非アルコール性脂肪肝炎治療効果の判定マーカー
【課題】臨床で軽度乃至重度の非アルコール性脂肪肝炎患者の治療の際に用いられ、治療の効果を、的確に判定するマーカーを提供する。
【解決手段】血中又は肝臓における非アルコール性脂肪肝炎治療効果の判定マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎患者から採取された血液に由来するフェリチン、チオレドキシン、遊離脂肪酸の何れか、又は前記患者から採取された肝臓に由来するＣｕ,Ｚｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、Ｍｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、腫瘍壊死因子α、細胞間接着分子-1、エンドトキシン受容体であるトール様受容体4の何れかであって、その含量の変化若しくはそのｍＲＮＡ含量の変化として測定される。非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果の判定マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎を含む非アルコール性脂肪肝疾患患者から採取された血液に由来するサイトケラチン18フラグメントであって、その含量の変化として測定される。
【解決手段】血中又は肝臓における非アルコール性脂肪肝炎治療効果の判定マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎患者から採取された血液に由来するフェリチン、チオレドキシン、遊離脂肪酸の何れか、又は前記患者から採取された肝臓に由来するＣｕ,Ｚｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、Ｍｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、腫瘍壊死因子α、細胞間接着分子-1、エンドトキシン受容体であるトール様受容体4の何れかであって、その含量の変化若しくはそのｍＲＮＡ含量の変化として測定される。非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果の判定マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎を含む非アルコール性脂肪肝疾患患者から採取された血液に由来するサイトケラチン18フラグメントであって、その含量の変化として測定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患、特に非アルコール性脂肪肝炎による脂肪肝や肝炎の症状を治療する非アルコール性脂肪肝炎治療薬、脂肪肝や肝炎である肝組織機能を改善する肝組織機能改善薬による治療効果を、判定するマーカーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
非飲酒者の脂肪肝である非アルコール性脂肪肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease：ＮＡＦＬＤ）の中でも特に非アルコール性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis：ＮＡＳＨ）は、炎症壊死を伴う肝臓の中性脂肪変性症、肝細胞の風船様腫大、類洞周囲／静脈周囲線維症で特徴付けられる疾患である。最近、肥満、耐糖能障害、脂質代謝異常のような代謝性疾病が増加してきており、これらに起因する非アルコール性脂肪肝炎は、我が国でもよく見られる慢性肝炎となってきている。
【０００３】
非アルコール性脂肪肝炎は、脂肪肝を呈する病態であるが、炎症・肝細胞傷害・線維症を随伴する点で、単純性脂肪肝と異なる。非アルコール性脂肪肝炎は、予後良好な単純性脂肪肝と比較すると、予後不良である。さらに非アルコール性脂肪肝炎は、肝硬変を惹き起こし、肝癌や肝不全に進行することがある。このような非アルコール性脂肪肝炎の患者は、心臓血管疾患や肝臓の所為による死亡の発生率が高いために、単純性脂肪肝の患者と比較しても平均の死亡率と比較しても、死亡の割合が高いと報告されている。
【０００４】
このように非アルコール性脂肪肝炎は、深刻な疾患であると考えられることから、適切な治療介入を必要とする。非アルコール性脂肪肝炎でなければ、血液検査によって血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）値が低いことは疑いないが、ＡＬＴ値やＡＳＴ値が低くても非アルコール性脂肪肝炎である症例が散見される。そこで、単純性脂肪肝と非アルコール性脂肪肝炎との識別は、今のところ肝生検に基づいて行われている。非アルコール性脂肪肝炎であると診断された患者の治療に、様々な薬物、例えばインスリン抵抗性改善剤、ビタミンＥ、ウルソデオキシコール酸、プロブコールのような脂質低下薬を含む薬物による治療が行われているが、その効果には著しい個人差がある。
【０００５】
疫学的研究や無作為対照試験の結果、魚油中に大量に含まれているｎ−３系不飽和脂肪酸（ｎ−３ ＰＵＦＡ）やその誘導体を補給すると、血中のトリグリセリド値が低下し、心臓の冠状動脈疾患の発症やそれに起因する突然死などのリスクが低減することが分かっている。エイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid、Ｃ２０：５ ｎ−３）やその誘導体は、ｎ−３系不飽和脂肪酸類の主要成分の一つである。高純度エイコサペンタエン酸誘導体は、高脂血症やアテローマ性動脈硬化症の治療に、汎用されている。我が国での大規模臨床試験ＪＥＬＩＳ（Japan EPA Lipid Intervention Study）によれば、エイコサペンタエン酸誘導体の補給による血漿エイコサペンタエン酸誘導体値の上昇が、高コレステロール血症患者での冠状動脈性心疾患の予防に有効であると報告されている。また、特許文献１には、エイコサペンタエン酸誘導体を有効成分として含むくも膜下出血の予後改善薬が、開示されている。
【０００６】
しかし、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者に対する高純度エイコサペンタエン酸誘導体による治療の有効性については、未だ明らかにされていない。しかも、非アルコール性脂肪肝炎に対する標準的で確実な治療方法は、未だ確立さえしていない。また、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）患者の肝組織機能の一層優れた改善方法が、望まれている。そして、そのような治療による効果を的確に判定するマーカーが、望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６９２３８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、臨床で軽度乃至重度の非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者の治療の際に用いられ、その脂肪肝や肝炎に対する優れた薬効を示し、安全で長期間服用でき、副作用がない非アルコール性脂肪肝炎治療薬、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）患者の肝機能改善薬による治療の効果を、的確に判定するマーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の血中又は肝臓における非アルコール性脂肪肝炎治療効果の判定マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎患者から採取された血液に由来するフェリチン、チオレドキシン、遊離脂肪酸の何れか、又は前記患者から採取された肝臓に由来するＣｕ,Ｚｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、Ｍｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、腫瘍壊死因子α、細胞間接着分子−１、エンドトキシン受容体であるトール様受容体４の何れかであって、その含量の変化若しくはそのｍＲＮＡ含量の変化として測定されるものである。
【００１０】
請求項２に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果の判定マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎を含む非アルコール性脂肪肝疾患患者から採取された血液に由来するサイトケラチン１８フラグメントであって、その含量の変化として測定されるものである。
【００１１】
このような非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果を発現させるために用いられる非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、少なくとも９８％の高純度のエイコサペンタエン酸、その塩及びそのエステルから選ばれる少なくとも一種類からなる不飽和脂肪酸類を含むものである。
【００１２】
この非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、非アルコール性脂肪肝炎による脂肪肝及び／又は肝炎の症状を、前記不飽和脂肪酸類により、改善することができるものであることが好ましい。
【００１３】
この非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、前記不飽和脂肪酸類が、血中のアラニンアミノトランスフェラーゼの低下剤、血中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの低下剤、血中の遊離脂肪酸の低下剤、血中のフェリチンの低下剤、血中のチオレドキシンの低下剤、血中のサイトケラチン１８フラグメントの低下剤、脂肪肝の酸化ストレスの低減剤、肝臓中の活性酸素除去酵素若しくはそのｍＲＮＡの増加剤、肝臓中の炎症性サイトカイン若しくはそのｍＲＮＡの低下剤、肝臓中の細胞間接着分子若しくはそのｍＲＮＡの低下剤、及び／又は肝臓中のエンドトキシン受容体若しくはそのｍＲＮＡの低下剤として作用することが好ましい。
【００１４】
また、このような非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果を発現させるために用いられる肝組織機能改善薬は、少なくとも９８％の高純度のエイコサペンタエン酸、その塩及びそのエステルから選ばれる少なくとも一種類からなる不飽和脂肪酸類を含有し、脂肪肝及び／又は肝炎である肝組織の機能異常を改善するものである。
【００１５】
この肝組織機能改善薬は、肝臓の中性脂肪変性症及び線維症と、肝細胞の風船様腫大と、小葉の炎症の少なくとも何れかの前記肝組織の機能異常を改善するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果を発現させるために用いられる非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、エイコサペンタエン酸やその誘導体のみからなる不飽和脂肪酸類を、ほぼ単一の有効成分として用いており、エイコサペンタエン酸やその誘導体に加えてドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やその誘導体等を含み、活性酸素生成酵素を増加させうることが明示された精製魚油などに比べ、より酸化ストレスを生じ難いという優越性を有すると判断される。
【００１７】
また、非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果を発現させるために用いられる非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者の治療に用いられるもので、安全かつ有効なものである。この治療薬や改善薬による薬効は、エイコサペンタエン酸やその誘導体のみからなる不飽和脂肪酸類の単独投与による抗炎症性と抗酸化性とに基づくものである。
【００１８】
この非アルコール性脂肪肝炎治療薬や肝組織機能改善薬は、治療に用いても有害事象を生じず、長期間服用しても、副作用がない。
【００１９】
この非アルコール性脂肪肝炎治療薬を用いて非アルコール性脂肪肝炎を治療すると、血中のアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、遊離脂肪酸、フェリチン、チオレドキシン、サイトケラチン１８フラグメントの各濃度が低下し、脂肪肝の酸化ストレスが低減され、肝臓中の活性酸素除去酵素やそのｍＲＮＡが増加し、かつ、炎症性サイトカインやそのｍＲＮＡ、細胞間接着分子やそのｍＲＮＡ、エンドトキシン受容体やそのｍＲＮＡの各濃度や作用が低減される。
