電気穿孔により送達されるＤＮＡワクチンにより誘導される抗体の産生
哺乳類の細胞に抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、該哺乳類に組換え抗原に対する該抗体を生成する方法であって、プロモータに操作可能に連結されたコード配列を含むＤＮＡプラスミドを該哺乳類の組織に注入するステップと、該ＤＮＡプラスミドの進入および該抗原の発現を可能にするように、該組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて、該組織を電気穿孔するステップと、該抗原に抗体を発生させるために、該哺乳類が該発現抗原に反応することを可能にするステップとを含む前記方法を提供する。さらに、所望の抗原に対して特異的な抗体を単離する方法であって、該抗体が、該抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、哺乳類内で生成される、方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１１月１４日に出願された米国仮出願第６０／９８８，０１２号、および２００７年１１月１６日に出願された米国仮出願第６０／９８８，７７３号の利益を主張し、参照により両方の内容が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
筋肉内または皮内経路で送達される裸ＤＮＡワクチンは、抗体およびＴ細胞反応の両方を感作するが、反応レベルは、しばしば、かなり低い。該低反応は、関心対象の生理学的部位への、および細胞による取り込み速度の両方の非効率的なプラスミド送達の結果であると考えられている。
【０００３】
生体内電気穿孔手法は、対象へのＤＮＡワクチンの送達の補助に利用可能である。しばしば、電気穿孔手法を使用するＤＮＡワクチン接種は、一定の電圧の電気穿孔器を利用し、このような機器は、組織抵抗を考慮せず、したがって、非最適なプラスミド発現、炎症を生じ得、および組織損傷を可能性として生じ得る。
【０００４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンの分野において、高力価中和抗体および広範なＴ細胞免疫を誘導できる予防的なＨＩＶ−１ワクチンの発見は、難しい。免疫システムの両部門がＨＩＶ−１疾患進行の制御に不可欠であることが見出されたことを考えれば（Ｐａｎｔａｌｅｏ ａｎｄ Ｆａｕｃｉ，１９９６；Ｓｏｕｄｅｙｎｓ ａｎｄ Ｐａｎｔａｌｅｏ，１９９９）、それらの誘導は、依然として、多くのワクチン研究および開発努力の主要な必要条件である。過去の報告は、多価のＨＩＶ−１ ＤＮＡプライム／タンパク質追加免疫ワクチン戦略を使用した、抗体およびＴ細胞反応の誘導を示すマウス、ウサギ、およびヒト以外の霊長類を用いた研究の結果を考察している。（Ｃｒｉｓｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００６、 Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）これらの研究ならびに他の報告による所見（Ａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｂａｒｏｕｃｈ ａｎｄ Ｌｅｔｖｉｎ，２０００、Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ，２００３、Ｒｅｙｅｓ−Ｓａｎｄｏｖａｌ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｓａｎｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｓｕｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）から、筋肉内または皮内投与経路を介して送達されるＤＮＡ免疫化は、測定可能だが、弱い抗体およびＴ細胞反応を誘導し、したがって、免疫の追加免疫を必要とすることが示された。アジュバント製剤組換えタンパク質の使用により、ＤＮＡワクチンにより感作された体液性および細胞性免疫反応の両方がさらに増大することが示された（Ｃｒｉｓｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）。
【０００５】
ＤＮＡ免疫化による免疫学的感作を増大するために、ＤＮＡ投与量およびスケジュール、アジュバントおよび免疫調節薬の同時投与、ならびに免疫化戦略および送達経路の変更を含む、いくつかのパラメータが調査されている。このような研究は、プラスミドＤＮＡ発現の増大、ならびにＨＩＶ−１ワクチン、肝炎Ｂウイルスワクチン、天然痘ワクチン、および結核ワクチンを使用した体液性および細胞性感作の増大に、電気穿孔技術の利用を強調してきた。いくつかの電気穿孔プラットホームが試験されて、大いに有望なデータを作成したが、これらの研究は、プラスミド送達を容易にするために、一定の電圧の電気穿孔器を使用したが、これは、結果的に免疫保護成果に満たない。
【０００６】
２００７年１１月上旬にオンラインで公開されたとして知られるＣｕｒｃｉｏらのＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００７）の表題「ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｆｆｏｒｄｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ−ｐｒｏｎｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ」は、ＤＮＡ送達方法を容易にする電気穿孔の使用、およびマウスにおけるＥｒｂＢ−２、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体の生成を論じている。
【０００７】
強い免疫反応を誘導し、中性抗体を含む抗体も生成することができる、哺乳類にウイルス抗原を発現するＤＮＡプラスミドの送達方法の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の態様は、哺乳類の細胞に抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、該哺乳類に該組換え抗原に対する抗体を生成する方法を含む。これらの方法は、プロモータに操作可能に連結されるコード配列を含むＤＮＡプラスミドを該哺乳類の組織に注入するステップと、該ＤＮＡプラスミドの進入および該抗原の発現を可能にするために、該組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて、該組織を電気穿孔するステップと、該抗原に対する抗体を生成するために、該哺乳類が該発現抗原に反応できるステップと、を含む。好ましくは、該組換え抗原は、ウイルス性抗原である。いくつかの実施形態において、該方法は、該抗原が癌抗原ではないことを条件とする。
【０００９】
別の態様において、所望の抗原に対して特異的な抗体を単離する方法があり、該抗体は、該哺乳類の細胞に該抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、哺乳類に生成される。これらの方法は、プロモータに操作可能に連結されるコード配列を含むＤＮＡプラスミドを該哺乳類の組織に注入するステップと、該ＤＮＡプラスミドの進入および該抗原の発現を可能にするために、該組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて、該組織を電気穿孔するステップと、該抗原に対する抗体を生成するために、該哺乳類が該発現抗原に反応できるステップと、該哺乳類から血清を採取するステップと、該血清から該抗体を抽出するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、抽出された抗体を精製するさらなるステップがある。好ましくは、該組換え抗原は、ウイルス性抗原である。いくつかの実施形態において、該方法は、該抗原が癌抗原ではないことを条件とする。
【００１０】
本発明の多くの目的および利点は、添付の図面を参照することにより、当業者により良く理解され得る。
【００１１】
好適な実施形態の詳細な説明
以下の省略または短縮された定義は、本発明の好適な実施形態の理解を補助するために提供される。本明細書に提供される省略された定義は、網羅的でもなければ、当該分野で理解される定義または辞書の意味に矛盾するものでもない。省略された定義は、本明細書で補助的に提供されるか、または当該分野で周知の定義をより明確に定義する。
【００１２】
「一定の電流」という用語は、本明細書で、同一の組織に送達される電気パルスの継続時間にわたって、組織または該組織を定義する細胞が受ける、または経験する電流を定義するために使用される。電気パルスは、本明細書に記述される電気穿孔装置から送達される。本電流は、本明細書で提供される電気穿孔装置がフィードバック要素を有するため、好ましくは、瞬時のフィードバックを有するため、電気パルスの寿命にわたって該組織に一定のアンペアに維持される。フィードバック要素は、パルスの継続時間中、組織（または細胞）の抵抗を測定でき、同一の組織の電流が、電気パルスにわたって（マイクロ秒程度）、およびパルスからパルスまで一定を維持するように、電気穿孔装置は、その電気エネルギー出力（例えば、電圧の増大）を変化させる。いくつかの実施形態において、該フィードバック要素は、制御器を備える。
【００１３】
「フィードバック」または「電流フィードバック」という用語は、互換的に使用され、かつ、結果的に、標的組織全体にわたって一定レベルで電流を保持するように電極間の組織の電流を測定し、ＥＰ装置により送達されるエネルギー出力を変化させることを含む、提供されたＥＰ装置の活性反応を意味する。本一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気的処理の開始前に、ユーザにより事前設定される。好ましくは、その電気回路が、電極間の組織の電流を継続的に監視でき、監視された電流（または組織内の電流）を事前設定の電流と比較でき、監視される電流を事前設定レベルに維持するために継続的にエネルギー出力調整を行うことができるように、フィードバックは、電気穿孔構成要素、例えば、ＥＰ装置の制御器により達成される。いくつかの実施形態において、フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックのため、瞬時である。
【００１４】
本明細書で互換的に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「動電強化」（「ＥＰ」）という用語は、生体膜に顕微鏡的経路（管孔）を誘導するために、膜貫通電界パルスの使用を意味する。これらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、鉄および水等の生体分子が、細胞膜の一側から他側に通過することを可能にする。
【００１５】
「分散電流」という用語は、本明細書で記述される電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを定義するために使用され、該パターンは、電気穿孔される組織の任意の領域にかかる電気穿孔に関連した熱ストレスの発生を最小化、好ましくは、除去する。
【００１６】
本明細書で使用される「フィードバック機構」という用語は、所望の組織のインピーダンス（エネルギーのパルスの送達前、送達中および／または送達後）を受け取り、現在値、好ましくは、電流と比較し、現在値を達成するために、送達されたエネルギーのパルスを調整する、ソフトウエアまたはハードウエア（またはファームウエア）のいずれかにより実行されるプロセスを意味する。「インピーダンス」という用語は、本明細書で、フィードバック機構を論ずる時に使用され、オームの法則に従う電流値に変換され、したがって、事前設定電流と比較できる。好適な実施形態において、「フィードバック機構」は、アナログ閉ループ回路により実行される。
【００１７】
本発明の態様は、哺乳類の細胞に抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、該哺乳類に該組換え抗原に対する抗体を生成する方法を含む。これらの方法は、プロモータに操作可能に連結されるコード配列を含むＤＮＡプラスミドを該哺乳類の組織に注入するステップと、該ＤＮＡプラスミドの進入および該抗原の発現を可能にするために、該組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて、該組織を電気穿孔するステップと、該抗原に対する抗体を生成するために、該哺乳類が該発現抗原に反応できるステップと、を含む。好ましくは、組換え抗原は、ウイルス性抗原である。いくつかの実施形態において、該方法は、抗原が癌抗原ではないこと条件とする。
【００１８】
別の態様において、所望の抗原に対して特異的な抗体を単離する方法があり、該抗体は、該哺乳類の細胞に該抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、哺乳類に生成する。これらの方法は、プロモータに操作可能に連結されるコード配列を含むＤＮＡプラスミドを該哺乳類の組織に注入するステップと、該ＤＮＡプラスミドの進入および該抗原の発現を可能にするために、該組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて、該組織を電気穿孔するステップと、該抗原に対する抗体を生成するために、該哺乳類が該発現抗原に反応できるステップと、該哺乳類から血清を採取するステップと、血清から該抗体を抽出するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、抽出された抗体を精製するさらなるステップがある。好ましくは、該組換え抗原は、ウイルス性抗原である。いくつかの実施形態において、該方法は、該抗原が癌抗原ではないことを条件とする。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドの注入ステップ、組織の電気穿孔ステップ、および該哺乳類の反応可能ステップを、同一の哺乳類において後日繰り返す、さらなるステップがある。さらに、いくつかの実施例では、この繰り返しステップは、別の後日にさらに繰り返されてもよい。いくつかの実施形態において、後日（つまり、前のＤＮＡプラスミド注入から後日）、同一の哺乳類に抗原のタンパク質追加免疫（言い換えれば、タンパク質変形）を送達する追加のステップがある。
【００２０】
いくつかの実施形態において、注入ステップは、哺乳類の皮内または筋肉内組織への注入を含む。
【００２１】
本明細書で提供される抗体は、ＤＮＡプラスミドが注入された該哺乳類の体液性免疫系により産生される抗体である。該抗体は、該ＤＮＡプラスミドから発現される組換え抗原に特異的である。該抗体は、多くの存在するアイソタイプの１つであってもよいが、好ましくは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプ、より好ましくは、ＩｇＧ２ａアイソタイプである。本明細書で提供される方法を使用して、該哺乳類により産生される抗体は、Ｌｅｅｎａａｒｓ，Ｍ． ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，Ｃ．Ｆ．Ｍ．，Ｉｎｓｔ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓ．４６（３）（２００５）に記述されるものを含む、当業者に利用可能な既知の手法を使用して抽出、および精製される。処理された哺乳類により生成される抗体を単離するステップは、該哺乳類から血清を採取するステップと、該採取した血清から抗体を抽出するステップと、を含む。いくつかの例において、該ステップは、該抽出した抗体を精製するステップを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、該組換え抗原は、免疫原性として同定されるタンパク質の抗原部分であり、該タンパク質は、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）のタンパク質構成成分である。同一のコード配列を送達する他のビヒクルも除外されないが、該組換え抗原は、好ましくは、例えば、哺乳類細胞の最終的なトランスフェクションおよび哺乳類細胞からの発現のためのｐＶＡＸ等のＤＮＡベクターにクローン化されるコード配列の形態である。いくつかの実施形態において、該組換え抗原は、包括的な一覧ではないが、以下から選択される免疫原性抗原である：１つもしくは複数のサブタイプからのＤＩＩＩドメイン抗原等のデングウイルス、ＨＡ、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質、キメラＭ２ｅ−ＮＰ等のインフルエンザウイルス、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ等のＨＩＶウイルス、カプシドタンパク質の一部等のウエストナイルウイルス、および他のウイルスタンパク質。
【００２３】
いくつかの実施形態において、電気穿孔は、ＤＮＡプラスミドが送達される哺乳類の電気穿孔細胞に、電気パルスを送達できる電気穿孔装置により実施される。好ましい電気穿孔装置は、本明細書に記述され、参照による援用によって、さらに含まれる。好ましくは、電気穿孔装置は、好ましくは、パルス継続時間中、一定の電流を提供する、一定電流電気穿孔装置である。好適な電気穿孔装置は、以下の電流範囲の電気パルスを送達できる：約０．０１Ａｍｐ〜約１０．０Ａｍｐ、約０．０１Ａｍｐ〜約５．０Ａｍｐ、約０．０１Ａｍｐ〜約３．０Ａｍｐ、約０．０１Ａｍｐ〜約１．０Ａｍｐ、約０．０５Ａｍｐ〜約１０．０Ａｍｐ、約０．０５Ａｍｐ〜約５．０Ａｍｐ、約０．０５Ａｍｐ〜約３．０Ａｍｐ、約０．０５Ａｍｐ〜約１．０Ａｍｐ、約０．１Ａｍｐ〜約１０．０Ａｍｐ、約０．１Ａｍｐ〜約５．０Ａｍｐ、約０．１Ａｍｐ〜約３．０Ａｍｐ、約０．１Ａｍｐ〜約１．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約１０．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約８．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約５．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約４．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約３．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約２．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ、または約２．０Ａｍｐ。
【００２４】
いくつかの実施形態において、電気穿孔装置により送達される電気パルスのパルスパターンは、特に選択され、以下のパラメータを含む：パルスの数、パルス間の時間、およびパルスの長さ。パルスの数は、１つ以上であってもよく、好ましくは、２つまたは３つのパルス、より好ましくは、３つのパルスである。いくつかの実施形態において、電気パルスの送達中のパルス間に遅延時間があり、好ましくは、遅延時間は、約１０秒、約９秒、約８秒、約７秒、約６秒、約５秒、約４秒、約３秒、約２秒、約１秒、約０．８秒、約０．５秒、または約０．２秒、より好ましくは、遅延時間は、約１秒である。各パルスの継続時間は、約０．１ミリ秒〜約１０秒、好ましくは、約１ミリ秒〜約１００ミリ秒〜約１ミリ秒〜約８０ミリ秒〜約１ミリ秒〜約６０ミリ秒〜約１ミリ秒〜約４０ミリ秒〜約１ミリ秒〜約２０ミリ秒、より好ましくは、約５２ミリ秒である。
【００２５】
ＤＮＡプラスミドは、該ＤＮＡプラスミドが電気穿孔後に進入すると、哺乳類細胞で発現できる組換え抗原のコード配列を含むものである。好ましくは、該コード配列は、標的哺乳類で免疫反応を引き起こす共通抗原である。いくつかの実施形態において、該コード配列は、以下の１つもしくは複数を含むことができる哺乳類発現のために最適化されたコンストラクトである：コザック配列の追加、コドン最適化、およびＲＮＡ最適化を含む。いくつかの実施形態において、これらの最適化されたコード配列は、ｐＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化されてもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態において、該ＤＮＡプラスミドは、好ましくは、高収率および／ｃＧＭＰ生産のために強化されるプロセスを使用して、大規模な量で生産されてもよい。好ましくは、哺乳類への送達のために生産されるＤＮＡプラスミドは、高ＤＮＡ濃度に製剤化されてもよい。ＤＮＡプラスミド生産プロセスは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞等の菌細胞のトランスフェクションにより実施されてもよい。本明細書で記述するＤＮＡプラスミド生産を考慮するプロセスは、米国特許第７，２３８，５２２号に開示されたプロセス、および第１２／１２６，６１１号（まだ公開されていないが、２００８年５月２３日出願）を有する米国特許出願において改善されたプロセスを含み、両方ともその全体が本明細書に援用される。該ＤＮＡプラスミドは、好ましくは、哺乳類対象への注入のために、安全で効果的であるように製剤化される。好ましくは、該ＤＮＡプラスミドは、濃縮形態で製剤化される。
【００２７】
電気穿孔および電気穿孔装置
本発明のＤＮＡワクチンの送達を容易にするための好適な電気穿孔装置および電気穿孔方法の実施例は、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらの米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されるものを含み、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。また、その全てが本明細書に援用される、２００６年１０月１７日に出願された米国仮特許第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された第６０／９７８，９８２号への３５ ＵＳＣ １１９（ｅ）の下に利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属および共同所有される米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供される、ＤＮＡワクチンの送達を容易にするための電気穿孔装置および電気穿孔方法も、好適である。
