を求めた（気体流通法）。試料の蒸発速度（減量速度）は電気天秤を、またキャリアガス流量は流量計を用いて測定し、試料の蒸気密度を求めた。蒸気密度から蒸気圧を求めるために、次式を用いた。
Ｐ＝（ｋ／ｖ）Ｖπ／Ｍ上記式において、Ｐ：蒸気圧[mmHg]、ｋ：蒸発速度[mg/min]、ｖ：キャリアガス流量[mL/min]、ｋ／ｖ：蒸気密度[mg/mL] 、Ｍ：試料の分子量、π：系の圧力[mmHg]、Ｖ：キャリアガスのモル体積[L/mol] である。
【００８７】図５に、各温度におけるＴＥＰＤおよびＴＨＥＰＤの蒸気圧曲線を１例として示した。また、２５℃における各化合物の蒸気圧を図２４に示した。図５および図２４に示されるように、ＰＰＤ，ＴＭＰＤおよびＴＥＰＤに比してＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの蒸気圧は低く、具体的には、２５℃でのＴＥＰＤ，ＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの蒸気圧はそれぞれ４．２×１０-4mmHg、８．７×１０-9mmHg、１．３×１０-6mmHgおよび１．０×１０-9mmHgでありＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの蒸気圧はＴＥＰＤの蒸気圧に比べ、それぞれ、約１／５００００、約１／３００、約１／４２００００である。この結果より、ＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤはＰＰＤ，ＴＭＰＤおよびＴＥＰＤに比べ、乾燥（凍結乾燥、減圧乾燥、風乾等）性および乾燥体の安定性に優れることが解る。
【００８８】＜実験例２＞ＴＥＰＤ・２ＨＣｌ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ・２ＨＣｌ、ＴＤＨＰＤ・２ＨＣｌ、ＨＴＥＰＤ・２ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤ・２ＨＣｌおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体（以下、２ＨＣｌは省略）のサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）の測定前述の合成例１〜９で作製したＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体を、ｐＨ６．０の０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、５．０×１０-4Ｍの溶液を調製し、これらのＣＶを測定した。作用電極としてグラッシーカーボン電極（BIOANALYTICAL SYSTEMS 社製、ＭＦ２０１２）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極（BIOANALYTICAL SYSTEMS 社製、ＭＦ２０２０）、対向電極として白金線（BIOANALYTICAL SYSTEMS 社製）を、それぞれ用い、これらをポテンショスタットＨＡ−１５０（北斗電工社製）に接続した。さらに電極電位設定のためのファンクションジェネレーターＨＢ−１０４（北斗電工社製）および記録計を接続した。記録計からＧＰＩＢラインを通じてコンピュータへ接続し、計測およびデータ処理を行った。ＣＶ測定は、初期電位−５００mV（vs Ag/AgCl、以下同様）〜反転電位＋８００mV、あるいは初期電位−２００mV〜反転電位＋３００mVに設定し、いずれも５０mV/secの速度で電位掃引を行った。
【００８９】ＴＥＰＤの−５００mV〜＋８００mVの結果を図６に、−２００mV〜＋３００mVの結果を図７に、以下同様に、ＴＣＰＤの結果を図８および図９に、ＴＨＥＰＤの結果を図１０および図１１に、ＴＤＨＰＤの結果を図１２および図１３に、それぞれ示す。また、ＨＴＥＰＤの結果を図２５および図２６に、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの結果を図２７および図２８に、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの結果を図２９および図３０に、ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の結果を図３１および図３２に、同じく２置換体の結果を図３３および図３４に、同じく３置換体の結果を図３５および図３６に、それぞれ示す。
【００９０】図８〜図１３および図２５〜図３６のＣＶに示される様に、本発明の測定方法に使用されるＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体も、前述のＴＥＰＤ（図６および図７R>７）と同様に電極上で酸化還元可能な物質であることが示唆され、電気化学的な測定方法において、電子伝達物質として好適に利用可能であることが解る。さらに、図９R>９、図１１、図１３、図２６、図２８、図３０、図３２R>２、図３４および図３６に示されるように、これらの物質によれば、−２００mVから＋３００mVの電位幅で可逆的な酸化還元反応が行われていると考えられる。
【００９１】＜実験例３＞ＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の電子伝達活性の測定１グルコ−スオキシダ−ゼ（ＧＯＤ、ベ−リンガ−マンハイム社製）を、ｐＨ６．０の０．１ＭＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、０Ｍおよび４．０×１０-4Ｍの溶液を調製した。また、グルコース（純正化学社製）を同様の緩衝液に溶解し、１．５Ｍの溶液を調製した。さらに、合成例１〜９で合成したＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の各化合物を同様の緩衝液に溶解し、５．０×１０-3Ｍの溶液を調製した。これらの各溶液を、測定直前に下記の量比でｐＨ６．０の０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液中で混合し、下記に示される組成Ａおよび組成Ｂで示される溶液を作製し、ＧＯＤ存在下（組成Ａ）あるいは非存在下（組成Ｂ）での電流値を連続的に測定した。
【００９２】
組成Ａ────────────────────────────────── ＧＯＤ ４．０×１０-4Ｍ １００μＬ グルコ−ス １．５Ｍ １．０mL 化合物溶液 ５．０×１０-3Ｍ １．０mL ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ ７．９mL────────────────────────────────── 組成Ｂ────────────────────────────────── ＧＯＤ ０Ｍ １００μＬ グルコ−ス １．５Ｍ １．０mL 化合物溶液 ５．０×１０-3Ｍ １．０mL ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ ７．９mL──────────────────────────────────