【００２０】
この肝組織機能改善薬は、非アルコール性脂肪肝炎治療薬と同様な組成からなり、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）患者に投与される脂肪肝や脂肪肝炎の組織機能の改善薬として用いられ、肝臓の中性脂肪変性症及び線維症と、肝細胞の風船様腫大と、小葉の炎症とを改善するもので、脂肪肝の酸化ストレスの改善薬としても作用する。
【００２１】
本発明の非アルコール性脂肪肝炎マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎の病勢又は治療効果を正確かつ簡便に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】非アルコール性脂肪肝炎治療薬を投与したときのＡＳＴ、ＡＬＴ、フェリチン、チオレドキシン、遊離脂肪酸の経時的な変化を示すグラフである。
【図２】本発明を適用する判定マーカーに関して、非アルコール性脂肪肝炎治療薬を投与したときのサイトケラチン（ＣＫ）１８フラグメント量又はＡＬＴ量とＮＡＦＬＤ組織学的活動性のスコアとの相関関係を示すグラフである。
【図３】本発明を適用する判定マーカーに関して、非アルコール性脂肪肝炎治療薬による治療前後でのサイトケラチン（ＣＫ）１８フラグメント量の変化を示すグラフである。
【図４】生体部分肝移植のドナー術前検査で得られた正常肝組織と、非アルコール性脂肪肝炎治療薬投与前後に肝生検を行なったＮＡＳＨ患者の肝組織における肝ＴＧ量、及びＭＤＡ＋４-ＨＮＥ量の変化を示すグラフである。
【図５】本発明を適用する判定マーカーに関して、生体部分肝移植のドナー術前検査で得られた正常肝組織と、非アルコール性脂肪肝炎治療薬投与前後に肝生検を行なったＮＡＳＨ患者の肝組織におけるＣｕ,Ｚｎ-ＳＯＤ量、Ｍｎ-ＳＯＤ量、ＴＮＦ−α量、ＩＣＡＭ−１量、及びＴＬＲ４量の変化を示すグラフである。
【図６】高脂肪食摂取のマウス肝臓、非アルコール性脂肪肝炎治療薬であるＥＰＡ単独投与、及びＥＰＡとＤＨＡ同時投与（魚油投与）を行なったマウス肝臓におけるＣＹＰ４Ａ１量、ＡＯＸ量、ｇｐ９１ｐｈｏｘ量、及びｐ４７ｐｈｏｘ量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の好ましい実施の形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施の形態に限定されるものではない。
【００２４】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、９８％以上の高純度のエイコサペンタエン酸エチルからなる不飽和脂肪酸類を含むものである。
【００２５】
このようなエイコサペンタエン酸エチルは、例えば魚油やエイコサペンタエン酸産生菌の培養液のような粗不飽和脂肪酸含有物から精製したエイコサペンタエン酸に由来するものである。より具体的には、その粗不飽和脂肪酸含有物を、蒸留、クロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、超臨界液体クロマトグラフィで精製し、エチルエステル化して調製したものである。
【００２６】
高純度のエイコサペンタエン酸エチルは、具体的には、エパデール（持田製薬株式会社製；登録商標）が挙げられる。
【００２７】
９８％以上の高純度のエイコサペンタエン酸エチルの例を挙げたが、その他のエイコサペンタエン酸誘導体、例えば遊離のエイコサペンタエン酸、炭素数１〜１８の低級乃至高級アルキルアルコールとのエステル、エチレングリコールのようなグリコールやグリセリンとのエステル；カリウム、ナトリウム、カルシウムのような金属、有機アミン及びアミノ酸のいずれかとの製薬上許容される塩であって、その純度のものであってもよい。このような高純度のエイコサペンタエン酸やその誘導体であれば、高々２％未満の不純物を含んでいたとしても、その不純物に起因する影響は殆んど無い。
【００２８】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、賦形剤、植物油、動物油、結合剤、懸濁剤、乳化剤、ＰＨ調整剤、等張化剤を含んでいてもよい。さらにビタミンＥのような抗酸化剤を含んでいてもよい。
【００２９】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、液状のまま液剤として投与されてもよいが、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、軟膏、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、坐剤、散剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、トローチ剤、軟膏剤、ハップ剤、リニメント剤、リモナーデ剤、ローション剤にして投与されてもよい。
【００３０】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬を、経口で投与してもよく、静脈注射・点滴で投与してもよく、皮膚に塗布乃至貼付して経皮吸収させてもよい。
【００３１】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、エイコサペンタエン酸誘導体として、１８００〜２７００ｍｇ／日投与されることが好ましい。毎日投与されることが好ましく、数時間おきに毎日数回投与されてもよく、毎食後に等量ずつ投与されてもよい。
【００３２】
その他の医薬品例えば、カルシウムチャンネル拮抗剤、アンギオテンシンII受容体拮抗剤、又はアロプリノールなどと併用してもよい。
【００３３】
この他、脂肪肝及び脂肪肝炎の改善薬として用いてもよく、脂肪肝の酸化ストレスの改善薬として用いてもよく、脂肪肝及び脂肪肝炎の組織機能の改善薬として用いてもよい。
【実施例】
【００３４】
以下に、非アルコール性脂肪肝炎治療薬や肝組織機能改善薬を、投与した実施例を示す。この非アルコール性脂肪肝炎治療薬を用いて治療を行いつつ、この治療薬が非アルコール性脂肪肝炎患者の生化学的乃至組織学的異常を回復させていることについて、検討した。
さらに、本発明を適用する判定マーカーにより、非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果の判定について、検討した。
【００３５】
（実施例に関与した患者）
非アルコール性脂肪肝炎の患者に、非アルコール性脂肪肝炎治療薬による治療を行った。この全患者は、腹部超音波診断により肝臓の中性脂肪変性症（脂肪肝）であると認められ、栄養士によるカロリー摂取を控えるよう常に指示されているにも関わらず血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値が６ヶ月以上４５Ｕ／Ｌを超え、さらに肝臓の生検で非アルコール性脂肪肝炎であると認められた者である。このような患者のうちこの実施例の非アルコール性脂肪肝炎治療薬による治療の対象外とする基準は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原陽性又はＣ型肝炎ウイルス抗体陽性の場合、薬剤性肝障害、自己免疫肝疾患、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス症、及びα１アンチトリプシン欠乏症のような慢性肝臓疾患の場合、タモキシフェンによる治療や外科手術した非アルコール性脂肪肝炎の場合、毎週４０ｇを超えるアルコールを摂取している場合、フィブレート、スタチン、又はプロブコールのような脂質低下薬を常用している場合である。
【００３６】
この治療を行う患者は、病院に入院し、一晩絶食した後、採血され、経皮的肝臓生検が行われた。治療前に、体重指標（ＢＭＩ）を算出した。日本人全体を基準にして比較し、ＢＭＩが２５ｋｇ／ｍ２を超える場合は、肥満であると考えられた。患者は、心収縮圧／心拡張圧が１４０／９０ｍｍＨｇを超える場合、又は降圧剤を服用している場合、高血圧症であるとみなした。また、患者は、空腹時のグルコース値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上である場合、若しくはインスリン又は経口低血糖症剤を服用している場合に、糖尿病であるとみなした。また、患者は、空腹時の血清中のコレステロール値及びトリグリセリド値が夫々２２０ｍｇ／ｄＬ以上及び１５０ｍｇ／ｄＬ以上である場合に、高脂血症であると診断した。なおこの治療は、世界医師会ヘルシンキ宣言に従って行ったもので、当該病院の倫理委員会で承認されたものである。
【００３７】
（治療介入）
肝臓の生検を行ったところ組織学的に非アルコール性脂肪肝炎と認められるが他には疾患がないと診断された患者に対して、この治療について説明した。非アルコール性脂肪肝炎である３０人の患者（内訳は男性が１８人で女性が１２人、年齢は２７〜７４歳で平均５８歳）から、この治療に関与することの同意書を得た。その後、９８％以上の純度を有する高純度エイコサペンタエン酸エチルエステルであるエパデール（持田製薬株式会社製；登録商標）（エパデールカプセル又はエパデールＳ）（以下、ＥＰＡと略記）を、その患者に１２箇月間、２７００ｍｇ／日ずつ内服投与した。このようなＥＰＡ単独内服を行った全患者は、少なくとも１２箇月間、カロリー制限を継続し、何人かの患者は、カルシウムチャンネル拮抗剤、アンギオテンシンII受容体拮抗剤、又はアロプリノールのような以前から常用していた様々な薬物も併せて服用した。このような治療介入は、この治療期間中、変わることなく、継続した。理学所見及び血液検査所見によって、ＥＰＡによる副作用を監視した。患者が医師の指示に従ってＥＰＡを摂取していることを、問診と血漿のＥＰＡ濃度の測定とによって、確かめた。治療効果は、主に臨床データと検査データとによって、評価した。うち７人の患者は、この１２箇月の治療での最後にも繰り返し肝臓の生検を行うことに同意した。これらの患者について、組織学的所見の変化を調べた。
【００３８】
（検査方法）
全てのデータは、空腹時のものである。常用検査を標準的な方法で行った。ＥＰＡ内服治療開始時、開始後３、６、９、１２箇月目での代表的な臨床検査を行った。血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、フェリチン値は、オートアナライザーを用いて測定した。フェリチン値は、抗フェリチン抗体を感作させたラテックスとの反応により生じる混濁度を濃度既知の標品と比較することにより、即ちラテックス比濁法により測定されたものである。血清中のチオレドキシン値は、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（レドックス・バイオサイエンス株式会社製；商品名）を用いて、酵素標識免疫吸着法により測定したものである。血中遊離脂肪酸（ＦＦＡ）濃度の測定はＮＥＦＡテストキット（和光純薬社製）を用いて発色させ、濃度既知の標品との比色測定により行ったものである。なお、値は平均±標準偏差で表示する。インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）は、次式
空腹時の血漿グルコース値（ｍｇ／ｄＬ）×空腹状態での血漿インスリン値（μＵ／ｍＬ）／４０５
を用いて算出した。血清の脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィーを用いて、その標品の濃度と検知面積との検量線の比較により、測定した。血漿の腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、可溶性ＴＮＦ−α受容体−１（ｓＴＮＦ−Ｒ１）及びｓＴＮＦ−Ｒ２の各濃度は、酵素免疫定量キット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製；商品名；米国ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、酵素免疫定量法により、測定した。血清のアディポネクチン濃度は、酵素標識免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）キット（大塚製薬株式会社製；商品名）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により、測定した。血清中のチオレドキシン値は、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（レドックス・バイオサイエンス株式会社製；商品名）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により、測定した。
【００３９】