【００２８】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらの米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を容易にするためのモジュラ電極システムおよびそれらの使用を記載している。該モジュラ電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な一定電流パルス制御器から複数の針電極に導電連結を提供する電気コネクタ、および電源を含む。操作者は、支持構造に搭載される複数の針電極を把持でき、これらを身体または植物の選択された組織にしっかり挿入できる。生体分子は、それから、皮下針を介して、選択された組織に送達される。プログラム可能な一定電流パルス制御器が起動され、一定電流パルスが複数の針電極に適用される。適用される一定電流電気パルスは、複数の電極間で、細胞への生体分子の導入を容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照により本明細書に援用される。
【００２９】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に容易にするために使用され得る電気穿孔装置を記載している。該電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアにより特定される動電装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、ユーザコントロールおよびパルスパラメータの入力に基づくアレイの電極間で、一連のプログラム可能な一定電流パルスパターンを作製し、電流の波形データの保存および取得を可能にする。該電気穿孔装置は、針電極のアレイ、挿入針用の中央注入チャネル、および脱着可能なガイドディスクを有する、交換可能な電極ディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容が、参照により本明細書に援用される。
【００３０】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイおよび方法は、筋肉等の組織だけでなく他の組織または臓器への深部進入に適応される。電極アレイの配置のため、（選択の生体分子を送達するための）注入針は、また、標的臓器に完全に挿入され、挿入は、電極により事前に示される領域の標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは、長さが２０ｍｍで、ゲージが２１である。
【００３１】
以下は、本発明の方法の実施例であり、上で論じた特許参考文献に詳細に論じられている。電気穿孔装置は、ユーザにより入力された事前設定電流に類似する一定電流を発生するエネルギーのパルスを、哺乳類の所望の組織に送達するように構成されてもよい。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含む。電気穿孔構成要素は、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスター、波形記録計、入力要素、状態報告要素、通信ポート、記憶構成要素、電源、および電源スイッチを含む、１つもしくは複数の電気穿孔装置の様々な要素を含み、組み込むことが可能である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の一要素として機能可能であり、他の要素は、電気穿孔構成要素と連通する別の要素（または構成要素）である。いくつかの実施形態において、電気穿孔構成要素は、まだ電気穿孔構成要素から離れた他の電気穿孔装置の要素と連通してもよい、一要素以上の電気穿孔装置として機能できる。本発明は、要素が、一装置として、または互いに連通する別の要素として機能できるため、１つの電気機械的または機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素により制限されない。電気穿孔構成要素は、所望の組織に一定電流を生じるエネルギーのパルスの送達が可能であり、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置に複数の電極を有する電極アレイを含み、該電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からエネルギーのパルスを受け取り、電極を通して所望の組織にそれらを送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中、中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定し、電気穿孔構成要素にインピーダンスを伝達する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取ることができ、一定電流を保持するように、電気穿孔構成要素により送達されるエネルギーのパルスを調節できる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパスルを送達できる。いくつかの実施形態において、複数の電極は、プログラム化シークエンス下で、電極の制御により分散パターンでエネルギーのパルスを送達でき、該プログラム化シークエンスは、ユーザにより、電気穿孔構成要素に入力される。いくつかの実施形態において、プログラム化シークエンスは、連続的に送達される複数のパルスを含み、該複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する中性電極とともに少なくとも２つの活性電極により送達され、該複数のパルスの後続のパルスは、インピーダンスを測定する中性電極とともに少なくとも２つの活性電極の異なる１つにより送達される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアにより実行される。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実行される。好ましくは、本フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓ毎に生じるが、好ましくは、リアルタイムフィードバックまたは瞬時（つまり、反応時間を決定するための利用可能な手法により決定されるように、実質的に瞬時）である。いくつかの実施形態において、中性電極は、所望の組織のインピーダンスを測定し、フィードバック機構にインピーダンスを伝達し、フィードバック機構がインピーダンスに反応し、事前設定の電流に類似する値で一定電流を保持するように、エネルギーのパルスを調節する。いくつかの実施形態において、フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達中、継続的かつ瞬時に一定電流を保持する。
【００３４】
ワクチンおよび製剤
医薬的に許容される賦形剤は、公衆に周知で、容易に入手可能である、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤等の機能分子を含むことができる。好ましくは、該医薬的に許容される賦形剤は、アジュバントまたはトランスフェクション促進剤である。いくつかの実施形態において、核酸分子、またはＤＮＡプラスミドは、ポリヌクレオチド機能賦活薬または遺伝的ワクチン促進剤（またはトランスフェクション促進剤）の投与と併用して細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能賦活薬は、米国特許第５，５９３，９７２号、および１９９４年１月２６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に援用される。遺伝的ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日に出願された、米国特許第０２１，５７９号に記載されており、参照により本明細書に援用される。トランスフェクション促進剤は、核酸分子を有する混合物として核酸分子と併用して投与されるか、または核酸分子の投与前または後に、別々に、同時に投与されてもよい。トランスフェクション促進剤の実施例は、免疫感作複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、およびスクアランとスクアレン等の小胞を含み、およびヒアルロン酸も、遺伝的コンストラクトとの併用投与に使用され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドワクチンは、リピド、ＤＮＡリポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照）として、当該分野で周知のレシチンリポソームもしくは他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤等を含むトランスフェクション促進剤も含み得る。好ましくは、該トランスフェクション促進剤は、ポリＬグルタミンを含むポリアニオン、ポリカチオン、またはリピドである。
【００３５】
いくつかの好適な実施形態において、ＤＮＡプラスミドは、このような標的タンパク質に対して免疫反応をさらに強化するタンパク質の遺伝子であるアジュバントとともに送達される。このような遺伝子の実施例は、αインターフェロン、γインターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびシグナル配列が削除され、任意にＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５等の他のサイトカインおよびリンホカインをコードする遺伝子である。有用であり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌ、ＭＩＰ−１、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン反応遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能的フラグメントをコードする遺伝子を含む。
【００３６】
本発明に従う医薬的組成物は、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、好ましくは、約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、より好ましくは、約１ミリグラム〜約２ミリグラムのＤＮＡ量を含む。いくつかの好適な実施形態において、本発明に従う医薬的組成物は、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。
【００３７】
本発明に従う医薬的組成物は、使用される投与形態に従い、製剤化される。医薬的組成物が、注射用医薬的組成物の場合、これらは、無菌で、発熱物質不含、および微粒子不含である。好ましくは、等張製剤が使用される。一般的に、等張性添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張液が好まれる。安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。いくつかの実施形態において、ＬＧＳまたは他のポリカチオンもしくはポリアニオン等の、長期間、室温つまり周囲温度で安定する製剤を可能にする安定剤が、製剤に添加される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、コンセンサスインフルエンザ抗原に対して、哺乳類に免疫反応を誘導する方法は、粘膜免疫反応の誘導方法を含む。このような方法は、上述の共通インフルエンザ抗原を含むＤＮＡプラスミドと併用して、１つもしくは複数のＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的フラグメント、またはそれらの発現可能コード配列を哺乳類に投与するステップを含む。１つもしくは複数のＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的フラグメントは、本明細書で提供されるＤＮＡプラスミドインフルエンザワクチンの投与前に、同時に、または後に投与され得る。いくつかの実施形態において、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣおよびそれらの機能的フラグメントから成る群から選択される、１つもしくは複数のタンパク質をコードする単離された核酸分子は、哺乳類に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ウサギおよびマカク血清を使用して実施されたＥＬＩＳＡアッセイを表すグラフを示す。ウサギ（上のパネル）およびマカク（下のパネル）を、指示された時間点（黒矢印）で、プラスミドＤＮＡを用いて免疫化した後、筋肉内タンパク質追加免疫（灰色の矢印）した。抗体力価は、免疫前血清の対応する希釈と比較した、４５０ｎｍでの光学密度の２倍を産生する免疫血清の希釈に基づく。
【図２】ウサギおよびマカク血清を使用して実施された中和（Ａ、Ｂ）アッセイを表すグラフを示す。抗体力価は、免疫前血清の対応する希釈と比較した、４５０ｎｍでの光学密度の２倍を産生する免疫血清の希釈に基づく。中和アッセイは、ＴＺＭｂ１細胞を使用して、単離されたＳＨＩＶＢａ−Ｌ（Ａ、Ｂ；上のパネル）およびＳＨＩＶ１６２Ｐ４（Ａ、Ｂ、下のパネル）に対して実施した。力価は、未処理の対照と比較した、５０％の感染阻害を示す免疫血清の希釈として示す。アッセイで試験された最低血清希釈は、示（点線）すように、１：５であった。マカク（Ｂ）において、血清は、免疫前（研究の前）、研究の６週目および２３週目にアッセイした。
【図３】血清抗体を関数として評価したＥＣ−ＴＭプラスミド電気穿孔の最適な電流電圧を表すグラフを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０ｍｇのＥＣ−ＴＭプラスミドを用いてワクチン接種し、０．２、０．３または０．４Ａで電気穿孔した。２週間後、血清を採取し、特定の抗体力価を評価した。グラフは、ＣＣＥの電流強度（アンペア）と抗体反応との間の逆相関方向へのトレンドを示す。各記号は、個々のマウスの平均血清を示すが、水平バーは、中間値を指す。
【図４】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｐ１８５neu抗体反応の誘導を表すグラフを示す。該マウスを５、１０、２５および５０μｇのＥＣ−ＴＭプラスミドおよび０．２Ａ ＣＣＥを用いてワクチン接種した。血清の抗ｐ１８５neu抗体力価をワクチン接種から４週間後に採取した。抗体の平均力価は、注入されたプラスミド量と共に増大するようである。５０μｇのプラスミドを用いてワクチン接種されたマウスの抗体力価は、５、１０および２５μｇ（それぞれ、Ｐ＝０．００４１、０．０２４４および０．０４２４）を用いてワクチン接種されたマウスに比べて有意に高かった。各記号は、個々のマウスの平均血清を示すが、水平バーは中間値を指す。
【図５】特定のアイソタイプにおけるｐ１８５neu抗体反応の誘導を表す棒グラフを示す。個々のマウスからの血清を電気穿孔から２週間後に採取し、その血清を統合して抗ｐ１８５neu抗体のアイソタイプ構成成分を評価した。データは、免疫血清および特定の抗ＩｇＧサブクラスＦＩＴＣ抱合抗体を用いてインキュベートした後に染色したｐ１８５neu+細胞の割合（％）として報告する。
【図６】マウスの異なる筋肉で測定されたＳＥＡＰ発現レベルを示す。マウスは、前脛骨（ＴＡ）筋または腓腹（Ｇ）筋に１０μｇのＣ５−１２−ＳＥＡＰプラスミドを注入し、４秒または８０秒の遅延の後ＥＰ（電気穿孔）を実施した。マウスに、また、ＥＰ（ＥＰなし）を用いず、１０μｇのｐｆ Ｃ５−１２−ＳＥＡＰプラスミドを注入した。血清ＳＥＡＰレベルは、ＥＰ（＊Ｐ＜１．３Ｅ−２１）なしでプラスミドを受けた対照マウスと比較して、ＴＡ筋およびＧ筋注入マウスで高かった。プラスミドバックボーン（ＮＢ）なしで発現カセットを注入し、それから電気穿孔したマウスは、ＥＰなしのＮＢ群よりＳＥＡＰレベルが高かった。しかしながら、ＮＢ群は、同一筋肉（ＴＡ４秒と比較して、ＮＢ４秒、＊＊Ｐ＜０．００８；ＴＡ８０秒と比較して、ＮＢ８０秒、＊＊＊Ｐ＜０．００４）において、Ｃ５−１２−ＳＥＡＰを投与された動物より有意に低かった。ＴＡ筋に注入されたマウスは、Ｇ筋に注入されたマウスより高い発現を得、ＴＡ筋への注入とＥＰとの間の遅延を８０秒から４秒へ減らしても、発現に影響しなかった。
【図７】偏在性ＣＭＶプロモータにより駆動されたＳＥＡＰ発現が、様々な電流設定で、マウスの異なる筋肉で測定されたことを示すグラフを示す。プラスミド製剤を試験した：生理食塩水、生理食塩水＋ＬＧＳ、水、または水＋ＬＧＳ。ＴＡ筋における０．１Ａでの生理食塩水＋ＬＧＳ製剤が、最高の発現を得た。プラスミドを水に製剤化し０．２Ａの電気穿孔法でプラスミドを導入したマウスは、同一の筋肉に０．１Ａを受けたマウス（ＴＡでは＊Ｐ＜０．０５およびＧでは＊＊Ｐ＜０．００１）より有意に低いＳＥＡＰレベルを得た。水＋ＬＧＳをプラスミド製剤として使用した時、血清ＳＥＡＰレベルでの差異は、ＴＡ筋では有意ではなかったが、Ｇでは有意であった（＊＊＊Ｐ＜０．０４）。
【図８】プラスミドが（Ａ）生理食塩水＋ＬＧＳで製剤化された時のＧ筋における、および（Ｂ）水＋ＬＧＳで製剤化された時のＴＡ筋における、０．１Ａの電流で処置されたマウスで最も高かった、処置から１４日後に測定された抗ＳＥＡＰ抗体ＨＩ力価を示す。
【図９】注入後３５日目のブタ血清におけるＨＩ力価の結果の棒グラフを示す。最も高い力価は、０．５Ａの電流設定で、２ｍｇのＨＡ発現プラスミドを投与された群で見られた（１２０±４０、＊Ｐ＝０．１１対２ｍｇ／０．３Ａおよび＊Ｐ＝０．０２対２ｍｇ／０．１Ａ）。下行用量のプラスミドを投与され、０．５Ａで電気穿孔された３群も、ＨＩ力価の減少を示した。
【図１０】ワクチン接種後のフェレットにおけるＨＩ力価の結果の棒グラフを示す。アッセイは、疾病管理センターから入手した合併結合変異ウイルス（Ａ／Ｖｉｅｔ／１２０３／０４またはＩｎｄｏ／０５／２００５インフルエンザ株）を使用して実施した。
【図１１】２回目の免疫から３週間後に測定されたＨＩ力価の結果の棒グラフを示す。ＩＤを免疫した後にＥＰが行われたマカクは、他の全ての群より有意に高いＨＩ力価を示した（Ｐ＜０．０３）。未処理の対照群は、任意のＨＩ力価を示さなかった。
【実施例】
【００４０】
本発明を、以下の実施例において、さらに説明する。これらの実施例は、本発明の好適な実施形態を示すが、単に例示として示されることを理解されたい。以上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認でき、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合するように、本発明の様々な変更および修正を行うことが可能である。したがって、本明細書に示され、かつ記載される実施例に加え、本発明の様々な修正が、前述から、当業者に明らになる。このような修正は、また、付属の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
【００４１】
好ましくは、本明細書に記載されるＥＰ装置を用いて使用するＤＮＡ製剤は、高ＤＮＡ濃度、好ましくは、皮膚への送達のために最適である小容量でのＤＮＡのグラム量を含む濃度、好ましくは、少量の注入量、理想的には、２５〜２００マイクロリットル（μＬ）を有する。いくつかの実施形態においてＤＮＡ製剤は、１ｍｇ／ｍＬ以上（製剤のｍｇ ＤＮＡ／容量）等の高ＤＮＡ濃度を有する。より好ましくは、該ＤＮＡ製剤は、２００μＬの製剤におけるグラム量のＤＮＡ、より好ましくは、１００μＬの製剤におけるグラム量のＤＮＡを提供するＤＮＡ濃度を有する。
【００４２】
本発明のＥＰ装置を用いて使用するＤＮＡプラスミドは、既知の装置および手法の組み合わせを使用して製剤化または製造されてもよいが、好ましくは、２００７年５月２３日に出願された、共同所有、同時係属の米国仮出願第６０／９３９，７９２号に記載される、最適化されたプラスミド製造手法を使用して製造される。いくつかの実施例において、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬを超える、または１０ｍｇ／ｍＬに同一の濃度で製剤化されてもよい。製造手法は、２００７年７月３日に出版された、共同所有の特許である、米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許第６０／９３９７９２号に記載されるものに加え、当該分野の当事者に一般的に知られる様々な装置およびプロトコルも含む、または援用する。ＥＰ装置を用いて使用されるプラスミドの高濃度、および本明細書に記載する送達手法は、適度な低容量で、皮内／皮下空間に、または必要ならば筋肉内的（用量のため）に、プラスミドの投与を可能にし、発現および免疫効果の強化を助ける。共同所有される出願および特許である、米国特許第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が本明細書に援用される。
【００４３】
実施例１ ＨＩＶ−１ ｅｎｖに対する抗体
材料および方法
抗原およびペプチド