【００９３】測定は、前述の実験例２と同様の装置で行い、測定時には＋３００mV（vs Ag/AgCl）の電位を作用極に印加し、ＧＯＤ存在下（組成Ａ）およびＧＯＤ非存在下（組成Ｂ）の電流値を電位印加後１０分間測定した。
【００９４】ＴＥＰＤの測定結果（ＧＯＤ−グルコ−ス−ＴＥＰＤ）を図１４に、ＴＣＰＤの測定結果（ＧＯＤ−グルコ−ス−ＴＣＰＤ）を図１５に、ＴＨＥＰＤの測定結果（ＧＯＤ−グルコ−ス−ＴＨＥＤＰ）を図１６に、ＴＤＨＰＤの測定結果（ＧＯＤ−グルコ−ス−ＴＤＨＰＤ）を図１７に、それぞれ示す。また、ＨＴＥＰＤの測定結果を図３７に、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの測定結果を図３８に、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの測定結果を図３９に、ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の測定結果を図４０に、同じく２置換体の測定結果を図４１に、同じく３置換体の測定結果を図４２に、それぞれ示す。
【００９５】図１４〜図１７および図３７〜図４２に示されるように、いずれの物質による測定でも、ＧＯＤを含有する場合（組成Ａ）には、含有しない場合（組成Ｂ）に比して酸化電流値が増大するので、本発明例のＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体は共に、従来例のＴＥＰＤと同様、ＧＯＤと電極間の可逆的な電子伝達物質としての機能を有することが明らかである。また、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤも、ＧＯＤと電極間の可逆的な電子伝達物質としての機能を有していた。
【００９６】＜実験例４＞ＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の電子伝達活性の測定２西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ、東洋紡社製）を、ｐＨ６．０の０．１ＭＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、０Ｍおよび５．０×１０-7Ｍの溶液を調製した。また、過酸化水素（和光純薬社製）を同様の緩衝液に溶解し、１．０×１０-1Ｍの溶液を調製した。さらに、合成例１〜９で合成したＴＥＰＤ、ＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の各化合物を同様の緩衝液に溶解し、５．０×１０-3Ｍの溶液を調製した。これらの各溶液を、測定直前に下記の量比でｐＨ６．０の０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸緩衝液中で混合し、下記に示される組成Ａおよび組成Ｂで示される溶液を作製し、ＨＲＰＯ存在下（組成Ａ）あるいは非存在下（組成Ｂ）での電流値を連続的に測定した。
【００９７】
────────────────────────────────── ＨＲＰＯ ５．０×１０-7Ｍ １００μＬ 過酸化水素 １．０×１０-1Ｍ １００μＬ 化合物溶液 ５．０×１０-3Ｍ １．０mL ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ ８．８mL────────────────────────────────── 組成Ｂ────────────────────────────────── ＨＲＰＯ ０Ｍ １００μＬ 過酸化水素 １．０×１０-1Ｍ １００μＬ 化合物溶液 ５．０×１０-3Ｍ １．０mL ０．１Ｍ ＮａＣｌ含有 ０．１Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ６．０ ８．８mL──────────────────────────────────
【００９８】測定は、前述の実験例２と同様の装置で行い、測定時には、ＴＥＰＤ、ＴＨＥＰＤおよびＴＤＨＰＤの場合−８０mV（vs Ag/AgCl 以下同様）の電位を、ＴＣＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体の場合−１５０mVの電位を、それぞれ作用極に印加し、ＨＲＰＯ存在下（組成Ａ）およびＨＲＰＯ非存在下（組成Ｂ）の電流値を電位印加後１０分間もしくは５分間測定した。
【００９９】ＴＥＰＤの測定結果（ＨＲＰＯ−過酸化水素−ＴＥＰＤ）を図１８に、ＴＣＰＤの測定結果（ＨＲＰＯ−過酸化水素−ＴＣＰＤ）を図１９に、ＴＨＥＰＤの測定結果（ＨＲＰＯ−過酸化水素−ＴＨＥＰＤ）を図２０２０に、ＴＤＨＰＤの測定結果（ＨＲＰＯ−過酸化水素−ＴＤＨＰＤ）を図２１に、それぞれ示す。また、ＨＴＥＰＤの測定結果を図４３に、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの測定結果を図４４に、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの測定結果を図４５に、ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の測定結果を図４６に、同じく２置換体の測定結果を図４７に、同じく３置換体の測定結果を図４８に、それぞれ示す。
【０１００】図１８〜図２１および図４３〜図４８に示されるように、いずれの物質もＨＲＰＯを含有する場合（組成Ａ）には、含有しない場合（組成Ｂ）に比して還元電流値が増大しており、本発明例のＴＣＰＤ、ＴＨＥＰＤ、ＴＤＨＰＤ、ＨＴＥＰＤ、Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤ、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤおよびｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の各置換体は共に、従来例のＴＥＰＤと同様、ＨＲＰＯと電極間の可逆的な電子伝達物質としての機能を有することが明らかである。また、Ｎ，Ｎ′−ＢＨＰＤも、ＨＲＰＯと電極間の可逆的な電子伝達物質としての機能を有していた。
【０１０１】＜実施例＞図２および図３に示される特異結合分析装置を作製し、それを用いて試料中のｈＣＧ濃度を測定した。まず、特異結合分析装置を作製するために、下記の各部材を作製した。
【０１０２】