（超音波検査法による肝臓の中性脂肪変性症の評価）
Ｂ−モード超音波検査法は、３．５ＭＨｚ凸型変換機（日立メディカル株式会社製；商品名）を装着した超音波診断装置モデルＥＵＢ−５２５（株式会社日立製作所製；商品名）を用い、同一の熟練技術者によって行われた。患者は、超音波検査の前、少なくとも１２時間絶食し、この治療の開始時と終了時とに測定が行われた。超音波検査により、肝臓のエコー反射性は、次の四つの等級で評定した。等級０は中性脂肪変性症なし、等級１は軽度中性脂肪変性症（僅かに均質に肝臓のエコー反射性の増加あり；明瞭な肝臓内部脈管像あり；肝臓深部エコーの減衰なし）、等級２は中程度中性脂肪変性症（肝臓のエコー反射性の中程度の増加あり；肝臓内部脈管に部分的な不明瞭像あり；僅かに肝臓深部エコーの減衰あり）、等級３は重度中性脂肪変性症（瀰漫性・高度の肝臓のエコー反射性の増加あり；もはや肝臓内部脈管の可視不能；非常に深刻な肝臓深部エコーの減衰あり）というものである。
【００４０】
（組織学的評価）
肝臓の生検標本は、１４−Ｇの生検針を用いて採取し、直ちに１０％中性ホルマリンで固定した。断片を４μｍの厚さに切断し、ヘマトキシリンとエオシンとによりアザン−マロリー法で染色した。組織学的所見は、クライナーらによる進展度診断／格付け法に準拠し、一人の病理学者（ＫＳ）による盲検法で、評定した。ＮＡＦＬＤの組織学的活動性（ＮＡＦＬＤ activity score: ＮＡＳ）は、中性脂肪変性症（０〜３レベルの４段階）、小葉炎症（０〜２レベルの３段階）、肝細胞風船様腫大（０〜２レベルの３段階）の夫々の評価の非加重合計による０〜８レベルの幅で定められるものである。ＮＡＳが５を超えるものは、疑いなく非アルコール性脂肪肝炎と診断される。
【００４１】
（統計処理）
統計学的分析は、ウインドウズ版ＳＰＳＳソフトウェア１１．０Ｊ（ＳＰＳＳ社製；米国イリノイ州シカゴ）を用いて行われた。定性値は、（％）で表示し、χ２検定で比較した。定量値データは、平均と標準偏差とで表示し、二項両側ｔ検定で比較した。確率値（Ｐ値）が０．０５未満で、統計学的有意性ありとみなし、＊で示した。
【００４２】
この治療の結果を以下に示す。
【００４３】
（患者の特徴の基準値）
この治療に関与した非アルコール性脂肪肝炎である３０人の患者の特徴の基準値を、表１に示す。２５人（８３％）の患者は、肥満であり、平均ＢＭＩが２８．３±３．３ｋｇ／ｍ２であった。１６人（５３％）の患者は高血圧症であり、５人（１７％）の患者は糖尿病であった。腹部超音波検査の結果、１５人（５０％）の患者が等級３の重度中性脂肪変性症であった。組織学的には、全患者のＮＡＳが、５を超えていた。多くの患者の線維症第１期又は第２期であった。６人（２０％）の患者は線維性架橋を形成していた。これら患者のうち肝硬変になっている者はいなかった。
【００４４】
【表１】
【００４５】
（生化学的特徴によるＥＰＡの効果）
全患者に１２箇月間、治療した。平均体重は、治療前に７３．８±１１．５ｋｇであったが、治療後に７３．６±１１．９ｋｇとなり（Ｐ＝０．８０７）、その前後で変化が認められなかった。血清中のＡＬＴ値は、図１に示す通り、８１±３８Ｕ／Ｌから１２箇月後に５０±２２Ｕ／Ｌとなり、その基準値と比較すると２９％減少していた（Ｐ＝０．００２）。血清のＡＳＴ値とＡＬＴ値との改善が、６ヶ月以降認められた。うち７人（２３％）の患者で、血清のＡＬＴ値が、ＥＰＡによる治療で正常値（＜３０Ｕ／Ｌ）に戻ったが、４人（１３％）の患者で血清のＡＬＴ値の有意な改善が認められなかった。血小板数と、血清中のアルブミン値、アルカリホスファターゼ値、γ−グルタミルトランスフェラーゼ値、ヒアルロン酸値及び４型コラーゲン７Ｓ値は、変化していなかった。ＥＰＡによる治療で、表２に示すように、総コレステロール値は、基準値から８％減少（Ｐ＝０．０３７）し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）値は、基準値から３４％減少（Ｐ＝０．０１１）していたが、トリグリセリド値と高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール値とは、変化していなかった。血清の脂肪酸のプロファイル分析の結果、ＥＰＡ濃度と、アラキドン酸（ＡＡ）に対するＥＰＡ組成比（Ｃ２０：５，ｎ−３）／（Ｃ２０：４，ｎ−６）とは、有意に増加していた。ＥＰＡによる治療で、血清のアラキドン酸濃度は、基準値から１２％（Ｐ＝０．０３８）減少していた。一方、ＥＰＡによる治療後、空腹時のグルコース値、インスリン値、及びアディポネクチン値、ＨＯＭＡ−ＩＲ、グリコヘモグロビン値は、有意な変化がなかった。そのためＥＰＡによる治療で血清のＡＳＴ及びＡＬＴの低下と、インスリン抵抗性及び低アディポネクチン血症の改善との間に相関性がないことが示された。
【００４６】
【表２】
【００４７】
次いで、非アルコール性脂肪肝炎の炎症性壊死を惹き起こす血清の炎症性サイトカイン値について、検討した。血漿の平均ＴＮＦα値は、治療後に低下する傾向にあった。血漿のｓＴＮＦ−Ｒ１値とｓＴＮＦ−Ｒ２値とは、基準値に対し夫々１０％と１６％有意に低下（夫々Ｐ＜０．００１）していた。血清の鉄濃度とトランスフェリン飽和度とは変化しないままであったが、血清のフェリチン濃度は１２箇月間のＥＰＡによる治療で、有意に低下していた。酸化的ストレスの指標である血清のチオレドキシン値も２８％低下（Ｐ＝０．０３２）していた。
【００４８】
ＥＰＡ単独内服治療を受けたＮＡＳＨ患者において、経時的に採取して分析した血清の結果を示す。図１から明らかなように、フェリチン(Ferritin)、チオレドキシン(Thioredoxin)、遊離脂肪酸（FFA）の各濃度の経時的変化は、ＡＳＴやＡＬＴの経時的変化によく類似していた。すなわち、これら５種の血清中の因子が、ＥＰＡ単独内服による治療過程で同調的に変化することが、明らかとなった。したがって、ＮＡＳＨ患者の治療におけるＥＰＡ単独内服治療によるＮＡＳＨの改善を判断する指標として、血清中のＡＳＴ・ＡＬＴ・可溶性腫瘍壊死因子受容体−１・可溶性腫瘍壊死因子受容体−２の治療前・治療後の変化のみならず、フェリチン・チオレドキシン・遊離脂肪酸含量の変化もＥＰＡのＮＡＳＨに対する好ましい薬効を表していることが分かった。
【００４９】
（超音波検査法の所見によるＥＰＡの効果）
１７人（５７％）の患者で、中性脂肪変性症のレベルの改善が見られた。中性脂肪変性症のレベルにつき、１５人（５０％）の患者が１レベル低下し、２人（７％）の患者が２レベル低下していた。７人（２３％）の患者は、１２箇月のＥＰＡによる治療で、中性脂肪変性症が消失していた。中性脂肪変性症の平均レベルは、２．２±１．０であったものが、治療によって１．６±１．２（Ｐ＝０．００４）に、有意に改善されていた。
【００５０】
（組織学的所見によるＥＰＡの効果）
全患者の２３％に相当する７人の患者が、１２箇月間ＥＰＡによる治療をした後、肝臓の生検を繰返し行うことに、同意した。その組織学的所見の変化を、表３に示す。中性脂肪変性症の平均レベルは、２．４±０．５であったものが、治療によって１．７±０．５に低下した。線維症の平均レベルは、１．７±１．１であったものが、治療によって０．７±０．５に低下した。生検を行ったところ、線維症の等級がその内の４人（５７％）の患者で１レベル低下しており、２人（２９％）の患者で２レベル低下していた。線維症が悪化した患者はいなかった。小葉炎症と肝細胞の風船様腫大との平均レベルは、何れも改善されていた。
【００５１】
【表３】
【００５２】
平均ＮＡＳは、６．１±１．３であったものが、１２箇月の治療後、３．７±１．４に低下していた。ＮＡＳは、６人（８６％）の患者で改善されていた。中性脂肪変性症、小葉炎症、及び肝細胞風船様腫大の夫々が少なくとも１レベルの改善がありＮＡＳの３レベル以上の低下があるものを、組織学的に治療効果があるとした。このような厳格な規定によると、３人の患者（４３％）に、組織学的な治療効果が見られた。５人（７１％）の患者に、ＮＡＳ ５未満への低下が見られ、これらの患者は『疑いなく非アルコール性脂肪肝炎である』から、１２箇月間のＥＰＡによる治療後に、『非アルコール性脂肪肝炎か否かのボーダーライン上にある』又は『非アルコール性脂肪肝炎でない』に、改善されていた。
【００５３】
（組織学的活動性と血清サイトケラチン１８とＡＬＴとの相関性の検討）
次に、過去に肝臓生検を施行した無治療のＮＡＦＬＤ患者の１１８例において、ＮＡＦＬＤの組織学的活動性のスコア値（ＮＡＳ）と、血清サイトケラチン（ＣＫ）１８フラグメント又はＡＬＴ値との相関を、調べた。
【００５４】
ＮＡＦＬＤの組織学的活動性は、患者背景、患者臨床情報を知らない病理学者が、１１８名の無治療のＮＡＦＬＤ患者の肝生検組織切片にヘマトキシリンエオジン染色を施しそれを顕微鏡で観察し、脂肪肝の程度、バルーニングや小葉内炎症の程度などをクライナーらにより提唱された基準（Kleiner et al., Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2005; 41: 1313-1321）に則り、スコアリングしたものである。スコアリングにより、１〜８のランクのスコアに区分され、ＮＡＳ値が大きいほどＮＡＦＬＤの活動性が強いことを示す。前記と同様、ＮＡＳ値が５以上でＮＡＳＨと確定される。またＮＡＦＬＤの治療効果もこのスコアの改善を以って評価される。
【００５５】
一方、各々のＮＡＦＬＤ患者から得られた血清ＡＬＴ量の値と血清サイトケラチン１８フラグメント量を測定した。血清サイトケラチン１８フラグメント値はM30-Apoptosense ELISAキット（Peviva社製、商品名）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により、測定し、ＡＬＴは前記と同様にして測定した。Spearman's rank correlation analysisにより相関係数（ｒ値）を求めた。横軸にＮＡＦＬＤの組織学的活動性のスコア値、縦軸に夫々血清ＡＬＴ量の値と血清サイトケラチン（ＣＫ）１８フラグメント量の値とにした相関の結果を、図２に示す。
【００５６】
図２から明らかな通り、血清サイトケラチン１８フラグメント量の値とＮＡＳ値との相関値（ｒ）は0.526であり、血清ＡＬＴ値とＮＡＳ値との相関値（ｒ）は0.298であった。この結果から明らかなように、血清サイトケラチン１８フラグメント量は、血清ＡＬＴ値よりも、ＮＡＳ値との相関値が、はるかに高い。したがって、血清サイトケラチン１８フラグメント量は、ＮＡＦＬＤの組織学的活動性（即ちＮＡＳＨの病勢）との高い相関性を示すことが分かった。
【００５７】
従来は、ＮＡＳＨの治療効果判定には複数回の肝生検を行い、組織学的変化を観察するしか有効な観察方法がなかった。肝生検は入院を要し、肝臓に針を刺してその一部を採取するという侵襲性の高い検査であるため、患者に多大な肉体的・精神的・経済的負担をかけているばかりか、定量的なＮＡＳＨの治療効果判定がしばしば困難であった。それに対し、血清サイトケラチン１８フラグメント量は、ＮＡＳＨの程度を判断するうえで定量化できる血清マーカーとして有用であるばかりでなく、今までＮＡＳ値と相関すると信じられてきた血清ＡＬＴの定量値よりも、遥かに優れたＮＡＳ値との相関を有することが判明した。従って、血清サイトケラチン１８フラグメントは、ＮＡＳＨの治療効果判定の際に、正確かつ簡便なマーカーであり、従来の肝生検より安全で侵襲性の低い評価法として用いることができる。また、ＮＡＳＨだけでなく、他の脂肪蓄積を伴う肝炎の程度を推定する血清マーカーとしても有用である。
【００５８】
この血清サイトケラチン１８フラグメント量は、（１）ＥＰＡ単独内服によるＮＡＳＨ患者の治療における肝炎改善程度を判断する新規血清マーカーとして有用であり、（２）脂肪肝疾患（ＮＡＳＨやＣ型肝炎）の脂肪蓄積および炎症程度を判断する新規血清マーカーとしても有用であり、さらに（３）ＮＡＳＨやＣ型肝炎患者のＥＰＡ単独内服以外の治療における肝炎改善程度を判断する新規血清マーカーとしても有用であると考えられる。
【００５９】
（ＥＰＡ治療前後における血清サイトケラチン１８フラグメント値の変化の検討）
１２箇月のＥＰＡ単独内服治療を完遂できたＮＡＳＨ患者６例において、治療開始時、１２箇月後に、前記と同様にして血清サイトケラチン１８フラグメント量を測定した。その血清サイトケラチン１８フラグメント量の値の変化を図２に、示す。治療開始時における血清サイトケラチン１８フラグメント値を各々１００％とし、１２箇月治療後の相対値を％で表示した。スチューデントのｔ検定によりＰ値を算出した。全ての患者において著しい血清サイトケラチン１８フラグメントの低下が確認され、低下の程度は図１に示した５種の血清マーカー値の低下の程度と強い相関があることが確認された。このことからも、血清サイトケラチン１８フラグメント量が、ＮＡＳＨの治療効果判定の有能なマーカーとして用いることができることが確かめられた。
【００６０】