コドン最適化ＨＩＶ−１ ｅｎｖ（Ｂａ−Ｌ）およびｐ５５ｇａｇ（９６ＺＭ６５１）遺伝子をコードするＣＭＶプロモータ駆動プラスミドを、Ｃｒｉｓｔｉｌｌｏ，Ａ．Ｄ．らのＶｉｒｏｌｏｇｙ ３４６（１），１５１−６８（２００６）に記述されているように製剤化した。ＣＭＶプロモータの制御下で、組換えｇｐ１２０（ｃｌａｄｅ Ｂ）を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で発現し、Ｃｒｉｓｔｉｌｌｏら（２００６）において以前報告されるように精製した。組換えＨＩＶ−１ ＨＸＢ２ ｐ４１タンパク質を発現し、形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから精製した。タンパク質をＱＳ−２１アジュバント（抗原ｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を用いて製剤化した。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ（ＢａＬ）およびＧａｇ（ＨＸＢ２）タンパク質を合成した（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ）。
【００４４】
電気穿孔されたＤＮＡにより誘導される抗外被結合および中和抗体
ニュージーランド産シロウサギを、上の材料および方法のセクションで概説したように免疫化した。電気穿孔によるＤＮＡの単回投与後、ＤＮＡがＩＭ経路で送達された時に観察されなかった抗ｇｐ１２０抗体を検出した（図１、上のパネル）。力価は、いずれかの経路による３回の追加ＤＮＡ投与後（図１、上のパネル、黒色の矢印）、増加することが分かり、また、最終ＤＮＡ免疫化２週間後（１４週目）でのＩＭ経路で免疫化されたウサギと比較して、電気穿孔で免疫化されたウサギにおいて、有意に大きい（ｐ＜０．０００１）ことが分かった。この所見は、ＩＭ（１ｍｇ）送達と比較して、５倍少ないＤＮＡが電気穿孔（２００μｇ）による免疫化で使用されたことを考えると、特に興味深い。ＩＭ経路によるＱＳ−２１製剤ｇｐ１２０タンパク質の単回投与（図１、上のパネル、灰色の矢印）は、両方のＤＮＡ感作群で同程度の抗体力価をもたらした。ウサギが休んでいる時、ＩＭ送達ＤＮＡで感作された群での抗体レベルは、電気穿孔群のレベルより迅速な動態を伴って減少することが分かった。これは、電気穿孔群とＩＭ群（ｐ＜０．０００１）との間で、６２週目（最終免疫化後４１週目）に観察された力価から明らかになった。
【００４５】
マカクに、ｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子の両方をコードするプラスミドを電気穿孔法で導入したが、両方の抗原への抗体の誘導が、免疫化後に誘導されたかどうかを評価することが目的であった。マカクにおいて、測定可能な抗ｇｐ１２０抗体は、２回のＤＮＡ免疫化後に検出されたが、該抗体が３度目の免疫化後に増加した（図１、下のパネル）。ウサギにおける我々の発見と一致して、４度目のＤＮＡ投与は、顕著に抗体力価をさらに増大しなかった。
【００４６】
ＤＮＡで感作されたマカクを、それから、ＱＳ２１製剤タンパク質を用いて追加免疫する前に、９週間、休ませた。抗Ｅｎｖ抗体力価のさらなる増加が、ｇｐ１２０タンパク質を用いたマカクの追加免疫後に観察された。本抗体レベルは、６２週目に測定された力価から実証されるように、次の４１週間持続した。これらのレベルは抗ｇｐ１２０抗体より速い速度で減衰することが分かったが（データ示さず）、抗Ｇａｇ抗体の類似した誘導も、ＤＮＡ電気穿孔後それらの動物において観察された。さらに、組換えｇｐ４１Ｇａｇタンパク質を用いたＤＮＡで感作された動物の追加免疫は、固体反応を増大したが、そのレベルも、タンパク質追加免疫後の抗Ｅｎｖ抗体力価より低かった（データ示さず）。
【００４７】
免疫血清の機能的特性は、相同（ＳＨＩＶBa-L）および異種（ＳＨＩＶ162P4）単離体の中和をアッセイすることにより評価された。ＳＨＩＶBa-L（図２Ａ、上のパネル）およびＳＨＩＶ162P4（図２Ａ、下のパネル）に対する抗体の中和は、ＩＭ経路による４回のＤＮＡ免疫化後１４週目まで、ウサギの血清において検出されなかった。しかしながら、このような抗体は、２回のＤＮＡ投与後、電気穿孔により免疫化されたウサギの血清での両方の中和感受性単離体で、明らかに検出された。ＤＮＡで感作されたウサギが、ｇｐ１２０／ＱＳ−２１の単回ＩＭ投与を用いて追加免疫された時、中和抗体力価は、両方のＤＮＡ感作群で増加することが分かったが、そのレベルは、ＩＭ経路と比較して、ＤＮＡが電気穿孔により送達されたウサギで高かった。
【００４８】
ＳＨＩＶBa-L（図２Ｂ、上のパネル）およびＳＨＩＶ162P4（図２Ｂ、下のパネル）に対する抗体の類似した中和が、２回のＤＮＡ電気穿孔後（６週目）のマカクの血清で検出された。加えて、これらの力価は、ＩＭタンパク質追加免疫後の２週目の２３週目でさらに追加免疫された。
【００４９】
ヒト以外の霊長類における抗体レベル（図１、下のパネル）は、研究の最大６２週目まで維持することが分かった。同様に、ウサギにおける抗体減少の動態（図、上のパネル）は、電気穿孔法により免疫化された動物と比較して、ＩＭ経路により免疫化された動物で、より迅速であることが分かった。
【００５０】
実施例２ ｐ１８５neuに対する抗体
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６週間）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＢＡＬＢｎｅｕＴ664V-Eマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）により、特定病原体未感染状態下で飼育された。Ｆｃ−γＲＩ／ＩＩＩ（ＢＡＬＢｎｅｕＴ664V-E／ＦｃγＲＩ／ＩＩＩ）の遺伝子がノックアウトされたＢＡＬＢｎｅｕＴ664V-Eマウスは、ＢＡＬＢｎｅｕＴ664V-Eマウスを、親切にもＤｒ Ｒ Ｃｌｙｎｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ＮＹ）により提供された、ＦｃγＲＩ／ＩＩＩ受容体の遺伝子がノックアウトされたＢＡＬＢ／ｃマウスと交配させることにより産生した。腫瘍の発現を観察するために、隔週で、乳腺を検査した。２つの垂直径で、カリパーを用いて腫瘍量を測定した。１ｍｍ平均径以上の進行性増殖腫瘤を腫瘍とみなした。腫瘍なしマウスの割合（％）（非坦癌マウス）を評価した。欧州連合ガイドラインに従い、マウスを処理した。
【００５１】
プラスミドおよび電気穿孔
ｐ１８５neu（ＥＣ−ＴＭプラスミド）の細胞外および膜貫通ドメインをコードするｐｃＤＮＡ３ベクターを産生し、前述のように使用した（Ｒｏｖｅｒｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ２０００；１６５：５１３３-５１４２）。ＤＮＡを沈殿させ、１ｍｇ／ｍｌの無菌生理食塩水で懸濁し、免疫化プロトコルに使用するために、−２０oＣのアリコートで保管した。
【００５２】
ＤＮＡ電気穿孔のために、０．１％のポリＬグルタミンを有する２５μｌ無菌生理食塩水中のＥＣ−ＴＭまたはｐｃＤＮＡ３プラスミドを、麻酔をかけたマウスの腓腹筋に注入した。各指定された時間に、５〜５０μｇのプラスミドを動物に注入した。パルス間で継続時間が１秒の、２０ｍｓの２つの一定電流方形波パルスを、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応電気穿孔装置および皮膚電極アセンブリ（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して、４秒後に適用した。皮膚電極アセンブリの電極は、長辺が５ｍｍで、短辺が３ｍｍの二等辺三角形の形状である。０．２Ａ、０．３Ａおよび０．４Ａが使用された電気穿孔条件実験を除き、０．２Ａの一定電流設定を、全ての癌ワクチン実験に使用した。筋肉抵抗は、１６０Ｖから１９５Ｖの算出電圧を伴う、８００から１０００Ωの間であることが測定された。
【００５３】
抗ｐ１８５neu抗体の評価
ＢＡＬＢ／ｃマウスからの血清を、ワクチン接種後、２、４または６週目に採取し、ＰＢＳ−アジド−ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−ａｚｉｄｅ−ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で、１：５０に希釈した。抗ｐ１８５neu抗体の存在は、野生型または野生型ｐ１８５neuマウスクラスＩ Ｈ−２ＫdおよびＢ７．１遺伝子（ＢＡＬＢ／ｃ ＮＩＨ３Ｔ３−ＮＫＢ）で安定に同時にトランスフェクトされたＢＡＬＢ／ｃ ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を使用して、フローサイトメトリにより判断した。結合一次抗体を検出するために、マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｄａｋｏ−Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｔａｌｙ）に特異的なＦＩＴＣ−抱合型ヤギ抗マウス抗体を使用した。正常なマウス血清を負の対照とした。ｐ１８５neuタンパク質の細胞外ドメインを認識するモノクローナルＡｂ４抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、正の対照として使用した。血清中の抗ｐ１８５neu抗体の濃度（ｍｇ／ｍｌ）を決定するための検量線を作製するために、連続Ａｂ４希釈物を使用した。ＣｙＡｎ ＡＤＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｔａｌｙ）を用いて、フローサイトメトリ分析を実施した。アイソタイプの判定は、間接的免疫蛍光手順により実行した。
【００５４】
ＰＢＳ−ａｚｉｄｅ−ＢＳＡ中で血清を１：２０に希釈し、４oＣで、４５分間、２×１０5ＢＡＬＢ／ｃ ＮＩＨ３Ｔ３−ＮＫＢ細胞を用いてインキュベートした。洗浄後、ラットビオチン抱合抗体抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて、３０分間、それから、５ｍｌのストレプトアビジン−フィコエルトリン（ＤＡＫＯ）を用いて、３０分間、細胞をインキュベートし、１ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ中で再懸濁した。サンプルをＣｙＡｎ ＡＤＰで評価し、データをｐ１８５neu＋細胞の割合（％）として報告した。
【００５５】
野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ｐ１８５ｎｅｕ反応の誘導
マウスに、５０μｇのＥＣ−ＴＭプラスミドを注入し、０．２Ａ〜０．４Ａの異なる一定電流設定で、一定電流電気穿孔（ＣＣＥ）を投与した（図３）。ＥＣ−ＴＭプラスミドを用いたワクチン接種により誘導される最も明らかな免疫反応は、抗ｐ１８５neu抗体の上昇のため、ワクチン接種２週間後に血清を採取し、特定の抗体力価を評価した。誘導された抗ｐ１８５neu抗体の力価は、電気電流アンペアの強度に反比例するようである。最低電流設定の０．２Ａが、全ての他の実験に使用された。ｐ１８５neuタンパク質に対する抗体の誘導が、増大した用量のＥＣ−ＴＭプラスミドを用いて、一定電流電気穿孔されたマウスで評価された。ＣＣＥから２および４週間後に採取された個々のマウスからの血清は、全ての用量のＥＣ−ＴＭプラスミドが、ワクチン接種から２（データ示さず）および４週間後の両方で、抗ｐ１８５neu抗体を誘導できたことを示した。電気穿孔から４週間後、５０μｇのＥＣ−ＴＭプラスミドを一定電で流電気穿孔したマウスから得た血清は、最も高い力価を示した（図４ａ）。さらに、ＣＣＥから２週間後に採取された血清は、抗ｐ１８５neu抗体のアイソタイプ成分を評価するために統合し、０．２Ａ条件が、ｎｅｕ＋腫瘍に対する抗腫瘍活性において最も効果的な抗体である、ＩｇＧ２ａ（図４ｂ）へのアイソタイプ転換を強く誘導したことを示した。
【００５６】
癌ワクチン実験において、電流設定（０．２Ａ）の一定電流電気穿孔が、効果的なレベルのＩｇＧ２抗体を誘導する。高い電流設定（０．３および０．４Ａ）は、おそらく、より多くの筋肉損傷を伴う、ＥＣ−ＴＭプラスミド発現の減少、したがって、特定の抗体力価の減少を導く低効率な電気穿孔をもたらした。
【００５７】
実施例３ マウスにおけるＳＥＡＰに対する抗体
プラスミドコンストラクト
偏在性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータは、ｐＣＭＶ−ＳＥＡＰベクターにおいて、ヒト分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータ導入遺伝子産物の発現を導く。商業的に入手可能なキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、プラスミドを得た。運動発色性ＬＡＬ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）により測定されたエンドトキシンレベルは０．０１ＥＵ／μｇ以下であった。共通ＨＡおよびＮＡコンストラクトは、近年、ヒトに致命的であると証明された１６Ｈ５ウイルスからの、および４０以上のヒトＮ１ウイルスからの一次ウイルス配列を分析することにより生成した。これらの配列は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのインフルエンザ配列データベースからダウンロードした。共通配列を生成した後、コザック配列、コドン最適化、およびＲＮＡ最適化の追加を含む、哺乳類発現のために、コンストラクトを最適化した。これらのコンストラクトは、それから、ｐＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化した。特に記載がない限り、プラスミド製剤は、無菌水で希釈し、ポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩（ＭＷ＝１０．５ｋＤａ ａｖｅｒａｇｅ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、１％重量／重量に製剤化し、さらに、ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）で、ＨＰＬＣにより精製した。
【００５８】
マウスへの発現コンストラクトの注入
最初の実験において、Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（１０匹／群）の群は、４または８０秒の遅延時間で、０．１Ａの一定電流で、前脛骨筋（ＴＡ）または腓腹（Ｇ）筋に、筋特異的合成プロモータ（ｐＳＰｃ５−１２−ＳＥＡＰ）の制御下で、１０μｇのプラスミド発現ＳＥＡＰを注入した。対照群は、ＥＰを用いずに（ＥＰなし）、ＴＡにプラスミドを導入した。追加群のマウスに、ＴＡ筋およびＧ筋に、ＥＰを用いて、およびＥＰを用いずに、等モル濃度で、プラスミドバックボーン（ＮＢ）が欠損した、同一のプロモータ、導入遺伝子、および３’ポリアデニル化信号を有する発現カセットを導入した。
【００５９】
第２のマウス実験において、一群に５匹のマウス×１６群（総数８０匹のマウス）を使用した（表１）。様々な製剤（生理食塩水、生理食塩水＋１％ＬＧＳ、水、水＋１％ＬＧＳ）かつ電流強度で、５０μｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（１０ｍｇ／ｍＬで）を、マウス（５匹／群）に注入した。マウスは、ＴＡ筋またはＧ筋へのＩＭ注入のために、様々な電流（０．１Ａ〜０．２Ａ）を用いて、４秒の遅延時間で、電気穿孔した。
【００６０】
全ての場合において、マウスを３日間、順化し、体重を測定し、耳にタグを付けた。食餌および水は、実験期間中、自由に利用できた。研究０日目、動物の体重を測定し、採血し、齧齒用の組み合わせ麻酔−キシラジン（３７．５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍＬ／３０グラム体重）、ケタミン（１．９ｍｇ／ｍＬ、０．０１６ｍＬ／１０グラム体重）、アセプロマジン（０．３７ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍＬ／１５グラム体重）を使用して麻酔をし、プラスミドをデザイン毎に投与し、電気穿孔した。
【００６１】
０、４、７、および１１日目に、それぞれ、マウスの体重を測定し、血液を、後眼窩出血を介してマイクロチューブに採取した。血液を室温で１０〜１５分間、凝血させ、その後、１０分間、３０００ｘｇで遠心分離し、さらなる分析まで血清を−８０℃で保管した。
【表１】
【００６２】
ＳＥＡＰアッセイ
血清サンプルを解凍し、ＳＥＡＰ活性を測定するために、ホスホ光化学発光レポータアッセイキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して５０μＬをアッセイした。アッセイの検出の下限は、３ｐｇ／ｍＬである。ＳＥＡＰ活性のアッセイ前に、より濃縮された血清サンプルを、対照種の特異的な血清で、１：１０に希釈した。全てのサンプルをＬＵＭＩｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙルミノメータ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して読み取った。
【００６３】
ＳＥＡＰ間接ＥＬＩＳＡ
ヒトＳＥＡＰタンパク質に対する免疫原性を、ＣｈａｓｔａｉｎらのＪ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２００１ Ａｐｒ；９０（４）：４７４−８４からの修正手順を使用して、マウスにおいて測定した。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）プレートを、一晩、４℃で、ＰＢＳ（１００ナノグラム／ヒト胎盤アルカリホスファターゼのウェル（Ｓｉｇｍａ）を含む１００μｌ）中で、精製したヒト胎盤アルカリホスファターゼで被覆した。プレートをデカントし、３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）（遮断溶液）を使用して遮断し、室温で２時間、インキュベートした。血清サンプルを１：１００に希釈した後、別の希釈プレートにおいてＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０の１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で、１：４に段階希釈した。プレートから遮断溶液をデカントした。１００μｌの希釈された試験血清を各ウェルに添加し、室温で２時間、インキュベートした。血清希釈をデカントし、３回洗浄した。二次抗体（ホスラディッシュペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス抗体）を、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の１％ ＢＳＡで、１：１０００に希釈し、室温で１時間、インキュベートした。プレートをデカントし、洗浄した。０．１Ｍのクエン酸緩衝液中で、１００μｌのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質を各ウェルに添加（０．６７ｍｇ／ｍＬ）し、８分間、インキュベートし、１００μｌの１Ｍ Ｈ2ＳＯ4を、反応を停止するために添加した。吸光度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４プレート読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、４９０ｎｍで測定した。
【００６４】
ＳＥＡＰ発現プラスミド注入が、注入とＥＰ間の遅延時間が８０秒および４秒の両方で、ＴＡ筋対Ｇ筋に投与されると、発現が増大した（図５）。ＳＰｃ５−１２−ＳＥＡＰプラスミドが、ＴＡ筋に注入されると、血清ＳＥＡＰレベルは、ＥＰ（Ｐ＜１．３Ｅ−２１）を用いずにプラスミドを導入した対照動物より２８５倍高く、ＴＡ筋（３５７±６対３５７±６．２ｐｇ／ｍＬ／ｇ）における４秒と８０秒間の遅延時間には、差異は観察されず、同一条件下でのＧ筋への注入は、対照群（Ｇ８０秒対ＥＰなし対照、Ｐ＜０．００３；Ｇ４秒対ＥＰなし対照、Ｐ＜７．７Ｅ−０６）より９０〜１８２倍高いＳＥＡＰレベルを生じた。（バックボーンなし（ＮＢ）だが、同一のプロモータ、導入遺伝子、および３’ポリアデニル化信号を有する）発現カセットを含むプラスミドフラグメントのみを、等モル製剤で、ＴＡ筋およびＧ筋に注入した時、発現レベルは、ＩＭ＋ＥＰ（８０秒対ＥＰなし、Ｐ＜１．８Ｅ−０８；４秒対ＥＰなし、Ｐ＜３．８Ｅ−０５）を受けなかった対照群より２１０〜２５０倍であった。ＴＡ８０秒でのＳＥＡＰ発現は、ＮＢ８０秒群（Ｐ＜０．００８）より２４％高く、一方、ＴＡ４秒は、ＮＢ ４秒群（Ｐ＜０．００４）より高かった。Ｃ５−１２−ＳＥＡＰおよびＥＰを用いない（ＥＰなし）ＮＢを投与された両群は、ほとんどＳＥＡＰを発現しなかった。
【００６５】
マウス−ＳＥＡＰ発現は製剤に依存する
ＳＥＡＰ導入遺伝子が偏在性プロモータの制御下である時のＳＥＡＰレベルの差異を評価した（対 最初のマウス実験で使用された筋特異的プロモータ）。発現レベルは、プラスミド注入ＥＰ手順がＴＡ筋対Ｇ筋（Ｐ＝０．０５）で実施された場合に上昇することが分かった（図６）。この特定の実験において、生理食塩水＋ＬＧＳ製剤は、群内変動が高かったために統計学的優位性は達成しなかったが、生理食塩水製剤（それぞれ、４１．１±７．９ｐｇ／ｍＬ／ｇ対３１．０±５．９ｐｇ／ｍＬ／ｇ）と比較して、血清ＳＥＡＰレベルが高かった。０．１Ａ電流設定で電気穿孔されたマウスは、０．２Ａの一定電流で同一のプラスミド製剤を導入されたマウスより高いＳＥＡＰ発現を生じた。
【００６６】
マウス−抗ＳＥＡＰ抗体の誘導
生理食塩水＋ＬＧＳによるＳＥＡＰプラスミドの製剤化は、高いタンパク質発現を生じたが、抗ＳＥＡＰ抗体の力価は、水＋ＬＧＳで製剤化されたＳＥＡＰプラスミドを用いて注入されたマウスと比較した時、低かった（図７）。
【００６７】
実施例４ ブタにおけるインフルエンザに対する抗体