【０１０３】一方、１００mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２０mg/mL 濃度に調製された西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ，東洋紡社製）溶液５００μＬを３０℃でゆっくり撹拌しながら、５０mMのスルホＳＭＣＣ（Pierce社製）５００μＬを添加して２０分間反応させた。反応後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−ＰＢで平衡化した Sephadex Ｇ−２５（ファルマシア社製）カラム（２．６φ×１５ｃｍ）を通して未反応のスルホＳＭＣＣを除去し、濃縮器CENTRIPREP−１０（Amicon社製）を用いて濃縮し、マレイミド化ＨＲＰＯを得た。得られたマレイミド化ＨＲＰＯの濃度は、４０３nmの吸光度から求めた。
【０１０４】１．２５×１０-8モルもしくは１．５６×１０-8モルのマレイミド化ＨＲＰＯ溶液に、それぞれ３倍モル量もしくは１／３倍モル量のＳＨ基導入抗ｈＣＧ抗体ＨＭ８１を添加混合後、窒素ガス雰囲気下、４℃で１２時間反応させた。次いで、それぞれ５０mMのシステアミン溶液５０μＬを添加し、窒素ガス雰囲気下、４℃にて６０分間反応させ、その後、窒素ガス置換したＥＤＴＡ−ＰＢで平衡化した ULTROGEL ＡｃＡ３４（ＩＢＦ Biotechnics社製）カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。２８０nmおよび４０３nmにおける吸光度測定を、ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出分画について行い、遊離の酵素を含まないＨＭ８１とＨＲＰＯとの結合体の分画を集めて濃縮した。得られた濃縮品（以下、ＨＲＰＯ−ＨＭ８１とする）は、Phast システムによる電気泳動（ファルマシア社製）で分子量を確認後、吸光度と酵素活性から含有される抗体および酵素量を決定し、後記する測定において酸化還元酵素標識抗体として用いた。
【０１０５】
【０１０６】
前述の合成例３で合成したＴＨＥＰＤをｐＨ ６．０の０．１Ｍ ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液に溶解し、５．０mMの溶液を調製した。次いで、ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社製）からパンチングして作製した直径１２mmの円形濾紙に上記溶液を１４０μＬ点着し、凍結乾燥を行い、本発明に対応する電子伝達物質含浸部１６となるＴＨＥＰＤの乾燥体を作製した。
【０１０７】
前述の合成例１で合成したＴＥＰＤをｐＨ６．０の１Ｍ ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液に溶解し、５．０mMの溶液を調製した。次いで、ガラス繊維濾紙（ＧＡ１００、アドバンテック東洋社製）からパンチングして作製した直径１２mmの円形濾紙に上記溶液を１４０μＬ点着し、凍結乾燥を行い、電子伝達物質含浸部１６となるＴＥＰＤの乾燥体を作製した。
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】ｈＣＧを認識するマウス単クローン性抗体ＨＭ２１（持田製薬社製）を０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム−０．０５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶解して、濃度を１．０mg/mL に調製した。この溶液を、ガラス板上で乾燥させた多孔性膜（１３mmφ）当たり２５μＬを中央部分から浸潤させた。室温で１時間反応させた後、多孔性膜を０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳ溶液２００mLに移し、振とう撹拌しながら、４℃で２日間ブロッキング反応した。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で３回洗浄し、さらにＰＢＳで７回洗浄し、乾燥して、マトリクス２２となる抗ｈＣＧ抗体（ＨＭ２１）不溶化多孔性セルロース混合エステル膜を得た。
【０１１１】
【０１１２】［発明例用装置の作製］以上のようにして作製した各部材を用い、ＭＥＤＩＡ法を利用した本発明の測定方法を実施するための図２および図３に示される測定装置を作製した。すなわち、アクリル製の下部基板２６に、前記
【０１１３】［比較例用装置の作製］前記
【０１１４】［全血中でのｈＣＧ測定］前述のように作製した前記発明例および比較例のｈＣＧ濃度測定用の特異結合分析装置を、前記実験例２と同様にしてポテンショスタット等の測定装置を接続した。他方、ヘパリン添加健常男性血液にｈＣＧを添加して、ｈＣＧ ０ＩＵ／Ｌ全血（Ａ）およびｈＣＧ １０００ＩＵ／Ｌ全血（Ｂ）を調製した。前記発明例および比較例で作製した特異結合分析装置のそれぞれに付き、溶液（Ａ）および溶液（Ｂ）のいずれかを、上部カバー１０の試料導入口１０ａを通じて、試料導入部３８に２６０μＬ導入した。試料点着時から３０秒経過後に、作用極を対極・参照極に対して−１５０mVとなるように電位設定し、電流値を記録した。発明例の結果を図２２に、比較例の結果を図２３に、それぞれ示す。
【０１１５】図２２に示されるように、電子伝達物質を保持する電子伝達物質含浸部１６としてＴＨＥＰＤ乾燥体を導入した発明例にかかる特異結合分析装置ではｈＣＧ濃度に依存して電流値は大きくなった。これに対し、電子伝達物質含浸部１６としてＴＥＰＤ乾燥体を導入した比較例の特異結合分析装置では、図２３に示されるように、ｈＣＧ濃度を高めても電流値は大きくはならなかった。これは、前述の実験例１でも示されたように、ＴＥＰＤは乾燥性および乾燥安定性が悪く、さらに試料中の妨害物質の影響を受けやすく、試料中での安定性が悪いために、上記態様では測定時に良好な電子伝達物質として作用することができなかったためであると考えられる。
【０１１６】この結果から、本発明の電子伝達物質を用いた装置によって試料中のｈＣＧ濃度の定量を簡便、迅速に行え、本発明の効果が明らかとなった。
【０１１７】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明の電気化学的測定方法および新規ｐ−フェニレンジアミン化合物によれば、酵素電極法あるいは例えばＭＥＤＩＡ法のような特異結合分析方法等の測定において、測定感度（応答性）が良好で、使い捨ての用途にも好適に利用することができ、しかも、試料が血液や尿等の妨害物質を含有するものであっても、常に安定して再現性の良好な測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）および（ｂ）は、それぞれ電子伝達物質の作用を説明するための模式図である。