（ＥＰＡ治療前後での肝臓内トリグリセリド（ＴＧ）と過酸化脂質（ＭＤＡ＋４-ＨＮＥ）量の変化）
生体部分肝移植のドナー術前検査で得られた正常肝組織（Ｃ：Control、ｎ＝４）、ＥＰＡ単独内服治療前後に肝生検を行なったＮＡＳＨ患者の肝組織（ＳＨ：steatohepatitis［脂肪肝炎、治療前］、及びＳＨ＋ＥＰＡ［ＥＰＡ治療後］、各ｎ＝５）から総脂質を抽出し、トリグリセリドテストキット（和光純薬社製、商品名）を用いてトリグリセリド量（ＴＧ）を測定した。肝組織中の過酸化脂質量（ＭＤＡ＋４-ＨＮＥ量、なおＭＤＡはmalondialdehyde、４-ＨＮＥは4-hydroxynonenal）は、ＬＰＯ-５８６キット（オキシス インターナショナル社製、商品名）を用いて測定した。測定値は平均±標準偏差で表示し、群間の比較は、スチューデントのｔ検定により行った。確率値（Ｐ値）が０．０５未満で、統計学的有意性ありとみなし、＊で示した。その結果を、図４に示す。
【００６１】
図４から明らかな通り、１２箇月間のＥＰＡ単独内服治療を完遂できたＮＡＳＨ患者５名において、生検で得た肝臓を生化学的手法で調べたところ、肝臓内のトリグリセリド量（ＴＧ）および過酸化脂質量（ＭＤＡ＋４-ＨＮＥ）は、ＥＰＡ治療前のＮＡＳＨ（ＳＨ）では高値であるが、治療後（ＳＨ＋ＥＰＡ）では大きく減少していた。
【００６２】
（ＥＰＡ治療前後での肝臓内の酸化ストレス消去・炎症に関連する遺伝子発現の変化）
生体部分肝移植のドナー術前検査で得られた正常肝組織（Ｃ：control，ｎ＝４）、ＥＰＡ単独内服治療前後に肝生検を施行し得えたＮＡＳＨ患者の肝組織（ＳＨおよびＳＨ＋ＥＰＡ、ｎ＝５）から、キット（キアゲン社製）を用いて総ＲＮＡを分離後、逆転写酵素（インビトロゲン社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。PRISM 7000 Sequence Detection System（ＡＢＩ社製、商品名）を用いた核酸染色であるSYBR green法により、酸化ストレス消去酵素であるスーパーオキサイドディスムターゼ（Ｃｕ,Ｚｎ-ＳＯＤ及びＭｎ-ＳＯＤ、なおＳＯＤはsuperoxide dismutase）、炎症関連分子（ＴＮＦ−αおよびＩＣＡＭ−１、なおＴＮＦ−αはtumor necrosis factor α：腫瘍壊死因子−α、ＩＣＡＭ-１はintercellular adhesion molecule-1：細胞間接着分子−１）、エンドトキシン受容体（ＴＬＲ４、なおＴＬＲ４はToll-like receptor 4：トール様受容体）各分子のｍＲＮＡ発現量（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量に対する相対値、なおＧＡＰＤＨはglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を算出した。測定値は平均±標準偏差で表示し、群間の比較は、スチューデントのｔ検定により行った。確率値（Ｐ値）が０．０５未満で、統計学的有意性ありとみなし、＊で示した。その結果を、図５に示す。
【００６３】
図５から明らかな通り、蛋白発現をｍＲＮＡレベルで測定すると、ＥＰＡ治療前のＮＡＳＨ（ＳＨ）ではＣｕ,Ｚｎ-ＳＯＤ及びＭｎ-ＳＯＤは正常（Ｃ：control）より低下していた。治療後（ＳＨ＋ＥＰＡ）は両方とも正常（Ｃ）の数倍レベルに増加した。両方のＳＯＤ分子は活性酸素を除去する機能を持つので、治療後に増加することはＥＰＡ内服により抗酸化能力が上昇することが示唆された。このことは治療後（ＳＨ＋ＥＰＡ）の過酸化脂質量の減少の一因と考えられる。
【００６４】
炎症関連分子（ＴＮＦ-α及びＩＣＡＭ-１）およびエンドトキシン受容体（ＴＬＲ４）の発現は治療前に高く、治療後に減少した。ＴＮＦ-αは炎症を生じている細胞から放出されるが、半減期が短いため、血中での蛋白量変化にはあまり反映されない（表２参照）。しかし、肝臓内でのｍＲＮＡ量は合理的な変化を示した。従って、肝臓内におけるＴＮＦ-α ｍＲＮＡ量は肝炎改善程度を判断するマーカーとして有用である。ＩＣＡＭ-１はＴＮＦ-αと似た機能と挙動を示すので、ＩＣＡＭ-１ ｍＲＮＡ量も肝炎改善程度を判断するマーカーとして有用である。ＴＬＲ４はエンドトキシン（ＬＰＳ:リポポリサッカライド）の細胞表面受容体として炎症の促進機能を持つことが知られている。図５に示されたデータはＴＬＲ４ ｍＲＮＡ量が、治療前に正常人の約３倍高く、治療後に正常人レベルまで低下することを、初めて示したものである。この変化は、ＥＰＡ内服により生じるＴＮＦ-αおよびＩＣＡＭ-１の変化に類似しており、肝臓内におけるＴＬＲ４ ｍＲＮＡ量は肝炎改善程度を判断するマーカーとして有用である。
【００６５】
ＮＡＳＨの肝炎改善程度を判断する手法として組織学的解析を併用することが有用である（表３参照）。図５に示された肝臓内蛋白分子の生化学的解析結果が加わると、血清解析データでは得られない情報が得られるので、ＥＰＡ単独内服治療効果のさらに的確な判断が、可能となる。
【００６６】
（酸化ストレス生成分子の発現レベルに関するＥＰＡ単独投与とＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与との差異）
Ｃ57 Ｂ6雄マウス（１２週齢）を１５％硬化ヤシ油含有のＡＩＮ-９３Ｇ変型高脂肪食にて１２週間飼育した。これにより、全てのマウスは脂肪肝症状を呈した（5.8 + 0.9 mg トリグリセリド／g 肝臓）。コントロール群（Ｃ：Control）は上記高脂肪食にて、さらに６週間飼育した。ＥＰＡ単独投与群（ＥＰＡ）は上記高脂肪食を与え、加えて、1.4 mg ＥＰＡ／日／30g 体重 にてＥＰＡを６週間経口投与した。ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与群（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）は上記高脂肪食を与え、加えて、30 mg マグロ油（27%ＤＨＡおよび5%ＥＰＡを含有、なおＤＨＡはdocosahexaenoic acid）／日／30g体重にてＥＰＡおよびＤＨＡを６週間経口投与した。マグロ油投与群（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）は、ＥＰＡ単独投与群とほぼ等量のＥＰＡとそのＥＰＡの5.4倍量のＤＨＡを与えたことになる。各群６匹のマウスを使用した。肝臓を摘出後、キット（キアゲン社製）を用いて総ＲＮＡを分離した。逆転写酵素（インビトロゲン社製）を用いてｃＤＮＡを合成した後、PRISM 7000 Sequence Detection System（ＡＢＩ社製）を用いたSYBR green法により、チトクロームＰ４５０ ４Ａ１(ＣＹＰ４Ａ１)、アシルＣｏＡオキシダーゼ(ＡＯＸ)、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ
サブユニット蛋白 (ｇｐ９１ｐｈｏｘ およびｐ４７ｐｈｏｘ) 各分子のｍＲＮＡ相対量（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量に対する相対値）を測定した。これら４種の酵素蛋白は、何れも活性酸素を生成する機能を有し、酸化ストレス生成酵素である。測定値は平均±標準偏差で表示し、群間の比較は、スチューデントのｔ検定により行った。確率値（Ｐ値）が０．０５未満で、統計学的有意性ありとみなし、＊で示した。その結果を、図６に示す。
【００６７】
図６から明らかな通り、肝臓における４種の酵素蛋白のｍＲＮＡ量を測定したところ、同一パターンの結果を得た。即ち、ＥＰＡ単独投与群（ＥＰＡ）では４分子種のｍＲＮＡ量は全く増加しないが、ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与群（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）では４分子種とも著しい増加が生じた。ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与群はＥＰＡ単独投与群とほぼ同量のＥＰＡが投与されているが、得られた結果はＥＰＡ単独投与群と全く異なるものであった。このことから、ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与（魚油投与）は、ＥＰＡ単独投与とは全く異なる変化を引き起こしうることが、明らかとなった。従って、ＮＡＳＨ患者へのＥＰＡ単独内服による薬効は特異的であり、ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与（魚油投与）による薬効とは、多くの事項に関して、かなり異なることが、強く示唆された。
【００６８】
（ＥＰＡの安全性）
ＥＰＡ治療期間中に、有害な症状は現われなかった。また出血傾向は、線維症を有する非アルコール性脂肪肝炎患者にさえ、認められなかった。
【００６９】
（治療結果の総括）
この高純度ＥＰＡにより治療するというこの方法によると、８７％の患者で、血清のＡＬＴ値が通常値よりも２９％も低下していた。また、肝臓の中性脂肪変性症が改善することは、肝臓の超音波診断法によって裏付けられた。再生検を行い得た患者の８６％に、肝臓の中性脂肪変性症、線維症、小葉炎症、及び肝細胞の風船様腫大のような非アルコール性脂肪肝炎の典型的な特徴の改善が認められた。そのうち４３％の患者に、ＮＡＳ評価の３レベルを超える有意な改善が認められた。この治療は少人数で行われたものであるが、非アルコール性脂肪肝炎の患者のＥＰＡによる治療の有効性と安全性を初めて示したものである。
【００７０】
ＥＰＡにより治療すると、非アルコール性脂肪肝炎の患者の肝臓の中性脂肪変性症を軽減することが、超音波検査や組織学的検査により認められた。中性脂肪変性症の肝臓中のトリグリセリドのほとんどは、主に脂肪組織から放出され循環している遊離脂肪酸（ＦＦＡ）から誘導されたり肝細胞中で脂質生合成されたりしたものである。ＥＰＡによる治療で、血清のＦＦＡ濃度の有意な低下が認められた。ｏｂ／ｏｂマウスへＥＰＡを投与すると、白色脂肪細胞中で脂肪酸合成酵素の発現の低下をもたらし、その結果、血漿中のＦＦＡ濃度が低下すると、報告されている。さらにこのマウスにおいて、ＥＰＡは肝臓での脂肪酸合成酵素発現値を低下させ、ステロール応答領域結合タンパク１の発現低下により脂肪生合成を抑制していることが示されている。
【００７１】
組織学的所見と血漿のｓＴＮＦ−Ｒ値とによる結果は、ＥＰＡ治療が、非アルコール性脂肪肝炎の活動性を有意に改善することを裏付けている。ＥＰＡ誘導抗炎症効果は、肝細胞中のＦＦＡ誘導脂肪毒性の減少、酸化ストレスの解消、５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸のような炎症前駆エイコサノイド誘導体を産生するアラキドン酸に対する代謝拮抗、ＮＦ−κＢ活性化の抑制のようなメカニズムによるものと考えられている。さらに、ＥＰＡの補給は、細胞／細胞小器官の膜脂質組成を変え、流動性を改善し、肝細胞の損傷の低下をもたらしているのであろう。
【００７２】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬を用いた治療では、ＥＰＡで、血清のアディポネクチン濃度を低下させインスリン抵抗性を改善するという効果は、認められなかった。最近、ピオグリタゾンによる非アルコール性脂肪肝炎の治療の効果を示す幾つかの報告がなされている。ＥＰＡに比較すると、非アルコール性脂肪肝炎に対するピオグリタゾンの主な薬効は、炎症前駆体のサイトカインや酸化ストレスの調整というよりむしろ、アディポネクチンを介在するインスリン感受性の改善と肝臓での脂肪酸の代謝促進にある。そのため、ＥＰＡとピオグリタゾンとの両剤併用療法によれば、これらの薬物の欠陥を補い合うことができる。また、単剤療法よりも、非アルコール性脂肪肝炎に対する一層の効果が得られるかもしれない。
【００７３】
この治療により、非アルコール性脂肪肝炎患者に２７００ｍｇ／日の服用量でＥＰＡを投与したときの安全性及び有効性に関し、有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、脂肪肝の酸化ストレスの改善や脂肪肝の組織機能の改善に用い、非アルコール性脂肪肝炎の症状の緩和、改善、治癒のような治療に有用である。無作為プラセボ対照試験による診断にも有用である。
【００７５】
また、肝組織機能改善薬は、脂肪肝及び／又は肝炎である肝組織の機能異常の改善に用い、非アルコール性脂肪肝疾患の症状の緩和、改善、治癒のような治療に有用である。
【００７６】