総数４０匹のブタを１０群×４匹のブタに分けた（表２）。ブタを４日間順化させ、体重を測定し、耳にタグを付けた。研究０日目、ブタの体重を測定し、採血し、ブタ用の組み合わせ麻酔−ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）、およびアトロピン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔をし、それから、イソフルラン（５％で誘導、２〜３％で維持）を使用して麻酔した。ブタ（４匹／群）に、様々なプラスミド濃度および電流強度で、０．６ｍＬのＣＭＶ−ＨＡ（共通Ｈ５抗原を発現するｐＶＡＸベースのコンストラクト）、ＣＭＶ−ＮＡ（共通Ｎ１抗原を発現するｐＶＡＸベースのコンストラクト）、およびＣＭＶ−ＳＥＡＰ（レポータ遺伝子分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するコンストラクト）プラスミド（プラスミド濃度、および「筋肉損傷」評価のために溶液の粘度を上げるために添加される最後のコンストラクト）＋１．０％ｗｔ／ｗｔＬＧＳを注入した。上の実施例３に提供される材料および方法に従い、プラスミドを製剤化した。４秒後、５本の電極を備え、以下のパルスパラメータで操作された適応一定電流ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）筋肉内（ＩＭ）システム（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して電気穿孔した：５２ミリ秒パルス、パルス間が１秒、様々な電流（０．１、０．３および０．５Ａ）を用いた３パルス。
【表２】
注入後１４日目および３５日目の生検の迅速な同定のために、各注入部位を包囲する領域を刺青した。
【００６８】
ブタを麻酔から回復させ、完全な回復を確認するために、２４時間、慎重に監視した。処理後２〜３時間内に完全に回復しなかったブタは、すべて書き留めた。ブタの体重を測定し、１０日目、２１日目、および３５日目に採血した。ブタに、２１日目に２回目のワクチンを投与した。血液を別のファルコンチューブに採取し、これを凝血させ、血清を遠心分離して単離し、それから氷上のチューブにアリコートさせた。
【００６９】
赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ
ブタ血清は、１部分量の血清を３部分量の酵素で希釈することにより、レセプタ破壊酵素（ＲＤＥ）を用いて処理し、３７℃の水浴で一晩、インキュベートした。５６℃で３０分インキュベートすることにより、該酵素を不活性化した後、６部分量のＰＢＳを添加して、最終希釈の１／１０にした。前述の通り、ウイルスの４つのＨＡユニットおよび１％のウマの赤血球細胞を使用して、Ｖ型底の９６ウェルマイクロタイタープレートで、ＨＩアッセイを実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，１０３（１−２）：９１−５（Ｊｕｌｙ ２００４））。
【００７０】
ＨＩアッセイ（図８）により示されるように、最も高い力価は、０．５Ａ（１２０±４０、Ｐ＝０．１１対２ｍｇ／０．３ＡおよびＰ＝０．０２対２ｍｇ／０．１Ａ）の電流設定で、２ｍｇのＨＡ発現プラスミドが投与された群からの血清で見られ、２ｍｇの各プラスミドが導入された群において、電界の強度に伴い、力価は減少し、電流のいずれかのプラスミド量が、その後、減少した場合、力価はより可変的で、群の間に差異はなかった。
【００７１】
ＨＩ力価は、２ｍｇのＨＡ発現プラスミドが投与され、０．５Ａで電気穿孔された群で、最も高かった。さらに、力価は、０．５Ａで電気穿孔された群のプラスミド量の、および電界の強度の減少に伴い減少した。低プラスミド量、または低電流強度は、群内の可変性を増大するようであった。
【００７２】
実施例５： フェレットにおけるインフルエンザに対する抗体
生後４〜６ヶ月の、または少なくとも体重が１ｋｇの２０匹の雄のフェレット（Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍｓ，Ｓａｙｒｅ，ＰＡ）を、本研究に使用し、ＢＩＯＱＵＡＬ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で飼育した。ファレット研究デザインは表３にある。研究の前に２週間、動物を順化させた。０、４および９週目で、動物を免疫化（麻酔下）した。血液を２週間毎に採取した。
【００７３】
本研究は、フェレットのインフルエンザ誘導モデルで、ＩＭ送達した後に、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応一定電流電気穿孔筋肉内（ＩＭ）システム（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して電気穿孔されたＨＡ、ＮＡ、およびＭ２ｅ−ＮＰ ＤＮＡワクチンの有効性を試験した。上の実施例３に提供される材料および方法に従い、ＤＮＡプラスミドを製剤化した。表３に概要を述べるように、群２、群３および群４の動物に、０．２ｍｇのそれぞれのインフルエンザプラスミドワクチンを接種した。１プラスミドワクチン（群２および群３）が接種された、またはワクチンを接種されなかった（対照群１）用量群を補正するために、差異はｐＶＡＸ空ベクターにより補われ、各群の全ての動物が、総用量の０．６ｍｇのプラスミドを導入するようにした。５本の針電極アレイを使用した電気穿孔の条件は、０．５Ａｍｐｓ、５２ミリ秒パルス幅、パルス間が１秒、注入と電気穿孔の間の遅延が４秒であった。
【表３】
【００７４】
赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ
血清は、１部分量の血清を３部分量の酵素で希釈することにより、レセプタ破壊酵素（ＲＤＥ）を用いて処理し、３７℃の水浴で一晩、インキュベートした。５６℃で３０分インキュベートすることにより、酵素を不活性化した後、６部分量のＰＢＳを添加して、最終希釈の１／１０にした。前述の通り、ウイルスの４つのＨＡユニットおよび１％のウマの赤血球細胞を使用して、Ｖ型底の９６ウェルマイクロタイタープレートで、ＨＩアッセイを実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，１０３（１−２）：９１−５（Ｊｕｌｙ ２００４））。ＨＩアッセイに使用されたウイルスは、疾病管理センターから得た交雑ウイルス株であるＡ／Ｖｉｅｔ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）／ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ−ＲＧ（クレイド１ウイルス）およびＡ／Ｉｎｄｏ／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）／ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ−ＲＧ２（クレイド２ウイルス）。インフルエンザ感染のフェレットモデルは、ヒト疾患をより反映し、また、より厳密な誘導モデルであると考えられる。フェレットは、インフルエンザに感染したヒトに類似する症状、およびヒトならびにトリインフルエンザウイルスに関して類似する組織指向性を表す。研究を通して、異なる時間点で採取した血清は、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対するＨＩ活性を検出するために使用した。図９に示すように、共通Ｈ５特異的ＨＡコンストラクトを含む両群は、２回の免疫化後、保護レベルの抗体（＞１：４０）を達成し、クレイド２Ｈ５Ｎ１ウイルスを阻害することも可能であった。つまり、ＨＩアッセイは、共通ＨＡ株がクレイド１ウイルスに基づくにも関わらず、両方のウイルス株に対して陽性であった。
【００７５】
実施例６ 霊長類におけるインフルエンザの抗体
アカゲザルをこれらの研究において免疫化した。実験の開始前に２ヶ月、動物を順化した。研究は以下のように進行させた：０週目に、１回目の免疫化（プラスミド量投与）を実施し、基準採血した。２週目に、採血を実施した。３週目に、２回目の免疫化（プラスミド量投与）を実施した。５週目に、採血を実施した。６週目に、３回目の免疫化（プラスミド量投与）を実施し、採血した。８週目に、採血を実施した。
【表４】
【００７６】
全てのプラスミドを、上の前述の実施例に記載されるように、１０ｍｇ／ｍＬで、注入用水＋１％ＬＧＳに製剤化し、研究群毎（上の表４のＣ、Ｄ、ＧおよびＨ群）に、単一溶液に混合した。ＩＭ ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰ（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＤ ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰ（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびＩＭ注入を指す各群の補正注入量を算出した。ＩＤ投与のために、必要な注入量が、部位毎に１００μＬを超える場合、製剤は注入部位の数に分けられる（どのくらいの総ｍｇのワクチンが投与されるかによって、２、３、または６）。ＩＭ注入を受けた動物の単一部位に全製剤を与えた。
【００７７】
ブタ実験、ファレット実験、およびヒト以外の実験に使用されたＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応一定電流装置が、実施例で説明された。電気穿孔条件は、以下であった：ＩＭ注入および電気穿孔群において、条件は０．５Ａｍｐｓ、５２ミリ秒／パルス、３パルス、プラスミド注入と電気穿孔との間の遅延が４秒であった。ＩＤ注入および電気穿孔群において、条件は、０．２Ａｍｐｓ、５２ミリ秒／パルス、３パルス、プラスミド注入と電気穿孔との間の遅延が４秒であった。
【００７８】
赤血球阻害（ＨＩ）アッセイ−サル血清は、１部分量の血清を３部分量の酵素で希釈することにより、レセプタ破壊酵素（ＲＤＥ）を用いて処理し、３７℃の水浴で一晩、インキュベートした。５６℃で３０分インキュベートすることにより、酵素を不活性化した後、６部分量のＰＢＳを添加して、最終希釈の１／１０にした。前述の通り、ウイルスの４つのＨＡユニットおよび１％のウマの赤血球細胞を使用して、Ｖ型底の９６ウェルマイクロタイタープレートで、ＨＩアッセイを実施した。本明細書に提示したデータは、２回目の免疫化後の結果である（３回目の免疫前に採取された出血）
【００７９】
２回目の免疫化から３週間後にＨＩ力価を測定した。その結果は、図１０に示されたグラフに見られる。ＩＤ注入を介してＨＡプラスミドワクチン後に電気穿孔を受けたサルは、ＩＭ＋ＥＰ群の平均力価の２倍以上、およびＩＭ群のみの平均力価のほぼ３倍（＊Ｐ＜０．０３）を示した。未処理対照群は、まったくＨＩ力価を表さなかった。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１１月１４日に出願された米国仮出願第６０／９８８，０１２号、および２００７年１１月１６日に出願された米国仮出願第６０／９８８，７７３号の利益を主張し、参照により両方の内容が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
筋肉内または皮内経路で送達される裸ＤＮＡワクチンは、抗体およびＴ細胞反応の両方を感作するが、反応レベルは、しばしば、かなり低い。該低反応は、関心対象の生理学的部位への、および細胞による取り込み速度の両方の非効率的なプラスミド送達の結果であると考えられている。
【０００３】
生体内電気穿孔手法は、対象へのＤＮＡワクチンの送達の補助に利用可能である。しばしば、電気穿孔手法を使用するＤＮＡワクチン接種は、一定の電圧の電気穿孔器を利用し、このような機器は、組織抵抗を考慮せず、したがって、非最適なプラスミド発現、炎症を生じ得、および組織損傷を可能性として生じ得る。
【０００４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンの分野において、高力価中和抗体および広範なＴ細胞免疫を誘導できる予防的なＨＩＶ−１ワクチンの発見は、難しい。免疫システムの両部門がＨＩＶ−１疾患進行の制御に不可欠であることが見出されたことを考えれば（Ｐａｎｔａｌｅｏ ａｎｄ Ｆａｕｃｉ，１９９６；Ｓｏｕｄｅｙｎｓ ａｎｄ Ｐａｎｔａｌｅｏ，１９９９）、それらの誘導は、依然として、多くのワクチン研究および開発努力の主要な必要条件である。過去の報告は、多価のＨＩＶ−１ ＤＮＡプライム／タンパク質追加免疫ワクチン戦略を使用した、抗体およびＴ細胞反応の誘導を示すマウス、ウサギ、およびヒト以外の霊長類を用いた研究の結果を考察している。（Ｃｒｉｓｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００６、 Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）これらの研究ならびに他の報告による所見（Ａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｂａｒｏｕｃｈ ａｎｄ Ｌｅｔｖｉｎ，２０００、Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ，２００３、Ｒｅｙｅｓ−Ｓａｎｄｏｖａｌ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｓａｎｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｓｕｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）から、筋肉内または皮内投与経路を介して送達されるＤＮＡ免疫化は、測定可能だが、弱い抗体およびＴ細胞反応を誘導し、したがって、免疫の追加免疫を必要とすることが示された。アジュバント製剤組換えタンパク質の使用により、ＤＮＡワクチンにより感作された体液性および細胞性免疫反応の両方がさらに増大することが示された（Ｃｒｉｓｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ）。
【０００５】
ＤＮＡ免疫化による免疫学的感作を増大するために、ＤＮＡ投与量およびスケジュール、アジュバントおよび免疫調節薬の同時投与、ならびに免疫化戦略および送達経路の変更を含む、いくつかのパラメータが調査されている。このような研究は、プラスミドＤＮＡ発現の増大、ならびにＨＩＶ−１ワクチン、肝炎Ｂウイルスワクチン、天然痘ワクチン、および結核ワクチンを使用した体液性および細胞性感作の増大に、電気穿孔技術の利用を強調してきた。いくつかの電気穿孔プラットホームが試験されて、大いに有望なデータを作成したが、これらの研究は、プラスミド送達を容易にするために、一定の電圧の電気穿孔器を使用したが、これは、結果的に免疫保護成果に満たない。
【０００６】
２００７年１１月上旬にオンラインで公開されたとして知られるＣｕｒｃｉｏらのＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００７）の表題「ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｆｆｏｒｄｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ−ｐｒｏｎｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ」は、ＤＮＡ送達方法を容易にする電気穿孔の使用、およびマウスにおけるＥｒｂＢ−２、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体の生成を論じている。
【０００７】
強い免疫反応を誘導し、中性抗体を含む抗体も生成することができる、哺乳類にウイルス抗原を発現するＤＮＡプラスミドの送達方法の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の態様は、哺乳類の細胞に抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、該哺乳類に該組換え抗原に対する抗体を生成する方法を含む。これらの方法は、プロモータに操作可能に連結されるコード配列を含むＤＮＡプラスミドを該哺乳類の組織に注入するステップと、該ＤＮＡプラスミドの進入および該抗原の発現を可能にするために、該組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて、該組織を電気穿孔するステップと、該抗原に対する抗体を生成するために、該哺乳類が該発現抗原に反応できるステップと、を含む。好ましくは、該組換え抗原は、ウイルス性抗原である。いくつかの実施形態において、該方法は、該抗原が癌抗原ではないことを条件とする。
【０００９】
別の態様において、所望の抗原に対して特異的な抗体を単離する方法があり、該抗体は、該哺乳類の細胞に該抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、哺乳類に生成される。これらの方法は、プロモータに操作可能に連結されるコード配列を含むＤＮＡプラスミドを該哺乳類の組織に注入するステップと、該ＤＮＡプラスミドの進入および該抗原の発現を可能にするために、該組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて、該組織を電気穿孔するステップと、該抗原に対する抗体を生成するために、該哺乳類が該発現抗原に反応できるステップと、該哺乳類から血清を採取するステップと、該血清から該抗体を抽出するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、抽出された抗体を精製するさらなるステップがある。好ましくは、該組換え抗原は、ウイルス性抗原である。いくつかの実施形態において、該方法は、該抗原が癌抗原ではないことを条件とする。
【００１０】
本発明の多くの目的および利点は、添付の図面を参照することにより、当業者により良く理解され得る。
【００１１】
好適な実施形態の詳細な説明
以下の省略または短縮された定義は、本発明の好適な実施形態の理解を補助するために提供される。本明細書に提供される省略された定義は、網羅的でもなければ、当該分野で理解される定義または辞書の意味に矛盾するものでもない。省略された定義は、本明細書で補助的に提供されるか、または当該分野で周知の定義をより明確に定義する。
【００１２】
「一定の電流」という用語は、本明細書で、同一の組織に送達される電気パルスの継続時間にわたって、組織または該組織を定義する細胞が受ける、または経験する電流を定義するために使用される。電気パルスは、本明細書に記述される電気穿孔装置から送達される。本電流は、本明細書で提供される電気穿孔装置がフィードバック要素を有するため、好ましくは、瞬時のフィードバックを有するため、電気パルスの寿命にわたって該組織に一定のアンペアに維持される。フィードバック要素は、パルスの継続時間中、組織（または細胞）の抵抗を測定でき、同一の組織の電流が、電気パルスにわたって（マイクロ秒程度）、およびパルスからパルスまで一定を維持するように、電気穿孔装置は、その電気エネルギー出力（例えば、電圧の増大）を変化させる。いくつかの実施形態において、該フィードバック要素は、制御器を備える。
【００１３】
「フィードバック」または「電流フィードバック」という用語は、互換的に使用され、かつ、結果的に、標的組織全体にわたって一定レベルで電流を保持するように電極間の組織の電流を測定し、ＥＰ装置により送達されるエネルギー出力を変化させることを含む、提供されたＥＰ装置の活性反応を意味する。本一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気的処理の開始前に、ユーザにより事前設定される。好ましくは、その電気回路が、電極間の組織の電流を継続的に監視でき、監視された電流（または組織内の電流）を事前設定の電流と比較でき、監視される電流を事前設定レベルに維持するために継続的にエネルギー出力調整を行うことができるように、フィードバックは、電気穿孔構成要素、例えば、ＥＰ装置の制御器により達成される。いくつかの実施形態において、フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックのため、瞬時である。
【００１４】
本明細書で互換的に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「動電強化」（「ＥＰ」）という用語は、生体膜に顕微鏡的経路（管孔）を誘導するために、膜貫通電界パルスの使用を意味する。これらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、鉄および水等の生体分子が、細胞膜の一側から他側に通過することを可能にする。
【００１５】
「分散電流」という用語は、本明細書で記述される電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを定義するために使用され、該パターンは、電気穿孔される組織の任意の領域にかかる電気穿孔に関連した熱ストレスの発生を最小化、好ましくは、除去する。
【００１６】
本明細書で使用される「フィードバック機構」という用語は、所望の組織のインピーダンス（エネルギーのパルスの送達前、送達中および／または送達後）を受け取り、現在値、好ましくは、電流と比較し、現在値を達成するために、送達されたエネルギーのパルスを調整する、ソフトウエアまたはハードウエア（またはファームウエア）のいずれかにより実行されるプロセスを意味する。「インピーダンス」という用語は、本明細書で、フィードバック機構を論ずる時に使用され、オームの法則に従う電流値に変換され、したがって、事前設定電流と比較できる。好適な実施形態において、「フィードバック機構」は、アナログ閉ループ回路により実行される。
【００１７】
本発明の態様は、哺乳類の細胞に抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、該哺乳類に該組換え抗原に対する抗体を生成する方法を含む。これらの方法は、プロモータに操作可能に連結されるコード配列を含むＤＮＡプラスミドを該哺乳類の組織に注入するステップと、該ＤＮＡプラスミドの進入および該抗原の発現を可能にするために、該組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて、該組織を電気穿孔するステップと、該抗原に対する抗体を生成するために、該哺乳類が該発現抗原に反応できるステップと、を含む。好ましくは、組換え抗原は、ウイルス性抗原である。いくつかの実施形態において、該方法は、抗原が癌抗原ではないこと条件とする。
【００１８】