【図２】本発明の電気化学的測定方法を実施する（特異結合）分析装置の一例を示す概略分解斜視図である。
【図３】図２に示される（特異結合）分析装置の組み立て状態の断面を概念的に示す図である。
【図４】図２に示される（特異結合）分析装置の電極部の概略平面図である。
【図５】ＴＥＰＤおよびＴＨＥＰＤの蒸気圧を示すグラフである。
【図６】ＴＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図７】ＴＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図８】ＴＣＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図９】ＴＣＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１０】ＴＨＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１１】ＴＨＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１２】ＴＤＨＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１３】ＴＤＨＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図１４】ＴＥＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図１５】ＴＣＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図１６】ＴＨＥＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図１７】ＴＤＨＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図１８】ＴＥＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図１９】ＴＣＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図２０】ＴＨＥＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図２１】ＴＤＨＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図２２】本発明の電子伝達物質を用いた実施例による測定結果を示すグラフである。
【図２３】従来の電子伝達物質を用いた測定方法による測定結果を示すグラフである。
【図２４】ＰＰＤ，ＴＭＰＤ，ＴＥＰＤ，ＴＣＰＤ，ＴＨＥＰＤ，ＴＤＨＰＤの２５℃における蒸気圧を示すグラフである。
【図２５】ＨＴＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図２６】ＨＴＥＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図２７】Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図２８】Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図２９】Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３０】Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤのサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３１】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３２】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３３】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の２置換体のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３４】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の２置換体のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３５】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の３置換体のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−５００ｍＶ〜＋８００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３６】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の３置換体のサイクリックボルタンメトリー（電位走査範囲−２００ｍＶ〜＋３００ｍＶ）を示すグラフである。
【図３７】ＨＴＥＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図３８】Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図３９】Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの電子伝達活性を示すグラフである。
【図４０】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の電子伝達活性を示すグラフである。
【図４１】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の２置換体の電子伝達活性を示すグラフである。
【図４２】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の３置換体の電子伝達活性を示すグラフである。
【図４３】ＨＴＥＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４４】Ｎ，Ｎ−ＢＨＤＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４５】Ｎ，Ｎ′−ＢＨＤＰＤの電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４６】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の１置換体（ＨＰＰＤ）の電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４７】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の２置換体の電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【図４８】ｐ−フェニレンジアミンとプロピレンオキサイドとの反応で生成したＮ原子上の３置換体の電子伝達活性の別の例を示すグラフである。