本発明の非アルコール性脂肪肝炎マーカーは、病勢や治療効果判定の指標として、有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患、特に非アルコール性脂肪肝炎による脂肪肝や肝炎の症状を治療する非アルコール性脂肪肝炎治療薬、脂肪肝や肝炎である肝組織機能を改善する肝組織機能改善薬による治療効果を、判定するマーカーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
非飲酒者の脂肪肝である非アルコール性脂肪肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease：ＮＡＦＬＤ）の中でも特に非アルコール性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis：ＮＡＳＨ）は、炎症壊死を伴う肝臓の中性脂肪変性症、肝細胞の風船様腫大、類洞周囲／静脈周囲線維症で特徴付けられる疾患である。最近、肥満、耐糖能障害、脂質代謝異常のような代謝性疾病が増加してきており、これらに起因する非アルコール性脂肪肝炎は、我が国でもよく見られる慢性肝炎となってきている。
【０００３】
非アルコール性脂肪肝炎は、脂肪肝を呈する病態であるが、炎症・肝細胞傷害・線維症を随伴する点で、単純性脂肪肝と異なる。非アルコール性脂肪肝炎は、予後良好な単純性脂肪肝と比較すると、予後不良である。さらに非アルコール性脂肪肝炎は、肝硬変を惹き起こし、肝癌や肝不全に進行することがある。このような非アルコール性脂肪肝炎の患者は、心臓血管疾患や肝臓の所為による死亡の発生率が高いために、単純性脂肪肝の患者と比較しても平均の死亡率と比較しても、死亡の割合が高いと報告されている。
【０００４】
このように非アルコール性脂肪肝炎は、深刻な疾患であると考えられることから、適切な治療介入を必要とする。非アルコール性脂肪肝炎でなければ、血液検査によって血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）値が低いことは疑いないが、ＡＬＴ値やＡＳＴ値が低くても非アルコール性脂肪肝炎である症例が散見される。そこで、単純性脂肪肝と非アルコール性脂肪肝炎との識別は、今のところ肝生検に基づいて行われている。非アルコール性脂肪肝炎であると診断された患者の治療に、様々な薬物、例えばインスリン抵抗性改善剤、ビタミンＥ、ウルソデオキシコール酸、プロブコールのような脂質低下薬を含む薬物による治療が行われているが、その効果には著しい個人差がある。
【０００５】
疫学的研究や無作為対照試験の結果、魚油中に大量に含まれているｎ−３系不飽和脂肪酸（ｎ−３ ＰＵＦＡ）やその誘導体を補給すると、血中のトリグリセリド値が低下し、心臓の冠状動脈疾患の発症やそれに起因する突然死などのリスクが低減することが分かっている。エイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid、Ｃ２０：５ ｎ−３）やその誘導体は、ｎ−３系不飽和脂肪酸類の主要成分の一つである。高純度エイコサペンタエン酸誘導体は、高脂血症やアテローマ性動脈硬化症の治療に、汎用されている。我が国での大規模臨床試験ＪＥＬＩＳ（Japan EPA Lipid Intervention Study）によれば、エイコサペンタエン酸誘導体の補給による血漿エイコサペンタエン酸誘導体値の上昇が、高コレステロール血症患者での冠状動脈性心疾患の予防に有効であると報告されている。また、特許文献１には、エイコサペンタエン酸誘導体を有効成分として含むくも膜下出血の予後改善薬が、開示されている。
【０００６】
しかし、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者に対する高純度エイコサペンタエン酸誘導体による治療の有効性については、未だ明らかにされていない。しかも、非アルコール性脂肪肝炎に対する標準的で確実な治療方法は、未だ確立さえしていない。また、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）患者の肝組織機能の一層優れた改善方法が、望まれている。そして、そのような治療による効果を的確に判定するマーカーが、望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６９２３８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、臨床で軽度乃至重度の非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者の治療の際に用いられ、その脂肪肝や肝炎に対する優れた薬効を示し、安全で長期間服用でき、副作用がない非アルコール性脂肪肝炎治療薬、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）患者の肝機能改善薬による治療の効果を、的確に判定するマーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載の血中又は肝臓における非アルコール性脂肪肝炎治療効果の判定マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎患者から採取された血液に由来するフェリチン、チオレドキシン、遊離脂肪酸の何れか、又は前記患者から採取された肝臓に由来するＣｕ,Ｚｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、Ｍｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、腫瘍壊死因子α、細胞間接着分子−１、エンドトキシン受容体であるトール様受容体４の何れかであって、その含量の変化若しくはそのｍＲＮＡ含量の変化として測定されるものである。
【００１０】
請求項２に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果の判定マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎を含む非アルコール性脂肪肝疾患患者から採取された血液に由来するサイトケラチン１８フラグメントであって、その含量の変化として測定されるものである。
【００１１】
このような非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果を発現させるために用いられる非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、少なくとも９８％の高純度のエイコサペンタエン酸、その塩及びそのエステルから選ばれる少なくとも一種類からなる不飽和脂肪酸類を含むものである。
【００１２】
この非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、非アルコール性脂肪肝炎による脂肪肝及び／又は肝炎の症状を、前記不飽和脂肪酸類により、改善することができるものであることが好ましい。
【００１３】
この非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、前記不飽和脂肪酸類が、血中のアラニンアミノトランスフェラーゼの低下剤、血中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの低下剤、血中の遊離脂肪酸の低下剤、血中のフェリチンの低下剤、血中のチオレドキシンの低下剤、血中のサイトケラチン１８フラグメントの低下剤、脂肪肝の酸化ストレスの低減剤、肝臓中の活性酸素除去酵素若しくはそのｍＲＮＡの増加剤、肝臓中の炎症性サイトカイン若しくはそのｍＲＮＡの低下剤、肝臓中の細胞間接着分子若しくはそのｍＲＮＡの低下剤、及び／又は肝臓中のエンドトキシン受容体若しくはそのｍＲＮＡの低下剤として作用することが好ましい。
【００１４】
また、このような非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果を発現させるために用いられる肝組織機能改善薬は、少なくとも９８％の高純度のエイコサペンタエン酸、その塩及びそのエステルから選ばれる少なくとも一種類からなる不飽和脂肪酸類を含有し、脂肪肝及び／又は肝炎である肝組織の機能異常を改善するものである。
【００１５】
この肝組織機能改善薬は、肝臓の中性脂肪変性症及び線維症と、肝細胞の風船様腫大と、小葉の炎症の少なくとも何れかの前記肝組織の機能異常を改善するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果を発現させるために用いられる非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、エイコサペンタエン酸やその誘導体のみからなる不飽和脂肪酸類を、ほぼ単一の有効成分として用いており、エイコサペンタエン酸やその誘導体に加えてドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やその誘導体等を含み、活性酸素生成酵素を増加させうることが明示された精製魚油などに比べ、より酸化ストレスを生じ難いという優越性を有すると判断される。
【００１７】
また、非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果を発現させるために用いられる非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者の治療に用いられるもので、安全かつ有効なものである。この治療薬や改善薬による薬効は、エイコサペンタエン酸やその誘導体のみからなる不飽和脂肪酸類の単独投与による抗炎症性と抗酸化性とに基づくものである。
【００１８】
この非アルコール性脂肪肝炎治療薬や肝組織機能改善薬は、治療に用いても有害事象を生じず、長期間服用しても、副作用がない。
【００１９】
この非アルコール性脂肪肝炎治療薬を用いて非アルコール性脂肪肝炎を治療すると、血中のアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、遊離脂肪酸、フェリチン、チオレドキシン、サイトケラチン１８フラグメントの各濃度が低下し、脂肪肝の酸化ストレスが低減され、肝臓中の活性酸素除去酵素やそのｍＲＮＡが増加し、かつ、炎症性サイトカインやそのｍＲＮＡ、細胞間接着分子やそのｍＲＮＡ、エンドトキシン受容体やそのｍＲＮＡの各濃度や作用が低減される。
【００２０】
この肝組織機能改善薬は、非アルコール性脂肪肝炎治療薬と同様な組成からなり、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）患者に投与される脂肪肝や脂肪肝炎の組織機能の改善薬として用いられ、肝臓の中性脂肪変性症及び線維症と、肝細胞の風船様腫大と、小葉の炎症とを改善するもので、脂肪肝の酸化ストレスの改善薬としても作用する。
【００２１】
本発明の非アルコール性脂肪肝炎マーカーは、非アルコール性脂肪肝炎の病勢又は治療効果を正確かつ簡便に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】非アルコール性脂肪肝炎治療薬を投与したときのＡＳＴ、ＡＬＴ、フェリチン、チオレドキシン、遊離脂肪酸の経時的な変化を示すグラフである。
【図２】本発明を適用する判定マーカーに関して、非アルコール性脂肪肝炎治療薬を投与したときのサイトケラチン（ＣＫ）１８フラグメント量又はＡＬＴ量とＮＡＦＬＤ組織学的活動性のスコアとの相関関係を示すグラフである。
【図３】本発明を適用する判定マーカーに関して、非アルコール性脂肪肝炎治療薬による治療前後でのサイトケラチン（ＣＫ）１８フラグメント量の変化を示すグラフである。
【図４】生体部分肝移植のドナー術前検査で得られた正常肝組織と、非アルコール性脂肪肝炎治療薬投与前後に肝生検を行なったＮＡＳＨ患者の肝組織における肝ＴＧ量、及びＭＤＡ＋４-ＨＮＥ量の変化を示すグラフである。
【図５】本発明を適用する判定マーカーに関して、生体部分肝移植のドナー術前検査で得られた正常肝組織と、非アルコール性脂肪肝炎治療薬投与前後に肝生検を行なったＮＡＳＨ患者の肝組織におけるＣｕ,Ｚｎ-ＳＯＤ量、Ｍｎ-ＳＯＤ量、ＴＮＦ−α量、ＩＣＡＭ−１量、及びＴＬＲ４量の変化を示すグラフである。
【図６】高脂肪食摂取のマウス肝臓、非アルコール性脂肪肝炎治療薬であるＥＰＡ単独投与、及びＥＰＡとＤＨＡ同時投与（魚油投与）を行なったマウス肝臓におけるＣＹＰ４Ａ１量、ＡＯＸ量、ｇｐ９１ｐｈｏｘ量、及びｐ４７ｐｈｏｘ量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の好ましい実施の形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施の形態に限定されるものではない。
【００２４】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、９８％以上の高純度のエイコサペンタエン酸エチルからなる不飽和脂肪酸類を含むものである。