別の態様において、所望の抗原に対して特異的な抗体を単離する方法があり、該抗体は、該哺乳類の細胞に該抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、哺乳類に生成する。これらの方法は、プロモータに操作可能に連結されるコード配列を含むＤＮＡプラスミドを該哺乳類の組織に注入するステップと、該ＤＮＡプラスミドの進入および該抗原の発現を可能にするために、該組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて、該組織を電気穿孔するステップと、該抗原に対する抗体を生成するために、該哺乳類が該発現抗原に反応できるステップと、該哺乳類から血清を採取するステップと、血清から該抗体を抽出するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、抽出された抗体を精製するさらなるステップがある。好ましくは、該組換え抗原は、ウイルス性抗原である。いくつかの実施形態において、該方法は、該抗原が癌抗原ではないことを条件とする。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドの注入ステップ、組織の電気穿孔ステップ、および該哺乳類の反応可能ステップを、同一の哺乳類において後日繰り返す、さらなるステップがある。さらに、いくつかの実施例では、この繰り返しステップは、別の後日にさらに繰り返されてもよい。いくつかの実施形態において、後日（つまり、前のＤＮＡプラスミド注入から後日）、同一の哺乳類に抗原のタンパク質追加免疫（言い換えれば、タンパク質変形）を送達する追加のステップがある。
【００２０】
いくつかの実施形態において、注入ステップは、哺乳類の皮内または筋肉内組織への注入を含む。
【００２１】
本明細書で提供される抗体は、ＤＮＡプラスミドが注入された該哺乳類の体液性免疫系により産生される抗体である。該抗体は、該ＤＮＡプラスミドから発現される組換え抗原に特異的である。該抗体は、多くの存在するアイソタイプの１つであってもよいが、好ましくは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプ、より好ましくは、ＩｇＧ２ａアイソタイプである。本明細書で提供される方法を使用して、該哺乳類により産生される抗体は、Ｌｅｅｎａａｒｓ，Ｍ． ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，Ｃ．Ｆ．Ｍ．，Ｉｎｓｔ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓ．４６（３）（２００５）に記述されるものを含む、当業者に利用可能な既知の手法を使用して抽出、および精製される。処理された哺乳類により生成される抗体を単離するステップは、該哺乳類から血清を採取するステップと、該採取した血清から抗体を抽出するステップと、を含む。いくつかの例において、該ステップは、該抽出した抗体を精製するステップを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、該組換え抗原は、免疫原性として同定されるタンパク質の抗原部分であり、該タンパク質は、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）のタンパク質構成成分である。同一のコード配列を送達する他のビヒクルも除外されないが、該組換え抗原は、好ましくは、例えば、哺乳類細胞の最終的なトランスフェクションおよび哺乳類細胞からの発現のためのｐＶＡＸ等のＤＮＡベクターにクローン化されるコード配列の形態である。いくつかの実施形態において、該組換え抗原は、包括的な一覧ではないが、以下から選択される免疫原性抗原である：１つもしくは複数のサブタイプからのＤＩＩＩドメイン抗原等のデングウイルス、ＨＡ、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質、キメラＭ２ｅ−ＮＰ等のインフルエンザウイルス、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ等のＨＩＶウイルス、カプシドタンパク質の一部等のウエストナイルウイルス、および他のウイルスタンパク質。
【００２３】
いくつかの実施形態において、電気穿孔は、ＤＮＡプラスミドが送達される哺乳類の電気穿孔細胞に、電気パルスを送達できる電気穿孔装置により実施される。好ましい電気穿孔装置は、本明細書に記述され、参照による援用によって、さらに含まれる。好ましくは、電気穿孔装置は、好ましくは、パルス継続時間中、一定の電流を提供する、一定電流電気穿孔装置である。好適な電気穿孔装置は、以下の電流範囲の電気パルスを送達できる：約０．０１Ａｍｐ〜約１０．０Ａｍｐ、約０．０１Ａｍｐ〜約５．０Ａｍｐ、約０．０１Ａｍｐ〜約３．０Ａｍｐ、約０．０１Ａｍｐ〜約１．０Ａｍｐ、約０．０５Ａｍｐ〜約１０．０Ａｍｐ、約０．０５Ａｍｐ〜約５．０Ａｍｐ、約０．０５Ａｍｐ〜約３．０Ａｍｐ、約０．０５Ａｍｐ〜約１．０Ａｍｐ、約０．１Ａｍｐ〜約１０．０Ａｍｐ、約０．１Ａｍｐ〜約５．０Ａｍｐ、約０．１Ａｍｐ〜約３．０Ａｍｐ、約０．１Ａｍｐ〜約１．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約１０．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約８．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約５．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約４．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約３．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ〜約２．０Ａｍｐ、約１．０Ａｍｐ、または約２．０Ａｍｐ。
【００２４】
いくつかの実施形態において、電気穿孔装置により送達される電気パルスのパルスパターンは、特に選択され、以下のパラメータを含む：パルスの数、パルス間の時間、およびパルスの長さ。パルスの数は、１つ以上であってもよく、好ましくは、２つまたは３つのパルス、より好ましくは、３つのパルスである。いくつかの実施形態において、電気パルスの送達中のパルス間に遅延時間があり、好ましくは、遅延時間は、約１０秒、約９秒、約８秒、約７秒、約６秒、約５秒、約４秒、約３秒、約２秒、約１秒、約０．８秒、約０．５秒、または約０．２秒、より好ましくは、遅延時間は、約１秒である。各パルスの継続時間は、約０．１ミリ秒〜約１０秒、好ましくは、約１ミリ秒〜約１００ミリ秒〜約１ミリ秒〜約８０ミリ秒〜約１ミリ秒〜約６０ミリ秒〜約１ミリ秒〜約４０ミリ秒〜約１ミリ秒〜約２０ミリ秒、より好ましくは、約５２ミリ秒である。
【００２５】
ＤＮＡプラスミドは、該ＤＮＡプラスミドが電気穿孔後に進入すると、哺乳類細胞で発現できる組換え抗原のコード配列を含むものである。好ましくは、該コード配列は、標的哺乳類で免疫反応を引き起こす共通抗原である。いくつかの実施形態において、該コード配列は、以下の１つもしくは複数を含むことができる哺乳類発現のために最適化されたコンストラクトである：コザック配列の追加、コドン最適化、およびＲＮＡ最適化を含む。いくつかの実施形態において、これらの最適化されたコード配列は、ｐＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化されてもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態において、該ＤＮＡプラスミドは、好ましくは、高収率および／ｃＧＭＰ生産のために強化されるプロセスを使用して、大規模な量で生産されてもよい。好ましくは、哺乳類への送達のために生産されるＤＮＡプラスミドは、高ＤＮＡ濃度に製剤化されてもよい。ＤＮＡプラスミド生産プロセスは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞等の菌細胞のトランスフェクションにより実施されてもよい。本明細書で記述するＤＮＡプラスミド生産を考慮するプロセスは、米国特許第７，２３８，５２２号に開示されたプロセス、および第１２／１２６，６１１号（まだ公開されていないが、２００８年５月２３日出願）を有する米国特許出願において改善されたプロセスを含み、両方ともその全体が本明細書に援用される。該ＤＮＡプラスミドは、好ましくは、哺乳類対象への注入のために、安全で効果的であるように製剤化される。好ましくは、該ＤＮＡプラスミドは、濃縮形態で製剤化される。
【００２７】
電気穿孔および電気穿孔装置
本発明のＤＮＡワクチンの送達を容易にするための好適な電気穿孔装置および電気穿孔方法の実施例は、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらの米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されるものを含み、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。また、その全てが本明細書に援用される、２００６年１０月１７日に出願された米国仮特許第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された第６０／９７８，９８２号への３５ ＵＳＣ １１９（ｅ）の下に利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属および共同所有される米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供される、ＤＮＡワクチンの送達を容易にするための電気穿孔装置および電気穿孔方法も、好適である。
【００２８】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらの米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を容易にするためのモジュラ電極システムおよびそれらの使用を記載している。該モジュラ電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な一定電流パルス制御器から複数の針電極に導電連結を提供する電気コネクタ、および電源を含む。操作者は、支持構造に搭載される複数の針電極を把持でき、これらを身体または植物の選択された組織にしっかり挿入できる。生体分子は、それから、皮下針を介して、選択された組織に送達される。プログラム可能な一定電流パルス制御器が起動され、一定電流パルスが複数の針電極に適用される。適用される一定電流電気パルスは、複数の電極間で、細胞への生体分子の導入を容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照により本明細書に援用される。
【００２９】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に容易にするために使用され得る電気穿孔装置を記載している。該電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアにより特定される動電装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、ユーザコントロールおよびパルスパラメータの入力に基づくアレイの電極間で、一連のプログラム可能な一定電流パルスパターンを作製し、電流の波形データの保存および取得を可能にする。該電気穿孔装置は、針電極のアレイ、挿入針用の中央注入チャネル、および脱着可能なガイドディスクを有する、交換可能な電極ディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容が、参照により本明細書に援用される。
【００３０】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイおよび方法は、筋肉等の組織だけでなく他の組織または臓器への深部進入に適応される。電極アレイの配置のため、（選択の生体分子を送達するための）注入針は、また、標的臓器に完全に挿入され、挿入は、電極により事前に示される領域の標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは、長さが２０ｍｍで、ゲージが２１である。
【００３１】
以下は、本発明の方法の実施例であり、上で論じた特許参考文献に詳細に論じられている。電気穿孔装置は、ユーザにより入力された事前設定電流に類似する一定電流を発生するエネルギーのパルスを、哺乳類の所望の組織に送達するように構成されてもよい。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含む。電気穿孔構成要素は、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスター、波形記録計、入力要素、状態報告要素、通信ポート、記憶構成要素、電源、および電源スイッチを含む、１つもしくは複数の電気穿孔装置の様々な要素を含み、組み込むことが可能である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の一要素として機能可能であり、他の要素は、電気穿孔構成要素と連通する別の要素（または構成要素）である。いくつかの実施形態において、電気穿孔構成要素は、まだ電気穿孔構成要素から離れた他の電気穿孔装置の要素と連通してもよい、一要素以上の電気穿孔装置として機能できる。本発明は、要素が、一装置として、または互いに連通する別の要素として機能できるため、１つの電気機械的または機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素により制限されない。電気穿孔構成要素は、所望の組織に一定電流を生じるエネルギーのパルスの送達が可能であり、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置に複数の電極を有する電極アレイを含み、該電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からエネルギーのパルスを受け取り、電極を通して所望の組織にそれらを送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中、中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定し、電気穿孔構成要素にインピーダンスを伝達する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取ることができ、一定電流を保持するように、電気穿孔構成要素により送達されるエネルギーのパルスを調節できる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパスルを送達できる。いくつかの実施形態において、複数の電極は、プログラム化シークエンス下で、電極の制御により分散パターンでエネルギーのパルスを送達でき、該プログラム化シークエンスは、ユーザにより、電気穿孔構成要素に入力される。いくつかの実施形態において、プログラム化シークエンスは、連続的に送達される複数のパルスを含み、該複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する中性電極とともに少なくとも２つの活性電極により送達され、該複数のパルスの後続のパルスは、インピーダンスを測定する中性電極とともに少なくとも２つの活性電極の異なる１つにより送達される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアにより実行される。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実行される。好ましくは、本フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓ毎に生じるが、好ましくは、リアルタイムフィードバックまたは瞬時（つまり、反応時間を決定するための利用可能な手法により決定されるように、実質的に瞬時）である。いくつかの実施形態において、中性電極は、所望の組織のインピーダンスを測定し、フィードバック機構にインピーダンスを伝達し、フィードバック機構がインピーダンスに反応し、事前設定の電流に類似する値で一定電流を保持するように、エネルギーのパルスを調節する。いくつかの実施形態において、フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達中、継続的かつ瞬時に一定電流を保持する。
【００３４】
ワクチンおよび製剤
医薬的に許容される賦形剤は、公衆に周知で、容易に入手可能である、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤等の機能分子を含むことができる。好ましくは、該医薬的に許容される賦形剤は、アジュバントまたはトランスフェクション促進剤である。いくつかの実施形態において、核酸分子、またはＤＮＡプラスミドは、ポリヌクレオチド機能賦活薬または遺伝的ワクチン促進剤（またはトランスフェクション促進剤）の投与と併用して細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能賦活薬は、米国特許第５，５９３，９７２号、および１９９４年１月２６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載されており、それぞれ、参照により本明細書に援用される。遺伝的ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日に出願された、米国特許第０２１，５７９号に記載されており、参照により本明細書に援用される。トランスフェクション促進剤は、核酸分子を有する混合物として核酸分子と併用して投与されるか、または核酸分子の投与前または後に、別々に、同時に投与されてもよい。トランスフェクション促進剤の実施例は、免疫感作複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、およびスクアランとスクアレン等の小胞を含み、およびヒアルロン酸も、遺伝的コンストラクトとの併用投与に使用され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドワクチンは、リピド、ＤＮＡリポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照）として、当該分野で周知のレシチンリポソームもしくは他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤等を含むトランスフェクション促進剤も含み得る。好ましくは、該トランスフェクション促進剤は、ポリＬグルタミンを含むポリアニオン、ポリカチオン、またはリピドである。
【００３５】
いくつかの好適な実施形態において、ＤＮＡプラスミドは、このような標的タンパク質に対して免疫反応をさらに強化するタンパク質の遺伝子であるアジュバントとともに送達される。このような遺伝子の実施例は、αインターフェロン、γインターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびシグナル配列が削除され、任意にＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５等の他のサイトカインおよびリンホカインをコードする遺伝子である。有用であり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌ、ＭＩＰ−１、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン反応遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能的フラグメントをコードする遺伝子を含む。
【００３６】
本発明に従う医薬的組成物は、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、好ましくは、約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、より好ましくは、約１ミリグラム〜約２ミリグラムのＤＮＡ量を含む。いくつかの好適な実施形態において、本発明に従う医薬的組成物は、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態において、該医薬的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含む。
【００３７】
本発明に従う医薬的組成物は、使用される投与形態に従い、製剤化される。医薬的組成物が、注射用医薬的組成物の場合、これらは、無菌で、発熱物質不含、および微粒子不含である。好ましくは、等張製剤が使用される。一般的に、等張性添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水等の等張液が好まれる。安定剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。いくつかの実施形態において、ＬＧＳまたは他のポリカチオンもしくはポリアニオン等の、長期間、室温つまり周囲温度で安定する製剤を可能にする安定剤が、製剤に添加される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、コンセンサスインフルエンザ抗原に対して、哺乳類に免疫反応を誘導する方法は、粘膜免疫反応の誘導方法を含む。このような方法は、上述の共通インフルエンザ抗原を含むＤＮＡプラスミドと併用して、１つもしくは複数のＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的フラグメント、またはそれらの発現可能コード配列を哺乳類に投与するステップを含む。１つもしくは複数のＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的フラグメントは、本明細書で提供されるＤＮＡプラスミドインフルエンザワクチンの投与前に、同時に、または後に投与され得る。いくつかの実施形態において、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣおよびそれらの機能的フラグメントから成る群から選択される、１つもしくは複数のタンパク質をコードする単離された核酸分子は、哺乳類に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ウサギおよびマカク血清を使用して実施されたＥＬＩＳＡアッセイを表すグラフを示す。ウサギ（上のパネル）およびマカク（下のパネル）を、指示された時間点（黒矢印）で、プラスミドＤＮＡを用いて免疫化した後、筋肉内タンパク質追加免疫（灰色の矢印）した。抗体力価は、免疫前血清の対応する希釈と比較した、４５０ｎｍでの光学密度の２倍を産生する免疫血清の希釈に基づく。