【符号の説明】
１０ 上部カバー
１０ａ 試料導入口
１２ フィルター
１４ 標識体含浸部
１６ 電子伝達物質含浸部
１６ａ，２４ａ シール部
１８ 連通部材
２０ 電極部
２２ マトリクス
２４ シール部
２６ 下部基板
２８ 基板
３０ 貫通孔
３２ 参照極
３４ 作用極
３６ 絶縁部
３８ 試料導入部
【特許請求の範囲】
【請求項１】少なくとも１つの酸化還元酵素を用いて液性試料中の分析対象物を測定する測定方法において、その測定系に酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を配し、前記電子伝達物質として、下記式［Ｉ］で示される化合物またはその塩を用いることを特徴とする電気化学的測定方法。
【化１】
（上記式［Ｉ］中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示す。但し、上記式［Ｉ］において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有する。また、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、同一であっても互いに異なるものであってもよい。）
【請求項２】前記式［Ｉ］が、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を有する請求項１に記載の電気化学的測定方法。
【請求項３】前記式［Ｉ］が下記化合物およびその塩より選ばれる少なくとも１つである請求項１または２に記載の電気化学的測定方法。
【化２】
【請求項４】前記分析対象物が前記酸化還元酵素の基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビターであり、この基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビター量に応じて生じる酵素反応の変調を前記電極における電気化学的信号の変調として検出する請求項１〜３のいずれかに記載の電気化学的測定方法。
【請求項５】前記分析対象物に対する特異結合物質を少なくとも一種用い、前記酸化還元酵素を標識物質として用いた特異結合反応によって、前記分析対象物を測定する請求項１〜３のいずれかに記載の電気化学的測定方法。
【請求項６】前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部において信号を発する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させてから、前記マトリクスに導入する；ことにより、前記酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物との複合体、酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物と第１の特異結合物質との複合体、あるいは複合体を形成していない酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質のうち、少なくとも１つの分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出する請求項５に記載の電気化学的測定方法。
【請求項７】前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、前記分析対象物に対する特異結合物質、あるいは特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のいずれか一方が、前記電極で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識されており、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させてから、前記マトリクスに導入する；ことにより、前記特異結合物質と分析対象物との複合体、特異結合物質と特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質との複合体、複合体を形成していない特異結合物質、あるいは複合体を形成していない特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のうち、少なくとも１つの酸化還元酵素で標識された分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出する請求項５に記載の電気化学的測定方法。
【請求項８】下記化学式で示される化合物またはその塩。
【化３】
【請求項９】下記化学式で示される化合物またはその塩。
【化４】
【請求項１０】少なくとも１つの酸化還元酵素を用いて液性試料中の分析対象物を測定する測定方法において、その測定系に酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を配し、前記電子伝達物質として、下記式［II］で示される化合物またはその塩を用いることを特徴とする電気化学的測定方法。
【化５】
（上記［II］中、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、水素原子または、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示す。但し、上記式［II］において、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は同一でも異なってもよいが、そのうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有するアルキル基であり、少なくとも一つは水素原子である。）
【請求項１１】前記式［II］が、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基を有する請求項１０に記載の電気化学的測定方法。
【請求項１２】前記分析対象物が前記酸化還元酵素の基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビターであり、この基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビター量に応じて生じる酵素反応の変調を前記電極における電気化学的信号の変調として検出する請求項１０〜１１のいずれかに記載の電気化学的測定方法。