【００２５】
このようなエイコサペンタエン酸エチルは、例えば魚油やエイコサペンタエン酸産生菌の培養液のような粗不飽和脂肪酸含有物から精製したエイコサペンタエン酸に由来するものである。より具体的には、その粗不飽和脂肪酸含有物を、蒸留、クロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、超臨界液体クロマトグラフィで精製し、エチルエステル化して調製したものである。
【００２６】
高純度のエイコサペンタエン酸エチルは、具体的には、エパデール（持田製薬株式会社製；登録商標）が挙げられる。
【００２７】
９８％以上の高純度のエイコサペンタエン酸エチルの例を挙げたが、その他のエイコサペンタエン酸誘導体、例えば遊離のエイコサペンタエン酸、炭素数１〜１８の低級乃至高級アルキルアルコールとのエステル、エチレングリコールのようなグリコールやグリセリンとのエステル；カリウム、ナトリウム、カルシウムのような金属、有機アミン及びアミノ酸のいずれかとの製薬上許容される塩であって、その純度のものであってもよい。このような高純度のエイコサペンタエン酸やその誘導体であれば、高々２％未満の不純物を含んでいたとしても、その不純物に起因する影響は殆んど無い。
【００２８】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、賦形剤、植物油、動物油、結合剤、懸濁剤、乳化剤、ＰＨ調整剤、等張化剤を含んでいてもよい。さらにビタミンＥのような抗酸化剤を含んでいてもよい。
【００２９】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、液状のまま液剤として投与されてもよいが、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、軟膏、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、坐剤、散剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、トローチ剤、軟膏剤、ハップ剤、リニメント剤、リモナーデ剤、ローション剤にして投与されてもよい。
【００３０】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬を、経口で投与してもよく、静脈注射・点滴で投与してもよく、皮膚に塗布乃至貼付して経皮吸収させてもよい。
【００３１】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、エイコサペンタエン酸誘導体として、１８００〜２７００ｍｇ／日投与されることが好ましい。毎日投与されることが好ましく、数時間おきに毎日数回投与されてもよく、毎食後に等量ずつ投与されてもよい。
【００３２】
その他の医薬品例えば、カルシウムチャンネル拮抗剤、アンギオテンシンII受容体拮抗剤、又はアロプリノールなどと併用してもよい。
【００３３】
この他、脂肪肝及び脂肪肝炎の改善薬として用いてもよく、脂肪肝の酸化ストレスの改善薬として用いてもよく、脂肪肝及び脂肪肝炎の組織機能の改善薬として用いてもよい。
【実施例】
【００３４】
以下に、非アルコール性脂肪肝炎治療薬や肝組織機能改善薬を、投与した実施例を示す。この非アルコール性脂肪肝炎治療薬を用いて治療を行いつつ、この治療薬が非アルコール性脂肪肝炎患者の生化学的乃至組織学的異常を回復させていることについて、検討した。
さらに、本発明を適用する判定マーカーにより、非アルコール性脂肪肝炎治療効果や非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果の判定について、検討した。
【００３５】
（実施例に関与した患者）
非アルコール性脂肪肝炎の患者に、非アルコール性脂肪肝炎治療薬による治療を行った。この全患者は、腹部超音波診断により肝臓の中性脂肪変性症（脂肪肝）であると認められ、栄養士によるカロリー摂取を控えるよう常に指示されているにも関わらず血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値が６ヶ月以上４５Ｕ／Ｌを超え、さらに肝臓の生検で非アルコール性脂肪肝炎であると認められた者である。このような患者のうちこの実施例の非アルコール性脂肪肝炎治療薬による治療の対象外とする基準は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原陽性又はＣ型肝炎ウイルス抗体陽性の場合、薬剤性肝障害、自己免疫肝疾患、ウィルソン病、遺伝性ヘモクロマトーシス症、及びα１アンチトリプシン欠乏症のような慢性肝臓疾患の場合、タモキシフェンによる治療や外科手術した非アルコール性脂肪肝炎の場合、毎週４０ｇを超えるアルコールを摂取している場合、フィブレート、スタチン、又はプロブコールのような脂質低下薬を常用している場合である。
【００３６】
この治療を行う患者は、病院に入院し、一晩絶食した後、採血され、経皮的肝臓生検が行われた。治療前に、体重指標（ＢＭＩ）を算出した。日本人全体を基準にして比較し、ＢＭＩが２５ｋｇ／ｍ２を超える場合は、肥満であると考えられた。患者は、心収縮圧／心拡張圧が１４０／９０ｍｍＨｇを超える場合、又は降圧剤を服用している場合、高血圧症であるとみなした。また、患者は、空腹時のグルコース値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上である場合、若しくはインスリン又は経口低血糖症剤を服用している場合に、糖尿病であるとみなした。また、患者は、空腹時の血清中のコレステロール値及びトリグリセリド値が夫々２２０ｍｇ／ｄＬ以上及び１５０ｍｇ／ｄＬ以上である場合に、高脂血症であると診断した。なおこの治療は、世界医師会ヘルシンキ宣言に従って行ったもので、当該病院の倫理委員会で承認されたものである。
【００３７】
（治療介入）
肝臓の生検を行ったところ組織学的に非アルコール性脂肪肝炎と認められるが他には疾患がないと診断された患者に対して、この治療について説明した。非アルコール性脂肪肝炎である３０人の患者（内訳は男性が１８人で女性が１２人、年齢は２７〜７４歳で平均５８歳）から、この治療に関与することの同意書を得た。その後、９８％以上の純度を有する高純度エイコサペンタエン酸エチルエステルであるエパデール（持田製薬株式会社製；登録商標）（エパデールカプセル又はエパデールＳ）（以下、ＥＰＡと略記）を、その患者に１２箇月間、２７００ｍｇ／日ずつ内服投与した。このようなＥＰＡ単独内服を行った全患者は、少なくとも１２箇月間、カロリー制限を継続し、何人かの患者は、カルシウムチャンネル拮抗剤、アンギオテンシンII受容体拮抗剤、又はアロプリノールのような以前から常用していた様々な薬物も併せて服用した。このような治療介入は、この治療期間中、変わることなく、継続した。理学所見及び血液検査所見によって、ＥＰＡによる副作用を監視した。患者が医師の指示に従ってＥＰＡを摂取していることを、問診と血漿のＥＰＡ濃度の測定とによって、確かめた。治療効果は、主に臨床データと検査データとによって、評価した。うち７人の患者は、この１２箇月の治療での最後にも繰り返し肝臓の生検を行うことに同意した。これらの患者について、組織学的所見の変化を調べた。
【００３８】
（検査方法）
全てのデータは、空腹時のものである。常用検査を標準的な方法で行った。ＥＰＡ内服治療開始時、開始後３、６、９、１２箇月目での代表的な臨床検査を行った。血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、フェリチン値は、オートアナライザーを用いて測定した。フェリチン値は、抗フェリチン抗体を感作させたラテックスとの反応により生じる混濁度を濃度既知の標品と比較することにより、即ちラテックス比濁法により測定されたものである。血清中のチオレドキシン値は、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（レドックス・バイオサイエンス株式会社製；商品名）を用いて、酵素標識免疫吸着法により測定したものである。血中遊離脂肪酸（ＦＦＡ）濃度の測定はＮＥＦＡテストキット（和光純薬社製）を用いて発色させ、濃度既知の標品との比色測定により行ったものである。なお、値は平均±標準偏差で表示する。インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）は、次式
空腹時の血漿グルコース値（ｍｇ／ｄＬ）×空腹状態での血漿インスリン値（μＵ／ｍＬ）／４０５
を用いて算出した。血清の脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィーを用いて、その標品の濃度と検知面積との検量線の比較により、測定した。血漿の腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、可溶性ＴＮＦ−α受容体−１（ｓＴＮＦ−Ｒ１）及びｓＴＮＦ−Ｒ２の各濃度は、酵素免疫定量キット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製；商品名；米国ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、酵素免疫定量法により、測定した。血清のアディポネクチン濃度は、酵素標識免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）キット（大塚製薬株式会社製；商品名）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により、測定した。血清中のチオレドキシン値は、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（レドックス・バイオサイエンス株式会社製；商品名）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により、測定した。
【００３９】
（超音波検査法による肝臓の中性脂肪変性症の評価）
Ｂ−モード超音波検査法は、３．５ＭＨｚ凸型変換機（日立メディカル株式会社製；商品名）を装着した超音波診断装置モデルＥＵＢ−５２５（株式会社日立製作所製；商品名）を用い、同一の熟練技術者によって行われた。患者は、超音波検査の前、少なくとも１２時間絶食し、この治療の開始時と終了時とに測定が行われた。超音波検査により、肝臓のエコー反射性は、次の四つの等級で評定した。等級０は中性脂肪変性症なし、等級１は軽度中性脂肪変性症（僅かに均質に肝臓のエコー反射性の増加あり；明瞭な肝臓内部脈管像あり；肝臓深部エコーの減衰なし）、等級２は中程度中性脂肪変性症（肝臓のエコー反射性の中程度の増加あり；肝臓内部脈管に部分的な不明瞭像あり；僅かに肝臓深部エコーの減衰あり）、等級３は重度中性脂肪変性症（瀰漫性・高度の肝臓のエコー反射性の増加あり；もはや肝臓内部脈管の可視不能；非常に深刻な肝臓深部エコーの減衰あり）というものである。
【００４０】
（組織学的評価）
肝臓の生検標本は、１４−Ｇの生検針を用いて採取し、直ちに１０％中性ホルマリンで固定した。断片を４μｍの厚さに切断し、ヘマトキシリンとエオシンとによりアザン−マロリー法で染色した。組織学的所見は、クライナーらによる進展度診断／格付け法に準拠し、一人の病理学者（ＫＳ）による盲検法で、評定した。ＮＡＦＬＤの組織学的活動性（ＮＡＦＬＤ activity score: ＮＡＳ）は、中性脂肪変性症（０〜３レベルの４段階）、小葉炎症（０〜２レベルの３段階）、肝細胞風船様腫大（０〜２レベルの３段階）の夫々の評価の非加重合計による０〜８レベルの幅で定められるものである。ＮＡＳが５を超えるものは、疑いなく非アルコール性脂肪肝炎と診断される。
【００４１】
（統計処理）
統計学的分析は、ウインドウズ版ＳＰＳＳソフトウェア１１．０Ｊ（ＳＰＳＳ社製；米国イリノイ州シカゴ）を用いて行われた。定性値は、（％）で表示し、χ２検定で比較した。定量値データは、平均と標準偏差とで表示し、二項両側ｔ検定で比較した。確率値（Ｐ値）が０．０５未満で、統計学的有意性ありとみなし、＊で示した。
【００４２】
この治療の結果を以下に示す。
【００４３】
（患者の特徴の基準値）
この治療に関与した非アルコール性脂肪肝炎である３０人の患者の特徴の基準値を、表１に示す。２５人（８３％）の患者は、肥満であり、平均ＢＭＩが２８．３±３．３ｋｇ／ｍ２であった。１６人（５３％）の患者は高血圧症であり、５人（１７％）の患者は糖尿病であった。腹部超音波検査の結果、１５人（５０％）の患者が等級３の重度中性脂肪変性症であった。組織学的には、全患者のＮＡＳが、５を超えていた。多くの患者の線維症第１期又は第２期であった。６人（２０％）の患者は線維性架橋を形成していた。これら患者のうち肝硬変になっている者はいなかった。
【００４４】
【表１】
【００４５】
（生化学的特徴によるＥＰＡの効果）