【図２】ウサギおよびマカク血清を使用して実施された中和（Ａ、Ｂ）アッセイを表すグラフを示す。抗体力価は、免疫前血清の対応する希釈と比較した、４５０ｎｍでの光学密度の２倍を産生する免疫血清の希釈に基づく。中和アッセイは、ＴＺＭｂ１細胞を使用して、単離されたＳＨＩＶＢａ−Ｌ（Ａ、Ｂ；上のパネル）およびＳＨＩＶ１６２Ｐ４（Ａ、Ｂ、下のパネル）に対して実施した。力価は、未処理の対照と比較した、５０％の感染阻害を示す免疫血清の希釈として示す。アッセイで試験された最低血清希釈は、示（点線）すように、１：５であった。マカク（Ｂ）において、血清は、免疫前（研究の前）、研究の６週目および２３週目にアッセイした。
【図３】血清抗体を関数として評価したＥＣ−ＴＭプラスミド電気穿孔の最適な電流電圧を表すグラフを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、５０ｍｇのＥＣ−ＴＭプラスミドを用いてワクチン接種し、０．２、０．３または０．４Ａで電気穿孔した。２週間後、血清を採取し、特定の抗体力価を評価した。グラフは、ＣＣＥの電流強度（アンペア）と抗体反応との間の逆相関方向へのトレンドを示す。各記号は、個々のマウスの平均血清を示すが、水平バーは、中間値を指す。
【図４】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｐ１８５neu抗体反応の誘導を表すグラフを示す。該マウスを５、１０、２５および５０μｇのＥＣ−ＴＭプラスミドおよび０．２Ａ ＣＣＥを用いてワクチン接種した。血清の抗ｐ１８５neu抗体力価をワクチン接種から４週間後に採取した。抗体の平均力価は、注入されたプラスミド量と共に増大するようである。５０μｇのプラスミドを用いてワクチン接種されたマウスの抗体力価は、５、１０および２５μｇ（それぞれ、Ｐ＝０．００４１、０．０２４４および０．０４２４）を用いてワクチン接種されたマウスに比べて有意に高かった。各記号は、個々のマウスの平均血清を示すが、水平バーは中間値を指す。
【図５】特定のアイソタイプにおけるｐ１８５neu抗体反応の誘導を表す棒グラフを示す。個々のマウスからの血清を電気穿孔から２週間後に採取し、その血清を統合して抗ｐ１８５neu抗体のアイソタイプ構成成分を評価した。データは、免疫血清および特定の抗ＩｇＧサブクラスＦＩＴＣ抱合抗体を用いてインキュベートした後に染色したｐ１８５neu+細胞の割合（％）として報告する。
【図６】マウスの異なる筋肉で測定されたＳＥＡＰ発現レベルを示す。マウスは、前脛骨（ＴＡ）筋または腓腹（Ｇ）筋に１０μｇのＣ５−１２−ＳＥＡＰプラスミドを注入し、４秒または８０秒の遅延の後ＥＰ（電気穿孔）を実施した。マウスに、また、ＥＰ（ＥＰなし）を用いず、１０μｇのｐｆ Ｃ５−１２−ＳＥＡＰプラスミドを注入した。血清ＳＥＡＰレベルは、ＥＰ（＊Ｐ＜１．３Ｅ−２１）なしでプラスミドを受けた対照マウスと比較して、ＴＡ筋およびＧ筋注入マウスで高かった。プラスミドバックボーン（ＮＢ）なしで発現カセットを注入し、それから電気穿孔したマウスは、ＥＰなしのＮＢ群よりＳＥＡＰレベルが高かった。しかしながら、ＮＢ群は、同一筋肉（ＴＡ４秒と比較して、ＮＢ４秒、＊＊Ｐ＜０．００８；ＴＡ８０秒と比較して、ＮＢ８０秒、＊＊＊Ｐ＜０．００４）において、Ｃ５−１２−ＳＥＡＰを投与された動物より有意に低かった。ＴＡ筋に注入されたマウスは、Ｇ筋に注入されたマウスより高い発現を得、ＴＡ筋への注入とＥＰとの間の遅延を８０秒から４秒へ減らしても、発現に影響しなかった。
【図７】偏在性ＣＭＶプロモータにより駆動されたＳＥＡＰ発現が、様々な電流設定で、マウスの異なる筋肉で測定されたことを示すグラフを示す。プラスミド製剤を試験した：生理食塩水、生理食塩水＋ＬＧＳ、水、または水＋ＬＧＳ。ＴＡ筋における０．１Ａでの生理食塩水＋ＬＧＳ製剤が、最高の発現を得た。プラスミドを水に製剤化し０．２Ａの電気穿孔法でプラスミドを導入したマウスは、同一の筋肉に０．１Ａを受けたマウス（ＴＡでは＊Ｐ＜０．０５およびＧでは＊＊Ｐ＜０．００１）より有意に低いＳＥＡＰレベルを得た。水＋ＬＧＳをプラスミド製剤として使用した時、血清ＳＥＡＰレベルでの差異は、ＴＡ筋では有意ではなかったが、Ｇでは有意であった（＊＊＊Ｐ＜０．０４）。
【図８】プラスミドが（Ａ）生理食塩水＋ＬＧＳで製剤化された時のＧ筋における、および（Ｂ）水＋ＬＧＳで製剤化された時のＴＡ筋における、０．１Ａの電流で処置されたマウスで最も高かった、処置から１４日後に測定された抗ＳＥＡＰ抗体ＨＩ力価を示す。
【図９】注入後３５日目のブタ血清におけるＨＩ力価の結果の棒グラフを示す。最も高い力価は、０．５Ａの電流設定で、２ｍｇのＨＡ発現プラスミドを投与された群で見られた（１２０±４０、＊Ｐ＝０．１１対２ｍｇ／０．３Ａおよび＊Ｐ＝０．０２対２ｍｇ／０．１Ａ）。下行用量のプラスミドを投与され、０．５Ａで電気穿孔された３群も、ＨＩ力価の減少を示した。
【図１０】ワクチン接種後のフェレットにおけるＨＩ力価の結果の棒グラフを示す。アッセイは、疾病管理センターから入手した合併結合変異ウイルス（Ａ／Ｖｉｅｔ／１２０３／０４またはＩｎｄｏ／０５／２００５インフルエンザ株）を使用して実施した。
【図１１】２回目の免疫から３週間後に測定されたＨＩ力価の結果の棒グラフを示す。ＩＤを免疫した後にＥＰが行われたマカクは、他の全ての群より有意に高いＨＩ力価を示した（Ｐ＜０．０３）。未処理の対照群は、任意のＨＩ力価を示さなかった。
【実施例】
【００４０】
本発明を、以下の実施例において、さらに説明する。これらの実施例は、本発明の好適な実施形態を示すが、単に例示として示されることを理解されたい。以上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認でき、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合するように、本発明の様々な変更および修正を行うことが可能である。したがって、本明細書に示され、かつ記載される実施例に加え、本発明の様々な修正が、前述から、当業者に明らになる。このような修正は、また、付属の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
【００４１】
好ましくは、本明細書に記載されるＥＰ装置を用いて使用するＤＮＡ製剤は、高ＤＮＡ濃度、好ましくは、皮膚への送達のために最適である小容量でのＤＮＡのグラム量を含む濃度、好ましくは、少量の注入量、理想的には、２５〜２００マイクロリットル（μＬ）を有する。いくつかの実施形態においてＤＮＡ製剤は、１ｍｇ／ｍＬ以上（製剤のｍｇ ＤＮＡ／容量）等の高ＤＮＡ濃度を有する。より好ましくは、該ＤＮＡ製剤は、２００μＬの製剤におけるグラム量のＤＮＡ、より好ましくは、１００μＬの製剤におけるグラム量のＤＮＡを提供するＤＮＡ濃度を有する。
【００４２】
本発明のＥＰ装置を用いて使用するＤＮＡプラスミドは、既知の装置および手法の組み合わせを使用して製剤化または製造されてもよいが、好ましくは、２００７年５月２３日に出願された、共同所有、同時係属の米国仮出願第６０／９３９，７９２号に記載される、最適化されたプラスミド製造手法を使用して製造される。いくつかの実施例において、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬを超える、または１０ｍｇ／ｍＬに同一の濃度で製剤化されてもよい。製造手法は、２００７年７月３日に出版された、共同所有の特許である、米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許第６０／９３９７９２号に記載されるものに加え、当該分野の当事者に一般的に知られる様々な装置およびプロトコルも含む、または援用する。ＥＰ装置を用いて使用されるプラスミドの高濃度、および本明細書に記載する送達手法は、適度な低容量で、皮内／皮下空間に、または必要ならば筋肉内的（用量のため）に、プラスミドの投与を可能にし、発現および免疫効果の強化を助ける。共同所有される出願および特許である、米国特許第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が本明細書に援用される。
【００４３】
実施例１ ＨＩＶ−１ ｅｎｖに対する抗体
材料および方法
抗原およびペプチド
コドン最適化ＨＩＶ−１ ｅｎｖ（Ｂａ−Ｌ）およびｐ５５ｇａｇ（９６ＺＭ６５１）遺伝子をコードするＣＭＶプロモータ駆動プラスミドを、Ｃｒｉｓｔｉｌｌｏ，Ａ．Ｄ．らのＶｉｒｏｌｏｇｙ ３４６（１），１５１−６８（２００６）に記述されているように製剤化した。ＣＭＶプロモータの制御下で、組換えｇｐ１２０（ｃｌａｄｅ Ｂ）を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で発現し、Ｃｒｉｓｔｉｌｌｏら（２００６）において以前報告されるように精製した。組換えＨＩＶ−１ ＨＸＢ２ ｐ４１タンパク質を発現し、形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから精製した。タンパク質をＱＳ−２１アジュバント（抗原ｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を用いて製剤化した。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ（ＢａＬ）およびＧａｇ（ＨＸＢ２）タンパク質を合成した（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ）。
【００４４】
電気穿孔されたＤＮＡにより誘導される抗外被結合および中和抗体
ニュージーランド産シロウサギを、上の材料および方法のセクションで概説したように免疫化した。電気穿孔によるＤＮＡの単回投与後、ＤＮＡがＩＭ経路で送達された時に観察されなかった抗ｇｐ１２０抗体を検出した（図１、上のパネル）。力価は、いずれかの経路による３回の追加ＤＮＡ投与後（図１、上のパネル、黒色の矢印）、増加することが分かり、また、最終ＤＮＡ免疫化２週間後（１４週目）でのＩＭ経路で免疫化されたウサギと比較して、電気穿孔で免疫化されたウサギにおいて、有意に大きい（ｐ＜０．０００１）ことが分かった。この所見は、ＩＭ（１ｍｇ）送達と比較して、５倍少ないＤＮＡが電気穿孔（２００μｇ）による免疫化で使用されたことを考えると、特に興味深い。ＩＭ経路によるＱＳ−２１製剤ｇｐ１２０タンパク質の単回投与（図１、上のパネル、灰色の矢印）は、両方のＤＮＡ感作群で同程度の抗体力価をもたらした。ウサギが休んでいる時、ＩＭ送達ＤＮＡで感作された群での抗体レベルは、電気穿孔群のレベルより迅速な動態を伴って減少することが分かった。これは、電気穿孔群とＩＭ群（ｐ＜０．０００１）との間で、６２週目（最終免疫化後４１週目）に観察された力価から明らかになった。
【００４５】
マカクに、ｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子の両方をコードするプラスミドを電気穿孔法で導入したが、両方の抗原への抗体の誘導が、免疫化後に誘導されたかどうかを評価することが目的であった。マカクにおいて、測定可能な抗ｇｐ１２０抗体は、２回のＤＮＡ免疫化後に検出されたが、該抗体が３度目の免疫化後に増加した（図１、下のパネル）。ウサギにおける我々の発見と一致して、４度目のＤＮＡ投与は、顕著に抗体力価をさらに増大しなかった。
【００４６】
ＤＮＡで感作されたマカクを、それから、ＱＳ２１製剤タンパク質を用いて追加免疫する前に、９週間、休ませた。抗Ｅｎｖ抗体力価のさらなる増加が、ｇｐ１２０タンパク質を用いたマカクの追加免疫後に観察された。本抗体レベルは、６２週目に測定された力価から実証されるように、次の４１週間持続した。これらのレベルは抗ｇｐ１２０抗体より速い速度で減衰することが分かったが（データ示さず）、抗Ｇａｇ抗体の類似した誘導も、ＤＮＡ電気穿孔後それらの動物において観察された。さらに、組換えｇｐ４１Ｇａｇタンパク質を用いたＤＮＡで感作された動物の追加免疫は、固体反応を増大したが、そのレベルも、タンパク質追加免疫後の抗Ｅｎｖ抗体力価より低かった（データ示さず）。
【００４７】
免疫血清の機能的特性は、相同（ＳＨＩＶBa-L）および異種（ＳＨＩＶ162P4）単離体の中和をアッセイすることにより評価された。ＳＨＩＶBa-L（図２Ａ、上のパネル）およびＳＨＩＶ162P4（図２Ａ、下のパネル）に対する抗体の中和は、ＩＭ経路による４回のＤＮＡ免疫化後１４週目まで、ウサギの血清において検出されなかった。しかしながら、このような抗体は、２回のＤＮＡ投与後、電気穿孔により免疫化されたウサギの血清での両方の中和感受性単離体で、明らかに検出された。ＤＮＡで感作されたウサギが、ｇｐ１２０／ＱＳ−２１の単回ＩＭ投与を用いて追加免疫された時、中和抗体力価は、両方のＤＮＡ感作群で増加することが分かったが、そのレベルは、ＩＭ経路と比較して、ＤＮＡが電気穿孔により送達されたウサギで高かった。
【００４８】
ＳＨＩＶBa-L（図２Ｂ、上のパネル）およびＳＨＩＶ162P4（図２Ｂ、下のパネル）に対する抗体の類似した中和が、２回のＤＮＡ電気穿孔後（６週目）のマカクの血清で検出された。加えて、これらの力価は、ＩＭタンパク質追加免疫後の２週目の２３週目でさらに追加免疫された。
【００４９】
ヒト以外の霊長類における抗体レベル（図１、下のパネル）は、研究の最大６２週目まで維持することが分かった。同様に、ウサギにおける抗体減少の動態（図、上のパネル）は、電気穿孔法により免疫化された動物と比較して、ＩＭ経路により免疫化された動物で、より迅速であることが分かった。
【００５０】
実施例２ ｐ１８５neuに対する抗体
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（生後６週間）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＢＡＬＢｎｅｕＴ664V-Eマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）により、特定病原体未感染状態下で飼育された。Ｆｃ−γＲＩ／ＩＩＩ（ＢＡＬＢｎｅｕＴ664V-E／ＦｃγＲＩ／ＩＩＩ）の遺伝子がノックアウトされたＢＡＬＢｎｅｕＴ664V-Eマウスは、ＢＡＬＢｎｅｕＴ664V-Eマウスを、親切にもＤｒ Ｒ Ｃｌｙｎｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ＮＹ）により提供された、ＦｃγＲＩ／ＩＩＩ受容体の遺伝子がノックアウトされたＢＡＬＢ／ｃマウスと交配させることにより産生した。腫瘍の発現を観察するために、隔週で、乳腺を検査した。２つの垂直径で、カリパーを用いて腫瘍量を測定した。１ｍｍ平均径以上の進行性増殖腫瘤を腫瘍とみなした。腫瘍なしマウスの割合（％）（非坦癌マウス）を評価した。欧州連合ガイドラインに従い、マウスを処理した。
【００５１】
プラスミドおよび電気穿孔
ｐ１８５neu（ＥＣ−ＴＭプラスミド）の細胞外および膜貫通ドメインをコードするｐｃＤＮＡ３ベクターを産生し、前述のように使用した（Ｒｏｖｅｒｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ２０００；１６５：５１３３-５１４２）。ＤＮＡを沈殿させ、１ｍｇ／ｍｌの無菌生理食塩水で懸濁し、免疫化プロトコルに使用するために、−２０oＣのアリコートで保管した。
【００５２】
ＤＮＡ電気穿孔のために、０．１％のポリＬグルタミンを有する２５μｌ無菌生理食塩水中のＥＣ−ＴＭまたはｐｃＤＮＡ３プラスミドを、麻酔をかけたマウスの腓腹筋に注入した。各指定された時間に、５〜５０μｇのプラスミドを動物に注入した。パルス間で継続時間が１秒の、２０ｍｓの２つの一定電流方形波パルスを、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応電気穿孔装置および皮膚電極アセンブリ（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して、４秒後に適用した。皮膚電極アセンブリの電極は、長辺が５ｍｍで、短辺が３ｍｍの二等辺三角形の形状である。０．２Ａ、０．３Ａおよび０．４Ａが使用された電気穿孔条件実験を除き、０．２Ａの一定電流設定を、全ての癌ワクチン実験に使用した。筋肉抵抗は、１６０Ｖから１９５Ｖの算出電圧を伴う、８００から１０００Ωの間であることが測定された。
【００５３】
抗ｐ１８５neu抗体の評価
ＢＡＬＢ／ｃマウスからの血清を、ワクチン接種後、２、４または６週目に採取し、ＰＢＳ−アジド−ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ−ａｚｉｄｅ−ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で、１：５０に希釈した。抗ｐ１８５neu抗体の存在は、野生型または野生型ｐ１８５neuマウスクラスＩ Ｈ−２ＫdおよびＢ７．１遺伝子（ＢＡＬＢ／ｃ ＮＩＨ３Ｔ３−ＮＫＢ）で安定に同時にトランスフェクトされたＢＡＬＢ／ｃ ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を使用して、フローサイトメトリにより判断した。結合一次抗体を検出するために、マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｄａｋｏ−Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｔａｌｙ）に特異的なＦＩＴＣ−抱合型ヤギ抗マウス抗体を使用した。正常なマウス血清を負の対照とした。ｐ１８５neuタンパク質の細胞外ドメインを認識するモノクローナルＡｂ４抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、正の対照として使用した。血清中の抗ｐ１８５neu抗体の濃度（ｍｇ／ｍｌ）を決定するための検量線を作製するために、連続Ａｂ４希釈物を使用した。ＣｙＡｎ ＡＤＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｔａｌｙ）を用いて、フローサイトメトリ分析を実施した。アイソタイプの判定は、間接的免疫蛍光手順により実行した。
【００５４】
ＰＢＳ−ａｚｉｄｅ−ＢＳＡ中で血清を１：２０に希釈し、４oＣで、４５分間、２×１０5ＢＡＬＢ／ｃ ＮＩＨ３Ｔ３−ＮＫＢ細胞を用いてインキュベートした。洗浄後、ラットビオチン抱合抗体抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて、３０分間、それから、５ｍｌのストレプトアビジン−フィコエルトリン（ＤＡＫＯ）を用いて、３０分間、細胞をインキュベートし、１ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ−アジド−ＢＳＡ中で再懸濁した。サンプルをＣｙＡｎ ＡＤＰで評価し、データをｐ１８５neu＋細胞の割合（％）として報告した。
【００５５】
野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ｐ１８５ｎｅｕ反応の誘導
マウスに、５０μｇのＥＣ−ＴＭプラスミドを注入し、０．２Ａ〜０．４Ａの異なる一定電流設定で、一定電流電気穿孔（ＣＣＥ）を投与した（図３）。ＥＣ−ＴＭプラスミドを用いたワクチン接種により誘導される最も明らかな免疫反応は、抗ｐ１８５neu抗体の上昇のため、ワクチン接種２週間後に血清を採取し、特定の抗体力価を評価した。誘導された抗ｐ１８５neu抗体の力価は、電気電流アンペアの強度に反比例するようである。最低電流設定の０．２Ａが、全ての他の実験に使用された。ｐ１８５neuタンパク質に対する抗体の誘導が、増大した用量のＥＣ−ＴＭプラスミドを用いて、一定電流電気穿孔されたマウスで評価された。ＣＣＥから２および４週間後に採取された個々のマウスからの血清は、全ての用量のＥＣ−ＴＭプラスミドが、ワクチン接種から２（データ示さず）および４週間後の両方で、抗ｐ１８５neu抗体を誘導できたことを示した。電気穿孔から４週間後、５０μｇのＥＣ−ＴＭプラスミドを一定電で流電気穿孔したマウスから得た血清は、最も高い力価を示した（図４ａ）。さらに、ＣＣＥから２週間後に採取された血清は、抗ｐ１８５neu抗体のアイソタイプ成分を評価するために統合し、０．２Ａ条件が、ｎｅｕ＋腫瘍に対する抗腫瘍活性において最も効果的な抗体である、ＩｇＧ２ａ（図４ｂ）へのアイソタイプ転換を強く誘導したことを示した。
【００５６】
癌ワクチン実験において、電流設定（０．２Ａ）の一定電流電気穿孔が、効果的なレベルのＩｇＧ２抗体を誘導する。高い電流設定（０．３および０．４Ａ）は、おそらく、より多くの筋肉損傷を伴う、ＥＣ−ＴＭプラスミド発現の減少、したがって、特定の抗体力価の減少を導く低効率な電気穿孔をもたらした。
【００５７】
実施例３ マウスにおけるＳＥＡＰに対する抗体
プラスミドコンストラクト