【請求項１３】前記分析対象物に対する特異結合物質を少なくとも一種用い、前記酸化還元酵素を標識物質として用いた特異結合反応によって、前記分析対象物を測定する請求項１０〜１１のいずれかに記載の電気化学的測定方法。
【請求項１４】前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部において信号を発する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させてから、前記マトリクスに導入する；ことにより、前記酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物との複合体、酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物と第１の特異結合物質との複合体、あるいは複合体を形成していない酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質のうち、少なくとも１つの分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出する請求項１３に記載の電気化学的測定方法。
【請求項１５】前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、前記分析対象物に対する特異結合物質、あるいは特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のいずれか一方が、前記電極で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識されており、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させてから、前記マトリクスに導入する；ことにより、前記特異結合物質と分析対象物との複合体、特異結合物質と特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質との複合体、複合体を形成していない特異結合物質、あるいは複合体を形成していない特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のうち、少なくとも１つの酸化還元酵素で標識された分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出する請求項１３に記載の電気化学的測定方法。
【請求項１】少なくとも１つの酸化還元酵素を用いて液性試料中の分析対象物を測定する測定方法において、その測定系に酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を配し、前記電子伝達物質として、下記式［Ｉ］で示される化合物またはその塩を用いることを特徴とする電気化学的測定方法。
【化１】
（上記式［Ｉ］中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示す。但し、上記式［Ｉ］において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有する。また、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は、同一であっても互いに異なるものであってもよい。）
【請求項２】前記式［Ｉ］が、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を有する請求項１に記載の電気化学的測定方法。
【請求項３】前記式［Ｉ］が下記化合物およびその塩より選ばれる少なくとも１つである請求項１または２に記載の電気化学的測定方法。
【化２】
【請求項４】前記分析対象物が前記酸化還元酵素の基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビターであり、この基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビター量に応じて生じる酵素反応の変調を前記電極における電気化学的信号の変調として検出する請求項１〜３のいずれかに記載の電気化学的測定方法。
【請求項５】前記分析対象物に対する特異結合物質を少なくとも一種用い、前記酸化還元酵素を標識物質として用いた特異結合反応によって、前記分析対象物を測定する請求項１〜３のいずれかに記載の電気化学的測定方法。
【請求項６】前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部において信号を発する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させてから、前記マトリクスに導入する；ことにより、前記酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物との複合体、酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物と第１の特異結合物質との複合体、あるいは複合体を形成していない酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質のうち、少なくとも１つの分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出する請求項５に記載の電気化学的測定方法。
【請求項７】前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、前記分析対象物に対する特異結合物質、あるいは特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のいずれか一方が、前記電極で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識されており、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させてから、前記マトリクスに導入する；ことにより、前記特異結合物質と分析対象物との複合体、特異結合物質と特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質との複合体、複合体を形成していない特異結合物質、あるいは複合体を形成していない特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のうち、少なくとも１つの酸化還元酵素で標識された分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出する請求項５に記載の電気化学的測定方法。