全患者に１２箇月間、治療した。平均体重は、治療前に７３．８±１１．５ｋｇであったが、治療後に７３．６±１１．９ｋｇとなり（Ｐ＝０．８０７）、その前後で変化が認められなかった。血清中のＡＬＴ値は、図１に示す通り、８１±３８Ｕ／Ｌから１２箇月後に５０±２２Ｕ／Ｌとなり、その基準値と比較すると２９％減少していた（Ｐ＝０．００２）。血清のＡＳＴ値とＡＬＴ値との改善が、６ヶ月以降認められた。うち７人（２３％）の患者で、血清のＡＬＴ値が、ＥＰＡによる治療で正常値（＜３０Ｕ／Ｌ）に戻ったが、４人（１３％）の患者で血清のＡＬＴ値の有意な改善が認められなかった。血小板数と、血清中のアルブミン値、アルカリホスファターゼ値、γ−グルタミルトランスフェラーゼ値、ヒアルロン酸値及び４型コラーゲン７Ｓ値は、変化していなかった。ＥＰＡによる治療で、表２に示すように、総コレステロール値は、基準値から８％減少（Ｐ＝０．０３７）し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）値は、基準値から３４％減少（Ｐ＝０．０１１）していたが、トリグリセリド値と高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール値とは、変化していなかった。血清の脂肪酸のプロファイル分析の結果、ＥＰＡ濃度と、アラキドン酸（ＡＡ）に対するＥＰＡ組成比（Ｃ２０：５，ｎ−３）／（Ｃ２０：４，ｎ−６）とは、有意に増加していた。ＥＰＡによる治療で、血清のアラキドン酸濃度は、基準値から１２％（Ｐ＝０．０３８）減少していた。一方、ＥＰＡによる治療後、空腹時のグルコース値、インスリン値、及びアディポネクチン値、ＨＯＭＡ−ＩＲ、グリコヘモグロビン値は、有意な変化がなかった。そのためＥＰＡによる治療で血清のＡＳＴ及びＡＬＴの低下と、インスリン抵抗性及び低アディポネクチン血症の改善との間に相関性がないことが示された。
【００４６】
【表２】
【００４７】
次いで、非アルコール性脂肪肝炎の炎症性壊死を惹き起こす血清の炎症性サイトカイン値について、検討した。血漿の平均ＴＮＦα値は、治療後に低下する傾向にあった。血漿のｓＴＮＦ−Ｒ１値とｓＴＮＦ−Ｒ２値とは、基準値に対し夫々１０％と１６％有意に低下（夫々Ｐ＜０．００１）していた。血清の鉄濃度とトランスフェリン飽和度とは変化しないままであったが、血清のフェリチン濃度は１２箇月間のＥＰＡによる治療で、有意に低下していた。酸化的ストレスの指標である血清のチオレドキシン値も２８％低下（Ｐ＝０．０３２）していた。
【００４８】
ＥＰＡ単独内服治療を受けたＮＡＳＨ患者において、経時的に採取して分析した血清の結果を示す。図１から明らかなように、フェリチン(Ferritin)、チオレドキシン(Thioredoxin)、遊離脂肪酸（FFA）の各濃度の経時的変化は、ＡＳＴやＡＬＴの経時的変化によく類似していた。すなわち、これら５種の血清中の因子が、ＥＰＡ単独内服による治療過程で同調的に変化することが、明らかとなった。したがって、ＮＡＳＨ患者の治療におけるＥＰＡ単独内服治療によるＮＡＳＨの改善を判断する指標として、血清中のＡＳＴ・ＡＬＴ・可溶性腫瘍壊死因子受容体−１・可溶性腫瘍壊死因子受容体−２の治療前・治療後の変化のみならず、フェリチン・チオレドキシン・遊離脂肪酸含量の変化もＥＰＡのＮＡＳＨに対する好ましい薬効を表していることが分かった。
【００４９】
（超音波検査法の所見によるＥＰＡの効果）
１７人（５７％）の患者で、中性脂肪変性症のレベルの改善が見られた。中性脂肪変性症のレベルにつき、１５人（５０％）の患者が１レベル低下し、２人（７％）の患者が２レベル低下していた。７人（２３％）の患者は、１２箇月のＥＰＡによる治療で、中性脂肪変性症が消失していた。中性脂肪変性症の平均レベルは、２．２±１．０であったものが、治療によって１．６±１．２（Ｐ＝０．００４）に、有意に改善されていた。
【００５０】
（組織学的所見によるＥＰＡの効果）
全患者の２３％に相当する７人の患者が、１２箇月間ＥＰＡによる治療をした後、肝臓の生検を繰返し行うことに、同意した。その組織学的所見の変化を、表３に示す。中性脂肪変性症の平均レベルは、２．４±０．５であったものが、治療によって１．７±０．５に低下した。線維症の平均レベルは、１．７±１．１であったものが、治療によって０．７±０．５に低下した。生検を行ったところ、線維症の等級がその内の４人（５７％）の患者で１レベル低下しており、２人（２９％）の患者で２レベル低下していた。線維症が悪化した患者はいなかった。小葉炎症と肝細胞の風船様腫大との平均レベルは、何れも改善されていた。
【００５１】
【表３】
【００５２】
平均ＮＡＳは、６．１±１．３であったものが、１２箇月の治療後、３．７±１．４に低下していた。ＮＡＳは、６人（８６％）の患者で改善されていた。中性脂肪変性症、小葉炎症、及び肝細胞風船様腫大の夫々が少なくとも１レベルの改善がありＮＡＳの３レベル以上の低下があるものを、組織学的に治療効果があるとした。このような厳格な規定によると、３人の患者（４３％）に、組織学的な治療効果が見られた。５人（７１％）の患者に、ＮＡＳ ５未満への低下が見られ、これらの患者は『疑いなく非アルコール性脂肪肝炎である』から、１２箇月間のＥＰＡによる治療後に、『非アルコール性脂肪肝炎か否かのボーダーライン上にある』又は『非アルコール性脂肪肝炎でない』に、改善されていた。
【００５３】
（組織学的活動性と血清サイトケラチン１８とＡＬＴとの相関性の検討）
次に、過去に肝臓生検を施行した無治療のＮＡＦＬＤ患者の１１８例において、ＮＡＦＬＤの組織学的活動性のスコア値（ＮＡＳ）と、血清サイトケラチン（ＣＫ）１８フラグメント又はＡＬＴ値との相関を、調べた。
【００５４】
ＮＡＦＬＤの組織学的活動性は、患者背景、患者臨床情報を知らない病理学者が、１１８名の無治療のＮＡＦＬＤ患者の肝生検組織切片にヘマトキシリンエオジン染色を施しそれを顕微鏡で観察し、脂肪肝の程度、バルーニングや小葉内炎症の程度などをクライナーらにより提唱された基準（Kleiner et al., Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2005; 41: 1313-1321）に則り、スコアリングしたものである。スコアリングにより、１〜８のランクのスコアに区分され、ＮＡＳ値が大きいほどＮＡＦＬＤの活動性が強いことを示す。前記と同様、ＮＡＳ値が５以上でＮＡＳＨと確定される。またＮＡＦＬＤの治療効果もこのスコアの改善を以って評価される。
【００５５】
一方、各々のＮＡＦＬＤ患者から得られた血清ＡＬＴ量の値と血清サイトケラチン１８フラグメント量を測定した。血清サイトケラチン１８フラグメント値はM30-Apoptosense ELISAキット（Peviva社製、商品名）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により、測定し、ＡＬＴは前記と同様にして測定した。Spearman's rank correlation analysisにより相関係数（ｒ値）を求めた。横軸にＮＡＦＬＤの組織学的活動性のスコア値、縦軸に夫々血清ＡＬＴ量の値と血清サイトケラチン（ＣＫ）１８フラグメント量の値とにした相関の結果を、図２に示す。
【００５６】
図２から明らかな通り、血清サイトケラチン１８フラグメント量の値とＮＡＳ値との相関値（ｒ）は0.526であり、血清ＡＬＴ値とＮＡＳ値との相関値（ｒ）は0.298であった。この結果から明らかなように、血清サイトケラチン１８フラグメント量は、血清ＡＬＴ値よりも、ＮＡＳ値との相関値が、はるかに高い。したがって、血清サイトケラチン１８フラグメント量は、ＮＡＦＬＤの組織学的活動性（即ちＮＡＳＨの病勢）との高い相関性を示すことが分かった。
【００５７】
従来は、ＮＡＳＨの治療効果判定には複数回の肝生検を行い、組織学的変化を観察するしか有効な観察方法がなかった。肝生検は入院を要し、肝臓に針を刺してその一部を採取するという侵襲性の高い検査であるため、患者に多大な肉体的・精神的・経済的負担をかけているばかりか、定量的なＮＡＳＨの治療効果判定がしばしば困難であった。それに対し、血清サイトケラチン１８フラグメント量は、ＮＡＳＨの程度を判断するうえで定量化できる血清マーカーとして有用であるばかりでなく、今までＮＡＳ値と相関すると信じられてきた血清ＡＬＴの定量値よりも、遥かに優れたＮＡＳ値との相関を有することが判明した。従って、血清サイトケラチン１８フラグメントは、ＮＡＳＨの治療効果判定の際に、正確かつ簡便なマーカーであり、従来の肝生検より安全で侵襲性の低い評価法として用いることができる。また、ＮＡＳＨだけでなく、他の脂肪蓄積を伴う肝炎の程度を推定する血清マーカーとしても有用である。
【００５８】
この血清サイトケラチン１８フラグメント量は、（１）ＥＰＡ単独内服によるＮＡＳＨ患者の治療における肝炎改善程度を判断する新規血清マーカーとして有用であり、（２）脂肪肝疾患（ＮＡＳＨやＣ型肝炎）の脂肪蓄積および炎症程度を判断する新規血清マーカーとしても有用であり、さらに（３）ＮＡＳＨやＣ型肝炎患者のＥＰＡ単独内服以外の治療における肝炎改善程度を判断する新規血清マーカーとしても有用であると考えられる。
【００５９】
（ＥＰＡ治療前後における血清サイトケラチン１８フラグメント値の変化の検討）
１２箇月のＥＰＡ単独内服治療を完遂できたＮＡＳＨ患者６例において、治療開始時、１２箇月後に、前記と同様にして血清サイトケラチン１８フラグメント量を測定した。その血清サイトケラチン１８フラグメント量の値の変化を図２に、示す。治療開始時における血清サイトケラチン１８フラグメント値を各々１００％とし、１２箇月治療後の相対値を％で表示した。スチューデントのｔ検定によりＰ値を算出した。全ての患者において著しい血清サイトケラチン１８フラグメントの低下が確認され、低下の程度は図１に示した５種の血清マーカー値の低下の程度と強い相関があることが確認された。このことからも、血清サイトケラチン１８フラグメント量が、ＮＡＳＨの治療効果判定の有能なマーカーとして用いることができることが確かめられた。
【００６０】
（ＥＰＡ治療前後での肝臓内トリグリセリド（ＴＧ）と過酸化脂質（ＭＤＡ＋４-ＨＮＥ）量の変化）
生体部分肝移植のドナー術前検査で得られた正常肝組織（Ｃ：Control、ｎ＝４）、ＥＰＡ単独内服治療前後に肝生検を行なったＮＡＳＨ患者の肝組織（ＳＨ：steatohepatitis［脂肪肝炎、治療前］、及びＳＨ＋ＥＰＡ［ＥＰＡ治療後］、各ｎ＝５）から総脂質を抽出し、トリグリセリドテストキット（和光純薬社製、商品名）を用いてトリグリセリド量（ＴＧ）を測定した。肝組織中の過酸化脂質量（ＭＤＡ＋４-ＨＮＥ量、なおＭＤＡはmalondialdehyde、４-ＨＮＥは4-hydroxynonenal）は、ＬＰＯ-５８６キット（オキシス インターナショナル社製、商品名）を用いて測定した。測定値は平均±標準偏差で表示し、群間の比較は、スチューデントのｔ検定により行った。確率値（Ｐ値）が０．０５未満で、統計学的有意性ありとみなし、＊で示した。その結果を、図４に示す。
【００６１】
図４から明らかな通り、１２箇月間のＥＰＡ単独内服治療を完遂できたＮＡＳＨ患者５名において、生検で得た肝臓を生化学的手法で調べたところ、肝臓内のトリグリセリド量（ＴＧ）および過酸化脂質量（ＭＤＡ＋４-ＨＮＥ）は、ＥＰＡ治療前のＮＡＳＨ（ＳＨ）では高値であるが、治療後（ＳＨ＋ＥＰＡ）では大きく減少していた。
【００６２】
（ＥＰＡ治療前後での肝臓内の酸化ストレス消去・炎症に関連する遺伝子発現の変化）
生体部分肝移植のドナー術前検査で得られた正常肝組織（Ｃ：control，ｎ＝４）、ＥＰＡ単独内服治療前後に肝生検を施行し得えたＮＡＳＨ患者の肝組織（ＳＨおよびＳＨ＋ＥＰＡ、ｎ＝５）から、キット（キアゲン社製）を用いて総ＲＮＡを分離後、逆転写酵素（インビトロゲン社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。PRISM 7000 Sequence Detection System（ＡＢＩ社製、商品名）を用いた核酸染色であるSYBR green法により、酸化ストレス消去酵素であるスーパーオキサイドディスムターゼ（Ｃｕ,Ｚｎ-ＳＯＤ及びＭｎ-ＳＯＤ、なおＳＯＤはsuperoxide dismutase）、炎症関連分子（ＴＮＦ−αおよびＩＣＡＭ−１、なおＴＮＦ−αはtumor necrosis factor α：腫瘍壊死因子−α、ＩＣＡＭ-１はintercellular adhesion molecule-1：細胞間接着分子−１）、エンドトキシン受容体（ＴＬＲ４、なおＴＬＲ４はToll-like receptor 4：トール様受容体）各分子のｍＲＮＡ発現量（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量に対する相対値、なおＧＡＰＤＨはglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を算出した。測定値は平均±標準偏差で表示し、群間の比較は、スチューデントのｔ検定により行った。確率値（Ｐ値）が０．０５未満で、統計学的有意性ありとみなし、＊で示した。その結果を、図５に示す。