偏在性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータは、ｐＣＭＶ−ＳＥＡＰベクターにおいて、ヒト分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータ導入遺伝子産物の発現を導く。商業的に入手可能なキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、プラスミドを得た。運動発色性ＬＡＬ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）により測定されたエンドトキシンレベルは０．０１ＥＵ／μｇ以下であった。共通ＨＡおよびＮＡコンストラクトは、近年、ヒトに致命的であると証明された１６Ｈ５ウイルスからの、および４０以上のヒトＮ１ウイルスからの一次ウイルス配列を分析することにより生成した。これらの配列は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのインフルエンザ配列データベースからダウンロードした。共通配列を生成した後、コザック配列、コドン最適化、およびＲＮＡ最適化の追加を含む、哺乳類発現のために、コンストラクトを最適化した。これらのコンストラクトは、それから、ｐＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化した。特に記載がない限り、プラスミド製剤は、無菌水で希釈し、ポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩（ＭＷ＝１０．５ｋＤａ ａｖｅｒａｇｅ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、１％重量／重量に製剤化し、さらに、ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）で、ＨＰＬＣにより精製した。
【００５８】
マウスへの発現コンストラクトの注入
最初の実験において、Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（１０匹／群）の群は、４または８０秒の遅延時間で、０．１Ａの一定電流で、前脛骨筋（ＴＡ）または腓腹（Ｇ）筋に、筋特異的合成プロモータ（ｐＳＰｃ５−１２−ＳＥＡＰ）の制御下で、１０μｇのプラスミド発現ＳＥＡＰを注入した。対照群は、ＥＰを用いずに（ＥＰなし）、ＴＡにプラスミドを導入した。追加群のマウスに、ＴＡ筋およびＧ筋に、ＥＰを用いて、およびＥＰを用いずに、等モル濃度で、プラスミドバックボーン（ＮＢ）が欠損した、同一のプロモータ、導入遺伝子、および３’ポリアデニル化信号を有する発現カセットを導入した。
【００５９】
第２のマウス実験において、一群に５匹のマウス×１６群（総数８０匹のマウス）を使用した（表１）。様々な製剤（生理食塩水、生理食塩水＋１％ＬＧＳ、水、水＋１％ＬＧＳ）かつ電流強度で、５０μｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（１０ｍｇ／ｍＬで）を、マウス（５匹／群）に注入した。マウスは、ＴＡ筋またはＧ筋へのＩＭ注入のために、様々な電流（０．１Ａ〜０．２Ａ）を用いて、４秒の遅延時間で、電気穿孔した。
【００６０】
全ての場合において、マウスを３日間、順化し、体重を測定し、耳にタグを付けた。食餌および水は、実験期間中、自由に利用できた。研究０日目、動物の体重を測定し、採血し、齧齒用の組み合わせ麻酔−キシラジン（３７．５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍＬ／３０グラム体重）、ケタミン（１．９ｍｇ／ｍＬ、０．０１６ｍＬ／１０グラム体重）、アセプロマジン（０．３７ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍＬ／１５グラム体重）を使用して麻酔をし、プラスミドをデザイン毎に投与し、電気穿孔した。
【００６１】
０、４、７、および１１日目に、それぞれ、マウスの体重を測定し、血液を、後眼窩出血を介してマイクロチューブに採取した。血液を室温で１０〜１５分間、凝血させ、その後、１０分間、３０００ｘｇで遠心分離し、さらなる分析まで血清を−８０℃で保管した。
【表１】
【００６２】
ＳＥＡＰアッセイ
血清サンプルを解凍し、ＳＥＡＰ活性を測定するために、ホスホ光化学発光レポータアッセイキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して５０μＬをアッセイした。アッセイの検出の下限は、３ｐｇ／ｍＬである。ＳＥＡＰ活性のアッセイ前に、より濃縮された血清サンプルを、対照種の特異的な血清で、１：１０に希釈した。全てのサンプルをＬＵＭＩｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙルミノメータ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して読み取った。
【００６３】
ＳＥＡＰ間接ＥＬＩＳＡ
ヒトＳＥＡＰタンパク質に対する免疫原性を、ＣｈａｓｔａｉｎらのＪ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ２００１ Ａｐｒ；９０（４）：４７４−８４からの修正手順を使用して、マウスにおいて測定した。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）プレートを、一晩、４℃で、ＰＢＳ（１００ナノグラム／ヒト胎盤アルカリホスファターゼのウェル（Ｓｉｇｍａ）を含む１００μｌ）中で、精製したヒト胎盤アルカリホスファターゼで被覆した。プレートをデカントし、３回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）（遮断溶液）を使用して遮断し、室温で２時間、インキュベートした。血清サンプルを１：１００に希釈した後、別の希釈プレートにおいてＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０の１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で、１：４に段階希釈した。プレートから遮断溶液をデカントした。１００μｌの希釈された試験血清を各ウェルに添加し、室温で２時間、インキュベートした。血清希釈をデカントし、３回洗浄した。二次抗体（ホスラディッシュペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス抗体）を、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の１％ ＢＳＡで、１：１０００に希釈し、室温で１時間、インキュベートした。プレートをデカントし、洗浄した。０．１Ｍのクエン酸緩衝液中で、１００μｌのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質を各ウェルに添加（０．６７ｍｇ／ｍＬ）し、８分間、インキュベートし、１００μｌの１Ｍ Ｈ2ＳＯ4を、反応を停止するために添加した。吸光度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４プレート読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、４９０ｎｍで測定した。
【００６４】
ＳＥＡＰ発現プラスミド注入が、注入とＥＰ間の遅延時間が８０秒および４秒の両方で、ＴＡ筋対Ｇ筋に投与されると、発現が増大した（図５）。ＳＰｃ５−１２−ＳＥＡＰプラスミドが、ＴＡ筋に注入されると、血清ＳＥＡＰレベルは、ＥＰ（Ｐ＜１．３Ｅ−２１）を用いずにプラスミドを導入した対照動物より２８５倍高く、ＴＡ筋（３５７±６対３５７±６．２ｐｇ／ｍＬ／ｇ）における４秒と８０秒間の遅延時間には、差異は観察されず、同一条件下でのＧ筋への注入は、対照群（Ｇ８０秒対ＥＰなし対照、Ｐ＜０．００３；Ｇ４秒対ＥＰなし対照、Ｐ＜７．７Ｅ−０６）より９０〜１８２倍高いＳＥＡＰレベルを生じた。（バックボーンなし（ＮＢ）だが、同一のプロモータ、導入遺伝子、および３’ポリアデニル化信号を有する）発現カセットを含むプラスミドフラグメントのみを、等モル製剤で、ＴＡ筋およびＧ筋に注入した時、発現レベルは、ＩＭ＋ＥＰ（８０秒対ＥＰなし、Ｐ＜１．８Ｅ−０８；４秒対ＥＰなし、Ｐ＜３．８Ｅ−０５）を受けなかった対照群より２１０〜２５０倍であった。ＴＡ８０秒でのＳＥＡＰ発現は、ＮＢ８０秒群（Ｐ＜０．００８）より２４％高く、一方、ＴＡ４秒は、ＮＢ ４秒群（Ｐ＜０．００４）より高かった。Ｃ５−１２−ＳＥＡＰおよびＥＰを用いない（ＥＰなし）ＮＢを投与された両群は、ほとんどＳＥＡＰを発現しなかった。
【００６５】
マウス−ＳＥＡＰ発現は製剤に依存する
ＳＥＡＰ導入遺伝子が偏在性プロモータの制御下である時のＳＥＡＰレベルの差異を評価した（対 最初のマウス実験で使用された筋特異的プロモータ）。発現レベルは、プラスミド注入ＥＰ手順がＴＡ筋対Ｇ筋（Ｐ＝０．０５）で実施された場合に上昇することが分かった（図６）。この特定の実験において、生理食塩水＋ＬＧＳ製剤は、群内変動が高かったために統計学的優位性は達成しなかったが、生理食塩水製剤（それぞれ、４１．１±７．９ｐｇ／ｍＬ／ｇ対３１．０±５．９ｐｇ／ｍＬ／ｇ）と比較して、血清ＳＥＡＰレベルが高かった。０．１Ａ電流設定で電気穿孔されたマウスは、０．２Ａの一定電流で同一のプラスミド製剤を導入されたマウスより高いＳＥＡＰ発現を生じた。
【００６６】
マウス−抗ＳＥＡＰ抗体の誘導
生理食塩水＋ＬＧＳによるＳＥＡＰプラスミドの製剤化は、高いタンパク質発現を生じたが、抗ＳＥＡＰ抗体の力価は、水＋ＬＧＳで製剤化されたＳＥＡＰプラスミドを用いて注入されたマウスと比較した時、低かった（図７）。
【００６７】
実施例４ ブタにおけるインフルエンザに対する抗体
総数４０匹のブタを１０群×４匹のブタに分けた（表２）。ブタを４日間順化させ、体重を測定し、耳にタグを付けた。研究０日目、ブタの体重を測定し、採血し、ブタ用の組み合わせ麻酔−ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）、およびアトロピン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔をし、それから、イソフルラン（５％で誘導、２〜３％で維持）を使用して麻酔した。ブタ（４匹／群）に、様々なプラスミド濃度および電流強度で、０．６ｍＬのＣＭＶ−ＨＡ（共通Ｈ５抗原を発現するｐＶＡＸベースのコンストラクト）、ＣＭＶ−ＮＡ（共通Ｎ１抗原を発現するｐＶＡＸベースのコンストラクト）、およびＣＭＶ−ＳＥＡＰ（レポータ遺伝子分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現するコンストラクト）プラスミド（プラスミド濃度、および「筋肉損傷」評価のために溶液の粘度を上げるために添加される最後のコンストラクト）＋１．０％ｗｔ／ｗｔＬＧＳを注入した。上の実施例３に提供される材料および方法に従い、プラスミドを製剤化した。４秒後、５本の電極を備え、以下のパルスパラメータで操作された適応一定電流ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）筋肉内（ＩＭ）システム（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して電気穿孔した：５２ミリ秒パルス、パルス間が１秒、様々な電流（０．１、０．３および０．５Ａ）を用いた３パルス。
【表２】
注入後１４日目および３５日目の生検の迅速な同定のために、各注入部位を包囲する領域を刺青した。
【００６８】
ブタを麻酔から回復させ、完全な回復を確認するために、２４時間、慎重に監視した。処理後２〜３時間内に完全に回復しなかったブタは、すべて書き留めた。ブタの体重を測定し、１０日目、２１日目、および３５日目に採血した。ブタに、２１日目に２回目のワクチンを投与した。血液を別のファルコンチューブに採取し、これを凝血させ、血清を遠心分離して単離し、それから氷上のチューブにアリコートさせた。
【００６９】
赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ
ブタ血清は、１部分量の血清を３部分量の酵素で希釈することにより、レセプタ破壊酵素（ＲＤＥ）を用いて処理し、３７℃の水浴で一晩、インキュベートした。５６℃で３０分インキュベートすることにより、該酵素を不活性化した後、６部分量のＰＢＳを添加して、最終希釈の１／１０にした。前述の通り、ウイルスの４つのＨＡユニットおよび１％のウマの赤血球細胞を使用して、Ｖ型底の９６ウェルマイクロタイタープレートで、ＨＩアッセイを実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，１０３（１−２）：９１−５（Ｊｕｌｙ ２００４））。
【００７０】
ＨＩアッセイ（図８）により示されるように、最も高い力価は、０．５Ａ（１２０±４０、Ｐ＝０．１１対２ｍｇ／０．３ＡおよびＰ＝０．０２対２ｍｇ／０．１Ａ）の電流設定で、２ｍｇのＨＡ発現プラスミドが投与された群からの血清で見られ、２ｍｇの各プラスミドが導入された群において、電界の強度に伴い、力価は減少し、電流のいずれかのプラスミド量が、その後、減少した場合、力価はより可変的で、群の間に差異はなかった。
【００７１】
ＨＩ力価は、２ｍｇのＨＡ発現プラスミドが投与され、０．５Ａで電気穿孔された群で、最も高かった。さらに、力価は、０．５Ａで電気穿孔された群のプラスミド量の、および電界の強度の減少に伴い減少した。低プラスミド量、または低電流強度は、群内の可変性を増大するようであった。
【００７２】
実施例５： フェレットにおけるインフルエンザに対する抗体
生後４〜６ヶ月の、または少なくとも体重が１ｋｇの２０匹の雄のフェレット（Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍｓ，Ｓａｙｒｅ，ＰＡ）を、本研究に使用し、ＢＩＯＱＵＡＬ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で飼育した。ファレット研究デザインは表３にある。研究の前に２週間、動物を順化させた。０、４および９週目で、動物を免疫化（麻酔下）した。血液を２週間毎に採取した。
【００７３】
本研究は、フェレットのインフルエンザ誘導モデルで、ＩＭ送達した後に、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応一定電流電気穿孔筋肉内（ＩＭ）システム（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）を使用して電気穿孔されたＨＡ、ＮＡ、およびＭ２ｅ−ＮＰ ＤＮＡワクチンの有効性を試験した。上の実施例３に提供される材料および方法に従い、ＤＮＡプラスミドを製剤化した。表３に概要を述べるように、群２、群３および群４の動物に、０．２ｍｇのそれぞれのインフルエンザプラスミドワクチンを接種した。１プラスミドワクチン（群２および群３）が接種された、またはワクチンを接種されなかった（対照群１）用量群を補正するために、差異はｐＶＡＸ空ベクターにより補われ、各群の全ての動物が、総用量の０．６ｍｇのプラスミドを導入するようにした。５本の針電極アレイを使用した電気穿孔の条件は、０．５Ａｍｐｓ、５２ミリ秒パルス幅、パルス間が１秒、注入と電気穿孔の間の遅延が４秒であった。
【表３】
【００７４】
赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ
血清は、１部分量の血清を３部分量の酵素で希釈することにより、レセプタ破壊酵素（ＲＤＥ）を用いて処理し、３７℃の水浴で一晩、インキュベートした。５６℃で３０分インキュベートすることにより、酵素を不活性化した後、６部分量のＰＢＳを添加して、最終希釈の１／１０にした。前述の通り、ウイルスの４つのＨＡユニットおよび１％のウマの赤血球細胞を使用して、Ｖ型底の９６ウェルマイクロタイタープレートで、ＨＩアッセイを実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，１０３（１−２）：９１−５（Ｊｕｌｙ ２００４））。ＨＩアッセイに使用されたウイルスは、疾病管理センターから得た交雑ウイルス株であるＡ／Ｖｉｅｔ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）／ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ−ＲＧ（クレイド１ウイルス）およびＡ／Ｉｎｄｏ／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）／ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ−ＲＧ２（クレイド２ウイルス）。インフルエンザ感染のフェレットモデルは、ヒト疾患をより反映し、また、より厳密な誘導モデルであると考えられる。フェレットは、インフルエンザに感染したヒトに類似する症状、およびヒトならびにトリインフルエンザウイルスに関して類似する組織指向性を表す。研究を通して、異なる時間点で採取した血清は、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対するＨＩ活性を検出するために使用した。図９に示すように、共通Ｈ５特異的ＨＡコンストラクトを含む両群は、２回の免疫化後、保護レベルの抗体（＞１：４０）を達成し、クレイド２Ｈ５Ｎ１ウイルスを阻害することも可能であった。つまり、ＨＩアッセイは、共通ＨＡ株がクレイド１ウイルスに基づくにも関わらず、両方のウイルス株に対して陽性であった。
【００７５】
実施例６ 霊長類におけるインフルエンザの抗体
アカゲザルをこれらの研究において免疫化した。実験の開始前に２ヶ月、動物を順化した。研究は以下のように進行させた：０週目に、１回目の免疫化（プラスミド量投与）を実施し、基準採血した。２週目に、採血を実施した。３週目に、２回目の免疫化（プラスミド量投与）を実施した。５週目に、採血を実施した。６週目に、３回目の免疫化（プラスミド量投与）を実施し、採血した。８週目に、採血を実施した。
【表４】
【００７６】
全てのプラスミドを、上の前述の実施例に記載されるように、１０ｍｇ／ｍＬで、注入用水＋１％ＬＧＳに製剤化し、研究群毎（上の表４のＣ、Ｄ、ＧおよびＨ群）に、単一溶液に混合した。ＩＭ ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰ（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＤ ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰ（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびＩＭ注入を指す各群の補正注入量を算出した。ＩＤ投与のために、必要な注入量が、部位毎に１００μＬを超える場合、製剤は注入部位の数に分けられる（どのくらいの総ｍｇのワクチンが投与されるかによって、２、３、または６）。ＩＭ注入を受けた動物の単一部位に全製剤を与えた。
【００７７】
ブタ実験、ファレット実験、およびヒト以外の実験に使用されたＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応一定電流装置が、実施例で説明された。電気穿孔条件は、以下であった：ＩＭ注入および電気穿孔群において、条件は０．５Ａｍｐｓ、５２ミリ秒／パルス、３パルス、プラスミド注入と電気穿孔との間の遅延が４秒であった。ＩＤ注入および電気穿孔群において、条件は、０．２Ａｍｐｓ、５２ミリ秒／パルス、３パルス、プラスミド注入と電気穿孔との間の遅延が４秒であった。
【００７８】
赤血球阻害（ＨＩ）アッセイ−サル血清は、１部分量の血清を３部分量の酵素で希釈することにより、レセプタ破壊酵素（ＲＤＥ）を用いて処理し、３７℃の水浴で一晩、インキュベートした。５６℃で３０分インキュベートすることにより、酵素を不活性化した後、６部分量のＰＢＳを添加して、最終希釈の１／１０にした。前述の通り、ウイルスの４つのＨＡユニットおよび１％のウマの赤血球細胞を使用して、Ｖ型底の９６ウェルマイクロタイタープレートで、ＨＩアッセイを実施した。本明細書に提示したデータは、２回目の免疫化後の結果である（３回目の免疫前に採取された出血）
【００７９】
２回目の免疫化から３週間後にＨＩ力価を測定した。その結果は、図１０に示されたグラフに見られる。ＩＤ注入を介してＨＡプラスミドワクチン後に電気穿孔を受けたサルは、ＩＭ＋ＥＰ群の平均力価の２倍以上、およびＩＭ群のみの平均力価のほぼ３倍（＊Ｐ＜０．０３）を示した。未処理対照群は、まったくＨＩ力価を表さなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の細胞で抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、前記哺乳類に組換えウイルス抗原に対する抗体を生成する方法であって、
プロモータに操作可能に連結されたコード配列を含むＤＮＡプラスミドを前記哺乳類の組織に注入するステップ、
前記ＤＮＡプラスミドの進入および前記抗原の発現を可能にするために、前記組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて前記組織を電気穿孔するステップ、及び
前記抗原に対する抗体を生成するために、前記哺乳類が、前記発現抗原に反応することを可能にするステップ