【請求項８】下記化学式で示される化合物またはその塩。
【化３】
【請求項９】下記化学式で示される化合物またはその塩。
【化４】
【請求項１０】少なくとも１つの酸化還元酵素を用いて液性試料中の分析対象物を測定する測定方法において、その測定系に酸化還元酵素、電子伝達物質、および前記電子伝達物質と電子移動可能な電極を配し、前記電子伝達物質として、下記式［II］で示される化合物またはその塩を用いることを特徴とする電気化学的測定方法。
【化５】
（上記［II］中、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は、水素原子または、それぞれ置換基を有してもよい炭素数１ないし４の直鎖もしくは分枝鎖を有するアルキル基を示す。但し、上記式［II］において、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 は同一でも異なってもよいが、そのうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有するアルキル基であり、少なくとも一つは水素原子である。）
【請求項１１】前記式［II］が、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ7 およびＲ8 のうち少なくとも１つは、ヒドロキシル基を有する請求項１０に記載の電気化学的測定方法。
【請求項１２】前記分析対象物が前記酸化還元酵素の基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビターであり、この基質、補因子、アクチベータあるいはインヒビター量に応じて生じる酵素反応の変調を前記電極における電気化学的信号の変調として検出する請求項１０〜１１のいずれかに記載の電気化学的測定方法。
【請求項１３】前記分析対象物に対する特異結合物質を少なくとも一種用い、前記酸化還元酵素を標識物質として用いた特異結合反応によって、前記分析対象物を測定する請求項１０〜１１のいずれかに記載の電気化学的測定方法。
【請求項１４】前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、第１の特異結合物質および電極部において信号を発する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質とを反応させてから、前記マトリクスに導入する；ことにより、前記酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物との複合体、酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質と分析対象物と第１の特異結合物質との複合体、あるいは複合体を形成していない酸化還元酵素で標識された第２の特異結合物質のうち、少なくとも１つの分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出する請求項１３に記載の電気化学的測定方法。
【請求項１５】前記分析対象物を含有することが予想される液性試料が展開される領域であるマトリクス、前記マトリクスに試料を導入する試料導入部、および前記マトリクスに実質的に接した電極を有する装置を用い、前記分析対象物に対する特異結合物質、あるいは特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のいずれか一方が、前記電極で信号を発生する電子伝達物質種を生成できる酸化還元酵素で標識されており、試料を前記試料導入部に導入し、前記マトリクス内で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させる；あるいは、前記マトリクス外で、前記試料中の分析対象物と、特異結合物質および特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質とを競合的に反応させてから、前記マトリクスに導入する；ことにより、前記特異結合物質と分析対象物との複合体、特異結合物質と特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質との複合体、複合体を形成していない特異結合物質、あるいは複合体を形成していない特異結合物質に対して分析対象物と競合する物質のうち、少なくとも１つの酸化還元酵素で標識された分子種の分布を変化させ、試料中の分析対象物量に対応する前記分布変化を、酸化還元酵素によって生成する電子伝達物質種の物質移動に律速される電極における信号の変調として検出する請求項１３に記載の電気化学的測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２６】
【図２８】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２２】
【図３４】
【図３６】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２３】
【図３０】
【図３２】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図２９】
【図３１】
【図３３】
【図３５】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図２】
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【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２６】
【図２８】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２２】
【図３４】
【図３６】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２３】
【図３０】
【図３２】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図２９】
【図３１】
【図３３】
【図３５】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【公開番号】特開平７−２３４２０１
【公開日】平成７年（１９９５）９月５日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平６−３３８６２６
【出願日】平成６年（１９９４）１２月２９日
【出願人】（０００１８１１４７）持田製薬株式会社 (62)
【公開日】平成７年（１９９５）９月５日
【国際特許分類】
【出願日】平成６年（１９９４）１２月２９日
【出願人】（０００１８１１４７）持田製薬株式会社 (62)
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