【００６３】
図５から明らかな通り、蛋白発現をｍＲＮＡレベルで測定すると、ＥＰＡ治療前のＮＡＳＨ（ＳＨ）ではＣｕ,Ｚｎ-ＳＯＤ及びＭｎ-ＳＯＤは正常（Ｃ：control）より低下していた。治療後（ＳＨ＋ＥＰＡ）は両方とも正常（Ｃ）の数倍レベルに増加した。両方のＳＯＤ分子は活性酸素を除去する機能を持つので、治療後に増加することはＥＰＡ内服により抗酸化能力が上昇することが示唆された。このことは治療後（ＳＨ＋ＥＰＡ）の過酸化脂質量の減少の一因と考えられる。
【００６４】
炎症関連分子（ＴＮＦ-α及びＩＣＡＭ-１）およびエンドトキシン受容体（ＴＬＲ４）の発現は治療前に高く、治療後に減少した。ＴＮＦ-αは炎症を生じている細胞から放出されるが、半減期が短いため、血中での蛋白量変化にはあまり反映されない（表２参照）。しかし、肝臓内でのｍＲＮＡ量は合理的な変化を示した。従って、肝臓内におけるＴＮＦ-α ｍＲＮＡ量は肝炎改善程度を判断するマーカーとして有用である。ＩＣＡＭ-１はＴＮＦ-αと似た機能と挙動を示すので、ＩＣＡＭ-１ ｍＲＮＡ量も肝炎改善程度を判断するマーカーとして有用である。ＴＬＲ４はエンドトキシン（ＬＰＳ:リポポリサッカライド）の細胞表面受容体として炎症の促進機能を持つことが知られている。図５に示されたデータはＴＬＲ４ ｍＲＮＡ量が、治療前に正常人の約３倍高く、治療後に正常人レベルまで低下することを、初めて示したものである。この変化は、ＥＰＡ内服により生じるＴＮＦ-αおよびＩＣＡＭ-１の変化に類似しており、肝臓内におけるＴＬＲ４ ｍＲＮＡ量は肝炎改善程度を判断するマーカーとして有用である。
【００６５】
ＮＡＳＨの肝炎改善程度を判断する手法として組織学的解析を併用することが有用である（表３参照）。図５に示された肝臓内蛋白分子の生化学的解析結果が加わると、血清解析データでは得られない情報が得られるので、ＥＰＡ単独内服治療効果のさらに的確な判断が、可能となる。
【００６６】
（酸化ストレス生成分子の発現レベルに関するＥＰＡ単独投与とＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与との差異）
Ｃ57 Ｂ6雄マウス（１２週齢）を１５％硬化ヤシ油含有のＡＩＮ-９３Ｇ変型高脂肪食にて１２週間飼育した。これにより、全てのマウスは脂肪肝症状を呈した（5.8 + 0.9 mg トリグリセリド／g 肝臓）。コントロール群（Ｃ：Control）は上記高脂肪食にて、さらに６週間飼育した。ＥＰＡ単独投与群（ＥＰＡ）は上記高脂肪食を与え、加えて、1.4 mg ＥＰＡ／日／30g 体重 にてＥＰＡを６週間経口投与した。ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与群（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）は上記高脂肪食を与え、加えて、30 mg マグロ油（27%ＤＨＡおよび5%ＥＰＡを含有、なおＤＨＡはdocosahexaenoic acid）／日／30g体重にてＥＰＡおよびＤＨＡを６週間経口投与した。マグロ油投与群（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）は、ＥＰＡ単独投与群とほぼ等量のＥＰＡとそのＥＰＡの5.4倍量のＤＨＡを与えたことになる。各群６匹のマウスを使用した。肝臓を摘出後、キット（キアゲン社製）を用いて総ＲＮＡを分離した。逆転写酵素（インビトロゲン社製）を用いてｃＤＮＡを合成した後、PRISM 7000 Sequence Detection System（ＡＢＩ社製）を用いたSYBR green法により、チトクロームＰ４５０ ４Ａ１(ＣＹＰ４Ａ１)、アシルＣｏＡオキシダーゼ(ＡＯＸ)、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ
サブユニット蛋白 (ｇｐ９１ｐｈｏｘ およびｐ４７ｐｈｏｘ) 各分子のｍＲＮＡ相対量（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量に対する相対値）を測定した。これら４種の酵素蛋白は、何れも活性酸素を生成する機能を有し、酸化ストレス生成酵素である。測定値は平均±標準偏差で表示し、群間の比較は、スチューデントのｔ検定により行った。確率値（Ｐ値）が０．０５未満で、統計学的有意性ありとみなし、＊で示した。その結果を、図６に示す。
【００６７】
図６から明らかな通り、肝臓における４種の酵素蛋白のｍＲＮＡ量を測定したところ、同一パターンの結果を得た。即ち、ＥＰＡ単独投与群（ＥＰＡ）では４分子種のｍＲＮＡ量は全く増加しないが、ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与群（ＥＰＡ＋ＤＨＡ）では４分子種とも著しい増加が生じた。ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与群はＥＰＡ単独投与群とほぼ同量のＥＰＡが投与されているが、得られた結果はＥＰＡ単独投与群と全く異なるものであった。このことから、ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与（魚油投与）は、ＥＰＡ単独投与とは全く異なる変化を引き起こしうることが、明らかとなった。従って、ＮＡＳＨ患者へのＥＰＡ単独内服による薬効は特異的であり、ＥＰＡ＋ＤＨＡ混合投与（魚油投与）による薬効とは、多くの事項に関して、かなり異なることが、強く示唆された。
【００６８】
（ＥＰＡの安全性）
ＥＰＡ治療期間中に、有害な症状は現われなかった。また出血傾向は、線維症を有する非アルコール性脂肪肝炎患者にさえ、認められなかった。
【００６９】
（治療結果の総括）
この高純度ＥＰＡにより治療するというこの方法によると、８７％の患者で、血清のＡＬＴ値が通常値よりも２９％も低下していた。また、肝臓の中性脂肪変性症が改善することは、肝臓の超音波診断法によって裏付けられた。再生検を行い得た患者の８６％に、肝臓の中性脂肪変性症、線維症、小葉炎症、及び肝細胞の風船様腫大のような非アルコール性脂肪肝炎の典型的な特徴の改善が認められた。そのうち４３％の患者に、ＮＡＳ評価の３レベルを超える有意な改善が認められた。この治療は少人数で行われたものであるが、非アルコール性脂肪肝炎の患者のＥＰＡによる治療の有効性と安全性を初めて示したものである。
【００７０】
ＥＰＡにより治療すると、非アルコール性脂肪肝炎の患者の肝臓の中性脂肪変性症を軽減することが、超音波検査や組織学的検査により認められた。中性脂肪変性症の肝臓中のトリグリセリドのほとんどは、主に脂肪組織から放出され循環している遊離脂肪酸（ＦＦＡ）から誘導されたり肝細胞中で脂質生合成されたりしたものである。ＥＰＡによる治療で、血清のＦＦＡ濃度の有意な低下が認められた。ｏｂ／ｏｂマウスへＥＰＡを投与すると、白色脂肪細胞中で脂肪酸合成酵素の発現の低下をもたらし、その結果、血漿中のＦＦＡ濃度が低下すると、報告されている。さらにこのマウスにおいて、ＥＰＡは肝臓での脂肪酸合成酵素発現値を低下させ、ステロール応答領域結合タンパク１の発現低下により脂肪生合成を抑制していることが示されている。
【００７１】
組織学的所見と血漿のｓＴＮＦ−Ｒ値とによる結果は、ＥＰＡ治療が、非アルコール性脂肪肝炎の活動性を有意に改善することを裏付けている。ＥＰＡ誘導抗炎症効果は、肝細胞中のＦＦＡ誘導脂肪毒性の減少、酸化ストレスの解消、５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸のような炎症前駆エイコサノイド誘導体を産生するアラキドン酸に対する代謝拮抗、ＮＦ−κＢ活性化の抑制のようなメカニズムによるものと考えられている。さらに、ＥＰＡの補給は、細胞／細胞小器官の膜脂質組成を変え、流動性を改善し、肝細胞の損傷の低下をもたらしているのであろう。
【００７２】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬を用いた治療では、ＥＰＡで、血清のアディポネクチン濃度を低下させインスリン抵抗性を改善するという効果は、認められなかった。最近、ピオグリタゾンによる非アルコール性脂肪肝炎の治療の効果を示す幾つかの報告がなされている。ＥＰＡに比較すると、非アルコール性脂肪肝炎に対するピオグリタゾンの主な薬効は、炎症前駆体のサイトカインや酸化ストレスの調整というよりむしろ、アディポネクチンを介在するインスリン感受性の改善と肝臓での脂肪酸の代謝促進にある。そのため、ＥＰＡとピオグリタゾンとの両剤併用療法によれば、これらの薬物の欠陥を補い合うことができる。また、単剤療法よりも、非アルコール性脂肪肝炎に対する一層の効果が得られるかもしれない。
【００７３】
この治療により、非アルコール性脂肪肝炎患者に２７００ｍｇ／日の服用量でＥＰＡを投与したときの安全性及び有効性に関し、有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
非アルコール性脂肪肝炎治療薬は、脂肪肝の酸化ストレスの改善や脂肪肝の組織機能の改善に用い、非アルコール性脂肪肝炎の症状の緩和、改善、治癒のような治療に有用である。無作為プラセボ対照試験による診断にも有用である。
【００７５】
また、肝組織機能改善薬は、脂肪肝及び／又は肝炎である肝組織の機能異常の改善に用い、非アルコール性脂肪肝疾患の症状の緩和、改善、治癒のような治療に有用である。
【００７６】
本発明の非アルコール性脂肪肝炎マーカーは、病勢や治療効果判定の指標として、有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝炎患者から採取された血液に由来するフェリチン、チオレドキシン、遊離脂肪酸の何れか、又は前記患者から採取された肝臓に由来するＣｕ,Ｚｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、Ｍｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、腫瘍壊死因子α、細胞間接着分子−１、エンドトキシン受容体であるトール様受容体４の何れかであって、その含量の変化若しくはそのｍＲＮＡ含量の変化として測定される血中又は肝臓における非アルコール性脂肪肝炎治療効果の判定マーカー。
【請求項２】
非アルコール性脂肪肝炎を含む非アルコール性脂肪肝疾患患者から採取された血液に由来するサイトケラチン１８フラグメントであって、その含量の変化として測定される非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果の判定マーカー。
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝炎患者から採取された血液に由来するフェリチン、チオレドキシン、遊離脂肪酸の何れか、又は前記患者から採取された肝臓に由来するＣｕ,Ｚｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、Ｍｎ-スーパーオキサイドディスムターゼ、腫瘍壊死因子α、細胞間接着分子−１、エンドトキシン受容体であるトール様受容体４の何れかであって、その含量の変化若しくはそのｍＲＮＡ含量の変化として測定される血中又は肝臓における非アルコール性脂肪肝炎治療効果の判定マーカー。
【請求項２】
非アルコール性脂肪肝炎を含む非アルコール性脂肪肝疾患患者から採取された血液に由来するサイトケラチン１８フラグメントであって、その含量の変化として測定される非アルコール性脂肪肝疾患の病勢又は治療効果の判定マーカー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−９４１３１（Ｐ２０１０−９４１３１Ａ）
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７６６２７（Ｐ２００９−２７６６２７）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【分割の表示】特願２００９−５３０１０９（Ｐ２００９−５３０１０９）の分割
【原出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【分割の表示】特願２００９−５３０１０９（Ｐ２００９−５３０１０９）の分割
【原出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【出願人】（５０４１８０２３９）国立大学法人信州大学 (759)
【Ｆターム（参考）】
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