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記抗原が、癌抗原ではないことを条件とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原が、ＨＩＶ ｅｎｖ、ＨＩＶ ｇａｇ、インフルエンザＨＡ、インフルエンザＮＡ、またはインフルエンザＭ２ｅ−ＮＰである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、中和抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記電気穿孔するステップが、一定電流の電気穿孔装置を用いて前記組織を電気穿孔するステップを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記電気穿孔装置が、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ装置である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記電気穿孔するステップが、約０．０１Ａｍｐから約１．０Ａｍｐの電流を送るステップを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記電気穿孔ステップが、約０．１Ａｍｐから約０．５Ａｍｐの電流を送達するステップを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記電気穿孔ステップが、約０．１Ａｍｐから約０．２Ａｍｐの電流を送るステップを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記電流が、パルス継続時間中、一定の電流である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記電気穿孔ステップが、前記注入ステップ後、約１秒から約２０秒実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記電気穿孔ステップが、前記注入ステップ後、約１秒から約１０秒実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記電気穿孔ステップが、前記注入ステップ後、約１秒から約５秒実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記電気穿孔ステップが、前記注入ステップ後、約４秒実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記電気穿孔するステップが、２つ以上の電気パルスを送達するステップを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記電気穿孔するステップが、３つの電気パルスを送達するステップを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記電気穿孔するステップが、電気パルス間で、約０．１秒から約５秒休止するステップを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記電気穿孔するステップが、電気パルス間で、約１秒休止するステップを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡプラスミドが、１ｍｇ／ｍｌを超える濃度で、前記注入するステップで注入される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡプラスミドの濃度が、２ｍｇ／ｍｌを超える、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡプラスミドの濃度が、４ｍｇ／ｍｌを超える、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、次の日に繰り返される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
次の日に、前記哺乳類に前記抗原のタンパク質追加免疫を行うステップをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記注入するステップが、皮内または筋肉内組織に注入するステップを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記注入するステップが、アジュバントを注入するステップをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
所望のウイルス抗原に対して特異的に抗体を単離する方法であって、前記抗体が、哺乳類の細胞で前記抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、前記哺乳類で生成され、
プロモータに操作可能に連結されたコード配列を含むＤＮＡプラスミドを前記哺乳類の組織に注入するステップ、
前記ＤＮＡプラスミド進入および前記抗原の発現を可能にするために、前記組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて前記組織を電気穿孔するステップ、
前記抗原に対する抗体を生成するために、前記哺乳類が、前記発現抗原に反応することを可能にするステップ、
前記哺乳類から血清を採取するステップ、及び
前記血清から前記抗体を抽出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記抽出された抗体を精製するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原が癌抗原ではないことを条件とする、請求項２７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原が、ＨＩＶ ｅｎｖ、ＨＩＶ ｇａｇ、ｐ１８５ｎｅｕ、インフルエンザＨＡ、インフルエンザＮＡ、またはインフルエンザＭ２ｅ−ＮＰである、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が、中和抗体である、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａである、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記電気穿孔するステップが、一定電流の電気穿孔装置を用いて前記組織を電気穿孔するステップを含む、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記電気穿孔装置が、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ装置である、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の任意の１つ方法。
【請求項３５】
前記電気穿孔するステップが、約０．０１Ａｍｐから約１．０Ａｍｐの電流を送るステップを含む、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記電気穿孔するステップが、約０．１Ａｍｐから約０．５Ａｍｐの電流を送達するステップを含む、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記電気穿孔するステップが、約０．１Ａｍｐから約０．２Ａｍｐの電流を送達するステップを含む、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記電流が、パルス継続時間中、一定の電流である、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記電気穿孔するステップが、前記注入するステップの後、約１秒から約２０秒実施される、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記電気穿孔するステップが、前記注入するステップの後、約１秒から約１０秒実施される、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記電気穿孔するステップが、前記注入するステップの後、約１秒から約５秒実施される、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記電気穿孔するステップが、前記注入するステップの後、約秒４秒実施される、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記電気穿孔するステップが、２つ以上の電気パルスを送達するステップを含む、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記電気穿孔するステップが、３つの電気パルスを送達するステップを含む、請求項２７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記電気穿孔するステップが、電気パルス間で、約０．１秒から約５秒休止するステップを含む、請求項２７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記電気穿孔するステップが、電気パルス間で、約１秒休止するステップを含む、請求項２７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＤＮＡプラスミドが、１ｍｇ／ｍｌを超える濃度で、前記注入ステップで注入される、請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＤＮＡプラスミドの濃度が、２ｍｇ／ｍｌを超える、請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＤＮＡプラスミドの濃度が、４ｍｇ／ｍｌを超える、請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が、次の日に繰り返される、請求項２７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
次の日に、前記哺乳類に前記抗原のタンパク質追加免疫を行うステップをさらに含む、請求項２７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記注入するステップが、皮内または筋肉内組織に注入するステップを含む、請求項２７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記注入するステップが、アジュバントを注入するステップをさらに含む、請求項２８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
哺乳類の細胞で抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、前記哺乳類に組換えウイルス抗原に対する抗体を生成する方法であって、
プロモータに操作可能に連結されたコード配列を含むＤＮＡプラスミドを前記哺乳類の組織に注入するステップ、
前記ＤＮＡプラスミドの進入および前記抗原の発現を可能にするために、前記組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて前記組織を電気穿孔するステップ、及び
前記抗原に対する抗体を生成するために、前記哺乳類が、前記発現抗原に反応することを可能にするステップ
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記抗原が、癌抗原ではないことを条件とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原が、ＨＩＶ ｅｎｖ、ＨＩＶ ｇａｇ、インフルエンザＨＡ、インフルエンザＮＡ、またはインフルエンザＭ２ｅ−ＮＰである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、中和抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記電気穿孔するステップが、一定電流の電気穿孔装置を用いて前記組織を電気穿孔するステップを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記電気穿孔装置が、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ装置である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記電気穿孔するステップが、約０．０１Ａｍｐから約１．０Ａｍｐの電流を送るステップを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記電気穿孔ステップが、約０．１Ａｍｐから約０．５Ａｍｐの電流を送達するステップを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記電気穿孔ステップが、約０．１Ａｍｐから約０．２Ａｍｐの電流を送るステップを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記電流が、パルス継続時間中、一定の電流である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記電気穿孔ステップが、前記注入ステップ後、約１秒から約２０秒実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記電気穿孔ステップが、前記注入ステップ後、約１秒から約１０秒実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記電気穿孔ステップが、前記注入ステップ後、約１秒から約５秒実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記電気穿孔ステップが、前記注入ステップ後、約４秒実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記電気穿孔するステップが、２つ以上の電気パルスを送達するステップを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記電気穿孔するステップが、３つの電気パルスを送達するステップを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記電気穿孔するステップが、電気パルス間で、約０．１秒から約５秒休止するステップを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記電気穿孔するステップが、電気パルス間で、約１秒休止するステップを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡプラスミドが、１ｍｇ／ｍｌを超える濃度で、前記注入するステップで注入される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡプラスミドの濃度が、２ｍｇ／ｍｌを超える、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡプラスミドの濃度が、４ｍｇ／ｍｌを超える、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、次の日に繰り返される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
次の日に、前記哺乳類に前記抗原のタンパク質追加免疫を行うステップをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記注入するステップが、皮内または筋肉内組織に注入するステップを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記注入するステップが、アジュバントを注入するステップをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
所望のウイルス抗原に対して特異的に抗体を単離する方法であって、前記抗体が、哺乳類の細胞で前記抗原を発現できるＤＮＡプラスミドを使用して、前記哺乳類で生成され、
プロモータに操作可能に連結されたコード配列を含むＤＮＡプラスミドを前記哺乳類の組織に注入するステップ、
前記ＤＮＡプラスミド進入および前記抗原の発現を可能にするために、前記組織の細胞を電気穿孔するのに効果的な電気パルスを送達できる電気穿孔装置を用いて前記組織を電気穿孔するステップ、
前記抗原に対する抗体を生成するために、前記哺乳類が、前記発現抗原に反応することを可能にするステップ、
前記哺乳類から血清を採取するステップ、及び
前記血清から前記抗体を抽出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記抽出された抗体を精製するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原が癌抗原ではないことを条件とする、請求項２７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原が、ＨＩＶ ｅｎｖ、ＨＩＶ ｇａｇ、ｐ１８５ｎｅｕ、インフルエンザＨＡ、インフルエンザＮＡ、またはインフルエンザＭ２ｅ−ＮＰである、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が、中和抗体である、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａである、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記電気穿孔するステップが、一定電流の電気穿孔装置を用いて前記組織を電気穿孔するステップを含む、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記電気穿孔装置が、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ装置である、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の任意の１つ方法。
【請求項３５】
前記電気穿孔するステップが、約０．０１Ａｍｐから約１．０Ａｍｐの電流を送るステップを含む、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記電気穿孔するステップが、約０．１Ａｍｐから約０．５Ａｍｐの電流を送達するステップを含む、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記電気穿孔するステップが、約０．１Ａｍｐから約０．２Ａｍｐの電流を送達するステップを含む、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記電流が、パルス継続時間中、一定の電流である、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記電気穿孔するステップが、前記注入するステップの後、約１秒から約２０秒実施される、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記電気穿孔するステップが、前記注入するステップの後、約１秒から約１０秒実施される、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記電気穿孔するステップが、前記注入するステップの後、約１秒から約５秒実施される、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記電気穿孔するステップが、前記注入するステップの後、約秒４秒実施される、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記電気穿孔するステップが、２つ以上の電気パルスを送達するステップを含む、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記電気穿孔するステップが、３つの電気パルスを送達するステップを含む、請求項２７〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記電気穿孔するステップが、電気パルス間で、約０．１秒から約５秒休止するステップを含む、請求項２７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記電気穿孔するステップが、電気パルス間で、約１秒休止するステップを含む、請求項２７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＤＮＡプラスミドが、１ｍｇ／ｍｌを超える濃度で、前記注入ステップで注入される、請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＤＮＡプラスミドの濃度が、２ｍｇ／ｍｌを超える、請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＤＮＡプラスミドの濃度が、４ｍｇ／ｍｌを超える、請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が、次の日に繰り返される、請求項２７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
次の日に、前記哺乳類に前記抗原のタンパク質追加免疫を行うステップをさらに含む、請求項２７〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記注入するステップが、皮内または筋肉内組織に注入するステップを含む、請求項２７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記注入するステップが、アジュバントを注入するステップをさらに含む、請求項２８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５０４１７３（Ｐ２０１１−５０４１７３Ａ）
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３４２２７（Ｐ２０１０−５３４２２７）
【出願日】平成２０年１１月１４日（２００８．１１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３６３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６５０３２
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５１０１３１２６９）ブイジーエックス ファーマシューティカルズ，リミティド ライアビリティー カンパニー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１４日（２００８．１１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３６３１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６５０３２
【国際公開日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【出願人】（５１０１３１２６９）ブイジーエックス ファーマシューティカルズ，リミティド ライアビリティー カンパニー (1)
【Ｆターム（参考）】
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